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DE2513929C2 - Verfahren zur Immobilisierung intakter mikrobiologischer Zellen - Google Patents

Verfahren zur Immobilisierung intakter mikrobiologischer Zellen

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DE2513929C2
DE2513929C2 DE2513929A DE2513929A DE2513929C2 DE 2513929 C2 DE2513929 C2 DE 2513929C2 DE 2513929 A DE2513929 A DE 2513929A DE 2513929 A DE2513929 A DE 2513929A DE 2513929 C2 DE2513929 C2 DE 2513929C2
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Germany
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water
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stirred
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DE2513929A
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Roger Peter Waterford Conn. Nelson
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Original Assignee
Pfizer Inc
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Publication date
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Description

in der
R1 ein Wasserstoff- oder Chloratom oder eine Methylgruppe bedeutet und is W eine Gruppe der Formel
f V-S-Cl — C — R2 oder — C — X— (Y- X')„Z
darstellt, worin
R2 ein Halogenatom, ein Hydroxyl-, Azido-, 23-Epoxypropoxy-, 2,3-Epi»hiopropoxy-, N-25 (23-Epoxypropyl)amino-, N-[(p-Diazoniumchlorid)phenyl]amino-, Acryloyloxy-, niederer Al-
koxycarbonyloxy- oder Benzolsulfonyloxyrest, X ein Sauerstoffatom oder ein Rest — NR3- ist, worin R3 ein Wasserstoffatom oder Alkylrest
mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, Y ein Alkyirest mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen ist, 30 π " 1 oder 2 ist,
Z ein Wasserstoffatom, ein Halogenacetyl-, 2-(4,6-Dichlor)-s-triazinyl-, p-Toluolsulfonyl-, p-(Ha-
logenmethyl)-benzoyl- oder Cyanorest ist und X' ein Sauerstoffatom oder einen Rest der Formel — NR3- darstellt, worin R3 wie oben definiert
ist, mit der Maßgabe, daß X' ein Sauerstoffatom ist, wenn Z ein p-Toluolsulfonylrcst ist: 35 oder
(2) mit einem Additionspolymerisat dieser Monomeren jeweils unter Bildung kovalenter Bindungen mit den mit Aminogruppen reagierenden Gruppen des Monomeren oder Polymeren umgesetzt werden, wobei im Falle der Umsetzung mit dem Monomeren anschließend in Gegenwart eines Vernctzungsmonomers und Polymerisationsinitiators polymerisiert wird, mit der Maßgabe, daß, wenn R2 eine Hydroxylgruppe 40 oder Z ein Wasserstoffatom darstellt, das Monomere oder Polymere vor Umsetzung mit den Zellen
zuvor durch Umsetzung mit einem Carboxylgruppen aktivierenden Reaktionsmittel in bekannter Weise bzw. einer Verbindung der Formel Halogen-Z in ebenfalls bekannter Weise aktiviert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in dem eingesetzten Monomer oder Polymer 45 die mit einer Aminogruppe reagierenden Gruppen Epoxid-, Halogencarbonyl- oder Halogcnmethylcarbo nylgruppen sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor dem Binden mit einem polyfunktionellen Vernetzungsmittel umgesetzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das polyfunktionelle Vernetzungsmittel so Glutaraldehyd ist.
55 Enzyme sind wegen ihres hohen Spezifitätsgrades bei vielen chemischen Reaktionen den konventionellen
Katalysatoren weit überlegen. Faktoren wie hohe Isolierungskosten, Neigung zur Instabilität, wenn die Enzyme
aus dem Milieu der intakten Zelle herausgenommen werden, und Erhältlichkeit nur in löslicher Form haben bisher die Verwendung von Enzymen stark beschränkt.
Die Immobilisierung von Enzymen durch Binden an oder Einschließen in einem festen Trägermaterial haben
60 dazu beigetragen, diese Schwierigkeiten zu überwinden und die Verwendung von Enzymen wirtschaftlicher zu gestalten. Die verschiedenen physikalischen und chemischen Methoden zur Immobilisierung werden in Berichten, wie »Immobilized Enzymes« von O. R. Zaborsky(CRS Press, 1973) erörtert.
Die Immobilisierung der ganzen intakten Zelle unter Umgehung der Enzymisolierung und unter Überwindung der Siabilitätsproblemc ist bekannt. Bisher blieb jedoch dieser Weg im wesentlichen auf physikalische
ω Immobilisierungsmethoden begrenzt. Beispiele sind die Adsorption von Zellen von Streptomyccs phaeochromogenes. die aktive Glucoseisomerase enthalten, auf Hautkollagen (Biotech. & Bioeng., XV, Seite 565 [1973]) und der Geleinschluß von Pilzzellen, die Hydroxylaseenzym zur Umwandlung der Verbindung S in Corlisol enthalten (Scientific American, März 197i, Seite 30). Diese Immobilisierungsmethoden verhindern jedoch nicht die
Loslösung der Zellen von dem Trägermittel. Die Art der Bindungskräfte ist derart, daß die Reaktionsbedingungen sehr eingeengt sind, damit eine solche Loslösung, die mit dem Verlust enzymatischer Aktivität und einer möglichen Kontamination des Verfahrensverlaufs verbunden ist, verhindert oder auf ein Kleinstmaß zurückgeführt wird.
Aus der DE-OS 17 68 841 sind kovatent gebundene Konjugate von sauren Polysacchariden, wie Pectinsäure, Alginsäure, Cellursäure oder Carrageenan, und komplexen organsichen Stoffen, nämlich biochemisch aktiven eiweißhaltigen oder phenolische Hydroxylgruppen enthaltenden Substanzen bekannt, bei denen die Komponenten kovalent über Amidbindungen, Esterbindungen oder Amid-Ester-Bindungen gebunden sind. Diese Konjugate sollen lösliche Natriumsalze, aber unlösliche Calciumsalze bilden; sie sind deshalb bedingt lösliche Produkt"·. Bekanntlich sind Polysaccharide anders; aufgebaut als Polymerisate aus additionspolymerisierbaren Monomeren.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zujgrunde, ein Verfahren anzugeben, mit dem intakte Mikroorgansimen dauerhaft immobilisiert werden können, um hierdurch beständige unlösliche Mikroorganismen-Zellimmobilisate zu schaffen.
Hierzu schlägt die Erfindung das in Anspruch 1 angegebene Verfahren vor; bevorzugte Ausgestaltungen is dieses Verfahrens sind Gegenstand der Unteransprüche 2 bis 4.
Es ist gefunden worden, daß mikrobiologische Zellen durch eine chemische kovalente Bindung der Zellen an eine Matrix aus dem wasserunlöslichem teilchenförmigen Polymerisat wirksam immobilisiert werden können. Die chemische Bindung kann entweder mit dem bereits gebildeten Polymerisat oder dem mit reaktionsfähigen Monomeren vor dessen Polymerisation erreicht werden. Außerdem verhindert eine Behandlung der Zellen mit einem polyfunksisnellen Vernetzungsmittel vor, während oder nach dem Binden einen Enzymverlust der Zelle.
Das Verfahren der Erfindung führt zu einem Präparat, das mikrobiologische Zellen enthält, die kovalent an eine Matrix aus wasserunlöslichem teilchenförmigen! Polymerisat gebunden sind.
Erfindungsgmäß werden also intakte mikrobiologische Zellen an wasserunlösliches teichenförmiges Polymerisat durch reaktionsfähige Gruppen an dem Polymerisat chemisch gebunden. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß ganze Zellen als solche, die eine Quelle für Enzyme sind und eine größere Größenanordnung als Enzyme aufweisen, nach dem ansprachisgemäßen Verfahren in wirksamer Weise durch chemische kovalente Bindung immobilisiert werden können. Eine solche Bindung kommt häufig durch Umsetzung von Zellaminogruppen mit den reaktionsfähigen Polyrnerisatsubstituenten zustande. Außerdem stehen auch andere Gruppen, wie z. B. Hydroxyl- und Sulfhydrylgruppen, in den Zellen zur Verfügung und können eine Rolle bei dem Bindungsmechan'smus spielen, weil mit Aminogruppen reagierende Polymerisauubstituenten, wie z. B. Expoxid-, Halogencarbonyl- und Halogenmethylcarbonylgruppen, auch gegenüber Hydroxyl- und Sulfhydrylgruppen, die in den Zellen vorhanden s'm-J, reagieren.
Die Bindung kann entweder vor od«r nach der Polymerisatbildung erfolgen. Im ersteren Fall werden die Zellen mit einem polymerisierbaren .thylenisch ungesättigten Monomeren mit einer reaktionsfähigen Gruppe des in Anspruch 1 angegebenen Typs und einem Initiatorsystem in Berührung gebracht und das von den Zellen getragene Monomere wird dann in Gegenwart eines Vernetzungsmonomeren und des Initiatorsystems polymerisiert oder copolymerisiert. Im letzteren Fall werden die Zellen direkt mit dem teilchenförmigen Polymerisat aus diesen Monomeren reaktionsfähigen Gruppen in Berührung gebracht.
Die polymerisierbaren äthylenisch ungesäutigten Monomeren für diese Polymerisate, die zur Durchführung der Erfindung entweder nach der Vor- oder Nachbindetechnik geeignet sind, besitzen die Formel I
CH2=C-W
I (D
R1
R' Wasserstoff, Methyl oder Chior ist und
W eine Gruppe der Formel
-R2 oder -C-X-(Y-X)nZ
55 Ö
R2 Halogen, Hydroxyl, Azido, 2,3-Epoxypropoxy, 23-EpIIhIOPrOpOXy, N-(2,3-Epoxypropyl)amino, N-[(p-
Diazoniumchlorid)phenyl]amimo, Acryloyloxy, niederes Alkoxycarbonyloxy oder Benzolsulfonyloxy ist, X Sauerstoff oder N R3 ist, worin R3 Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist,
Y Alkylen mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen ist,
π = 1 oder 2 ist,
Z Wasserstoff. Halogenacctyl, 2-(4,6-Dichlor)-s-triazinyl, p-Toluolsulfonyl, p-(Halogenmcthylbcnzoyi
oder Cyano ist und b5
X' gleich X (siehe oben) ist mit der Maßgabe, daß, wenn Z p-Toluolsulfonyl ist, dann X'Sauerstoff ist.
Für die Bindung werden Monomere und Polymerisate vorgezogen, die Epoxid-, Halogencarbonyl- und
O Cl -c O O
Il
— s —
Il		 -S-Cl Il
Q
Il
0		 O
V.
Halogenmethylcarbonylgruppen enthalten. Besonders geeignet sind solche Polymerisate, die die reaktionsfähigen Monomeren 2,3-EpoxypropylmethacryIat (Glycidylmethacrylat), 2r3-Epithiopropylmethacrylat, Methacryloylchlorid und Bromacetylhydroxyäthylmethacrylat enthalten-
In dem Fall, in dem die Monomeren und Polymerisate nichtreaktionsfähige funktioneile Gruppen enthalten, d. h. wenn R2 in der obigen Monomerformel I Hydroxyl ist oder Z in dieser Formel I Wasserstoff ist, werden die funktioneilen Gruppen in reaktionsfähige Substituenten nach bekannten Methoden umgewandelt Dieses erfordert häufig die Verwendung multifunktioneller Reaktionsmittel niedrigen Molekulargewichts. So können, wenn R2 in der Formel I Hydroxyl ist, die Carboxylgruppen des Monomeren oder Polymerisats durch Umsetzung mit einem geeigneten Carboxylgruppen-aktivierenden Reaktionsmitel aktiviert werden, z. B. mit Carbodiimid wie
Dicycishexylcarbodümid oder Äthylmorpholinocarbodiimid, N-ÄthyI-5-phenylisoxazoliuni-3'-sulfonat (Woodward's Reagens K), Keteniminen, z. B. Pentamethylenketencyclohexylimin, acetylenischen Äthern, z. B. Äthoxyacetylen, Hexahalogencyclotriphosphatriazinen, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxysuccinimid und anderen Reaktionsmittein, die zur Bildung einer Peptidbindung benutzt werden. Wenn Z in der Formel I Wasserstoff ist, können die Monomer- oder Polymerisathydroxylgruppen gleichfalls nach Standardverfahren mit Halogen-Z, insbesondere Bromacety lbromid, Cyanbromid und 2-Amino-4,6-dichlor-1,3,5-triazin aktiviert werden.
Das Immobilisierungsverfahren ist auf mikrobiologische Zellen, wie z. B. Bakterien, Hefen Actinomyces und Pilze anwendbar. Bevorzugte Zellen sind solche, in denen die Hauptenzymsysteme Oxidoreductasen sind, insbesondere Glucoseoxidase, die keine löslichen Cofaktoren erfordert, Hydrolasen, wie 2. B. «v^-Analysen und Peptidasen und insbesondere Penicilinacylase, Lyasen, vor allem solche, die Kohlenstoff-Sauersloff-Bildungen spalten, z. B. Phenylalaninammoniaklyase und Asparaginatammoniaklyase, oder die Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen spalten, und isomerasen, wie z. B. Racemasen, Epimerasen, cis-trans-Isornerr/vn und insbesondere GlüCöScisörnerase. Zweckmäßige Bakieriengaiiitngeri sind Pseudomcmas, Xanthümonas, Aretobacter, Aicanigenes, Flavobacterium, Escherichia, ^erobacter, Erwinia, Serratia, Proteus, Micrococus, Sacina, Lactobacillus, Bacillus, Nocardia, Streptomyces und Corynebacterium. Zweckmäßige Pilz- und Hefegattungen sind Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, Mucor, Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Glomerella, Rhizopus, Saccharomyces, Conidiobolus, Byssochlamys, Candida, Chaetop'um, Trichoderma, Septoria, Coprinus, Neurospora, Humucola und Trichosporon. Die vorgezogene Actinomycesgattung ist Micropolyspora. Besonders zweckmäßige Arten sind Escherichia coli, Bacterium cadaveris, Proteus rettgeri, Rhodotorula gracilis, Penicilium chrysogenum und Aspergillus niger.
Die kovalente Bindung der Zellen ar. das reaktionsfähige Polymerisat oder die Bindung an. das reaktonsfähige Monomere, gefolgt von der Polymerisation oder Copolymerisation des Monomeren, findet im wäßrigen Medium statt. Obwohl die Temperatur zum Binden an das Polymerisat oder Monomere oder für die Polymerisation nach dem Binden an das Monomere innerhalb eines großen Bereichs variiert werden kann, ist der günstigste Bereich 5 bis 500C und insbesondere 10 bis 30° C. Die zur Herstellung der Bindung erforderliche Zeitdauer hängt von dem System und der zur Herstellung der Bindung angewandten Temperatur ab, liegt aber normalerweise in dem Bereich von 0,5 bis 35 Stunden. Die Zeit zur Bindung an das Polymerisat beträgt meistens 15 bis 30 Stunden und an das Monomere 1 bis 5 Stunden. Die Polymerisation ist normalerweise in 1 bis 6 Stunden beendet. Das Gewichtsverhältnis von Polymerisat zu Zellen (bezogen auf das Trockengewicht) kann erheblich variiert werden, und das zweckmäßigste Verhältnis beträgt 0,1 bis 25 und insbesondere 0,5 bis 4.
Wenn die Zellen an das reaktionsfähige Monomere gebunden sind, wird die nachfolgende wäßrige Additionspol} inerisation mit einem oder mehreren Comonomeren oder ohne Comonomer in Gegenwart von difunktionellen Verneizungsmonomeren und eines lnitiatorsyste:.is durchgeführt. Comonomere, Vernetzungsmonomere und Initiatorsysteme, die üblicherweise bei diesem Polymerisationstyp benutzt werden und die enzymatische Aktivität der Zellen nicht zerstören, können dafür in einfacher Weise angewendet werden.
Geeignete Comonomere sind z. B. Acrylsäure, Λ-Chloracrylsäure, Methacrylsäure und der Glycidylniederalkylester, N-N-(disubst.)-Aminoalkylester, Amide, mit niederem Alkyl substituierte Amide, methylolsubstiluiertc Amide, N-ftionosubstituierte Aminoalkylamide und die entsprechenden N,N-disubstituierten Aminoalkylamide Styrol, Butadien und Isopren. Besonders günstige Comonomere sind Styrol, Acrylsäure, 2-ydroxy-3-(l-[4-methylpiperaziny'fj-propylmethacrylat und insbesondere Methylmethacrylat.
Eine gro'Je Vielfalt von Vernetzungsmonomeren, die dem Endprodukt den Charakter eines dreidimensionalen Netzwerke und vVasserunlöslichkeit verleihen, können angewendet werden, wie z. B. Acrylmonomere oder Olefinverb'ndungen. Typische Monomere hierfür sind
lJ-Butylendiacrylat.Äthylenglykoldimethacrylat. 1,6-Hexamethylendiacrylat, LS-Butylendimethacrylat,
Äthylendiadrylat, Diäthylenglykoldimethacrylat, N1N' Viethylenbisacrylamid,
Neopentylglykoldimethcrylat. U.l-Trimethyloläihantrimethacrylat und Divinylbenzol.
Ein besonders zweckmäßiges Vernetzungsmonomeres ist N.N'-Methylei.bisacrylamid.
Die Polymerisations- und Copolymerisationsreaktion werden durch freie Radikale initiiert. Geeignete freiradikalische Initiatorsysteme sind solche, die freie Radikale mit einer geeigneten Geschwindigkeit für die Polymerisation oder Copolymerisation «inter den wegen der Wärmeempfind'ichkeit des Zellenzymteils erforderlichen milden Bedingungen bilden. Redoxinitiatorsysteme werden aus diesem Grund bevorzugt. Beispiele für solche Systeme sind Peroxyverbindungen, z. B. Ammonium-, Natrium- oder Kaliumpersulfat, Benzoylpcroxid und Di-(sek.-butyl)peroxydicarbonat in Kombination mit einem Reduktionsmittel, wie z. B. Natriumthiosuifal, Nalriummctabisulfit. Eisen(ll)ammoniumsulfai-hexahydrai, Dimethylaminopropionitril oder Riboflavin. Ein günstiges Initiatorsysiem ist Dimethylaminopropionitril-Ammoniumpersulfat.
b5 Die Zusammensetzung des Polymerisats kann erheblich variieren, wobei die bevorzugte Zusammensetzung in Mol-%, belogen auf die gesamten Monomeren, 15 bis 90% an mit den Zeilen reaktionsfähigen Monomeren, 0 bis 60% an Comonomeren und 10 bis 40% an Vernetzungsmonomeren entspricht. Diese Verhältnisse werden vorgezogen, gleicii ob die Zellen an das Monomere oder .in das bereits gebildete Polymerisat gebunden werden.
In bestimmtem Rillen werden die Zellen mit einem polyfunklionellon Vernetzungsmittel behandelt, um einen Enzymverlust der Zellen herabzusetzen. Obwohl der genau ablaufende Mechanismus nicht völlig geklärt ist, wird angenommen, daß eine Klasse der polyfunktionellen Reaktionsmittel mit den Aminogruppen der Zellmembranen reagiert, und diese dadurch vernetzt, wodurch die Porosität der Zellmembran in wirksamer Weise verringert wird;, die andere Klasse erreicht dieses Ergebnis durch Aktivierung der in der Zellmembran vornandenen Carboxylgruppen, die dann mit Membranaminogruppen durch Bildung von Amidbindungen reagieren. Zu typischen Beispielen für die erste Klasse gehören Reaktionsmittel wie Methylglyoxal (Pyruvaldehyd), Glyoxal, Hydroxyadipaldehyd, Cyanursaurechlorid, tetraazotiertes o-Dianisidin, bisdiazotiertes Benzidin, 1,3-Difluor-4,6-dinitrobenzol, Toluol-2,4-diisocyanat und insbesondere Glutaraldehyd, während zu der zweiten Klasse Reaktionsmittel gehören, wie Äthylchlorformiat und wasserlösliche Carbodiimide, z. B. l-Äthyl-3-(3'-dimethylami-(■-,opropyljcarbodiimid-hydrochlorid.
Die Zellen können entweder vor dem Binden, während des Bindens oder nach dem Binden an das reaktionsfähige Monomere oder Polymerisat behandelt werden. Wie beim Binden der Zellen wird die Behandlung in wäßrigem Medium vorgenommen. Obwohl die Zellen innerhalb eines breiten Temperaturbereichs wirksam behandelt werden können, sind 5 bis 500C und insbesondere 10 bis 30°C am zweckmäßigsten. ]e nach der is ungewandten Temperatur und dem benutzten Mittel erfordert die Behandlung normalerweise 0,5 bis 10 Stunden, speziell 2 bis 4 Stunden. Die erforderliche Menge des Mittels kann erheblich schwanken, beträgt aber im allgemeinen I bis 50 Gew.-% der Zellen (auf Trockenbasi·;) und insbesondere 5 bis 25 Gew.-% der Zellen. ι
Die beschriebene Zellimmobilisierung durch chemische kovalente Bindung an wasserunlösliches Polymerisat, gegebenenfalls unter Behandlung der Zellen, um einen Enzymverlust der Zellen auf ein KleinstmaLS zurückzuführen, führt zu einem haltbaren immobilisierten Enzymsystem, ohne daß es erforderlich wäre, das Enzym zu isolieren. Wegen der Beständigkeit und der leicht filtrierbaren Teilchenform kann das Produkt in wirksamer Weise bei wäßrigen katalytischen chemischen Prozessen verwendet werden, bei denen entweder ansatzweise oder kontinuierlich unter Rückführung von Material gearbeitet wird.
Beispiel 1 ,
Zu 80 g Glyciidylmethacrylat plus 1,0 Liter Wasser wurden unter Rühren 30 g N.N'-Methylenbisacrylamid gegeben. Nach dem Rühren des Gemisches für 15 Minuten bei Raumtemperatur wurden 10 g Methylmethacrylat zugegeben und das Gemisch auf etwa 5°C abgekühlt und Stickstoffgas in das kalte Gemisch für 15 Minuten geblasen. Dann wurden 20 ml Dimethylaminopropionitril und 2 g Ammoniumpersulfat zugegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoff bei 100C gerührt, bis die Polymerisation begann, dann wurde eine weitere Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt und schließlich 2 Stunden stehengelassen. Etwa 750 ml Wasser wurden zur erhaltenen festen Substanz gegeben, und das Gemisch wurde stark gerührt, um das Polymerisat zu zerteilen. Die feste Substanz wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet, und es wurden 120 g weißes 35 teilchenförmigeü Polymerisat erhalten.
Eine A.niger(NRRL-3)-Fermentationsbrühe, die unter aeroben Unterwasserbedingungen bei 33°C und einem pH-Wert von 5<Β—7,0 auf Giucoscsubsirai gczücnici wurden war, würde minen, und die Zellen wurden mit Wasser gewaschen und zu einer halbtrocknen Paste verpreßt. Die Zellen (250 g, 55 g trocken) wurden in eine Lösung eingetragen, die 22 g 25 Gew.-°/oigen wäßrigen Glutaraldehyd in 1000 ml Wasser enthielt. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 6,2 eingestellt, und die Suspension wurde 1 3/4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die festen Substanzen wurden abfiltriert und mit Wasser gewaschen und ergaben 104 g feuchte behandelte Zellen, die 76% der ursprünglichen Glucoseoxidase-Aktivität besaßen.
Eine Suspension von 32 g feuchten behandelten Zellen und 16 g des Glycidylmethacrylatpolymerisats in 240 ml Wasser wurde 30 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Die festen Substanzen wurden mit Wasser gewaschen und ergaben 126 g feuchte immobilisierte Zellen, die 58% der Glucoseoxidas-Aktivität der ursprünglichen unbehandelten Zellen aufwiesen.
Beispiel 2
Zu einer Aufschlämmung von 600 mg der wie in Beispiel 1 zubereiteten feuchten behandelten A.niger-Zellen (23 Einheiten Glucoseoxidase-Aktivität/110 mg) in 20 ml Acetonitril wurden gleichzeitig 600 mg Methacryloylchlorid und 400 mg Triäthylamin gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt und dann in 20 ml Wasser eingetragen (wobei ein pH-Wert von 6,0 erhalten wurde). Zu dem wäßrigen Gemisch wurden unter Stickstoff 1,3 g Ν,Ν'-Methyllenbisacrylamid, 750 mg Methylmethycrylat und 300 mg Acrylsäure gegeben. Der pH-Wert des Gemisches wurde auf 6,7 eingestellt, und das Gemisch wurde dann mit 0,5 ml Dimethylaminopropionitril und 250 mg Ammoniakpersulfat behandelt. Nach 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit weiteren 150 mg Ammoniumpersulfat behandelt und für eine Stunde gerührt Ein gleiches Volumen Wasser wurde dem Reaktionsgemisch zugegeben, und das Gemisch wurde zentrifugiert Der Rückstand wurde filtriert und mit Wasser gewaschen, und es wurden 32,25 g feuchte immobilisierte Zellen erhalten, die 78% der Glucoseoxidase-Aktivität der ursprünglichen unbehandelten Zellen aufwiesen. : '■>
B e i s ρ i e I 3 '>:
(Anwendungsbeispiel) 65 ¥
Die feuchten immobilisierten Zellen des Beispiels 1(473 g) wurden in 100 ml einer wäßrigen Lösung eingetra- >j
gen, die 10 g Glucose enthielt und das Gemisch wurde unter Belüften 21 Stunden bei Raumtemperatur gerührt ΐ;
Eine 99%ige Umwandlung zu einem Gemisch von Gluconsäure und delta-Gluconlacton wurde erzielt, und 75% der ursprünglichen Enzymaktivität war erhalten geblieben.
Diese Oxidation konnte unter Verwendung von 30 g der feuchten immobilisierten Zellen des Beispiels 2 in 20 ml einer wäßrigen Lösung, die 2 g Glucose enthielt, unter Erzielung einer vergleichbaren Umwandlung und Erhall einer vergleichbaren Enzymaktivität wiederholt werden.
Beispiel 4
Eine Proteus rettgeri (ATCC 9250) Fermentationsbrühe, die unter aeroben Unterwasserbedingungen bei ίο 28°C und einem pH-Wert von 6,8 —7,0 auf Milchkaseinsubstrat gezüchtet worden war, wurde zentrifugiert, und die Zellen wurden erneut in Wasser aufgeschlämmt und zu einer halbtrocknen Paste verpreßt. Zu einer Aufschlämmung der feuchten Zellen (?3g Trockengewicht) in 100 ml Wassser wurden 4 g 25 Gew.-%iger wäßriger Glutaraldehyd gegeben. D.is Gemisch wurde bei einem pH-Wert von 7,0 3 Stunden gerührt und dann zentrifugiert. Die behandelten Zellen wurden erneut in 100 ml Wasser suspendiert, und 7,5 g des Glycidylmethacrylatpolymerisats des Beispiels 1 wurden unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wurde bei einem pH-Wert von 7,0 bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt. Die festen Substanzen wurden abfiltriert, Mit Wasser gewaschen und als feuchter Kuchen bis zur Verwendung aufbewahrt. Die immobilisierten Zellen enthielten 65% der Aktivität der ursprünglichen unbehandelten Zellen, gemessen durch die Umwandlungsgeschwindigkeit von Penicillin G in 6-Aminopenicillansäure.
Beispiel 5
Zu einer Aufschlämmung von 20 g (5,0 g trocken) der immobilisierten Proteus rettgeri-Zellen des Beispiels 4 in 500 ml Wasser bei einem pH-Wert von 8,0 und 37°C wurden 5 g Kalium-Penicillin G gegeben. Der pH-Wert der Aufschlämmung wurde bei 8,0 durch eingestellte Zugabe von 1-N NaOH gehalten. Die Hydrolyse war nach 3 Stunden beendet. Die immobilisierten Zeilen wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und als feuchter Kuchen für eine weitere Verwendung aufbewahrt. Das Filtrat wurde mit 2-N HCI auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und mit Äthylacetat extrahiert. Der pH-Wert der erhaltenen wäßrigen Schicht wurde mit 2-N NaOH auf 4,3 eingestellt, und die wäßrige Schicht wurde konzentriert und abgekühlt und ergab eine weiße kristalline Substanz.
Die Kristalle wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und luftgetrocknet und ergaben 2,17 g (75%ige Ausbeute) rein 6-Aminopenicillansäure. Die immobilisierten Zellen behielten nach 20 Hydrolysezyklen noch etwa 50% der Penicillinaclylase-Aktivität der ursprünglichen immobilisierten Zellen des Beispiels 4.
Beispiel 6 35
Zu einem Gemisch von 3,6 g Bromacetylhydroxäthylmethacrylat in 15 ml Wasser wurden unter Rühren des Gemisches unter Stickstoff 375 mg N.N-Methylenbisacrylamid gegeben. Das Gemisch wurde auf 5~C abgekühlt üinj ΐϊϊϊί 0yfc-> ΐΐΐι i^iiTiCiiiyiSininopiOpiGniinOi ümi 3S ?Mg AiTünöriiümpcfSünäi uchänucii. l/US *jcmi5Ci! Wüfuc langsam bei Raumtemperatur gerührt, bis die Polymerisation begann. Der Rührer wurde dann abgestellt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden stehengelassen. Die erhaltene Aufschlämmung wurde mit 25 ml Wasser verdünnt und filtriert. Der Kuchen wurde mit Wasser gewaschen und luftgctrocknc; und ergab 3.7 g teilchenförmiges Material.
Feuchte ausgedrückte Proteus rettgeri-Zellen, die wie in dem Beispiel 4 gezüchtet und isoliert worden waren
(10 g, 2 g trocken), wurden in eine Lösung eingetragen, die 0,8 g 25Gew.-%igen wäßrigen Glutaraldehyd in 50 ml Wasser enthielt. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 7,0 eingestellt, und die Suspension wurde 3
Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann zentrifugiert. Die behandelten Zellen wurden erneut in 50 ml Wasser aufgeschlämmt und zu einer halbtrocknen Paste verpreßt. Eine Suspension von 10 g der behandelten Zellen und 20 g des Bromacetylhydrocyäthylmethacrylatpolymeri-
sats in 120 ml Wasser wurde 30 Stunden bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 7.0 gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, und der Kuchen wurde mit Wasser gewaschen und ergab 36,8 g feuchte immobilisierte Zeilen mit 75% der Penicilinaclylase-Aktivität der ursprünglichen unbehandelten Zellen.
Beispiel 7
In einer Aufschlämmung von 46 g der feuchten immobilisierten Zellen des Beispiels 5 in 500 ml Wasser bei einem pH-Wert von 8,0 und 37° C wurden 5 g Kalium-Penicillin G gegeben. Der pH-Wert der Aufschlämmung wurde bei 8,0 durch eingestellte Zugabe von 1 N NaOH gehalten, und die Hydrolyse wurde nach 3 Stunden beendet Die immobilisierten Zellen wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann als feuchter Kuchen bis zum weiteren Gebrauch aufbewahrt Der pH-Wert des Filtrats wurde mit 2 N HCI auf 2 eingestellt, und das Filtrat wurde mit Athylacetat extrahiert Der pH-Wert der erhaltenen wäßrigen Schicht wurde auf 43 mit 2 N NaOH eingestellt und die wäßrige Schicht wurde konzentriert und abgekühlt und ergab kristalline 6-Aminopcnicilliansäurc.
Beispie! 8
Eine Suspension von 25 g feuchten behandelten A.r.iger-Ze!!en (wie in Beispiel 1) sowie 2 g Giycidyimethacrylat in 60 ml Wasser wurde 17 Stunden bei 7° C gerührt Die Suspension wurde dann zu einem Gemisch von 22 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid, 2 ml Styrol, 450 mg Methylmethacrylai, 0,5 ml Dimethylaminopropionitrill und
1,5 g 2-Hydroxy-3-(l-[4-methylpiperazinyl])-propyl-methacrylat in 40 ml Wasser bei einem pH-Wert von 6.8 gegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoff mit 200 mg Ammoniumpersulfa behandelt und für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die festen Bestandteile des Reaktionsguts wurden abfiltriert und mit Wasser gewaschen, und es wurden 43,6 g feuchte immobilisierte Zellen mit 75% der Glucoseoxidase-Aktiviiäl der ursprünglichen tinbchandclten Zellen erhalten. -,
Beispiel 9
Die feuchten !.'!!mobilisierten Zellen des Beispiels 8 (28,3 g) wurden in 200 ml einer wäßrigen Lösung eingetragen, die 20 g Glucose enthielt, und das Gemisch wurde unter Belüften 21 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. ;o Es wurde eine 80%ige Ausbeute von einem Gemisch von Gluconsäure und delta-Gluconlacton erhalten. Die nach der Umsetzung erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, und die festen Substanzen wurden mit Wasser gewaschen und ergaben 28 g feuchte immobilisierte Zellen mit 82% der ursprünglichen Enzymaktivität.
Beispiel 10
Eine Suspension von 5 g feuchter ausgedrückter Proteus rettgeri-Zellen, gezüchtet und isoliert wie in Beispiel 4, und 10 g Glycidylmethacrylatpolymerisat des Beispiels 1 in 65 ml Wasser wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und ergab 26,9 g feuchte immobilisierte Zellen mit 62% de:r anfänglichen Penicillinacylase-Aktivität.
Die immobilisierten Zellen (25 g, I g Trockenzellgewicht) wurden in eine Lösung eingetragen, die 0.4 g 25 Gcw.-%igcn wäßrigen Glutaraldehyd in 50 ml Wasser enthielt. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 7,0 eingestellt, und die Suspension wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufschlämmung wurde filtriert, und der Filierkuchen wurde mit Wasser gewaschen und ergab 23,2 g feuchte behandelte immobilisierte Zellen mit 79% der Penicillinacylase-Aktivität der unbehandclten immobilisierten Zellen.
Beispiel 11
Zu einer Aufschlämmung von 12 g der feuchten behandelten immobilisierten Zellenzubereitung des Beispiels 10 in 100 ml Wasser bei einem pH-Wert von 8,0 und 37°C wurde 1 g Kalium-Penicillin G gegeben. Der pH-Wert jo des Reaktionsgemisches wurde bei 8,0 durch eingestellte Zugabe von I N NaOH gehalten, und die Umsetzung wurde nach 3 Stunden beendet. Das immobilisierte Zellmaterial wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und als feuchter Kuchen bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Der pH-Wert des Filtrats wurde auf 2 mit 2 N HCl eingestellt, und das Filtrat wurde dann mii· Äthylacetat extrahiert. Der pH-Wert der erhaltenen wäßrigen Schicht wurde mit 2 N NaOH auf 4,3 eingestellt, und die Schicht wurde konzentriert und abgekühlt und ergab kristalline 6-Aminopenicillansäure.
D c 1 a μ l c i \Δ
Eine Suspension von A.niger-Zellen (20 g, 4 g trockne Zellen), die wie in dem Beispiel 1 gezüchtet und isoliert worden waren, und 80 gGlycidylmethacirylat in 100 ml Wasser wurde auf einen pH-Wert von 7.5 eingestellt und 18 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Ν,Ν-Methylenbisacrylamid (1,5 g) wurde zugegeben, unu die erhaltene Aufschlämmung wurde 15 Minuten unter Stickstoff gerührt, dann auf 5°C abgekühlt, mit 150 mg Ammoniumpersulfat plus I ml Dimethyhminopropionitril behandelt und bei Umgebungstemperatur 3 Stunden gerührt. Die festen Bestandteile des Rtaktionsgemsiches wurden abfiltriert und mit Wasser gewaschen und ergaben 71 g feuchte immobilisierte Zellen mit 62% der ursprünglichen Glucoseoxidase-Aktivität.
Die immobilisierte Zellen (18 g. 1 g Trockenzellgewicht) wurden in eine Lösung eingetragen, die 0,4 g 25 Gew.-%igen wäßrigen Glutaraldehyd in 100 ml Wasser enthielt. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 7,0 eingestellt, und die Suspension wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die festen Substanzen wurden abfiltriert und mit Wasser gewaschen und ergaben 17,3 g feuchte behandelte immobilisierte Zellen mit 75% der Glucoseoxidase-Aktivität, die in den immobilisierten Zellen vor der Behandlung mit Glutaraldehyd vorhanden gewesen war.
Beispiel 13
Die feuchten behandelten immobilisierten Zellen (14 g) des Beispiels 12 wurden in 15 ml einer wäßrigen Lösung eingetragen, die 1,5 g Glucose enthielt, und das Gemisch wurde unter Belüften 21 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei eine Umwandlung in Gluconsäure stattfand und eine Enzymaktivität erhalten wurde, die den betreffenden Werten des Beispiels 3 entsprachen.
Beispiel 14
Rhodotoruia gracilis-Zellen (NRRL Y1091) wurden aus einer Fermentationsbrühe, in der die Kultur unter aeroben Unterwasserbedingungen bei 28°C und einem pH-Wert von 6,8—7,0 auf Glucosesubstrat gezüchtet worden war, durch Zentrifugieren isoliert. 50 g gewaschene Zellen in 250 ml Wasser wurden mit 5 g Glycidylme- es thacrylatpolymerisat des Beispiels 1 behandelt Das Gernisctt wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden gerührt. Die Suspension wurde filtriert, und der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen und ergab 63 g feuchte immobilisierte Zellen, die 49% der ursprünglichen Phenyialaninammoniaklyase-Aktivität aufwiesen.
Beispiel 15
Eine Suspension von 14,74 g feuchten immobilisierten Zellen des Beispiels 14 in 30 ml Wasser, das 2,25 g trar.s-Zimtsäure, 652 g Ammoniumchlorid und 3,3 ml konzentrierten Ammoniumhydroxid enthielt, wurde auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt. Das Gemisch wurde bei 37"C 18 Stunden geschüttelt und ergab eine etwa 90%ige Ausbeute von L-Phenylalanin, bezogen auf die wiedergewonnene Zimtsäure. Die festen Substanzen des Reaktionsgemisches wurden abfiltriert und mit Wasrer gewaschen und ergaben 14 g feuchte immobilisierte Zellen mit 77% ihrer ursprünglichen Phenylalaninammoniaklyase-Aktivität. Das L-Phcnyialanin wurde aus dem Filtrat nach Standardmethoden isoliert.
Beispiel 16
Eine Suspension von 40 g gewaschenen Rhodotorula gracilis-Zellen, die wie in dem Beispiel 14 gezüchtet und isoliert worden waren, plus 8 g Glycidylmethacrylat in 80 ml Wasser wurde auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt. Ν,Ν'-Methylenbiscrylamid (1,5 g) wurde zugegeben, und die erhaltene Aufschlämmung wurde unter Stickstoff 10 Minuten gerührt, dann auf 5°C abgekühlt, mit 150 mg Ammoniumpersulfat plus 1 mg Dimethylaminopropionitril behandelt und bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Die nach der Umsetzung erhaltene Aufschlämmung wurde mit Wasser verdünnt und filtriert. Der Polymerisatkuchen wurde mit Wasser gewaschen und ergab 62,3 g feuchte immobilisierte Zellen mit 44% der ursprünglichen Phcnyiaianinammoniakiyase-Äktivitäi.
Beispiel 17
Eine Suspension von 15 g feuchten immobilisierten Zellen des Beispiels 16 in 30 ml Wasser, das 1,12 g trans-Zimtsäure, 320 mg Ammoniumchlorid und 1,6 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid enthielt, wurde auf einen pH-Wer! von 9,5 eingestellt. Das Gemisch wurde bei 'Sl0C 18 Stunden geschüttelt, wobei eine L-Phcnyiulaninbildung erzielt wurde.die der des Beispiels 15 entsprach.
Beispiel 18
Eine Suspension von 15 g feuchten ausgedrückten Proteus rettgeri-Zellen, die wie in dem Beispiel 4 gezüchtet und isoliert worden waren, und 30 g Glycidylmethacrylatpolymerisat des Beispiels I in 100 ml Wasser wurde bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 7 18 Stunden gerührt. Die Suspension wurde dann zentrifugiert, und die festen Substanzen wurden mit Wasser gewaschen. Es wurden 100 g feuchte immobilisierte Zellen mit 100% der ursprünglichen Penicillinaclylase-Aktivität erhalten.
Zu einer Aufschlämmung von 25 g der feuchten immobilisierten Zellen in 70 ml Wasser bei einem pH-Wert von 8,0 und 37°C wurde 1 g Kalium-Penicillin G gegeben. Die Hydrolyse, die bei einem pH-Wert von 8.0 durch eingestellte Zugabe von ! N NaOH durchgeführt wurde, war nach 3 Stünden beendet. Die Äufschlärnmung wurde dann filtriert, und die immobilisierten Zellen wurden mit Wasser gewaschen und als feuchter Kuchen für eine weitere Verwendung aufbewahrt. Die Wirksamkeit dieser Zellen für die Bildung von 6-Aminopenicillansäure war jedoch nicht so groß wie die Wirksamkeit der immobilisierten Zellen des Beispiels 4, weil die Zellen nur 15% der Penicillinacylase-Aktivität der ursprünglichen Zellen nach 2 Hydrolyse-Zyklen zurückbehielten.
Beispiel 19
Zu 25 g 2-Hydroxyäthylmethacrylat in 100 ml Wasser wurden 12,5 g Cyanbromid, gelöst in 100 ml Wasser, gegeben. Der pH-Wert des Gemisches wurde sofort mit 5 N NaOH auf 11 eingestellt, wodurch sich die Reaktionstemperatur auf 46° C erhöhte, und dann bei diesem pH-Wert gehalten, bis keine weitere Base erforderlich war. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, der pH-Wert des Gemisches wurde auf 6,5
so eingestellt, und das Gemisch wurde dann mit einer Aufschlämmung von 50 g gefriergetrockneten Proteus rettgeri-Zellen, die vor dem Trocknen wie in Beispiel 4 gezüchtet und isoliert worden waren, in 500 ml Wasser behandelt. Die erhaltene Suspension wurde 45 Minuten gerührt. Dann wurden 25 g Acrylamid und 2,5 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid zugegeben, und die Suspension wurde 15 Minuten gerührt, auf 4°C abgekühlt und mit 4 ml Dimethylaminopropionitril plus 425 mg Ammoniumsulfat behandelt Das Polymerisationsgemisch konnte dann auf Raumtemperatur abkühlen und wurde 1 Stunde stehengelassen. Das Gemisch wurde dann unter Benutzung eines Mischers durchgemischt und zentrifugiert Die abzentrifugierten festen gelartigen Substanzen wurden in Wasser erneut suspendiert, zentrifugiert, mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet und ergaben 112g trockene immobilisierte Zellen mit 19% der ursprünglichen Penicillinaclyse-Aktivität.
Beispiel 20
Zu einer Suspension von 20 g feuchten ausgedrückten Proteus rettgeri-Zellen, die wie in dem Beispiel 4 gezüchtet und isoliert worden waren, in 80 ml Wasser wurden 1 g 25 Gew.-%iger wäßriger Glutaraldehyd und 10 g Glycidylmethacrylat gegeben. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 6,8 eingestellt, und die Suspension wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Das Gemisch wurde dann unter Stickstoff mit 1,9 g N,N'-Methy- !enbisacrylamid und 2 ml Dirnethylarninopropiorsitrii behandelt, auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und mit 200 mg Ammoniumpersulfat behandelt Die erhaltene Suspension wurde V2 Stunde gerührt und dann IV2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die festen Bestandteile wurden abfiltriert und mit Wasser gcw;i-
sehen und ergaben 813 g feuchte immobilisierte Zellen mit 54% der ursprünglichen Penicillinacylase-Akth tat der unbehandelten Zellen.
Die feuchten immobilisierten Zellen waren zur Umwandlung von Kalium-Penicillin G in 6-AminopeniciIlansäurc, wie in dem Beispiel 7 beschrieben, mit vergleichbaren Ergebnissen geeignet
Beispiel 21
Eine Bacterium cadaveris (ATCC 9760) Fermentationsbrühe, die durch Züchten unter aeroben Unterwasserbedingungen bei 28°C und einem pH-Wert von 6—8 Proteinhydrolysatsubstrat erhalten worden war, wurde zentrifugiert, und die Zellen wurden erneut in Wasser aufgeschlämmt und zu einer halbtrockenen Paste verpreßL Zu der Aufschlämmung der feuchten Zellen (7,5 g Trockengewicht) in 100 ml Wasser wurden 4 g 25 Gew.-%iger wäßriger Glutaraldehyd gegeben. Das Gemisch wurde etwa 2 Stunden bei einem pH-Wert von 7 gerührt und dann zentrifugiert. Die behandelten Zellen wurden erneut in 100 ml Wasser suspendiert, und 73 g Glycidylmethacrylatpolymerisat des Beispiels 1 wurden unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wurde bei einem pH-Wert von etwa 7,0 und Raumtemperatur 30 Stunden gerührt. Die festen Bestandteile wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und als feuchter Kuchen bis zur Verwendung aufbewahrt.
Beispiel 22
Fumarsäure (120 g) wurde zu 140 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid gegeben. Der pH-Wert des Gemisches wurde mit Ammoniumhydroxid auf 83 eingestellt, und das Volumen des Reaktionsgemisches wurde mit Wasser bis zu 600 ml aufgefüllt Immobilisierte Zellen des Beispiels 21, enthaltend 7000 μ Asparaginatammoniaklyase-Aktivität, wurden zugegeben, und das Genvsch wurde bei 37°C 4 Stunden gerührt die nach der Umsetzung erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, und der pH-Wert des Filtrats wurde mit Schwefelsäure auf 2,8 eingestellt, um Asparaginsäure auszufällen.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Immobilisierung intakter mikrobiologischer Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in einem wäßrigen Medium 5
(1) mit einem polymerisierbaren äthylenisch ungesättigten Monomeren der Formel
CH2=C-W fl)
lu R1
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