DE2407961B2 - ENZYMATICALLY ACTIVE MEMBRANE, PROCESS FOR THEIR MANUFACTURING AND USE - Google Patents
ENZYMATICALLY ACTIVE MEMBRANE, PROCESS FOR THEIR MANUFACTURING AND USEInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine enzymatisch aktive Membran, die eine polymere Membran und aktive Enzyme umfaßt, ein Verfahren zu ihrer Herstellung undThe invention relates to an enzymatically active membrane which is a polymeric membrane and active Includes enzymes, a process for their preparation and
die Verwendung dieser Membran zur Durchführung enzymatischer Reaktionen.the use of this membrane to carry out enzymatic reactions.
Enzyme sind Proteinkatalysatoren, die für eine große Anzahl von Anwendungen in Industrie und Forschung benutzt werden, insbesondere in Arzneimitteln sowie bei der Papier- und Textilverarbeitung usw. Sie sind äußerst spezifisch in ihrer Aktivität und erzeugen im allgemeinen keine bedeutenden Mengen an unerwünschten Nebenprodukten. Die Enzymreaktionen sind industriell vorteilhaft, da sie keine großen Investitionen für Wärmeübertragungsapparaturen erfordern und leicht abgestuft werden können, wodurch die Probleme, die bei Zwischenstufen-Produkttrennungen auftreten, minimalisiert werden.Enzymes are protein catalysts that have a large number of uses in industry and research are used, especially in pharmaceuticals and in paper and textile processing, etc. They are extremely specific in their activity and generally do not produce significant amounts of undesirable By-products. The enzyme reactions are industrially advantageous as they do not require a large investment for heat transfer equipment and can easily be staggered, eliminating the problems that occur with interstage product separations are minimized.
Ein Problem beschäftigte diejenigen, die sich mit industriellen Anwendungen von Enzymen befassen, jedoch lange, und zwar die Schwierigkeit, Enzymmaterialien zu trennen und wieder zu gewinnen. Bei den meisten kommerziellen Arbeitsverfahren wird die Enzymrealktion durch einfaches Vermischen des En-One problem preoccupied those concerned with industrial uses of enzymes however long, namely the difficulty of separating and recovering enzyme materials. Both In most commercial working processes, the enzyme reaction is achieved by simply mixing the en-
(ΐΰ zyms mit dem Substrat bewirkt, d. h. man läßt die Chemikalie auf das Enzym einwirken und inaktiviert das Enzyma danach und/oder stellt es wieder her, und zwar aus den Produkten oder dem nichtumgesetzten Substrat, welches sich aus der Reaktion ergibt. Dieser(ΐΰ zyms with the substrate, i.e. one leaves the Chemical acts on the enzyme and then inactivates and / or restores the Enzyma from the products or unreacted substrate resulting from the reaction. This
fts Vorgang führt jedoch häufig zu einem fehlerhaften Produkt und zu einem charakteristischen Verlust großer Enzymmengen, da üblicherweise kein Enzym wiederhergestellt wird oder, wenn man es versucht, dieHowever, the fts operation often results in a defective product and a characteristic loss of a large one Amounts of enzyme, as usually no enzyme is restored or, if tried, the
Ausbeute äußerst gering istYield is extremely low
Ein weiteres Problem von großer Bedeutung für jene, die sich mit dieser Technologie beschäftigen, ist darin zu sehen, daß die Enzyme normalerweise in wäßriger Dispersionsform vorliegen. In der Regel weisen die Enzyme in dieser Form jedoch nur eine begrenzte Haltbarkeit auf und unterliegen, insbesondere dann, wenn sie in flüssiger Form aufbewahrt werden, bei der Lagerung einem schnellen AktivitätsverlustAnother problem of great concern to those who deal with this technology is in it see that the enzymes are normally in aqueous dispersion form. Usually the However, enzymes in this form only have a limited shelf life and are subject to, in particular, when stored in liquid form, a rapid loss of activity when stored
Um diese Probleme abzuschwächen, wurden verschiedene sogenannte »immobilisierte Enzyme« entwikkelt, in denen die Enzyme unbeweglich gemacht wurden oder an inerte oder unlösliche Träger gebunden wurden. Beim Abschluß der Enzymreaktion können die unlöslichen, enzymhaltigen Materialien durch Techniken, wie die Ultrafiltration oder dergleichen von dem nichtumgesetzten Substrat oder dem Produkt getrennt Werder.To alleviate these problems, various so-called "immobilized enzymes" have been developed. in which the enzymes have been immobilized or bound to inert or insoluble carriers. Upon completion of the enzyme reaction, the insoluble, enzyme-containing materials can be removed by techniques such as the ultrafiltration or the like is separated from the unreacted substrate or product.
Wie bei K a y in />Process Biochemistry«, August 1963, wo eine Obersicht über die Geschichte der immobilisierten Enzyme zu finden ist, diskutiert wird, gibt es im wesentlichen drei bekannte Verfahren, um Enzyme zu immobilisieren:As with K a y in /> Process Biochemistry «, August 1963, where an overview of the history of immobilized enzymes can be found, discussed, is available in three main known methods of immobilizing enzymes:
1. Die kovalente Bindung an ein chemisch modifiziertes Substrat oder an ein Substrat, das kovalente Bindungen eingehen kann;1. The covalent bond to a chemically modified Substrate or to a substrate capable of forming covalent bonds;
2. die Adsorption an Ton oder ein Gel oder das Einbetten in eine inerte Matrix (wobei keine Bindung eingegangen wird) oder2. Adsorption on clay or a gel or embedding in an inert matrix (with none Binding is entered into) or
3. die Vernetzung des Enzyms mit sich selbst.3. the cross-linking of the enzyme with itself.
Alle diese bekannten Verfahren haben sich für industrielle Anwendungen jedoch als nachteilig herausgestellt und zwar vor allem deshalb, da die Verfahren, die die Uinbeweglichkeit der Enzyme bewirken, kompliziert sind und eine sehr genaue Kontrolle des pH-Wertes, der Temperatur, der Materialien usw. erfordern.However, all of these known processes have proven to be disadvantageous for industrial applications mainly because the processes that make the enzymes mobile complicated and very precise control of pH, temperature, materials, etc. require.
Wenn ein Enzym in Vorbereitung auf kovalente Bindungen chemisch modifiziert wird, werden einige der enzymatisch aktiven Plätze des Enzyms chemisch beständig angegriffen, wobei die Aktivität der Enzyme reduziert wird. Beispielsweise diskutieren S i 1 m a η et al in »Biopolymers«, Band 4, Seite 441 bis 448 (1966) die kovalente Bindung der Enzyme an Kollagen und p-Aminophenylalanin-leucinpolymere durch die Verwendung von Diazoniumsalzen. Dieses Verfahren Hefen jedoch ein Produkt mit herabgesetzter enzymatischer Aktivität.When an enzyme is chemically modified in preparation for covalent bonds, some of the enzymatically active places of the enzyme chemically resistant attacked, whereby the activity of the enzymes is reduced. For example, S i 1 m a η et al in "Biopolymers", Volume 4, pages 441 to 448 (1966) discuss the covalent attachment of the enzymes to collagen and p-aminophenylalanine-leucine polymers through the use of diazonium salts. However, this method yields a product with reduced enzymatic yeasts Activity.
Die Adsorption der Enzyme an Ton oder ein Gel oder das Einbetten eines Enzyms in eine inerte Matrix, wie dies von Leuschner in der GB-PS 9 53 414 gezeigt wird, liefert wegen der Behinderung oder des Blockiereffekts der Matrix ebenfalls Produkte von herabgesetzter enzymatischer Aktivität.The adsorption of the enzymes on clay or a gel or the embedding of an enzyme in an inert matrix, such as this is shown by Leuschner in GB-PS 9 53 414, provides because of the obstruction or the blocking effect the matrix also has products of reduced enzymatic activity.
In der NL-PS 70 17 848 ist ein ähnliches Verfahren zur Fixierung oder Komplexierung von Enzymen oder
enzymhaltigen Produkten an einer Trägermembran beschrieben. Anhand mehrerer Beispiele verdeutlicht
dieser Stand der Technik die Bindung gewisser Enzyme an polymere Substrate, wie Cellulosederivate, nämlich
Cellophan, regenerierte Cellulose und Celluloseester, wie Celluloseacetat und teilweise nitrierte Baumwolle,
wie Pyroxylin, einschließlich Celluloid und Collodium, Proteine, wie Kollagen, und Vinylpolymerisate, wie
Vinylester und Polymethylmethacrylat. Es ist in diesem Stand der Technik jedoch als wesentlich angegeben, daß
die polymeren Substrate indifferent sind und nicht mit dem Enzym reagieren, so daß die Enzyme nur durch
physikalischen Einschluß in der Membran festgehalten werden können. Es ist ferner angegeben, daß es zur
Verbindung des Enzyms mit der Membran unerläßlich ist, daß die Porengröße der Membran geringer ist als die
aktive Größe des Enzymmoleküls.
Bei der Vernetzung der Enzyme mit sich selbst, wie dies durch Kay oder Si im aη et al. in den
vorstehenden Veröffentlichungen offenbart ist, treten ähnliche Nachteile wie bei dem kovalenten Binden der
Enzyme auf.NL-PS 70 17 848 describes a similar method for fixing or complexing enzymes or enzyme-containing products on a carrier membrane. Using several examples, this prior art illustrates the binding of certain enzymes to polymeric substrates, such as cellulose derivatives, namely cellophane, regenerated cellulose and cellulose esters, such as cellulose acetate and partially nitrided cotton, such as pyroxyline, including celluloid and collodion, proteins such as collagen, and vinyl polymers, such as vinyl ester and polymethyl methacrylate. In this prior art, however, it is stated as essential that the polymeric substrates are indifferent and do not react with the enzyme, so that the enzymes can only be retained in the membrane by physical entrapment. It is also stated that in order for the enzyme to bind to the membrane it is essential that the pore size of the membrane be smaller than the active size of the enzyme molecule.
When the enzymes are cross-linked with themselves, as shown by Kay or Si in aη et al. is disclosed in the above publications, there are similar disadvantages as with the covalent binding of the enzymes.
ίο Ein weiterer Nachteil der immobilisierten Enzyme ist darin zu sehen, daß sie das Bestreben haben, einen großen Teil ihrer Aktivität zu verlieren, wenn sie über längere Zeiträume erhöhten Temperaturen ausgesetzt werden. Manchmal sind die Enzyme derart temperaturempfindlich, daß ihre enzymatische Aktivität bei Temperaturen um 800C innerhalb weniger Minuten schnell zerstört wird, während die Immobilität im iillgemeinen einen stabilisierenden Effekt auf die Aktivität zu haben scheint Nichtsdestoweniger weisen mit der Zeit sogar immobile Enzyme einen Trend in Richtung auf eine herabgesetzte Aktivität auf.Another disadvantage of the immobilized enzymes is that they tend to lose a large part of their activity when they are exposed to elevated temperatures for long periods of time. Sometimes the enzymes are so sensitive to temperature that its enzymatic activity is at temperatures around 80 0 C within minutes quickly destroyed, while the immobility iillgemeinen a stabilizing effect on the activity seems to have Nonetheless point in time even immobile enzymes a trend towards on a reduced activity.
Es ist ferner bekannt daß ganze Mikrobenzellen sogar ohne Trennung und Reinigung der Enzymkomponenten der Zelle ein erhebliches Maß an enzymatischer Aktivität aufweisen. Bisher bestand jedoch das einzige bekannte Verfahren zur Immobilisierung von ganzen Mikrobenzellen darin, sie in einer inerten Matrix anzufangen (vgl. M ο s b a c h et al, Biotech, and Bioeng. XII [1970] 19). Die Schwierigkeit dieses Verfahrens liegt jedoch darin, daß die Matrix hinsichtlich der eingefangenen Enzyme dazu neigt sich ungünstig oder hindernd Ruf die enzymatische Aktivität der Zelle auszuwirken.It is also known that whole microbial cells can be removed even without separation and purification of the enzyme components the cell have significant levels of enzymatic activity. So far, however, was the only one known method for immobilizing whole microbial cells therein in an inert matrix to begin (cf. M ο s b a c h et al, Biotech, and Bioeng. XII [1970] 19). The difficulty of this procedure lies however, in that the matrix tends to be unfavorable or obstructive with respect to the trapped enzymes Reputed to affect the enzymatic activity of the cell.
Andere Verfahren, die die Immobilität von Enzymen bewirken, wurden vor allem wegen der größerenOther processes that induce the immobility of enzymes were mainly because of the larger ones
xs Abmessung der ganzen Mikrobenzellen, die üblicherweise in der Größenordnung von Mikron liegt, nicht in Erwägung gezogen. Solche großen Partikeln können nicht ohne weiteres in die Zwischenräume einer immobilisierenden Membran eindringen, so daß angenommen wurde, daß eine erfolgreiche chemische Bindung nicht wahrscheinlich sei.xs Dimension of the whole microbial cells, usually on the order of microns is not considered. Such large particles can does not easily penetrate into the interstices of an immobilizing membrane, so that it is assumed became that a successful chemical bond was not likely.
Die DT-AS 11 73 640 beschreibt Membranfilter bzw. Verfahren zu ihrer Herstellung, die gegebenenfalls Nährstoffe für Mikroorganismen oder andere chemisehe Substanzen enthalten können, die in den Membranfiltern besonderen Zwecken dienen. Dlse vorbekannten Membranfilter können beispielsweise zur Bestimmung des Keimgehaltes der Luft eingesetzt werden, d. h. sie halten Keime zurück. Sie vermitteln dem Fachmann jedoci. in keiner Weise die Möglichkeit, enzymatisch aktive ganze Mikrobenzellen an bestimmte Substrate zu binden.The DT-AS 11 73 640 describes membrane filters resp. Process for their production, which may contain nutrients for microorganisms or other chemisehe May contain substances that serve special purposes in the membrane filters. Dlse previously known Membrane filters can be used, for example, to determine the germ content of the air, i. H. she hold back germs. They convey jedoci to the specialist. in no way the possibility of enzymatic to bind active whole microbial cells to specific substrates.
Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, immobilisierte ganze Mikrobenzellen in Membranform zu schaffen und ein Verfahren anzugeben, wvn diese enzymatisch aktiven Membranen herzustellen.The object of the invention is to create immobilized whole microbial cells in membrane form and to specify a method for producing these enzymatically active membranes.
Es wurde nunmehr gefunden, daß ganze Mikrobenzellen durch Protein oder Polypeptide in Membranform komplexiert werden können, beispielsweise durch eineIt has now been found that whole microbial cells by protein or polypeptides in membrane form can be complexed, for example by a
f.o Membran aus Kollagen oder Zein, und daß diese ganzen Mikrobenzellen über salzarrige Verknüpfungen, Wasserstoffbrückenbindungen und Van der Waals-Kräfte an die Membran gebunden werden können, so daß man enzymatisch aktive Membranen erhält, die nicht nur einf.o membrane made of collagen or zein, and that this whole Microbial cells via salty connections, hydrogen bonds and Van der Waals forces the membrane can be bound, so that enzymatically active membranes are obtained that are not only one
ds liöhcres Maß an enzymatischer Aktivität aufweisen, als bisher durch den Stand der Technik erreichbar war, Mindern wegen der Schutzfunktion der Zellstruktur auch eine hedeutend höhere Temperaturstabilitäthave the same level of enzymatic activity as was previously achievable by the state of the art, reducing because of the protective function of the cell structure also a significantly higher temperature stability
besitzen.own.
Diese Aufgabe wird nun durch die erfindungsgemäße enzymatisch aktive Membran, die eine polymere Membran und aktive Enzyme umfaßt, gelöst, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie aus enzymatisch aktiven, ganzen Mikrobenzellen besteht, die direkt an eine Membran aus einem Protein, das aus der Gruppe Kollagen, Zein, Kasein, Ovalbumin, Weizengluten, Fibrinogen, Myosin und Mucoprotein ausgewählt ist, oder aus einem Polypeptid, das aus der Gruppe Polyglutamat, Polyaspartat, Polyphenylalanin, Poly ty rosin und Copolymere aus Leucin und p-Aminophenylalanin ausgewählt ist, komplex gebunden sind, wobei die Mikrobenzellen in der Membran dispergiert sind und über Wasserstoffbrücken, salzartige Verknüpfungen und Van-der-Waals-Kräfte komplex gebunden und immobilisiert sind.This object is now achieved by the invention enzymatically active membrane, which comprises a polymeric membrane and active enzymes, dissolved the is characterized in that it consists of enzymatically active, whole microbial cells that directly a membrane made from a protein selected from the group Collagen, zein, casein, ovalbumin, wheat gluten, fibrinogen, myosin and mucoprotein is selected, or from a polypeptide selected from the group consisting of polyglutamate, polyaspartate, polyphenylalanine, poly ty rosin and copolymers of leucine and p-aminophenylalanine is selected, are complexed, wherein the microbial cells are dispersed in the membrane and bound and complexed via hydrogen bonds, salt-like connections and van der Waals forces are immobilized.
Geeignete Membranen umfassen sowohl synthetische Polypeptide als auch natürliches Protein. Die Immobilisierung der ganzen Mikrobenzelle wird durch die Bildung einer Proteindispersion bewirkt, durch Vermischen und Komplexieren dieser Dispersion mit einer Zellsuspension, durch Gießen einer Membran und deren Trocknung.Suitable membranes include both synthetic polypeptides and natural protein. The immobilization the whole microbial cell is caused by the formation of a protein dispersion, by mixing and complexing this dispersion with a cell suspension by casting a membrane and the same Drying.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein 2s Verfahren zur Herstellung der oben definierten enzymatisch aktiven Membran, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Dispersion aus einem Protein, das aus der Gruppe Kollagen, Zein, Kasein, Gvalbumin, Weizengluten, Fibrinogen, Myosin und Mucoprotein ausgewählt ist, oder aus einem Polypeptid, das aus der Gruppe Polyglutamat, Polyaspartat, Polyphenylalanin, Polytyrosin und Copolymeren aus Leucin und p-Aminophenylalanin ausgewählt ist, und ganzen Mikrobenzellen unter solchen Bedingungen bereitet, daß die Dispersion des Proteins oder des Polypeptids einen dem Mikrobenzellentyp entsprechenden pH-Wert besitzt; die Dispersion zu einer Membran vergießt; und die Membran unter Ausbildung von komplexierenden Gruppen trocknet, die die ganzen Mikrobenzellen über Wasserstoffbrücken, salzartige Verknüpfungen und Van-der-Waals-Kräfte an das Protein oder das Polypeptid der Membran komplex binden und immobilisieren.The invention therefore also relates to a 2s Process for the production of the enzymatically active membrane defined above, which is characterized is that a dispersion of a protein from the group collagen, zein, casein, gvalbumin, Wheat gluten, fibrinogen, myosin and mucoprotein, or a polypeptide selected from the Group polyglutamate, polyaspartate, polyphenylalanine, polytyrosine and copolymers of leucine and p-aminophenylalanine is selected, and whole microbial cells prepared under such conditions that the The dispersion of the protein or the polypeptide has a pH corresponding to the type of microbial cell; casting the dispersion to form a membrane; and the membrane with the formation of complexing agents Groups that dry out the whole microbial cells via hydrogen bonds, salt-like linkages and Van der Waals forces bind to the protein or polypeptide of the membrane complex and immobilize.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform dieses Verfahrens werden die ganzen Mikrobenzellen mit Proteinmakromolekülen durch elektrolytische Fällung in einem Bad komplexiert, um auf diese Weise eine enzymatisch aktive Membran zu bilden.According to a further embodiment of this method, the whole microbial cells are with Protein macromolecules are complexed by electrolytic precipitation in a bath to form in this way a to form enzymatically active membrane.
Gegenstand der Erfindung ist daher eine weitere Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung der so enzymatisch aktiven Membran, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Dispersion aus einem Protein, das aus der Gruppe Kollagen, Zein, Kasein, Ovalbumin, Weizengluten, Fibrinogen, Myosin und Mucoprotein ausgewählt ist, oder aus einem Polypeptid, das aus der Gruppe Polyglutamat, Polyaspartat, Polyphenylaianin, Polytyrosin und Copolymeren aus Leucin und p-Aminophenylalanin ausgewählt ist, und ganzen Mikrobenzelien unter Ausbildung von komplexierenden Gruppen, die die ganzen Mikrobenzellen über Wasserstoffbrük- (m ken, salzartige Verknüpfungen und Van-der-Waals-Kräfte an das Protein oder das Polypeptid der Membran komplex binden und immobilisieren, elektrolytisch fällt und die gebildete, ganze Mikrobenzellen enthaltende Membran trocknet. <-sThe invention therefore relates to a further embodiment of the method for producing the so enzymatically active membrane, which is characterized in that a dispersion of a protein, that from the group of collagen, zein, casein, ovalbumin, wheat gluten, fibrinogen, myosin and mucoprotein is selected, or from a polypeptide selected from the group consisting of polyglutamate, polyaspartate, polyphenylaianin, Polytyrosine and copolymers selected from leucine and p-aminophenylalanine, and whole microbial cells with the formation of complexing groups that bind the entire microbial cells via hydrogen bridges (m ken, salt-like connections and van der Waals forces bind to the protein or the polypeptide of the membrane complex and immobilize, electrolytically falls and drying the formed membrane containing whole microbial cells. <-s
Der Komplexierungsmechanismus zwischen ganzen Mikrobenzellen und Proteinmembranen oder filmähnlichen Proteinträgern umfaßt die Bildung von vielfältigen Wasserstoffbrücken, salzartigen Verknüpfungen und Van-der-Waals-Wechselwirkungen. Die Komplexbildung wird bei einem pH-Wert zwischen den isoelektrischen Punkten der ganzen Mikrobenzelle und der Proteinmembran erleichtertThe mechanism of complexation between whole microbial cells and protein membranes or film-like ones Protein carriers include the formation of a variety of hydrogen bonds, salt-like linkages and Van der Waals interactions. The complex formation is at a pH between the isoelectric points of the whole microbial cell and the Protein membrane facilitated
Jedes aus der großen Vielzahl der synthetischen Polypeptide und natürlichen Proteine kann zur Bildung des Membranbestandteils des Komplexes verwendet werden. So umfassen z. B. die geeigneten natürlichen Proteine Kollagen, Zein, Kasein, Ovalbumin, Gluten des Weizens, Fibrinogen, Myosin, Mucoprotein und ähnliches. Geeignete syntherische Polypeptide sind Polyglutamat, Polyaspartat, Polyphenylalanin, Polytyrosin und Copolymere von Leuchin mit p-Aminophenylalanin und ähnliches. Kollagen und Zein sind bevorzugte natürliche Proteinausgangsstoffe.Any of the wide variety of synthetic polypeptides and natural proteins can be formed of the membrane component of the complex can be used. So include e.g. B. the appropriate natural ones Proteins collagen, zein, casein, ovalbumin, gluten des Wheat, fibrinogen, myosin, mucoprotein and the like. Suitable synthetic polypeptides are polyglutamate, polyaspartate, polyphenylalanine, polytyrosine and Copolymers of Leuchin with p-aminophenylalanine and similar. Collagen and zein are preferred natural protein sources.
Die Wahl eines bestimmten synthetischen Polypeptids oder natürlichen Proteins wird im wesentlichen durch die Eigenschaften des zu komplexierenden Enzyms, des zu behandelnden Substrates und der einzubeziehenden Reaktionsumgebung bestimmt.The choice of a particular synthetic polypeptide or natural protein is essential by the properties of the enzyme to be complexed, the substrate to be treated and the the reaction environment to be included is determined.
Geeignete ganze Mikrobenzellen, welche gemäß dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen:Suitable whole microbial cells which can be used in accordance with this invention include:
Bakterien, insbesondere Acetobacter, Lactobazil'us, Clostridium und Pseudcvmonas wie Suboxydans, Acetixylinum und ähnliches; Delbruecki, Suboxydans und ähnliches; Acetutylicum und ähnliches; Hydrophila und ähnliches.Bacteria, especially Acetobacter, Lactobazil'us, Clostridium and Pseudcvmonas such as Suboxydans, Acetixylinum and similar; Delbruecki, Suboxydans and the like; Acetutylicum and the like; Hydrophila and similar.
Auch Actinomyceten, insbesondere Streptomyces wie Phaechromogenes, Griseus und ähnliches.Also actinomycetes, especially Streptomyces such as Phaechromogenes, Griseus and the like.
Auch Schimmel und Pilze, insbesondere Aspergillus und Penicillium wie Niger, Oryzae und ähnliches; Notatum, Griseofulvum, Funiculosum, Bilacinum und ähnliches.Also molds and fungi, in particular Aspergillus and Penicillium such as Niger, Oryzae and the like; Notatum, Griseofulvum, Funiculosum, Bilacinum and the like.
Ebenso Hefe, insbesondere Saccharomyces und Torula wie Cerevisiae, Eilipsoideus und ähnliches. Torulopsis, Utilis und ähnliches.Likewise yeast, especially Saccharomyces and Torula such as Cerevisiae, Eilipsoideus and the like. Torulopsis, Utilis and the like.
Diese ganzen Mikrobenzellen können eine große Vielzahl verschiedener Enzyme enthalten, wobei dies membrangebundene Enzyme, intrazellulare oder Endoenzyme sind, und alle diese Enzyme wesentlich an der zellularen Umwandlung beteiligt sind. Diese Enzyme umfassenThese whole microbial cells can contain a wide variety of different enzymes, with this being the case membrane-bound enzymes, intracellular or endoenzymes, and all of these enzymes are essential to the cellular conversion are involved. These enzymes include
Adenosintriphosphatasen,Adenosine triphosphatases,
Hydroxymethyl-Glutaryl-Coenzym A-Reduktase;Hydroxymethyl glutaryl coenzyme A reductase;
die motochondrischen Enzyme wiethe motochondrial enzymes like
pyruvische Oxidasekomplexe undpyruvic oxidase complexes and
Acyl-Coenzym A-Synthetase;Acyl coenzyme A synthetase;
oder membrangebundene Enzyme wieor membrane-bound enzymes such as
Adenylcyclase und Phosphodiesterase;Adenyl cyclase and phosphodiesterase;
intrazellulare Enzyme desintracellular enzymes of the
glycolytischen Pfades wieglycolytic path like
Alkoholdehydrogenase,Alcohol dehydrogenase,
laktische Dehydrogenase, Aldolase,lactic dehydrogenase, aldolase,
Glucose-6-phosphat-Isomerase und ähnliches;Glucose-6-phosphate isomerase and the like;
Enzyme des Pentosephosphatzweiges wiePentose phosphate branch enzymes such as
Glucose-6-phosphatdehydrogenase,Glucose-6-phosphate dehydrogenase,
Transketolase, Transaldolase und ähnliches;Transketolase, transaldolase and the like;
Enzyme des Fettsäure-Synthetase-KomplexesFatty acid synthetase complex enzymes
wie Malonyl CoA-Synthetase,like malonyl CoA synthetase,
D-Sorbitol-Dehydrogenase,D-sorbitol dehydrogenase,
Gluconolactonase,Gluconolactonase,
3-Keto-steriod Δ '-Dehydrogenase,3-keto-steriod Δ '-dehydrogenase,
11-a-Progesterone-Hydroxylase,11-a-progesterone hydroxylase,
9-(\-Fluorocortisol-Hydroxylase,9 - (\ - fluorocortisol hydroxylase,
Xylose- Isomerase, /J-Galactosidase,Xylose isomerase, / J-galactosidase,
Penicillin-Amidase, Tryptophan-Pyrrolase,Penicillin amidase, tryptophan pyrrolase,
Sucrose-6-Glucosyl-Transferase,Sucrose-6-glucosyl transferase,
Glucoamylase, Glucose-Oxidase,
Galactose-Oxidase, Enzyme des
Nukleinsäurestoffwechsels wie Dihydroorotase,
glutaminische Synthetase, folische Reduktase,
dihydrofolische Reduktase, Penicillinase
und Äthanolamin-Oxidase.Glucoamylase, glucose oxidase,
Galactose oxidase, enzymes of
Nucleic acid metabolism such as dihydroorotase,
glutaminic synthetase, folic reductase,
dihydrofolic reductase, penicillinase
and ethanolamine oxidase.
Invertase oder 0-D-Fructofuranosidase wird in der Nahrungsmittel- und Getränkeindustrie sowie für analytische Zwecke häufig verwendet. Invertase kann dazu verwendet werden, die Hydrolyse von Sucrose zu Glucose und Fructose oder Invertzucker zu katalysieren. Invertase ist bei der Hydrolyse von 0-D-Fructofuranosyl-Bindungen in Sucrose, Raffinose, Gentianose und Methyl- und ß-Fructofructose wirksam. Eine besonders bedeutende Anwendung für eine immobilisierte, invertaseenthaltende ganze Mikrobenzelle ist bei der kontinuierlichen Hydrolyse von Sucrose möglich.Invertase or 0-D-fructofuranosidase is used in the food and beverage industry as well as for often used for analytical purposes. Invertase can be used to hydrolyze sucrose Catalyze glucose and fructose or invert sugar. Invertase is involved in the hydrolysis of 0-D-fructofuranosyl bonds effective in sucrose, raffinose, gentianose and methyl- and ß-fructofructose. A special one significant application for an immobilized invertase-containing whole microbial cell is in the continuous hydrolysis of sucrose possible.
«-Amylase wird als »verflüssigendes Enzym« eingestuft und ist bekannt dafür, Stärke, Glykogen und Dextrane zu hydrolysieren. B-Amylase kann Maltose aus Zucker, Glykogen und Dextran erzeugen. Andere geeignete Amylasen umfassen «-Glucosidase, Amyloglucosidase, Amylo-l,6-«-Glucosidase (unverzweigtes Enzym), Oligo-1,6-Glucosidase (Grenze Dextrinase), Isomaltase und Isotriase. Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff »Amylose« im allgemeinen auf eine oder mehrere von diesen oder anderen Amylasen. Eine besonders wichtige Anwendung einer immobilisierten ganzen Zelle, welche Amylase enthält, ist die kontinuierliche Hydrolyse von Stärke."Amylase is classified as a" liquefying enzyme " and is known to hydrolyze starch, glycogen, and dextrans. B-amylase can be maltose from sugar, glycogen and dextran. Other suitable amylases include α-glucosidase, amyloglucosidase, Amylo-l, 6 - «- glucosidase (unbranched enzyme), oligo-1,6-glucosidase (limit dextrinase), Isomaltase and isotriase. As used herein, the term "amylose" generally refers to an or several of these or other amylases. A particularly important application of an immobilized whole cell, which contains amylase, is the continuous hydrolysis of starch.
Immobilisierte Komplexe, die auf diese Weise gebildet werden, liefern eine gute enzymatische Aktivität. Wird ein enzymatisch aktives Substrat mit solchen Komplexen in Kontakt gebracht, so ist die Stufe der enzymatischen Aktivität bestrebt, konstant zu bleiben, und es gibt keine Notwendigkeit, ein getrenntes Trennungsverfahren wie bisher vorzusehen.Immobilized complexes formed in this way provide good enzymatic Activity. If an enzymatically active substrate is brought into contact with such complexes, the step is the enzymatic activity tends to remain constant and there is no need to separate it Separation procedures to be provided as before.
Um die Komplexe dieser Erfindung herzustellen, ist es notwendig, die Zellen zu »fixieren«. Dies bedeutet, daß die ganzen Zellen in einer stationären Phase verbleiben sollen, wie etwa der Wärmebehandlung bei einer Temperatur von 60 bis 800C über eine Minute bis zwei Stunden und/oder durch Zufügen von nichtkoppelnden Substanzen wie 2,4-Dinitrophenol,Pentachlorophenol, andere hochsubstituierte flüssige, lösliche Phenole, Gramicidin und Dikumarol. Wenn Sporen als ganze Zellen verwendet werden, erübrigt sich ein Fixieren, da Sporen bereits in einem beharrenden Zustand vorliegen.To make the complexes of this invention it is necessary to "fix" the cells. This means that the whole cells should remain in a stationary phase, such as the heat treatment at a temperature of 60 to 80 0 C for one minute to two hours and / or by adding non-coupling substances such as 2,4-dinitrophenol, pentachlorophenol, other highly substituted liquid, soluble phenols, gramicidin and dikumarol. When spores are used as whole cells, fixation is unnecessary because spores are already in a persistent state.
Die ganzen, zu immobilisierenden Mikrobenzelien werden in einem geeigneten, inerten Medium, etwa Wasser, dispergiert Man erhält gute Resultate, wenn der Feststoff anteil der Dispersion zwischen 0,5 und 10 Gewichtsprozent liegt All of the microbe cells to be immobilized are dispersed in a suitable, inert medium, such as water. Good results are obtained when the solids content of the dispersion is between 0.5 and 10 percent by weight
Das Protein ist in der Dispersion in Mengen von ca. 0,1 bis ca. 5 Gewichtsprozent enthalten. Die Konzentration des Proteins wird natürlich von den Eigenschaften des verwendeten Proteins abhängen. Zum Beispiel neigt bei der Verwendung von Kollagen als Protein die Suspension bei Zugabe von mehr als 1 Gewichtsprozent dazu, zu zähflüssig zu werden. Vorzugsweise wird daher das Protein in Mengen von 0,1-1 Gewichtsprozent zugesetzt The protein is contained in the dispersion in amounts of approx. 0.1 to approx. 5 percent by weight. The concentration of the protein will of course depend on the properties of the protein used. For example, when collagen is used as a protein, the suspension tends to become too viscous if more than 1 percent by weight is added. The protein is therefore preferably added in amounts of 0.1-1 percent by weight
Die Temperatur bei der Vorbehandlung der Zellsuspension ist äußerst wichtig, da es notwendig ist die eiweißspaltende Aktivität der Zellen zu zerstören. Wird die eiweißspaltende Aktivität nicht zerstört neigen die Zellen dazu, sich selbst zu zersetzen und die strukturelle Einheit der Proteinmembran zu zerstören. Es wurde nun gefunden, daß die wirksame Zerstörung der eiweißspaltender. Aktivität einsetzt, sobald die Zellsuspension über wenigstens 10 Minuten auf eine Temperatur von 800C bis 820C erhitzt wird. Längere Zeiträume und höhere Temperaturen sind ebenfalls wirkungsvoll, jedoch treten bei Steigerung der Temperatur auf über 900C schädliche Effekte für die Eigenschaften der Zellen auf. Der Proteinträger wird durch jedes beliebige The temperature during the pretreatment of the cell suspension is extremely important, as it is necessary to destroy the protein-splitting activity of the cells. If the protein-splitting activity is not destroyed, the cells tend to decompose and destroy the structural unit of the protein membrane. It has now been found that the effective destruction of the protein splitting. Activity begins as soon as the cell suspension is heated to a temperature of 80 ° C. to 82 ° C. for at least 10 minutes. Longer periods of time and higher temperatures are also effective, but if the temperature is increased to above 90 ° C., harmful effects for the properties of the cells occur. The protein carrier is by any
ίο konventionelle Verfahren dispergiert. Es wird sodann eine Suspension der ganzen Zellen damit zusammengemischt und komplexiert, wonach eine Komplexmembran gegossen und getrocknet wird. Gute Ergebnisse sind erreichbar, wenn die Dicke der Membranenίο conventional method dispersed. It will then a suspension of whole cells mixed with it and complexed, after which a complex membrane is poured and dried. Good results can be achieved if the thickness of the membranes
ι j zwischen 6 und 500 Tausendstel Millimeter liegt.ι j is between 6 and 500 thousandths of a millimeter.
Der pH-Wert der Dispersion sollte im Zeitpunkt des Kontaktes dem verwendeten ganzen Zellentyp entsprechen. Wenn die ganzen Zellen ein Alkalienzym enthalten, sollte der pH-Wert der Dispersion alkalisch sein, und wenn das Enzym sauer ist, sollte der pH-Wert der Dispersion sauer sein.The pH of the dispersion at the time of contact should correspond to the entire cell type used. If the whole cells contain an alkaline enzyme, the pH of the dispersion should be alkaline and if the enzyme is acidic the pH of the dispersion should be acidic.
Nach Beendigung der Trocknungszeit werden die ganzen Mikrobenzellen an die Membran gebunden worden sein. Die Bindung wird vielfach sein und der Bindungsmechanismus wird mindestens Salzverknüpfungen, Van-der-Waals-Kräfte und Wasserstoffbindungen aufweisen. Ein wichtiger Gesichtspunkt dieser Erfindung ist die Erkenntnis, daß die Mikrobenzellen direkt an das Protein der Membran gebunden sind.After the drying time has ended, the whole microbial cells are bound to the membrane have been. The binding will be multiple and the binding mechanism will at least be salt linkages, Have van der Waals forces and hydrogen bonds. An important aspect of this Invention is the knowledge that the microbial cells are bound directly to the protein of the membrane.
Abweichend von der bekannten Bindung der Enzyme an Proteinmaterialien werden die ganzen Zellen und die Membran vorher nicht mit Diazo versetzt und das Proteinmaterial oder die ganzen Zellen chemisch nicht behandelt, um kovalente Bindungen herzustellen. BeiDeviating from the known binding of enzymes to protein materials, the whole cells and the Diazo has not been added to the membrane beforehand and the protein material or the whole cells have not been chemically treated treated to create covalent bonds. at
.15 der Erfindung werden die ganzen Zellen mit den Proteinmakromolekülen in Berührung gebracht, und es wurde gefunden, daß die Bindung direkt eintritt. Die Reaktion ist in grober Analogie mit der Wiederherstellung eines einfachen Gewebes durch Kombination von.15 of the invention, the whole cells are brought into contact with the protein macromolecules, and it binding was found to occur directly. The response is roughly analogous to the restoration of a simple fabric by combining
4u faserigem Protein und ganzen Zellen, welche mit Hilfe von physikalisch-chemischen Bindungen miteinander verknüpft werden, zu vergleichen.4u fibrous protein and whole cells, which with the help are linked by physico-chemical bonds.
Das sich hieraus ergebende Produkt ist eine enzymatisch aktive Membran, welche durch eine gute strukturelle Einheit charakterisiert ist. Da ganze Mikrobenzeller. darüber hinaus durch eine hohe Konzentration an Enzymen gekennzeichnet sind, ist die enzymatische Aktivität der immobilisierte ganze Mikrobenzelien enthaltenden Membran höher als diejenige, die früher durch Immobilisieren der Enzyme auf Proteinmembranen erreicht wurde. Darüber hinaus wurde gefunden, daß das verbleibende Zellskelett einen beachtlichen Temperaturstabilisierungseffekt auf die Enzyme ausübt wie in dem nachfolgenden Beispiel belegt wird: The resulting product is an enzymatically active membrane, which is characterized by a good structural unit. There whole microbial cells. Moreover, characterized by a high concentration of enzymes, the enzymatic activity of the immobilized membrane containing whole microbial cells is higher than that previously achieved by immobilizing the enzymes on protein membranes . In addition , it was found that the remaining cell skeleton has a considerable temperature stabilizing effect on the enzymes, as is demonstrated in the following example:
Zwei Reaktionsgefäße, von denen das eine mit immobilisierten ganzen Zellen (Streptomyces Phaechromogenes, welche aktive Glucose-Isomerase enthalten) und das andere mit immobilisierter Glucose- Isomerase (Enzym aus Streptomyces-Phaechromogen- Zellen gewonnen und gereinigt) gefüllt war, wurden bei 7O0C über einen Zeitraum in der Größenordnung vor Monaten kontinuierlich betrieben. Immobilisierte ganze Mikrobenzellkomplexe hatten eine Glucose-Isomerase Aktivität von 290 Einheiten pro Gramm Produkt um immobilisierte Enzyme wurden mit 80 Einheiten pn Gramm Produkt festgestellt Unter Berücksichtigunj des Temperaturstabilisierungseffekts wiesen immobili Two reaction vessels, one of which was (obtained enzyme from Streptomyces Phaechromogen- cells and purified) with immobilized whole cells (Streptomyces Phaechromogenes which active glucose isomerase included) and the other with an immobilized glucose isomerase were filled at 7O 0 C operated continuously over a period of the order of months ago. Immobilized whole microbial cell complexes had a glucose isomerase activity of 290 units per gram of product. Immobilized enzymes were found to be 80 units per gram of product
sierte ganze Zellen eine Halbwertszeit von 60 Tagen auf, wohingegen die immobilisierten Enzymderivate eine solche von 20 Tagen hatten. (Halbwertszeit ist definiert als derjenige Zeitraum, in dem das immobilisierte Präparat die Hälfte seiner ursprünglichen Aktivität erreicht.) Das besondere Verfahren und die besonderen Apparaturen, welche für die elektrolytische Fällung benötigt werden, sind dieselben, wie sie Gegenstand des Patents (Patentanmeldung P 22 19 063.2) sind.whole cells had a half-life of 60 days, whereas the immobilized enzyme derivatives had one of 20 days. (Half-life is defined as the period of time in which the immobilized Preparation achieved half of its original activity.) The special procedure and the special apparatus required for electrolytic precipitation are the same as them Subject of the patent (patent application P 22 19 063.2) are.
Die Verwendung immobilisierender ganzer Zellen kann sich, wenn für ein gegebenes Verfahren eine bestimmte Anzahl an Enzymen erforderlich ist, als sehr fruchtbar erweisen. Ein besonderer Vorteil tritt auf, wenn ein Verfahren Zusatzfaktoren, wie NAD/ NADH+,H+, aufweist. In solchen Fällen werden die Zellen nicht nur als Enzym- oder Enzymequelle verwendet, sondern auch als Quelle der Zusatzfaktoren.The use of immobilizing whole cells may prove beneficial, if for a given procedure certain number of enzymes required prove to be very fertile. There is a particular advantage when a procedure has additional factors such as NAD / NADH +, H +. In such cases the Cells are used not only as a source of enzymes or enzymes, but also as a source of additional factors.
In einem Ausführungsbeispiel wurden Kollagen als Membranmaterial verwendet. Kollagen ist ein faseriges Hydroxyprolin aus einem Protein von Glycintyp, welches den hauptsächlichen organischen Bestandteil des tierischen Bindegewebes und der Knochen darstellt. In diesem Ausführungsbeispiel wird Kollagen aus Rindersehne oder -haut in einer Mischeinrichtung in Dispersion gebracht. Der pH-Wert der Dispersion wurde je nachdem, welches Enzym verwendet wurde, an die sauren oder basischen Bedingungen angepaßt. Die Konzentration des Kollagens in der Dispersion liegt üblicherweise zwischen 0,5 und 5 Gew.-% pro Gewicht dieser Stufe. Der Dispersion in dem Mischer wird sodann eine Zellsuspension zugefügt und ebenfalls untergemischt. Das Verhältnis Zelle zu Kollagen (auf der Grundlage des Trockengewichts) liegt zwischen '/5 und Vi und hängt vom Zellentyp ab; d. h. Kugel, Stab oder Faden usw. Die gutverteilte Mischung wird sodann auf ein Polyestersubstrat in einer Dicke von 100 — 12 500 tausendstel Millimeter ausgegossen. Die gegossene Membran läßt man dann auf dem Polyestersubstrat bei Zimmertemperatur trocknen. Der getrocknete Film wird sodann durch Eintauchen in eine saure Chromsulfatlösung (11,67%. mindestens 1 Monat gealtert, saures Enzym), oder in eine alkalische Formaldehydlösung (10% HCHO, 1% NaHCO3) oder eine Glutaraldehydlösung usw. (alkalisches Enzym) gegerbt. Die Gerbzeit liegt normalerweise zwischen '/2 Minute und '/2 Stunde und hängt von der Stabilität der in die Gerblösung gebrachten Enzyme ab. Die gegerbte Membran wird sodann sorgfältig mindestens eine '/2 Stunde lang in fließendem Wasser ausgewaschen. Die Membran ist sodann gebrauchsfertig. Die Membran kann sowohl trocken als auch naß aufbewahrt werden. Die Dicke der getrockneten Membran liegt normalerweise zwischen 2 und 250 tausendstel Millimeter. In one embodiment, collagen was used as the membrane material. Collagen is a fibrous hydroxyproline made from a protein of the glycine type, which is the main organic component of animal connective tissue and bones. In this embodiment, collagen from bovine tendon or skin is dispersed in a mixing device. The pH of the dispersion was adjusted to the acidic or basic conditions, depending on which enzyme was used. The concentration of collagen in the dispersion is usually between 0.5 and 5% by weight per weight of this stage. A cell suspension is then added to the dispersion in the mixer and also mixed in. The cell to collagen ratio (on a dry weight basis) is between 1/5 and Vi and depends on the cell type; ie ball, rod or thread etc. The well-distributed mixture is then poured onto a polyester substrate in a thickness of 100-12,500 thousandths of a millimeter. The cast membrane is then allowed to dry on the polyester substrate at room temperature. The dried film is then immersed in an acidic chromium sulfate solution (11.67%. Aged at least 1 month, acidic enzyme), or in an alkaline formaldehyde solution (10% HCHO, 1% NaHCO 3 ) or a glutaraldehyde solution, etc. (alkaline enzyme) tanned. The tanning time is normally between 1/2 minute and 1/2 hour and depends on the stability of the enzymes brought into the tanning solution. The tanned membrane is then carefully washed in running water for at least 1/2 hour. The membrane is then ready for use. The membrane can be stored dry as well as wet. The thickness of the dried membrane is usually between 2 and 250 thousandths of a millimeter.
Das aus den Zellen und dem Kollagen komplexierte Medium sollte sorgfältig bei Raumtemperatur oder darunter getrocknet werden, um nicht die gebundenen Zellen zu beschädigen.The medium complexed from the cells and the collagen should be carefully kept at room temperature or dried underneath so as not to damage the bound cells.
Die Membran mit den in ihr enthaltenen immobilisierten ganzen Zellen wird üblicherweise auf einem inerten Untergrund, wie etwa Kunstseide-Baumwoll-Mischgewebe, aufgetragen und zu einer zylinderförmigen Patrone aufgerollt Die Dicke des inerten Untergrundes liegt im allgemeinen zwischen 5 und 500 Tausendstel Millimeter.The membrane with the immobilized whole cells contained in it is usually on an inert Substrate, such as a rayon-cotton blend, is applied and made into a cylindrical shape Rolled up cartridge The thickness of the inert substrate is generally between 5 and 500 thousandths Millimeter.
Üblicherweise wird ein zentral angebrachter Stab dazu verwendet, um den Aufbau der Patrone zu bewirken, welche sodann eng in eine ummantelte Säule oder ein anderes Gehäuse eingepaßt wird, um auf diese Weise ein katalytisches Reaktionsgefäß zu bilden. A centrally located rod is commonly used to effect the construction of the cartridge which is then snugly fitted into a jacketed column or other housing to thereby form a catalytic reaction vessel.
Während Kollagen ein bevorzugtes Beispiel für die vorstehend beschriebenen Anwendungen ist, können andere membranbildende Materialien wie Zein und andere dispergierbare natürliche oder synthetische Polymere ebenfalls als Trägermaterial für immobilisierbare ganze Zellen in Membranform verwendet werden. Als zweites Beispiel für die Verwendung natürlichen Proteins zum Komplexieren von Mikrobenzellen wird ein Film aus Zein und ganzen Zellen aus einer Lösung aus Zein und ganzen Zellen gemäß dem Stand der Technik gegossen. Dasselbe Verfahren wie beim Kollagen-Film wurde auch bei Präparieren der Komplexe aus dem Protein und den Zellen angewendet. While collagen is a preferred example of the uses described above, other membrane-forming materials such as zein and other dispersible natural or synthetic polymers can also be used as a carrier material for immobilizable whole cells in membrane form. As a second example of the use of natural protein to complex microbial cells, a film of zein and whole cells is cast from a solution of zein and whole cells according to the prior art. The same procedure as with the collagen film was used to prepare the complexes from the protein and the cells.
Zein ist ein Prolamin (alkohollösliches Protein) aus Mais. Es ist das einzige kommerziell erhältliche Prolamin und eines der am wenigsten leicht erhältlichen Pflanzenproteine. Zein tritt überwiegend in der Endosperma des Maiskornes auf. Die Menge an alkohollöslichem Protein steht in direkter Beziehung zum gesamten Endosperma-Proteingehalt, wobei der Zeingehalt in verschiedenen Maisproben zwischen 2,2 und 10,4% der Trockensubstanz schwankt.Zein is a prolamin (alcohol-soluble protein) from corn. It is the only commercially available prolamin and one of the least readily available vegetable proteins. Zein occurs predominantly in the endosperm of the corn kernel. The amount of alcohol-soluble protein is directly related to the total endosperm protein content, with the zein content in different maize samples fluctuating between 2.2 and 10.4% of the dry matter.
Zein wird im Vergleich zu den meisten Proteinen durch einen relativ hohen Fehlbetrag an hydrophilen Gruppen gekennzeichnet. In der Tat bewirkt der hohe Anteil an unpolaren (Kohlenwasserstoffe) und sauren amidischen Seitenketten die Löslichkeit von Zein in organischen Lösungsmitteln und deren Klassifikation als ein Prolamin.Compared to most proteins, zein is characterized by a relatively high lack of hydrophilic properties Groups marked. In fact, the high proportion of non-polar (hydrocarbons) and acidic causes amidic side chains the solubility of zein in organic solvents and their classification as a prolamin.
Lösungen von z. B. kommerziell erhältlichem Zein zum Gießen von Filmen können auf reiner Komponentenbasis hergestellt werden, wobei der Wassergehalt von rohem Zein und anderen Reagenzien in Betracht gezogen werden muß. Die gießfertigen Lösungen werden durch Lösen des Proteins in einem frei wählbaren organischen Lösungsmittel unter leichtem Rühren bei Zimmertemperatur während eines Zeitraums von 1 -2 Stunden, innerhalb dessen die Lösung vervollständigt wird, bereitet. Als geeignete Lösungsmittel werden vorzugsweise 81 Gew.-% Isopropylalkohol und 4%ige Methylcellosolve (Äthylenglycol-Monoäthyl-Äther) verwendet. Die klaren Lösungen enthieltenSolutions from z. B. Commercially available zein for casting films can be made on a component-only basis taking into account the water content of crude zein and other reagents must be pulled. The ready-to-pour solutions are released by dissolving the protein in one selectable organic solvent with gentle stirring at room temperature for a period of time of 1-2 hours, within which the solution is completed. As a suitable solvent Preferably 81% by weight isopropyl alcohol and 4% methyl cellosolve (ethylene glycol monoethyl ether) used. The clear solutions contained
20 - 30 Gewichtsprozent trockenes Zein und waren von bernsteinfarbigem Aussehen. Polymerisationsmittel, wie20-30 weight percent dry zein and was amber in appearance. Polymerizing agents such as
Formaldehyd, und Weichmacher sollten kurz vor dem Ausgießen des Films beigefügt werden.Formaldehyde and plasticizers should be added just before the film is poured out.
Natürlich kann auch jedes beliebige andere bekannteOf course, any other known
Verfahren zum Ansetzen geeigneter gießfertigei Zeinlösungen verwendet werden und in der vorstehenden Beschreibung wurde nur ein geeignetes bekanni:« Verfahren beispielhaft ausgewählt Ein weiteres Verfahren zum Herstellen von Membra nen durch Komplexieren von enzymatisch aktivem Protein und ganzen Mikrobenzellen besteht b dei elektrolytischen Fällung einer makromolekularen Proteindispersion, welche mit ganzen Mikrobenzellen vor enzymatischer Aktivität zusammengemischt und korn- Process for preparing suitable pourable zein solutions can be used and in the above description only one suitable known: «Process selected by way of example Another process for the production of membranes by complexing enzymatically active protein and whole microbial cells consists in the electrolytic precipitation of a macromolecular protein dispersion, which mixed together with whole microbial cells before enzymatic activity and granular
plexiert wurde. Die Mikrobenzellwände sind zum teJwas plexed. The microbial cell walls are at teJ aus Polypeptiden zusammengesetzt, so daß die Zellencomposed of polypeptides so that the cells
eine elektrische Ladung aufweisen, welche vomhave an electrical charge which from
pH-Wert der Zellsuspension abhängtpH of the cell suspension depends
Proteinträgermaterial und einer wäßrigen Lösung aus ganzen Mikrobenzellen werden stabile Makromolekularkomplexe zwischen den Zellen und dem Protein gebildet Diese aus Zellen und Protein bestehenderProtein carrier material and an aqueous solution of whole microbial cells become stable macromolecular complexes between the cells and the protein These are made up of cells and protein
Makromolekularkomplexe weisen bei einem auf jeder Seite ihres isoelektrischen Punktes gelegenem pH-Wert eine elektrische Nettoladung auf und wurden sich daher unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes bewegen. Beim Trocknen der Komplexe, welches erst nach dem Vorliegen ausreichender Dicke der elektrolytisch gefällten, makromolekularen Komplexe einsetzt, ergibt sich dann die enzymatisch aktive Membran, welche ganze immobilisierte Mikrobenzellen enthält. Sowohl die Zellen als auch das Trägermaterial brauchen nicht in ι ο geladener Form vorzuliegen, da sie in der Dispersion Komplexe bilden und daher entweder die Zelle oder der Träger eine elektrische Nettoladung für den Komplex beisteuert.Macromolecular complexes have a pH value on either side of their isoelectric point have a net electric charge and would therefore move under the influence of an electric field. When drying the complexes, which is only done after the presence of a sufficient thickness of the electrolytic If precipitated, macromolecular complexes are used, the enzymatically active membrane then results, which contains whole immobilized microbial cells. Both the cells and the carrier material do not need in ι ο charged form, since they form complexes in the dispersion and therefore either the cell or the Carrier contributes a net electrical charge to the complex.
Nachdem nun die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird ein mehr ins Einzelne gehendes Verständnis der Erfindung durch Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele erreicht, welche in diese Beschreibung aufgenommen wurden, um die Erfindung besser zu erläutern, und nicht dazu dienen sollen, als Begrenzung der Erfindung betrachtet zu werden, wenn dies nicht ausdrücklich betont wird.Having now generally described the invention, a more detailed understanding will be provided of the invention is achieved by reference to certain specific examples included in this specification are included in order to better illustrate the invention and are not intended to be used as a limitation of the invention to be considered unless expressly emphasized.
B e i s ρ i e 1 1B e i s ρ i e 1 1
20 g gefrorene Zellen von Streptomyces Phaeochromogenes (Chargen-Nr. 6-7-72) wurden mit destilliertem Wasser so aufgefüllt, daß das Volumen der Suspension bei IOC ml lag. Die Suspension wurde 10 Minuten lang gerührt, um die Zellen zu dispergieren. Die Zellsuspension wurde 15 Minuten lang unter Schütteln (130 Umdrehungen pro Minute) in einem Rotationswasserbadschüttler auf 8O0C erhitzt und die Suspension sodann langsam auf Zimmertemperatur abgekühlt.20 g of frozen cells of Streptomyces Phaeochromogenes (batch no. 6-7-72) were made up with distilled water so that the volume of the suspension was IOC ml. The suspension was stirred for 10 minutes to disperse the cells. The cell suspension was heated for 15 minutes with shaking (130 rpm) on a rotary water bath shaker at 8O 0 C and the suspension was then slowly cooled to room temperature.
110 g Hautkollagen wurde 100 ml Wasser zugegeben und in einem Mischer vermischt. Der pH-Wert des innig vermischten Gemenges wurde durch Zugabe von 1 n-NaOH-Lösung auf 11,2 eingestellt. Die sich hieraus ergebende Zellsuspension wurde sodann langsam in die Kollagendispersion eingegeben. Die Mischung wurde in Abständen abgekühlt, um ein Ansteigen der Temperatur auf über 200C zu verhindern. Die gemischte Dispersion wurde auf ein Polyesterblatt vergossen und sodann bei Zimmertemperatur getrocknet. Das totale Trockengewicht des Komplexes betrug 12,5 g. Der getrocknete Komplex wurde eine Minute lang in Formaldehydlösung (lOVoig und 1% Natriumbicarbonat enthaltend, pH-Wert 835) gegerbt Er wurde danach sofort eine halbe Stunde lang unter kaltem fließendem Wasser gewaschen. 13 g der gegerbten Komplexmembran wurden in kleine Stücke geschnitten und auf ihre Glucose-Isomerase-Aktivität hin untersucht Die ca. 6x6 mm messenden Stückchen wurden dazu verwendet, um die Isomerisation von 5 ml 18%iger Glucose (bestehend aus 0,01 molarem Mg++ und 0,2molaran Phosphatpuffer mit pH 7) bei 700C zu katalysieren. Die Reaktion wurde in einem auf einem Schüttler angebrachten Testrohr eingeleitet und bei 700C durchgeführt Das Schütteln wurde mit einer Geschvrindigkeit von 150 Umläufen pro Minute durchgeführt Die Reaktion wurde durch Feststellen der sich bildenden Menge an Fructose, wobei die Thiobarbitursäuremelhode (2) verwendet wurde, verfolgt Das Probeverfaliren wurde modifiziert und für die Verwendung in einem automatischen Analyseapparat automatisiert Der prozentuale in Fructose umgewandelte Glucoseanteil wurde während verschiedener Reaktionszeiten entnommen. Tabelle 1 faßt die Ergebnisse zusammen. Aus den anfänglichen Umwandlungsdaten wurde berechnet, daß pro Gramm des Komplexes insgesamt Streptomyces Phaeochromogenes-Zellen, welche 131 Einheiten von Glucose-Isomerase-Aktivität entsprechen, immobilisiert wurden. Eine Einheit wurde definiert als diejenige Menge an Enzym, welche 1 mg Fructose bei 70°C pro Stunde erzeugt.110 g of skin collagen was added to 100 ml of water and mixed in a mixer. The pH of the intimately mixed mixture was adjusted to 11.2 by adding 1N NaOH solution. The resulting cell suspension was then slowly added to the collagen dispersion. The mixture was cooled at intervals in order to prevent the temperature from rising to above 20 ° C. The mixed dispersion was cast on a polyester sheet and then dried at room temperature. The total dry weight of the complex was 12.5 g. The dried complex was tanned for one minute in formaldehyde solution (containing 10% and 1% sodium bicarbonate, pH 835). It was then immediately washed for half an hour under cold running water. 13 g of the tanned complex membrane were cut into small pieces and examined for their glucose isomerase activity. The pieces measuring approximately 6 × 6 mm were used to determine the isomerization of 5 ml of 18% glucose (consisting of 0.01 molar Mg + + and 0.2 molar phosphate buffer with pH 7) at 70 0 C to catalyze. The reaction was initiated in a mounted on a shaker test tube and was carried out at 70 0 C. The shaking was performed with a Geschvrindigkeit of 150 revolutions per minute, the reaction was stopped by detecting the forming amount of fructose, said Thiobarbitursäuremelhode was used (2), The sampling procedure was modified and automated for use in an automatic analyzer . The percentage of glucose converted to fructose was taken during various reaction times. Table 1 summarizes the results. From the initial conversion data it was calculated that a total of Streptomyces Phaeochromogenes cells corresponding to 131 units of glucose isomerase activity were immobilized per gram of the complex. One unit was defined as the amount of enzyme which produces 1 mg of fructose per hour at 70 ° C.
Dieses Beispiel weist den Einfluß des Gerbens von Membranen aus Komplexen von Kollagen und Zellen in einer Formaldehyd-Lösung als Funktion der Zeit nach. Das Vernetzen der Membran führt zu stabilen Komplexen, welche bei hohen Temperaturen (bis zu 70° C) verwendet werden können.This example shows the influence of the tanning of membranes made from complexes of collagen and cells in a formaldehyde solution as a function of time. The cross-linking of the membrane leads to stable Complexes that can be used at high temperatures (up to 70 ° C).
Destilliertes Wasser wurde zu 33 g gefrorener Streptomyces Phaeochromogen-Zellen (Chargen-Nr. 6 29-72) gegeben, bis das Volumen der Suspension 200 ml betrug. Die Suspension wurde magnetisch 15 Minuten lang gerührt, um die Zellen gut zu dispergieren. Die Zellsuspension wurde 1,5 Stunden lang in einem Rotationswasserbadschüttler (bei 130 UpM) über 8O0C erhitzt.Distilled water was added to 33 g of frozen Streptomyces Phaeochromogen cells (Lot No. 6 29-72) until the volume of the suspension was 200 ml. The suspension was magnetically stirred for 15 minutes to disperse the cells well. The cell suspension was heated for 1.5 hours in a rotary water bath shaker (at 130 rpm) about 8O 0 C.
Der Suspension wurden 150 g Hautkollagen zugegeben und der Kollagen-Zell-Komplex magnetisch gerührt. Der pH-Wert der Mischung wurde unter fortgesetztem Rühren langsam auf einen Wert von 11,35 geändert, indem tropfenweise 1 n-NaOH zugegeben wurde. (Langsame Zugabe von verdünntem Natriumhydroxyd verhindert bei schnellem magnetischem Rühren ein lokales Ansteigen des pH Wertes der Mischung über den erwünschten Wert.) Während der zweistürdigen Rührperiode wurde ein Ansteigen der Mischungstemperatur auf über 20°C vermieden. Die Dispersion wurde auf ein Blatt aus Mylar gegossen und bei Zimmertemperatur trocknen gelassen. 150 g of skin collagen were added to the suspension and the collagen-cell complex was stirred magnetically. The pH of the mixture was slowly changed to a value of 11.35 by adding 1N NaOH dropwise with continued stirring. (The slow addition of dilute sodium hydroxide prevents the pH of the mixture from rising locally above the desired value with rapid magnetic stirring.) During the two-hour stirring period, the temperature of the mixture did not rise to over 20 ° C. The dispersion was poured onto a sheet of Mylar and allowed to dry at room temperature.
Ein kleiner Teil der getrockneten Komplexmembran wurde zerschnitten und in sieben Stücke geteilt Jedes Stück wurde gewogen und unterschiedlich lange; in flüssigem Formaldehyd (10%ig mit 1% Natriumbikarbonat, pH 8) gegerbt Unmittelbar danach wurde jedes Stück unter fließendem kaltem Wasser eine halbe Stunde lang gewaschea Auch die nicht gegerbter Stücke wurden eine halbe Stunde lang gewaschen. Jede; Stück wurde sodann bei 700C auf Glucose-Isomerase Aktivität untersucht, wobei 10 ml 18%iger Glucose (welche O.Olmolares Mg++ und 0,1% Methylparabei enthielt) als Substrat verwendet wurden. Die Reaktioi wurde in Teströhren unter Schütteln (130 Zyklen p. M. durchgeführt Durch Messung der in einer halbei Stunde gebildeten Fructose wurden die Enzymeinheitei bei jedem Stück berechnet Tabelle 2 faßt die Resultat« zusammen:A small part of the dried complex membrane was cut and divided into seven pieces. Each piece was weighed and of different lengths; tanned in liquid formaldehyde (10% with 1% sodium bicarbonate, pH 8). Immediately thereafter, each piece was washed under running cold water for half an hour. The untanned pieces were also washed for half an hour. Every; Piece was then examined activity at 70 0 C on glucose isomerase, with 10 ml 18% glucose (which contained O.Olmolares Mg ++ and 0.1% Methylparabei) were used as substrate. The reaction was carried out in test tubes with shaking (130 cycles per minute). By measuring the fructose formed in half an hour, the enzyme units were calculated for each piece. Table 2 summarizes the results:
Komplexgewichi Complex weight
GerbzeitTanning time
(min)(min)
Gesamte Einheiten der Glucose-Isomerase Total units of glucose isomerase
Einheiten des KomplexesUnits of the complex
(g)(G)
0,42
0,29
0,35
0,26
0,45
0,47
0,380.42
0.29
0.35
0.26
0.45
0.47
0.38
0,50.5
1,01.0
2,02.0
5,05.0
10,010.0
30,030.0
54,0
80,4
71,4
64,2
93,6
25,6
4,854.0
80.4
71.4
64.2
93.6
25.6
4.8
128,5128.5
268,4268.4
201,0201.0
249,0249.0
207,6207.6
54,654.6
12,712.7
66 g gefrorener Streptomyces Phaeochromogen-Zellen (Chargen-Nr. 6-29-72) wurden in 200 ml Wasser und 210 g Hautkollagen suspendiert und die Membranen aus Kollagen-Zell-Komplexen wurden nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Membrane wurde sodann in einer Formaldehydlösung gegerbt und danach eine halbe Stunde unter fließendem kaltem Wasser gewaschen.66 g frozen Streptomyces Phaeochromogen cells (Lot No. 6-29-72) were suspended in 200 ml of water and 210 g of skin collagen and the membranes off Collagen-cell complexes were made according to the example 2 described method produced. The membrane was then tanned in a formaldehyde solution and then washed for half an hour under cold running water.
25 g der Komplexmembranen wurden auf ein ca. 128 mm breites Filtergewebe, das als Abstandselement diente, geschichtet. Ein 127 mm langer und 3 mm dicker Glasstab wurde als Zentralelement verwendet. Der Kollagen-Zellmembran-Komplex wurde auf dem Filtergewebe (0,15 mm dick) zu zwei Patronen aufgewickelt. Jede Patrone war 127 mm lang und hatte einen Außendurchmesser von 25,4 mm.25 g of the complex membranes were placed on an approx. 128 mm wide filter fabric, which was used as a spacer element served, layered. One 127 mm long and 3 mm thick Glass rod was used as the central element. The collagen-cell membrane complex was on the filter tissue (0.15 mm thick) wound into two cartridges. Each cartridge was 127 mm long and had one Outside diameter of 25.4 mm.
Die zwei Patronen wurden Rücken an Rücken in eine ummantelte Glassäule gepackt. Die Säulenabmessungen sind 292 mm Mantellänge und 25,4 mm Innendurchmesser. Die Säulen hatten am Boden Ausschnitte, auf denen die Patronen abgestützt wurden. Die Säule war auch ti)it einem Vorerwärmungsteil ausgerüstet, um die Substra!- lösung vor der Kontaktnahme mit dem Katalysatorbett auf die richtige Temperatur zu bringen. Die Temperatur wurde in diesem System durch Wasser, welches mit einer hohen Flußrate durch den Säulenmantel zirkulierte, kontrolliert, wobei ein Thermostat verwendet wurde. In dieser Weise konnte die Temperatur des Reaktionsgefäßes auf ±0,2°C konstant gehalten werden. Die Säule wurde dazu verwendet, um kontinuierlich Glucose zu isomerisieren, weiche durch eine peristaltische Pumpe am Boden der Säule eingeleitet wurde. Die Flüssigkeit floß durch die Säule nach oben, und das Produkt wurde im Kopf der Säule gesammelt. In dieser Durchflußvorrichtungsanordnung wurde das gleichförmige laminare Fließverhalten den Membranoberflächen durch die Kapillarwirkung der Filtertuchabstände und den geringen Druck, der von der peristaltischen Pumpe bewirkt wird, erleichtert Der Transport der Reagenzien und der Produkte in den Membrankomplex hinein bzw. heraus wurde durch Diffusion bewirkt Die komplexierte Zellmembran wurde auf diese Weise wirksam in Kontakt gebracht The two cartridges were packed back to back in a jacketed glass column. The column dimensions are 292 mm jacket length and 25.4 mm inner diameter. The pillars had cutouts at the bottom on which the cartridges were supported. The column was also equipped with a preheating section in order to bring the substrate solution to the correct temperature before it came into contact with the catalyst bed. The temperature in this system was controlled by water circulating through the column jacket at a high flow rate using a thermostat. In this way, the temperature of the reaction vessel could be kept constant at ± 0.2 ° C. The column was used to continuously isomerize glucose which was introduced by a peristaltic pump at the bottom of the column. The liquid flowed up the column and the product was collected at the top of the column. In this flow device arrangement, the uniform laminar flow behavior of the membrane surfaces was facilitated by the capillary action of the filter cloth gaps and the low pressure exerted by the peristaltic pump.The transport of reagents and products into and out of the membrane complex was effected by diffusion into the complexed cell membrane was effectively brought into contact in this way
Die Säule arbeitet bei 700C Das verwendete Substrat war 18%ige Glucose, welche 0,01-molares Mg+ + und 0,1% Methylparaben enthielt Im Substrat wurde kein Puffer verwendet und der pH-Wert des Substrates wurde durch die Verwendung von 1 η-Natronlauge auf 7,1 gebracht. Das leere Volumen der Säule betrug ungefähr 20 ml und die Durchflußrate variierte zwischen 11 und 12 ml/Stunde. Diese Zahlen entsprechen einer Verweilzeit von 1,7 bis 1,8 Stunden in der Säule. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt:The column operates at 70 ° C. The substrate used was 18% glucose, which contained 0.01 molar Mg + + and 0.1% methyl paraben. No buffer was used in the substrate and the pH of the substrate was determined by using 1 η sodium hydroxide solution brought to 7.1. The empty volume of the column was approximately 20 ml and the flow rate varied between 11 and 12 ml / hour. These numbers correspond to a residence time of 1.7 to 1.8 hours in the column. The results are summarized in Table 3:
Dauer der ProbeDuration of the rehearsal
4 Stunden
5,5 Stunden
31 Stunden
53 Stunden
79 Stunden4 hours
5.5 hours
31 hours
53 hours
79 hours
4 Tage4 days
5 Tage5 days
6 Tage6 days
7 Tage7 days
8 Tage
10 Tage
11,12 Tage8 days
10 days
11.1 2 days
12 Tage12 days
13 Tage13 days
14 Tage14 days
15 Tage15 days
Umwandlung
in Prozentconversion
in percent
41,0
42,5
40,0
40,0
41,8
40,6
40,6
41,0
39,7
38,4
35,4
35,0
35,0
38,4
38,5
40,0 41.0
42.5
40.0
40.0
41.8
40.6
40.6
41.0
39.7
38.4
35.4
35.0
35.0
38.4
38.5
40.0
Die Kolonne setzte die Glucose-Isomerisierung sogar noch einige Wochen nach Beendigung der täglichenThe column continued isomerization of glucose even a few weeks after the end of the daily isomerization
Messungen kontinuierlich fort.
•'-sMeasurements continue continuously.
• '-s
Dieses Beispiel weist die Herstellung von Komplexmembranen aus enzymatisch aktiven Protein und ganzen Mikrobenzellen durch elektrolytische Fällung nach.This example demonstrates the production of complex membranes from enzymatically active protein and whole microbial cells by electrolytic precipitation.
0,75 g Natriumalginat wurden in 75 ml destilliertem Wasser gelöst und zu 100 ml 1%iger Kollagendispersion zugegeben. Dazu wurde tropfenweise und unter ständigem magnetischen Rühren TRIS-Lösung zugege-0.75 g of sodium alginate was dissolved in 75 ml of distilled water and made into 100 ml of 1% collagen dispersion admitted. For this purpose, TRIS solution was added dropwise and with constant magnetic stirring.
is ben bis ein pH-Wert von 8,5 erreicht und die Mischung gut dispergiert war. Ein Gramm getrocknete Streptotnyces Phaechromogen-Zellen wurde mit hoher magnetischer Rührgeschwindigkeit unter die Dispersion gemischt.is ben until a pH of 8.5 is reached and the mixture was well dispersed. One gram of dried Streptotnyces Phaechromogen cells was found to be highly magnetic Stirring speed mixed into the dispersion.
Die Dispersion wurde in ein Edelstahlgefäß, welches als Kathode diente, getan. Ein flexibler Edelstahlschirm wurde in der Mitte des elektrolytischen Fällungsgefäßes angeordnet und wie eine Anode mit der Stromquelle verbunden. Beim Anlegen eines Gleichstroms von 0,5 — 0,6 Ampere bei einer Spannung von 50 V beganr Sich der Komplex aus den ganzen Zellen und derr Kollagen auf der flexiblen Edelstahlanode niederzu schlagen. Nach 15minütiger Ablagerung wurde die Stromquelle abgeschaltet und die Anode aus dem GefäCThe dispersion was placed in a stainless steel vessel which served as a cathode. A flexible stainless steel umbrella was placed in the middle of the electrolytic precipitation vessel and like an anode with the power source tied together. When applying a direct current of 0.5-0.6 amps at a voltage of 50 V it began The complex of the whole cells and the collagen settles on the flexible stainless steel anode beat. After 15 minutes of deposition, the power source was switched off and the anode was removed from the vessel
so herausgenommen. Die Membran wurde auf dei Elektrode getrocknet Durch Wiederholung diese: Vorganges wurden insgesamt 3,6 g (Tockengewicht Membranmaterial aus ganzen Zell-Kollagen-Komple xen auf 9 Edelstahlschirmen niedergeschlagen. so taken out. The membrane was dried on the electrode. By repeating this: a total of 3.6 g (dry weight membrane material from whole cell-collagen complexes were deposited on 9 stainless steel screens.
Diese Schirme wurden zusammen mit den aufgetra genen Membranen in ein mit Ein- und Auslal versehenes Glasgehäuse gebracht Diese Vorrichtun) wurde dazu verwendet, um die Umwandlung voi Glucose in Fructose durch Hindurchtretenlassen deThese screens were combined with the applied membranes in a with inlet and outlet provided glass case. This device was used to convert the voi Glucose into fructose by letting it pass through Substratlösung durch die aktive, immobilisierte, ganz Mikrobenzelle enthaltende Membran zu katalysierer Diese Vorrichtung wurde nach dem Zirkulationsverfah ren, mit Auswaschen nach jedem Durchlauf, bei 60° < dreimal betrieben. Jedesmal wurde festgestellt daß diSubstrate solution through the active, immobilized, whole Membrane containing microbial cells to be catalyzed This device was operated according to the circulation method ren, with washing out after each run, at 60 ° < operated three times. Each time it was found that di
immobilisierte ganze Mikrobenzellen enthaltende Gk cose-Isomerase aktiv war, wie dies durch ein beachtliche (13%ige) Umwandlung von Glucose i Fructose bewiesen wurde.Gk cose isomerase containing immobilized whole microbial cells was active, as indicated by a considerable (13%) conversion of glucose to fructose was demonstrated.
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