DE202010017957U1

DE202010017957U1 - Nicht-invasive Sensorik von Bioprozessparametern

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Publication number: DE202010017957U1
Application number: DE202010017957U
Authority: DE
Original assignee: University of Maryland at Baltimore; University of Maryland at Baltimore County UMBC
Current assignee: University of Maryland at Baltimore; University of Maryland at Baltimore County UMBC
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2010-06-21
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2020-06-22
Also published as: WO2010148392A1; EP2443224B1; US8852921B2; US20120171760A1; EP2443224A1; EP2443224A4

Abstract

System zur Messung von zumindest einem Bioprozessanalyt oder Bioprozessparameter, umfassend: ein Kulturgefäß zur Aufnahme von Kulturmedium, wobei zumindest ein Teilbereich der Kulturgefäßwand eine Membranbarriere umfasst, die zumindest teilweise permeabel für zumindest ein vorbestimmten Analyt ist; und einen an die Membranbarriere angrenzenden Sensor, so dass die Membranbarriere zwischen dem Sensor und dem Kulturmedium positioniert ist wenn in dem Kulturgefäß Kulturmedium vorliegt, wobei der Sensor so positioniert ist, dass der zumindest eine vorbestimmte Analyt die Membranbarriere passieren muss um mit dem Sensor in Kontakt zu kommen, und wobei der Sensor angepasst ist um mit dem zumindest einen vorbestimmten Analyt chemisch zu interagieren oder auf das zumindest eine Bioprozessparameter physikalisch zu reagieren.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Sensorik von Bioprozessparametern, und insbesondere auf die nicht-invasive Sensorik von Bioprozessparamtern.
2. Hintergrund des damit im Zusammenhang stehenden Standes der Technik
Bioprozesse sind für ein breites Spektrum der Industrie von Bedeutung, wie beispielsweise für die pharmazeutische Industrie, die Lebensmittelindustrie, die Ökologie und Wasserbehandlung, genauso wie für Unternehmungen wie beispielsweise das humane Genomprojekt (Arroyo, M. et al., Biotechnol. Prog. 16: 368–371 (2000); Bakoyianis, V. und Koutinas, A. A., Biotechnol. Bioeng. 49: 197–203 (1996); Bylund, F. et al., Biotechnol. Bioeng. 69: 119–128 (2000); Handa-Corrigan, A. et al., J. Chem. Technol. Biotechnol. 71: 51–56 (1998); López-López, A. et al., Biotechnol. Bioeng. 63: 79–86 (1999); McIntyre, J. J. et al., Biotechnol. Bioeng. 62: 576–582 (1999); Pressman, J. G. et al., Biotechnol. Bioeng. 62: 681–692 (1999); Yang, J.-D. et al., Biotechnol. Bioeng. 69: 74–82 (2000)).
Die meisten Zellkulturen werden derart hergestellt, dass Zellen und Wachstumsmedium in einen sterilen Kunststoffbehälter in einem Inkubator gegeben werden. Es ist wünschenswert die Wachstumsparameter der Kultur zu überwachen, wie beispielsweise Sauerstoff, den pH-Wert, pCO₂, Glucose, Ionen, etc. Idealerweise sollte die Messung soweit als möglich nicht-invasiv und ohne Kontamination erfolgen. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass die nicht-invasiven Sensoren des damit in Zusammenhang stehenden Standes der Technik aus sterilisierbaren Stücken (Patches) bestehen, die in das Gefäß gegeben und optisch von außen überwacht werden. Diese sind unfangreich in der Literatur beschrieben (V. Vojinovíc et al., Sensors and Actuators B 114: 1083-1091 (2006); T. Scheper et al., Analytica Chimica Acta 400: 121–134 (1999); V. Vojinovíc et al.,
113: 1–15 (2007); S. Bambot et al., Biotechnology and Bioengineering 43: 1139–1145 (1994)).
Das Erfordernis der Einbringung der Sensorstücken (Sensorpatches) in das Gefäß wirft jedoch einige Probleme auf. Zunächst einmal ist erstens dieses System nicht leicht herstellbar, da die Sensoren vor der Sterilisation des Gefäßes eingebracht werden müssen. Dieses Vorgehen kann dazu führen, dass die Sensoren nach der Sterilisation erneut kalibriert werden müssen. In Fällen, bei denen die Sensoren in die vorsterilisierten Gefäße eingebracht werden sollen, ist es umständlich die Sensoren an den richtigen Platz zu bringen. Zweitens ist eine umfangreiche Validierung erforderlich, da die Sensorchemie in direktem Kontakt mit dem Zellkulturmedium steht. Des Weiteren gibt es bei Experimenten mit langer Verfahrensdauer keine einfachen Mittel für die Kontrolle der Sensorstückenkalibrierung (Sensorpatchkalibirierung) oder zum Austausch eines funktionsgestörten Sensors.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der Erfindung besteht darin, zumindest die oben genannten Probleme und/oder Nachteile zu lösen und zumindest die nachfolgend beschriebenen Vorteile zur Verfügung zu stellen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist deshalb, ein System und ein Verfahren für die Sensorik von Bioprozessparametern auf eine Art und Weise bereitzustellen, die weniger invasiv als die derzeitigen Techniken sind.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein System und ein Verfahren bereitzustellen, bei denen die Bioprozessparameter erkannt werden ohne Sensoren im Inneren des Kulturgefäßes platzieren zu müssen.
Um zumindest die vorgenannten Ziele ganz oder teilweise zu erreichen wird hiermit ein System für die Messung von zumindest einem Bioprozessparameter bereitgestellt, umfassend ein Kulturgefäß zur Aufnahme eines Kulturmediums, wobei zumindest ein Teil der Kulturgefäßwand eine Membranbarriere umfasst die zumindest teilweise permeabel für zumindest einen vorbestimmten Analyt ist, und einen Sensor, der an der Membranbarriere angrenzend befestigt ist, so dass zumindest ein vorbestimmter Analyt, welcher die Membranbarriere durchdringt, mit dem Sensor in Kontakt kommt, wobei der Sensor angepasst ist um mit dem zumindest einem vorbestimmten Analyt chemisch zu interagieren oder auf den zumindest einen Bioprozessparameter physikalisch zu reagieren.
Um zumindest die oben genannten Ziele ganz oder teilweise zu erreichen wird des Weiteren ein System für die Messung von zumindest einem Bioprozessparameter bereitgestellt, umfassend ein Kulturgefäß zur Aufnahme eines Kulturmediums, wobei das Kulturgefäß definiert ist durch mindestens eine Kulturgefäßwand, einen Ausschnitt in einem Bereich der Kulturgefäßwand, der so geformt ist, dass die Stärke der Kulturgefäßwand in dem ausgeschnittenen Bereich ausreichend dünn ist um zumindest teilweise permeabel für zumindest ein vorbestimmten Analyt zu sein, und einen Sensor, der in dem Ausschnitt positioniert ist, so dass zumindest ein vorbestimmter Analyt, der durch die Kulturgefäßwand in dem Ausschnittsbereich tritt, in Kontakt mit dem Sensor kommt.
Um zumindest die oben genannten Ziele ganz oder teilweise zu erreichen wird des Weiteren ein steckbares (plug-in) Sensorsystem für die Messung von zumindest einem Bioprozessparameter bereitgestellt, umfassend eine gasundurchlässige optisch transparente Schicht, einen auf der optisch transparenten Schicht positionierten Sensor, der angepasst ist um mit zumindest einem Analyt zu interagieren, und eine auf dem Sensor positionierte Hydrogelschicht, wobei die gasundurchlässige optisch transparente Schicht, der Sensor und die Hydrogelschicht gemeinsam eine Kassette definieren, die angepasst ist um selektiv in eine Öffnung in einer Kulturgefäßwand eingeführt und aus dieser herausgenommen zu werden.
Um zumindest die oben genannten Ziele ganz oder teilweise zu erreichen, wird ebenfalls ein System zur Messung von mindestens einem Bioprozessparameter bereitgestellt, umfassend ein Kulturgefäß zur Aufnahme eines Kulturmediums, wobei das Kulturgefäß definiert ist durch zumindest eine Kulturgefäßwand, zumindest zwei Ausschnitte in Bereichen der Kulturgefäßwand, die so geformt sind, dass die Dicke der Kulturgefäßwand in den ausgeschnittenen Bereichen ausreichend dünn ist um zumindest teilweise permeabel für zumindest einen vorbestimmten Analyt zu sein, und einen Sensor, der so in jedem Ausschnitt positioniert ist, dass zumindest ein vorbestimmter Analyt, das durch die Kulturgefäßwand in die Ausschnittsbereiche tritt, in Kontakt mit dem Sensor kommt, wobei der Sensor angepasst ist um auf den zumindest einen vorbestimmten Analyt zu reagieren.
Zusätzliche Vorteile, Ziele und Merkmale der Erfindung werden in der nachfolgenden Beschreibung ausgeführt und ergeben sich für den Fachmann bei der Sichtung des Folgenden oder lässt sich bei der Ausführung der Erfindung erlernen. Die Ziele und Vorteile der Erfindung lassen sich derart realisieren und erreichen, wie insbesondere in den beigefügten Ansprüchen ausgeführt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird im Detail mit Bezug auf die folgenden Zeichnungen beschrieben, in denen gleiche Bezugsziffern sich auf gleiche oder ähnliche Elemente beziehen, wobei:
1 eine schematische Darstellung eines Kulturgefäßes ist, das für die nicht-invasive Sensorik von Bioprozessparametern angepasst ist, entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2A eine schematische Darstellung eines nicht-invasiven Sensorsystems ist, welches die Positionierung einer Membranbarriere an der Kulturgefäßwand durch welche Analyte diffundieren können zeigt, entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung; Die Barriere kann einfach eine reduzierte Dicke des Gefäßmaterials sein, wodurch es diffusionsfähigen Spezien erlaubt ist rasch zu diffundieren und das Sensormolekül zu kontaktieren, oder sie kann von anderem Barrierenmaterial sein, das an dem Gefäß fixiert ist.
2B eine schematische Darstellung von einem nicht-invasiven Sensorsystem ist, das die Positionierung von Massentransportverstärkerelementen zum Verstärken des Stofftransports durch die Membranbarriere zeigt, entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2C eine schematische Darstellung von einem nicht-invasiven Sensorsystem ist, welches die Positionierung einer Membranbarriere an der Kulturgefäßwand zeigt, durch welche die Analyte diffundieren können, entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2D eine schematische Darstellung von einem nicht-invasiven Sensorsystem ist, welches die Positionierung einer Membranbarriere an der Kulturgefäßwand zeigt, durch welche die Analyten diffundieren können, entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2E eine schematische Darstellung von einem nicht-invasiven Sensorsystem ist, welches die Positionierung einer Membranbarriere an der Kulturgefäßwand zeigt, durch welche die Analyten diffundieren können, entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2F eine schematische Darstellung von einem nicht-invasiven Sensorsystem ist, welches die Positionierung einer Membranbarriere an der Kulturgefäßwand zeigt, durch welche die Analyten diffundieren können, entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2G die Ansicht von unten der Ausführungsform nach 2F ist;
2H eine schematische Darstellung von einem nicht-invasiven Sensorsystem ist, welches die Positionierung einer Membranbarriere an der Kulturgefäßwand zeigt, durch welche die Analyten diffundieren können, entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2I eine schematische Darstellung von einem nicht-invasiven Sensorsystem ist, welches die Positionierung einer konventionellen Clark-Elektrode in dem Ausschnitt der Gefäßwand zeigt, entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2J eine schematische Darstellung von einem nicht-invasiven Sensorsystem ist, welches die Positionierung einer „nackten” Clark-Elektrode in dem Ausschnitt der Gefäßwand zeigt, entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2K eine schematische Darstellung von einem nicht-invasiven Sensorsystem ist, welches die Positionierung einer pH-Elektrode in dem Ausschnitt der Gefäßwand zeigt, entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
3 eine schematische Darstellung von einem nicht-invasiven Sensorsystem ist, welches eine steckbare (plug-in) Sensorkassette nutzt, entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
4 eine grafische Darstellung ist, in der die Outputs von Gasphasenmessungen von einem Sensor für gelösten Sauerstoff, der im Inneren eines Kulturgefäßes positioniert ist, und einem Sensor für gelösten Sauerstoff, der außerhalb des Kulturgefäßes ohne die Verwendung einer Membranbarriere positioniert ist, verglichen werden;
5 eine graphische Darstellung ist, in der die Outputs von Gasphasenmessungen von einem Sensor für gelösten Sauerstoff, der im Inneren eines Kulturgefäßes positioniert ist, und einem Sensor für gelösten Sauerstoff, der außerhalb des Kulturgefäßes positioniert ist (externer Sensor) mit einer Membranbarriere die den externen Sensor vom Wachstumsmedium separiert, verglichen werden;
6 eine grafische Darstellung ist, in der die Outputs von Flüssigphasenmessungen von einem Sensor für gelösten Sauerstoff, der im Inneren einer Küvette positioniert ist, und einem Sensor für gelösten Sauerstoff, der außerhalb der Küvette positioniert ist (externer Sensor) mit einer Membranbarriere die den externen Sensor vom Wachstumsmedium separiert, verglichen werden;
7 eine schematische Darstellung einer Hohlfaser oder eines Perfusionsreaktors 1100 ist, der die nicht-invasiven Sensorsysteme 1000 der vorliegenden Erfindung nutzt;
8 eine schematische Darstellung einer Chromatographie-Säule 1200 ist, welche die nicht-invasiven Sensorsysteme 1000 der vorliegenden Erfindung nutzt;
9 eine schematische Darstellung einer Röhre 1300 ist, welche die nicht-invasiven Sensorsysteme 1000 der vorliegenden Erfindung umfasst;
10 eine schematische Darstellung einer Tasche 1400 ist, wie beispielsweise ein Mischbeutel, Puffertasche oder ein Haltebeutel, welche die nicht-invasiven Sensorsysteme 1000 der vorliegenden Erfindung nutzt;
11 eine schematische Darstellung einer Membrankassette 1500 ist, welche die nicht-invasiven Sensorsysteme 1000 der vorliegenden Erfindung nutzt; und
12 eine schematische Darstellung eines verfügbaren Rührkesselbioreaktors 1600 ist, welcher die nicht-invasiven Sensorsysteme 1000 der vorliegenden Erfindung nutzt.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
1 ist eine schematische Darstellung eines Kulturgefäßes, welches für die nicht-invasive Sensorik von Bioprozessparametern angepasst ist, entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Das in 1 dargestellte Kulturgefäß 10 enthält Zellen 20 und ein Zellkulturmedium 30.
Sensorpatche 40/50, vorzugsweise optisch-chemische Sensorpatche, und assoziierte Anregungsquellen 47/57 und optische Detektoren 45/55 sind außerhalb des Kulturgefäßes 10 angebracht. Membranbarrieren 60/70 stellen eine physische Barriere zwischen den Sensorpatchen 40/50 und dem Zellkulturmedium 30 her. So kann zum Beispiel die Barriere 60/70 aus demselben Material wir das Gefäß oder aus davon verschiedenen Materialien konstruiert sein. Die Membranbarriere ist angepasst um eine sterile Barriere bereitzustellen, die zumindest teilweise permeabel für die Analyten ist, die mit den Sensorpatchen 40/50 interagieren müssen um bestimmte Bioprozessparameter zu überwachen.
So können zum Beispiel die Sensorpatche 40/50 optische Sensorpatche sein, die für die entsprechende Messung des pH-Werts und gelösten Sauerstoff vorgesehen sind. Jedoch kann auch jeder andere Typ eines Sensorpatches verwendet werden, wie sie bekannterweise im Stand der Technik für die Überwachung eines Bioprozessparameters verwendet werden. Die Membranbarrieren 60/70 sind so gestaltet, dass die zu messenden Analyten ohne Weiteres in das Kulturgefäß 10 hinein und aus diesem heraus diffundieren können um mit den Sensorpatchen 40/50 zu interagieren. Optische Anregungsquellen 47/57 werden verwendet um die Sensorpatche 40/50 optisch anzuregen, welche dann eine Lichtemission und/oder Absorption generieren, die von der Menge der Analyten abhängig ist, welche die Membranbarriere 60/70 passieren und auf die Sensorpatche 40/50 treffen. Die Lichtemission und/oder Absorption wird durch die optischen Detektoren 45/55 gemessen.
Die verwendete optische Anregungsquelle 47/57 passt zu der Art der verwendeten Sensorpatche 40/50. Jegliche Kombination von aus dem Stand der Technik bekannten optischen Anregungsquellen und Sensorpatchen kann in Abhängigkeit von den zu messenden Bioprozessparametern verwendet werden. Beispiele von optischen Anregungsquellen, die verwendet werden können, schließen Licht emittierende Dioden und Laserdioden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform haben die Membranbarrieren 60 und 70 entsprechend eine Porengröße von zwischen 0,1 und 0,4 Mikrometer, und vorzugsweise etwa 0,2 Mikrometer bei hydrophoben Membranen. Abhängig von dem Medium, in dem der zu überwachende Analyt enthalten ist, können auch andere Membranen, wie beispielsweise hydrophobe oder oleophobe Membranen, verwendet werden. Die Membrantypen, die verwendet werden können, schließen Membrane für die Ultrafiltration, die Dialyse, oder nanoporöse Membranen ein, die für die Diffusionserleichterung konstruiert sind. Die Membrane sind vorzugsweise aus synthetischen oder natürlichen Polymeren, wie beispielsweise Poly(ether)sulfon oder Zellulosederivaten hergestellt. Im Fall von Sauerstoff, CO₂ und anderen gasförmigen Spezien kann auf Poren verzichtet werden und das Barrierenmaterial einfach aus demselben Material sein, aus dem auch das Gefäß 10 konstruiert ist, jedoch mit einer Stärke in einem Bereich von 0,1 bis 100 Mikrometer. Die Kulturgefäßwand 80 des in 2A dargestellten nicht-invasiven Sensorsystems 1000a nutzt solch ein Barrierematerial. Insbesondere ist die Membranbarriere 70 durch Formung eines Ausschnitts 75 in der Gefäßwand 80 derart hergestellt, dass diese Gefäßwand sehr dünn ist (vorzugsweise zwischen 0,1 und 100 Mikrometer) und als Membranbarriere 70 fungieren kann. Der Sensorpatch 50 wird dann in das Innere des in die Gefäßwand 80 geformten Ausschnitts 75 positioniert. Vorzugsweise ist über den Ausschnitt 75 eine relativ gasundurchlässige transparente Schicht 90, geeigneterweise aus Polycarbonat, Polymethylmethacrylat oder dem Gefäßmaterial mit einer 1 mm übersteigenden Dicke, geformt, so dass der Sensorpatch 40 zwischen der Membranbarriere 70 und der gasundurchlässigen transparenten Schicht 90 positioniert ist.
Die Sensorpatche 40/50 können geeigneterweise ein Sensor-„Cocktail” sein, wie beispielsweise Gas-sensitiven Farbstoff enthaltender PDMS-Gummi. Jedoch kann jedes aus dem Stand der Technik bekannte Sensorenmaterial für die Sensorpatche 40/50 verwendet werden. Des Weiteren, obgleich die bevorzugte Porengröße zur Messung von gelöstem Sauerstoff und des pH-Werts etwa 0,2 Mikrometer ist können auch andere Porengrößen in Abhängigkeit von den zu messenden Analyten verwendet werden. Obgleich das in 1 gezeigte System zwei Sensorpatche 40/50 und zwei Membranbarrieren 60/70 nutzt, ist darauf hinzuweisen, dass jegliche Zahl an Sensorpatchen und Membranbarrieren verwendet werden kann.
Die Sensorpatche 40/50 sind vorzugsweise an den Membranbarrieren 60/70 oder dem Ausschnitt 75 unter Verwendung eines geeigneten Mittels angebracht, einschließlich Haft- bzw. Klebemittel, mechanischer Mittel (Friktions-, Größenbeschränkungs- oder Gewindemittel), magnetischer Mittel oder ineinandergreifende Mittel (Velcro-artige). Allgemein werden vorzugsweise jegliche Mittel verwendet, die dafür vorgesehen sind den Stofftransferwiderstand zu minimieren und ein maximales Oberflächenkontaktgebiet zwischen den Sensorpatchen 40/50 und der Membranbarriere 60/70 zu schaffen.
Wie nachfolgend detaillierter beschrieben wird, kann die Wand 80 des Kulturgefäßes 10 so die Membranbarrieren 60/70 aufnehmend modifiziert sein, dass Löcher in das Gefäß gebohrt werden und die Membranbarrieren 60/70 über dem Loch durch Schweißen, Kleben oder anderweitig gesichert werden. In anderen Ausführungsformen können diese Löcher als Poren unter Verwendung eines Lasers oder Strahlung von einem nuklearen Zerfallprozess oder durch mechanische Vorrichtungen oder Formwerkzeuge während der Gefäßproduktion geschaffen werden. Eine geeignete Membranbarriere 60/70 kann dann für die Abdichtung der Löcher verwendet werden, so dass nur Analytemoleküle herausdiffundieren können. Das Material des Gefäßes 10 selbst kann in Abschnitten modifiziert sein um es wie oben beschrieben dünner zu machen, und um es permeabel zu machen, können Nanoporlöcher hineingebohrt und mit diffusionsfähigen Gelen aus Polyethylenglycol oder anderem geeigneten nicht-toxischen biokompatiblen Material versiegelt werden. In anderen Ausführungsformen kann die Barriere eine Dialysemembran mit einer ausgewählten Molekulargewichtsabgrenzung sein. Einige dieser können auf dem Gefäß vorliegen um Bereiche für die Analyten zwischen 100–1000 Molekulargewicht, zwischen 1000–10.000, zwischen 10.000–20.000 etc bis hin zu 0,2 Mikrometer auszuwählen.
2B zeigt ein nicht-invasives Sensorsystem 1000b ähnlich der Ausführungsform in 2A, mit der Ausnahme, dass Stofftransportverstärkungselemente 57 verwendet werden, um den Stofftransport durch die Membranbarriere 60/70 mittels Vibration und/oder Erwärmung des Sensorcocktails, der die Sensorpatche 40/50 ausmacht, zu erhöhen. Die Stofftransportverstärkungselemente 57 sind geeignete piezoelektrische Elemente oder Heizelemente und vorzugsweise in Nähe zu der Membranbarriere 60/70 positioniert, so dass der Abstand zwischen den Elementen 57 und der Innenwand 58 des Gefäßes vorzugsweise etwa derselbe ist, wie die Dicke der gasundurchlässigen transparenten Schicht 90. Die Stofftransportverstärkungselemente 57 können geeignete akustische (piezoelektrische), magnetische (Magnetostriktion) oder RF (lokales erwärmen und abkühlen um die Größen zu verändern) sein. Sie können entweder mechanisch an der Gefäßwand 80 angebracht oder in diese eingebettet sein.
In der Ausführungsform der 2A schwächt der in die Gefäßwand 80 geformte Ausschnitt 75 die Gefäßwand 80 in dem Bereich des Ausschnitts 75. 2C zeigt ein nicht-invasives Sensorsystem 1000c, das dem der Ausführungsform in 2A ähnlich ist, mit der Ausnahme, dass ein Verstärkungsgewebe 100 in die Gefäßwand 80 inkorporiert ist und sich über den Ausschnitt 75 erstreckt und vorzugsweise aus Edelstahl, Teflon oder Gefäßmaterial selbst hergestellt ist. In den beiden 2A und 2C wird die Barrierenfunktion durch eine dünne Schicht des Gefäßwandmaterials selbst bereitgestellt.
2D zeigt ein anderes nicht-invasives Sensorsystem 1000d das für Flüssigkulturen konstruiert ist, bei dem die Membranbarriere 60/70 durch die Schaffung einer Öffnung oder eines Lochs 110 in der Gefäßwand 80 und sich durch die gesamte Gefäßwand 80 hindurch erstreckend geformt wird. Die Membranbarriere 60/70 wird dann durch Abdeckung der Öffnung 110 mit einer nicht-porösen Membran 120 auf der Innenseite der Gefäßwand 80 geformt. Dann wird eine wasserundurchlässige Schicht 130, die aus geeigneten Polycarbonat, Polymethylmethacrylat oder unter Verwendung des Gefäßmaterials mit einer Dicke von mehr als 1 mm geformt werden kann, über die Öffnung 110 auf der Außenseite der Gefäßwand 80 so geformt, dass der Sensorpatch 40/50 zwischen der Membranbarriere 60/70 und der wasserundurchlässigen Schicht 130 positioniert ist. Die Schichten 130 und 90 dienen einem ähnlichen Zweck, welcher darin besteht, die Sensorpatche 40/50 drin zu halten und zu verhindern, dass atmosphärische Gase oder andere Moleküle in den Sensorpatch 40/50 von der Rückseite diffundieren und sich mit der Messung auf der sterilen Seite überlagern bzw. diese beeinträchtigen.
Für Flüssigkulturen können die Sensorpatche 40/50 ein geeignetes Hydrogel mit immobilisierten Ionen-sensitiven Farbstoff sein. Es kann jedoch jegliche Art von aus dem Stand der Technik bekanntem Sensormaterial für die Sensorpatche 40/50 verwendet werden. In der in 2D gezeigten Ausführungsform können die Sensorpatche 40/50 mittels Entfernung der Rückstütze 130 während eines Experiments ausgetauscht werden. Dies erlaubt eine Überwachung über lange Zeiträume und/oder den Austausch der Sensorpatche um die Kalibrierung zu überprüfen ohne die Sterilität des Gefäßes und dessen Inhalts zu beeinträchtigen. Wie in dem nicht-invasiven Sensorsystem 1000e in 2E gezeigt, kann ein Verstärkungsgewebe 100 in die Gefäßwand 80 inkorporiert werden, so dass es sich über die Öffnung 110 erstreckt um die Gefäßwand 80 in dem Bereich der Öffnung 110 zu festigen.
2F zeigt ein nicht-invasives Sensorsystem 1000f, das für Gasphasenmessungen konstruiert ist, bei dem viele kleine Ausschnitte 140 in einem Gittermuster anstatt des in den 2A und 2C gezeigten großen Ausschnitts 75 verwendet werden. Jeder kleine Ausschnitt 140 ist vorzugsweise mit einem Sensorpatch oder „Cocktail” 40/50 gefüllt. Die vielen kleinen Ausschnitte 140 ergeben eine stärkere Gefäßwand 80, ohne dass ein Verstärkungsgewebe verwendet werden muss. 2G zeigt in Ansicht von unten das Gittermuster der kleinen Ausschnitte 140.
Dieses Design kann ebenfalls in einem für Flüssigphasenmessungen konstruierten nicht-invasiven Sensorsystem 1000g genutzt werden, wie in 2H gezeigt. Diese Ausführungsform ist zu der in 2D gezeigten Ausführungsform ähnlich, mit den Ausnahmen, dass viele kleine Löcher oder Öffnungen 150 anstatt einer großen Öffnung und Sensorpatchen oder „Cocktails” 40/50 in jeder Öffnung 150 verwendet werden.
2I zeigt ein nicht-invasives Sensorsystem 1000h, welches eine konventionelle Clark-Elektrode 160 nutzt. Ähnlich zu den oben beschriebenen Ausführungsformen ist die Membranbarriere 60/70 gemacht durch die Formung eines Ausschnitts 75 in die Gefäßwand 80 in einer Art, dass die Gefäßwand sehr dünn wird (vorzugsweise zwischen 0,1 und 100 Mikrometer) und als Membranbarriere 60/70 fungieren kann. Die Clark-Elektrode 160 wird in dem Ausschnitt 75 positioniert.
2J zeigt ein nicht-invasives Sensorsystem 1000i ähnlich der Ausführungsform in 2I, mit der Ausnahme, dass eine „nackte” Clark-Elektrode 170 genutzt wird. In dieser Ausführungsform fungiert die Membranbarriere 60/70 ebenfalls als Membran für die Clark-Elektrode 170.
2K zeigt ein nicht-invasives Sensorsystem 1000j, das eine in dem Ausschnitt 75 positionierte pH-Elektrode 180 nutzt. Ein O-Ring 190 wird verwendet um den Ausschnitt 75 abzudichten.
3 zeigt ein nicht-invasives Sensorsystem 1000k, das eine steckbare (plug-in) Sensorkassette 200 nutzt. Die steckbare (plug-in) Sensorkassette 200 passt in eine Öffnung 210 in der Gefäßwand 80 und kann bei Bedarf hineingesteckt und herausgenommen werden. Die Biosensoren für die Messung von Glucose, Glutamin etc. sind vorzugsweise immobilisiert oder in einer Hydrogelschicht oder in einer Pufferlösung suspendiert.
In der Ausführungsform der 3 liegt der Sensorcocktail 40/50 als Biosensoren in einer Pufferlösung vor. Der Sensorcocktail 40/50 wird durch eine Hydrogelschicht 220 vor dem Auslaufen geschützt. Die steckbare (plug-in) Sensorkassette 200 wird in die Aufnahme 210 in der Reaktorgefäßwand 80 eingesetzt. Wenn die Hydrogelschicht 220 keine ausreichende Abdichtung bewirkt, kann optional eine semi-permeable Membran 230 oben auf der Hydrogelschicht 220 verwendet werden. Die semi-permeable Membran 230 erlaubt eine freie Diffusion von kleinen Molekülen (Glucose, Glutamine, etc.) um in Kontakt mit den Biosensoren in dem Sensorcocktail 40/50 zu kommen. Die Konzentration des Nährstoffs bestimmt sich nach dem Tempo, mit dem ein Signalplateau erreicht wird. Eine gasundurchlässige transparente Schicht 240 ist hinzugefügt und bildet eine Außenwand oder einen Deckel für die Kassette 200.
Die semi-permeable Membran 230 und die Hydrogelschicht 220 sind zusammen vorzugsweise zwischen 0,1 Mikrometer und 10 Mikrometer dick um minimalen Diffusionswiderstand zu bieten. Der Sensorcocktail 40/50 ist geeigneterweise etwa 1 mm dick, obgleich andere Dicken verwendet werden können.
4 ist eine grafische Darstellung, in der die Outputs von einem Sensor für gelösten Sauerstoff, der im Inneren eines Kulturgefäßes positioniert ist (interner Sensor), und einem Sensor für gelösten Sauerstoff, der außerhalb des Kulturgefäßes (externer Sensor) ohne der Verwendung einer Membranbarriere zwischen dem externen Sensor und dem Kulturmedium positioniert ist, verglichen werden. Die in der grafischen Darstellung von 4 gezeigten Messwerte betreffen nur Gasphasenmessungen.
Der externe Sensor reagiert auf die Abreicherung von Sauerstoff in dem Behälter, hat jedoch eine sehr lange Reaktionszeit aufgrund der Diffusionskinetik der Kulturgefäßwand. Wie die Messwerte des internen Sensors zeigen, sinkt der gelöste Sauerstoffgehalt von etwa 90% auf im Wesentlichen 0% innerhalb von etwa 14,3 Stunden. Das Signal vom externen Sensor fällt jedoch sehr langsam ab. Bei etwa 89 Stunden misst der interne Sensor einen Anstieg von gelöstem Sauerstoff von etwa 0% auf nahezu 100%. Das Signal von dem externen Sensor steigt hingegen nur sehr langsam an.
5 ist eine grafische Darstellung, in der die Outputs von Gasphasenmessungen von einem Sensor für gelösten Sauerstoff, der im Inneren eines Kulturgefäßes positioniert ist (interner Sensor), und einem Sensor für gelösten Sauerstoff, der außerhalb des Kulturgefäßes positioniert ist (externer Sensor) mit einer Membranbarriere, die Teil des Kulturgefäßes ist, und die den externen Sensor vom Wachstumsmedium separiert, verglichen werden. Wie sich aus 5 ergibt, liegen die Messungen von dem internen und externen Sensor dichter zusammen wenn eine Membranbarriere verwendet wird um den externen Sensor vom Kulturmedium abzugrenzen.
6 ist eine grafische Darstellung, in der die Outputs von Flüssigphasenmessungen von einem Sensor für gelösten Sauerstoff, der im Inneren eines Kulturgefäßes positioniert ist (interner Sensor), und einem Sensor für gelösten Sauerstoff, der außerhalb des Kulturgefäßes positioniert ist (externer Sensor) mit einer Membranbarriere die Teil des Kulturgefäßes ist und die den externen Sensor vom Wachstumsmedium separiert, verglichen werden. Wie sich aus 6 ergibt, haben die Flüssigphasenmessungen eine größere Abweichung als die Gasphasenmessungen in 5 aufgrund der zusätzlichen Stofftransferbeschränkungen der Membranbarriere und des dünnen Films stagnierender Flüssigkeit oberhalb der Membranbarriere. Dieser Effekt kann jedoch durch die Anpassung des Designs der materiellen Gestalt und durch Auswahl eines anderen Membranmaterials kompensiert werden.
Die 7–12 zeigen verschiedene Beispiele von Prozessausrüstungen, bei denen das oben beschriebene Sensorsystem 1000 als ein oder mehrere Sensorports verwendet werden können. 7 zeigt eine Hohlfaser oder einen Perfusionsreaktor 1100, welche die nicht-invasiven Sensorsysteme 1000 der vorliegenden Erfindung nutzen. 8 zeigt eine Chromatographie-Säule 1200, welche die nicht-invasiven Sensorsysteme 1000 der vorliegenden Erfindung nutzt. 9 zeigt eine Röhre 1300, welche die nicht-invasiven Sensorsysteme 1000 der vorliegenden Erfindung inkorporiert. 10 zeigt eine Tasche 1400, wie beispielsweise ein Mischbeutel, Puffertasche oder ein Haltebeutel, welche die nicht-invasiven Sensorsysteme 1000 der vorliegenden Erfindung nutzt. 11 zeigt eine Membrankassette 1500, welche die nicht-invasiven Sensorsysteme 1000 der vorliegenden Erfindung nutzt. 12 zeigt einen verfügbaren Rührkesselbioreaktor 1600, welcher die nicht-invasiven Sensorsysteme 1000 der vorliegenden Erfindung nutzt.
Das in den oben beschriebenen nicht-invasiven Sensorsystemen 1000 verwendete Kulturmedium 30 hängt von dem speziellen zu kultivierenden Zelltyp und/oder der Konzentration des zu messenden Analytes ab. Die Festlegung des geeigneten Kulturmediums liegt im üblichen Handlungsspektrum des Fachmanns. Die mit der vorliegenden Erfindung messbaren Kulturparameter schließen den pH-Wert, die Menge an gelösten Sauerstoff (DO), das Kohlendioxidniveau, die Glucosekonzentration, die Phosphatkonzentration, die Ammoniakkonzentration, die Lactatkonzentration, die Metallionenkonzentration, die Anionenkonzentrationen von beispielsweise Sulfat, Nitrat, Phosphat, Zusatznährstoffkonzentrationen einschließlich Aminosäuren und Spurenelementen, die Strömungsgeschwindigkeit, den Druck, die Leitfähigkeit, Konzentrationen von Proteinprodukten (einschließlich Antikörper), Proteinen und DNS, insbesondere bei Downstreamprozessen etc. ein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Die vorhergehend beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile sind lediglich beispielhaft und nicht im Sinne einer Beschränkung der vorliegenden Erfindung zu verstehen. Die vorliegende Lehre kann ohne Weiteres auf andere Arten von Apparaturen übertragen werden. Die Beschreibung der vorliegenden Erfindung dient dem Ziel der Veranschaulichung und nicht der Beschränkung des Schutzbereiches der Ansprüche. Viele Alternativen, Modifikationen und Abweichungen sind dem Fachmann ersichtlich. Verschiedenste Änderungen können erfolgen, ohne sich vom Geist und dem Rahmen der Erfindung zu entfernen, wie diese in den nachfolgenden Ansprüchen definiert ist.
Bezugszeichenliste
zu Fig. 12

301: H₂O Eingang
302: Einblasrohr
303: Innengerüst/Trennwände
304: Flügelrad
305: Öse
306: Gaseinlass
307: Säure/Base
308: Entschäumer
309: Septum
310: Achse
311: Auslass
312: Einfüllöffnung
313: Schutzrohr
314: H₂O Ausgang
315: Mantel
316: Abwasseranschluss
1000: Sensorsysteme
1600: Rührkesselbioreaktor

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

System zur Messung von zumindest einem Bioprozessanalyt oder Bioprozessparameter, umfassend: ein Kulturgefäß zur Aufnahme von Kulturmedium, wobei zumindest ein Teilbereich der Kulturgefäßwand eine Membranbarriere umfasst, die zumindest teilweise permeabel für zumindest ein vorbestimmten Analyt ist; und einen an die Membranbarriere angrenzenden Sensor, so dass die Membranbarriere zwischen dem Sensor und dem Kulturmedium positioniert ist wenn in dem Kulturgefäß Kulturmedium vorliegt, wobei der Sensor so positioniert ist, dass der zumindest eine vorbestimmte Analyt die Membranbarriere passieren muss um mit dem Sensor in Kontakt zu kommen, und wobei der Sensor angepasst ist um mit dem zumindest einen vorbestimmten Analyt chemisch zu interagieren oder auf das zumindest eine Bioprozessparameter physikalisch zu reagieren.
System nach Anspruch 1, wobei der Sensor ein optisch-chemisches Sensorpatch umfasst; und optional das System des Weiteren eine optische Anregungsquelle für die optische Anregung des optisch-chemischen Sensorpatch und einen optischen Detektor für die Detektion des von dem optisch-chemischen Sensorpatch ausgestrahlten Lichts umfasst.
System nach Anspruch 1, wobei die Membranbarriere eine hydrophobe, hydrophile, oder oleophobe Membran, eine Ultrafiltrationsmembran, eine Dialysemembran, oder eine nanoporöse Membran umfasst.
System nach Anspruch 1, wobei die Membranbarriere und der Sensor in einem in der Kulturgefäßwand geformten Ausschnitt positioniert sind.
System nach Anspruch 1, wobei die Membranbarriere einen Teil der Kulturgefäßwand umfasst, die ausreichend dünn ist um so zumindest teilweise permeabel für zumindest ein vorbestimmten Analyt zu sein, wobei vorzugsweise: a) der Teil der Kulturgefäßwand der die Membranbarriere umfasst eine Dicke zwischen etwa 0,1 Mikrometer und etwa 100 Mikrometer aufweist; oder b) der Teil der Kulturgefäßwand der die Membranbarriere umfasst einen Ausschnitt in der Kulturzellwand definiert, wobei der Sensor vorzugsweise im Ausschnitt positioniert ist, weiter vorzugsweise das System eine gasundurchlässige optisch transparente Schicht aufweist, die über eine Außenöffnung des Ausschnitts geformt ist um den Ausschnitt abzudichten, wobei weiter vorzugsweise die gasundurchlässige transparente Schicht Polycarbonat oder Polymethylmethacrylat umfasst.
System nach Anspruch 1, wobei der Sensor PDMS-Gummi umfasst, der Gas-sensitiven Farbstoff enthält.
System nach Anspruch 1, des Weiteren umfassend zumindest eine Stofftransportverstärkungsstruktur, die an der Kulturzellwand befestigt und positioniert ist um den Stofftransport durch die Membranbarriere zu verstärken, wobei vorzugsweise die zumindest eine Stofftransportverstärkungsstruktur ein piezoelektrisches Element, ein Magnetostriktionselement oder ein RF-Element umfasst.
System nach Anspruch 5b), des Weiteren umfassend ein in der Kulturgefäßwand eingebettetes und sich durch den Ausschnitt erstreckendes Verstärkungsgewebe, wobei das Verstärkungsgewebe vorzugsweise Edelstahl oder Teflon^® umfasst.
System nach Anspruch 1, wobei die Membranbarriere eine nicht-poröse Membran umfasst.
System zur Messung von zumindest einem Bioprozessparameter, umfassend: ein Kulturgefäß zur Aufnahme von Kulturmedium, wobei das Kulturgefäß durch mindestens eine Kulturgefäßwand definiert ist; ein derart in einen Teil der Kulturgefäßwand geformten Ausschnitt, dass die Dicke der Kulturgefäßwand in dem Ausschnittsbereich ausreichend dünn ist um zumindest teilweise permeabel für zumindest ein vorbestimmten Analyt zu sein; und ein so in den Ausschnitt positionierten Sensor, dass die Kulturgefäßwand zwischen dem Sensor und dem Kulturmedium positioniert ist wenn in dem Kulturgefäß Kulturmedium vorliegt, wobei der Sensor so positioniert ist, dass der zumindest eine vorbestimmte Analyt die Kulturgefäßwand in dem Ausschnittsbereich passieren muss um mit dem Sensor in Kontakt zu kommen, und wobei der Sensor angepasst ist um mit dem zumindest einen vorbestimmten Analyt chemisch zu interagieren oder auf das zumindest eine Bioprozessparameter physikalisch zu reagieren.
System nach Anspruch 10, wobei der Sensor eine konventionelle Clark-Elektrode oder eine nackte Clark-Elektrode oder eine pH-Elektrode umfasst.
Stecksensorsystem (Plug-in-Sensorsystem) zur Messung von zumindest einem Bioprozessparameter, umfassend: eine Kassette, die angepasst ist um selektiv in eine Öffnung in einer Wand eines Kulturgefäßes eingeführt und aus dieser herausgenommen zu werden, wobei die Kassette eine gasundurchlässige optisch transparente Schicht, einen auf der optisch transparenten Schicht positionierten und für die Interaktion mit einem zu überwachenden Analyt angepassten Sensor, und eine für den zu überwachenden Analyt zumindest teilweise permeable Membranbarriere, die mit dem Sensor in Kontakt und auf diesem positioniert ist, umfasst; wobei, wenn die Kassette in die Öffnung in der Wand des Kulturgefäßes eingeführt ist, die Membranbarriere so positioniert ist, dass ein zu überwachendes und in dem Kulturgefäß vorliegender Analyt die Membranbarriere passieren muss um mit den Sensor in Kontakt zu kommen.
System nach Anspruch 12, des Weiteren umfassend eine zwischen der Membranbarriere und dem Sensor positionierten Hydrogelschicht.
System nach Anspruch 1 als Bestandteil eines Perfusionreaktors oder einer Chromatographie-Säule oder eines Mischbeutels oder einer Puffertasche oder eines Haltebeutel oder einer Membrankassette oder eines Rührkesselbioreaktors oder einer Röhre.
System zur Messung von zumindest einem Bioprozessparameter, umfassend: ein Kulturgefäß zur Aufnahme von Kulturmedium, wobei das Kulturgefäß durch zumindest eine Kulturgefäßwand definiert ist; zumindest zwei derart in Teile der Kulturgefäßwand geformte separate Ausschnitte, dass die Dicke der Kulturgefäßwand in den Ausschnittsbereichen ausreichend dünn ist um zumindest teilweise permeabel für zumindest ein vorbestimmten Analyt zu sein; und ein so in jeden Ausschnitt positionierten Sensor, dass die Kulturgefäßwände in den Ausschnittsbereichen zwischen den Sensoren und dem Kulturmedium positioniert sind wenn in dem Kulturgefäß Kulturmedium vorliegt, wobei die Sensoren so positioniert sind, dass der zumindest eine vorbestimmte Analyt die Kulturgefäßwand in den Ausschnittsbereichen passieren muss um mit den Sensoren in Kontakt zu kommen, und wobei der Sensor angepasst ist um auf den zumindest einen vorbestimmten Analyt zu reagieren.