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DE2528584A1 - Verfahren zur inaktivierung der virusinfektiositaet unter gleichzeitiger stabilisierung von virusantigenen - Google Patents

Verfahren zur inaktivierung der virusinfektiositaet unter gleichzeitiger stabilisierung von virusantigenen

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DE2528584A1
DE2528584A1 DE19752528584 DE2528584A DE2528584A1 DE 2528584 A1 DE2528584 A1 DE 2528584A1 DE 19752528584 DE19752528584 DE 19752528584 DE 2528584 A DE2528584 A DE 2528584A DE 2528584 A1 DE2528584 A1 DE 2528584A1
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DE
Germany
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virus
inactivation
formaldehyde
inactivating
infectivity
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Withdrawn
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DE19752528584
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English (en)
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Vjatscheslav Nikol Baschkirzev
Geb Kljukina Maria Kro Chanina
Antonia Vasiljevna Gagarina
Alexandr Michajlovi Poverennyj
Jurij Alexejevitsch Semin
Jevgenij Alexandro Tkatschenko
Michail Petrovitsch Tschumakov
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INST POLIOMIELITA I VIRUSNYKH
Original Assignee
INST POLIOMIELITA I VIRUSNYKH
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Publication date
Application filed by INST POLIOMIELITA I VIRUSNYKH filed Critical INST POLIOMIELITA I VIRUSNYKH
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Description

AlTTIGHiEN
Priorität vom 27. 8. 1974 UdSSR Nr. 2055851
Die vorliegende Erfindung bezieht eich auf die biologische Industrie (medizinische und Veterinäre), insbesondere . c'.uf Verfahren zur Herstellung von unschädlichen inaktivierten Viruspräparaten, die spezifische antigene Eigenschaften beibehalten und zur Prophylaxe und Labordiagnostik ver~ wandt werden, insbesondere auf Verfahren zur Inaktivierung der Virusinfektiosität unter gleichzeitiger Stabilisierung von Virusanti^enen.
Es ist bekannt, daß spezifische antigene Eigenschaften der Viren mit Eiweißmakroinolekülen der Hülle der Viruskörperchen verbunden sind, während die Infektiosität (Infizie-
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rungsfähigkeit) von dör Nukleinsäure abhängt, die sich gewöhnlich im Virus Zentrum befindet. Es ist auch bekannt, daß es zur Herstellung eines inaktivierten Viruspräparats (ohne Infektionsaktivität), das z.B. zur prophylaktischen Vakzination gegen eine Viruserkrankung oder zur ungefährlichen Verwendung zu den diagnostischen serologischen Eealrfcionen geeignet ist, notwendig ist, die Struktur der Virusnukleinsäure zu zerstören und dabei die Viruseiweißstoffe - die Träger von spezifischen antigenen, immunogenen Eigenschaften vor der überflüssigen Denaturierung zu verhüten und die-
se zu stabilisieren. Der Prozeß der Inaktivierung der Virusinfektiosität und der Stabilisierung der antigenen Viruseiweißstoffe muß momentan verlaufen.
Gewöhnlich werden pathogene Viren, z.B. Erreger der Virusenzephalitis und des hämorrhagischen Fiebers, indem diese in der Zellensuspension der geschädigten Gewebe oder in zellenlosen Substraten untergebracht werden, bei einer Temperatur über dem Y/assergefrierpunkt von sich selbst zerstört.. Dabei ist die Inaktivierungsgeschwindigkeit bei verschiedenen Viren (unter Berücksichtigung der Schutzwirkung einiger virushaltigen Substrate) verschieden, im Grunde genommen ist diese dem Grad der Temperaturerhöhung direkt proportionell. Der Verlust an infektiösen Eigenschaften unter der Einwirkung der Anwärmung wird in der Eegel von der
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fort schre it enden Senkung und vom Verlust der Fräparatantigenität begleitet. Im Zusammenhang damit v/erden· solche Verfahren zur Inaktivierung der Virusinfektiosität verwendet, die gleichzeitig erlauben, Virusantigene vor einer übermäßigen Senkung der Aktivität bei der Einwirkung der erhöhten Temperatur zu schützen, d.h. zu stabilisieren, die Zerstörung von Viruseiweißantigenen zu verhindern. Es sind z.B. Verfahren zur chemischen Behandlung des Viruspräparats mit Phenolen, ß-Propiolakton und Formaldehyd in Verbindung mit mehr oder weniger kurzeitigen Temperatureinv/irkung in der Größenordnung von +37°» +32°» +24°, +40C je nach der Virusnatur bekannt ( S.Gard, "Chemische Inaktivierung" in Buch "Virusnatur", Moskau, 1958)·
Es ist notwendig, den Prozeß der Virusinaktivierung so durchzuführen, daß bei einer vollen Zerstörung der Infektiosität die aritigenen Eigenschaften maximal beibehalten werden, was von den oben erwähnten chemischen Substanzen in ungenügendem Llaße gewährleistet wird.
So wird z.B. Formaldehyd, das öfter als andere genannte Verbindungen als Virusinaktivätor bei der Herstellung von Vakzinen gegen die Virusenzephalitis und das hämorrhagische Fieber ausgenutzt wird, in Konzentrationen von 2,4.10~2 Mol bis 6.10~^ Mol je nach dem virushaltigen Substrat benutzt; es ist schwer, dessen optimale Dosie-
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rung auszuwählen, was zur überflüssigen Denaturierung der
antigenen Eiweißstoffe und zur Senkung der Präparatimmunogenität führt; bei solchen Formaldehydkonzentrationen werden die Antigene zur Koinplementbindungsreaktion antikomplementär und dürfen in dieser Reaktion nicht verwendet werden.
Der andere Kachteil der Verwendung von Formaldehyd als Inaktivator ist die Langwierigkeit des Inaktivierungsprozesses, was sich auf die iinmunogene Vakzinenaktivität negativ auswirkt.
Um die unvermeidliche Senkung der antigenen Aktivität des Viruspräparats wegen der zerstörenden Formaldehydwirkung zu kompensieren, ist es notwendig, ständig sehr hohe
Viruskonzent rat ionen in dem zu inaktivierenden Material zu verwenden, was unter den Bedingungen der großen Fließbandproduktion ziemlich kompliziert ist. Außerdem ruft das Vorhandensein vom freien Formaldehydüberschuß in der Vakzine
schmerzhafte Empfindungen beim vakzinierten Patienten hervor und verlangt die spezielle Prozedur - die Deformalinisierung4ä©r Vakzine,
Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung besteht in
der Ausnutzung der selektiven Einwirkung des passenden Infektiosi^&tsinaktivators auf die Virusnukleinsäure unter
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gleichzeitiger Stabilisierung (Schutz vor der Zerstörung) von antigenen und immunogenen Viruseigenschaften,
Das andere Ziel der Erfindung besteht in der Ausarbeitung solch eines Verfahrens zur Inaktivierung der Virusinfek· tiosität, welches eine volle Zuverlässigkeit der Inaktivierung des Viruspräparats gewährleistet.
Das nächste Ziel der Erfindung besteht in der Ausarbeitung solch eines Verfahrens zur Inaktivierung der Virusinfektiosität, welches gestattet, den Inaktivierungsprozeß der Virusinfektiosität bedeutend zu beschleunigen.
Noch ein Ziel der Erfindung besteht in der Ausarbeitung des Verfahrens zur Virusinaktivierung, welches erlaubt, Vakzine von höherer Qualität und längerer Tauglichkeitsfrist zu erhalten.
Das unmittelbare Ziel der Erfindung besteht in der Ausarbeitung des Verfahrens zur Inaktivierung der Viren, der Erreger von Enzephalitis und hamorrhagischem Fieber, das erlaubt, unschädliche hochimmunogene Standardvakzinen und diagnostische Präparate zu schaffen, welche bei diesen besonders gefährliehen menschlichen Infektionen Verwendung finden können.
In Übereinstimmung mit dem Ziel wurde die Aufgabe gestellt, solch ein inaktivierendes Agens auszuwählen, welches die Virusnukleinsäure als Infektiositätsträger zer-
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stört oder stabil modifiziert und gleichseitig dessen antigene und immunogene Eigenschaften aufrechterhält.
Da© genannte Ziel und die anderen Ziele wurden durch ein Verfahren zur Inaktivierung der Virusinfektiosität unter gleichzeitiger Stabilisierung von Virusantigenen erreicht, welches erfindungsgemäß die Inaktivierung des von Zellendetritus befreiten flüssigen virushaltigen Materials mit einer der Ami noxnethylolverbindungen der Formel I
E2
, t
E-CH- HHCH0OH , (I)
d.
worin E1 H, CH2OH, COOH,
E2 H, (CH2)nCH3, (CH2)nEH2, (CH^COOH, η 1-4
bedeuten, in einer Konzentration von 6,6.10 J IUoI bis 1,6.10""^ iiol bei einer Temperatur von 4 bis 320C vorsieht, die je nach der Virusnatur und der Indikation des Präparats, bei der Exposition gewählt wird, die für eine volle Infektiosität&iinaktivierung des entsprechenden Virus genügend ist.
Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß die Infektiösität eines beliebigen Virus mit der Fukleinsäure verbunden ist, kantt man auf eine erfolgreiche Verwendung der genannten Verbindungen für die Inaktivierung vieler Viren rech-
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Unter dem Begriff das flüssige virushalt ige Llaterial ist zu verstellen:
1. Flüssigkeiten aus den mit Virus infizierten Zellenkulturen}
2. Suspensionen der zerriebenen Organengewebe der uit dem Virus infizierten Tiere in verschiedenen Pufferlösungen, die sui· Antigenenbereitsstellung verwendet werden, oder in physiologischer Lösung.
Wie oben gezeigt v/urde, wird die Inaktivierung bei einer Temperatur von 4 bis 320C je nach den Viruseigenschaften durchgeführt, während die Inaktivierungsdauer für jeden Virus unter Berücksichtigung der Tatsache experimentell gewählt wird, daß diese für eine volle Zerstörung der Virusinfektiosität ausreicht und gleichzeitig antigene und immunogene Viruseigenschaften in bedeutendem Laße nicht beeinflußt. So beträgt z.B. die optimale Temperatur im Falle der Virusinalcfcivierung der japanischen und Llilbenenzephalitis 32°G bei einer Exposition von 48 h.
Bei der Virusin&ktivierung des hämorrhagisehen Fiebers beträgt die optimale Temperatur 24°C bei einer Exposition von 24 h.
Die oben genannten Aminomethylolverbindungen der Formel I können bei der Formaldehydumsetzung mit einer Substanz
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der Formel II erhalten werden, die eine primäre Aminogruppe
E2
E1 - CH - KH0 , (II)
worin E1 H, OH2CH, COOH
E2 H, 2n3 2n2 ^ 2n
η 1-4
bedeuten.
Die Reaktion wird im liatriuinphosphatpuff er bei pH von 6,8 durchgeführt.
Die Erfinder haben festgestellt, daß die
genannten Äminomethylolverbindungen fähig sind, ITukleinsäuren und deren Komponenten umzusetzen. In Hodellexperimenten wurden die Gleichgewichtskonstanten der Reaktion von Nukleotiden mit Aminomethylolderivaten der Aminosäuren und
■ Aminoalkohole, die Gleichgewichtskonstanten direkter und umgekehrter Reaktionen bestimmt.
Die Reaktion wurde in 0,1 molarer Katriumphosphatpufferlösung bei einer Nukleotidenkonzentration von ca. 5·10 ''Mol
und einer Konzentrat ion von Aminomethylolverbindungen von 0,1 Mol durchgeführt. Zum Vergleich wurde Formaldehyd in einer Konzentration von 0,1 Hol genommen. Der Reaktionsverlauf
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wurde spektrophotoinetrisch kontrolliert.
Die Konstanten der Reaktionsgeschwindigkeit der pseudoersten Ordnung (E^, min ) sind in Tabelle 1 angeführt.
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die Urasetzungsge-BChwindigkeit der Aininomethylolverbindungen der Formel 1 mit liukleotiden um 100 mal und mehr die Reaktionsgeschwindigkeit von Formaldehyd mit Ilukleotiden übertrifft.
Tabelle 1
lmkleotid Aniinomethylolverbundungen von Lysin Äthanol- Formalde
amin hyd
R1=COOH E^=CH2OH
Glyzin Ha=BH2(OH2: >4 R2=H
0,124
R1=COO, R2=H 0,080
0,260 0,00176
JEP 0,290 0,096 0,051 0,0092
ZKP 0,056 0,08 0,057 0,0106
GMP 0,62 0,240 0,0036
d-AL3? 0,280 0,0127
d-ZLIP 0,056 0,0040
d-GHP 0,46
Darin bedeuten:
Adenosimaonophosphat
Zytidinmonophosx;hat
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GMP Guanidinmonophosphat
d-AIiP Desoxyadenosinmonophosphat
d-ZMP Desoxyzytidinmonophosphat
d-GMP Desoxyguanidinmonophosphat
Durch. Umsetzung von !nucleotiden mit der Aminomethylolverbindung geht die Hydrolyse der K-Glykosidbindungen in Purinesoxynukleotiden, d.h. die Depurinsation - das Abreißen der Purinbasen vom Kohlenhydratrest - vor sich, welche den Abbau der Nukleinsäure hervorruft, die schon bei Zirnmerteinper atur erfolgt.
Die Bildung der säurelöslichen Produkte (in % vom Gesamtgehalt der DlTS in der Lösung) bei der DNS-Behandlung mit Aminomethylolderivaten bei 100° ist in Tabelle 2 angeführt.
Tabelle 2
Glyzin E {=0O0H
Horvalin R1=COOH
Serin E l=COOE
Monomethylolderivat 0 Behandlung 40 sdauer, min 100
folgender Amine 2 20 4 60 80 7
1 3 5 6 '
20 50 78 100
20 34 46
20 34 50
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1 R2=CH2C00H 2 3 4 5 6 7
ß-Alanin R1=H 0 11 25 30 38 44
R1= COOH
Threonin R2=CHOH.CH3
R2=(CH2)4CC0H
p1 tr
Xl 5ΞΠ. 		0 1 10 18 3 35
I -Leuzin R1=COOH 0 3 10 18 23 30
Valin R2=CH(CH3)2
0 1 6 14 18 24
nur Atain 0 0 1 1 2 2,5
Die Kalbthymis-DITS (das II. g. nach der Denaturierung 1,2.10 ) wurde in einer Konzentration von 400 Ü g/ml in CJ molarer llatriumphosphatpufferlösung bei 100° mit 0,2 IiIoI Iv.onomethylolderivat inkubiert. pH-Wert des Gemisches betrug 5,5· Es wurden Proben zu 0,2 ml entnommen, 3,0 ml 0,5 η-Lösung von HClO2, wurden in der Kälte zugegeben und zentrifugiert. Zum niederschlag nach dem Zentrifugieren wurden wiederum 3,0 aß. 0,5 η-Lösung von HClO^ zugesetzt, durchgewärmt (20°, 100°) und nach der spektrophotometrischen Methode (nach der Absorptionsdifferenz bei 270 (j[ m und 290 hvx4
wurde das Volumen der säureunlöslichen Fraktion bestimmt.
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Praktisch wird das Verfahren folgenderweise verwirklicht1 Der virushaltigen Flüssigkeit wird die frisch .bereitgestellte Lösung der Aminomethylolverbindung der Formel I zugegeben. Diese Lösung wird folgenderweise erhalten. Zu 40%iger (13»3 Mol) wäßriger Formaldehydlösung wird die Lösung der Verbindung gegeben, die die primäre Aminogruppe dex Formel II in 0,1 molarer Natriumphosphatj^ufferlösung besitzt. Man bringt das Volumen des Gemisches mit Hatriumphosphatpuffer bis zur Formaldehydkonzentration von 0,166 Mol und der Konzentration der Aminoverbindung von 0,7 Mol; pH-V7ert der Lösung beträgt 6,ö. Dabei wird das genommene Formaldehyd um 80 ml verdünnt. Die fertige Lösung enthält das Aminomonomethylolderivat in einer Konzentration von 0,166 Mol und die freie Aminoverbindung (0,54 LIoI). Das freie Formaldehyd ist in der Lösung nicht enthalten.
Die nach dem oben genannten Verfahren bereitgestellte Losung der Ami nomethylolverbindung gibt man der virushaltigen Flüssigkeit in einer Menge von 20 bis 40 ml pro 1 1 virushaltige Flüssigkeit zu, rührt während 10 min sorgfältig und halt bei einer bestimmten Temperatur im Bereich von 4° bis 320C» die vorläufig je nach der Virusnatur gewählt wird, während der für die volle Inaktivierung der Virusinfektiosität ausreichenden Zeit.
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Der ganze Prozeß der Inaktivierung der Virusinfektiosität wird unter sterilen Bedingungen mit obligatorischer vorangehender Prüfung der virushaltigen Flüssigkeit auf das Fehlen der kontaminierenden Agentien (Mikroorganismen, Fungizide usw.) durchgeführt.
Ή ach der Inaktivierung wird das erhaltene L'aterial den Kontrollprüfungen auf die Unschädlichkeit (das Fehlen des lebendigen Virus) in den Versuchen zur Infizierung empfänglicher iüiere und außerdem auf die iirxiunologische und antigene Aktivität untersogen. Eei den günstigen Ergebnissen der Eontrollprüfungen wird das erhaltene Llaterial zur Verwendung als Vakzine und diagnostisches Antigen in serologischen Reaktionen für tauglich gehalten.
Das Verfahren gibt gut reproduzierbare Ergebnisse, verlangt keine speziellen Ausrüstungen und kann unter Betriebsbedingungen leicht verwirklicht v/erden.
Die Hauptvorteile des vorgeschlagenen Verfahrens sind folgende:
1. Die Erfindung gewährleistet die gründliche Opti~ laierung des technologischen IrodukticnsprozeEses verschiedener Arten von prophylaktischen und diagnostischen Viruspräparaten, z.B. gegen verschiedene Arten besonders gefährlicher Virusenzephalitis und hämorrhagischen Virusfiebers,
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sowie zur Anreicherung von für Laborarbeiter unschädlichen stabilisierten diagnostischen Antigenen aus den Erregern der oben genannten Infektionen?
2. die Möglichkeit der regelmäßigen Herstellung von hochinuaunogenen Standardserien der prophylaktischen inaktivierten Virusvakzinen und Antigene aus den Viren - den Erregern von besonders gefährlichen Infektionenj
3. eine hohe Zuverlässigkeit der erhaltenen Vakzinen und diagnostischen Eräparate, v/eil die Aminomethylolverbindungen die Virusinfektiosität schnell und irreversibel zerstören}
4. die Möglichkeit einer langwierigen Aufbewahrung der erhaltenen Vakzinen ohne Senkung der immunologischen Aktivität, weil die immunogenen und antigenen Eigenschaften stabilisiert sind.
Die Ergebnisse der experimenteilen Prüfungen des vorgeschlagenen Verfahrens zur Virusinaktivierung und Stabilisierung von Virusantigenen sind an 2 Viren gezeigt: die Inaktivierung des in der Gewebekultur des Ilühnerembryos gezüchteten Virus der Liilbenenzephal it is und des Virus des hämorrhagischen Fiebers, das im Gehirn der infizierten neugeborenen weißen Liäuse vermehrt wurde. Die genannten Viren wurden mit Hilfe von Monomethylollysin inaktiviert. Es wurden
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immunogene Präparate hergestellt, die eine ziemlich, hohe
immunologische Hesistenz bei vakzinierten v;eißen Hausen
(gegen die r.ilbenenzephalitis) schaffen und zur Immunisierung der Tiere - der Spender von hyperiinmunen ü-lobulinen (gegen das hämorrhagische Fieber) geeignet sind, sowie als Antigene in der Komplementbindungsreaktion verwendet werden.
In Tabelle 3 sind Angaben über die Inaktivierungsdynamik des Virus der Lilbenenzephalitis in einer Serie der
zellenlosen virushaltigen Flüssigkeit unter der Einwirkung von Formaldehyd und Konomethylollysin bei einer Temperatur von 32°C angeführt, die von einem bedeutenden Vorteil der Inaktivierung unter der 7/irkung von r.onoinethylollysin zeugen.
Tabelle 3
Inaktivierendes Agens Exposition (Stunden)
in einer Konzentra- —
tion 0 6 12 18 24 36 48 72
Viruskonzentration (!D^/Oi ml
1. Formaldehyd 6.10~3
I.I0I 5»6 4,0 3,6 3,5 3,0 2,0 0,7 0
2. Lonomethylollysin
3,3.1O"3 Hol 5,6 2,0 1,1 0,7 0 0 0 0
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Die Viruskonzentration ist in Logarithmen der Endvirustiter ausgedrückt, die in den Infizierungsversuchen von 5-6 g schweren weißen Mäusen mit dem Virus vor und während der Inaktivierung bestimmt werden.
Aus l'abelle 3 ist zu ersehen, daß die Virustiter,- der Milbenenzephalitis unter der Einwirkung des I.lonomethylollysins schon nach 6, 12, 18 h stark sanken und der Virue wurde ab 24 h nach dem Versuchsbeginn völlig inaktiviert, während Formaldehyd den Virus der L.ilbenenzephalitis sogar 48 h nach dem Versuchsbeginn nicht völlig inaktivierte. Beide Partien des inaktivierten Virus: mit Formaldehyd und mit Iuonomethylollysin wurden bei +320C während 72 h stehengelassen, und danach zur Vakzination weißer Mäuse nach der Standardmethodik ausgenutzt.
Die Erüfung der immunologischen Resistenz beider vakzinierten !.iäusegruppen zeigte, daß die mit der Aniinomethylolverbindung hergestellte Vakzine eine annehmbare Immunogenität besaß j deren Index betrug 4,0; die mit Formaldehyd hergestellte Vakzine hatten, einen Index von 2,9 und entsprachen den Forderungen des offiziellen Immunogenitätsstandards nicht. Die Behandlung des genannten Virus mit der Aminomethylolverbindung bei einer Temperatur von +320C beseitigte also die Virusinfektiosität während der ersten
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24 h und stabilisierte Virusantigene gegen die schädliche Einwirkung der erhöhten Temperatur bei der Aufrechterhaltung der Immunigenität des Präparats sogar nach der dreitägigen Behandlung unter den konstanten Temperaturbedingungen. Unter diesen Bedingungen führte die Behandlung mit .Formaldehyd zu einer bedeutenden Immunogenitätssenkung des Viruspräparats aus derselben Serie.
In 1-abelle 4 sind Prüfergebnisse der Immunität zum Virus der Kilbenenzephalitis angegeben, die in den Indexen der immunologischen Resistenz der mit dem Viruspräparat der Kilbenenzephalitis vakzinierten tläuse ausgedrückt sind, das mit r.onomethylollysin und Formaldehyd (.während '/2 h bei 320C) inaktiviert wurde.
Tabelle 4
Versuch Llonomethylollysin in Konzentrationen Formal-
dehyd
1,6.1(T^ UoI 3,3.1O~3 LIoI 6,6.10~\ol 6.1O*"3 LIol
1 5,4 5,8 5,5 . 4,8
2 5,0 4,6 3,7 3,1
Aus Tabelle 4 ist zu ersehen, daß die Inaktivierung des Virus der Lilbenenzephalitis mit drei verschiedenen Konzentrationen von Ivionomethylollysin in zwei Versuchen zur
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Erhaltung von hochimmunogenen Vakzinen in 5 Fällen aus 6 führte, während bei der Inaktivierung mit Formaldehyd ein Versuch den 8tandardforderungen nicht entsprach.
Die Ergebnisse der Inaktivierung des Virus der Milbenenzephalitis mit Monomethylollysin in einer Konzentration von 3,3.1O*"3 Mol bei 32°C während 48 und 72 h sind in Tabelle 5 angeführt.
Tabelle 5
Versuch Exposition Nachweis des Resistenz- über einst im-(Stunden) Virus im Itä- index vak— mung mit dem . parat nach zinierter Vakzinenstander Inakti- L'ause dard Vierung
48. O 6,2
72 O 6,2
48 O 6,4
72 . O 6,4
48 O 6,5
72 O 6,3
Wie aus Tabelle 5 zu ersehen ist, war der Virus der fcilbenenzephalitis während der genannten Zeit völlig inakti-
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viert; in allen Fällen erwies sich die Vaksinenimnunogenität als sehr hoch und die Vakzinen entsprachen den Stendardforderungen. Diese Angaben veranschaulichen die Möglichkeit der regelmäßigen Herstellung der Vakzine.. von einer ziemlich hohen Qualität mit Hilfe der Aminomethylolverbindungen.
Die Reproduzierbarkeit der Herstellung von hoehiimnunogenen Vakzinen wird von Tabelle 6 veranschaulicht. Aus 21 Serien der unter der Verwendung von Ilonomethylollysin erhaltenen Vakzinen wurde nur eine Serie verv/orf en. Die in den Eesistenzindexen ausgedrückten Immunogenitätskennziffern sind in Tabelle 6 angeführt.
Tabelle 6
ßerieniaenge der Eesistenzindexe, IE (Ig I^cq)
Vakzine gegen die
Llilbenenzephali- 3,0-3,9 4,0-4,9 5,0-5,9 6,0-6,9 7 tis
21 1x/ 6 4 8 2
■yr/
'Hationalforderungen: das Vakzin wird für immunogen gehalten, wenn der Eesistenzindex mindestens 4,0 beträgt.
Ih Tabelle 7 sind Angaben über die Vakzinenstabilität gegen die I.Iilbenenzephalitis v/ährend der Aufbewahrung
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2^28584
bei einer Temperatur von +4 bis +60C angeführt. Die Vakzinenimmunogenität ist in denselben Einheiten wie in Tabelle 6 ausgedrückt.
Tabelle 7
Versuch Lonomethylol— Resistenz— Aufbewah— £esistenzin~
lysinkonzen- index der rungsfrist dex nach der
tration, Ltol Vakzine, (Lonate) Aufbewahrung,
IE IR
1 6,6.10~3 5,5 14 6,1
2 3,3.1O~3 5,8 14 6,5
3 1,6.1O~3 4,6 14
In Tabelle 8 ist die Inaktivierungsdynasiik des Virus des hämorrhagisehen P.iebers (Stamm nach Hodge) unter der Konomethylollysineinwirkung bei einer Temperatur von +240C
dargestellt. Virustiter in Ig IDq 1,5.1O*"3 3.1O"3
Mol Mol		 Tabelle 8
Exposition
(Stunden) —		 Kontrolle Formaldehyd 3,2 3,16
1,65 0,7
0 0		 ,02 ^
Lonoinethylollysin
0
12
24
36		 5,1
4,5
3,66
2,8		 1,6.1O""3 3»3.1O~3
Llol Mol
1,8 1,36
0 0
0 0
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Das virushaltige Material ist die ICfiige Gehirnsuspension der mit dem Virus des hänorrhagisehen Fiebers infizierten neugeborenen weißen iV.äuse. Die Geschwindigkeit der Virus inaktivierung unter der Einwirkung des !..onomethylollysins v/ar bedeutend höher als bei der Behandlung mit Formaldehyd. Es v.airde eine direkte Abhängigkeit des Inaktivierungsgrades von der Konzentration des inaktivierenden Agens nachgewiesen. Diese Angaben über die Inaktivierung des Virus des hämorrha^ischen Fiebers stiirjnen mit den Ergebnissen der Versuche zur Inaktivierung des Virus der Eilbenenzephalitis überein und zeugen von den Vorteilen der Verwendung der Aminomethylolverbiridungen statt Formaldehyd.
In Tabelle 9 sind Angaben über die Antigenentiter des Virus des hämorrhagisehen Fiebers in der K.or;iplement— bindungsreaktion vor und nach der Behandlung mit Llonomethyl-
ollysin und Formaldehyd bei +4 und +24 C angeführt. Es wurde gezeigt, daß die Behsuidlung mit Konomethylollysin in einer Konzentration von 3» 3· 10 J I.iol das Entstehen von antikonplementären Eigenschaften nicht hervorruft und spezifische Antigenen&ktivität zur liomplementbindungsreaktion in wesentlichem Laße nicht herabsetzt. Die Beobachtungen zeigen die !löslichkeit der Herstellung von mit Hilfe
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der Aminomethylolverbindungen inaktivierten stabilisierten Antigenen zur Kompleiaentbindungsreaktion (IZBE) aus 'dem Virus des hämorrhagischen Fiebers.
Tabelle 9
Antigenentiter in der EBR
Antigene
vor Be- Behandlung bei +40G Behandlung bei handlung
+240G
Formalde- ilonome- IT or mal— Llonomehyd thylol- dehyd thylollysin lysin
Versuch 1 1:32 1:32 1:32 1:16 1:16
Versuch 2 1:32 1:16 1:32 1:8 1:16
Versuch 3 1:64 1:64 1:64 1:32 1:32
Versuch 4 1:32 1:32 1:32
Aus den angeführten Angaben ist zu ersehen, daß alle Versuche zur Inaktivierung der Virusinfektiosität in genannten Yirushaltigen Materialien einen bedeutenden Vorteil der Verwendung von ^onomethyiollysin in Vergleich zu Formaldehyd zeigen, was neue Perspektive zur Optimierung der Verfahren zur Herstellung von inaktivierten prophylaktischen Vakzinen und diagnostischen Virusantigenen er-
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öffnet.
Zum "besseren Verstehen der vorliegenden Erfindung werden Beispiele angeführt, die das Verfahren zur Inaktivierung der Virusinfektiosität unter gleichzeitiger Stabilisierung von Virusantigenen während der Herstellung der Vakzine gegen die I^ilbenenzephalitis und während der Herstellung des uninfektiösen antigenen diagnostischen Präparats aus dem Virus des hämorrhagischen Fiebers zur Eompleiaentbindungsreaktion veranschaulichen.
Beispiel 1
Herstellung der Vakzine gegen die Lilbenenzephalitis Es wurde die virushaltige Kulturflüssigkeit ausgenutzt, die die Lese des auf der infizierten Zellenkultur des Gev/ebes der Huhnereinbryonen im ITährmedium Nr. 199 bei der Inkubation während 3 Tage bei 37°C gezüchteten Virus der l.iilbenenzephalitis darstellt.
Die genannte virushaltige Kulturflüssigkeit wurde der Separierung bei 9000 U/min unterzogen, nachher durch klärende Asbestplatten und dann durch Filter mit Porengröße von 450 a m durchgelassen.
x/
Zu den auf solche Weise gereinigten ' FiItrat wurde
x/
'Anmerkung: Es ist möglich, die Reinigung des Präparats vom Zellendetritus entweder vor oder nach der Virusinaktivierung durchzuführen.
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die frisch vorbereitete Lösung des inaktivierenden Agens in Form von L'onomethylollysin zugegeben, das folgenderweise erhalten wurdei zu Formaldehyd (40%ige, d.h. 13» 3 molare wäßrige Lösung) wurden 0,7 LoI Lysinlösung in 0,1 molarer ITatriumphosphatpuffexlösung gegeben.
Die Endkcnzentration von Lonomethyloilysin betrug 0,166 Hol, der Lysinüberschuß 0,54 LoI, pH-V/ert der Lösung 6,8; das freie Formaldehyd ist in der Lösung nicht enthalten.
Die oben genannte LonomethylollysinlÖsung wurde in einer Lenge von 20 ml Lösung pro 1 1 gereinigte virushaltige Flüssigkeit hinzugegeben, was der lionomethylollysinendkonzentration von 3»3·10 J LToI entspricht. Die Inaktivierung wurdev bei einer Temperatur von +320O während 48 h verwirklicht.
Im Ergebnis der biologischen Prüfung wurde das Fehlen des lebenden Virus und das Vorhandensein der annehmbaren immunologischen Aktivität des Präparates festgestellt, das sich zur Verwendung als Vakzine als geeignet erwies.
Beispiel 2
Herstellung des uninfektiösen Antigens des Virus des hämorrha^ischen Fiebers für die Ivomplementbindungsreaktion. AIb den Virus des hämorrhagischen Fiebers enthaltendes
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Substrat wurde zwecks der Herstellung des Antigens zur Koiaplernentbir_dungsreaktion die 10%ige Suspension des Gehirngewebes der erkrankten neugeborenen weißen Mäuse in Boratpuffer bei pH von 9»O ausgenutzt; die Suspensionsklärung wurde durch das Zentrifugieren bei 13*000 U/min während 30 zu-V-durchgeführt.
Zur Entfernung der Komponenten der Wirtszellen aus dem Zentrifugat wurde Prctaminsulfat in einer Endkonzentration von 1,0 mg/ml ausgenutzt. Das Gemisch v/urde für 2 h bei einer Temperatur von 4°C unter periodischem Aufschütteln stehengelassen. Das gebildete Fräzipität wurde durch Zentrifugieren bei 3000 U/min während 15 min abgetrennt.
Der den Virus des hämorrhagisehen Fiebers enthaltenden Flüssigkeit über dem niederschlag wurde die analog zu Beispiel 1 erhaltene Lonoinethylollysinlösung in einer Lenge von 20 ml Lösung pro 1 1 virushaltige Flüssigkeit zugesetzt, was der Iwonomethylollysinkonzentration von 3»3·10 J Hol entspricht. Das Gemisch wurde 24 h bei einer Temperaxur ven 240O stehengelassen.
Das erhaltene Präparat wurde als Antigen in der Komplementbindungsreaktion erfolgreich verwendet ( siehe Tabelle 9)
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Claims (2)

  1. PATENTANSPRÜCHE :
    ί'Ü
    'Ü Verfahren zur Inaktivierung der Virusinfektiosität unter gleichzeitiger Stabilisierung von Virusantigenen
    durch die Einwirkung eines inaktivierenden Agens auf das flüssige virunhaltige Llaterial, dadurch gekennzeichnet, daß die Inaktivierung mit einer Ani.nonie~ thylolverbindung der Formel
    E2
    1 I
    E1 - CH - IJHCH2OH,
    worin R1 H, CH2OH, COOK
    R2 H, (OHg)nCSH3, (CH2)niiH2, (CH^COOH, (CH2)n0H
    η 1~4
    bedeuten, in einer Konzentration von 6,6«10 J bis 1,6.10 LIöl bei einer Temperatur von 4 bis 320C, die je nach der Virusnatur gewählt wird, bei der imposition durchgefüiirt v»'ird, die für eine volle Infektiositätsinaktivierung des entsprechenden Virus ausreicht.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge-
    11/0833
    kennzeichnet, daß die Inalct ivierung des virushaltigen Materials mit Lonomethylollysin durchgeführt wird·
    6(jy811/0833 /· ' ' ORIGINAL INSPECTED
DE19752528584 1974-08-27 1975-06-26 Verfahren zur inaktivierung der virusinfektiositaet unter gleichzeitiger stabilisierung von virusantigenen Withdrawn DE2528584A1 (de)

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US3981772A (en) 1976-09-21
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