DE2756032A1

DE2756032A1 - Neue praeparationen von mikroorganismen

Info

Publication number: DE2756032A1
Application number: DE19772756032
Authority: DE
Inventors: Joerg Dr Baumgarten; Werner Prof Dr Frommer; Douglas Marshall Dr Munnecke; Delf Dr Schmidt; Friedrich Dr Schmidt
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Genencor Inc
Priority date: 1977-12-15
Filing date: 1977-12-15
Publication date: 1979-06-21
Also published as: NL7808586A; JPH02299581A; FR2411889B1; CH645919A5; JPH0244507B2; IT7826758A0; IL55421A0; JPH043948B2; US4391887A; GB2010327A; DK349978A; GB2010327B; IT1098059B; JPS5484084A; FR2411889A1; BE870359A; DE2756032C2; IL55421A

Description

Bayer Aktiengesellschaft 2756032

Zentralbereich Patente, Marken und Lizenzen

5090 Leverkusen. Bayerwerk

Rt-Ma

Typ IVb

Neue Präparationen von Mikroorganismen

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Präparationen von Mikroorganismen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte.

Es ist bekannt, mit organischen Syntheseprodukten verunreinigte Abwässer in Kläranlagen nach dem Belebtschlamm-Verfahren abzubauen. Dabei werden die Abwässer in großen Becken belüftet, wobei eich im Laufe der Zeit bestimmte Mikroorganismen anreichern, die den gewünschten Abbau vornehmen. Es ist jedoch nicht möglich, aus den dabei erhaltenen Mikroorganismenmassen stabile Präparationen zu gewinnen, mit denen bestimmte Produkte abgebaut werden können, da die Abbauaktivität dieser Mikroorganismenmassen für diese Zwecke nicht ausreicht und zudem beim Aufarbeiten mindestens teilweise verloren geht.

Es ist außerdem bekannt, daß Backhefe bei der Teigbereitung Stärke bzw. Zucker abbaut. Es ist jedoch schwierig, diese Backhefen als Dauerpulver, z.B. als Trockenhefepulver, unter Erhalt ihrer vollen Aktivität haltbar zu machen. Auch Trockenbackhefe ist ohne wesentlichen Aktivitätsverlust nur

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im Vakuum oder unter Schutzgasatmosphäre haltbar (vgl. G. Reed et al, Yeast Technology, 1973 (West Port, Avi Publication Comp.).

Es ist ferner bekannt geworden, daß im Boden lebende Mikroorganismen insektizide Wirkstoffe, insbesondere Phosphorsäureester und Carbamate, abbauen (vgl. Ubersichtsartikel von J. Laveglia et al, Annual Review of Entomology 1977, 22, S. 483 ff. und die darin angegebenen Literaturstellen).

Es ist ferner bekannt geworden, daß Mischkulturen von Mikroorganismen zum Abbau von Insektiziden Wirkstoffen, wie Parathion, geeignet sind. Solche Kulturen sind jedoch verhältnismäßig inaktiv und nur schwierig zu handhaben. Präparationen, die bisher aus solchen Kulturen gewonnen wurden, waren selbst bei -18⁰C instabil und konnten nicht in fester Form hergestellt werden (vgl. Munnecke et al, Applied Environ, Microbiology 1976, 32, S. 7-13).

1) Es wurde nun gefunden, daß man neue lagerstabile Präparationen von Mikroorganismen, ausgehend von stabilisierten aktivierten Mischkulturen von Mikroorganismen, die zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte dienen, erhält, indem man die Kulturbedingungen einer auf übliche Weise angereicherten aktiven Mischkultur unter Zugabe des abzubauenden Produkts in üblicher Weise nach dessen Abbaugeschwindigkeit optimiert und diese Mischkultur unter den so ermittelten optimalen Bedingungen in mindestens zwei-

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maliger Passage in eine stabilisierte aktivierte Mischkultur überführt und die dabei erhaltene Kultur lagerstabilisiert, indem man sie unter Erhaltung ihrer Aktivität konserviert.

2. Es wurde ferner gefunden, daß die Herstellung der neuen lagerstabilen Präparationen, von Mikroorganismen ausgehend von stabilisierten aktivierten Mischkulturen von Mikroorganismen, im technischen Maßstab erfolgen kann, indem man stabilisierte aktivierte Mischkulturen, die wie unter 1. beschrieben hergestellt wurden,direkt oder soweit sie ohne Verlust ihrer Vitalität lagerstabilisiert worden sind, in Form ihrer Konserven als Impfgut verwendet und den technischen Ansatz bei den unter 1. angeführten Bedingungen durch fuhrt und die erhaltene Kultur unter · Erhaltung ihrer Aktivität schonend trocknet.

3. Es wurde ferner gefunden, daß man neue lagerstabile Präparationen von Mikroorganismen ausgehend von aktivierten Reinkulturen von Mikroorganismen, die zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte dienen, erhält, indem man aus der unter 1. erhaltenen Mischkultur auf üblicher Weise angewendeten Komplexmedien Einzelstämme anzieht, diese nach ihrer Aktivität selektioniert und die aktiven Stämme in üblicher Weise unter sterilen Bedingungen kultiviert, wobei das abzubauende Produkt im Substrat anwesend sein kann,und die erhaltene Kultur unter Erhaltung ihrer Aktivität schonend trocknet.

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ORIGJNAL IN6PECTED

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4. Es wurden ferner die neuen lagerstabilen Präparationen von Mikroorganismen, ausgehend von stabilisierten aktivierten Mischkulturen von Mikroorganismen, die zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte dienen und gemäß Verfahren 1 oder 2 erhalten werden, gefunden.

5. Es wurden ferner die neuen lagerstabilen Präparationen von Mikroorganismen, ausgehend von aktivierten Reinkulturen von Mikroorganismen, die zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte dienen und gemäß Verfahren 3 erhalten werden, gefunden.

6. Es wurden ferner neue Stämme von Mikroorganismen gefunden.

Es war überraschend, daß es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich war, zu lagerstabilen Präparationen aus Mikroorganismen zu kommen.Eine Stabilisierung solcher Präparationen war bislang nur durch Bindung solubilisierter Enzyme an Träger, z.B. Glas, gelungen (vgl. Munnecke, Applied Environm. Microbiology, 1977, 22' S 503 - 507). Bei diesem Verfahren treten jedoch hohe Aktivitätsverluste auf. Erst durch das erfindungsgemäße Verfahren war es möglich, auch unter technischen Bedingungen lagerstabile Präparationen aus Mikroorganismen herzustellen, die über lange Zeit ihre volle Aktivität behalten und einfach, schnell und preiswert angewendet werden können„ Es war überraschend, daß die Aktivität dieser Präparationen erhalten bleibt, ohne daß es erforderlich ist, die für die Aktivität verantwortlichen Enzyme zu isolieren.

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OWGlNAL INSPECTED

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Es war außerdem bekannt, daß Mischkulturen von Mikroorganis men in technischem Maßstab schwer handhabbar sind. Daher war es überraschend, daß eine stabilisierte aktivierte Mischkultur erhalten werden kann, die auch in technischem Maßstab handhabbar ist.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Zellpräparationen dienen zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte an Stellen, an denen diese unerwünscht sind. Sie können eingesetzt werden z.B. zur Behandlung von Abwässern, die bei der Produktion organischer Produkte anfallen, zur Reinigung von Transportbehältern sowie zur Beseitigung bzw. zum Unschädlichmachen von Verunreinigungen, die durch Unfälle hervorgerufen worden sind. Sie sind außerdem zur Haut- und Bodendekonlajnination geeignet.

Unter industriellen organischen Syntheseprodukten versteht man organische Verbindungen, die durch chemische Syntheseverfahren industriell hergestellt werden. (Es sollen darunter keine in industriellem Maßstab aus natürlichen Quellen stammende organische Verbindungen verstanden werden.) Zu den industriellen organischen Syntheseprodukten im erflndungsgemäßen Sinn zählen beispielsweise:

1) Pflanzenschutzmittel, besonders Insektizide, ferner Herbizide und Fungizide.

2) Fharmazeutika

3) Farbstoffe, besonders Azo- und Anthrachinonfarbstoffe

4) Organische Zwischenprodukte, besonders Monomere, die zur Polymerisation Verwendung finden, wie Nitrile sowie Hilfsstoffe bei der Kautschukherstellung , wie Sulfonsäuren sowie organische Lösungsmittel, wie Aromaten.

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909825/0255 ^{0RIGINALIN6PECTED}

Zu den Insektiziden gehören:

A) Carbamate und/oder

B) Carbonsäureester, einschließlich der Pyrethroide, und/oder

C) Phosphorsäureester und/oder

D) Cycloalkane und/oder

E) Halogenalkane Dazu gehören:

A) Carbamate der allgemeinen Formel

Λν-co-or³

R⁵

in welcher

R für Aryl, heterocyclische Feste oder Oximrest steht,

R für Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis k Kohlenstoffatomen steht und

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NACHC -REICHT

R³ für Alkyl, Alkylcarbonyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatorcen im Alkylrest, der gegebenenfalls auch durch Hydroxy oder Methylthio substituiert sein kann, oder den Rest -S-Z steht, wobei

Z für einen gegebenenfalls durch Halogen substituierten aliphatischen Rest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere CCl₃ und CF₃ sowie für einen gegebenenfalls bevorzugt durch Nitril, Halogen, insbesondere Chlor, Methyl, Trihalcgenmethyl, Trifluormethylinercapto oder Nitro substituierten Arylrest, insbesondere Phenyl, oder für Methoxycarbonyl oder für den Rest W-SO₉-N-

" R⁴

steht, wobei W für Alkyl, Halogenalkyl oder Alkylamino, Dialkylamino oder einen gegebenenfalls bevorzugt durch Halogen, Trihalogen, Nitril, Methyl oder Nitro substituierten Arylrest steht.

Besonders bevorzugt sind Carbamate, in denen

R für Phenyl oder Naphtyl steht, die gegebenenfalls substituiert sind durch Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Alky!mercapto oder Alkylthioalkylen mit jeweils 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Dialkylamino, Dialkenylamino mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen je Alkyl-bzw. Alkenylteil, Halogen, insbesondere Chlor, Dioxolanyl oder den Rest -N=CH-N(C, ,,-Alkyl) „ steht.

Weiterhin sind besonders bevorzugt Carbamate, in denen

R für 2,3-Dihydrobenzofuranyl, Benzodioxolyl, Benzothienyl, Pyrimidinyl oder Pyrazolyl steht, die gegebenenfalls durch

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C..-Alkyl, insbesondere Methyl, oder Dialkylar.ino mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen je Alkylteil substituiert sind.

Weiterhin sind besonders bevorzugt Carbamate, in denen R für einen Oximrest der allgemeinen Formal

^R
-N=C ^

steht, in welcher

R und R gleich oder verschieden sind und für Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy, Alkylmercapto, Alkoxycarbonyl, Carbonylair.id, Aikylmercaptoalkyl, mit jeweils bis zu 5 Kohlenstoffatomen, Nitril, Aryl, insbesondere Phenyl, einen gegebenenfalls substituierten heterocyclischen Rest oder für Alkyl, das durch einen heterocyclischen Rest substituiert ist oder gemeinsam einen gegebenenfalls durch C-.-Alkyl substituierten Dioxolanyl oder Dithiolanylrest stehen;

Besondere erwähnt seien folgende Carbamate 2-Methylphenyl-, 2-Äthylphenyl-, 2-n-Propylphenyl-, 2-Methoxyphenyl-, 2-Äthoxyphenyl-, 2-iso-Propoxyphenyl-, 4-Methylphenyl-, 4-Äthylphenyl-, 4-n-Propylphenyl-, 4-Methoxyphenyl-, 4-Äthoxyphenyl-, 4-n-Propoxyphenyl-, 3,4,5-Trimethylphenyl-, 1-Naphthyl-, 2,3-Dihydro-2,2-dimethyl-7-benzofuranyl-, 2-^T,3-Dioxolan(2)yl-phenyl7~ bzw. 2,2-Dimethyl-1,3-benzodioxol-(4)yl-N-methyl-carbamat und die entsprechenden -N-methyl-N-acetyl-, -N-methyl-N-trifluormethylthio-, N-methy1-N-dichlormonofluormethylthio- bzw. -N-methy1-N-dimethylaminothiocarbamate.

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I Nf- ... :." -Γ.ΙΙΙΟΗΤ

B) Carbonsäureester der allgemeinen Formel

R⁹
R⁸-CO-O-CH-R¹⁰

in welcher

R für Alkyl, Aralkyl, Aryl oder Cycloalkyl steht, die gegebenenfalls substituiert sein können und

R für Wasserstoff, Alkyl, Halogenalkyl, Alkenyl, Alkinyl oder Nitril steht und

R für Aryl oder einen Heterocyclus steht, oder ge-

meinsam mit R einen gegebenenfalls substituierten Cyclopentenonring bildet.

Besonders bevorzugt sind Carbonsäureester, in denen R für Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch gegebenenfalls substituiertes Phenyl substituiert ist, Cyclopropyl, das gegebenenfalls durch Alkyl, Alkenyl, Halogenalkyl oder Halogenalkenyl mit jeweils bis zu 6 Kohlenstoffatomen substituiert ist, oder für Phenyl, das gegebenenfalls substituiert ist, steht. Bevorzugt sind

α
Carbonsäureester, in denen R für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und bis zu 3 Halogenatomen, Nitril oder Äthinyl steht.

Weiterhin sind besonders bevorzugt Carbonsäureester, in denen R für Phenyl steht, das gegebenenfalls durch Cj,-Alkyl, Halogen, insbesondere Fluor oder Chlor, gegebenenfalls substituiertes Phenoxy; sowie gegebenenfalls substituiertes Benzyl substituiert ist, ferner für Furanyl, Tetrahydrophthalimido, Benzodioxolyl, die gegebenenfalls durch Halogen, insbesondere Chlor, Alkyl oder Alkenyl mit bis zu

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4 Kohlenstoffatomen oder Benzyl substituiert sind, steht, und ferner für Cyclopentenon steht, das gegebenenfalls durch C..-Alkyl, Furfuryl, C. _,--Alkenyl substituiert ist

Besonders erwähnt seien folgende Carbonsäureester

Essigsäure-/?-(3,4-dichlorphenyl)-2,2,2-trichloräthyl7~ ester, 2,3,4, S-Tetrahydrophthalimidomethylchrysanthernat und (5-Eenzyl-3-furyl)-methyl-2,2-dimethyl-3-(2-methylpropenyl)-cyclopropan-carboxylat.

C) Phosphorsäureester der allgemeinen Formel

X¹ X'-R¹

R¹¹ -X'-P

in welcher

X¹ unabhängig voneinander für O oder S steht und

Y¹ für O, S, -NH- oder für eine direkte Bindung zwischen dem zentralen P-Atom und dem Rest R steht und

11 12

R und R gleich oder verschieden sind und für

Alkyl oder Aryl stehen und

R für Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Aralkyl, Alkenyl,

Dioxanyl, oder einen Oximrest oder für den gleichen Rest steht, an den es gebunden ist.

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aene-

Besonders bevorzugt sind Phosphorsäureester, in

12
R und R gleich oder verschieden sind und für C_1-,-Alkyl oder Phenyl stehen,

R für Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steh-,

das gegebenenfalls durch Halogen, Hydroxyl, Nitril, gegebenenfalls substituiertes Phenyl, Carbonylamid, SuIfonylalkyl, SuIfoxyalkyl, Carbonylalkyl, Alkoxy, Alky!mercapto, Alkoxycarbonyl, substituiert ist, für Alkenyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch Halogen, gegebenenfalls halogensubstituiertes Phenyl oder Alkoxycarbonyl substituiert ist, oder für den Oximrest der allgemeinen Formel

-N=C

wobei R und R die oben angegebene Bedeutung besitzen, insbesondere jedoch für Cyan oder Phenyl stehen,

R steht ferner für Dioxanyl, das durch denselben

Rest substituiert ist, an den R gebunden ist, oder R steht für den gleichen Rest, an den er gebunden ist, oder R steht für Phenyl, das ge gebenenfalls durch Methyl, Nitro, Nitril, Halogen, Methylthio substituiert ist; R steht außerdem besonders bevorzugt für gegebenenfalls durch C₁ .-Alkyl, Halogen substituierte Heteroaromaten, wie Pyridin, Chinolin, Chinoxalin, Pyrimidin, Diazinon, Benzo-1,2,4-triazin.

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I NACH-3-r.ElCHTJ

Besonders erwähnt seien folgende Phosphorsäureester O,O-Dimethy1- bzw. O,O-Diäthyl-0-(2,2-dichlor- bzw. 2,2-Dibromvinyl)-phosphorsäureester, 0 O-Diäthyl-0-(4-nitro-phenyl)-thionophosphorsäureester (= Parathion) , 0,O-Dimethy 1-0- (3-methyi-4-ni~thylthio) thionophosphorsäureester, 0, O-Dimethy 1-0- (3-me thy 1-4 -nitro) -thior.ophcsph ensäureester, O-Äthyl-S-n-propyl-O-(2,4-dichlorphenyl)-thicnophosphorsäureester, O-Äthyl-S-n-propyl-O-(4-methylthio-phenyl)-thionophcsphorsäureester, 0,0-Diir,ethyl-S-/4-oxo-1 , 2 , 3-bcnzotriazin (3) yl-r.ethyi?- thionothiolphosphorsäureester, O-Methyl-O-Z^-iso-propyl-G-methoxy-pyrimidin(4)yl7~thionomethanphosphonsäureester, 0,O-Diäthyl-0-/2-iso-propyl-6-methyl-pyrimidin(4)yl/-thionophosphcrsäureester, 0,0-Diäthyl-0-/3-chlor-4-methyl-cumarin(7)yl7-thionophosphorsäureester, 0,0-Dimethy1-2,2,2-trichlor-1-hydroxy-äthan-phosphonsäureester, 0,O-Dimethy1-S-(methylcarbamoylmethyl)-thionophosphorsäureester,

D) Cycloalkane der Formel

Hai Hal J^ Hai

in welcher Hai Halogen, vorzugsweise Chlor, bedeutet.

Besondere erv/ähnt sei 1 , 2 , 3, 4, 5 , 6-Hexachlorohexan.

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E) Haloqenalkane dor Formel

In welcher

Hal¹ fUr Chlor oder Brom R für Wasserstoff oder Hydroxyl,

R¹⁵ und R gleich oder verschieden sind und für Halogen, Alkyl oder Alkoxy und

R¹^ für Wasserstoff oder Halogen stehen. Besonders bevorzugt sind Halogenalkane, in denen R Wasserstoff oder Hydroxyl bedeutet,

R¹⁵ und R¹⁶ für gleiches Halogen, Alkyl bzw. Alkoxy mit 1 bis U Kohlenstoffatomen Je Alkyl- bzw. Alkoxyrest stehen und

R Halogen bedeutet.

Besonders zu erwähnen seien folgende Halogenalkane

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1,1,1-Trichlor-2,2-bis-(4-chlor- bzw. 4-methoxyphenyl)-äthan, 1,1,1 -Trichlor^-hydroxy^, 2-bis-(4-chlorphenyl)-äthan und 1,1-Dichlor-2,2-bis-(4-äthylphenyl)-äthan.

Zu den abzubauenden Farbstoffen gehören: Anthrachinonfarbstoffe, Azofarbstoffe, Methinfarbstoffe, Phenoxazinfarbstoffe, Triphenylmethanfarbstoffe.

Zu den abzubauenden organischen Zwischenprodukten gehören: Die einfachen Nitrile wie Acetonitril, Isobutyronitril, die Nitrile mit einer Aminogruppe in Ov,-Stellung, z.B. jr -Aminopropionitril, di-^mino-Ϋ -methylthiobutyronitril, /-Aminobutyronitril, Amino-acetonitril, die Nitrile mit ^einer Hydroxyl-Gruppe in OL-Stellung, z.B. Milchsäurenitril, Hydroxyacetonitril,o^-Hydroxy- / -methylthiobutyronitril, die Nitrile mit einer Aminogruppe in ß-Stellung, z.B. Amino-3-propionitril, die Dinitrile wie Malonsäurenitril, Bernsteinsäurenitril, Adipinsäurenitril, dieo£-ungesättigten Nitrile wie Acrylnitril, Methacrylnitril, die^C-Aryl-Nitrile wie Homoveratronitril, Benzonitril, die heterocyclischen Nitrile wie Nicotinsäurenitril, Isonicotinsäurenitril.

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Weiter gehören zu den organischen Zwischenprodukten: Acet(yl)gammasäure, Acet(yl)-H-Säure, Acet(yl)-I-Säure, Acet(yl)-K-Säure, Alensäure, Alphanaphthoesäure, Alphanaphthylsäure, Alphamin, Alphaoxynaphthoesäure, Alphasäure, Amido-E-Säure, Amino-C-Säure, Aminochicagosäure (148), Aminocroceinsäure, Aminoepsilonsäure, Amino-F-Säure, Amino-G-Säure, Amino-Geigy-Säure, Amino-I-Säure, 2,3-Aminonaphthol, Amino-

naphthol(säure) R, Amino-R-Säure, Amino-R,R-Säure, Amino-Schäffer-Äher(säure), Amino-Schäffersäure, Andre sensäure, Armstrongsäure, Äthylbetanaphthamin, Äthylchromotropsäure, Azurinbase, Azurinsäure, B-Säure, Badische Säure, Bayer-Säure, Benzolsulfogammasäureester, Benzolsulfo-R-R-Säure, Benzoyl-H-Säure, Benzoyl-I-Säure, Benzoyl-K-Säure, Betanaphthoesäure, Betasäure, Böniger Säure, Brönnersäure, C-Säure, Casella'sche Säure, Chicagosäure SS, Chromotropsäure (4G bzw. C), Clevesäure-1,6 bzw. 1,7, Columbiasäure, Croceinsäure, D-Säure, Dahl'sche Säuren, Deltasäure, Diaminogensäuren, Dimethylgammasäure, Dinah-Säure, Dinol, Dioxychicagosäure, Dioxy-F-Säure, Dioxy-G-Säure, Dioxy-I-Säure, Dressel-Säure, Ε-Säure, Eikonogen, Epsilonsäure, F-Säure, Flaviansäure, Freund'sehe Säure 136, Freund'sehe Säure 137, G-Säure, Gammasäure, Geigy-Säure, Η-Säure, H-Säureester, Η-Säure-SuIfamid, I-Säure, I-Säure-Harnstoff, I-Disäure, Imidazol-I-Säure, Iso-Columbiasäure, Iso-I-Säure, Isoneusalz, K-Säure, Koch'sehe Säure, L-Säure, Laurentsäure, M-Säure, Melansäure, Metazolsäure, Methylamino-F-Säure, Methylbetanaphthamin, Methylparazol-I-Säure, Meyer-Landshoff-Säure, Musizin, Naphthalindisäure F, Naphthalinsalz, Naphthamindisäure 147, Naphthamindisäure 157, Naphthaminsäure 13, Naphthamintrisäure 1247 bzw. 1248, Naphthamintri-

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säure 2157,Naphthamintrisäure K, o-Naphthionsäure, Naphthionsäure, Naphtholdisulfonsäure C, Naphtholdisulfonsäure F, Naphtholdisulfonsäure S, Naphtholgelb, Naphthol-I-Säure, Naphtholsäure 13, Naphtholsäure FF, Naphtholsäure P, Naphtholsäure S, Naphtholsulfonsäure 21, Naphtholtri (sulfon)säure RR, Naphtholtri(sulfon)säure T, Naphthylamindisulfonsäure I, Naphthylamindisulfonsäure S, Naphthylensäure 125, Nekal BX, Neusalz, Nevile-Winther-Säure, Nitrotinsäure, Nitrodiazoamidolsäure, Nitrodiazo-Böniger-Säure, Nitroso-R-Säure, o-Naphthionsäure, (5-)Oxy-C-Säure, Oxychicacosäure, Oxy-Koch'sehe Säure, Oxy-L-Säure, Oxynaphthoesäure 21, 8-Oxynaphthylsäure, Oxy-R-Säure, Oxy-Tobiassäure, Paradurol, Parazol-I-Säure, Patrol-I-Säure, Perisäure, Phenylgammasäure, Purpurinsäure, Purpurol, Purpurölsäure, R-Säure, 2R-Säure, R.G.-Säure, Rhodulinsäure, RM-Säure, Rotsäure I, RR-Säure, Rudolf und Gurke, Säure von- , SS-Säure, Säure IV, Säure von Rudolf und Gurke, Schaffersäure, Schaffer-K-Säure, Scheidesalz, Schöllkopfsäure, Sulfamidinsäure, Sulfäthy1gammasäure, Sulfogammasäure, Sulfo-I-Säure, Sulfonaphthylsäure 6, Sulfonaphthylsäure 8, Schwarzsäure, T-Säure, Tetrasäure, Tobiassäure, Trioxy-R-Säure, Trisalz, Violettsäure (N), W-Säure , ferner Phenol, Nitrophenol, Chlorphenole, Chlornitrophenole, Benzol, Chlorbenzole, Aniline.

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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der neuen Präparationen geht entweder von neuen oder von bekannten Mischkulturen von Mikroorganismen aus, die die Eigenschaft haben, bestimmte organische Syntheseprodukte abzubauen.

Zu neuen Nischkulturen gelangt man, indem man Proben aus Böden, Belebtschlämmen von Kläranlagen, Oberflächenwässern oder Oberflächen, die unter nichtsterilen Bedingungen ständig mit den abzubauenden Produkten in Berührung kommen (z.B. Wände und Böden von Produktionsbetrieben) entnimmt und mit den abzubauenden Produkten unter üblichen Bedingungen kultiviert. Die Anzucht wird dabei in mehreren Passagen solange wiederholt, bis man zu einer aktiven Mischkultur gelangt, die das abzubauende Produkt spalten kann. Die Anzucht kann aber auch kontinuierlich unter Verwendung des abzubauenden Produkts im Substrat erfolgen.

Solche Mischkulturen können aus Protozoen, Algen, Blaualgen, Hefen, Pilzen und/oder Bakterien bestehen. Besonders bevorzugt sind Mischkulturen aus Pilzen und/oder Bakterien.

Zu den Pilzen gehören:

Myxomyceten, Acrasiales, Phycomyceten, Ascomyceten und Hefen, Basidiomyceten sowie Deuteromyceten.

Zu den Bakterien gehören:

Phototrophe Bakterien wie Rhodospirillaceae, Chromatiaceae, Chlorobiaceae. Kriechende Bakterien wie Myxococcaceae, Archangiaceae, Cystobacteriaceae, Polyangraceae, Cystophagaceae, Beggiatoaceae, Simonsiellaceae, Leucotrichaceae. Scheidenbakterien wie 3?haerotilus, Leptothrix, Streptothrix. Knospende und gestielte Bakterien wie Hyphomicrobium, Hyphomonas, Pedomikrobium, Caulobacter, Gallionella, Nevskia. Spiralige

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Bakterien wie Sperillaceae. Außerdem: Achromatiaceae, Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae, Rhizobiaceae, Methylomonadaceae, Halobacteriaceae, Alcaligenes, Acetobacter, Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Zymomonas, Chromo bacterium, Flavobacterium, Haemophilus, Actinobacillus, Streptobacillus, Desulfovibrio, Selenomonas, Neisseriaceae, Aclnetobacter, Nitrobacteraceae, Thiobacillus, Thiobacterium, Siderocapsaecaea, Methanobacteriaceae, Micrococcaceae, Streptococcaceae, Peptococcaceae, Bacillaceae, Lactobacillaceae, Corynebacterium , Arthrobacter, Cellulomonas, Kurthia, Propionibacteriaceae, Actinomycetales, Mycobacteriaceae, Actinoplanaceae, Nocardiaceae.

Für die so erhaltenen aktiven Mischkulturen werden nun die für den durchzuführenden Abbau optimalen Kulturbedingungen bestimmt.

Dabei ist es erforderlich folgende Parameter abzustimmen:

1. Temperatur

2. pH-Wert

3. Sauerstoffpartialdruck

4. Mineralsalzgehalt zur Regulierung des Angebotes an Stickstoff, Phosphor, Schwefel, Calcium, Eisen, Schwermetallen etc.

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5. Dosierung des abzubauenden Produkts, sowohl mengenmäßig als auch kontinuierlich oder diskontinuierlich.

6. Kulturdauer

7. Rührgeschwindigkeit

8. Formulierungshilfsmittel für das abzubauende Produkt, insbesondere bei schwerlöslichen Produkten .

Zur Feststellung der optmalen Kulturbedingungen werden nun diese Parameter sowohl einzeln als auch in ihren Kombinationen variiert und ständig die Aktivität beim Abbau des abzubauenden Produkts kontrolliert. Die dabei ermittelten Kulturbedingungen der einzelnen Parameter liegen in folgenden Bereichen:

1. Temperatur 10 - 7O°C

2. pH-Wert 1-10

3. Sauerstoffkonzentration 0-48 mg/1

4. Phosphatgehalt PO₄'³"' 0,01 - 10 g/l Stickstoffhaltige Salze (als NH₄Cl) 0-50 g/l Magnesium (als MgSO₄) 0,01 - 2 g/l

Eisen (als Salz) 0,01 - 0,1 g/l
Calcium (als CaCl₃) 0,01 - 0,1 g/l Spurenelemente wie z.B. Cu, Co, Mn, Zn, Ba u.a.

5. Das abzubauende Produkt wird entweder mit wachstumsbegrenzender Konzentration oder im Überschuß zugesetzt. Es kann auch bei wachstumsbegrenzender Konzentration kontinuierlich mit einer dem Wachstum angepaßten Fließrate zugesetzt werden.

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6. Die Kulturdauer liegt zwischen 5 Stunden und 14 Tagen,

7. Rührgeschwindigkeit im Labormaßstab zwischen O und 1500 Umdrehungen pro Minute.

8. Als Emulgier- und Dispergiermittel dienen beispielsweise nichtionogene und anionische Emulgatoren, wie Polyoxyäthylen-Fettsäure-Ester, Polyoxyäthylen-Fettalkohol-Äther, z.B. Alkylaryl-polyglykol-äther, Alkylsulfonate, Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Eiweißhydrolysate, z.B. Lignin-SuIfitablaugen und Methylcellulose.

Durch die Kombination dieser Maßnahmen wird die Mischkultur so weit stabilisiert, daß unsteriles Arbeiten ermöglicht wird, ohne daß eine Aktivitätsminderung eintritt.

Die aktiven Mischkulturen werden dann unter den ermittelten optimalen Kulturbedingungen in mindestens zwei, im allgemeinen zwischen 2 und 50, Passagen in eine stabilisierte aktivierte Mischkultur übergeführt.

Dabei werden in relativ kleinem Naßstab (geringes Ansatzvolumen) so viele Passagen durchgeführt wie erforderlich sind, um eine Mischkultur zu erhalten, bei der in weiteren Passagen keine Steigerung der den Abbau organischer Syntheseprodukte bewirkenden Eigenschaften mehr stattfindet. Bei der so erhaltenen Mischkultur spricht man von einer stabilisierten aktivierten Mischkultur.

Die so erhaltenen stabilisierten aktivierten Mischkulturen werden lagerstabilisiert. Dies kann gesehen, indem man die Kultur einfriert oder schonend trocknet,

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z.B. durch Lyophilisation, Entwässerung mit organischen Lösungsmitteln, Sprühtrocknen oder durch Zugabe konservierender Chemikalien wie Zitronensäure, Benzoesäure, Ameisensäure, Salizylsäure, Zucker oder Kochsalz haltbar macht.

Eine bevorzugte Form der Lagerstabilisierung, vor allem im großtechnischen Maßstab,ist es, die Mikroorganismenmasse von der Kulturbrühe abzutrennen und durch Lyophilisation oder durch Entwässern mit organischen Lösungsmitteln zu trocknen.

Wählt man eine Form der Lagerstabilisierung der wie oben beschrieben erhaltenen stabilisierten aktivierten Mischkultur, bei der die Vitalität nicht verlorengeht, kann sie als Impfgut für weitere z.B. großtechnische Ansätze aufbewahrt und verwendet werden. Solche Arten der Lagerstabilisierung ohne Verlust der Vitalität sind z.B. Einfrieren der KulturbrUhe und Aufbewahren bei Temperaturen unter O⁰C, mit und ohne Zusatz von Schutzstoffen wie z.B.Glycerin oder Dimethylsulfoxid, Lyophilisation oder Konservierung in flüssigem Stickstoff. Die so erhaltenen Konserven von stabilisierten aktivierten Mischkulturen können dann jederzeit als Impfgut für großtechnische Ansätze verwendet werden.

Solche großtechnischen Ansätze erfolgen batch-weise in üblicher Weise unter den oben angegebenen optimalen Bedingungen, wobei als Impfgut die wie oben beschrieben erhaltene stabilisierte aktivierte Mischkultur direkt bzw. in Form ihrer Konserven eingesetzt wird.

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Bei der Kultivierung der stabilisierten aktivierten Mischkulturen im großtechnischen Maßstab kann es vorteilhaft sein, das abzubauende Produkt je nach Eigenschaften entweder direkt oder in Form einer Formulierung, die eine gute gleichmäßige Vermischung des Produktes im gesamten Ansatz erlaubt, oder zusammen mit geeigneten Emulgier- bzw. Dispergiermitteln einzusetzen.

Aus den wie oben beschrieben erhaltenen stabilisierten aktivierten Mischkulturen lassen sich auf übliche Weise durch Auslese nach ihrer spaltenden Aktivität Reinkul turen gewinnen (vgl. Methods in Mikrobiology, Band 3a, Seiten 305-361, Band 3b, Seitei 1-329, Band U, Seiten1-460). Es wurden so z.B. die Stämme DSM 1192 und DSM 1193 isoliert.

Die so erhaltenen Reinkulturen können in üblichen Nährmedien kultiviert werden. Das abzubauende Produkt kann dabei im Substrat anwesend sein oder als Induktor in geringen Konzentrationen dem Substrat zugesetzt sein,oder es kann in einzelnen Fällen ganz darauf verzichtet werden.

Aus den so erhaltenen Reinkulturen kann entweder durch Lagerung unter Erhalt der Vitalität Impfgut für weitere Ansätze gewonnen werden oder die Mikroorganismenmasse von der KulturbrUhe abgetrennt und schonend getrocknet werden, um zur erfindungsgemäßen Präparation gemäß 5. (oben) zu gelangen. Die Trocknung erfolgt dabei wie bereits bei Erhalt der erfindungsgemäßen Präparation aus stabilisierten aktivierten Mischkulturen beschrieben.

Auch die Reinkulturen können wie oben beschrieben im großtechnischen Maßstab batch-weise kultiviert werden.

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Im Folgenden sei die vorliegende Erfindung am Beispiel einer Präparation zum Abbau insektizider Wirkstoffe, bevorzugt phosphorhaltlger Wirkstoffe, insbesondere Parathion, erläutert:

Mischkulturen zum Abbau phosphorhaltiger Wirkstoffe, insbesondere Parathion, sind bekannt (vgl. Munnecke et al., Applied Microbiology, 1974, 28, S. 212-217).

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann daraus eine stabilisierte aktivierte Mischkultur erhalten werden. Dazu arbeitet man in mindestens 2 Passagen unter folgenden Bedingungen:

In einem Temperaturbereich zwischen 20 und 35⁰C, bevorzugt zwischen 24 und 30⁰C, besonders bevorzugt zwischen 25 und 28⁰C.

Zu einem pH-Bereich zwischen 6.5 und 9.0, bevorzugt zwischen 7.5 und 7.9» insbesondere zwischen 7.5 und 7*6.

Bei der Kultur wird kontinuierlich der abzubauende phosphorhalt ige Wirkstoff als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle mit einer dem Wachstum angepaßten diskontinuierlichen Fließrate so zugeführt, daß die Konzentration des Wirkstoffs nicht über 10 DiDm und des Spalt Produktes p-Nitrophenol nicht über 30 ppm steigt. Durah die Kombination dieser Maßnahmen wird die Mischkultur so stabilisiert, daß unsteriles Arbeiten ermöglicht wird, ohne daß sich die wirkstoffabbauende Aktivität ändert.

Die so gewonnenen Mischkulturen sind als Impfgut für neue Fermentationen verwendbar und bei -18°C ohne

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Vitalitätsverlust über lange Zeit haltbar. Die durch diese Maßnahmen erhaltenen Aktivitätsausbeuten liegen für Parathion um den Faktor 10-20 höher als die, der dem Stand der Technik entsprechende Kultur. Gewinnt man aus so gewonnenen Fermentationen durch geeignete Trocknung, z.B. Lyophilisation, Präparate, so ist deren Aktivität, bezogen auf mg Protein, um den Faktor 10 höher als die bisher beschriebenen, überraschenderweise sind derartige Präparate auch ohne Bindung an einen Träger über lange Zeit auch bei Raumtemperatur haltbar.

Aus solchen Mischkulturen können Reinkulturen isoliert werden, die phosphorhaltige Wirkstoffe, insbesondere Parathion, abbauen.

Solche Reinkulturen können überraschenderweise in gebräuchlichen Komplex- Nährmedien, z.B. Hefeextrakt, ohne zusätzlichen phosphorhaltigen Wirkstoff als Wachstumssubstrat und phosphorhaltige Wirkstoffe spaltender Aktivator kultiviert werden. Ihre den Abbau phosphorhaltiger Wirkstoffe bewirkende Aktivität bleibt überraschenderweise erhalten.

Aus diesen Reinkulturen kann ebenfalls durch schonende Trocknung, z.B. Lyophilisation der Biomasse zu einem technisch geeigneten hochaktiven Streupulver gelangen. Dieses Pulver ist im Gegensatz zu den bisher verwendeten Enzymlösungen selbst bei Raumtemperatur über Jahre haltbar. Durch Behandlung einer wässrigen Suspension dieses Präparates mit organischen Lösungsmitteln oder Detergentien kann man zu stabilen voll wasserlöslichen Enzympräparationen gelangen. Zur Darstellung des löslichen Enzympräparats kann man auch direkt von feuchten Zellen ausgehen, die mit organischen Lösungsmitteln bzw. Detergentien behandelt werden.

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Soll eine Parathion-abbauende Präparation gewonnen werden, wird ausgehend von der oben erwähnten bekannten Mischkultur (s.loc.cit.) im einzelnen wie folgt vorgegangen:

1. FUr die Aktivierung der bekannten Mischkultur nimmt man anorganische Stickstoff enthaltende Salze wie z.B. (NH^)₂SO₄ und übliche Nährsalze enthaltendes Medium. Die Konzentration dieser Stoffe kann in weiten Grenzen schwanken. Bevorzugt werden Konzentrationen in den Bereichen:

MgSO₄	0.05 -	0.2 g/l
CaCl₂	0.01 -	0.05 "
(NH₄J₂SO₄	0.1 -	1.0 "
Eisensalze	0.001 -	0.01 "
K₂HPO₄	0.5 -	5.0 "
KH₂PO₄	0.1	1.0 "

Der pH-Wert wird durch Pufferlösung zwischen 6.5 und 9.0» insbesondere mit Phosphatpuffer auf 7.5 - 7.9 gestellt. Besonders günstig ist es, den pH-Wert durch Zugabe von NaOH auf pH 7.6 konstant zu halten. Solche Lösungen werden mit Zellen aus Konserven beimpft. Die Impfmenge kann in weiten Grenzen schwanken. Optimal sind 0.1 - 5.0 g, besonders 0.5 - 1.0 g Zelltrockenmasse Je 10 1 Kulturlösung. Diese Kulturen werden bei 20 - 37°C bevorzugt bei 24 - 30°C inkubiert, wobei 25 - 28°C einen besonders bevorzugten Temperaturbereich darstellt.

Für die Anzucht der Mischkultur wird das Parathion mit einer Pumpe kontinuierlich so dosiert, daß während der Fermentation kein oder nur Spuren von Nitrophenol (Spaltprodukt aus Parathion) nachweisbar sind. Die Dosierungsmenge pro Stunde richtet sich nach dem Wachstum der Kultur und wird der Konzentrationserhöhung der Biomasse entsprechend ständig

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erhöht. Es werden z.B. anfangs 0.1 ml pro Stunde und zuletzt 0.75 ml Parathion pro Stunde einer 10 Ltr.-Kultur zugeführt, wobei die Parathionkonzentration im Fermenter stets unter 10 ppm bleiben soll. Die Fermentationsdauer beträgt 5-7 Tage, vorzugsweise 6 Tage. Bei einem Verbrauch von 50 ml reinem Parathion werden Zelldichten von etwa 1 g Trockengewicht pro Liter Kulturmedium erreicht.

Bei Fermentationsansätzen, bei denen nur mit geringen Durchmischungsraten gearbeitet werden kann, empfiehlt sich der Einsatz einer Parathionformulierung als Kohlenstoffquelle, durch die eine bessere Verteilungsgeschwindigkeit im Fermenter erzielt wird. Es können z.B. Formulierungen mit organischen Lösungsmitteln und Emulgatoren eingesetzt werden. Eine geeignete Formulierung ist z.B.:

3 Teile Isopropanol

1 Teil Parathion

0.01 " Alkylarylpolyglykoläther

Die Phosphorsäureester-spaltende Aktivität der auf diese Weise gewonnenen KulturbrUhen liegt bei etwa gleicher Fermentationsdauer und Parathiondosierung um 50 - 100 % höher als bei Kulturen, die mit reinem Parathion angezogen werden.

Zur Herstellung einer aktiven Zellkultur aus Reinkulturen verwendet man am besten übliche Komplexmedien, z.B. Hefeextrakt-, Hefeautolysat- oder Fleischextrakt-Medien. Zusätzlich können noch andere Kohlenstoffquell,en wie organische Säuren, z.B. Succinat, aber auch Nitrophenol, gegeben werden. Die Fermentationszeit bei gleichen oder wesentlich erhöhten Aktivitätsausbeuten verkürzt sich bei Verwendung von Reinkulturen wesentlich gegenüber den Fermentationen mit Mischkulturen und Parathion als organische Kohlenstoffquelle. Die Verwendung der Reinkulturen zur Herstellung von P-Ester spaltenden Zellpräparationen erfordert jedoch steriles Arbeiten.

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Die Endpunkte der Fermentationen ergeben sich aus den Zunahmeraten der Phosphorsäureester-spaltenden Aktivität der Kultur. Die Kultur wird abgebrochen, wenn keine deutliche Zunahme der Aktivität mehr meßbar ist.

Zur Herstellung von Phosphorsäureester-spaltenden Präparationen wird die Mikroorganismenmasse durch Zentrifugation gewonnen. Sie wird z.B. in 1/10 bis 1/20 des Ausgangsvolumens dest. aufgenommen und durch Rühren homogen verteilt. Die Suspension wird erneut zentrifugiert, der überstand verworfen und das Sediment erneut in z.B. 1/50 - 1/100 des Ausgangsvolumens dest. Wasser aufgenommen. Man friert diese Suspension ein und lyophilisiert sie anschließend. Das erhaltene Trockenprodukt ist wasserunlöslich, aber gut suspendierbar. Es enthält die gesamte phosphorsäureesterspaltende Aktivität.

Eine einfachere Methode der Trocknung, die jedoch mit gewissen Aktivitätseinbußen verbunden ist, ist die Entwässerung des mit dest. H₂O gewonnenen Mikroorganismensediments durch zweimalige Extraktion mit z.B. 10 Volumenteilen (bezogen auf das gepackte Zellvolumen) organischen Lösungsmitteln, insbesondere mit Aceton oder Äthanol. Das entwässerte Mikroorganismensediment wird dann bei 20 - 30°C im Vakuumtrockenschrank bei 20 Torr getrocknet.

nerscexxuny exnes tiucKeuen, duex wdäsezxusxxcnen tnzympräparates geht man am besten von einer Suspension frischer oder eingefrorener und aufgetauter Mikroorganismenzellen in Wasser oder Puffer (z.B. 0,1 m, pH 6 - 9) aus. Es kann aber auch eine entsprechende Suspension lyophilisierter Mikroorga-

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nismenzellen verwendet werden. Die Mikroogranismenzellsuspension wird mit 1 - 5 % einer oberflächenaktiven Substanz, wie z.B. Na-Desoxicholat, Triton X 100 etc. oder mit 2-10 Vol-% Butanol, bei 25 - 27°C 0,5 bis 8 Stunden inkubiert, der Ansatz anschließend zentrifugiert und der überstand direkt (bei Butanol als stabilisierendem Agens) oder nach vorheriger Dialyse gegen dest. Wasser (bei Verwendung der obenflächenaktiven Substanzen) lyophilisiert. Die erhaltenen Testpräparate enthalten etwa 50 % der eingesetzten Aktivität, ihre spezifische Aktivität ist 2-3 mal so hoch wie die des verwendeten Ausgangsmaterials, und sie sind in Wasser oder Puffer klar löslich.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern ohne eine Einschränkung ihrer universellen Durchführbarkeit zu geben. Dies geschieht anhand von Parathion-abbauenden Mikroorganismen.

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Test zur Bestimmung der parathionabbauenden Aktivität Beispiel 1

Benötigt werden ein 0,1 m Kaliumphosphatpuffer pH 8,2, eine 10 %ige Lösung von Aryloxypolylglykoläther in Wasser sowie eine 1 %ige Lösung von Parathion in Äthanol. Zur Herstellung der Substratlösung werden 50 ml Pufferlösung unter Rühren mit 0,3 ml der wäßrigen Emulgatorlösung versetzt, dann werden langsam 2 ml der äthanolischen Parathionlösung hinzugegeben.

Zur Testung gibt man in eine auf 25 C temperierte Küvette 2,4 ml obiger Substratlösung. Die gleiche Substratlösung dient auch als Leerwert. Nach Temperierung gibt man in die Leerwertküvette lOO.ul Pufferlösung, in die Meßküvette 100,Ul der zu testenden Enzymlösung, Suspension oder Kulturbrühe, letzere nach Vorbehandlung mit Toluol (s.u.), registriert die Extinktionsänderung bei 410 nm und rechnet auf gebildete ,uMol Paranitrophenol bzw. gespaltenes Parathion um.

1 Enzymeinheit /U/ ist definiert als Spaltung von 1^uMoI Parathion pro Minute bzw. die Freisetzung von 1,uMol Paranitrophenol pro Minute unter obigen Testbedingungen.

Zur Testung von frischen Zellen in der Kulturlösung oder frischen Zellsuspensionen müssen diese zunächst aufgeschlossen werden. Dazu versetzt man die zur Prüfung kommende Probe mit 0,2 % Toluol und inkubiert unter Umschütteln 30 Minuten bei 30°C. 10 bis 100,ul der derartig vorbehandelten Probe werden getestet. Bei lyophilisierten bzw. eingefrorenen und wieder aufgetauten Zellen ist die Toluolbehandlung überflüssig und bringt keine Aktivitätsänderung der zu prüfenden Probe.

Bei den folgenden Beispielen wird die Aktivität in U wie oben bestimmt angegeben.

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Ιο,	0	g
ο,	6	g
4,	0	g
looo		ml
3,	0	g
looo		ml

Beispiel 2

Herstellung einer aktivierten, stabilisierten Mischkultur aus der nach dem Stand der Technik bekannten P-Ester-spaltenden Mischkultur

Zur Herstellung einer aktivierten, stabilisierten Mischkultur wurden zunächst folgende Stammlösungen angesetzt:

Stammlösung 1 IM K-Phosphatpuffer pH 7,6

Stammlösung 2 Ammoniumsulfat

Calciumchlorid Magnesiumsulfat Wasser

Stammlösung 3 Eisen II Sulfat

Wasser

Stammlösung 4 übliche Spurenelementelösung

Zur Anzucht wurde ein Mineralsalz-Medium verwendet, das in Io Ltr. Wasser

loo ml Stammlösung 1

2oo ml " 2

Io ml " 3 und 4 enthielt.

Als Ausgangskultur diente die von Munnecke et al in Applied Microbiology 1974, 28, S. 212-217 beschriebene parathionspaltende Mischkultur.

Die Anzucht der Kultur wurde in einem 10 Liter Fermenter mit 9 Liter Mineralmedium durchgeführt. Es wurde mit 1 g Biomasse (bezogen auf das Trockengewicht) der aktiven Mischkultur, die wie von Munnecke et al beschrieben angezogen wurde, angeimpft. Die Fermenterkultur wurde unter Rührung (1200 U/Min.) bei 25-28°C mit 10 Liter Luft pro

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Minute begast. Der pH-Wert wurde mit einem Titrator mit 2,5 η NaOH zwischen 7,5 und 7,6 eingestellt. Als Wachstumssubstrat diente Parathion; es wurde dem Fermentationsansatz kontinuierlich so zugesetzt, daß die Parathionkonzentration im Fermenter wachstumsbegrenzend war. Diese Bedingung war dann gegeben, wenn die aktuelle Parathionkonzentration unter 10 ppm lag und kein Nitrophenol nachweisbar war. Die Kultivierung wurde in 4 aufeinanderfolgenden Passagen durchgeführt, wobei 1 Liter der vorhergehenden Anzucht als Impfmaterial der folgenden diente. Die Kulturdauer betrug 3 bis 6 Tage. Die Kultivierung wurde dann beendet, und es wurde mit der nächsten Passage begonnen, wenn nur noch geringe oder keine Aktivitätserhöhungen im Fermenteransatz messbar waren. Die Aktivitätssteigerung der Mischkultur über die 4 Passagen ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Passagen-Nr. Kulturdauer (Tage) Aktivität bei Permen-

tatlonsende (U/Ltr.)

1 3 31,5

2 3 24o

3 5 82o

4 6 114o

Mit der Anzucht der Mischkultur in einer fünften Fassage konnte die Aktivität nicht weiter gesteigert werden. Dies geht aus Tab. 2 hervor, in der neben der Aktivitätszunahme in Abhängigkeit von der Fermentationszeit auch die Dosierung des Parathions, die während der Fermentation verbrauchte Parathionmenge sowie die Zunahme der Biomasse dargestellt ist. Die Fermentationsdauer betrug 123 Stunden. Bei einem Gesamtverbrauch von 4,4 ml Parathion pro Ltr. wurden Zeil-* dichten von 48o mg Trockengewicht pro Ltr. Kulturmedium mit einer parathionspaltenden Aktivität von 134o U /Ltr. Kulturmedium erreicht; das entspricht einer Aktivität von 28oo U pro g Trockenzellen.

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Tabelle 2: Zeitlicher Verlauf der Parathionfermentation

Fermenta tionsdauer (Std.)	Aktivität (U /Ltr.)	Trocken gewicht (g/Ltr.)	geerntet	Kontin. Dosierung (ml/Std.)	Parathion- Verbrauch (ml)
O	119	o,o45
25			o,15	3,8o
56,5			o,2o	Ιο,οο
71,5	375	o,29	o,375	15,9o
95,5	82o		o,5oo	27,9o
119,5	134o	o,48	o,5oo	39,9o
123	o,75o	42,5o

Die so gewonnene aktivierte, stabilisierte Mischkultur wurde durch Zentrifugation auf l/lo Ausgangsvolumen eingeengt und bei -18⁰C konserviert. Sie diente als Ausgangskultur für die weiteren Fermentationsansätze.

Beispiel 3

Herstellung von aktivem Zellmaterial mit einer Parathion-

Formulierung

Die Kulturbedingungen entsprachen weitgehend den unter Beispiel 2 beschriebenen. Anstelle des reinen Parathions wurde eine Parathionformulierung folgender Zusammensetzung benutzt:

Iaopropanol 15o ml Parathion 5o ml Alkylarylpolyglykoläther 0,5 ml

8,5 Liter Kulturmedium wurden mit 80 ml der in Beispiel 2 beschriebenen konservierten Mischkultur angeimpft und über

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123 Stunden kultiviert. Die Dosierung der Parathionformulierung erfolgte kontinuierlich. Die Fermentation wurde unsteril durchgeführt. Die zu den angegebenen Zeiten erhaltenen Aktivitäten der Kulturbrühe, der Verbrauch an Parathion und andere Fermentationsdaten sind der Tabelle 3 zu entnehmen.

Tabelle 3

Fermen- Akti- Trocken- Formu- Para-

tations- ίΓΓ+χΙ gewicht Kontin. lierver- thionverdauer Xg Zellen/ Dosierung brauch brauch

(Std.) (U /Ltr) Ltr) (ml/Std.) (ml) (ml)

O 116 0,147

25

56,5

71,5 765 0,906

95,5 1030
119,5 2500 1,085 123 geerntet

	0	0
0,7	20	5
0,95	50	12,5
1,3	75	17
1,5	110	27
1,8	150	38
2,1	165	41

Bei einem Gesamtverbrauch von 4,2 ml reinem Parathion pro Liter Kulturmedium wurde mit der Parathionformulierung eine spezifische Aktivität von 2300 U pro Gramm Trockenzellen erreicht.

Beispiel 4

Herstellung der aktivierten Mischkultur im 2000 Liter Maßstab mit reinem Parathion als Substrat

Zu 2000 Liter entionisiertem Wasser wurden Le A 18 459 - 33 -

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(NH₄)₂S0₄ 1000 g

CaCl₂ 30 g

MgSO₄ 200 g

K₂HPO₄ 3100g

KH₂PO₄ 600 g

FeCl₂ und 6 g

Lösung von Spurenelementen 2000 ml

gegeben.

Der 2000 Liter Fermentationsansatz wurde mit 200 Liter Vorkultur beimpft, die ausgehend von der im Beispiel 2 beschiebenen konservierten Kultur in Passagen über 1 Liter, 20 Liter und 200 Liter unter den im Beispiel 2 beschriebenen Kultivierungsbedingungen gewonnen wurde. Es wurde 138 Stunden mit Umdrehungen pro Minute, danach bis zum Ende der Fermentation mit 350 Umdrehungen pro Minute gerührt und mit 2000 Liter-Luft pro Minute begast. Die Temperatur betrug 27-28°C. Der pH-Wert wurde mit 2,5 η NaOH auf 7,5-7,7 konstant gehalten. Die Parathionzugabe erfolgte kontinuierlich mit den in der Tabelle angegebenen Dosierungen. Der Verlauf der Fermentation ist ebenfalls aus der Tabelle 4 zu entnehmen.

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Tabelle 4: Zeitlicher Verlauf der Parathionfermentation im 2000 Liter Maßstab

Fermen- .. .. Kontin-

tations- _v?+ät Trocken- Parathion- Parathion-

dauer gewicht Dosierung Verbrauch

(Std.) (U /Ltr) (g/Ltr.) (ml/Std.) (ml)

72

120

148

168

75

103 334 384 500

0,17

0,537

	0
20	160
30	2080
40	4000
60	5680
100	7680

Bei einem Verbrauch von 3,8 ml Parathion pro Liter Kulturmedium wurde eine spezifische Aktivität von 940 U /g Trockenzellen erreicht.

Beispiel 5;

Herstellung von aktivem Zeilmaterial mit einer Isopropanolformulierung bei geringer Fermenterdurchmischung (200 Upm)

In einem 7 Liter Fermenter wurden 5 Liter Nährlösung mit 10 ml eingeengter und bei -18⁰C über 7 Tage gelagerter aktivierter Mischkultur aus Beispiel 2 beimpft, mit 200 u/Min gerührt und mit 6 Liter Luft/Minute begast. Die Kultivierungstemperatur betrug 27°C; der pH-Wert 7,6. Es wurde zunächst

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0,5 ml Isopropanol-Parathion-Formulierung (Zusammensetzung: siehe Beispiel 3) diskontinuierlich zugesetzt und 15 Stunden inkubiert. Danach wurde mit in der Tabelle 5 angegebenen Dosierung kontinuierlich die Parathionformulierung zugesetzt. Die Zunahme der Aktivität und· das Trockengewicht der Biomasse ist ebenfalls aus der Tabelle 5 zu entnehmen.

Tabelle 5: Zeitlicher Verlauf der Parathionfermentation bei

	geringer Durchmischung	Kontin.Parathion Formulierungs- Dosierg: Verbrauch (ml/Std.) (ml)	0,5	Parathion- verbrauch (ml)
Fermen tations- dauer (Std.)	TVnrkpn- vität irocKen gewicht (U /Ltr) (g/Liter)		21,0	0,1
15,0		0,7	41,1	5,2
30,5	343	1,15	54,0	10,3
48,0	580 0,45	1,3	75,8	13,5
57,5		1,5		19,0
72,0	860 0,98

Bei einem Verbrauch von 3,8 ml reinem Parathion pro Liter Kulturmedium wurde eine spezifische Aktivität von 880 U /g Trockenzellen erreicht.

Beispiel 6;

Herstellung von aktivem Zellmaterial aus Reinkulturen

9 Liter Komplexmedium ■ mit einer Zusammensetzung

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NaHCO₈ 1 g

Hefeautolysat 8 g Pleiechhydrolyeat (Danimex) 3 g

H₈O looo ml

wurden mit 5oo ml einer 3 Tage in Komplexmedium gewachsenen Vorkultur des P-Ester spaltenden Pseudomonas-Isolats Pseudomonas spec. (DSM-GöttIngen, Nr. 1193 ) beimpft, bei 28⁰C mit looo Upm gerührt und 9 Ltr./Min. belüftet. Der pH-Wert betrug 7,6. Sie Fermentationsdauer war 21 Std. Nach dieser Zeit betrug die Parathion spaltende Aktivität des Fermentationsansatzes 52oo U /Ltr. Kulturmedium. Die spezifische Aktivität der Zellen war 162o U /g Trockengewicht. Beispiel 7;

Die in der Deutschen Sammlung Mikroorganismen unter den Nummern 1193, 1195, 1196, 1197, 1194 hinterlegten Pseudomonas-Stämme wurden in Nutrient Broth (DIfco) als Schüttelkulturen herangezogen und nach Erreichen der Höchstaktivität die Parathionhydrolase aktivität gemessen.

1) Die Hydrolaseaktivitäten in U /mg Zellprotein sind in der

Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 6 Stamm-Nr. (DSM) spez.Aktivität Ό /mg Protein ¹^

1193 o,42

1195 o,83

1196 1,21

1197 2,o4

1194 0,2

Die Zellen wurden mit Ultraschall aufgeschlossen; Test nach

Ultraschallbehandlung wie unter Beispiel 1 beschrieben Le A 18 459 - 37 -

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ho-

Beispiel 8

Die in der Deutschen Sammlung Mikroorganismen hinterlegten Pseudomonas Stämme Nr.

DSM 1192, DSM 1198 und DSM 1199 wurden im unter Beispiel 6 beschriebenen Komplexmedium unter Schütteln über 2 Tage bei 3O°C inkubiert. Die Parathion spaltenden Aktivitäten der Stämme pro Liter Kulturmedium sind in der Tabelle 7 zusammengefasst

Tabelle 7 Stamm-Nr. (DSM) Aktivität U¹ /Ltr.

1192 124o

1198 785

1199 52o

Beispiel 9

5 Ltr. aktivierter Miechkultur mit 89o U/Liter, die wie im Beispiel 2 beschrieben kultiviert worden war, wurden bei 4ooo Upm in einer Kühlzentrifuge der Fa. Hettich bei 4⁰C für 3o Min. zentrifugiert. Der inaktive Überstand wurde abgegossen und das Sediment mit 5oo ml dest. H₈O versetzt und Io Min. mit einem MagnetrUhrer gerührt. Sie homogene Zellsuspension (55o ml, 7I00 U/Ltr. ) wurde erneut wie oben zentrifugiert, der inaktive Überstand verworfen und das Sediment dieses Mal mit loo ml dest. H₈O versetzt und wie oben gerührt. Die erhaltenen 13o ml Zellsuspension (273oo TJ/LtrJ wurden bei -18⁰C eingefroren anschliessend gefriergetrocknet. Ausbeute 3,3 g Präparation mit 750 U/g.

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27S6032

Beispiel 10

Aus 4000 Ltr. Kulturbrühe, die in 2 Ansätzen nach Beispiel 4 hergestellt wurde, wurde in einem Separator der Fa. Westfalia der Zellschlamm angereichert (200-300 Ltr.), der inaktive Klarlauf wurde verworfen. Aus dem Schlamm wurde die Zellmasse in einer Korbzentrifuge bei 2500 Upm sedimentiert. Das Sediment wurde in 300 Ltr. destilliertem Wasser aufgenommen und durch Rühren in Suspension gebracht. Man schleuderte nochmals in der Korbzentrifuge ab, nahm das gewaschene Zellsediment in 30-40 Ltr. destilliertem Wasser auf, brachte in Suspension, fror die Suspension bei -40⁰C ein und lyophilisierte anschließend.

Ausbeute: 981 g mit 700 U/g.

Beispiel 11

100 ml eines gewaschenen, dann eingefrorenen und 1 Monat bei -18⁰C gelagerten Zellsuspension, die wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden war, wurden aufgetaut und 20 Minuten bei 10000 Upm (4°) zentrifugiert. Der Überstand (200 U/Ltr.) wurde verworfen. Das Zellsediment wurde in 100 ml Wasser resuspendiert und geteilt (6830 U/Ltr.). Die eine Hälfte wurde direkt lyophilisiert. Ausbeute: 1,25 g mit 175 U/g.

Die andere Hälfte wurde erneut bei 10000 Upm zentrifugiert und das Bakteriensediment mit 2x50 ml Aceton p.a. bei 4°C extrahiert. Die Acetonextrakte wurden verworfen, der Rückstand bei Raumtemperatur im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Ausbeute: 0,9 g mit 150 U/g.

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8O9825/025S

Beispiel 12

■ la-

12 Liter Kulturbrühe, nach Beispiel 2 hergestellt mit 125 U/Ltr. wurden bei 4000 Upm 30 Minuten zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Sediment in 500 ml Wasser aufgenommen und suspendiert (3000 U/Ltr.). Man zentrifugierte erneut ab, verwarf den Überstand und resuspendierte das Sediment ad 120 ml in Wasser. Diese Lösung diente als Ausgangslösung für die Solubilisierungsversuche in Bei- ' spiel 6 und 7.

Beispiel 13

Man versetzte 30 ml der Suspension aus Beispiel 4 mit 30 ml 0,1 m K Phosphatpuffer pH 8,2 (Test-Suspension 4800 U/Ltr.), 10000 g Überstand:U/Ltr.=0).Man versetzte nun mit 3 g Natriumdesoxycholat und inkubierte 30 Minuten bei 30⁰C Im Schüttelwasserbad. Der Ansatz wurde dann 30 Minuten bei und 10000 g zentrifugiert. Der Überstand enthielt jezt 10930 U/Ltr. Man gab den Überstand in einen Dialyseschlauch und dialysierte bei 4⁰C gegen destilliertes Wasser. Die ursprünglich viskose Lösung wurde dabei klar, man zentrifugierte das Retentat bei 19000 Upm und lyophilisierte den klaren Überstand.
Ausbeute: 1,4 g wasserlösliches Enzym mit 320 U/g.

Beispiel 14

Man versetzte 30 ml der Suspension aus Beispiel 4 mit 30 ml 0,1 m K-Phosphatpuffer pH 8,2 (Test-Suspension 4800 U/Ltr., 10000 g Überstand U/Ltr. =0. Dann gab man 6 ml n-Butanol hinzu und schüttelte 30 Minuten bei 30⁰C im Schüttelwasserbad.

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Iß.

Man zentrifugierte den Ansatz 30 Minuten bei 1OOOO g. Der Überstand enthielt jetzt 13700 U/Ltr.

25 ml des überStandes wurden direkt lyophilisiert.

Ausbeute: 300 mg wasserlösliche Präparation mit 890 U/g.

25 ml des ÜberStandes wurden zunächst gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert.

Ausbeute: 120 mg mit 1760 U/g.

Beispiel 15

16 Liter Kulturbrühe, wie unter Beispiel 2 beschrieben gewonnen mit 120 U/Ltr., wurden bei 4000 Upm zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Sediment in 500 ml Wasser aufgenommen und resuspendiert. Man zentrifugierte erneut und nahm das Sediment in 100 ml destilliertes Wasser auf. Zu dieser Ze11suspension wurden 100 ml 0,1 m Glycin/Na OH-Puffer pH 8,5 gegeben und der Ansatz kurz am Ultraturax-Homogenisator homogenisiert (Test-Suspension 956 U/Ltr., 10000 g Überstand 550 U/Ltr.). Man gab nun 15 ml (= 7,5 Vol.tf) Butanol zum Ansatz und inkubierte 1 Stunde unter Rühren bei 37⁰C Der Ansatz wurde anschließend auf 4⁰C abgekühlt und dann bei 19000 Upm 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand enthielt 9150 U/Ltr. Das Sediment wurde in 100 ml Wasser aufgenommen und nochmals zentrifugiert. Dieser zweite überstand (2860 U/Ltr.) wurde mit dem ersten vereinigt (280 ml 7650 U/Ltr.). 190 ml dieser Lösung wurden direkt lyophilisiert. Ausbeute 1.4 g lösliche Präparation mit 1090 U/g. 90 ml wurden zunächst gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisiert.
Ausbeute: 0,5 g lösliche Präparation mit 1370 U/g.

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Beispiel 16

6 Liter Fermentationsbrühe aus einem Fermentationsansatz nach Beispiel 6 wurden bei 4000 Upm und 40°C 30 Minuten zentrifugiert. Das Sediment wurde in 500 ml Wasser resuspendiert und nochmals wie oben zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das derart gewaschene Sediment in 100 ml Wasser suspendiert, die Suspension eingefroren und lyophilisiert.
Ausbeute: 8,1 g mit 770 U/g.

Beispiel 17

Abbau von Parathion in Containern

In einem 120 Liter Metallcontainer zur Aufbewahrung von Parathion, der nach Entleerung 40-60 g Parathion als Restverunreinigung enthielt, wurde 30 Liter Wasser gegeben, gut durchgemischt und der pH-Wert auf 8,3 eingestellt. Der Abbau des Parathions wurde mit 400 mg der gemäß Beispiel erhaltenen Präparation gestartet. Mit einer Umsatzrate von 90-120 mg pro Minute war der Abbau des Parathions in 10 Stunden beendet.

Beispiel 18

Enzymatischer Abbau von Paralhion in nassem Sand

500 g Sand (0,76 % Trockenverlust bei 14O⁰C) wurde mit 200 ml destilliertem Wasser und 1 g MaHCO-, p.a. versetzt. Es wurden 425,5 mg einer 47 %igen Parathionformulierung zugegeben,

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ks-

gemischt und 20 mg Präparation hergestellt gemäß Beispiel 10 zugesetzt. Nach einer Mischzeit von 2,5 Stunden wurde alkalis iert, filtriert und im Filtrat das p-Nitrophenol sofort photometrisch bestimmt. Gehalt: 490 g p-Nitrophenol/Ltr., das heißt es erfolgte ein Abbau von 100 % der Theorie.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von lagerstabilen Präparationen von Mikrcogranismen, ausgehend von stabilisierten aktivierten Mischkulturen von Mikroorganismen, die zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte dienen, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturbedingungen einer auf übliche Weise angereicherten aktiven Mischkultur unter Zugabe des abzubauenden Produkts in üblicher Weise nach dessen Abbaugeschwindigkeit optimiert werden und diese Mischkultur unter den so ermittel ten optimalen Bedingungen in mindestens zweimaliger Passage in eine stabilisierte aktivierte Mischkultur überführt wird und die dabei erhaltene Kultur unter Erhaltung ihrer Aktivität lagerstabilisiert wird.

2. Verfahren zur Herstellung von lagerstabilen Präparationen von Mikroorganismen, ausgehend von aktivierten Reinkulturen von Mikroorganismen, die zum Abbau industrieller organischer Syntheseprodukte dienen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einer gemäß Anspruch 1 erhaltenen Mischkultur auf üblicher Weise angewendeten Komplexmedien Einzelstämme anzieht, sie nach ihrer Aktivität selektioniert und die aktiven Stämme in üblicher Weise unter sterilen Bedingungen kultiviert,wobei das abzubauende Produkt im Substrat anwesend sein kann und die erhaltene Kultur schonend trocknet.

3. Lagerstabile Präparationen aus Mikroorganismen,ausgehend von stabilisierten aktivierten Mischkulturen von Mikroorganismen, die gemäß Anspruch 1 erhalten werden.

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4. Lagerstabile Präparationen aus Mikroorganismen, ausqehend von aktivierten Reinkulturen von Mikroorganismen, die gemäß Anspruch 2 erhalten werden.

5. Verwendung von Präparationen gemäß Anspruch 3 zum Abbau industrieller Syntheseprodukte.

6. Verwendung von Präparationen gemäß Anspruch 4 zum Abbau industrieller Syntheseprodukte.

7. Pseudomonas-Stamm DSM 1192, ATCC
Pseudonomas-Stamm DSM 1193, ATCC

8. Stämme von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß sie erhältlich sind, indem man die Kulturbedingungen einer auf übliche Weise angereicherten aktiven Mischkultur unter Angabe des abzubauenden Produkts in üblicher Weise nach dessen Abbaugeschwindigkeit optimiert, diese Mischkultur unter den so ermittelten optimalen Bedingungen in mindestens zweimaliger Passage in eine stabilisierte aktivierte Mischkultur überfuhrt, aus dieser stabilisierten aktivierten Mischkultur auf in üblicher Weise angewendeten Komplexmedien Einzelstämme anzieht und diese nach ihrer Aktivität selektioniert.

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