DE2138000A1

DE2138000A1 - Verfahren zur Herstellung von Zeaxan thin

Info

Publication number: DE2138000A1
Application number: DE19712138000
Authority: DE
Inventors: A J Schocher; O Wiss
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1970-07-31
Filing date: 1971-07-29
Publication date: 1972-02-10
Also published as: CA950848A; NL7110401A; FR2099367A5; TR17137A; AT304414B; GB1318828A; ZA714028B; ES393771A1; CH549094A; IT1051240B; SE377135B; BE770744A

Description

Dr. Ing. Λ. van der Werth 29 Juli 1971 Dr. Franz Leder« PATENTANWALT!

6002/110

Hofl&nann-La Rochc & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin [^i^'-Dihydroxy-ß-carotin] durch Kultivieren von Bakterienstämmen, die der Klasse der Schizomyceten angehören.

Es wurde festgestellt, dass für die Herstellung von Zeaxanthin auf fermentativem Wege bestimmte, unter den Nos. CBS 519/67 und CBS 523/67 registrierte Stämme der Gattung FIavobacter oder durch Selektion oder Mutation erhaltene Subkulturen dieser Stämme aus der Familie Achromobacteraceae, die sich über die Ordnung Eubacteriales von der Klasse der Schizomyceten ableitet, besonders geeignet sind.

Die im vorstehend beschriebenen Verfahren verwendeten Mikroorganismen, die im Meer- und Süsswasser syrnbiotisch oder parasitär leben, können in an sich bekannter Weise, z.B. aus Meerwasser und Meersand, aus Meertieren, z.B. aus Muscheln oder Austern sowie aus pflanzlichem Material aus Meer- und Landwässern gewonnen werden.

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Die Mikroorganismen lassen sich in an sich bekannter Weise züchten. Meeralgen oder verrottetes organisches Material ■δ.Β. von den Stränden von Skandinavien oder Afrika worden in einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Die Auswahl des Materials für die WeiterZüchtung erfolgt z.B. in der Weise, dass man die Suspensionen in bekannter Weise kultiviert, erhaltene gelbe Kulturen durch Weiterzüchten auf festen Nährböden und in flüssigen Nährlösungen reinigt, das intrazellular gebildete Carotinoid mit Aceton extrahiert und mit Hilfe eines Dünnschichtchromatogramms analysiert. Als Testsubstanz dient zweckmässig reines Zeaxanthin aus Zea-Mais.

Die Isolierung und Reinzüchtung der erhaltenen gelben Kulturen kann z.B. wie folgt durchgeführt werden:

Das als Quelle von Mikroorganismen verwendete Material von Strandzonen aus Norwegen wird In physiologischer Kochsalzlösung aufgeschwemmt. Von der überstehenden Flüssigkeit werden Streukulturen in Petrischalen angelegt [Nährboden: 0,1 % Hefeextrakt, 0,1 % Trypton, 1,0 % Kochsalz und 2 # Ap;ar in Leitungswasser, pH 7«2j. Die auf dem Agar wachsenden gelben Kolonien werden auf den Carotinoidgehalt untersucht.

Das Material aus Afrika wird analog behandelt.

Auf diese Weise wurde eine Reihe Zeaxanthin-produzierender Stämme isoliert, von denen Reinkulturen ausgewählt wurden, die nach einer vom Institut für Mikrobiologie der Eidg. Technischen Hochschule, Zürich, durchgeführten taxonomischen Klassifizierung Eigenschaften zeigen, die am besten mit denjenigen des Genus Flavobacterium, zugehörig zu der Familie Achromobacteraceae der Ordnung Eubaeteriales übereinstimmen.

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213 800Q

Die genannten Reinkulturen sind

a) beim Centraalbureau für Schimmelcultures, iiaarri, Holland
unter den Nos. CBS 519/67 und CBS 523/67

h) bei der American Type Cultures Collection, Rockville, Maryland, USA
unter den Nos.ATCC 21.588 und ATCC 2108l

deponiert und registriert.

Ein Abkömmling der Reinkultur CBS 519/67 bzw. ATCC 21.'j'ö'ö wurde von dem der

National Collection of Industrial Bacteria

angeschlossenen Torry Research Station in Aberdeen, Schottland, wie folgt charakterisiert:

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Morphologie

Motilität:

Physiologische Teste:

Gram negative Stäbchen.

Gelbe, durchsichtige Kolonien auf Seewasser-Nährboden-Agar.

Fortbewegung mit Hilfe einiger lateraler Geissein, nicht durch Kriechen.

Kovacs-Oxydase:

Phosphatase:

Bakteriolytische Eigenschaften:

Gegen Polymyxin B:

Hugh &Leifson-Test:

Kohlehydrattest:

keine

stark empfindlich keine Glucosebildung keine Säurebildung.

Das erfindungsgemässe Verfahren basiert auf der Verwendung dieser Stämme. Es ist dadurch gekennzeichnet, dass man · einen Mikroorganismus der Stämme CBS 519/67 oder CBS 525/67 der Gattung Plavobacter oder eine durch Selektion oder Mutation erhaltene Subkultur dieser Stämme in einer wässerigen Nährlösung, die eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie die bei Gärprozessen üblichen Zusätze enthält, gegebenenfalls unter Belichtung und/oder Zusatz von die Pigmentbildung und das Wachstum fördernden Stoffen, kultiviert und aus der erhaltenen Zellmasse gegebenenfalls das Zeaxanthin isoliert,

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Die im vorliegenden Verfahren eingesetzten Stämme lassen sich in an sieh bekannter Weise auf festen Nährböden oder submers in flüssigen Nährlösungen, allgemein in Nährmedien, die eine assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoff-quelle.sowie die üblicherweise verwendeten anorganischen Salze enthalten, kultivier&n.

Als assimilierbare Stickstoffquelle können zahlreiche tierische, pflanzliche, mikrobielle sowie anorganische Stickstoffverbindungen, z.B. Soyamehl, Fischmehl, Fleischmehl, Fleischextrakt, Pepton, Trypton, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Aminosäuren, Ammoniumsalze, Harnstoff oder auch Salze der Salpetersäure, verwendet werden.

Als assimilierbare Kohlenstoffquelle eignen sieh al U: 'Zucker und deren Polymere, z.B. Stärke, Dextrin, Saccharose,Lactose, Maltose, Glucose, Melasse und Maisquellwasser, ferner auch Aminosäuren und deren Polymere, Fettsäuren und Polyalkohole _t wie z.H. Glycerin.

Das Nährmedium kann von Natur aus vorhandene oder zugesetzte aus mineralischen oder organischen Bestandteilen stammende Spurenelemente enthalten. So können beispielsweise Schwefel und Phosphor aus den im Nährmedium vorhandenen anorganischen oder organischen Komponenten stammen oder speziell dem Nährmediuin zugefügt werden. Falls erwünscht oder erforderlich , können dem Nährmedium auch wachstumsf ordernde Mittel oder Stimulantien , wie z.B. Vitamine und/oder Kinetin^zugesetzt werden.

Der eigentliche Gärprozess sowie die Aufarbeitung der Zellmasse kann nach an sich bekannten Methoden z.B.wie folgt durchgeführt werden:

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Für die Kultivierung der erfindunf;s/>;erriäss für die Herstellung von Zeaxanthin eingesetzten Schlzorriycelen-ILitLiniriie eignen sich u.a. Nährlösungen folgender Zusammensetzung:

Nährboden I [für CBS 519/67 und CBS 523/67

und Abkömmlinge dieser Stämme]

Hefeextrakt 5 g

Glucose 5 g

Tri3-(hydroxymethyl)-aminömethan 1 g

natriumchlorid 1 g

tu^nesiumsulfat · 7HO 100 mg

Kaliumchlorid 100 mg

Natriumnitrat 100 mg

Calciumchlorid · 2HO 100 mg

Natriump.lycerophospnat 100 mg

lnnrLn in Cyrmocohfl-.jnin 1 mg

Spurenelemente:

KiKen als Eisensulfat · 7H₂O 0,5 mg

Zink als Zinkchlorid 0,3 mg

ßor als Borsäure 0,1 mg

Cobalt als Cobaltnitrat . 6HpO 0,1 mg

Kupfer als Kupfersulfat · 5H₃O 0,1 mg

■Jlangan als Mangansulfat 0,1 mg

i'iolybdän als Natriummolybdat 0,1 mg

aqua destillata quantum satis ad 1.000 ml

pH = 7,5

Nährboden II [für CBS 519/67 und CBS 523/67

und Abkömmlinge dieser Stämme]

hefeextrakt 1 g

Trypton 10 g

Glucose 10 g

Natriumchlorid 10 g

Leitungswasser q.s.ad 1.000 ml

pH = 7,5

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Nährboden III

Hefeextrakt 'irypton

Glucose

Natri umchloricl hixpne s iumc hlor id f'iiifjinfjsiumtu' 1 fat Calciumsulfat Kaliumchlorid Mo >/ne s iumbr omid

Leitungswasser q. pH = 7,5

[für CBS 519/67 und CBS 523/67; und Abkömmlinge dieser Stämme]

. 10 μ g 1 *'

3.1 g

2.2 g 1,2 r. 0,7 g 0,07g

ad

1.000 ml

Nährboden IV

Hof«extrakt 'rrypton
Glucose
ü'leischexti'iJct W atriuiuchlorid

.inurenelemente: [Zusammensetzung wie unter Ij

a-sua uestiliata α. s. ad pH =7,5

[für CBS 519/67 und CBS 523/67 und Abkömmlinge dieser Stämme]

b	g
10	g
1	er O
5	g
35

I.000 ml

Nährboden V [für CBS 519/67 und CBS 523/67

und Abkömmlinge dieser Stämme] Hefeextrakt 10 g

Trypton 10 g

Glucose 5g

Palmitinsäuremethylester 20 g

Kohlenwasserstoff-Fraktion [^G2.0~"^G20^ ^{10 g} Natriumchlorid 30 g

Magnesiumsulfat · 7H„0 5 g

Leitungswasser q.s. ad pH = 7*5

1.000 ml

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Nährboden VI [für CBS 519/67 und Abkömmlinge dieses Stammes]

Glucose Harnstoff Natriumchlorid Magnesiumsulfat · sec.Kalium-o-phosphat

Vitamine:

Biotin Thiamin-hydr ο chlor i d Riboflavin Polsäure Pyridoxin-hydrochlorid Nicotinsäure Calcium-Pantothenat

Spurenelemente r Stammlösung in ml

1 ml Stammlösung: enthält: Bor als Borsäure Cobalt als Cobaltsulfat · Kupfer· als Kupfersulfat · Mangan als. Mangansulfat · Eisen als Elsensulfat Zink. als Zinksulfat Calcium als Calciumchlorid g

1,5 g

g

5 g

1 g

0,,Ql mg

1	mg.
1	mg
ö _rQ5	mg
2'	mg
1	mg'
1	mg

mg

5	mg
5	mg
	mg
2,5	mg
5	mg
	mg
	mg

Agar

aqua destillata q.s, pH = 7*2

ad

1.000 ml

Nährboden VIa [für CBS 519/67 und Abkömmlinge dieses Stammes]

Glucose Harnstoff Natriumchlorid Magnesiumsulfat . 7Ho see.Kalium-o-phosphat

Vitamine: Nicotinsäure

Spurenelemente: analog Nährboden VI

aqua destillata q. PH = 7,2

s. ad

1,5
20 .

g g g g g

mg

1.000 ml

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.Nährboden VII [für CBS 519/67 und CBS 523/67

und Abkömmlinge dieser Stämme]

Glucose 10 g

Totalhydrolysat von Casein ·'( vitaminfrei)· 10 g

Natriumchlorid . 20 g

Natriumsulfat · 7H₂O 5g

see^Kaliiim-o-phosphat 1 S

Vitaminen

analog Nährboden VI

Spurenelementes
analog Nährboden VI

aqua destillata q,s. ad 1.000 ml

pH = 6_S6

Nährboden VIIa [für CBS 519/67 und CBS 523/67

und Abkömmlinge dieser Stämme]

Glucose - 10 g

Totalhydrolysat von Casein (vitaminfrei) 10 g

Natriumchlorid 20 g

Natriumsulfat · 7H₂O 5 g

sec.Kalium-o-phosphat 1 g

Vitamine:

Nicotinsäure 1 mg

Spurenelemente;
analog Nährboden VI

aqua destillata q.s. ad 1.000 ml

pH ψ 6,6

Nährboden VIII [für CBS 519/67 und CBS 523/67

und Abkömmlinge dieser Stämme]

analog Nährboden VII + 2 % Agar

Nährboden IX [für CBS 519/67 und CBS 523/67

und Abkömmlinge dieser Stämme]

Glucose 5 g

Trypton 10 g

Hefeextrakt 10 g

Natriumchlorid 10 g

Magnesiumsulfat · 7H_o0 5 g

aqua destillata q.s. ad 1.000 ml

pH = 6,5

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Die Nährböden I bis ix können, wie bei den Nährböden VI und VIII beschrieben, durch einen Zusatz von Agar verfestigt und für die Züchtung von Streukulturen verwendet werden. Von der Streukulturplatte können die für den Gärprozess verwendbaren Stämme nach bekannten Methoden über die Schrägagarkultur und Glaskolben-FlUssigkultur in den Gärbehälter eingeschleust werden. Der Gärprozess verläuft submers. Die Gärlösung wird zweckmässig unter Bewegen belüftet. Die Gärtemperatur kann zwischen 10 und 55 C liegen, sie wird vorzugsweise zwischen 20 und 28 C gehalten. Die Pigmentbildung nimmt proportional dem Wachstum der Kultur zu. Nach etwa 1 bis 4 Tagen ist das Maximum der Pigmentbildung erreicht.

Natürliches Licht und Kunstlicht mit dem Spektralbereich des Tageslichtes können die Pigmentbildunß fördern.

Die Ausbeute an intrazellular gebildetem Zeaxanthin kann durch bestimmte Zusätze beträchtlich erhöht werden. Die jeweils erreichbare Ausbeutesteigerung kann der nachstehenden Tabelle, in der einige charakteristische Zusatzstoffe aufgeführt sind, entnommen werden.

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2138Q00

Steigerung der Ausbeute an Zeaxanthin in % bei Verwendung von Nährlösung II, III oder VII in Gegenwart von stimulierend wirkenden Stoffen:

Zusatzstoff

Zunahme der Zeaxanthinbildun^r in yS

Tween 80
[Polyoxyäthylenßorbitannionooleat J

'rween 60
[tolyojxyäthylensorbitanmonoütearat ]

'i'vxeen 80 + Soyaöl

'i"ween 80 + Kerosin

Twoen bu + Kerosin + iJoyaöl IsonicotinHäurehydrazid üorbit

i^Jalraitinsäui*emeth^ lester i'aiinitJnsäureraethylester + borbit Milchsäure

1-5	140-150
1	157
1+2	150
l.+l	l.?f.i
1+1+2	L3Ö
υ, oui	1*0
0/5	!33
0,5	:>S6
0,5+0,5	270
0,5	l40

Des weiteren wurde festgestellt, dass die Zeaxanthinbildung merklich gesteigert wird, wenn der Kohlenhydratanteil der Nährlösung, insbesondere der Glucosegehalt auf etwa 10 Gew.#, der Phosphatanteil, insbesondere der Gehalt an see. Kalium-ophosphat auf max. I Gew.J^ erhöht wird.

Ferner wurde gefunden, das speziell die Bildung von Zeaxanthin gefördert wird, wenn man den Sauerstoffpartialdruck bei der Fermentation erhöht und gleichzeitig die Gärtemperatur auf etwa 24°C hält.

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Nach beendeter Gärung wird die Zellmasse durch Zentrifugieren oder Filtrieren isoliert. Das intrazellulare Zexanthin kann den Zellen z.B. in der Weise entzogen werden, dass man die Zellmasse schonend - am besten durch Gefriertrocknung - trocknet, pulverisiert und mit einem Lösungsmittel z.B. mit einem niederen Alkanol wie Äethanol, mit einem Keton wie Aceton oder einem halogenierten Kohlenwasserstoff wie Chloroform digeriert, den Extrakt eindampft, den Rückstand z.B.in Essigsäureäthylester aufnimmt,die Lösung z.B. über Silieagel„ neutralem Aluminiumoxyd oder Magnesiums ilieat filtriert und das reine Zeaxanthin dureh Eltilerert mit beispielsweise Äethyläther isoliert,.

Die nach Abtrennen des Zeaxanthin^ zurückbleibende praktisch pigmentfreie Zellmasse kann wegen Ihres Gehaltes an essentiellen Aminosäuren z.B. an Methionin und Lysin und Vitaminen, insbesondere an Vitaminen der B-Gruppe, vornehmlich an Vitamin B₁₂* ^al^s ideale Protein- und Vitamin-quelle bei der Aufzucht von Geflügel verwendet werden.

Das von den Plavobacterien gebildete Pigment besteht zu 90-100 % aus Zeaxanthin, das sich, wie durch Vergleiche festgestellt wurde, als identisch mit aus Zea-Mais isoliertem Zeaxanthin erwiesen hat.

In gleicher Weise wie das auf fermentativem Wege erhaltene reine Zeaxanthin kann auch die pigmenthaltige Zellmasse zum Färben von Nahrungsmitteln - worunter im* weiteren Sinne auch lebendes Geflügel verstanden werden soll - sowie zum Färben von kosmetischen Präparaten verwendet werden. Die Zellmasse eignet sich insbesondere zum Färben von Läufen, Schnäbeln, Haut, Fett, Fleisch und Eidotter von Geflügel.

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Beispiel 1

Eine Flavobacter-Schrägagarkultur CBS 523/67 wird in einen 5'DO ml Erlenmeyerkolben, der 100 ml -einer wie vorstehend unter I angegebenen Nährlösung enthält, abgeschwemmt und unter Schiitteln 24 Stunden bei .22⁰C Debrütet. Die Viarrkultur wird als Inokulum für 8 Liter einer Nährlösung glelener Zusammensetzung verwendet ^ die nach dem Beimpfen 36 Stunden 'bsi 22°C unter Schütteln belüftet wird. Anschliessend wird die Gärlösung zentrifugiert. Die Zellmasse kann in getrocknetem Zustand unmittelbar für Färbezweeke verwendet werden.

Für die analytische Gehaltsbestimmung wird ein Teil in Aceton digeriert. Die Acetonlösoing wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das zurückbleibende Zeaxanthin kann durch präparative Dünnschichtchromatographie in reiner Form isoliert werden.

Für die präparative Gewinnung von reinem Zeaxanthin wird das feuchte Zellmaterial unter schonenen Bedingungen getrocknet und erschöpfend mit Essigsäureäthylester oder Aethanol oder mit Gemischen davon extrahiert. Der Extrakt wird konzentriert und an Silicagel adsorbiert. Das reine Zeaxanthin wird durch Eluleren mit Aether, Methylenchlorid oder Dichloräthylen gewonnen.

Unter den vorstehend beschriebenen Reaktionsbedingungen kann mit gleichem Erfolg der Flavobacter-Stamm CBS 519/67 in einer wie vorstehend unter III angegebenen Nährlösung kultiviert, das intrazellulare Zeaxanthin mit Chloroform extrahiert werden.

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Beispiel 2

Unter den im Beispiel 1 angegebenen Reaktionsbedingungen wird der Flavobacter-Starnm CBS 523/67 in einer wie vorstehend unter II, IV oder V angegebenen Nährlösung kultiviert. Das Zellmaterial wild abzentrifugiert und durch Behandeln mit einer 20 %-igen methanolisehen Kaliumhydroxydlösung im Verlauf einiger Stunden bei Raumtemperatur und unter Ausschluss von'Luftsauerstoff hydrolysiert. Das erhaltene Zellmaterial eignet sich insbesondere als Zusatz zu Geflügelfutter.

Beispiel 3

90 Liter einer wie vorstehend unter III, VII oder IX angegebenen Nährlösung werden mit einer 24 Stunden alten Flavobacter CBS 519/67-Suspension beimpft und 72 Stunden bei 22-28°C unter Rühren belüftet. Das gebildete Zellmaterial wird abzentrifugiert und unter vermindertem Druck bei etwa 40°C getrocknet. Das Material kann vorzugsweise als Zusatz zu Geflügelfutter verwendet werden.

Beispiel 4

k 8 Liter einer wie vorstehend unter IX angegebenen Nährlösung werden mit einer 24 Stunden alten Flavobacter CBS 519/67-Suspension beimpft und unter Rühren [300 Upm] bei 24⁰C '-mit 4 1 Luft pro Minute belüftet. Nach 48 Stunden enthält die (Erlösung 30-40 mg Zeaxanthin pro Liter. Der Gärprozess wird danach abgebrochen. Das Zeaxanthin-haltige Zellmaterial wird abzentrifugiert und unter vermindertem Druck bei 4o°C getrocknet. Die erhaltene Trockensubstanz kann, wie in.nachfolgenden Beispielen beschrieben, zur Pigmentierung von Geflügel und insbesondere zur Pigmentierung von Hühnereiern verwendet werden.

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Beispiel 5

Das nach Beispiel 4 von dem Flavobacter-Stamm CBS 519/67 erhaltene Zellmaterial wurde wie folgt für die Eignung zur Pigmentierung von Geflügel getestet:

3 Gruppen zu Je 20 Nichols-Küken wurden bis zum 56. Lebenstag mit einem Futter folgender Zusammensetzung ernährt:

Mais	35 %
Reis	12 %
Weizenschrot	12 %
Soya	34 %
Rindertalg	3 %
Futterhefe	1 %
Knochenmehl	2 %
Kalksplitter	. 0,4 %
Kochsalz	0,3 %
Vitamin A	12.000 IE/kg
Vitamin B₂	4 mg/kg
Vitamin D-	1.000 IE/kg
Vitamin ΈΓ	20 IE/kg

zusammen mit Trägermaterial 0,3 f>

Die Tiergruppe 1 erhielt das Grundfutter ohne Zusatz, während dem Grundfutter der Tiergruppe 2 2 Gew.% Zellmaterial, dem Grundfutter der Tiergruppe 3 4 Gew.% Zellmaterial beigemischt wurde.

Alle Tiere wurden am 56. Lebenstag getötet pnd küchenfertig zubereitet. Dabei wurde die Pigmentierung von Haut, Schnabel, Lauf und Körperfett jedes einzelnen Tieres gemessen.

Die Tiergruppe 1 zeigte praktisch keine Pigmentierung, die Tiergruppe 2 war schwach pigmentiert, die Tiergruppe 3 war ausgesprochen stark und signifikant stärker als die Tiergruppe 2 pigmentiert.

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Beispiel 6

Das nach. Beispiel 4 aus dem Flavobacter-Stamm CBS 519/67 erhaltene Zellmaterial wurde wie folgt für die Eignung zur Pigmentierung van Eiern geprüft:

4 Gruppen von je l8 hochwertigen Leghennen wurden 4 Wochen: lang mit dem im Beispiel 5 angegebenen Grundfutter ernährt. Die' Tiergruppe 1 erhielt das Grundfutter ohne Zusatz., während dem Grundfütter der Tiergruppe 2 0,5 Gew.% Zellmaterial, dem Grundfutter der Tiergruppe 5 1,0 Gew.^ Zellmaterial und dem Grundflitter der Tiergruppe 4 2,0 Gew.$ Zellmaterial beigemischt wurde. Vom 14. Versuchstag ab wurden von Jeder Tiergruppe 30 Eier gesammelt. Die Stärke der Pigmentierung des Eidotters wurde mit Hilfe der "Roche-Farbskala 1965" bestimmt. Es wurden folgende Pigmentierungsgrade gemessen:

Eier der Tiergruppe 1 2,9 Eier der Tiergruppe 2 7,1 Eier der Tiergruppe 3 9*8

Eier der Tiergruppe 4 11,2.

Bei einer Wiederholung des Pigmentierungsversuches unter den vorstehend beschriebenen Versuchsbedingungen mit einem gemäss Beispiel 4 von dem Flavobacter-Stamm CBS 523/67 gewonnenen Zellmaterial wurden folgende Pigmentierungsgrade gemessen:

Eier der Tiergruppe 1 2,9

Eier der Tiergruppe 2 6,4

Eier der Tiergruppe 3 9,1

Eier der Tiergruppe 4 10,7.

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Beispiel 7

Mit einem pigmentarraen Putter nachstehender Zusammensetzung

Ingredienzen

Milocorn

S oyab ohnenmehl

Heringsmehl

Dorschmehl

Molke

Gerstensehrot

Haferschrot

Weizenschrot

Kno chenf utt er mehl

Kohlensaurer Kalk

Salz

Vitamingemisch I

Vitamingemisch II*

Mineralstoffgemisch

Anteile in

70,00 10,00 3,00 2,00 1,60 4,00 2,00

1,75

2,00

3,025

0,25

0,10

0,125

0,15

Vitamingemisch I enthält pro kg
Putter:

Vitamingemisch II enthält pro kg Putter:

'Mineralstoff gemisch enthält pro kg Putter:

Mio. I.E. Vit. A 0,8 Mio. I.E. Vit. D. 26,7 g Aureomycin

10 40 40

g Eisen g Mangan g Zink 2,5 g Kupfer 2 - g Jod 0,2 g Kobalt

3 g Vitamin Bo

5 g Ca-Pantotnenat 10 g Nicotinsäure 50 g Cholinchlorid

1 g Vitamin B₁ 0,5 g Vitamin Bg

5 mg Vitamin B₁₂

4000 I.E. Vitamin E 1,5 g Vitamin K 0,5 g Polsäure ■

gefütterte Derco-Leghennen legen nach einiger Zeit Eier mit fast vollständig weissen, praktisch pigmentlosen Eidottern [Fächerwert der "Roche-Farbskala 1965" weniger als I]. Gibt man den Tieren in diesem Stadium zusätzlich ein aus einem Gemisch von Abkömmlingen zweier Plavobacter-Stämme [CBS 519/67 und CBS 523/67] bestehendes trockenes Zellmaterial mit einem Gehalt von 8 mg Zeaxanthin /kg Putter, so steigt der Pigmentgehalt der Eidotter etwa vom 14. Tag ab Beginn der Ver-

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fütterung, wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich, stark an.

Tiergruppe:

Carotinoidgehalt: des verabreichten Putters in mg/kg Dotterpigmentierung: Visueller Farbwert [Roche-Parbskala 1965] Mittelwerte

1
2

5
6

8 mg Zeaxanthin 8 mg Zeaxanthin 8 mg Zeaxanthin 8 mg Zeaxanthin 1 1 9 9 9 10

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus der Stämme CBS 519/67 oder CBS 523/67 der Gattung Flavobacter oder eine durch Selektion oder Mutation erhaltene Subkultur dieser Stämme in einer wässerigen Nährlösung, die eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-quelle sowie die bei Gärprozessen üblichen Zusätze enthält, gegebenenfalls unter Belichtung und/oder Zusatz von die Pigmentbildung und das Wachstum fördernden Stoffen,kultiviert und aus der erhaltenen Zellmasse gegebenenfalls das Zeaxanthin isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus der Stämme CBS 519/67 oder CBS 523/67 der Gattung Plavobacter oder eine durch Selektion oder Mutation erhaltene Subkultur dieser Stämme in einer bewegten Nährlösung submers, aerob, zu Beginn der Fermentation bis zur erfolgten Bildung einer ausreichenden Kulturmenge bei einer Temperatur zwischen 28 und 35°C, danach bei 20 bis 28⁰C, insbesondere bei 24°C kultiviert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von den Zusatzstoffen zur Gärlösung den Kohlenhydratanteil, insbesondere den Glucoseanteil bis auf 10 Gew.^, den Phosphatanteil, insbesondere den Anteil an see. Kalium-ophosphat auf max. 1 Gew.% erhöht.

\. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet, dass man der Nährlösung zur Förderung der Pigmentbildung Milchsäure zusetzt.

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5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man der Nährlösung zur Förderung der Pigmentbildung Palmitinsäuremethylester zusetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man der erhaltenen Zellmasse das gebildete Zeaxanthin durch Extraktion entzieht, durch Adsorption reinigt und durch Elution isoliert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Extralctionsmittel ein Gemisch von Aethanol/Essigsäureäthylester, als Adsorptionsmittel Silicagel und als Eluierungsmittel Aethyläther verwendet.

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