DE2619667A1

DE2619667A1 - Pharmazeutisches mittel

Info

Publication number: DE2619667A1
Application number: DE19762619667
Authority: DE
Inventors: Jacques Durand; D Hinterland Lucien Dussourd; Gerard Normier; Lucien Pradayrol
Original assignee: Pierre Fabre SA
Current assignee: Pierre Fabre SA
Priority date: 1975-05-05
Filing date: 1976-05-04
Publication date: 1976-11-18
Also published as: FR2310133A2; GB1551275A; FR2310133B2; DE2619667C2; BE841251R; ES447803A2; US4083961A

Description

PATENTANWÄLTE

Dr.-Ing. Wolff H.Bartels

Dipl.-Chem. Dr. Brandes Dr.-Ing. Held Dipl.-Phys. Wolff

Reg. Hr. 124 975

8 München 22,Thierschstraße 8

Tel.(089)293297

Telex 0523325 (patwo d) Telegrammadresse:

wolffpatent, manchen Postscheckkonto Stuttgart 7211 (BLZ 60010070) Deutsche Bank AG, 14/28630 (BLZ 60070070) Bürozeit: 8-12 Uhr, 13-16.30 Uhr außer samstags

4. Mai 1976 R/dö

Pierre Fabre S.A.
75016 Paris, Frankreich

Pharmazeutisches Mittel (Zusatz zu Patent (Patentanmeldung P 24 56 589.7))

ORIGINAL INSPECTED

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Pharmazeutisches Mittel

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung und weitere Ausgestaltung des pharmazeutischen Mittels gemäß Hauptpatent.

Es zeigte sich, daß die Aktivität des im Hauptpatent beanspruchten pharmazeutischen Mittels sehr stark erhöht werden kann durch Kombination des als aktive Komponente vorliegenden Plasminogen-Aktivators mit einem sulfathaltigen Polysaccharid.

Das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel mit einem Gehalt an mindestens einem Plasminogen-Aktivator gemäß Hauptpatent als aktive Komponente ist daher dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein sulfathaltiges Polysaccharid enthält.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäß verwendeten sulfatierten Polysaccharid um ein Dextransulfat, das vorzugsweise ein Molekulargewicht zwischen etwa 3000 und 15 000 aufweist und etwa 10 bis 20 <fo Schwefel enthält.

Das sulfathaltige Polysaccharid ist erfindungsgemäß entweder in Form einer einfachen Vereinigung mit dem Plasminogen-Aktivator, die durch einfaches Vermischen der beiden Verbindungen erhalten wird, oder in Form eines Komplexes mit dem Plasminogen-Aktivator verwendbar. Versuche haben gezeigt, daß die Aktivitäten der einfachen Vereinigung und des Komplexes sehr ähnlich sind. .

Das sulfatierte Polysaccharid wird erfindungsgemäß in Mengen zwischen 10 und 30 Gew.-$, vorzugsweise in Mengen in der Größenordnung von 20 Gew.-?S, bezogen auf Aktivator, der als Protein bestimmt ist, angewandt.

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Das erfindungsgemäß verwendbare sulfathaltige Polysaccharid kann nach jedem üblichen bekannten Verfahren hergestellt werden, z. B, durch Veresterung eines Polysaccharide mit einer schwefelhaltigen Mineral- oder organischen Säure in Gegenwart einer das Wasser bindenden Base. Das erfindungsgemäß verwendbare Dextransulfat ist herstellbar durch Abbau des Dextrans in der Wärme in schwefelsaurem Milieu zur Verminderung des Molekulargewichts des Dextrans und anschließende Veresterung des erhaltenen Dextrans mit Chlorsulfonsäure in Pyridin.

Wird die aktive Komponente des erfindungsgemäßen Mittels in Form eines Komplexes angewandt, so erfolgt die Komplexbildung bei einem pH-Wert nahe dem Neutralpunkt durch Zugabe der erforderlichen Menge an sulfatiertem Polysaccharid zu dem in Lösung befindlichen Aktivator, worauf der pH-Wert der Lösung allmählich angesäuert wird bis auf einen Wert nahe 6, wodurch die Ausfällung des gewünschten Komplexes bewirkt wird. Nach Isolierung, des Niederschlags kann dieser in einer Pufferlösung mit einem pH—Wert von etwa 7 erneut gelöst und anschließend lyophilisiert werden.

Bei der Komplexbildung wird vorzugsweise Phosphorsäure zur Erniedrigung des pH-Werts der Lösung verwendet und die Ausfällung wird bei etwa +4⁰G durchgeführt.

Die Erfindung betrifft ferner auch ein verbessertes Verfahren zur Herstellung des Plasminogen-Aktivators.

Dieses Verfahren besteht ebenso wie das Verfahren gemäß Hauptpatent in der Behandlung eines Acetonpulvers aus tierischen Organen, bestehend aus den Lungen und Nieren von Schweinen, Kälbern, Rindern, Pferden, Lämmern oder Schafen, oder aus Schweine-, Rinder- oder Schafeierstöcken, und ist charakterisiert durch

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a) Suspendierung des Acetonpulvers in einer Acetatpufferlösung mit einer Ionenstärke zwischen 0,01 und 0,1 bei ungefähr neutralem pH-Wert,

b) Aufnahme des in Verfahrensstufe (a) erhaltenen Niederschlags in einer Acetatpufferlösung mit einer Ionenstärke zwischen 0,6 und 1 bei einem pH-V/ert zwischen 3 und 5,

c) Ausfällung der nach Abdekantieren der in Verfahrensstufe (b) erhaltenen Lösung durch Zugabe eines Salzes bei einem pH-Wert zwischen etwa 3 und 5,

d) Aufnahme des in Verfahrensstufe (c) erhaltenen Niederschlags in einer Acetatpufferlösung und Ausfällung durch Zugabe eines Salzes bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8,

e) Ausfällung der in Verfahrensstufe (d) nach Klärung erhaltenen Lösung durch Zugabe eines Salzes bei einem annähernd neutralen pH-Wert und

f) Reinigung des erhaltenen Niederschlags.

Die Reinigungs-Verfahrensstufe (f) wird vorzugsweise durchgeführt durch Ausfällung des Plasminogen-Aktivators beim isoelektrischen Punkt, d. h. bei einem pH-Wert zwischen 6,3 und 6,5, und bei einem spezifischen Widerstand der Lösung in der Größenordnung von 450 0hm.cm, und durch Chromatographie des erhaltenen Niederschlags nach Lösen desselben. Die angewandte Chromatographie ist vorzugsweise eine Affinitätschromatographie.

Wie im Verfahren gemäß Hauptpatent handelt es sich bei dem zur Ausfällung in den Verfahrensstufen (c), (d) und (e) verwendeten Salz vorzugsweise um kristallines Ammoniumsulfat· Wird in Verfahrensstufe (c) als Ausfällsalz Ammoniumsulfat verwendet, so wird es in einer Konzentration zwischen etwa 200 und 300 g/l

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angewandt, während es in den Verfahrensstufen (d) und (e) in einer Konzentration zwischen etwa 60 und 80 g/l eingesetzt wird»

Im folgenden wird ein allgemeines Arbeitsschema zur Herstellung eines erfindungsgemäß verwendbaren Komplexes eines Plasminogen- Aktivators mit einem sulfatierten Polysaccharid angegeben, um die Erfindung zu erläutern, ohne daß diese auf bestimmte Ausführungsformen beschränkt wird.

Das als Ausgangsmaterial für die Herstellung des Plasminogen-Aktivators dienende Acetonpulver wird vorzugsweise wie folgt hergestellt:

Nach dem Auftauen und Zerkleinern werden die behandelten Organe in einem Acetonbad bei einer Temperatur unter -10 ⁰C dispergiert und kräftig gerührt. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird filtriert und der Filterkuchen wird mit Aceton gewaschen und anschließend unter Stickstoffatmosphäre getrocknet.

^a) Vorwaschen des Acetonpulverst

Das Acetonpulver wird suspendiert in einer Acetatpufferlösung einer Ionenstärke in der Größenordnung von 0,02, wobei der pH-Wert der Lösung nahe dem Neutralpunkt liegt. Die erhaltene Suspension wird 1 Stunde lang bei +4 ⁰O gerührt, worauf der Rückstand des Acetonpulvers getrocknet und die überstehende Lösung verworfen wird.

b) Extraktion;

Der erhaltene Rückstand wird in einer Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 3 und 5 suspendiert und die erhaltene Suspension wird 3 Stunden lang bei +4 ⁰C gerührt. Nach dem

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Trocknen wird der Rückstand des nicht extrahierten Pulvers abgetrennt und die isolierte Lösung durch eine Klärvorrichtung geschickt.

c) Erste Ausfällung in saurem Milieu;

Der in Verfahrensstufe (b) anfallende geklärte Extrakt wird in saurem Milieu bei einem pH-Wert von etwa 4,5 ausgefällt durch Zugabe von Ammonsulfifc in einer Konzentration zwischen 290 und 3OO g/l, und der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird in einer Acetatpufferlösung gelöst, worauf der pH-Wert der erhaltenen Lösung auf einen Wert zwischen 7 und 8 erhöht wird mit Hilfe von konzentrierter Natronlauge.

d) Zweite Ausfällung in schwach basischem Milieu;

Die erhaltene Lösung wird erneut ausgefällt durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Konzentration zwischen etwa 60 und 80 g/l. Nach Durchleiten durch eine Klärvorrichtung wird der inaktive Niederschlag verworfen und die erhaltene Lösung auf einen pH-Wert von etwa 7 gebracht.

e) Dritte Ausfällung nahe dem Neutralpunkt:

Die erhaltene Lösung wird ein drittes Mal ausgefällt durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Konzentration zwischen 60 und 80 g/l. Der gebildete Niederschlag wird in einer Klärvorrichtung abgetrennt und mit neutralem destilliertem Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird in destilliertem Wasser dispergiert und die erhaltene Lösung wird auf einen pH-Wert von 4 angesäuert. Nach Zentrifugation wird der erhaltene Überstand mehrere Male mit destilliertem Wasser verdünnt bis ein spezifischer Widerstand von 600 bis 65O 0hm.cm erreicht ist.

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Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wird sodann auf einen Wert zwischen 6,3 und 6,5 gebracht unter Erzielung eines spezifischen Widerstands in der Größenordnung von 450 Ohm.cm.

Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und anschließend in einer Phosphatpufferlösung dispergiert. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung, der sodann nahe dem Weutralpunkt liegt, wird mit Hilfe einer Base auf einen Wert zwischen 9 und 10 eingestellt und anschließend auf einen ungefähr neutralen pH-Wert gebracht.

Die nach Zentrifugation erhaltene Lösung wird sodann isoliert. Die dabei erhaltene Lösung wird einer Affinitätschromatographie unterworfen.

Das bei der Chromatographie verwendete Trägermaterial ist solches vom Typ " AH-Sepharose 4B", auf welchem zuvor ein spezifischer Inhibitor für den Plasminogen-Aktivator mit Hilfe eines Oarbodiimids aufgekuppelt wurde.

Typische geeignete Inhibitoren sind z. B. £-Aminocapronsäure, Aminoäthylcyclohexansäure, trans-4-Aminoäthyl-cyclohexancarbonsäure und p-Aminomethylbenzoesäure.

Die Affinitätschromatographie ist auch auf einem mit C]JBr aktivierten Sepharose-Trägermaterial durchführbar, auf welchem Lysin oder eine der angegebenen Verbindungen fixiert werden kann. Selbstverständlich ist es auch möglich, andere Trägermaterialien zu verwenden, auf welchen ein derartiges Aufkuppeln oder Aufpfropfen realisierbar ist, z. B. Materialien aus der Reihe der Biogele.

Die auf das Trägermaterial gebunden gebliebene Fraktion wird mit Hilfe eines Ionenstärke-Gradienten eluiert. Das erhaltene Eluat wird auf Proteingehalt und Aktivität untersucht nach den weiter unten beschriebenen Methoden.

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Die erhaltene Lösung wird bei einem in der Nähe des Neutralpunkts gelegenen pH-Wert mit einem sulfathaltigen Polysaccharid in einer Menge von 20 %, bezogen auf die Menge an in der Lösung vorhandenem Protein versetzt; die erhaltene Lösung wird sodann angesäuert bis zu einem pH-Wert nahe 6. Der Plasminogen-Aktivator fällt dabei in Form eines Komplexes mit dem sulfatierten Polysaccharid aus. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt, danach in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert nahe 7 gelöst und anschließend lyophilisiert.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern.

Beispiel

10 kg bei -20 ⁰C aufbewahrte Mutterschweineierstöcke wurden bei -5 ⁰C erweichen gelassen und anschließend mit Hilfe eines Fleischwolfs einer Gitteröffnungsweite von 5 mm zerkleinert. Das zerkleinerte Produkt wurde in 75 1 Aceton bei -20 ⁰C dispergiert. Nach 1 Stunde langem kräftigem Rühren wurde die Suspension auf einem Buchner-Trichter filtriert und der Filterkuchen wurde auf dem Filter mit Aceton von -20 ⁰C gespült. Danach wurde der Filterkuchen entnommen und in einer Säule mit einem aufsteigenden Strom trockenen Stickstoffs getrocknet. Es wurden 1,3 kg Acetonpulver erhalten, das bei +4 ⁰O" aufbewahrt werden konnte.

a) Das erhaltene Acetonpulver wurde in 30 1 M/iOO-Acetatpuffer von pH 6,5 suspendiert. Es wurde 1 Stunde lang bei +4 ⁰G kräftig gerührt und anschließend die Feststoffe von der Flüssigkeit getrennt. Die Organteile wurden isoliert und das FiI-trat verworfen. Die Organe wurden sodann erneut in 10 1 des angegebenen Acetatpuffers suspendiert, worauf die Suspension 15 Minuten lang bei +4 C gerührt und anschließend abgeschleu-

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dert wurde.

b) Nach dem Abschleudern wurden die Organe in 30 1 0,3 M-Acetatpuffer von pH 4,2 bei +4 ⁰C suspendiert und das ganze wurde 3 Stunden lang bei +4 C leicht gerührt.

Danach wurde abgeschleudert und die Organteile wurden verworfen. Das erhaltene Filtrat wurde durch eine Klärvorrichtung geleitet zur Entfernung der suspendierten Peinteile. Der erhaltene geklärte Extrakt wurde isoliert.

c) Der Extrakt wurde in einer Konzentration von 250 g/l mit kristallinem Ammonsulfat versetzt. Es wurde bis zur vollständigen Lösung gerührt und anschließend eine Nacht lang bei +4 ⁰C stehen gelassen. Der gebildete Niederschlag wurde aus der Klärvorrichtung isoliert und die Mutterlaugen wurden verworfen. Der Niederschlag wurde sodann gelöst durch 1 Stunde langes Rühren in 8 1 0,1 M-Acetatpuffer von pH 4,2 bei +4 ⁰G. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wurde mit konzentrierter Natronlauge auf 7,5 gebracht.

d) Die auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellte Lösung wurde in einer Konzentration von 64 g/l mit kristallinem Ammoniumsulfat versetzt, worauf der pH-Wert mit Essigsäure auf 7,2 eingestellt wurde. Es wurde 30 Minuten lang bei +4 ⁰C stehen gelassen. Nach Durchleiten durch eine Klärvorrichtung wurde der inaktive Niederschlag verworfen und die geklärte Lösung auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht.

e) Die erhaltene Lösung wurde in einer Konzentration von 72,5 g/l mit Ammonsulfat versetzt unter Aufrechterhaltung des pH-Werts mit Hilfe von N-Natronlauge. Es wurde bis zur vollständigen Lösung gerührt, worauf 1 i/2 Stunde lang bei +4 C stehen gelassen wurde. Nach Behandlung in einer Klärvorrichtung wurde die Lösung verworfen. Der erhaltene Niederschlag

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wurde auf der Klärvorrichtung gewaschen durch Durchleiten von 2,5 1 neutralem destilliertem Wasser.

f) Der gewaschene Niederschlag wurde sodann in 500 ml destilliertem Wasser dispergiert.

Bis zur Erreichung eines stabilen pH-Werts von 4,3 wurde verdünnte Essigsäure zugegeben, worauf 1 Stunde lang bei +4 ⁰C gerührt wurde. Nach Zentrifugation wurde der erhaltene unlösliche Anteil verworfen und der Überstand mit destilliertem Wasser auf das 5- his 8-fache verdünnt bis zur Erzielung eines spezifischen Widerstands von 600 bis 650 λ ·

Der pH-Wert des erhaltenen Überstands wurde sodann auf 6,3 bis 6,5 erhöht durch Zugabe von 0,5 N-Natronlauge unter Erzielung eines spezifischen Widerstands von 4 50 Λ . Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugation sofort isoliert und der Überstand wurde verworfen.

Der erhaltene Niederschlag wurde in 200 ml M/15-Phosphatpuffer von pH 7»2 bei +4 ⁰G dispergiert, worauf der pH-Wert auf 9,5 bis 10 mit Natronlauge (3 N) erhöht wurde. Es wurde 20 Minuten lang kräftig gerührt, bevor der pH-Wert mit verdünnter Phosphorsäure auf 7,3 gebracht wurde. Danach wurde 30 Minuten lang stehen gelassen und anschließend zentrifugiert.

Der unlösliche Anteil wurde verworfen und der Überstand wurde durch eine Säule geleitet, die ein Trägermaterial vom Typ "AH-Sepharose 4B" enthielt.

Nach Bestimmung des Proteingehalts (der zwischen 2,5 und 3 mg/ml lag) wurde das 2-fache des Proteingewichts an Glycin zugesetzt, worauf die Aktivität bestimmt wurde. In diesem Verfahrensstadium wurden 0,5 Ms 0,6 g Proteine mit einem Gehalt zwischen 3OOO und 4000 CTA-Einheiten/mg erhalten. Diese Einheit wurde

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1964 durch das Komitee für thrombolytische Mittel (National Heart Institute) festgelegt. Die CTA-Einheit basiert auf der Aktivität eines Standard-Urokinasepräparats, das separat in verschiedenen Laboratorien getestet wurde. Das Standard-Urokinasepräparat wurde ferner mit Hilfe des synthetischen Substrats N-Acetyl-L-lysinmethylester (ALME) bestimmt. Eine Urokinase-Einheit setzt 5 x 10"⁴ Mikromol/CTA-Einheit/Minute bei 37 ⁰C frei (vgl. Methods in Enzymology, Bd. XIX, S. 666).

Nach Bestimmung des Proteingehalts und der Aktivität wurde die aktive Fraktion mit Dextransulfat versetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde sodann mit verdünnter Phosphorsäure allmählich auf 5,8 bis 5,9 erniedrigt. Es wurde 30 Minuten lang bei +4 ⁰C stehen gelassen und anschließend zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde isoliert und der Überstand verworfen. Der erhaltene Komplex wurde in einer Pufferlösung von pH 7 "bis 7,5 gelöst und anschließend lyophilisiert.

Im folgenden werden die Arbeitsweise und die angewandten Bestimmungsmethoden zur Feststellung der Ergebnisse experimenteller Untersuchungen angegeben.

Die in vivo-Versuche zur Bestimmung der fibrinolytischen Aktivität eines Plasminogen-Aktivators können an der Ratte durchgeführt werden durch Messung der Lysiszeit der Plasma-Euglobuline. Diese einfache, reproduzierbare und mit kleinen Versuchstieren durchführbare Bestimmungsmethode wurde dem Wirkungsmechanismus des zu untersuchenden Produktes angepaßt.

Prinzip:

Die Lysiszeit eines Plasma-Euglobulingerinnsels stellt eine empfindliche Methode dar zur Beurteilung einer Global-Lysisaktivität.

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Zur Durchführung wird die Ionenstärke des Plasmas erniedrigt durch Verdünnen mit destilliertem Y/asser von saurem pH-Y/ert, die Euglobuline werden ausgefällt, während die Pseudoglobuline im Überstand verbleiben.

Aus diesem Überstand werden außerdem die die Fibrinolyse hemmenden Antiplasmine entfernt (woraus eine größere Empfindlichkeit der Methode resultiert)· Unter den ausgefällten Euglobulinen findet sich praktisch die Gesamtmenge an Fibrinogen, Plasminogen und Plasminogen-Aktivator.

Durchführungstechnik:
Blutentnahme:

Das entnommene Blut wurde in eine 3»8 %lge Lösung von Trinatriumcitrat.5,5 H_?0 im Verhältnis von i/5 eingebracht (ab seiner Entnahme muß das Blut in schmelzendem Eis aufbewahrt werden und die Durchführung der Bestimmung muß innerhalb einer Stunde ab Entnahme erfolgen). Das Blutplasma wurde durch 10 Minuten lange Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit erhalten.

Reagentien:

- Michaelis-Puffer von pH 7,35 (bezogen von Lab. STAGO)

- Essigsäure, 1,6 folge Lösung, die bei Gebrauch frisch verdünnt wird auf 1/1OO mit auf 4 ⁰C gekühltem destilliertem Wasser

- Thrombaselösung mit 20 Mellanby-Einheiten pro ml in 0,05 M-Calciumchloridlösung. 1 Ampulle ROUSSEL-Thrombase enthält 500 Mellanby-Einheiten und wird in 25 ml 0,05 M-CaCl₂-Losung gelöst. Zur Herstellung der 0,05 M-CaClp-Lösung werden 5 ml 0,25 M-CaCl₂ (STAGO) mit 20 ml destilliertem Wasser versetzt.

Die wie angegeben erhaltene ThrombaseTösung wurde in 2 ml-Fraktionen unterteilt, die im Tiefkühlschrank aufbewahrt und bei Gebrauch aufgetaut wurden.

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Durchführungsmethode:

- In ein konisches Zentrifugierglas wurden 0,5 ml Plasma eingebracht ,

- es wurden langsam und unter Rühren 9,5 ml 0,016 $ige, auf 4 ⁰G gekühlte Essigsäurelösung zugegeben,

- durch Umwenden nach Abdecken mit Parafilm wurde gemischt,

- 20 Minuten lang wurde bei 4 ⁰O stehen gelassen,

- 10 Minuten lang wurde bei 3500 UpM zentrifugiert,

- der Überstand wurde entfernt,

- die Röhrchen wurden auslaufen gelassen durch Umwenden auf Filterpapier,

- die Röhrchenwände wurden sorgfältig getrocknet unter Vermeidung des Berührens des am Röhrchenboden befindlichen Niederschlags,

- der Euglobulinkuchen wurde in 0,5 ml Michaelispuffer aufgenommen,

- nach vollständiger Lösung wurden 0,25 ml der erhaltenen Euglobulinlösung in ein Hämolyseröhrchen eingebracht,

- das Röhrchen wurde in ein Wasserbad von 37 ⁰C eingebracht,

- der Calciumgehalt wurde erneuert durch 50 /ul calciumhaltige Thrombaselösung (von 20 E/ml),

- die Stoppuhr wurde in Gang gesetzt ab Eintreten der Koagulation und

- das Gerinnsel wurde regelmäßig beobachtet und die Zeit bis zu seiner vollständigen Zersetzung (ein Aussehen wie Schneeflocken in einer klaren Flüssigkeit) wurde gemessen.

Tierversuche;

Männliche Ratten des Stammes "Iffa-Credo", die seit der letzten Fütterung etwa 16 Stundenliichtern waren und nach den durchgeführten Untersuchungen ein Körpergewicht zwischen 180 und 250 g aufwiesen, wurden in Versuchsgruppen unterteilt und in gleicher Weise behandelt.

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für Vergleichsbestimmungen Die Versuchsratten/erhielten durch Injektion in die Penisvene pro 100 g Körpergewicht 1 nil Phosphatpuffer von pH 7,2 oder physiologische Kochsalzlösung, je nachdem in welchem dieser Trägermittel das zu untersuchende Produkt gelöst war.

Die behandelten Ratten erhielten durch Injektion in die Penisvene pro 100 g Körpergewicht 1 ml des zu untersuchenden Produktes in Form einer Lösung in solcher Konzentration, die zur Erzielung der gewünschten Dosierung erforderlich war.

Genau 15 Minuten nach den verschiedenen Injektionen wurden die Ratten leicht mit Äther anästhesiert, der Thorax wurde geöffnet und das Blut wurde durch direkte Punktion aus der Herzkammer entnommen. Das Blut wurde sodann nach der oben beschriebenen Technik behandelt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen aufgeführt. Bei dem in den Versuchen verwendeten Dextransulfat handelte es sich um ein Kalium-Hydrodextran der folgenden Formel:

GH₂OSO₃K

OSO ,K

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Versuch 1; Von Dextransulfat entfaltete Aktivität

Lysiszeit in Minuten

Vergleich 115 120 85 108 115 108

^{73 12}° ¹¹° ¹¹° ^{50 12}° ^{93 105 10}° ^{95 90 108}

Mittelwert	5
108,	1
97,	5
98,

Die Ergebnisse zeigen, daß Dextransulfat in den angewandten Dosen keine merkliche Aktivität entfaltet.

Versuch 2: Aktivität des Plasminogen-Aktivators allein im Vergleich zu der erfindungsgemäß verwendbaren^ Kombination

In allen Versuchen sind die angegebenen Mengen an Aktivator Proteinkonzentrationen·

Dieser Versuch wurde mit Blindversuch durchgeführt.

Mittel- f Lysiszeit in Minuten wert Wirkung

Vergleich 120 155 120 135 130 - 128

^{70 85 10}° ¹⁰° ^{85 92 88}'^{7 30}'⁷

Aktivator

^ ^fi5 52 45 45 35 - 48,4 62,1

2 mg/kg

Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäße Lösung mehr als doppelt so aktiv ist wie die nur den Plasminogen-Aktivator enthaltende Lösung.

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Versuch. 3 s

Mittel-Lysiszeit in Minuten wert Wirkung

Vergleich 145 135 130 145 150 140 140,8

^{125 115 12}° ^{105 11}° * ^{115 18}'³

Aktivator

Dextrafsulfat ^{85 10}° ⁸^ ?° 75 100 8₅,8 1 mg/kg

Die erhaltenen Ergebnisse sind die gleichen wie in Versuch

Versuch 4t

Mittel-Lysiszeit in Minuten wert Wirkung

Vergleich 83 80 75 65 95 - 79,6 Aktivator 5 mg/kg 67 100 100 65 70 85 81,2 Aktivator

Dextrafsulfat *⁸ 53 48 55 55 50 51,5 35,3 1 mg/kg

Die Ergebnisse zeigen, daß bei der verwendeten Dosierung weder die aktive Fraktion noch das verwendete Dextransulfat eine merkliche Aktivität entfaltet, daß demgegenüber jedoch eine Kombination dieser beiden Verbindungen eine gute und eindeutige Aktivität in der Größenordnung von 35 i° bewirkt.

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-4Ψ-

Versuch 5ϊ Vergleich zwischen der Aktivität einer einfachen Vereinigung und eines Komplexes gemäß vorliegender Erfindung

Lysiszeit in Minuten

Mittel- % wert Wirkun_;

Vergleich Komplex Vereinigung

145 HO 135 103 85 70 95 75' 95 90 85 80 85 95 80

130,75
85
85

35 35

Die Ergebnisse zeigen, daß die Aktivitäten der einfachen Vereinigung und des Komplexes praktisch gleich sind.

Aus den angegebenen Versuchen ergibt sich, daß die erfindungsgemäße Kombination eines sulfatierten Polysaccharids und eines Plasminogen-Aktivators ein pharmazeutisches Mittel ergibt, das sich in besonders vorteilhafter Weise zur Behandlung von zahlreichen Kreislauferkrankungen eignet, z. B. insbesondere von arteriellen oder venösen Thrombosen.

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Claims

Patentansprüche

· Pharmazeutisches Mittel mit einem Gehalt an einem Plasminogen-Aktivator nach Hauptpatent . .·. ··· (Patentanmeldung
P 24 56 589.7) als aktive Komponente, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein sulfathaltiges Polysaccharid enthält.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
sulfathaltige Polysaccharid ein Dextransulfat ist.
3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das
verwendete Dextransulfat ein Molekulargewicht zwischen
3OOO und 15 000 aufweist und etwa 10 Ms 20 <fo Schwefel
enthält.
4. Mittel nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfathaltige Polysaccharid in Mengen von 10 bis 30
Gew.-$, bezogen auf als Protein bestimmten Aktivator, vorliegt.
5. Mittel nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen-Aktivator und das sulfathaltige Polysaccharid in Form eines Komplexes vorliegen.
6. Mittel nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen-Aktivator gewonnen ist durch Behandlung eines Acetonpulvers aus tierischen Organen, bestehend aus den Lungen und !Tieren von Schweinen, Kälbern, Rindern, Pferden, Lämmern oder Schafen, oder aus Schweine-, Rinder— oder
Schafeierstöcken, durch

a) Suspendierung des Acetonpulvers in einer Acetatpufferlösung einer Ionenstärke zwischen 0,01 und 0,1 bei einem
pH-Wert nahe dem Neutralpunkt,

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b) Aufnahme des in Verfahrensstufe (a) erhaltenen Niederschlags in einer Acetatpufferlösung mit einer Ionenrstärke zwischen 0,6 und 1 und einem pH-Wert zwischen 3 und 5,

c) Ausfällung der nach dem Abdekantieren der in Verfahrensstüfe (b) erhaltenen Lösung durch Zugabe einesjSalzes bei einem pH-Wert zwischen etwa 3 und 5»

d) Aufnahme des in Verfahrensstufe (c) erhaltenen Niederschlags in einer Acetatpufferlösung und Ausfällung durch Zugabe eines Salzes bei einem pH-Wert zwischen und 8,

e) Ausfällung der nach Klärung der in Verfahrensstufe (d) erhaltenen Lösung durch Zugabe eines Salzes nahe dem Neutralpunkt, und

f) Reinigung des erhaltenen Niederschlags.
7. Mittel nach Anspruh 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausfällung in den Verfahrensstufen (c), (d) und (e) kristallines Ammoniumsulfat gedient hat.
8. Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Ammoniumsulfat in der Verfahrensstufe (c) in einer Konzentration zwischen 200 und 3OO g/l und in den Verfahrensstufen (d) und (e) in einer Konzentration zwischen etwa 60 und 80 g/l zur Anwendung gelangt ist.
9. Mittel nach Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigungs-Verfahrensstufe (f) durch Ausfällung des Plasminogen-Aktivators bei einem pH-Wert zwischen 6,3 und -6,5 und durch Affinitätschromatographie des erhaltenen Niederschlags nach Lösen desselben erfolgt ist·
10. Mittel nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogen-Aktivator und das sulfathaltige Polysaccharid in Form eines Komplexes vorliegen, der gewonnen ist durch Zugabe des sulfatierten Polysaccharide zum Plasminogen-Akti-

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vator in Lösung bei einem pH-Wert nahe dem Heutralpunkt, und anschließende Ausfällung des Komplexes durch Ansäuern der Lösung auf einen pH-Wert von etwa 6.