DE2837383C2 - 6-N-(p-Hydroxyphenyl)-mitomycin-C, Verfahren zur Herstellung und dieses Derivat enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung - Google Patents

Description

>NH

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in an sich bekannter Welse Mltomycln-A mit p-Amlnophenol zur Reaktion gebracht wird.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die Verbindung nach Anspruch 1 als aktiven Bestandteil und einen pharmazeutischen Träger.

Die Erfindung betrifft den Gegenstand der Patentansprüche.

6-N-Phenylmltomycin-C sowie 6-N-Phenylmltomycln-C-derivate, nämlich 6-N-Alkoxyphenylmltomycln-C und das durch Reaktion von N-Benzylmltomycin-A mit p-Anisidln gebildete 6-N-<p-Methoxyphenyl)-mItomycln-C-derivat, und die antlbloUsche Wirkung dieser Verbindungen sind bekannt (US-PS 33 32 944).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein 6-N-Phenylmltomycln-C -derivat anzugeben, das nicht nur antibiotische Wirksamkeit, sondern auch Antltumoraktlvltät bei verhätlnismäßlg niedriger Toxlzltät besitzt.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung gelöst durch 6-N-(p-HydrGxyphenyl)-mltomycln-C der Formel

CH₂OCONH₂

OCH₃

:>NH

CH₃ Il N
O

Daß diese Verbindung eine Antitumoraktlvität und eine vergleichweise niedrige Toxlzltät besitzt und aus diesem Grunde für die Medizin von besonderem Interesse Ist, war nicht vorhersehbar, da Im Stand der Technik über diese Eigenschaften bei ähnlichen Verbindungen nichts berichtet wird.

Gegenstand der Erfindung 1st auch ein Verfahren zur Herstellung von o-N-ip-HydroxyphenyO-mltomycin-C, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß In an sich bekannter Weise (US-PS 33 32 944, GB-PS 10 71393) Mltomycln-A mit p-Amlnophenol zur Reaktion gebracht wird.

Zweckmäßigerweise erfolgt die Reaktion In Gegenwart eines Lösungsmittels, vorzugsweise von Methanol, Äthanol oder Propanol. Das Mltomycln-A und das p-Amlnophenol sollen dabei In einem Molverhältnis von 1 : 100 bis 3:1, Insbesondere von 1 :20 bis 1:1, verwendet werden. Die Konzentration des Mltomycln-A beträgt zweckmäßigerweise 10"* bis 5 mol/1 und vorzugsweise 10~³ bis 1 mol/1. Vortellhafterwclse wird die Reaktion bei einer Temperatur zwischen -30 und +50° C, Insbesondere von +5 bis +30° C, durchgeführt. Die Reaktion ist Im allgemeinen nach 3 bis 50 Stunden abgeschlossen. Anschließend kann das 6-N-(p-Hydroxyphenyl)-mltomycln-C In üblicher Welse von der Reaktionslösung abgetrennt und gereinigt werden, z. B. unter Verwendung der Slllkagel-Säulenchromatographle.

In der nachstehenden Tabelle 1 ist die Inhibitorische Mindestkonzentration der erfindungsgemäßen Verbindung 6-N-(p-Hydroxyphenyl)-mltomycln-C (I) und von 6-N-Phenylmltomycln-C (II) angegeben:

Tabelle I

Mikroorganismus	10707	Verbindung I	II
Staphylococcus aureus ATCC 6538 P	9290	0,196	< 0,025
Bacillus subtilis ATCC		0,049	< 0,025
Shigella sonnei ATCC	6,25	1,563
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031	0,391	0,098

Die akute Toxizltät sowie die Antitumoraktivität der erflndungsgemäßen Verbindung und einiger weiterer bekannter Verbindungen wurden in der im einzelnen In den nachstehenden Versuchen angegebenen Weise bestimmt, wobei mit Verbindung I das erfindungsgemäße 6-N-(p-Hydroxyphenyl)-mitomyc!n-C, mit Verbindung II 6-N-Phenvlmitomycin-C und mit Verbindung III das aus N-Benzyl-mitomycln-A und p-Anisidln gebildete 6-N-(p-Methoxyphenyl)-mltomycin-C-derivat (gem. US-PS 33 32 944) bezeichnet ist.

Die Verbindungen I, II und III haben eine geringe Löslichkeit In Wasser. Um diese Verbindungen in den nachfolgenden Versuchen verwenden zu können, wurden sie zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit folgendermaßen behandelt: Die jeweilige Verbindung wurde In Äthanol (etwa tausendfache Gewichtsmenge) gelöst und mit einem handelsüblichen Oberflächenbehandlungsmitte! (etwa dreifache Gewichtsmenge) versetzt. Die Mischung wurde dann zum Lösen des Oberilächenbehandlungsmlttels gut umgerührt. Unter Verwendung eines in Umlaufveraampfers wurde unter vermindertem Druck das Äthanol aus der Lösung entfernt. Anschließend wurde eine Testlösung hergestellt, indem unter Rühren eine geeignete Menge einer physiologischen Kochsalzlösung zugesetzt wurde.

(1) Versuch zur Bestimmung der akuten Toxizität i>

Bei diesem Versuch wurden Mäuse vom dd-Stamm mit einem Gewicht von jeweils 20 ± 1 g verwendet, wobei jede Gruppe aus 5 Mäusen bestand. Jede Maus erhielt eine Einzeltestlösung durch intraperitoneale Injektion. Die Testlösungen von jeweils 0,5 ml wurden durch schrittweise Verdünnung hergestellt. Nach Injektion der Testlösung wurden die Mäuse 14 Tage lang beobachtet, um die Sterblichkeit festzustellen, woraus nach der ;< > Behrens-Kärber-Methode (Arch. Exp. Path. Pharmak. 177/1935, S. 379 ff.) die LDso-Werte berechnet wurden. Die Resultate zeigt die nachstehende Tabelle 2:

Tabelle 2

Verbindung LD50 (mg/kg)

I 34

II " 21

(2) Versuch zum Nachweis der Antltuaor-Aktlvität gegenüber Leukämla P-388 (Ip-Ip)

Verwendet wurden 7 'iage alte Leukämla-Zellen, welche von den Vorfahren von Intraperltoneal mit 10' P-388-Zellen geimpften DBA/2-Mäusen erhalten wurden. Eine Zellsuspenslon, welche 5 χ ΙΟ⁶ Zellen/ml enthielt, wurde unter Verwendung einer sterilisierten physiologischen Kochsalzlösung hergestellt. Die Testmäuse (CDF₁- Ji Mäuse, 20 bis 25 g) wurden mit 0,2 ml der Zellsuspenslon, welche .1 χ 60⁶ Zellen enthielt, intraperitoneal geimpft. Nach 24 Stunden wurden die Mäuse In Gruppen von jeweils 5 Mäusen unterteilt, und die Testlösungen wurden Intraperltoneal nur einmal injiziert. Die Überlebensdauer der Mäuse In Tagen wurde über einen Zeitraum von 60 Tagen beobachtet. Um die Wirkungen der Testproben auszuwerten, wurde die durchschnittliche Überlebensdauer in Tagen 30 und 60 Tage nach der Tumorimplantation berechnet und mit denen einer -tu Kontrollgruppe, d. h. einer unbehandelten Gruppe, verglichen. In der nachstehenden Tabelle 3 sind die Antitumor-Aktlvltäten der Verbindungen durch ILS (Verlängerung der Lebensdauer In 96) auf der Basis einer Kontrollgruppe angegeben (A = Verbindung, Kon = Kontrollgruppe, B = Dosis (mg/kg), C = durchschnittliche Überlebensdauer in Tagen, D = ILS (96), E = Anzahl der Überlebenden):

Tabelle 3

bestimmt nach	C	0,4	D	E	60 Tagen	D	E
30 Tagen	9,8 ±	10,4	-	0/5	C	-	0/5
A B	15,4 ±	3,2	57	1/5	9,8 ± 0,4	118	1/5
Kon	28,4 ±	4,5	190	4/5	21,4 ±20,7	386	3/5
I 30	23,0 ±	5,2	135	1/5	47,6 ± 15,8	136	0/5
20	20,4 ±	4,4	108	1/5	23,4 ± 5,1	108	0/5
10	21,6 +	2,8	120	1/5	20,4 ± 5,2	122	0/5
5	21,2 ±	4,3	116	0/5	21,8+ 4,8	116	0/5
II 20	21,8 ±	1.2	122	1/5	21,2 ± 2,8	124	0/5
15	17.8 ±		82	0/5	72,0 ± 4,6	82	0/5
10					17,8 ± 1,2
5

Fortsetzung

bestimmt nach	C	D	E	60 Tagen	D	E
30 Tagen				C
A B

Kon

III

40 20 10

40 20 10

5 2,5

10,6 ±	0,8	toxisch	0/5
6,2 ±	0,8	> 389	0/5
> 51,8		> 166	4/5
>28,2		> 160	1/5
>27,6		60	1/5
17,0 ±	2,3	toxisch	0/5
5,6 ±	1,1	81	0/5
19,2 ±	10,0	> 166	0/5
> 28,1		75	1/5
18,6 +	4,8	42	0/5
15,0 ±	0,7	0/5

(3) Antitumor-Experiment gegen Leukemia P-388 (Iv-Iv)

Mäuse wurden Intravenös mit P-388-Zellen (10⁶/0,2 ml) In gleicher Welse wie zuvor beschrieben geimpft. 24 Stunden nach der Impfung wurden den Mäusen die Verbindungen einmal eingespritzt und die Überlebensdauer über einen Zeitraum von 30 Tagen beobachtet, wobei sich die in nachstehender Tabelle 4 angegebenen Resultate ergaben. Für Kontrollzwecke wurden unbehandelte Mäuse sowie Mäuse, denen Sorblmacrogololeat eingegeben worden war, beobachtet (Kon = unbehandelte Kontrollgruppe, Kon⁺ = mlt 0,5 ml von 1% Sorbimacrogololeat behandelte Kontrollgruppe, ++ wahrscheinlicher statistischer Fehler kleiner 5%, übrige Abkürzungen siehe vor Tabelle 3):

Tabelle 4

AB CD

Kon
Kon
I

30 20 15 10 5

30 20 15 10 5

8,6 ± 0,5	-
8,6 + 0,5	12
7,6 ± 0,8	105
17,6 + 4,1	93
16,6 ± 1,5	63
14,0 ± 0	33
11,4 ±1,4	16
10,0 ± 2,3	109
18,0 ± 1,7**)	84
15,8 ± 1,5	54
13,6 ± 1,4	33
11,4 + 1,4

(4) Auswirkungen auf Sarcoma-180

Mäuse des dd-Stammes wurden Intraperltoneal mit Sarcoma-180-ZeIlen geimpft. 7 Tage nach der Tumorimplantation wurden den Mäusen ausgewachsene Tumor-Zellen entnommen. Die Zellen wurden gewaschen, und es wurde eine Tumorzellen-Suspension mit 5 χ 10⁷ Zeller./ml mit physiologischer Kochsalzlösung hergestellt. 0,1 ml der auf diese Welse hergestellten Suspension mit 5 χ 10" Zellen wurden In die linke Leistengegend einer jeden Testmaus (dd-Stamm; Gewicht 19±1 g; aufgeteilt In Gruppen von jeweils 5 Mäusen) geimpft. 24 Stunden nach der Impfung wurden den Mäusen die Verbindungen einzeln und Intraperitoneal verabreicht. 4 Tage nach der Impfung wurde den behandelten Testmäusen durch Punktieren der Orbitalvene peripheres Blut abgenommen, In welchem die Anzahl der Leukocyten gemessen wurde. Zur Bewertung der Antitumor-Effekte wurde der Tumor 7 Tage nach der Impfung entfernt und gewogen. Sein Gewicht wurde mit dem Durchschnittsgewicht der

—	69,9 ± 16,4
0,27	40,0 ± 15,3
0,46	39,0 ± 5,6
0,66	64,0 ± 24,6
0,83	63,2 ± 10,2
D+	D+
0,21	31,8 ±11,9
0,59	60,8 ± 18,7
0,84	81,4 ±21,1

Tumore der Kontrollgruppe, d. h. der unbehandelten Mäusegruppe verglichen, die Gewichtsverhältnisse (T/C)
sind In Tabelle 5 wiedergegeben (A = Verbindung, B = Dosis, (mg/kg), C = durchschnittliche Leukocytenzahl
(x lOVmm³), Kon = Kontrollgruppe, f> = alle Mäuse der Gruppe starben):

Tabelle 5

Λ B T/C C

Kon

I 40

20

10

II 40

20

10 0,59 60,8 ± 18,7 20

Wie die vorstehenden Versuche gezeigt haben, besitzt die erflndunsgemäße Verbindung gute Antltumor-Akti- g

vltät und 1st diese als Wirkstoff gegen Tumore besonders interessant. Ji

Gegenstand der Erfindung Ist daher auch eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend 6-N-(p- 25 -;

Hydroxyphenyi)-mltomycin-C als aktiven Bestandteil und einen pharmazeutischen Träger. ■'

Die erfindungsgemäßen Mischungen können eine für orale oder parenterale Verabreichung geeignete Form ί

aufweisen. Die erfindungsgemäße Verbindung besitzt zwar eine geringe Löslichkeit in Wasser, sie kann jedoch }.

In destilliertem Wasser oder Glukose so weit gelöst werden, daß man eine Injektionslösung und beispielsweise ;:

die In den nachstehenden Beispielen beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen herstellen kann. 30 3

Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können beispielsweise Intravenös oder Intraperltoneal einmal ii

pro Tag verabreicht werden, wenn auch die verabreichte Menge vom Alter und den Krankheitssymptomen des :;

Patienten abhängen kann. Eine ähnliche Menge des aktiven Bestandteils kann auch oral verabreicht werden. '.".

Zur oralen Verabreichung wird der aktive Bestandteil zusammen mit einem Träger oder einem geeigneten Stoff, -;

beispielsweise In Form von Tabletten, Pulver oder Granularlen verabreicht. Für die parenterale Verabreichung 35 j

kann der aktive Bestandteil gewünschtenfalls Intraarteriell, Intrathoratlell oder intraperitoneal oder auch direkt ν

In den Tumorbereich injiziert werden. Für die parenterale Injektion kann als Träger eine sterile, parenteral- ^:;· verträgliche Flüssigkeit, wie beispielsweise steriles Wasser, eine sterile Glukoselösung oder ein parenteral-

verträgliches Öl wie beispielsweise Erdnußöl, In Ampullen eingesetzt werden. Als Antltumor-Wirkstoff wird 'p

vorteilhafterweise 0,1 bis 0,5 mg/kg (Körpergewicht) des aktiven Bestandteils der Erfindung verwendet. Zweck- 40 ;i

mäßigerweise wird der aktive Bestandteil einmal täglich verabreicht, doch hängen, wie bereits erwähnt, die §,

Häufigkeit der Verabreichung und die Menge des aktiven Bestandteils vom Alter und den Krankheltssympto- K

men des zu behandelnden Patienten ab. Die Zusammensetzungen werden vorteilhafterweise als Dosierungsein- |

heiten zusammengestellt, wobei jede Einheit eine feststehende Dosis an aktiven Bestandteilen abgibt. Als &

Formen geeigneter Dosierungseinheiten sind beispielsweise Tabletten und Ampullen zu nennen. Vorzugsweise 45 g

enthält jede Dosierungseinheit 2 bis 60 mg, Insbesondere 5 bis 60 mg, an aktivem Bestandteil. ^

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung: t

Beispiel 1 S

Herstellung von o-N-ip-HydroxyphenyO-mitomycln-C. P

Mltomycln-A (Ig) und p-Amlnophenol (2 g) wurden in Methanol (100 ml) gegeben. Die Mischung wurde |

dann bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionslösung
dann unter vermindertem Druck konzentriert und dann In vacuo getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde 55
dann einer Sllikagel-Säulenchromatographle unterworfen, mit einer Azeton-Chloroform-Mischung (1 :1) entwikkelt und aus einer Azeton-Äthermlschung in Form von grünen Nadelkristallen rekrlstalHslert. Es ergaben sich
950 mg des gewünschten Produktes, was einer Ausbeute von 78% entspricht. Dieses Produkt zeigte bei der SiH-kagel-Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Azeton-Chloroform-Mischung (1: 1) als Entwickler
einen grünen Fleck (Rf=O₁I). Das Produkt zeigte keinen genauen Schmelzpunkt. 60

Die chemischen Verschiebungen (bei 60 MHz NMR) der typischen Protonen des Produktes wurden mit einem
Kernresonanzspektrometer bestimmt, und zwar als δ-Wert (ppm) unter Verwendung von Tetramethylsilan als
internem Standard (verwendetes Lösungsmittel: Dimethylsulfoxid substituiert mit Deuterium): (a) 6,47; (b) 3,20;
(c) 1,31; (d) 8,40; (e) 6,64 bis 7,03; (0 9,35.

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Produktes nach der KBr-Tablettenmethode 1st in der beiliegenden Zeich- 65
nungsfigur wiedergegeben.

Beispiel 2
Herstellung von 10 000 Dosierungen einer Injektionslösung.

5 Die Verbindung I (100 g) und ein handelsübliches Oberflächenbehandlungsmlttel mit Polyoxyäthylen-Rlcinusöl-Äther (300 g) wurden In 501 Äthanol gelöst. Die Lösung wurde dann durch einen Mllllpore-Membranfllter mit einer Porenweite von 0,22 μ unter Druck hindurchgeleitet und sterilisiert. Das sterilisierte Flltrat wurde In Einzelmengen von jeweils 5 ml in braunen Glasfläschchen von 20 ml Fassungsvermögen abgefüllt, die dann mit Gummistopfen verschlossen wurden. Jedes Fläschchen enthielt 10 mg der Verbindung I und 30 mg des Ober-

lo flächenbehandlungsmlttels. Zum Gebrauch wird diese Injektionslösung einer sterilisierten physiologischen Kochsalzlösung (10 ml) zugesetzt und das Ganze kräftig geschüttelt.

Beispiel 3
15 Herstellung von 10 000 überzogenen Tabletten.

250 g der Verbindung I, 1100 g Lactose und 520 g Stärke wurden Innig vermischt. Die Mischung wurde dann einer üblichen Naßgranullerung unterworfen, wobei 500 ml einer Granullerungslösung aus 500 ml Wasser und 50 g Polyvinylalkohol benutzt wurden. Das Granulat wurde dann mit 20 g Magnesiumstearat vermengt und mit 20 einer rotierenden Tablettenpresse mit ausgehöhlten 8 mm-Stempeln zu Tabletten von 8 mm 0, 4 mm Dicke und 194 mg Gewicht gepreßt. Die Tabletten wurden dann In üblicher Welse mit einem Überzug versehen, wozu eine Lösung folgender Zusammensetzung verwendet wurde:

Methylenchlorid	(C4H9OCOC6H4COOC4H,)	1000 ml
Azeton	Hierzu 1 Blatt Zeichnungen	1000 ml
Zelluloseacetatphthalat	120 g
SlO2	10 g
TlO2	20 g
Butylphthalylbutylglycerat	25 g.

Claims (1)

1. Patentansprüche: 1. o-N-ip-HydroxyphenylJ-mitomycin-C der Formel

   HO

   CH

   CH₂OCONH₂

   OCH₃