DE2713680A1

DE2713680A1 - Verfahren zur herstellung eines mittels mit mitogenen und/oder adjuvans-eigenschaften und dieses mittel enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE2713680A1
Application number: DE19772713680
Authority: DE
Inventors: Constantin Bona; Louis Chedid; Rita Ciorbaru; Edgar Prof Lederer; Jean-Francois Petit
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
Current assignee: Bpifrance Financement SA
Priority date: 1976-03-26
Filing date: 1977-03-28
Publication date: 1977-09-29
Also published as: FR2345159A2; JPS52154513A; US4201768A; FR2345159B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels mit gleichzeitig mitogenen Eigenschaften und/oder Adjuvanseigenschaften, das frei ist von Zellwandbestandteilen, ausgehend von Nocardiae, die nach diesem Verfahren erhältlichen Mittel sowie diese enthaltende Arzneimittel.

Die Erfindung betrifft ganz allgemein Mittel mit mitogenen Eigenschaften und/oder nichtspezifischen immuno-stimulierenden Eigenschaften. Aufgrund dieser Eigenschaften stellen sie wertvolle biologische Reagentien für die Forschung und für die Diagnose dar. Wenn diese Mittel an Menschen oder Tiere verabreicht werden, können sie eine nichtspezifische Stimulierung von Lymphozyten B verursachen, was zu einer Erhöhung des Gehalts von Antikörpern führt, die gegen eine große Anzahl von Antigenen wirken. Weiterhin begünstigen sie die Entwicklung von Stammzellen, so daß man sie zur Heilbehandlung von Krankheiten verwenden kann, die eine Folge des Mangels von immunokompetenten und hämatopoetisehen Zellen sind.

Fraktionen, die solche Mittel mit mitogenen Eigenschaften und/ oder Adjuvanseigenschaften enthalten, sind bereits in dem Hauptpatent (Patentanmeldung P 25 18 474.1) der Anmelderin

beschrieben, das ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung solcher Fraktionen betrifft.

Gemäß dem Hauptpatent (Patentanmeldung P 25 18 474.1)

kann man diese Fraktionen insbesondere ausgehend von einer ersten wäßrigen Fraktion erhalten, die man ihrerseits von einer Suspension abgetrennt hat, die die Produkte der Digerierung von Nocardia-Zellen, die zuvor von Lipiden befreit worden sind, in Gegenwart einer Muramidase und insbesondere von Lysozym in einer wäßrigen Pufferlösung enthält. Man erhält noch weiter an dem mitogenen Mittel angereicherte Fraktionen, wenn man die in der ersten wäßrigen Fraktion enthaltenen löslichgemachten

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Ή,

Peptidoglykanfraktionen abtrennt, die durch die Fragmentierung der Glykanketten des Peptidoglykans als Folge einer mindestens teilweisen Hydrolyse die 1,4-ß-Bindungen zwischen alternierenden N-Acetylglucosaminyl-Gruppen und N-Acylmuramyl-Gruppen der Glykanketten gebildet werden. Diese Peptidoglykanfragmente, deren Adjuvanseigenschaften und/oder nichtspezifische immunostimulierende Eigenschaften ebenfalls beschrieben wurden, besitzen, wenn überhaupt, dann nur eine geringe mitogene Wirkung.

Die zuletzt erwähnte Abtrennung kann durch Filtration über ein Molekularsieb erreicht werden, beispielsweise über Gele der Art, wie sie im Handel unter der Bezeichnung Sephadex (vernetzte Dextrane) erhältlich sind, oder nach einer Abänderung dieses Verfahrens, das darin besteht, daß man ein Produkt der Gefriertrocknung der genannten ersten Fraktion in konzentrierter Essigsäure suspendiert und, insbesondere durch Zentrifugieren, die nicht gelöste Fraktion mit mitogener Wirkung gewinnt, während die flüssige Phase die Peptidoglykanfragmehte in gelöstem Zustand enthält, die zwar eine Adjuvanswirkung, jedoch keine mitogenen Eigenschaften ausüben.

Es sei ferner daran erinnert, daß die aus Nocardiae nach dem

Verfahren des Hauptpatentes (Patentanmeldung

P 25 18 474.1) extrahierten mitogenen Fraktionen ebenfalls Adjuvanseigenschaften besitzen. Dies trifft insbesondere auf die Fraktionen zu, die man nach der Abtrennung der Peptidoglykanf ragmen te erhält, die in dem wäßrigen Medium enthalten sind, das man ausgehend von der Suspension der Zellen, nach ihrem Digerieren in Gegenwart von Lysozym, erhält.

In dem Hauptpatent (Patentanmeldung P 25 18 474.1)

ist ferner angegeben, daß die Filtration gewisser wäßriger Phasen dieser Art, insbesondere jener, die man durch Anwendung des in dem Hauptpatent (Patentanmeldung P 25 18 47 4.1)

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beschriebenen Verfahren auf Nocardia rubra erhält, über ein
Molekularsieb, insbesondere ein Gel der Art, das im Handel
unter der Bezeichnung "Sephadex" bekannt ist, bestimmte Fraktionen ergibt, die Adjuvanseigenschaften besitzen, wenngleich sie keine Peptidoglykanfragmente enthalten.

Die vorliegende Erfindung stellt nun neue Fraktionen mit mitogeneh und/oder Adjuvanseigenschaften zur Verfügung, die gegebenenfalls mit jenen verwandt sind, die Gegenstand des Hauptpatentes (Patentanmeldung P 25 18 474.1) sind, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Fraktionen.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels mit gleichzeitig mitogenen Eigenschaften und/oder Adjuvanseigenschaften, das frei ist von Zellwandbestandteilen, ausgehend von Nocardiae, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ganze Zellen von Nocardiae in einem wäßrigen Medium, insbesondere in destilliertem Wasser, einer Behandlung unterwirft, die ein Aufbrechen ihrer Zellwände bewirkt, die nichtaufgebrochenen Zellen sowie die Fragmente der Zellwände der
aufgebrochenen Zellen, insbesondere durch Zentrifugieren, abtrennt und die wäßrige Phase gewinnt, die das genannte Mittel mit gleichzeitig mitogenen und Adjuvanseigenschaften enthält.

Es konnte ferner gezeigt werden, daß man, ausgehend von der in dieser Weise erhaltenen flüssigen Phase, verschiedene Fraktionen abtrennen kann, die mitogene Eigenschaften und/oder Adjuvanseigenschaften besitzen.

Insbesondere wurde gefunden, daß gewisse Bestandteile des Zytoplasmas eine mitogene Wirkung ausüben, so daß man gemäß einer weiter verbesserten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vorteilhafterweise eine Anreicherung der wäßrigen Phase an den mitogenen Mitteln bewirkt, indem man insbesondere aus

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dieser flüssigen Phase die Zytoplasmamembranen oder ihre Fragmente abtrennt. Diese Abtrennung kann insbesondere durch Zentrifugieren bei einer ausreichend hohen Beschleunigung erreicht werden, beispielsweise bei einer Beschleunigung von etwa 48000 g, wodurch man einen Zentrifugenrückstand erhält, der Fragmente der Zytoplasmamembranen der Nocardiae-Zellen und Ribosomen dieser Zellen enthält.

Die über diesem Zentrifugenrückstand überstehende Flüssigkeit enthält ebenfalls noch Bestandteile mit Adjuvanseigenschaften und mitogenen Eigenschaften.

Man kann weiterhin eine aktive Fraktion, insbesondere mit einer nichtspezifischen Adjuvanswirkung, dadurch erhalten, daß man die zentrifugierbaren Bestandteile von den nichtzentrifugierbaren Bestandteilen abtrennt, die noch in der genannten überstehenden Flüssigkeit enthalten sind, insbesondere durch Ultrazentrifugieren bei einer Beschleunigung von mehr als 1OO 000 g, wobei sowohl der hierbei erhaltene Zentrifugenrückstand als auch die überstehende Flüssigkeit, die im wesentlichen lösliche Bestandteile der Zelle enthält, Adjuvanseigenschaften und mitogene Eigenschaften besitzen, wie es weiter unten erläutert werden wird.

Vorteilhafterweise versetzt man die ersterwähnte überstehende Flüssigkeit mit einer geringen Menge Magnesiumchlorid, bevor man sie der Ultrafiltration unterzieht, um eine Zusammenballung der darin noch enthaltenen Ribosomen zu bewirken.

Die nach der Durchführung jeder Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen mitogenen Fraktionen sind, wie die in

dem Hauptpatent (Patentanmeldung P 25 18 474.1)

beschriebenen mitogenen Mittel wirksam bezüglich Lymphozyten, insbesondere Lymphozyten B, von verschiedenen Tierarten, so daß

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man auch für diese Fraktionen den nichtspezifischen Charakter ihrer mitogenen Eigenschaften feststellen kann. Aufgrund dieser Eigenschaften stellen die erhaltenen Fraktionen Wirkstoffe von Zubereitungen mit mitogenen und/oder Adjuvanseigenschaften dar, so daß diese Zubereitungen als Arzneimittel eingesetzt werden können. Sie können insbesondere mit beliebigen, physiologisch verträglichen Bindemitteln, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffen kombiniert werden, um ihre Verabreichung unter den besten Bedingungen zu ermöglichen.

Die Erfindung betrifft daher auch Arzneimittel, die in Form von wäßrigen, isotonischen, sterilen und injizierbaren Lösungen vorliegen und die genannten Mittel mit mitogenen und/oder Adjuvanseigenschaften enthalten.

Weitere Ausführungsformen, Vorteile und Gegenstände der Erfindung ergeben sich aus der weiteren Beschreibung der Herstellung von Fraktionen, die die erfindungsgemäßen Mittel mit mitogenen und/oder Adjuvanseigenschaften enthalten.

Im folgenden seien die Bedingungen erläutert, unter denen die Zellen der verschiedenen Bakterien gezüchtet werden können, aus denen man die mitogenen Mittel unter Anwendung der weiter unten beschriebenen Bedingungen bereitet.

a) Züchten der Zellen von Nocardia rubra, ATCC 14898 und von Nocardia opaca, ATCC 21953 oder des Stammes des Institut Pasteur (Paris, Frankreich)

Man züchtet die oben erwähnten Stämme in einem Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 20 Liter auf 14 Litern eines Mediums, das mit 500 ml einer auf dem gleichen Medium durchgeführten Vorkultur angeimpft ist.

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Das für das Züchten von Nocardia rubra verwendete Medium enthält 2,5 % "Herzinfusionsbrühe" (Heart Infusion Broth, Difco), 10 ml/1 Glycerin und 0,25 g/l Na₃HPO₄ . 12H₂O und ist auf einen pH-Wert von 7,4 bis 7,6 eingestellt. Das Medium zur Züchtung von Nocardia opaca enthält 0,2 % Hefeextrakt (Difco), 0,4 % Fleischextrakt (Difco), 2 % Bactopepton (Difco) und 0,5 % NaCl und besitzt einen pH-Wert von 7,2.

In beiden Fällen züchtet man die Zellen unter den gleichen Bedingungen, abgesehen von den Züchtungstemperaturen (die im Fall von N. rubra 25°C und im Fall von N. opaca 30°C betragen). Man bewirkt das Züchten unter Rühren, indem man die Spirale des Fermenters bei 250 min ]
Luft pro Minute belüftet.

Fermenters bei 250 min betreibt und das Medium mit 2 Liter

Man unterbricht den Züchtungsvorgang nach Ablauf von 3 bis Tagen. Im Fall von N. rubra besitzt die Kultur eine ziegelrote Färbung.

Anschließend gewinnt man die Kulturen durch Zentrifugieren, wäscht mit destilliertem Wasser und lagert sie bis zu ihrer Verwendung bei -20 C.

b) Aufbrechen der Zellen

Zur Gewinnung der Zellwände suspendiert man die Zellen in einer Menge destillierten Wassers, die dem 5-fachen ihres Gewichtes entspricht, wozu man den Behälter einer Homogenisiereinrichtung oder eines "Mischers" verwendet,und führt sie dreimal durch eine Druckvermahlungseinrichtung (Manton-Gaulin) unter einem Druck von 750 kg/cm hindurch. Nach dem ersten Durchgang setzt man DNase zu.

Das schließlich erhaltene homogene Material wird mit der drei-

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fachen Menge seines Volumens destillierten Wassers vermischt und dreimal während 15 Minuten bei 800 g in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert, worauf man die dabei erhaltenen Zentrifugenrückstände, die die nichtaufgebrochenen Zellen enthalten, verwirft. Die schließlich erhaltene flüssige Phase wird dann während 50 Minuten bei 27500 g zentrifugiert. Man verwirft den Zentrifugenrückstand, der die rohen Zellwände der behandelten Zellen enthält,und gewinnt die wäßrige Phase, die die Bestandteile des Zytoplasmas der behandelten Zellen enthält.

Diese Phase besitzt bereits mitogene Eigenschaften und Adjuvanseigenschaften. Die saure Hydrolyse dieser wäßrigen Phase mit 6 η-Chlorwasserstoffsäure bei 110⁰C während 18 Stunden führt nicht zu einer merklichen Freisetzung von meso-Ot,fc-Diaminopimalinsäure in dem wäßrigen Medium, die durch eine Aminosäureanalyse und durch Dünnschichtchromatographie feststellbar wäre. Es ist daher festzustellen, daß die genannte flüssige Phase nicht durch Zellwände und demzufolge nicht mit Peptidoglykanbestandteilen verunreinigt ist.

Die durch Gefriertrocknen dieser flüssigen Phase erhaltene "rohe Zytoplasmafraktion" wird anschließend erneut in destilliertem Wasser suspendiert. Durch Zentrifugieren bei 48000 g während 1 Stunde erhält man einen Zentrifugenrückstand, der Fragmente der Zytoplasmamembran und Ribosomen enthält. Der von der überstehenden wäßrigen Flüssigkeit abgetrennte Zentrifugenrückstand wird im folgenden als "Cy I" bezeichnet.

Man versetzt die überstehende Flüssigkeit mit Magnesiumchlorid bis zu einer Konzentration dieses Salzes von 10 m. Hierdurch wird die Zusammenballung der noch in dieser überstehenden Flüssigkeit enthaltenen Ribosomen und ihre Abtrennung im Verlaufe der sich anschließenden Zentrifugierung während 1 Stunde bei 105 000 g begünstigt. Man erhält erneut einen geringen Zentri-

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fugenrückstand, der noch Ribosomen enthält und der im folgenden abgekürzt als "Cy II" bezeichnet wird. Die als "Cy III" bezeichnete überstehende Flüssigkeit enthält die nicht zentrifugierbaren löslichen Bestandteile der Zellen.

Die stärkste mitogene Wirkung besitzen die "rohe Zytoplasma-. fraktion" und die Fraktion "Cy I", unabhängig, ob diese Wirkung an Mäusen oder an Kaninchen nachgewiesen wird, wie es weiter unten hinsichtlich der pharmakologischen Eigenschaften angegeben ist.

Pharmakologische Eigenschaften der erfindunqsqemäßen Fraktionen: 1. Mitogene Eigenschaften

Die mitogenen Eigenschaften der verschiedenen erfindungsgemäßen Fraktionen manifestieren sich unter anderem in ihrer Fähigkeit, in nichtspezifischer Weise Lymphozytenzellen B des Knochenmarks zu stimulieren. Diese Wirkung kann durch die Fähigkeit von MiIz-Lymphozyten (von Mäusen oder Kaninchen) mehr Tritium-Thymidin (durch Inkorporation) zu absorbieren, als die Lymphozyten B der Kontrolltiere, nachgewiesen werden.

a) Lymphozytenkultur

Man trennt Lymphozyten aus der Milz von Mäusen oder Kaninchen nach der Methode von C. Bona et col. (Eur. J. Immun. 2, (1972) 434) ab.

Man benützt Mäuse des Stammes AKR mit einem Alter von 2 bis 3 Monaten und Mäuse des Stammes NUDE mit Thyminmangel, die im Laboratorium von C.IJ.R.S. in Orleans, Frankreich, gezüchtet werden und einer wilden Linie ohne Blutsverwandtschaft mit einer nackten Mutation angehören, die aus dem "Institut of Animal Genetics", Edinburgh, stammen, mit einem Alter von 4 bis 8 Wochen.

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Man verwendet ferner Milzzellen von Kaninchen des Stammes Bouscat, die ein Alter zwischen 4 und 6 Wochen besitzen und in dem Institut Pasteur, Garches, gezüchtet werden.

Dann züchtet man 1,5 χ 10 Milz-Lymphozyten von Mäusen während 48 Stunden bei 37°C in 1 ml eines Mediums, das unter der Bezeichnung RPMI-1640 (Eurobio) bekannt ist, das man mit 5 % Serum von Kalbsfeten (Flow-labs) versetzt hat.

Weiterhin züchtet man 2,5 χ 10 Milzlymphozyten von Kaninchen während 72 Stunden bei 37°C in 1 ml eines Mediums, das unter der Bezeichnung "Eagle-Medium" bekannt ist, das man mit IO % autologem Serum versetzt hat, das durch Erhitzen während 3O Minuten auf 56°C inaktiviert worden ist.

b) Inkorporation von Tritium-Thymidin

16 Stunden vor der Gewinnung der Zellen versetzt man jede Kultur mit l,u Ci H-Thymidin (1 Ci/mMol, Saclay, Frankreich). Am Ende der Inkubationszeit setzt man eine um den Faktor 1OO größere Menge nichtradioaktiven Thymidins zu. Nach dem Zentrifugieren während 10 Minuten bei 45Ο g trennt man die überstehende Flüssigkeit ab, fällt den Zentrifugenrückstand mit Trichloressigsäure und suspendiert erneut in üblicher Weise, bevor man eine Bestimmung mit Hilfe eines Szintillationszählers durchführt .

Wie aus der folgenden Tabelle I zu ersehen ist, besitzen sämtliche untersuchten erfindungsgemäßen Mittel eine mitogene Wirkung, die sich darin manifestiert, daß die Milz-Lymphozyten der untersuchten Tiere eine erhöhte Menge Tritium-Thymidin speichern. In der linken Spalte sind die verschiedenen Fraktionen angegeben. In den Spalten, die den Tieren entsprechen, von denen die untersuchten Lymphozyten gewonnen wurden, sind die Werte des Stimulationsindex angegeben, die man bei den Dosierungen (die in Klammern neben den entsprechenden Werten des Stinulationsindex angegeben sind) der untersuchten Mittel beobachtet hat. Es sei

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,11.

daran erinnert, daß der Stimulationsindex das Verhältnis der Radioaktivität der stimulierten Zellen der der Kontrollzellen darstellt.

TABELLE I

Art des Produktes	Mitogene Wirkung (Stimulationsindex)	Mäuse AKR	Mäuse NUDE	Kaninchen
"Rohe Zytoplasmafraktion" von N. rubra (gefrierge trocknetes Material) Cy I N. rubra Cy II N. rubra Cy III N. rubra Cy I N. opaca	6,64 (lOO.ug) 9,26 (100,Ug) 9,75 (l00_/Ug) 8,56 (lOO.ug) 2,01 (1_/Ug)	9,95 (lOO.ug) 9,53 (1O₇Ug)	4,28 (lOO.ug) 8,29 (100_/Ug) 6,85 (100_/Ug) 1,57 (10_/Ug) 2,84 (100,ug)

Wie aus der obigen Tabelle I zu ersehen ist, beobachtet man, daß sämtliche Fraktionen eine Steigerung der gemessenen Stimulationsindizes bewirken. Die von N. rubra abgeleiteten Mittel sind besonders wirksam. Dies trifft ganz besonders auf die "rohe Zytoplasmafraktion" von N. rubra und die Fraktion Cy I von N. rubra bei Dosierungen von lOO,ug zu, und zwar sowohl bei Mäusen als auch bei Kaninchen. Aufgrund der Tatsache, daß man an Mäusen des Stammes NUDE eine mitogene Wirkung beobachtet, entfalten die Produkte eine Wirkung auf die Lymphozyten B.

2^_Adjuvanseigenschaften

Man injiziert weiblichen Meerschweinchen des Stammes Hartley mit einem Gewicht von 300 bis 350 g in die Sohle einer jeden Hinterpfote eine Wasser-in-Öl-Emulsion aus gleichen Teilen

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einer Ovalbuminlösung (5O mg/ml in einer isotonischen Lösung) und entweder des vollständigen Freund'sehen Adjuvans (ACF) auf der Grundlage von Mycobacterium butyricum, oder des unvollständigen Freund'schen Adjuvans (AIF), die (mit Ausnahme des Kontrollpräparates) die untersuchten Fraktionen in Dosierungen enthält, die in der folgenden Tabelle II angegeben sind.

Die Adjuvanswirkung wird wie folgt bewertet:

a) Man bestimmt in dem Serum, das man 21 Tage nach der Injektion entnimmt, den Antikörpergehalt, ausgedrückt in.ug/ml des Serums, des Antigen-Antikörper-Niederschlags am Äquivalenzpunkt ;

b) man bestimmt die verzögerte Hypersensibilitat gegenüber Ovalbumin (in Dosierungen von 10 und 100 ,ug) an anderen Tieren durch eine Hautreaktion 4 Wochen nach der Injektion. Sie ist als Durchmesser (in mm) des Erythems (E), durch die Verhärtung (I) und die Nekrose (N) 48 Stunden nach der Injektion von Ovalbumin angegeben.

c) Man bewertet das Granulom an der Injektionsstelle.

Wie aus der folgenden Tabelle II zu ersehen ist, entfalten sämtliche untersuchten Fraktionen signifikante Adjuvanseigenschaften, die mindestens in der gleichen Größenordnung liegen wie die des vollständigen Freund'schen Adjuvans (ACF).

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TABELLE II

O CD OO CJ

untersuchte Fraktionen	Dosis Cug/Tier)	Tumor-Antikörpergehalt (ug/ml)	mittlere	Granulom an der Injektions stelle	Verzögerte Empfindlich keit gegenüber Ovalbumin bei Dosierungen von	100,ug
AIF	0	Anzahl der	Standardab weichung	+	10/ug	1 13 I
M. butyricum (ACF)	50	Tiere	764 + 103	4 - 5 +	8 I*	17/5*·
N. rubra Cy I	100	5	2968 + 369,40	4 - 5 +	14 I	15/3
N. rubra Cy II	100	5	3400 + 268	5 +	14 I	12 I
N. rubra Cy III	100	5	3876 + 658	3 - 4 +	10 I	13/2
"Rohe Zytoplasma- fraktion"von N. rubra (gefriergetrocknet)	100	5	2734 + 685	3 - 4 +	8 I	18 I
N. opaca Cy I	100	5	2728 + 651	3 - 4 +	12 I	16/4
5	2792 + 686	12 I
5

I = Verhärtung

Die erste Zahl steht für den Durchmesser des Erythems und die zweite für den Durchmesser des Nekrosebereiches (jeweils in mm). ι

σ> co ο

Aufgrund ihrer biologischen Eigenschaften sind die erfindungsgemäßen Mittel für verschiedene Anwendungszwecke geeignet, nämlich:

a) als biologische Forschungsreagentien, wo sie ein erhebliches Interesse finden, da sie die Stimulierung von Lymphozyten B in verschiedenen Tierarten, darunter Affen und sogar Menschen, ermöglichen;

b) als biologische Reagentien für medizinische Zwecke, wo sie ausgehend von Zellen von Lymphoidorganen die Diagnose des Immunitätsdefizits der betreffenden Zellen, die Antikörper bilden, ermöglichen;

c) zur vorbeugenden Behandlung: nach der Injektion des Produktes an Tiere beobachtet man eine globale, nichtspezifische Stimulation, die zu einer Steigerung des Gehaltes von Antikörpern führt, die gegen eine Vielzahl von Antigenen wirken;

d) als insbesondere wasserlösliche mitogene Mittel für die Heilbehandlung von Knochenmarksmangelerkrankungen, die durch Unfälle (beispielsweise durch Bestrahlung) oder durch andere Krankheiten (beispielsweise Myelosklerose) verursacht sind. Sie werden vorzugsweise durch Injektion in einem flüssigen, sterilen, injizierbaren Träger, wie einer isotonischen Salzlösung oder Glucoselösung, verabreicht.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Mittels mit gleichzeitg mitogenen Eigenschaften und/oder Adjuvans-Eigenschaften, das frei ist von Zellwandbestandteilen, ausgehend von Nocardiae, dadurch gekennzeichnet, daß man ganze Zellen von Nocardiae in einem wäßrigen Medium, insbesondere in destilliertem Wasser, einer Behandlung unterwirft, die ein Aufbrechen ihrer Zellwände bewirkt,

die nichtaufgebrochenen Zellen sowie die Fragmente der Zellwände der aufgebrochenen Zellen, insbesondere durch Zentrifugieren, abtrennt, und

die wäßrige Phase gewinnt, die das genannte Mittel mit mitogenen und Adjuvans-Eigenschaften enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von der genannten wäßrigen Phase, insbesondere durch differenzielles Zentrifugieren eine feste Phase mit mitogener Wirkung und Adjuvanswirkung abtrennt, die Bestandteile des Zytoplasmas, insbesondere Fragmente der Zytoplasmamembranen, der genannten Zellen enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung durch Zentrifugieren bei 48000 g bewirkt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man auch die wäßrige Phase gewinnt, die Mittel mit nichtspezifischen Immunitäts-Adjuvanseigenschaften und mitogenen Eigenschaften enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die zuletzt erwähnte wäßrige Phase, insbesondere bei einer Beschleunigung im Bereich von 100 000 g, einer Ultrazentrifugierung unterwirft, um die zentrifugierbaren von den nichtzen-

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ORIGINAL INSPECTED

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trifugierbaren Bestandteilen zu trennen, und sowohl die schließlich erhaltene wäßrige überstehende Flüssigkeit als auch den Zentrifugenrückstand gewinnt, wobei die überstehende wäßrige Flüssigkeit und der Zentrifugenrückstand gleichzeitig Adjuvanseigenschaften und mitogene Eigenschaften besitzen.

6. Mittel mit Adjuvanseigenschaften, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.

7. Mittel, das auch mitogene Eigenschaften besitzt, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.

8. Mittel mit mitogenen und Adjuvans-Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, daß es die Zytoplasmamembranen von Nocardiae oder Fragmente dieser Membranen enthält.

9. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff ein Mittel gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 zusammen rrit einem annehmbaren pharmazeutischen Trägermaterial, Bindemittel und/oder Hilfsstoff enthält.

10. Arzneimittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer injizierbaren Lösung des genannten Mittels in einer flüssigen Phase, insbesondere einer wäßrigen, isotonischen, sterilen und pyrogenfreien Lösung vorliegt.

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