DE2450137A1

DE2450137A1 - Verfahren zur herstellung von l-apfelsaeure und immobilisierter fumarase-produzierender mikroorganismus zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2450137A1
Application number: DE19742450137
Authority: DE
Inventors: Ichiro Chibata; Tadashi Sato; Osaka Takatsuki; Tetsuya Tosa; Kozo Yamamoto
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1973-10-22
Filing date: 1974-10-22
Publication date: 1975-04-24
Also published as: SE7413220L; JPS5069289A; JPS5410636B2

Description

Verfahren zur Herstellung von L-Apfelsäure und immobilisierter Fumarase-produzierender Mikroorganismus zur Durchführung des Verfahrens Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Apfelsäure mit Hilfe eines Fumarase-produzierenden Mikroorganismus und sie betrifft ferner einen zur Durchführung des Verfahrens in besonders vorteilhafter Weise geeigneten Mikroorganismaus.
Fumarase (Enzym-Klassifikationsnummer: 4.2.1.2) ist bekanntlich ein Enzym, das die reversible Reaktion zwischen Fumarsäure und L-Apfelsäure katalysiert.
Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Herstellung von L-Apfelsäure durch enzymatische Umsetzung von Fumarase mit Fumar- -säure oder einem Salz derselben bekannt. So kann z. B. L-Apfelsäure hergestellt werden durch Kultivierung eines Fumarase-produzierenden Mikroorganismus in einem Nährmedium, das Fumarsäure oder ein Salz derselben enthält, und anschließende Isolierung von L-Apfelsäure aus dem erhaltenen Fermentationsmedium (vgl.
z. B. japanische Patentpublikationen 16547/1966 und 14786/1969).
Ferner ist L-Apfelsäure herstellbar durch Umsetzung eines Fumarase-erzeugenden Mikroorganismus mit Fumarsäure -oder einem Salz derselben (vgl. japanische Patentpublikationen Nr. 4511/1962 und 1191/1969, sowie "The Journal of General and Applied Microbiology, Band 6, Nr. 2 (1960), Seiten 108 bis 116). Diese bekannten Verfahren sindS edZoçhZ zu ZeZ er Herstellung in großtechnischem Maßstab nicht geeignet. Die Herstellung von L-Apfelsäure nach diesen bekannten Verfahren wird begleitet von der Bildung von Verunreinigungen in Form von Mikrobenzellen, Nährmediumstoffen und/oder Proteinen. Es sind daher zusätzliche Verfahrensschritte zur Entfernung der Mikrobenzellen und anderen Verunreinigungen vom Verfahrensprodukt erforderlich, um L-Apfelsäure in hoher Reinheit zu gewinnen. Ferner wird nach Beendigung der enzymatischen Reaktion die Reaktionslösung aufgekocht und/oder angesäuert, um die Fumarase-produzierenden Mikroorganismen zu zerstören, worauf die Niederschläge aus Mikroorganismen abfiltriert werden. Die Fumarase-produzierenden Mikroorganismen sind daher nur einmal verwendbar und müssen danach verworfen werden.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung von L-Apfelsäure anzugeben, das die Bildung von Nebenprodukten, z. B. Bernsteinsäure, vermeidet und zusätzliche Reinigungsschritte bei der Abtrennung des Verfahrensproduktes überflüssig macht durch Verwendung eines Mikroorganismus, der sich durch eine hohe Fumarase-Aktivität über eine lange Zeitspanne auszeichnet und nicht verworfen zu werden braucht, sondern in nachfolgenden Operationen wieder verwendbar ist.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß die angegebene Aufgabe lösbar ist mit Hilfe eines Fumarase-produzierenden Mikroorganismus, der immobilisiert und zur Herstellung von L-Apfelsäure aus Fumarsäure oder einem Salz derselben befähigt ist.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Apfelsäure mit Hilfe eines Fumarase-produzierenden Mikroorganismus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man mindestens ein Acryloylmonomer in einer wäßrigen Suspension eines Pumarase-produzierenden Mikroorganismus polymerisiert unter Bildung eines immobilisierten Fumarase-produzierenden Mikroorganismus, und den immobilisierten erhaltenen Fumarase-produzierenden Mikroorganismus einer enzymatischen Reaktion mit Fumarase oder einem Salz derselben unterwirft.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein immobilisierter Fumarase-produzierender Mikroorganismus zur Durchführung des Verfahrens, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er einen Fumarase-produzierenden Mikroorganismus fest eingeschlossen enthält im Molekül gitter eines semipermeablen Acryloylpolymerisats bestehend aus einem Homopolymerisat aus N,N'-Niedrigalkylen-bisacryloylamid, Bis(acryzloyl-amidomethyl)äther oder N,N'-T)iacryloyl-äthylen-harnstoff, oder einem Copolymer ausAcryloylamid und N,N'-Di--niedrigalkylen-bis-acryloyl2unid, einem Copolymer aus Acryloylamid und Bis(acryloyl-amidomethyl)äther oder einem Copolymer aus Acryloylamid und N,N'Di-acryloyl-äthylen harnstoff.
Erfindungsgemäß in besonders vorteilhafter Weise verwendbare Fumarase-produzierende Mikroorganismen sind z. B. Brevibacterium ammoniagenes IAM (Institution of Applied Microbiology, Tokyo University, Japan) 1641 (ATCC 6871) (vgl0 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7e Auflage (1957), Seite 499), Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 (ATCC 6872) (vgl. das angegebene Bergey's Manual, Seite 499), Corynebacterilun equi lAM 1038 (vgl. das angegebene Bergey's Manual, Seite 588), Escherichia coli ATCC 113ob (vgl. das angegebene Bergey's Manual, Seite 336), Microbacterium flavum IAM 1642 (vgl. das angegebene Bergey's Manual, Seite 601), Proteus vulgaris IFO (Institute for Fermentation, Osaka, Japan) 3045 (vgl. das angegebene Bergey's Manual, Seite 365), und Pichia farinosa IFO 0574 (vgl.
The Chemistrg and Biology of Yeast (herausgegeben von A.H. Cook), 1958, Seite 37). Die angegebenen Mikroorganismen sind der Öffentlichkeit zugänglich von den genannten Hinterlegungsstellen.
In diesem Zusammenhang ist jedoch hervorzuheben, daß das Verfahren der Erfindung nicht begrenzt ist auf die Verwendung dieser speziellen Mikroorganismen, sondern daß alle Fumarase-produzierenden Mikroorganismen verwendbar sind, z. B. die zum Genus Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Proteus und Pichia gehörenden. Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung sind die Fumarase-erzeugenden Mikroorganismen in einer Menge von 0,1 bis 5 g, insbesondere von 1 bis 3 g, pro g Acryloylmonomer oder -monomeren, verwendbar. Die erfindungsgemäß durchgeführte Polymerisationsreaktion dient dazu, jeden Mikroorganismus in das Molekülgitter des Polymeren fest e-inzuschließen, wodurch eine hohe enzymatische Aktivität für eine lange Zeitdauer erzielt wird.
Die erfindungsgemäß durchgeführte Polymerisationsreaktion kann in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsbeschleunigers durchgeführt werden. Typische geeignete Polymerisationsinitiatoren sind z. B Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B2 und Methylenblau. Als Polymerisationsbeschleuniger sind z. B. ß-(Dimethylamino)-propionitril und N,N,N' zu -Ile trane N,N,N',N'-etramethyl-äthylendiamin verwendbar.
Der Polymerisationsinitiator kann zu der wäßrigen Suspension des Fumarase produzierenden Mikroorganismus in einer Menge von 1 bis 100 mg pro g Acryloylmonomer oder -monomeren zugesetzt werden. Der Polymerisationsbeschleuniger wird zweckmäßigerweise in einer Menge von 5 bis 10 mg ipro g Acryloylmonomer oder -monomeren zugegeben. Die Reaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 5 bis 50 °C, insbesondere von 10 bis 30 0C durchgeführt. Die Umsetzung kann innerhalb von 5 bis 60 Minuten beendet werden.
Typische, zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendbare Acryloylmonomere sind z. B. Acryloylamid, N,N'-Niedrigalkylen-bis-acryloylamid, Bis( acryloylamidomethyl )äther und N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff (N,N'-Diacryloyl-imidazolidin-2-on). Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung erweist es sich als vorteilhaft, den Fumarase-erzeugenden Mikroorganismus mit einem Polymer einzuschließen, das aus einem oder zwei der angegebenen Monomeren erhalten wird, insbesondere mit einem Copolymer aus Acryloylamid und einem Acryloylmonomer bestehend aus N,N'-Niedrigalkylen-bis-acryloylamid, Bis(acryloylamidomethyl)-äther oder N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff. N,N'-Methylenbis-acryloylamid und N,N'-Propylen-bis-acryloylamid werden als N,N' -Niedrigalkylen-bis-acryloylamide bevorzugt verwendet.
N,N'-Niedrigalkylen-bis-acryloylamid, Bis(acryloylamidmethylp äther oder N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff werden für die Mischpolymerisation mit Acryloylamid zweckmäßigerweise in einer Menge von 10 bis 200 mg, insbesondere 50 bis 100 mg, pro g Acryloylamid verwendet.
Nach beendeter Polymerisationsreaktion wird der erhaltene immobilisierte Fumarase-produzierende Mikroorganismus granuliert durch Hindurchleiten durch ein Sieb unter Bildung von Granalien von 0,5 bis 30 mm, insbesondere 1 bis 5 mm Durchmesser. Die Fumarase-Aktivität des auf diese Weise erhaltenen immobilisierten Präparats kann erhöht werden durch Behandlung desselben mit einer wäßrigen Lösung, die ein oberflächenaktives Mittel sowie Fumarsäure oder ein Salz derselben enthält. Die Behandlung Wird vorzugsweise durchgeführt durch Suspendieren des immobilisierten Präparats in einer wäßrigen Lösung (pH 6 bis 9), die ein oberflächenaktives Mittel und Fumarsäure oder ein Salz derselben enthält, worauf die Suspension bei 20 bis 40 °0 stehen gelassen wird. Als oberflächenaktives Mittel ist jedes übliche bekannte kationische oberflächenaktive Mittel (z. B. Cetylpyridiniumchlorid oder Cetyltrimethylammoniumchlorid) oder anionische oberflächenaktive Mittel (z. B. Natriumdodecylsulfat) oder nichtionogene oberflächenaktive Mittel (z. B. Glycerylmonostearat) verwendbar. Als Salze der Fumarsäure sind z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Cal c ium-, Magnesium-, und Bariumfumarat e verwendbar.
Das oberflächenaktive Mittel wird in der Lösung vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,005 bis 0,5 9G (G/V) verwendet. Vorzugsweise beträgt die Konzentration an Fumarsäure oder deren Salz etwa 0,5 bis 1,0 Mol/Liter.
Ferner erweist es sich als besonders vorteilhaft, das immobilisierte Präparat mit einem organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser zu behandeln. Die Behandlung des immobilisierten Präparats mit dem organischen Lösungsmittel oder wäßrigen organischen Lösungsmittel ist insofern besonders vorteilhaft, als nach dieser Behandlung das immobilisierte Präparat praktisch keine Nebenprodukte, z. 3. Bernsteinsäure, bei der enzymatischen Umsetzung desselben mit Fumarsäure liefert. Diese Behandlung ist auch insofern von Vorteil, weil sie die Abtrennung von L-Apfelsäure von Bernsteinsäure erübrigt. Sobald L-A»felsäure mit Bernsteinsäure verunreinigt ist, kann es schwierig sein, das Verfahrensprodukt Apfelsäure von der nebenbei gebildeten Bernsteinsäure mit Hilfe übliMer bekannter Reinigungsverfahren abzutrennen. Ferner kann die Fumarase-Aktivität des immobilisierten Präparats durch die Behandlung mit dem organischen Lösungsmittel erhöht werden. Die Behandlung mit dem organischen Lösungsmittel ist durchführbar durch Imprägnierung des immobilisierten Präparats in einem organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser, vorzugsweise unter Rühren. Vorzugsweise wi-rd die Behandlung bei 20 bis 40 0C bei einem pH-Wert von 6 bis 9 durchgeführt.
Typische, bevorzugt verwendete organische Lösungsmittel sind z. B. Alkanone mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen (z. B. Aceton oder Methyläthylketon), ein Alkanol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (z. B. Methanol, Äthanol, Propanol oder Butanol), ein Dialkyläther mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen (z. B. Diäthyläther), Dioxan, Toluol, Äthylacetat und Chloroform.
L-Apfelsäure kann, wie bereits erwähnt, hergestellt werden durch enzymatische Reaktion des immobilisierten Fumarase-produzierenden Mikroorganismus mit Fumarsäure oder einem Salz derselben. Als Salz der Fumarsäure sind z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium- und Bariumfumarate geeignet.
Die enzymatische Umsetzung kann bei 5 bis 60 OC, insbesondere bei 10 bis 50 00, durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Umsetzung bei einem pH-Wert von 5 bis 10, insbesondere von 7 bis 7,5, durchgeführt. Die erfindungsgemäße enzymatische Reaktion kann beschleunigt werden, indem sie in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels durchgeführt wird. Für diesen Zweck sind die selben oberflächenaktiven Mittel verwendbar, wie sie für die Aktivierung der Granalien des immobilisierten Fumarase-produzierenden Mikroorganismus eingesetzt werden. Eine bevorzugte Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in der Reaktionslösung beträgt etwa 0,005 bis 0,5 (G/V). Die gonzentration an Substrat ist nicht kritisch bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Wird z. B. Natriumfumarat als Substrat verwendet, so wird es in Wasser bei beliebiger Konzentration gelöst. Der angegebene immobilisierte Mikroorganismus wird in der wäßrigen Lösung von Natriumfumarat suspendiert, worauf die Suspension gerührt wird. Nach Beendigung der Reaktion wird das Gemisch abfiltriert oder zentrifugiert, wn den immobilisierten Mikroorganismus für eine nachfolgende Wiederverwendung abzutrennen. Auf diese Weise wird eine wäßrige Lösung, die Natrium-L-malat enthält9 als Filtrat oder überstehende Flüssigkeit erhalten. L-Apfelsäure kann aus dem Filtrat oder dem Überstand isoliert werden. Wird andererseits ein /encfit wasserlösliches Fumarat, z. B. Calciumfumarat, als Substrat verwendet, so wird dieses in Wasser suspendiert. Der immobilisierte Mikroorganismus wird zu depwäßrigen Suspension von Calciumfumarat zugesetzt und das Gemisch wird gerührt. Nach beendeter Reaktion wird Calcium-L-malat in Form des kristallinen Niederschlags erhalten. Die optimale Bedingung für die Umwandlung von Fumarsäure oder einem Salz derselben in L-Apfelsäure kann leicht erhalten werden durch Anpassung der Reaktionszeit.
Wahlweise kann die enzymatische Reaktion gemäß vorliegender Erfindung auch durch eine Säulenmethode durchgeführt werden. Die Säulenmethode ermöglicht es, die Reaktion in sukzessiver Weise durchzuführen. So kann z. B. der immobilisierte Mikroorganismus in die Säule eingebracht werden, worauf eine wäßrige Lösung von Fumarsäure oder einem Salz derselben durch die Säule geleitet wird. Eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt an L-Apfelsäure oder einem Salz derselben wird auf diese Weise als Ausfluß erhalten. Die Isolierung von L-Apfelsäure aus dem Ausfluß kann in üblicher bekannter Weise erfolgen. Wird z. B. Natriumfumarat als Substrat verwendet, so kann L-Apfelsäure isoliert werden durch Ansäuern des Ausflusses mit Salzsaure, Entfernung des gebildeten Niederschlags an Fumarsäure durch Filtration, Zugabe von Calciumcarbonat oder Calciumhydroxid zu dem Filtrat, Sammeln des erhaltenen Niederschlags von Calcium-L-malat durch Filtration, Zugabe von Schwefelsäure zu dem erhaltenen Calcium-L-malat, Abtrennung des erhaltene nen Niederschlags von Calciumsulfat durch Filtration und Behandlung des Filtrats mit einem Ionenaustauscherharz. Wird weniger andererseits ein/leicft wasserlösliches Fumarat, z. B. Calciumfumarat, als Substrat verwendet, so wird dieses vorzugsweise zusammen mit einem wasserlöslichen Fumarat, z. B. Natriumfumarat, eingesetzt. In diesem Falle kann Calciumfumarat in Calcium-L-malat überführt werden durch Filtration einer wäßrigen Suspension eines Gemisches aus Calciumfumarat und Natriumfumarat unter Rühren, Leiten des Filtrats durch die Säule, und Zirkulieren des Ausflusses durch Rückführung desselben zu der angegebenen Suspension. Nach beendeter Reaktion wird Calcium-L-malat in Form eines kristallinen Niederschlags erhalten. Das erhaltene Calcium-L-malat kann in gleicher Weise, wie oben beschrieben, in L-Apfelsäure umgewandelt werden.
Bei der Durchführung der enzymatischen Reaktion hängt die Umwandlungsrate von Fumarsäure oder einem Salz derselben in L-Apfelsäure hauptsächlich von der enzymatischen Wirksamkeit des immobilisierten Mikroorganismus, der Temperatur oder der Reaktionszeit ab. Bei Anwendung der Säulenmethode kann demgegenüber die optimale Reaktionsbedingung für die Umwandlung von Fumarsäure oder einem Salz derselben in L-Apfelsäure leicht erhalten werden durch Einstellung der Fließrate der Substratlösung.
In jedem Falle behält der erfindungsgemäß verwendete immobilisierte Mikroorganismus einen hohen Grad an enzymatischer Aktivität während der Umsetzung bei. Außerdem ist der erfindungsgemäß verwendbare immobilisierte Mikroorganismus aufgrund der ausreichenden Dauerhaftigkeit seiner enzymatischen Aktivität wiederholt für die enzymatische Umsetzung verwendbar.
In der Praxis bewährte und zur Zeit bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden Experimenten und Beispielen erläutert. Mit "Niedrigalkylen" werden in vorliegender Beschreibung Alkylenreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bezeichnet.
Experiment 1 1 g Mikrobenzellen eines in der unten angegebenen Tabelle I aufgeführten Mikroorganismus wurde wie im unten angegebenen besc r bn Beispiel 1-( 1) /immoi isiert. Das erhaltene steife Gel wurde granuliert, indem es durch ein Sieb geleitet wurde unter Bildung von Granalien von 2 mm Durchmesser. Die erhaltenen Granalien wurden mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene immobilisierte Präparat wurde in 30 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,5) suspendiert, die in einigen Ansätzen 0,02 % Cetylpyridiniumchlorid enthielt, in anderen Ansätzen frei von diesem Zusatz war. Die erhaltene Suspension wurde 1 Stunde lang bei 37 0C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann filtriert zur Entfernung des immobilisierten Präparats. Das Filtrat wurde angesäuert mit dem gleichen Volumen 2 N-Salzsäure, um Etumarsäure auszufällen, worauf filtriert wurde. Der Gehalt an L-Apfelsäure im Filtrat wurde nach der in "Analytical Chemistryt' Band 29 (1957), Seite 283 beschriebenen Methode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.
Tabelle 1 Menge an gebildeter L-Apfelsäure in /uMol Menge an zugesetztem Cetylp;,rridinium Immobilisierter Mikroorganismus keine Zugabe 0,02 % Brevibacterium ammoniagenes 178 1220 IAM 1461 Brevibacterium ammoniagenes 490 3370 IAM 1645 Corynebacterium equi 85 424 IAM 1038 Escherichia coli 268 a22 ATCC 11303 Microbacterium flaviun 195 483 IAM 1642 Pichia farinosa 90 650 IFO 0574 Proteus vulgaris 161 263 IFO 3045 Experiment 2 1 g Mikrobenzellen von Brevibacterium ammoniagenes lAM 1645 wurde nach dem im unten angegebenen Beispiel 1-(1) beschriebenen Verfahren immobilisiert. Das erhaltene steife Gel wurde granuliert, indem es durch ein Sieb durchgeleitet wurde unter Bildung von Granalien von 2 mm Durchmesser. Die erhaltenen Granalien wurden mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene immobilisierte Präparat wurde zu 30 ml einer 1 wäßrigen Natriumfumaratlösung (r)H 7,5) die 0,02 % Cetylpyridiniumchlorid enthielt, zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde bei 37 °C eine Zeit lang stehen gelassen, um das immobilisierte Präparat zu aktivieren. Das immobilisierte Präparat wurde sodann durch Filtration gesammelt, mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und danach in 30 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,5) suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde bei 37 OC 1 Stunde lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung des immobilisierten Präparats filtriert. Der Gehalt an L-Apfelsäure im Filtrat wurde wie in Experiment 1 beschrieben bestimmt. Die Fumarase-Aktivität des immobilisierten Präparats wurde aus den Meßdaten berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt.
T a b e 1 1 e II Aktivie- Fumaraseaktivität des immobilisierten rungszeit Präparats (Tage) (/u Mole/Std./g Zellen) 0 490 1 5870 3 5450 7 6530 13 6230 ExPeriment 3 1 g Mikrobenzellen von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 wurde wie im unten angegebenen Beispiel 1-(1) beschrieben immobilisiert. Das erhaltene steife Gel wurde granuliert, indem es durch ein Sieb geleitet wurde unter Bildung von Granalien mit 2 mm Durchmesser. Die erhaltenen Granalien wurden mit einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene immobilisierte Präparat wurde zu 30 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,0), die 0,02 ß Cetylpyridiniumchlorid enthielt, zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde bei 37 0C 24 Stunden lang stehen gelassen, um das immobilisierte Präparat zu aktivieren. Das erhaltene immobilisierte Präparat wurde durch Filtration gesammelt und zu 30 ml einer 0,05 M-PhosphatDufferlösung (pH 7,0), die Aceton, Methanol oder Äthanol in den in der unten angegebenen Tabelle III aufgeführten Konzentrationen enthielt, zugegeben. Nach 30 Minuten langem Rühren des Gemisches bei 25 0C wurde das immobilisierte Präparat durch Filtration gesammelt, mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und danach in 30 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,5) suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde bei 37 0C 1 Stunde lang gerührt. Der Gehalt an L-Apfelsäure in der Reaktionslösung wurde wie im Experiment 1 beschrieben bestimmt und aus den erhaltenen Meßdaten wurde die Fumarase-Aktivität des immobilisierten Präparats berechnet. Nachdem die enzymatische Reaktion weitere 20 Stunden lang durchgeführt worden war, wurde das Reaktionsgemisch filtriert, um das immobilisierte Präparat abzutrennen. Der Gehalt an L-Apfelsäure im Filtrat wurde wie im Experiment 1 beschrieben bestimmt und der Gehalt an Bernsteinsäure im Filtrat wurde durch Papierchromatographie bestimmt unter Verwendung eines Gemisches aus Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 1) als Entwicklerflüssigkeit.
Das Verhältnis von Bernsteinsäure zu L-Apfelsäure wurde aus den Bestimmungsergebnissen berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt.
Tabelle III Organisches Lösungs- Fumaraseaktivität Verhältnis von mittel und dessen des immobilisierten Bernsteinsäure Konzentration in % (/µ Präparats zu L-Apfelsäure (/µ Mole/Std./g Zellen) (%) - 0 5 226 > 2,5 Aceton 20 5 809 > 2,5 lt 33 6 429 1- 2,5 50 50 9 138 <0,5 ., 67 7 408 <0,5 Methanol 33 5 580 <0,5 50 6 080 <0,5 Äthanol 33 6 640 1- 2,5 " 50 2 385 <0,5 Beispiel 1 (1) Es wurde ein wäßriges Nährmedium (pH 7,0) der folgenden Zusammensetzung hergestellt: Glucose 2,0 so (G/V) Fumarsäure 0,5 % (G/V) Harnstoff 0,2 % (G/V) Monokaliumphosphat 0,2 (G/V) Magnesiumsulfat.7 H20 0,05% (G/V) Maisquellwasser 1,0 % (G/V) Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 wurde in 200 ml des Nährmediums eingeimpft. Das Medium wurde bei 30 °C 20 Stunden lang unter Schütteln kultiviert. Danach wurde die Nährlösung zentrifugiert. Die auf diese Weise gesammelten Mikrobenzellen zeigten eine Fumarase-Aktivität von 10 790 /uMol/Std./g Zellen. 4 g der Mikrobenzellen wurden in 16 ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde mit 3 g Acryloylamid, 160 mg N,N'-Methylen-bis-acryloylamid, 2,0 ml einer wäßrigen 5 %igen ßWPimethylamino)-propionitril-Lösung und 2,0 ml einer wäßrigen 1 %igen Kaliumpersulfatlösung versetzt.
Das erhaltene Gemisch wurde bei 25 9C 10 Minuten lang stehen gelassen. Das erhaltene steife Gel wurde granuliert, indem es durch ein Sieb geleitet wurde unter Bildung von Granalien mit 2 mm Durchmesser. Die erhaltenen Granalien wurden mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Es wurden 30 g eines immobilisierten Präparats von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 erhalten. Die Fumarase-Aktivität betrug 450 XuMol/Std./g Gel.
(2) 30 g des immobilisierten Präparats von Brevibacteriwn ammoniagenes IAM 1645 wurden in 100 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,5), die 0,02 % Cetylpyridiniumchlorid enthielt, suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde bei 37 OC 20 Stunden lang stehen gelassen und danach filtriert. Das auf diese Weise erhaltene immobilisierte Präparat wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und danach in eine Säule der Ausmaße 1,72 çm x 28,5 cm eingebracht. 1 l einer 1 M-wäßrigen NatriumiVllmaratlösung (pH 7,5) wurde durch die Säule bei 37 OC mit einer Fließrate von 15 ml/Std. geleitet. Es wurde ein Ausfluß erhalten, der L-Malat in einer Konzentration von 0,85 M und Natriumfumarat in einer Konzentration von 0,15 14 enthielt. Der Ausfluß wurde mit konzentrierter Salzsäure angesäuert und danach zur Entfernung des Niederschlags aus Fumarsäure filtriert. Das Filtrat wurde mit b5 g Calciumcarbonat versetzt. Der gebildete kristalline Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und danach getrocknet. Es wurden 150 g Calcium-L-malat-dihydrat erhalten. Das Calcium-L-malat-dihydrat wurde mit 350 ml 2N-Schwefelsäure versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde filtriert, um den Niederschlag aus Calciumsulfat abzutrennen. Das Filtrat wurde durch eine Säule geleitet, die mit etwa 150 ml Ionenaustauscher "Amberlite IR-120" (H+-Typ) beschickt war, und anschließend durch eine Säule geleitet, die mit etwa 150 ml Ionenaustauscher Amberlite IR-45" (OH--Typ) beschickt war.
Der Ausfluß wurde bei 60 0C unter vermindertem Druck konzentriert. Der gebildete kristalline Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit einer geringen Menge Aceton gewaschen und danach getrocknet. Es wurden 50 g L-Apfelsäure erhalten. Die Mutterlauge wurde konzentriert und die konzentrierte Lösung in gleicher Weise wie oben beschrieben behandelt. Dabei wurden 22 g L-Apfelsäure erhalten.
Gesamtausbeute: 77 g; F = 100 0C; [a]20 = -2,2° ( c = 8,5, H20) Beispiel 2 Nach dem in Beispiel 1-(1) beschriebenen Verfahren wurde ein immobilisiertes Präparat von Brevibacterium ammoniagenes IADI 1645 hergestellt. 30 g des immobilisierten Präparats wurden in 100 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,5), die 0,02 % Cetylpyridiniumchlorid enthielt, suspendiert. Die ° erhaltene Suspension wurde bei 37 C 20 Stunden lang stehen gelassen und danach filtriert. Das auf diese Weise erhaltene immobilisierte Präparat wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und danach in eine Säule der Ausmaße 1,72 cm x 28,5 cm eingebracht. Eine 1 M-wäßrige Natriumfumaratlösung (pH 7,5) wurde durch die Säule bei 37 0C bei einer Fließrate geleitet, wie sie in Tabelle IV angegeben ist. Der Gehalt an L-Apfelsäure im Ausfluß wurde wie in Experiment 1 beschrieben bestimmt. Die prozentuelle Umwandlung von Fumarsäure in L-Apfelsäure wurde aus den Meßdaten berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.
T a b e 1 1 e IV Fließrate Umwandlungsrate von Fumarsäure in Apfelsäure (ml/Std.) (%) 6 85 8,5 85 15 85 26 68 32 60 45 48 72 37 Beispiel 3 Ein immobilisiertes Präparat von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 wurde nach dem in Beispiel 1-(i) beschriebenen Verfahren hergestellt. 30 g des immobilisierten Präparats wurden in 100 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,5), die 0,02 % Cetylpyridiniumchlorid enthielt, suspendiert. Die ° erhaltene Suspension wurde bei 37 C 20 Stunden lang stehen gelassen und danach filtriert. Das auf diese Weise erhaltene immobilisierte Präparat wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und danach in eine Säule mit den Ausmassen 1,72 cm x 28,5 cm eingebracht. Eine 1 M-wäßrige Natriumfumaratlösung (pH 7,5), die 0,001 M-Magnesiumchlorid enthielt, wurde durch die Säule bei 35 °C bzw. 45 0C mit einer-Fließrate von 15 ml/St, geleitet. Der Gehalt an Il-Apfelsäure im Ausfluß wurde wie im Experiment- t beschrieben bestimmt. Die prozentuelle Umwandlung von Fumarsäure in L-Apfelsäure wurde aus den Meßdaten berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V aufgeführt.
Tabelle V Umwandlungsrate von Bumarinsäure in Betriebs- L-Apfelsäure (%) zeit 37 0 0 (Tage) 37 °C 45 °C 3 85 85 6 85 85 9 85 85 12 85 85 15 85 83 18 80 83 21 78 80 24 75 77 27 72 76 30 68 70 Beispiel 4 Nach dem in Beispiel 1-(1) angegebenen Verfahren wurde ein immobilisiertes Präparat aus Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645- hergestellt. 30 g des immobilisierten Präparats wurden in 500 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,5), die 0,02 ffi Cetylpyridiniumchlorid enthielt, suspendiert. Die erhaltene -Suspension wurde bei 37 °C eine bestimmte Zeit lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann filtriert zur Entfernung des immobilisierten Präparats. Der Gehalt an L-Apfelsäure im Filtrat wurde nach dem in Experiment 1 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die prozentuelle Umwandlung von Fumarsäure in L-Apfelsäure wurde aus den Meßdaten berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI aufgeführt.
T a b e 1 1 e VI Betriebszeit Umwandlungsrate von Fumarinsäure in (Std.) L-Apfelsäure (%) 3 12 8 30 24 80 30 85 40 85 Beispiel 5 (1) Microbacterium flavum IAM 1642 wurde in 200 ml eines wäßrigen Nährmediums (pH 7,0) der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1-(1 ) beschrieben, eingeimpft. Das Nährmedium wurde sodann bei 30 0C 20 Stunden lang unter Schütteln kultiviert. Danach wurde die Nährlösung zentrifugiert. Die auf diese Weise erhaltenen Mikrobenzellen zeigten eine Fumaraseaktivität von 810 piol/Std./g. 4 g der Mikrobenzellen wurden in 16 ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde mit 3 g Acryloylamid, 160 mg N,N1-Methylen-bis-acryloylamid, 2,0 ml einer 5 %igen wäßrigen Lösung von ß-(Dimethylamino)propionitril und 2,0 ml einer 1 frigen wäßrigen Lösung von Kaliumsulfat versetzt. Danach wurde das Gemisch bei 25 °C 10 Minuten lang stehen gelassen. Nach beendeter Reaktion wurde das Reaktionsgemish filtriert. Das auf diese Weise erhaltene steife Gel wurde granuliert, indem es durch ein Sieb geleitet wurde unter Bildung von Granalien mit 2 mm Durchmesser. Die erhaltenen Granalien wurden mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Es wurden 30 g eines immobilisierten Präparats von Microbacterium flavum IAM 1642 erhalten. Die Fumarase-Aktivität betrug 65 /uDiol/S$d./g Gel.
(2) 30 g des immobilisierten Präparats von Microbacterium flavum IAM 1642 wurden in eine Säule mit den Ausmaßen 1,6 cm x 33 cm eingebracht. 500 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,5), die 0,05 % Cetylpyridiniumchlorid enthielt, wurden durch die Säule bei 37 °C mit einer Fließrate von 3 ml/Std. geleitet. Der Ausfluß enthielt Natrium-L-malat und Natrium-Fumarat in Konzentrationen von 0,80 M bzw. 0,20 M.
Der Ausfluß wurde wie in Beispiel 1-(2) behandelt. Es wurden 70 g Galcium-L-malat-dihydrat erhalten.
Beispiel 6 Es wurde ein immobilisiertes Präparat von Brevibacterium ammoniagenes lAM 1645 nach dem in Beispiel 1-(1) beschriebenen Verfahren hergestellt. 30 g des immobilisierten Präparats wurden in 100 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlösung, die 0,02 7G Cetylpyridiniumchlorid enthielt, suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde bei 37 °C 20 Stunden lang stehen gelassen und danach filtriert. Das auf diese Weise erhaltene immobilisierte Präparat wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und danach in eine Säule mit den Ausmaßen 1,72 cm x 8,5 cm eingebracht. Ferner wurde eine Substratsuspension hergestellt durch Zugabe von 500 ml einer 1 M-wäßrigen Calciumfumaratsuspension (pH 7,5), die 0,02 ffi Cetylpyridiniumchlorid enthielt, zu 150 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,5). Diese Substratsuspension wurde unter Rühren durch ein Filter geleitet und das erhaltene Filtrat wurde bei 37 0C bei einer Fließrate von 50 ml/Std. durch die Säule geleitet. Der Ausfluß wurde zu der angegebenen Substratsuspension zugegeben und einer Verfahrenszirkulation unterworfen.
Nachdem diese Zirkulation 40 Stunden lang fortgesetzt worden war, wurde der kristalline Niederschlag gesammelt. Es wurden 92 g Calcium-L-malat-dihydrat erhalten.
Beispiel 7 Ein immobilisiertes Präparat von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 wurde wie in Beispiel 1-(1) beschrieben hergestellt.
20 g des immobilisierten Präparats wurden in 60 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,0), die 0,02 % Cetylpyridiniumchlorid enthielt, suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde bei 37 0C 24 Stunden lang stehen gelassen und danach filtriert. Das auf diese Weise. erhaltene immobilisierte Präparat wurde in 100 ml einer 0,05 M-Phosphatnufferlösung (pH 7,0), die 50 % Aceton enthielt, suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde bei 25 0C 30 Minuten lang gerührt. Das immobilisierte Präparat wurde sodann durch Filtration gesammelt, mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und danach in eine Säule mit den Ausmaßen 1,6 cm x 15 cm eingebracht. Eine 1 M-wäßrige Natriumfumaratlösung (pH 7,0) wurde bei 37 °C und einer Fließrate von 6 ml/Std. durch die Säule geleitet. Der Gehalt an L-Apfelsäure im Ausfluß wurde in gleicher Weise, wie in Experiment 1 beschrieben, bestimmt. Die prozentuelle Umwandlung von Fumarsäure in L-Apfelsäure wurde aus den Meßdaten berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VII aufgeführt.
T ab e 1 1 e VII Betriebs- Umwandlungsrate von Fumarsäure in zeit t (Tage) L Apfelsäure (%) 2 81 5 83 7 85 9 83 12 84 16 81 19 82 23 83 28 83 33 82 35 82 Beispiel 8 (1) 4 g Mikrobenzellen von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 wurden in 16 ml einer physiologischen Köchsalzlösung suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde mit 3 g Acryloylamid, 160 mg Bis-(acryloylamidomethyl)äther, 2 ml einer 5 zeigen Lösung von ß-(Dimethylamino)-propionitril und 2 ml einer 1 %igen Kaliumpersulfatlösung versetzt. Die erhaltene Suspension wurde bei 25 0C 10 Minuten la;ng stehen gelassen. Das erhaltene steife Gel wurde granuliert, indem es durch ein Sieb geleitet wurde unter Bildung von Granalien mit 2 mm Durchmesser. Die erhaltenen Granalien wurden mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Es wurden 30 g immobilisiertes Präparat von Brevibacterium ammoniagenes IÄM 1645 erhalten. Die Fumarase-Aktivität betrug 430 /uMol/ Std./g Gel.
(2) 30 g des immobilisierten Präparats wurden in 100 ml einer wäßrigen 1 M-Lösung von Natriumfumarat (pH 7,5), die 0,02 % Cetylpyridiniunchlorid enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde bei 37 D 20 Stunden lang stehen gelassen und danach filtriert. Das erhaltene Gel wurde mit einer physiologischen Kochsalziösung gewaschen und danach in 500 ml einer 1 M-wäßrigen Natriumfumaratlb.sung (pH 7,5) suspendiert. Die Suspension wurde bei 37 OC 24 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann zur Entfernung des immobilisierten Präparats filtriert. Die im Filtrat vorhandene L-Apfelsäure wurde in Form des Calciumsalzes isoliert in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben. Es wurden 70 g Calcium-L-malat-dihydrat erhalten.
Beispiel 9 (1) 4 g Mikrobenzellen von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 wurden in 16 ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension wurden 3 g Acryloylamid, 160 mg N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff, 2 ml einer 5 zeigen Lösung von ß-(Dimethylamino)-propionitril und 2 ml einer 1 %igen Kaliumpersulfatlösung zugegeben. Die Suspension wurde bei 25 °C 10 Minuten lang stehen gelassen. Das erhaltene steife Gel wurde granuliert, indem es durch ein Sieb geleitet wurde unter Bildung von Granalien mit 2 mm Durchmesser. Die erhaltenen Granalien wurden mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Es wurden 30 g des immobilisierten Präparats von Brevibacteriwn ammoniagenes IAM 1645 erhalten. Die Fumarase-Aktivität betrug 450 /uMol/Std./g Gel.
(2) 30 g des immobilisierten Präparats wurden in 100 ml einer wäßrigen 1 M-Natriumfumaratlösung (pH 7,5), die 0,02 74 Cetylpyridiniumchlorid enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde bei 37 oC 20 Stunden lang stehen gelassen und danach filtriert.
Das erhaltene Gel wurde mit einer shysiologischen Eochsalzlösung gewaschen und danach in 500 ml einer wäßrigen 1 M-Lösung von Natriumfumarat (pH 7,5) suspendiert. Die Suspens-ion-wurde bei 37 °C 24 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemis-ch wurde sodann filtriert, wn das immobilisierte Präparat abzutrennen. Die -im Filtrat vorliegende L-Apfelsäure wurde in Form des Calciumsalzes isoliert nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren. Es wurden 70 g Calcium-L-malat-dihydrat erhalten.
Beispiel 10 (1) 4 g Mikrobenzellen von Brevibacterium ammoniagenes I 1645 wurden in 16 ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension wurden 40 mg N,N'-Methylen-bis(acryloylamid), 1,2 ml einer 0,112 frigen Lösung von ,N,N','-Tetramethyl-äthylendiamin und 0,12 ml einer 2,5 frigen Lösung von Ammoniumpersulfat zugegeben. Die Suspension wurde sodann bei 37 °C 60 Minuten lang stehen gelassen. Das erhaltene steife Gel wurde granuliert, indem es durch ein Sieb geleitet wurde unter Bildung von Granalien mit 2 mm Durchmesser.
Die erhaltenen Granalien wurden mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Es wurden 25 g des immobilisierten Präparats von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 erhalten.
Die Fumarase-Aktivität betrug 470 /uMol/Std./g Gel.
(2) 25 g des immobilisierten Präparats wurden in 500 ml einer wäßrigen 1 M-Natriumfumaratlösung (pH 7,5), die 0,02 % Cetylpyridiniumchlorid enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde bei 37 OC 24 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung des immobilisierten Präparats filtriert. Die im Filtrat vorhandene L-Apfelsäure wurde in Form des Calciumsalzes isoliert, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wird. Es wurden 70 g Calcium-L-malat-dihydrat erhalten.
Beispiel 11 (1) 4 g Mikrobenzellen von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 wurden in 16 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension wurden 40 mg Bis(acryloylamidomethyl)äther, 1,2 ml einer 0,112 zeigen Lösung von N?N,N' ,N'-Tetramethyl-äthylendiamin und 0,12 ml einer 2,5 eigen Lösung von Ammoniumpersulfat zugegeben. Die Suspension wurde bei 37 0C 60 Minuten lang stehen gelassen.
Das erhaltene steife Gel wurde granuliert, indem es durch ein Sieb geleitet wurde unter Bildung von Granalien mit 2 mm Durchmesser. Die Granalien wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Es wurden 25 g des immobiliaerten Präparats von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 erhalten.
Die Fumarase-Aktivität betrug 480 /uMol/Std./g Gel.
(2) 25 g des immobilisierten Präparats wurden in 500 ml einer wäßrigen 1 M-Natriumfumaratlösung (pH 7,5), die 0,02 % Cetylpyridiniumchlorid enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde 24 Stunden lang bei 37 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um das immobilisierte Präparat abzutrennen. Die im Filtrat vorhandene L-Apfelsäure wurde in Form des Calciumsalzes isoliert nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren.
Es wurden 70 g Calcium-L-malat-dihydrat erhalten.
Beispiel 12 (1) 4 g Mikrobenzellen von Brevibacteriwn ammoniagenes IADI 1645 wurden in 16 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspension wurde mit 40 mg N,N'-Di-acryloyl-äthylen harnstoff, 1,2 ml einer 0,112 zeigen Lösung von N,N,N',N'-Tetramethyl-äthylendiamin und 0,12 ml einer 2,5 zeigen Ammoniumpersulfatlösung versetzt. Die Suspension wurde bei 37 0C 60 Minuten lang stehen gelassen. Das erhaltene steife Gel wurde granuliert, indem es durch ein Sieb geleitet wurde unter Bildung von Granalien mit 2 mm Durchmesser. Die erhaltenen Granalien wurden mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Es wurden 25 g iminobilisiertes Präparat von Brevibacterium ammoniagenes IABi 1645 erhalten. Die Fumarase-Aktivität betrug 480 /uMol/Std./g Gel.
(2) 25 g des immobilisierten Präparats wurden in 500 ml einer wäßrigen 1 M-NatriumÎumaratlösung (pH 7,5), die 0,02 ffi Cetylpyridiniumchlorid enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde bei 37 °C 24 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann filtriert zur Entfernung des immobilisierten Präparats.
Die im Filtrat vorhandene L-Apfelsäure wurde in Form des Calciumsalzes isoliert, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wird.
Es wurden 70 g Calcium-L-malat-dihydrat erhalten.

Claims

P a t e n-t a n s p r ü c h e

0 Verfahren zur Herstellung von L-Apfelsäure mit Hilfe eines Fumarase-produzierenden Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein Acryloylmonomer in einer wäßrigen Suspension eines Fumarase-produzierenden Mikroorganismus polymerisiert unter Bildung eines immobilisierten Fumarase-produzierenden Mikroorganismus, und den erhalteimmobllisierten nen/ rwnarase-proauzlerenden Mikroorganismus einer enzymatischen Reaktion mit Fumarase oder einem Salz derselben unterwirft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acryloylmonomer Acryloylamid, N,N'-Niedrigaikylen-bisacryloylamid, Bis-(acryloylamidomethyl)äther oder N,Nt-Di-acryloyl-äthylenharnstoff verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man N,N'-Niedrigalkylen-bis-acryloylamid, Bis(acryloylamidomethyl)-äther oder N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff polymerisiert, oder Acryloylamid mit N,N1-Niedrigalkylen-bis-acryloylamid, Bis(acryloylamidomethyl)äther oder N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff mischpolymerisiert in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsbeschleunigers.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polymerisation bei 5 bis 50 oC durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Reaktion bei 5 bis 50 OC und einem pH-Wert von 5 bis 10 durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische-Reaktion bei 5 bis 60 0C und einem pH-Wert von 5 bis 10 in Gegenwart eines in einer Konzentration von 0,005 bis 0,5 ffi (G/V) vorliegenden oberflächenaktiven Mittels durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polymerisationsinitiator Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B2 oder Methylenblau, und als Polymerisationsbeschleuniger ß-(Dimethylamino)-prop.ionitril oder W,N,N',N'-Tetramethyl-äthylendiamin verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fumarase-produzierende Mikroorganismen Brevibacterium ammoniagenes IAM 1641, Brevibacterium ammoniagenes TAM 1645, Corynebacterium equi IAM 1038, Escherichia coli ATCC 11303, Microbacterium flavum IAM 1642, Proteus vulgaris IFO 3045 oder Pichia farinosa IFO 0574 verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Salz der Fumarsäure Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, agnesium- oder Bariumfumarat verwendet.
10. Verfahren nach Ansprüchen 3, 4 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den immobilisierten Fumarase-produzierenden Mikroorganismus durch ein Sieb leitet unter Bildung von Granalien mit 0,5 bis 30 mm Durchmesser und den in Form von Granalien vorliegenden immobilisierten Fumarase-produzierenden Mikroorganismus mit einer wäßrigen Lösung aktiviert, die 0,005 bis 0,5 % (G/V) eines oberflächenaktiven Mittels und 0,1 bis 1,0 Mol/l Fumarsäure oder ein Salz derselben enthält, bevor er der enzymatischen Reaktion mit Fumarsäure oder einem Salz derselben unterworfen wird.
11. Verfahren nach Ansprüchen 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den immobilisierten Fumarase-produzierenden Mikroorganismus durch ein Sieb leitet unter Bildung von Granalien mit 0,5 bis 30 mm Durchmesser und den in Form von Granalien vorliegenden immobilisierten Fumarase-produzierenden Mikroorganismus mit einem organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser behandelt, bevor er der enzymatischen Reaktion mit Fumarsäure oder einem Salz derselben bei 5 bis 60 °O und einem pH-Wert von 5 bis 10 unterworfen wird.
12. Verfahren nach Ansprüchen 3, 4, 6, 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß man den immobilisierten Pumarase-produzierenden Mikroorganismus durch ein Sieb leitet unter Bildung von Granalien mit 0,5 bis 30 mm Durchmesser und den in Form von Granalien vorliegenden immobilisierten Fumaraseproduzierenden Mikroorganismus zunächst durch Behandlung mit einer wäßrigen Lösung, die 0,005 bis 0,5 % (G/V) eines obdrflächenaktiven Mittels und 0,5 bis 1,0 Mol/l Fumarsäure/ein Salz derselben enthält, aktiviert und danach mit einem organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser behandelt, bevor er der enzymatischen Reaktion mit Fumarsäure oder einem Salz derselben unterworfen wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Reaktion in Gegenwart von 0,005 bis 0,5 % (G/V) eines oberflächenaktiven Mittels durchführt.
14. Immobilisierter Fumarase-produzierender Mikroorganismus zur Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Fumarase-produzierenden Mikroorganismus fest eingeschlossen enthält im Molekülgitter eines semipermeablen Acryloylpolymerisats bestehend aus einem Homopolymerisat aus N,N'-Niedrigalkylen-bis-acryloylamid, Bis(acryloyl-amidomethyl)äther oder N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff, oder einem Copolymer aus Acryloylamid und N,N'-Di-niedrigalkylen-bis-acryloylamid, einem Copolymer aus Acryloylamid und Bis(acryloyl-amidomethyl)äther oder einem Copolymer aus Acryloylamid und N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff.
15. Immobilisierter Eumarase-produzierender Mikroorganismus nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß pro g Acryloylpoßymerisat 0,1 bis 5 g des Fumarase-produzierenden Mikroorganismus eingeschlossen sind.
16. Immobiliåerter Fumarase-produzierender Mikroorganismus nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das semipermeable Acryloylpolymerisat in Form von Granalien mit 0,5 bis 30 mm Durchmesser vorliegt.
17. Immobilisierter Fumarase-produzierender Mikroorganismus nach Ansprüchen 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Acryloylpolymerisat aus einem Mischpolymerisat aus Acryloylamid und 10 bis 200 mg, pro g Acryloylamid, N,N'-Niedrigalkylenbis-acryloylamid, Bis(acryloylamidomethyl)äther oder N,N'-Di-acryloyl-äthylenharnstoff besteht.