DE2154993A1 - Verfahren zur bestimmung der alkalischen phosphatase in koerperfluessigkeiten - Google Patents

Description

• Verfahren zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase in Körperflüssigkeiten.
• Die Aktivitit der alkalischen Phosphatase in Körperflüzsigkeiten, vornehmlich im Serum, ist für die Beurteilung von Knochen und Lebererkrankungen von Bedeutung.
• Für die Bestimmung dieses Ferments gibt es mehrere Verfahren, die sich durch die Verwendung verschiedener Substrate und verschiedener Pufferzusammensetzungen und Konzentrationen unterscheiden. Unter anderem haben Bessey, Lowry und Brock (J.Biol.Chem.164 (1946 321) ein Verfahren beschrieben, bei dem p-lMitrophenylphosphat als Substrat in einem Glaycin-NaOH-Puffer verwendet wird. Das durch die Phosphatasereaktion freigesetzte p-Nitrophenol wird nach gemessener Reaktionsdauer photometrisch bestimmt und stellt ein Maß für die in der Zeiteinheit umgesetzte Substratmenge dar.
• Unter Verwendung des gleichen Substrats haben Helger, Rick und Hausamen mit einem Diäthanolaminhydrochloridpuffer 1 molarer Konzentration einen etwa 3-fach höheren Substratumsatz erzielen konnen (DBP 1300710) Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß sich diese Aktivität nochmals steigern läßt, wenn man an Stelle des salz sauren Salzes des Diäthanolamins die Salze gewisser organischer Säuren mit Diathanolamin verwendet.
• Es wurde festgestellt, daß diese Aktivitätssteigerung bei einbasischen organischen Säuren im umgekehrten Verhältnis zur Molekülgröße steht, so daß nur das Salz der Ameisensaure eine Steigerung der Aktivität gegenüber dem Salz der Chlorwasserstoffsäure bewirkt.
• Bei den Dikarbonsäuren dagegen zeigen die Salze des Diäthanolamine mit der Glutarsäure eine Aktivitätssteigerung, die höher ist als die der homologen Oxalsäure, Malonsäure und Bernsteinsäure.
• Eine geringere Wirkung haben auch die @-Ketoglutarsäure und die Glutaminsäure, die als Salze des Diäthanolamins die Wirkung des Diathanolaminhydrochloridpuffers nur geringfügig übertreffen.
• Die nachstehende Tabelle gibt Auskunft über die prozentuale Steigerung der Phosphataseaktivität beim gleichen Serum, bei Verwendung der genannten organischen walze des Diäthanolamins im Vergleich mit dem Hydrochlorid.
• Ansatz: pH: 10,2, Substrat:p-Nitrophenylphosphat 1,5 x 10-² M Temperatur 250, Serum 0,2 ml, Puffersubstratlösung 2,0 ml Gesamtvolumen 2,2 ml

  Diäthanolamin- Diäthanolamin-
  Hydrochlorid Formiat
  Serum Nr. Extinktion E/min. Extinktion E/min. Steigerung
  1 A 0,100 0,100
  1. 0,119 0,019 0,122 0,022
  2. 0,138 0,019 0,144 0,022 13,5%
  3. 0,159 0,021 0,167 0,023
  2 A 0,100 0,100
  1. 0,121 0,021 0,123 0,023
  2. 0,142 0,021 0,146 0,023 9,5%
  3. 0,163 0,021 0,169 0,023
  3 A 0,100 0,100
  1. 0,113 0,013 0,118 0,018
  2. 0,126 0,013 0,137 0,019 46,0%
  3. 0,138 0,012 0,157 0,019
  4 A 0,100 0,100
  1. 0,119 0,019 0,123 0,023
  2. 0,137 0,018 0,116 0,023 23 %
  3. 0,155 0,018 0,168 0,022

  Diäthanolamin- Diäthanolamin-
  Hydrochlorid Glutarat
  Serum Nr. Extinktion E/min. Extinktion E/min. Steigerung
  5 A 0,100 0,100
  1. 0,113 0,013 0,114 0,014
  2. 0,126 0,013 0,128 0,014 10 %
  3. 0,139 0,013 0,143 0,015
  6 A 0,100 0,100
  1. 0,117 0,017 0,119 0,019
  2. 0,132 0,015 0,134 0,015 8,3 %
  3. 0,148 0,016 0,152 0,018
  7 A 0,100 0,100
  1. 0,137 0,031 0,143 0,043
  2. 0,175 0,038 0,187 0,044 16 %
  3. 0,213 0,038 0,231 0,044
  8 A 0,100 0,100
  1. 0,180 0,080 0,192 0,092
  2. 0,260 0,080 0,284 0,092 13,5 %
  3. 0,380 0,080 0,373 0,089

  Beispiel der Herstellung der Puffersubstratlösung.
• Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden 10,5 g Diäthanolamin in ca. 70 ml dest. H20 gelöst und durch Einbringen von fester Glutarsäure aus pH 9,8 - 10,0 gebracht.
• Die Glutarsäure wird unter Rühren so langsam zugegeben, daß sie sich sofort löst. Dann werden 10,2 mg MgCl2 x 6 H20 zugefügt und schließlich mit gesättigter wässriger Glutarsäurelösung auf pH 10,2 eingestellt, Mit dest.
• wasser wird jetzt auf 100,0 ml aufgefüllt. In 10 ml dieser Pufferlösung werden 39,5 mg p-Nitrophenylphosphat eingewogen, so daß eine Substratkonzentration von 1,5 x 10 2 M vorhanden ist.
• Die Herstellung der Puffersubstratlösung mit Ameisensaure erfolgt in anologer Weise, wobei es ohnehin einfacher ist, mitder flüssigen Ameisensäure ein pH von 10,2 einzustellen.
• Diese Substratpufferlösung muß unter Lichtausschluß im Kühlschrank aufbewahrt werden und ist selbst unter diesen Vorsichtemaßnahmen nur kurze Zeit heltbar. Es kommt sur spontanen Zersetzung des p-Nitrophenylphosphats. Daher ist es zweckmäßig, das Substrat in möglichst kleinen Portionen abzufüllen, womöglich in Portionen, die für einen Ansatz ausreichen (ca.8 mg).
• Bringt man diese Portionen in Tablettenform, so ist eine relativ große Menge eines Füllstoffs zuzusetzen um eine einigermaßen genaue Dosierung zu ermöglichen.
• Einfacher und genauer wäre es, eine Lösung des Substrats in solch kleinen Portionen in Fläschchen abzufüllen und zu lyophilysierenj so daß das trockene Substrat nur in der für einen Ansatz benotigten Pufferlösung (2 ml) aufgelöst werden kann. Diesem Vorgehen steht jedoch entgegen, daß sich p-Nitrophenylphosphat während der Gefriertrocknung in hohem Maße zersetzt und man beim Auflösen des Lyophilysats größtenteils schon p-Nitrophenol vorliegen hat. Dadurch kann die Fermntreaktion nicht mehr gemessen werden.
• Es wurde nun gefunden, daß die Gefriertrocknung einer p-Nitrophenylphosphatlösung ohne wesentliche Zersetzung der Substanz vor sich geht, wenn man der Lösung eine die Phosphatasereaktion nicht beinflußende Schutzsubstanz beifügt. Als besonders geeignet hat sich hierfür Glukose erwiesen.
• Beispiel der Herstellung eines Substratiyophilysats.
• 800 mg p-Nitrophenylphosphat und 4,0 g Glukose werden in 10 ml Wasser gelöst. In Portionen von 0,1 ml wird diese Lösung in keine Gefäße gefüllt und rasch zum Gefrieren gebracht. Nach dem Trocknen im Vakuum werden die Gefäße mit Stickstoff gefüllt und verschloßen Bei Aufbewahrung im Kühlschrank ist die so hergestellte Substratportion über ein Jahr haltbar. Zur Verwendung wird der Inhalt der Gefäße in 2,0 ml Pufferlösung gelöst und ist nach Vorwärmen auf die Reaktionstemperatur sofort für die Bestimmung verfügbar.
• Beispiel der DurchführunR einer Bestimmung Zu 2 ml der Substrat-Pufferlösung in einer Küvette bei 25°C werden 0,02 ml frisches Serum zugesetzt und gut gemischt. Nach etwa einer Minute wird die Extinktion bei 405 nm bestimmt und unter Verwendung einer Stoppuhr genau jede Minute die Extinktion 3 Minuten lang gemessen.
• Aus den Extinktionsdifferenzen pro Minute wird ein Mittelwert gebildet, der mit 5460 multipliziert, die Enzymkonzentration in m tr/ml Serum angibt.

Claims (5)

1. Patentansprüche

   Verfahren zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase in Körperflüssigkeiten in an sich bekannter Weise unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Substrat und photometrische Messung des durch die Fermentreaktion freigesetzten p-Ditrophencis, dadurch gekennzeichnet, daß an Stelle von Diäthanolaminhydrochlorid als Puffersubstanz ein organisches Salz des Diäthanolcmmins vornehmlich Diäthanolamin-Formiat oder Diäthanomamin-Glutarat verwendet wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung durch die Säure auf pH 10,0 - 10,5 vornehmlich 10,2 eingestellt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß die pufferkonzentration 0,5 - 1,5 molar ist.
4. 4. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 - 3 dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat in lyophilysiertem Zustand in Finzelportionen zur Auflösung in der Pufferlösung bereitgestellt wird.
5. 5. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-4 dadurch gekennzeichnet, daß die Substratlösung vor der Gefriertrocknung mit der 4 - 6-fachen Menge einer Schutz substanz vornehmlich Glukose versetzt wird.