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DE202008017456U1 - Flüssig-Formulierung von G-CSF-Konjugaten - Google Patents

Flüssig-Formulierung von G-CSF-Konjugaten Download PDF

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DE202008017456U1
DE202008017456U1 DE202008017456U DE202008017456U DE202008017456U1 DE 202008017456 U1 DE202008017456 U1 DE 202008017456U1 DE 202008017456 U DE202008017456 U DE 202008017456U DE 202008017456 U DE202008017456 U DE 202008017456U DE 202008017456 U1 DE202008017456 U1 DE 202008017456U1
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Abstract

Eine wässrige Zubereitung umfassend ein Polymer-G-CSF-Konjugat, worin das Präparat einen pH im Bereich von 4,5 bis 5,5 und weiterhin ein Tensid umfasst.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft flüssige, pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend ein Polypeptid des Granulozyten Kolonie-stimulierenden Faktors, das mit einem Polymer konjugiert ist, wobei die Zusammensetzung einen pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 5,5 aufweist. Zudem umfasst die Zusammensetzung ein Tensid und optional dazu ein oder mehrere weitere, pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe. Des Weiteren ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung frei von Tartarsäure oder deren Salzen und Succinylsäure sowie deren Salzen als Puffersubstanzen und sie enthält keine Aminosäuren als Stabilisator. Die Zusammensetzung zeigt eine gute Lagerstabilität und ist besonders nützlich in der Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen und medizinischen Indikationen, wo Granulozyten Koloniestimulierender Faktor-Präparate als zweckmäßige Hilfsmittel erachtet werden.
  • Granulozyten Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF) ist ein hämatopoetischer Wachstumsfaktor, der die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen und die Aktivierung von reifen Neutrophilen stimuliert. G-CSF ist in der Lage, die Proliferation von Neutrophilen in vitro und in vivo zu fördern. Die menschliche Form von G-CSF wurde 1986 von Gruppen in Japan und in den USA kloniert (siehe z. B. Nagata et al. (1986) Nature 319: 415–418). Es existieren zwei Formen des natürlichen, menschlichen Glykoproteins, wovon eine 174 und die andere 177 Aminosäuren besitzt. Die häufigere und aktivere Form mit 174 Aminosäuren wurde in der Entwicklung von pharmazeutischen Produkten durch rekombinante DNA-Technologie verwendet.
  • Große Mengen von rekombinantem G-CSF wurden in genetisch veränderten Escherichia coli hergestellt und wurden bereits erfolgreich in der klinischen Behandlung von Krebspatienten eingesetzt, welche unter Chemotherapie-bedingter Neutropenie leiden. Das in Escherichia coli hergestellte G-CSF ist eine 175 Aminosäuren lange Polypeptidkette mit einem zusätzlichen Methionin am N-Terminus. Dieses Protein wurde hergestellt, indem G-CSF in E. coli exprimiert und anschließend bis zur Homogenität des Proteinendprodukts gereinigt wurde. Es handelt sich um ein hydrophobes Protein mit fünf Cysteinresten, wobei vier davon an Disulfid-Bindungen beteiligt sind. Der freie Cysteinrest ist hauptsächlich für die Ausbildung von höher molekulargewichtigen Aggregaten bei der Lagerung in Lösung verantwortlich. Aggregate der Proteine können ebenso durch oxidierte Formen des Proteins entstehen, die sich aus der Oxidation von internen Methioninresten in der Primärsequenz des Proteins ergeben. Von den vier Methioninresten befindet sich eines am N-Terminus, die anderen drei sind intern verteilt. Die oxidierte Form des Proteins, das ein oxidiertes Methionin an Position 122 besitzt, kann mit Hilfe gängiger Umkehrphasen-HPLC-Trennungsverfahren von den Formen mit oxidiertem Methionin an der Position 127 oder 138 sowie dem nativen Protein getrennt werden (die Positionen werden anhand von Methionyl-G-CSF mit 175 Aminosäuren ermittelt).
  • Das in E. coli-Expressionssystemen hergestellte rekombinante menschliche G-CSF wird Filgrastim (internationaler Freiname, INN) genannt. Die Struktur von Filgrastim unterscheidet sich nur geringfügig vom natürlichen Glykoprotein. Die andere Form des rekombinanten menschlichen G-CSF wird Lenograstim (INN) genannt und wird in Zellen aus den Ovarien Chinesischer Hamster (CHO) synthetisiert. Filgrastim und Lenograstim werden in Europa unter den Handelsbezeichnungen Neupogen® bzw. Granocyte vermarktet.
  • Allerdings besitzen die kommerziell erhältlichen Formen von rekombinantem menschlichen G-CSF eine kurzlebige pharmakologische Wirkung und müssen oft mehr als einmal am Tag während der Dauer des leukopenischen Zustands verabreicht werden. Ein Molekül mit längerer Zirkulations-Halbwertszeit würde die Anzahl von Verabreichungen herabsetzen, welche für die Linderung der Leukopenie notwendig ist, und nachfolgende Infektionen verhindern. Ein weiteres Problem mit derzeit erhältlichen rekombinanten humanen G-CSF-Produkten besteht in dem Auftreten von Dosis-abhängigen Knochenschmerzen. Da Knochenschmerzen bei Patienten erfahrungsgemäß eine erhebliche Nebenwirkung bei der Behandlung mit rekombinantem menschlichen G-CSF darstellen, wäre es wünschenswert, ein rekombinantes humanes G-CSF-Produkt bereitzustellen, das keine Knochenschmerzen hervorruft, entweder indem das Produkt inhärent diese Wirkung nicht besitzt oder indem es bereits in einer Dosis wirksam ist, die so gering ist, dass keine oder zumindest weniger Knochenschmerzen hervorgerufen werden. Somit besteht ein klares Bedürfnis nach einem verbesserten rekombinanten G-CSF-Molekül sowie pharmazeutischen Zubereitungen enthaltend das G-CSF-Molekül in Form einer stabilen einsatzbereiten Zubereitung.
  • Protein-veränderte Varianten des menschlichen G-CSF wurden berichtet, z. B. wurden G-CSF-Varianten beschrieben in WO 01/87925 , EP 0 456 200 A , US 6,166,183 , US 6,004,548 , US 5,580,755 , US 5,582, 823 , US 5,675,941 , US 5,416,195 , US 5,399,345 , WO 2005/055946 und WO 2006/074467 .
  • Eine Modifikation von menschlichem G-CSF und anderen Polypeptiden in der Form, dass mindestens eine im Vergleich zum nativen Polypeptid zusätzliche Kohlenhydratkette eingebracht wird, wurde ebenso beschrieben ( US 5,218,092 ). Weiterhin wurden Polymermodifikationen des nativen menschlichen G-CSF, einschließlich die Bindung an Poly(ethylenglykol)(PEG)-Gruppen, beschrieben und untersucht ( US 5,824,778 , US 5,824,784 , WO 96/11953 , WO 95/21629 und WO 94/20069 ).
  • Es ist allgemein anerkannt, dass die Stabilität des Proteins dadurch verbessert und die Immunantwort auf diese Proteine vermindert werden kann, wenn diese Proteine an polymere Moleküle gekoppelt sind. In WO 94/28024 wird offenbart, dass physiologisch aktive, mit PEG modifizierte Proteine verminderte Immunogenizität und Antigenizität aufweisen und beträchtlich länger im Blutstrom zirkulieren als unkonjugierte Proteine, d. h. sie besitzen eine verminderte Eliminierungsrate (clearance rate).
  • Die Bindung eines synthetischen Polymers an ein Peptidrückgrat, um die pharmakokinetischen Eigenschaften eines Glykoprotein-Therapeutikums zu verbessern, ist im Stand der Technik bekannt. Ein mustergültiges Polymer, das an Peptide konjugiert wird, ist PEG. Die Verwendung von PEG für die Derivatisierung von Peptid-Therapeutika erwies sich als geeignet, um die Immunogenizität der Peptide zu vermindern. Beispielsweise werden im US-Patent Nummer 4,179,337 nicht-immunogene Polypeptide, darunter Enzyme und Peptidhormone, die an PEG oder Poly(Propylenglykol)(PPG) gekoppelt sind, offenbart. Außer der verminderten Immunogenizität ist zudem die Eliminierungszeit bei der Zirkulation aufgrund der erhöhten Größe des PEG-Konjugats des betreffenden Polypeptids verlängert.
  • Pegfilgrastim (INN) ist ein kovalent gebundenes Konjugat von rekombinantem menschlichen Methionyl-G-CSF (Filgrastim) mit einem einzelnen 20 kDa Monomethoxy-PEG-Molekül. Das Monomethoxy-PEG-Molekül ist kovalent an den N-terminalen Methionylrest von Filgrastim gebunden. Pegfilgrastim wird in Europa unter dem Handelsnamen Neulasta® vermarktet.
  • Die Bindung von PEG und dessen Derivaten an Peptide erfolgt hauptsächlich über unspezifische Bindungen an einen Peptid-Aminosäurerest (siehe z. B. US 4,088,538 , US 4,496,689 , US 4,414,147 , US 4,055,635 und WO 87/00056 ). Eine andere Möglichkeit, PEG an Peptide zu binden, besteht in der nicht-spezifischen Oxidation von Glycosylresten in einem Glykopeptid (siehe z. B. WO 94/05332 ).
  • Bei diesen nicht-spezifischen Verfahren wird PEG in einer zufallsbedingten, nichtspezifischen Art und Weise an einen reaktiven Rest in einem Peptidrückgrat addiert. Die zufallsbedingte Addition von PEG-Molekülen hat ihre Nachteile. Darunter fallen das Fehlen von Homogenität des Endprodukts sowie die Möglichkeit, dass die biologische oder enzymatische Aktivität des Peptids vermindert ist. In den letzten Jahren wurden deshalb Anstrengungen unternommen, um Verfahren für die Bindung eines synthetischen Polymers oder einer anderen Markierung an ein Peptid mit höherer Ortspezifität zu entwickeln, und es hat sich gezeigt, dass spezifisch konjugierte, homogene Peptid-Therapeutika in vitro mit Hilfe von Enzymen hergestellt werden können. Diese Enzym-basierten Konjugationen haben den Vorteil der Regioselektivität und Stereoselektivität. Die zwei hauptsächlichen Klassen von Enzymen, die für die Synthese von konjugierten Peptiden verwendet werden, sind Glycosyltransferasen (z. B. Sialyltransferasen, Oligosaccharyltransferasen, N-Acetylglucosaminyltransferasen) und Glycosidasen. Diese Enzyme können für die spezifische Bindung von Zuckern verwendet werden, welche anschließend modifiziert werden können, um einen therapeutischen Rest zu umfassen. Andererseits können Glycosyltransferasen und modifizierte Glycosidasen dazu verwendet werden, um modifizierte Zucker direkt auf ein Peptidrückgrat zu übertragen (siehe z. B US 6,399,336 und US 2003/0040037 , US 2004/0132640 , US 2004/0137557 , US 2004/0126838 und US 2004/0142856 ). Verfahren, die sowohl chemische als auch enzymatische Syntheseelemente vereinen, sind ebenfalls bekannt (siehe z. B. US 2004/137557 ).
  • Die verschiedenen Verfahren für die Konjugation von Polypeptiden wie G-CSF mit polymeren Resten wie PEG sind wohl bekannt und wurden im Stand der Technik ausgiebig beschrieben. Zum Beispiel ist die Zubereitung von glykoPEGyliertem G-CSF in WO 2005/055946 beschrieben. WO 2006/074467 ist eine weitere Patentanmeldung, die auf die Zubereitung von Konjugaten zwischen G-CSF und PEG-Resten gerichtet ist. In diesem Verfahren sind die Konjugate über eine ganze, zwischengeschaltete Glycosylgruppe verbunden, welche kovalent sowohl an das G-CSF-Polypeptid als auch an die modifizierende Gruppe gebunden ist. Die Konjugate werden aus glycosylierten und unglycosylierten G-CSF-Polypeptiden durch die Aktivität von Glycosyltransferasen gebildet. Die Glycosyltransferase ligiert einen modifizierten Zuckerrest entweder an eine Aminosäure oder an einen Glycosylrest des Polypeptids. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird ausdrücklich auf die Offenbarungen in WO 2005/055946 und WO 2006/074467 Bezug genommen.
  • Neben PEG wurden aber auch andere polymere Reste als geeignete Konjugate mit G-CSF sowie mit anderen therapeutischen Proteinen beschrieben. WO 02/09766 offenbart, unter anderem, biokompatible Protein-Polymer-Verbindungen, die durch die Konjugation eines biologisch aktiven Proteins mit einem biokompatiblen Polymerderivat hergestellt werden. Bei den verwendeten biokompatiblen Polymeren handelt es sich um hochreaktive und verzweigte Polymere, und die resultierenden Konjugate enthalten einen langen Linker zwischen dem Polymerderivat und dem Protein. Beispiele für biokompatible Polymere gemäß WO 02/09766 sind PEG, PPG, Polyoxyethylen (POE), Polytrimethylenglykol, Polymilchsäure und deren Derivate, Polyacrylsäure und deren Derivate, Polyaminosäuren, Polyurethan, Polyphosphazen, Poly(L-Lysin), Polyalkylenoxid (PAO), wasserlösliche Polymere wie etwa Polysaccharide, Dextran, und nicht-immunogene Polymere wie etwa Polyvinylalkohol und Polyacrylamid.
  • WO 94/01483 offenbart biokompatible Polymerkonjugate, die durch kovalente Bindung eines biologisch inaktiven Polymers oder Polymerderivats an ein pharmazeutisch reines, synthetisches hydrophiles Polymer über spezifische Arten von chemischen Bindungen gebildet werden. Als natürlich vorkommende Polymere und Derivate davon werden Polysaccharide wie etwa Hyluronsäure, Proteoglycane wie etwa Chondroitinsulfate A, B und C, Chitin, Heparin, Heparinsulfate, Dextrane wie etwa Cyclodextran, Hydroxyethylcellulose, Celluloseether und Stärke, Lipide wie etwa Triglyceride und Phospholipide beschrieben.
  • WO 96/11953 beschreibt N-terminale chemisch modifizierte Proteinverbindungen und Verfahren zu deren Herstellung. Insbesondere werden G-CSF-Verbindungen beschrieben, die durch Kopplung eines wasserlöslichen Polymers an den N-Terminus von G-CSF gebildet werden. Beispiele für wasserlösliche Polymere sind in WO 96/11953 aufgelistet, dabei handelt es sich um Copolymere von Ethylenglykol und Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder zufallsbedingte Copolymere), Poly(n-vinylpyrrolidon), Polyethylenglykol, PPG-Homopolymere, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymere oder polyoxyethylierte Polyole.
  • WO 97/30148 beschreibt Polypeptidkonjugate mit reduzierter Allergenizität umfassend ein polymeres Trägermolekül mit zwei oder mehreren daran gekoppelten Polypeptidmolekülen. Diese Konjugate werden hergestellt, indem ein polymeres Trägermolekül aktiviert wird, die zwei oder mehrere Polypeptidmoleküle mit dem aktivierten polymeren Trägermolekül in Reaktion gebracht werden und die verbleibenden aktiven Gruppen des Konjugats blockiert werden. WO 97/30148 enthält eine Liste mit verschiedenen polymeren Trägermolekülen, darunter natürliche oder synthetische Homopolymere wie etwa Polyole, Polyamine, Polycarboxylsäuren und Heteropolymere umfassend mindestens zwei unterschiedliche Bindegruppen. Es werden Beispiele beschrieben umfassend sternenförmige PEG-Moleküle, verzweigte PEG-Moleküle, Polyvinylalkohole, Polycarboxylate, Polyvinylpyrrolidone und Poly-D,L-Aminosäuren. Die Konjugate in WO 97/30148 umfassen auch jene Konjugate mit Dextranen wie etwa Carboxymethyldextran, Cellulosen wie etwa Hydroxy ethylcellulose oder Hydroxypropylcellulose, Hydrolysaten von Chitosan, Stärken wie etwa Hydroxyethylstärke oder Hydroxypropylstärke, Glykogen, Agarose, Guargummi, Inulin, Pullulan, Xanthangummi, Carrageenin, Pectin, Alginsäure, etc.
  • WO 03/074087 betrifft ein Verfahren zur Kopplung von Proteinen an Stärkeabgeleiteten modifizierten Polysacchariden. Bei der Bindung zwischen dem Protein und dem Polysaccharid (Hydroxyalkylstärke) handelt es sich um eine kovalente Bindung, die zwischen der terminalen Aldehydgruppe oder einer funktionellen Gruppe, entstanden durch chemische Modifikation der genannten terminalen Aldehydgruppe des Hydroxyalkylstärke-Moleküls, und einer funktionellen Gruppe des Proteins erfolgt. Als reaktive Gruppen des Proteins werden Aminogruppen, Thiolgruppen und Carboxylgruppen offenbart.
  • WO 2005/014050 beschreibt Präparate enthaltend Konjugate von Hydroxyalkylstärke (HAS) und einem G-CSF-Protein, worin mindestens eine funktionelle Gruppe des Polymers oder des Derivats davon mit mindestens einer funktionellen Gruppe des Proteins reagiert, wobei eine kovalente Bindung ausgebildet wird. Weitere Dokumente des Standes der Technik, die die HASylierung, vorzugsweise HESylierung, von Polypeptiden betreffen, sind WO 2005/014655 , WO 2005/092390 , WO 2007/031266 , WO 2005/092928 und WO 2005/092391 .
  • Obwohl einige Ansätze im Stand der Technik beschrieben werden, welche die Modifizierung von therapeutischen Polypeptiden wie etwa G-CSF mit einem polymeren Rest zum Gegenstand haben, um auf diese Weise die Eliminierungszeit zu verlängern und die Immunogenizität zu vermindern, wurde nur wenig Augenmerk auf die Entwicklung von vorteilhaften Formulierungen solcher Polymer-G-CSF-Konjugate gerichtet.
  • Das oben genannte Produkt Neulasta® ist eine flüssige Zusammensetzung für die subkutane Injektion. Die Zubereitung umfasst Pegfilgrastim, Natriumacetat, Sorbitol, Polysorbat 20 und Wasser für die Injektion und besitzt einen pH-Wert von 4,0 (siehe http://www.neulasta.com, und ROTE LISTE 2007). Die Produkte Neulasta® und Neupogen® werden beide von Amgen vertrieben und sind im Hinblick auf Puffersubstanz, Hilfsstoffe und pH-Wert der Lösung nahezu identisch: Neupogen® umfasst Filgrastim (anstatt Pegfilgrastim), Natriumacetat, Sorbitol, Polysorbat 80 und Wasser für die Injektion und hat ebenso einen pH-Wert von 4,0 (siehe http://neupogen.com, und ROTE LISTE 2007).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend ein Polymer-G-CSF-Konjugat, wobei bei der Entwicklung der Zusammensetzung auf die Charakteristika von Polymer-G-CSF-Konjugaten besonders geachtet wurde. Im Hinblick auf Formulierungen enthaltend unkonjugiertes G-CSF wurden im Stand der Technik bereits etliche Ansätze beschrieben, allerdings ist nur wenig über brauchbare Zubereitungen von Polymer-G-CSF-Konjugaten bekannt.
  • Obgleich einige pharmazeutische Zusammensetzungen, die für nicht-konjugiertes G-CSF entwickelt wurden, in der Patentliteratur so dargestellt werden, als umfassten sie auch Präparate, in denen nicht-konjugiertes G-CSF durch PEG-G-CSF-Konjugate ersetzt wird, ist es dennoch offensichtlich, dass die Zusammensetzungen ausschließlich auf G-CSF zugeschnitten und darauf getestet worden sind.
  • Zum Beispiel beschreibt WO 2005/042024 stabile pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend G-CSF, worin die Zusammensetzung einen pH-Wert oberhalb von 4,0 aufweist und weiterhin eine Säure umfasst, aber frei von Tensiden ist. Obgleich die in WO 2005/042024 beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung eindeutig für nicht-konjugiertes G-CSF entwickelt worden ist, wird in der Beschreibung darauf verwiesen, dass sie auch G-CSF umfasse, das chemisch mit PEG oder Ähnlichem modifiziert ist und dieselbe oder verbesserte biologische Aktivität aufweist.
  • WO 2005/039620 ist ein weiteres Beispiel, das ebenfalls auf eine stabile wässrige G-CSF-haltige Zusammensetzung gerichtet ist. Die Zusammensetzung enthält als Puffersubstanzen Succinylsäure oder Tartarsäure oder Salze davon und weist vorzugsweise einen pH im Bereich von 4,0 bis 5,8 auf. Gemäß der Beschreibung kann das G-CSF-Protein auch synthetisch modifiziert sein, z. B. durch enzymatische Glycosylierung oder chemische PEGylierung.
  • EP 1 260 230 A1 offenbart stabile Proteinformulierungen enthalten Tryptophan als Stabilisator. Die Auflistung von Proteinen umfasst G-CSF sowie auch G-CSF, das chemisch mit PEG oder Ähnlichem modifiziert ist. Die G-CSF-Formulierungen besitzen bevorzugt einen pH von 5–7, besonders bevorzugt von 6,0–6,7.
  • Ein weiteres Beispiel ist EP 1 336 410 A1 , welche injizierbare, pharmazeutische Formulierungen enthaltend ein physiologisch aktives Protein als einen aktiven Bestandteil und mindestens einen Zucker als ein Linderungsmittel mit einem pH von 6,5–7,4 beschreibt. Auch in diesem Fall wird erwähnt, dass chemisch mit PEG oder Ähnlichem modifiziertes G-CSF ebenso inbegriffen ist.
  • EP 1 329 224 A1 beschreibt eine lösliche G-CSF-Formulierung, die als Stabilisator mindestens eine Aminosäure oder ein Salz davon, vorzugsweise Methionin, enthält. Die löslichen G-CSF-Formulierungen besitzen vorzugsweise einen pH von 5–7, besonders bevorzugt von 5,5–6,8. Hier wird ebenfalls erwähnt, dass chemisch mit PEG oder Ähnlichem modifiziertes G-CSF inbegriffen ist.
  • Allerdings stellt keine der offenbarten Formulierungen des Standes der Technik eine spezifische Formulierung für Polymer-G-CSF-Konjugate dar. Vielmehr wurden die in der Patentliteratur beschriebenen Lösungen lediglich für unkonjugiertes G-CSF entwickelt und getestet.
  • Das Problem der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung für Polymer-G-CSF-Konjugate, die für derartige Konjugate geeignet ist und bei erhöhter Temperatur, d. h. über Kühlschrank-Temperatur, die normalerweise zwischen 2 und 8°C liegt, stabil ist. Weiterhin ist es Ziel der Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die zu keiner Stufe ihrer Herstellung eine Rekonstitution erfordert, und die bei der Verabreichung an einen Patienten so wenig wie möglich Irritationen verursacht.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden diese Probleme gelöst, indem eine pharmazeutische wässrige Zusammensetzung umfassend ein Polymer-G-CSF-Konjugat bereitgestellt wird, wobei die Zusammensetzung einen pH im Bereich von 4,5 bis 5,5 aufweist. Das erfindungsgemäße wässrige Präparat umfasst ein Tensid und optional dazu ein oder mehrere zusätzliche pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung frei von Aminosäuren oder Derivaten oder Salzen davon als Stabilisatoren und frei von Tartarsäure oder Salzen davon sowie frei von Succinylsäure oder Salzen davon als Puffersubstanzen.
  • Es wurde überraschenderweise gefunden, dass eine Formulierung eines Polymer-G-CSF-Konjugats in einer Zusammensetzung mit einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 5,5, vorzugsweise von 5,0, die saure Hydrolyse der Konjugatbindung verhindert. Dieser pH-Bereich verbessert die Stabilität der Lösung bei Temperaturen über Kühlschrank-Temperatur (2–8°C), insbesondere bei Raumtemperatur (d. h. unter 25°C) und sogar bei höheren Temperaturen, z. B. 40°C. Dies bedeutet, dass die Zusammensetzung ohne Kühlung über einen verlängerten Zeitraum ohne signifikanten Verlust von Aktivität und ohne signifikante Degradation gelagert werden kann.
  • Unabhängig von der Lagerstabilität sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weiterhin vorteilhaft gegenüber einer vergleichbaren Zusammensetzung mit einem pH von 4,0, da eine weniger saure Zusammensetzung weniger Irritation bei der Verabreichung an einen Patienten hervorruft.
  • Falls nicht anders angegeben, dienen die dargelegten Definitionen dazu, die Bedeutung und den Umfang der verschiedenen Begriffe, die hier verwendet werden, um die Erfindung zu beschreiben, zu veranschaulichen und zu definieren.
  • Der Begriff ”Polymer-G-CSF-Konjugat” bezieht sich auf ein Konjugat zwischen einem G-CSF-Polypeptid und einem Polymer, wobei das Konjugat durch eine kovalente Verbindung zwischen einer funktionellen Gruppe des Polymers und einer funktionellen Gruppe des Polypeptids ausgebildet wird. Die Konjugate können einen oder mehrere polymere Reste umfassen.
  • Der Begriff ”G-CSF” (oder G-CSF-Polypeptid oder G-CSF-Protein oder G-CSF-Peptid) bezieht sich auf ein Protein mit der biologischen in vivo-Aktivität eines natürlich im Menschen vorkommenden G-CSF, d. h. ein Protein, das in der Lage ist die Differenzierung und Proliferation von hämatopoetischen Vorläuferzellen zu stimulieren. Das G-CSF kann unverkennbar als G-CSF anhand des Assays, das in Stute, N., et al. "Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in children" (1992) Blood 79 (11), Seiten 2849-2854 beschrieben ist, identifiziert werden.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform besitzt G-CSF eine Aminosäuresequenz gemäß den folgenden SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2, wobei SEQ ID NO:1 die Wildtyp-Aminosäuresequenz des menschlichen Methionyl-G-CSF darstellt, wie es in E. coli hergestellt wird, und SEQ ID NO:2 die Aminosäuresequenz des menschlichen G-CSF, wie es in Säugetierzellen, z. B. CHO-Zellen, hergestellt wird, darstellt. SEQ ID NO:1 ist die Variante mit 175 Aminosäuren, wobei die erste Aminosäure ein Methionin ist und ein Threoninrest an Thr 134 vorliegt. SEQ ID NO:2 ist eine Variante mit 174 Aminosäuren, die mit Ausnahme des fehlenden Startmethionins dieselbe Sequenz besitzt wie die 175 Aminosäuren lange Variante. Somit beginnt die Sequenz mit einem T und an Position 133 liegt ein Threoninrest vor. SEQ ID NO: 1:
    Figure 00130001
    SEQ ID NO: 2:
    Figure 00130002
  • Der Fachmann erkennt ohne weiteres, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hier dargestellten Sequenzen begrenzt ist, sondern auch Varianten von G-CSF umfassen kann. Solche Varianten sind im Stand der Technik wohl bekannt. Sie können Deletionen, Substitutionen oder Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren in den oben dargestellten Aminosäuresequenzen enthalten, während die biologische Aktivität des natürlich vorkommenden G-CSF beibehalten wird. Beispiele für G-CSF-Varianten, die aber keinesfalls dazu gedacht sind, die vorliegende Erfindung zu beschränken, sind beschrieben in WO 01/87925 , EP 0 456 200 A , US 6,166,183 , US 6,004,548 , US 5,580,755 , US 5,582,823 , US 5,675,941 , US 5,416,195 , US 5,399,345 , WO 2005/055946 und WO 2006/074467 .
  • Das G-CSF-Polypeptid kann glycosyliert oder nicht-glycosyliert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das G-CSF-Polypeptid ein in E. coli hergestelltes rekombinantes menschliches G-CSF, d. h. mit der Aminosäuresequenz, wie sie oben in SEQ ID NO:1 oder einer Variante davon dargestellt ist.
  • Das Polymer kann ein beliebiges Polymer sein, das kovalent an das G-CSF-Polypeptid gebunden sein kann, und das zu einem therapeutisch verwendbaren Polymer-G-CSF-Konjugat führt, wenn es kovalent an ein G-CSF-Polypeptid gebunden ist. Einige geeignete Polymere wurden bereits weiter oben im einführenden Teil erwähnt und umfassen Poly(alkylenglykole) wie etwa PEG und PPG, Hydroxyalkylstärke wie etwa Hydroxyethylstärke (HES) und die in WO 02/09766 , WO 96/11953 und WO 97/30148 beschriebenen Polymere im Zusammenhang mit polymeren Polypeptid-Konjugaten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer PEG.
  • Alle Konzentrationsangaben in mg/ml, die im Folgenden in Verbindung mit dem Konjugat verwendet werden, beziehen sich nur auf den G-CSF-Rest. Definitionsgemäß wird der PEG-Rest nicht bei der Massenkonzentration berücksichtigt.
  • Während Filgrastim ein Molekulargewicht von etwa 18–19 kDa besitzt, ist Pegfilgrastim aufgrund des Monomethoxy-PEG-Rests weitaus größer und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 39 kD. Die Polymer-G-CSF-Konjugate der vorliegenden Erfindung können ein Molekulargewicht im Bereich von 20 bis 60 kD, vorzugsweise im Bereich von 35 bis 45 kD besitzen.
  • Geeignete PEGs sind im Stand der Technik beschrieben, z. B. in WO 2005/055946 , WO 2006/074467 und WO 01/87329 . Der PEG-Rest kann linear oder verzweigt sein mit Größen von 5 bis 40 kD. Vorzugsweise besitzt der PEG-Rest ein Molekulargewicht von 15 bis 25 kD, besonders bevorzugt von ungefähr 20 kD.
  • Verfahren für die Herstellung von Polymer-G-CSF-Konjugaten wurden ebenso im Stand der Technik beschrieben. Die oben genannten Dokumente, die im Zusammenhang mit der Herstellung von Konjugaten zwischen Polypeptiden und polymeren Resten stehen, sind hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
  • Andere für die vorliegende Erfindung geeignete Polymer-G-CSF-Konjugate sind ausführlich in WO 96/11953 , EP 822 199 A , WO 01/51510 , WO 2006/0128460 , EP 921 131 A und EP 744 409 beschrieben. Es wird hiermit explizit auf die Offenbarung dieser Dokumente Bezug genommen, d. h. auf die Konjugate sowie die Verfahren zu deren Herstellung wie sie darin beschrieben sind.
  • Der Fachmann erkennt ohne weiteres, dass die vorliegende Erfindung nicht auf Konjugate beschränkt ist, worin ein Polymer wie etwa PEG oder HES direkt an einen Aminosäurerest des Proteins verknüpft ist, sondern auch Konjugate erfasst, worin ein polymerer Anteil und das G-CSF-Polypeptid über einen Linker miteinander verbunden sind. Zum Beispiel stellen verbindende Glycosylgruppen, die zwischen dem Polypeptid und dem PEG-Rest angeordnet sind, geeignete Linker innerhalb der Konjugate der vorliegenden Erfindung dar. WO 2006/074467 beschreibt derartige Polymer-G-CSF-Konjugate, in denen das G-CSF-Polypeptid und der polymere Rest über einen Glycosyl-Linker oder über einen nicht-Glycosyl-Linker, z. B. ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, substituiertes oder unsubstituiertes Heteroalkyl, verbunden sind. Die Offenbarung in WO 2006/074467 ist hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
  • Der Ausdruck ”PEG-G-CSF” (PEGyliertes G-CSF) bezieht sich auf ein G-CSF-Protein, das kovalent mit einem oder mehreren Polyethylenglykolresten wie nachfolgend beschrieben verbunden ist. Die PEG-Gruppe(n) und das G-CSF-Protein können entweder direkt oder über einen Linker, z. B. einen Glycosyl-Linker, verbunden sein.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Polymer-G-CSF-Peptidkonjugat anhand des in WO 2006/074467 beschriebenen Verfahrens hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer-G-CSF-Peptid ein PEG-G-CSF-Konjugat mit einer verbindenden Glycosylgruppe, die zwischen dem PEG-modifizierenden Rest und dem G-CSF-Polypeptid angeordnet ist. Ein derartiges Konjugat wird auch als ”glykoPEGyliertes” G-CSF bezeichnet.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform wird das ”glykoPEGylierte” G-CSF-Molekül der Erfindung durch die Enzym-vermittelte Ausbildung eines Konjugats zwischen einem glycosylierten oder nicht-glycosylierten G-CSF-Peptid und einem enzymatisch übertragbaren Saccharylrest enthaltend einen Poly(ethylenglykol)-Rest in seiner Struktur hergestellt. Der PEG-Rest ist an den Saccharylrest direkt (d. h. durch eine einzelne Gruppe, die aus der Reaktion von zwei reaktiven Gruppen entstanden ist) oder durch eine Linker-Komponente, z. B. substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, substituiertes oder unsubstituiertes Heteroalkyl, etc., gebunden. Die verbindende Glycosylgruppe kann ein mit PEG derivatisierter Sialinsäurerest sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Glycosyl-Linker an das G-CSF-Protein über O-Glycosylierung, vorzugsweise über O-Glycosylierung an einem Threoninrest des G-CSF-Proteins, gebunden.
  • Vorzugsweise umfasst der Glycosyl-Linker ein Mono-, Di- oder Oligosaccharid, besonders bevorzugt umfasst der Glycosyl-Linker Sialinsäure und N-Acetylgalactosamin.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Polymer-G-CSF-Peptidkonjugat die Komponente:
    Figure 00170001
    wobei R1 einen Rest umfassend einen geradkettigen oder verzweigten Poly(ethylenglykol)-Rest darstellt; und L ein Linker ist, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus einer Bindung, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl und substituiertes oder unsubstituiertes Heteroalkyl; wobei das Peptid mit einem Glycosylrest glycosyliert ist und wobei der Rest kovalent an den Glycosylrest gebunden ist. Der Glycosylrest ist vorzugsweise N-Acetylgalactosamin. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das G-CSF-Peptid an einem Threoninrest glycosyliert, vorzugsweise an dem Threoninrest an Position 134 (ausgehend von Methionyl-G-CSF-Polypeptid, d. h. mit einem N-terminalen Methionin und insgesamt 175 Aminosäuren). In einer bevorzugten Ausführungsform stellt R1 einen geradkettigen Poly(ethylenglykol)-Rest und L ein Heteroalkyl dar.
  • Das oben beschriebene G-CSF-Peptidkonjugat kann anhand eines Verfahrens hergestellt werden, umfassend (a) Inkontaktbringen eines G-CSF-Peptidsubstrats mit einem PEG-Sialinsäure-Donor mit der Formel:
    Figure 00180001
    wobei R1 und L wie weiter oben definiert sind, und einem Enzym, das in der Lage ist, den PEG-Sialinsäurerest vom Donor auf den Glycosylrest des G-CSF-Peptidsubstrats zu übertragen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym eine Sialyltransferase, z. B. ST6GalNAcI, wie in WO 2005/055946 beschrieben.
  • Das G-CSF-Peptidkonjugat wie oben beschrieben kann anhand eines Verfahrens hergestellt werden, umfassend (a) Inkontaktbringen eines unglycosylierten G-CSF-Peptidsubstrats mit einem Glycosyl-Donor und einem Enzym, das in der Lage ist, einen Glycosylrest von einem Donor auf das G-CSF-Peptidsubstrat zu übertragen, und (b) Inkontaktbringen des glycosylierten G-CSF-Peptids mit einem PEG-Sialinsäure-Donor mit der Formel:
    Figure 00180002
    wobei R1 und L wie weiter oben definiert sind und einem Enzym, das in der Lage ist, den PEG-Sialinsäurerest von einem Donor auf den Glycosylrest des G-CSF-Peptidsubstrats zu übertragen, wobei (a) und (b) entweder aufeinander folgende oder simultane Reaktionen sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Glycosyl-Donor UDP-N-Acetylgalactosamin. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym in (a) eine N-Acetylgalactosaminyltransferase, und das Enzym in (b) ist eine Sialyltransferase, z. B. GalNAcT2 in (a) und ST6GalNAcI in (b).
  • Das G-CSF kann durch chemische Syntheseverfahren hergestellt werden oder kann humaner Herkunft sein oder von einer anderen Säugetier-Quelle stammen und kann ebenso durch die Aufreinigung aus natürlich vorkommenden Quellen wie humane Plazenta, humanes Blut oder humaner Urin gewonnen werden. Darüber hinaus sind eine Menge von Epithel-Karzinomen, akute myeloische Leukämiezellen und verschiedene Tumor-Zelllinien in der Lage, diesen Faktor zu exprimieren.
  • Vorzugsweise wird das G-CSF rekombinant hergestellt. Dies umfasst die Expression von exogenen DNA-Sequenzen, die durch Klonierung von genomischer oder cDNA oder durch DNA-Synthese erhalten werden, von einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt. Geeignete prokaryotische Wirte umfassen verschiedene Bakterien wie etwa E. coli, welches vorzugsweise verwendet wird. Geeignete eukaryotische Wirte umfassen Hefen wie etwa S. cerevisiae und Säugetierzellen wie etwa Zellen aus den Ovarien Chinesischer Hamster (CHO) und Affen-Zellen.
  • Die rekombinante Herstellung eines Proteins wie G-CSF ist im Stand der Technik bekannt. Im Allgemeinen umfasst die Herstellung die Transfektion von Wirtszellen mit einem geeigneten Expressionsvektor, die Kultivierung der Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Herstellung des Proteins sowie die Reinigung des Proteins aus den Wirtszellen ermöglichen. Detaillierte Informationen sind zu finden unter z. B. Souza, L. M. et al. 1986, Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects an normal and leukemic myeloid cells, Science (1986) 232: 61–65; Nagata, S. et al. 1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor, Nature (1986) 319: 415–418; Komatsu, Y. et al. 1987, Cloning of granulocyte colony-stimulating factor cDNA from human macrophages and its expression in Escherichia coli, Jpn. J. Cancer Res. (1987) 78: 1179–1181.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das G-CSF die Aminosäuresequenz des humanen reifen G-CSF (siehe z. B. Nagata, S. et al. (1986), siehe oben), und kann weiterhin ein Methionin am Aminoterminus enthalten, was schließlich zu einem Protein mit 175 Aminosäuren führt (siehe SEQ ID NO: 1 oben). Des Weiteren kann das G-CSF anstatt eines Methionins einen Serin- oder Threonin-Rest enthalten.
  • Das Protein wird anschließend anhand von konventionellen ”downstream processing”-Protokollen aufgereinigt. Geeignete Verfahren für die Aufreinigung von G-CSF sind im Stand der Technik beschrieben, z. B. in WO 87/01132 , EP 0 719 860 A , EP 1 458 757 A , EP 1 527 188 A , WO 03/051922 , WO 01/04154 und WO 2006/097944 .
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Polymer-G-CSF-Peptidkonjugat wie hier in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Dieses Konjugat ist dadurch charakterisiert, dass das G-CSF-Polypeptid und die PEG-Komponente über eine N-Acetylgalactosaminyl (GalNAc)-Gruppe und eine Sialinsäure (SA)-Gruppe verknüpft sind. Das Konjugat hat die Struktur G-CSF-GalNAc-SA-PEG wie folgt:
    Figure 00210001
    wobei R1 und L wie weiter oben definiert sind und AA einen Aminosäurerest von G-CSF darstellt.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform stellt R1 einen linearen PEG-Rest dar, der über eine Sialinsäuregruppe und eine GalNAc-Gruppe an ein G-CSF-Polypeptid verknüpft ist wie im Folgenden gezeigt:
    Figure 00210002
    wobei L wie weiter oben definiert ist; AA einen Aminosäurerest von G-CSF darstellt; und f ein Vielfaches ist ausgewählt aus 1 bis 2500.
  • In einigen Ausführungsformen hat das Polymer-G-CSF-Konjugat die folgende Formel:
    Figure 00220001
    wobei AA das Threonin 133 (Threonin 134, falls ein N-terminales Methionin vorhanden ist) des G-CSF darstellt; und f ein Vielfaches ist ausgewählt zwischen 1 und 2500.
  • Die pharmazeutische Zubereitung der vorliegenden Erfindung ist eine Flüssigzusammensetzung, z. B. eine wässrige Lösung. Zum Zwecke der Injektion ist die Verwendung von reinem Wasser als Lösungsmittel bevorzugt. Allerdings können ebenso andere Lösungsmittel verwendet werden, die für pharmazeutische Präparationen geeignet und üblich sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um isotonische Lösungen.
  • Des Weiteren ist an keiner Stelle im Herstellungsprozess der Flüssigformulierung der Erfindung eine Rekonstitution erforderlich. Bei der Lösung handelt es sich um eine gebrauchsfertige Formulierung.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung besitzt einen pH im Bereich von 4,5 bis 5,5. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der pH-Wert zwischen 4,7 und 5,3, besonders bevorzugt zwischen 4,8 und 5,2 und am meisten bevorzugt zwischen 4,9 und 5,1.
  • Ist eine Einstellung des pH-Werts erforderlich, um den gewünschten Bereich zu erreichen, wird der pH-Wert mit Hilfe von geeigneten Lösungen eingestellt; mit einer sauren Lösung für den Fall, dass eine Absenkung des pH-Werts angebracht ist und mit einer alkalischen Lösung, falls eine Erhöhung des pH-Werts erforderlich ist. Geeignete saure Lösungen sind z. B. Salzsäure, Phosphorsäure, Zitronensäure und Natrium- oder Kaliumhydrogenphosphat. Geeignete alkalische Lösungen sind Alkali- und Erdalkalihydroxide, Alkalicarbonate, Alkaliacetate, Alkalicitrate und Dialkalihydrogenphosphate, z. B. Natriumhydroxid, Natriumacetat, Natriumcarbonat, Natriumcitrat, Dinatrium- oder Dikaliumhydrogenphosphat oder Ammoniak.
  • Bevorzugt wird der pH der Lösung mit Hilfe von Natriumhydroxid eingestellt. Dies hat zur Folge, dass die erfindungsgemäße Formulierung Natriumionen enthalten kann. Natrium ist generell in einer Konzentration von weniger als 10 mmol/l, üblicherweise weniger als 6 mmol/l vorhanden.
  • Die pharmazeutische Präparation der Erfindung umfasst ein oder mehrere Tenside. Beispielhafte Tenside umfassen: nicht-ionische Tenside, z. B. Sorbitanfettsäureester wie etwa Sorbitanmonocaprylat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonopalmitat; Glycerinfettsäureester wie etwa Glycerinmonocaprylat, Glycerinmonomyristat, Glycerinmonostearat; Polyglycerinfettsäureester wie etwa Decaglycerylmonostearat, Decaglyceryldistearat, Decaglycerylmonolinoleat; Polyoxyethylensorbitanfettsäureester wie etwa Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Polyoxyethylensorbitanmonooleat, Polyoxyethylensorbitanmonostearat, Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat, Polyoxyethylensorbitantrioleat, Polyoxyethylensorbitantristearat; Polyoxyethylensorbitolfettsäureester wie etwa Polyoxyethylensorbitoltetrastearat, Polyoxyethylensorbitoltetraoleat; Polyoxyethylenglycerinfettsäureester wie etwa Polyoxyethylenglycerylmonostearat; Polyethylenglykolfettsäureester wie etwa Polyethylenglykoldistearat; Polyoxyethylenalkylether wie etwa Polyoxyethylenlaurylether; Polyoxyethylenpolyoxypropylenalkylether wie etwa Polyoxyethylenpolyoxypropylenglykolether, Polyoxyethylenpolyoxypropylenpropylether, Polyoxyethylenpolyoxypropylencetylether; Polyoxyethylenalkylphenylether wie etwa Polyoxyethylennonylphenylether; Polyoxyethylengehärtetes Castoröl (Polyoxyethylen-hydrogeniertes Castoröl); Polyoxyethylen-Bienenwachsderivate wie etwa Polyoxyethylensorbitol-Bienenwachs; Derivate von Polyoxyethylenlanolin wie etwa Polyoxyethylenlanolin; Polyoxyethylenfettsäureamide wie etwa Polyoxyethylenstearinsäureamid mit einem HLB-Wert von 6–18; anionische Tenside, z. B. Alkylsulfate mit C10-18-Alkylgruppen wie etwa Natriumcetylsulfat, Natriumlaurylsulfat, Natriumoleylsulfat; Polyoxyethylenalkylethersulfate mit einem durchschnittlichen Mol-Verhältnis von 2–4 MOL EO und mit einer C10-18-Alkylgruppe wie etwa Natriumpolyoxyethylenlaurylsulfat; Salze von Alkylsulfosuccinylsäureestern mit einer C8-18-Alkylgruppe wie etwa Natriumlaurylsulfosuccinat; und natürliche Tenside, z. B. Lecithin; Glycerophospholipide; Sphingophospholipide wie etwa Sphingomyelin; Saccharosefettsäureester von Fettsäuren mit C12-18. Eines oder mehrere dieser Tenside können in Kombination zu den Formulierungen der vorliegenden Erfindung hinzugefügt werden.
  • Bevorzugte Tenside sind Polyoxyethylensorbitanalkylester, besonders bevorzugt Polysorbat 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81, 85, am meisten bevorzugt Polysorbat 20 und 80.
  • Die Konzentration des Detergens in der Formulierung ist typischerweise im Bereich zwischen 0,0005% (w/v) und 0,05% (w/v), bevorzugt von 0,001% (w/v) bis 0,01% (w/v), besonders bevorzugt von 0,002% (w/v) bis 0,006% (w/v) und am meisten bevorzugt von 0,003% (w/v) bis 0,004% (w/v), bezogen auf das Gesamtvolumen der Formulierungslösung.
  • Meist enthalten die erfindungsgemäßen Formulierungen das Tensid Polysorbat 20 oder 80 in einer Konzentration von 0,003% (w/v), 0,0033% (w/v) oder 0,004% (w/v). Bevorzugt wird Polysorbat 20 verwendet.
  • Die erfindungsgemäße Formulierung umfasst eine physiologisch annehmbare Puffersubstanz. Geeignete Puffer sind im Fachgebiet der Lösungsformulierungen bekannt, z. B. Phosphatpuffer (vorzugsweise Natriummonohydrogenphosphat-Natriumdihydrogenphosphat-System), Citratpuffer, Lactatpuffer, Acetatpuffer, Carbonatpuffer, BisTris, MES, und Glycin-HCl. Die Verwendung eines Acetatpuffers, d. h. Essigsäure oder ein Salz davon, z. B. Alkali- oder Ammoniumsalze, ist bevorzugt.
  • In der Formulierung liegt die Puffersubstanz meist in einer Konzentration von 1 bis 100 mmol/l, bevorzugt 2 bis 50 mmol/l und am meisten bevorzugt 5 bis 20 mmol/l vor. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration des Puffers 10 mmol/l, am meisten bevorzugt liegt Acetat zu 10 mmol/l vor.
  • Die Konzentration des Puffers, z. B. Acetat, ist so ausgewählt, dass die pH-stabilisierende Wirkung sowie eine ausreichende Pufferkapazität gewährleistet ist. Allerdings wird gleichzeitig die Ionenkonzentration und damit zusammenhängend die Leitfähigkeit der Lösung so niedrig wie möglich gehalten, um die Bildung von Aggregaten zu vermeiden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung beträgt die Leitfähigkeit der finalen Lösung weniger als 1,0 mS/cm, bevorzugt weniger als 0,8 mS/cm und besonders bevorzugt weniger als 0,5 mS/cm.
  • Weiterhin ist die Zubereitung bevorzugt frei von Tartarsäure und Succinylsäure und Salzen davon. Des Weiteren ist die Lösung bevorzugt frei von HEPES, TES und Tricin.
  • Die Formulierung der Erfindung ist bevorzugt auch frei von Sulfationen.
  • Die Formulierung der Erfindung ist außerdem vorzugsweise frei von Konservierungsstoffen, womit Substanzen gemeint sind, welche für gewöhnlich als Konservierungsstoffe eingesetzt werden, um die Lagerstabilität zu erhöhen und bei Standardkonzentrationen einen bakterizide Wirkung aufweisen. Insbesondere enthält die Formulierung keine Konservierungsstoffe wie Chlorethan, Benzylalkohol, p-Chloro-m-cresol, und Dialkyldicarbonat, und Benzalkoniumchlorid.
  • In einer Ausführung der Erfindung umfasst die Formulierung weiterhin ein Polyol, vorzugsweise einen Zuckeralkohol, am meisten bevorzugt sind Mannitol oder Sorbitol als ein Tonizitätsmittel. Insbesondere wird Sorbitol bevorzugt verwendet. Der Anteil des Zuckes wie etwa Sorbitol oder Mannitol beträgt für gewöhnlich bis zu 10,0% (w/v), bezogen auf das Gesamtvolumen der Lösung. Vorzugsweise ist die Konzentration bis zu 8,0% (w/v), besonders bevorzugt bis zu 6,0% (w/v) und am meisten bevorzugt 5,0% (w/v). In einer bevorzugten Ausführungsform liegt Sorbitol in einer Konzentration von 5,0% (w/v) vor.
  • Weiterhin enthält die erfindungsgemäße Lösungsformulierung bevorzugt keine Stabilisatoren ausgewählt aus Aminosäuren sowie Derivate und Salze davon, polymere Stabilisatoren und Protein-Stabilisatoren.
  • Die das Polymer-G-CSF-Konjugat enthaltenden Formulierungen der vorliegenden Erfindung werden normalerweise auf parenteralem Wege verabreicht wie etwa Injektion (subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Injektion), können aber auch perkutan, mukosal, nasal oder pulmonal, aber ebenso oral verabreicht werden.
  • Das Polymer-G-CSF-Konjugat liegt in der Formulierung meist in einer Konzentration von 1,0 bis 30,0 mg/ml, bevorzugt von 5,0 bis 20,0 mg/ml und am meisten bevorzugt von 8,0 bis 12,0 mg/ml vor. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer-G-CSF-Konjugat PEG-SA-GalNAc-G-CSF, das in einer Konzentration von 10,0 mg/ml vorliegt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Formulierung das Polymer-G-CSF-Konjugat als einen aktiven Bestandteil, ein Tensid, eine Puffersubstanz, ein Tonizitätsmittel, Natriumionen und Wasser, und keine weitere Komponente. Am meisten bevorzugt enthält die erfindungsgemäße wässrige Zubereitung ein glykoPEGyliertes G-CSF als Wirkstoff, Polysorbat 20 und/oder Polysorbat 80 als Tensid, Sorbitol und/oder Mannitol als Tonizitätsmittel, Acetat als Puffer und Natrium, und keine weiteren Hilfsstoffe.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die erfindungsgemäße wässrige Zubereitung, wie sie oben beschrieben wird, verdünnt, um eine für die pädiatrische Verwendung geeignete Verdünnung des wässrigen Präparats zu erhalten. Geeignete Verdünnungen zur Behandlung von Kinder werden erhalten durch eine 1:2 bis 1:8-Verdünnung der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Lösung.
  • Die Erfindung betrifft ebenso einen pharmazeutischen Behälter enthaltend die erfindungsgemäße wässrige Zubereitung oder eine durch Verdünnung erhaltene verdünnte Lösung. Geeignete pharmazeutische Behälter sind im Stand der Technik bekannt. Bei dem Behälter kann es sich zum Beispiel um eine Spritze, ein Fläschchen, eine Infusionsflasche, eine Ampulle oder eine Karpule handeln. In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn es sich bei dem Container um eine Spritze handelt, ist diese mit einem Nadelschutzsystem ausgestattet. Derartige Nadelschutzsysteme, die aus dem Stand der Technik wohl bekannt sind, tragen dazu bei, das Verletzungsrisiko herabzusetzen. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Behälter um eine Karpule eines Injektionsstiftes.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Zubereitung der Erfindung, wobei das Polymer-G-CSF-Konjugat als Wirkstoff in einer wässrigen Zubereitung mit einem pH im Bereich von 4,5 bis 5,5 umfassend ein Tensid und weitere pharmazeutische Hilfsstoffe formuliert wird.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung einer wässrigen Zubereitung der Erfindung zur Behandlung oder Prävention von Neutropenie. Des Weiteren kann die erfindungsgemäße wässrige Zubereitung vorteilhaft zur Behandlung oder Prävention von neurologischen Krankheiten oder in Verbindung mit Knochenmarkstransplantationen verwendet werden. Im Allgemeinen ist die erfindungsgemäße pharmazeutische Lösung dazu geeignet, Stammzellen zu mobilisieren.
  • Es stellte sich heraus, dass die erfindungsgemäße pharmazeutische Flüssigformulierung eine sehr gute Lagerstabilität aufweist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck ”lagerstabil”, dass der Anteil des aktiven Polymer-G-CSF-Konjugats nach drei Monaten Lagerung der Formulierung bei 25°C immer noch 80% oder mehr bezogen auf die anfängliche Konzentration beträgt. Vorzugsweise ist nach drei Monaten Lagerung bei 25°C der verbleibende Anteil von G-CSF-Aktivität immer noch mindestens 85%, besonders bevorzugt mindestens 90%, und am meisten bevorzugt mindestens 95% der ursprünglichen Aktivität.
  • Die Aktivität des Polymer-G-CSF-Konjugats kann mit Hilfe von konventionellen Aktivitätstests, wie sie im Stand der Technik für G-CSF beschrieben worden sind, bestimmt werden (siehe z. B. Draft Monographie "Filgrastim Concentrated Solution" PharmEur. Vol. 19, No. 1, Jan. 2007, oder Stute, N., et al. "Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in children 1" (1992) Blood 79 (11), pages 2849–2854).
  • Die Messung der G-CSF-Aktivität in vitro ist beispielsweise beschrieben in Shirafuji, N. et al. 1989, A new bioassay for human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) using murine myeloblastic NFS-60 cells as targets and estimation of its levels in sera from normal healthy persons and patients with infectious and hematological disorders, Exp. Hematol. (1989) 17, 116–119. Die Messung der G-CSF-Aktivität in vivo findet sich z. B in Tanaka, H. et al. 1991, Pharmacokinetics of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor conjugated to polyethylene glycol in rats, Cancer Research (1991) 51, 3710–3714. Weitere Veröffentlichungen, welche Tests für die (zur) Messung der Aktivität von G-CSF beschreiben, sind US 6,555,660 ; Nohynek, G.J. et al. 1997, Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factors in neutropenic and non-neutropenic CD rats, Cancer Chemother. Pharmacol. (1997) 39, 259–266.
  • Das in der erfindungsgemäßen Formulierung verwendete Polymer-G-CSF-Konjugat sollte eine Reinheit von mindestens 95%, bevorzugt mindestens 97%, besonders bevorzugt mindestens 99% und am meisten bevorzugt mehr als 99% aufweisen. Der Reinheitsgrad kann mit Hilfe von HPLC-Analyse bestimmt werden. Geeignete Materialien und Protokolle, um derartige Analysen durchzuführen, sind bei kommerziellen Anbietern wie etwa Vydac oder TOSOH Bioscience (http://www.tosohbiosep.de) erhältlich.
  • Die Komponenten für die Formulierung der erfindungsgemäßen Lösungen können von konventionellen Quellen bezogen werden, zum Beispiel von Firmen wie Sigma oder Merck.
  • Die Herstellung der erfindungsgemäßen Formulierung kann gemäß konventioneller Verfahren durchgeführt werden. Die Komponenten der Formulierung können in einem wässrigen Puffer gelöst werden. Alternativ kann das Konjugat bereits in einem wässrigen Puffer als Ergebnis eines Aufreinigungsprozesses erhalten werden.
  • Schließlich wird die fertiggestellte Flüssigformulierung in einen geeigneten pharmazeutischen Behälter gefüllt, wo sie bis zur Verabreichung gelagert wird.
  • Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung näher zu veranschaulichen, ohne jedoch den Umfang der Erfindung zu beschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1. Herstellung von G-CSF-GalNAc-SA-PEG
  • Das folgende Beispiel beschreibt die Herstellung von G-CSF-GalNAc-SA-PEG durch (a) ein sequentielles zweistufiges Verfahren, worin jedes Zwischenprodukt aufgereinigt wird, bevor es im nächsten Schritt verwendet wird, und durch (b) ein einstufiges Verfahren, das die simultane Zugabe von Enzymen verwendet.
  • a. Das zweistufige Verfahren
  • Herstellung von G-CSF-GalNAc-SA-PEG (pH 6,2) aus G-CSF und UDP-GalNAc unter Verwendung von GalNAc-T2.
  • G-CSF (960 μg) in 3,2 mL eines Standardpuffers wurde durch Ultrafiltration mittels eines UF-Filters (MWCO 5K) angereichert und anschließend in 1 mL 25 mM MES-Puffer (pH 6,2, 0,005% NaN3) rekonstituiert. Anschließend wurde UDP-GalNAc (6 mg, 9,24 mM), GalNAc-T2 (40 μL, 0,04 U) und 100 mM MnCl2 (40 μL, 4 mM) zugegeben und die daraus resultierende Lösung bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Nach 24 Std. zeigte MALDI die Vollständigkeit der Reaktion an. Das Reaktionsgemisch wurde direkt einer HPLC-Reinigung mittels SEC (Superdex 75 und Superdex 200) und einem PBS-haltigen Elutionspuffer (Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 4,9 und 0,005% Tween 80) unterzogen. Die gesammelte Peak-Fraktion von G-CSF-GalNAc wurde mit einem Centricon-5 KDa-MWCO-Filter bis auf ungefähr 150 μL ankonzentriert und das Volumen anschließend auf 1 ml mit PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 4,9 und 0,005% Tween 80) eingestellt.
  • Die Protein-Endkonzentration betrug 1 mg/mL (A280), die Ausbeute 100%. Die Probe wurde bei 4°C gelagert.
  • Herstellung von G-CSF-GalNAc-SA-PEG unter Verwendung von gereinigtem G-CSF-GalNAc, CMP-SA-PEG (20 KDa) und ST6GalNAc-TI der Maus (pH 6,2).
  • Die G-CSF-GalNAc-Lösung enthaltend 1 mg Protein wurde mit 25 mM MES-Puffer (pH 6,2, 0,005% NaN3) umgepuffert und anschließend CPM-SA-PEG (20 KDa) (5 mg, 0,25 μmol) zugegeben. Nach Auflösung wurde MnCl2 (100 μL, 100 mM Lösung) und ST6GalNAc-T1 (100 μL, Maus-Enzym) zugegeben und das Reaktionsgemisch langsam bei 32°C für drei Tage geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Ultrafiltration (MWCO 5K) ankonzentriert und einmalig mit 25 mM NaOAc (pH 4,9) umgepuffert und anschließend zu 1 mL Endvolumen ankonzentriert. Das Produkt wurde anschließend mit SP-Sepharose (A: 25 mM NaOAc + 0,005% Tween-80 pH 4,5; B: 25 mM NaOAc + 0,005% Tween-80 pH 4,5 + 2 M NaCl) bei einer Retentionszeit von 13–18 Min. und mit SEC (Superdex 75; PBS-pH 7,2, 0,005% Tween 80) bei einer Retentionszeit von 8,6 Min. (Superdex 75, Flow 1 ml/min) gereinigt. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und auf 0,5 mL ankonzentriert und bei 4°C gelagert.
  • b. Einstufiges Verfahren
  • Ein-Topf-Verfahren unter Verwendung von ST6GalNAc-TI (pH 6,0) der Maus.
  • G-CSF (960 μg Protein gelöst in 3,2 mL Produkt-Formulierungspuffer) wurde durch Ultrafiltration (MWCO 5K) bis auf 0,5 mL ankonzentriert und mit 25 mM MES-Puffer (pH 6,0, 0,005% NaN3) in einem Gesamtvolumen von ungefähr 1 mL oder einer Proteinkonzentration von 1 mg/mL rekonstituiert. Anschließend wurden UDPGalNAc (6 mg, 9,21 μmol), GalNAc-T2 (80 μL, 80 mU), CMP-SA-PEG (20 KDa) (6 mg, 0,3 μmol) und das Mausenzym ST6GalNAc-TI (120 μL) und 100 mM MnCl2 (50 μL) zugegeben. Die Lösung wurde anschließend bei 32°C für 48 Std. geschüttelt und über SP-Sepharose unter Standard-Chromatographie-Bedingungen gereinigt. Insgesamt wurden 0,5 mg Protein (A280) oder eine Gesamtausbeute von ungefähr 50% erhalten. Die strukturelle Beschaffenheit des Produkts wurde durch MALDI- und SDS-PAGE-Analysen bestätigt.
  • Ein-Topf-Verfahren unter Verwendung von Huhn-ST6GalNAc-TI (pH 6,0).
  • 14,4 mg G-CSF wurden bis zu 3 mL Endvolumen ankonzentriert, mit 25 mM MES-Puffer (pH 6,0, 0,05% NaN3, 0,004% Tween 80) umgepuffert und das Volumen auf 13 mL eingestellt. Anschließend wurden UDP-GalNAc (90 mg, 150 μmol), GalNAc-T2 (0,59 U), CMP-SA-PEG-20 KDa (90 mg), Huhn-ST6GalNAc-TI (0,44 U) und 100 mM MnCl2 (600 μL) zugegeben. Die resultierende Mischung wurde für 60 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit einem UF (MWCO 5K) ankonzentriert und zentrifugiert. Das Sediment (ungefähr 2 mL) wurde in 25 mM NaOAC-Puffer (pH 4,5) gelöst und erneut auf ein Endvolumen von 5 mL ankonzentriert. Die Probe wurde mit SP-Sepharose für ungefähr 10–23 Min., SEC (Superdex 75, 17 Min., Flussrate 0,5 ml/min.) und einer zusätzlichen SEC (Superdex 200, 23 Min., Flussrate 0,5 ml/min.) gereinigt. Die Ausbeute von G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20 KDa (A280 und BCA-Verfahren) betrug 3,6 mg (25% Gesamtausbeute).
  • Beispiel 2. Polymer-G-CSF-Konjugat (PEG-SA-GalNAc-G-CSF)-Flüssigformulierung
  • Eine Flüssigformulierung umfassend glykoPEGyliertes G-CSF (das Konjugat besitzt die Struktur: PEG-SA-GalNAc-G-CSF) wurde durch Formulierung der folgenden Komponenten in einer wässrigen Acetat-Pufferlösung hergestellt.
    Bestandteil
    glykoPEGyliertes G-CSF 10 mg/ml
    Acetat 10 mM
    Sorbitol 5.0% (w/v)
    Polysorbat 20 0,0033% (w/v)
    Natrium 4,38 mM
    pH 5,0
  • Der pH-Wert der Zusammensetzung wurde durch Zugabe von NaOH eingestellt.
  • Alle Bestandteile besitzen den Qualitätsstandard gemäß der European Pharmacopoeia (Ph. Eur.).
  • Zudem wurde dieselbe Zusammensetzung mit entweder pH 4,5 oder pH 5,5 und dementsprechend weniger bzw. mehr Natrium hergestellt. Ebenso wurde eine Vergleichsformulierung mit einem pH von 4,0 (entsprechend dem Neulasta®-Präparat) hergestellt.
  • Beispiel 3. Stabilitätsanalyse der erfindungsgemäßen Formulierungen
  • Die Zusammensetzungen mit pH 4,5, 5,0 und 5,5 wurden zu 500 μl/Fläschchen aliquotiert und bei 2–8°C und bei 25°C gelagert. Nach 1, 2, 3, 4,5, 6, 8, 12 und 15 Monaten wurden die Proben im Hinblick auf die Testparameter in der Tabelle weiter unten analysiert.
  • Die Vorgaben für eine Zusammensetzung mit einem pH von 5,0 waren wie folgt:
    Testparameter Verfahren Spezifikation
    Aussehen Visuelle Inspektion Klar, farblos
    Gehalt UV-VIS 10,0 mg/ml ± 5%
    Gehalt RP-HPLC (30°C) 10,0 mg/ml ± 5%
    Wirksamkeit Bioassay 54–156%
    Beschaffenheit SDS-PAGE Übereinstimmung mit einem Referenzstandard
    Reinheit Western Blot Übereinstimmung mit einem Referenzstandard
    Reinheit RP-HPLC (60°C) Oxidation < 2,0%
    Reinheit RP-HPLC (30°C) Nicht-PEGyliertes G-CSF 2,0%
    Reinheit SEC Dimere und Aggregate < 2,0%
    Desaminierung IEF Keine weiteren Banden nachweisbar
    pH Gemäß Ph. Eur. 5 und USP 28 5,0 ± 0,2
    Endotoxine Test auf bakterielle Endotoxine gemäß Ph. Eur. 5 < 5 EU/mg
    Sterilität Gemäß Ph. Eur. 5 Steril
    Sub-visible Partikel Partikelförmige Verunreinigungen: sub-visible Partikel gemäß Ph. Eur. 5 < 6000 Partikel ≥ 10 μm pro Fläschchen; < 600 Partikel ≥ 25 μm pro Fläschchen
  • Alle untersuchten Proben zum Zeitpunkt T = 0, 1 Monat, 2 Monate, 3 Monate, 4,5 Monate, 6 Monate, 8 Monate, 12 Monate und 15 Monate erfüllten die erwarteten Vorgaben. Dies wurde für alle Zusammensetzungen umfassend glykoPEGyliertes G-CSF mit einem pH von 4,5, 5,0 oder 5,5 festgestellt.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wurden mit zwei Vergleichsformulierungen verglichen: Neulasta® (pH 4,0) und eine Zusammensetzung von glykoPEGyliertem G-CSF (PEG-SA-GalNAc-G-CSF) mit einem pH von 4,0. Die Ergebnisse zeigen, dass im Vergleich zu den Vergleichslösungen enthaltend glykoPEGyliertes G-CSF mit einem pH von 4,0 die Formulierungen mit einem höheren pH-Wert von 4,5, 5,0 und 5,5 eine weitaus bessere Lagerstabilität aufweisen. Die ermittelten Daten erlauben die Schlussfolgerung, dass höhere pH-Werte vor einer sauren Hydrolyse der glykoPEG-Bindung schützen. Des Weiteren wurde beobachtet, dass die Formulierungen der vorliegenden Erfindung eine Stabilität aufweisen, die vergleichbar ist mit der Stabilität des PEG-G-CSF-Konjugats bekannt als Neulasta®. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00360001
    Figure 00370001
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  • Zitierte Patentliteratur
    • - WO 01/87925 [0006, 0038]
    • - EP 0456200 A [0006, 0038]
    • - US 6166183 [0006, 0038]
    • - US 6004548 [0006, 0038]
    • - US 5580755 [0006, 0038]
    • - US 5582823 [0006, 0038]
    • - US 5675941 [0006, 0038]
    • - US 5416195 [0006, 0038]
    • - US 5399345 [0006, 0038]
    • - WO 2005/055946 [0006, 0013, 0013, 0038, 0043, 0053]
    • - WO 2006/074467 [0006, 0013, 0013, 0038, 0043, 0046, 0046, 0048]
    • - US 5218092 [0007]
    • - US 5824778 [0007]
    • - US 5824784 [0007]
    • - WO 96/11953 [0007, 0016, 0016, 0040, 0045]
    • - WO 95/21629 [0007]
    • - WO 94/20069 [0007]
    • - WO 94/28024 [0008]
    • - US 4179337 [0009]
    • - US 4088538 [0011]
    • - US 4496689 [0011]
    • - US 4414147 [0011]
    • - US 4055635 [0011]
    • - WO 87/00056 [0011]
    • - WO 94/05332 [0011]
    • - US 6399336 [0012]
    • - US 2003/0040037 [0012]
    • - US 2004/0132640 [0012]
    • - US 2004/0137557 [0012]
    • - US 2004/0126838 [0012]
    • - US 2004/0142856 [0012]
    • - US 2004/137557 [0012]
    • - WO 02/09766 [0014, 0014, 0040]
    • - WO 94/01483 [0015]
    • - WO 97/30148 [0017, 0017, 0017, 0040]
    • - WO 03/074087 [0018]
    • - WO 2005/014050 [0019]
    • - WO 2005/014655 [0019]
    • - WO 2005/092390 [0019]
    • - WO 2007/031266 [0019]
    • - WO 2005/092928 [0019]
    • - WO 2005/092391 [0019]
    • - WO 2005/042024 [0024, 0024]
    • - WO 2005/039620 [0025]
    • - EP 1260230 A1 [0026]
    • - EP 1336410 A1 [0027]
    • - EP 1329224 A1 [0028]
    • - WO 01/87329 [0043]
    • - EP 822199 A [0045]
    • - WO 01/51510 [0045]
    • - WO 2006/0128460 [0045]
    • - EP 921131 A [0045]
    • - EP 744409 [0045]
    • - WO 87/01132 [0059]
    • - EP 0719860 A [0059]
    • - EP 1458757 A [0059]
    • - EP 1527188 A [0059]
    • - WO 03/051922 [0059]
    • - WO 01/04154 [0059]
    • - WO 2006/097944 [0059]
    • - US 6555660 [0090]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Nagata et al. (1986) Nature 319: 415–418 [0002]
    • - http://www.neulasta.com, und ROTE LISTE 2007 [0021]
    • - http://neupogen.com, und ROTE LISTE 2007 [0021]
    • - Stute, N., et al. ”Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in children” (1992) Blood 79 (11), Seiten 2849-2854 [0036]
    • - Souza, L. M. et al. 1986, Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects an normal and leukemic myeloid cells, Science (1986) 232: 61–65 [0057]
    • - Nagata, S. et al. 1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor, Nature (1986) 319: 415–418 [0057]
    • - Komatsu, Y. et al. 1987, Cloning of granulocyte colony-stimulating factor cDNA from human macrophages and its expression in Escherichia coli, Jpn. J. Cancer Res. (1987) 78: 1179–1181 [0057]
    • - Nagata, S. et al. (1986) [0058]
    • - ”Filgrastim Concentrated Solution” PharmEur. Vol. 19, No. 1, Jan. 2007 [0089]
    • - Stute, N., et al. ”Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in children 1” (1992) Blood 79 (11), pages 2849–2854 [0089]
    • - Shirafuji, N. et al. 1989, A new bioassay for human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) using murine myeloblastic NFS-60 cells as targets and estimation of its levels in sera from normal healthy persons and patients with infectious and hematological disorders, Exp. Hematol. (1989) 17, 116–119 [0090]
    • - Tanaka, H. et al. 1991, Pharmacokinetics of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor conjugated to polyethylene glycol in rats, Cancer Research (1991) 51, 3710–3714 [0090]
    • - Nohynek, G.J. et al. 1997, Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factors in neutropenic and non-neutropenic CD rats, Cancer Chemother. Pharmacol. (1997) 39, 259–266 [0090]
    • - http://www.tosohbiosep.de [0091]

Claims (36)

  1. Eine wässrige Zubereitung umfassend ein Polymer-G-CSF-Konjugat, worin das Präparat einen pH im Bereich von 4,5 bis 5,5 und weiterhin ein Tensid umfasst.
  2. Wässrige Zubereitung gemäß Anspruch 1, worin das Polymer ein Polyalkylenglykol ist.
  3. Wässrige Zubereitung gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, worin das Polymer und G-CSF über einen Glycosyl-Linker verbunden sind.
  4. Wässrige Zubereitung gemäß Anspruch 3, worin die Gycosylverbindung über O-Glycosylierung erfolgt.
  5. Wässrige Zubereitung gemäß Anspruch 4, worin die O-Glycosylierung an einem Threoninrest des G-CSF-Proteins erfolgt.
  6. Wässrige Zubereitung gemäß Anspruch 5, worin der Threoninrest Thr 134 bezogen auf die Aminosäuresequenz des Methionyl-G-CSF-Proteins oder Thr 133 bezogen auf die Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden humanen G-CSF ist.
  7. Wässrige Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, worin der Glycosyl-Linker ein Mono-, Di- oder Oligosaccharid umfasst.
  8. Wässrige Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, worin der Glycosyl-Linker Sialinsäure und N-Acetylgalactosamin umfasst.
  9. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Tensid in einer Konzentration von 0,0001% (w/v)–0,05% (w/v) vorliegt.
  10. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Tensid ein Polyoxyethylensorbitanalkylester ist.
  11. Wässrige Zubereitung gemäß Anspruch 10, worin der Polyoxyethylensorbitanalkylester Polysorbat 20 oder Polysorbat 80 ist.
  12. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin der pH im Bereich von 4,7 bis 5,3 ist.
  13. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin der pH im Bereich von 4,9 bis 5,1 ist.
  14. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine physiologisch annehmbare Puffersubstanz.
  15. Wässrige Zubereitung gemäß Anspruch 14, worin die Puffersubstanz Essigsäure oder ein Salz davon umfasst.
  16. Wässrige Zubereitung gemäß den Ansprüchen 14 oder 14, worin die Puffersubstanz in einer Konzentration von 2–50 mmol/l vorliegt.
  17. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, weiterhin umfassend ein Tonizitätsmittel ausgewählt aus Sorbitol und Mannitol.
  18. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Tonizitätsmittel in einer Konzentration von 1–10% vorliegt.
  19. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Präparat frei von Stabilisatoren ausgewählt aus Aminosäuren, polymeren Stabilisatoren und Protein-Stabilisatoren ist.
  20. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Zubereitung frei von Konservierungsstoffen ist.
  21. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Zubereitung frei von Sulfationen ist.
  22. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin der pH-Wert mit NaOH eingestellt wird.
  23. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Zubereitung Natriumionen enthält.
  24. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Präparat ein Polymer-G-CSF-Konjugat als Wirkstoff, Polysorbat 20 und/oder Polysorbat 80 als Tensid, Sorbitol und/oder Mannitol als Tonizitätsmittel, Acetat als Puffer und Natrium, und keine weiteren Hilfsstoffe enthält.
  25. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Polymer-G-CSF-Konjugat in einer Konzentration von 1–20 mg/ml vorliegt.
  26. Wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Polymer-G-CSF-Konjugat in einer Konzentration von 8–12 mg/ml vorliegt.
  27. Wässrige Verdünnungszubereitung abgeleitet von der wässrigen Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin die wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche 1:2 bis 1:8 verdünnt wird.
  28. Pharmazeutischer Behälter enthaltend eine wässrige Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche.
  29. Pharmazeutischer Behälter gemäß Anspruch 28, wobei der Behälter eine Spritze, ein Fläschchen, eine Infusionsflasche, eine Ampulle oder eine Karpule ist.
  30. Pharmazeutischer Behälter gemäß den Ansprüchen 28 oder 29, wobei der Behälter eine Spritze ausgestattet mit einem Nadelschutzsystem ist.
  31. Pharmazeutischer Behälter gemäß den Ansprüchen 28 oder 29, wobei der Behälter eine Karpule innerhalb eines Injektionsstiftes ist.
  32. Verwendung einer wässrigen Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Behandlung oder Prävention von Neutropenie.
  33. Verwendung einer wässrigen Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Behandlung oder Prävention von neurologischen Erkrankungen.
  34. Verwendung einer wässrigen Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 in Verbindung mit Knochenmarkstransplantation.
  35. Verwendung einer wässrigen Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Mobilisierung von Stammzellen.
  36. Verwendung einer wässrigen Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 für pädiatrische Anwendungen.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2519031C1 (ru) * 2010-01-19 2014-06-10 Ханми Сайенс Ко., Лтд. Жидкие препаративные формы для длительно действующего конъюгата g-csf
MX2012010661A (es) 2010-03-17 2013-03-25 Biogenerix Gmbh Metodo para obtener factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) humano recombinante biologicamente activo.
EP2384759A1 (de) 2010-05-06 2011-11-09 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Sulfatierte Hyaluronsäure in Kombination mit G-CSF für den Einsatz bei der Mobilisierung von Blutstammzellen
WO2017181920A1 (zh) * 2016-04-18 2017-10-26 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法
IT201700108526A1 (it) * 2017-09-28 2019-03-28 Alfasigma Spa Composizioni orali per il trattamento del refluso gastroesofageo.
US20210121529A1 (en) * 2018-05-04 2021-04-29 Ilkogen Ilaç Sanayi Ve Ticaret A.S. Stable hybrid fc fusion g-csf formulation
CN114224853B (zh) * 2022-01-04 2022-09-23 山东新时代药业有限公司 聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子注射用冻干制剂
WO2024037633A2 (en) * 2022-08-19 2024-02-22 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd Formulations comprising g-csf and uses thereof

Citations (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4055635A (en) 1973-07-05 1977-10-25 Beecham Group Limited Fibrinolytic compositions
US4088538A (en) 1975-05-30 1978-05-09 Battelle Memorial Institute Reversibly precipitable immobilized enzyme complex and a method for its use
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4414147A (en) 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
WO1987001132A1 (en) 1985-08-23 1987-02-26 Kirin-Amgen, Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
EP0456200A1 (de) 1990-05-08 1991-11-13 Roche Diagnostics GmbH Muteine des Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors (G-CSF)
US5218092A (en) 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
WO1994001483A1 (en) 1992-07-02 1994-01-20 Collagen Corporation Biocompatible polymer conjugates
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
WO1994020069A1 (en) 1993-03-08 1994-09-15 Amgen Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5399345A (en) 1990-05-08 1995-03-21 Boehringer Mannheim, Gmbh Muteins of the granulocyte colony stimulating factor
US5416195A (en) 1990-04-30 1995-05-16 Zeneca Limited Polypeptide derivatives of granulocyte colony stimulating factor
WO1995021629A1 (en) 1994-02-08 1995-08-17 Amgen Inc. Oral delivery of chemically modified proteins
WO1996011953A1 (en) 1994-10-12 1996-04-25 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
EP0719860A1 (de) 1988-05-13 1996-07-03 Amgen Inc. Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Infektionen bei Tieren
EP0744409A1 (de) 1994-02-23 1996-11-27 Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha Beschleuniger des plättchenwachstums
WO1997030148A1 (en) 1996-02-15 1997-08-21 Novo Nordisk A/S Conjugation of polypeptides
US5675941A (en) 1983-12-09 1997-10-14 Dykmans; Maximiliaan J. Method and apparatus for constructing prestressed structures utilizing a membrane and floating dome assembly
US5824778A (en) 1988-12-22 1998-10-20 Kirin-Amgen, Inc. Chemically-modified G-CSF
EP0921131A1 (de) 1997-06-06 1999-06-09 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Chemisch modifitierte polypeptide
US6004548A (en) 1985-08-23 1999-12-21 Amgen, Inc. Analogs of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US6166183A (en) 1992-11-30 2000-12-26 Kirin-Amgen, Inc. Chemically-modified G-CSF
WO2001004154A1 (fr) 1999-07-08 2001-01-18 Aventis Pharma S.A. Procede de purification de facteur de stimulation de colonies de granulocytes
WO2001051510A2 (en) 2000-01-10 2001-07-19 Maxygen Holdings Ltd G-csf conjugates
WO2001087329A1 (en) 2000-05-15 2001-11-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivate
WO2001087925A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
WO2002009766A1 (en) 2000-07-29 2002-02-07 Park Myung Ok Highly reactive branched polymer and proteins or peptides conjugated with the polymer
US6399336B1 (en) 1997-01-16 2002-06-04 Neose Technologies, Inc. Practical in vitro sialylation of recombinant glycoproteins
EP1260230A1 (de) 2000-02-29 2002-11-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Langfristig stabilisierte präparate
US20030040037A1 (en) 2000-05-12 2003-02-27 Neose Technologies, Inc. In vitro modification of glycosylation patterns of recombinant glycopeptides
US6555660B2 (en) 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
WO2003051922A1 (en) 2001-12-19 2003-06-26 Lek Pharmaceuticals D.D. Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor
EP1329224A1 (de) 2000-09-01 2003-07-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Über lange zeit stabilisierte lösungen
EP1336410A1 (de) 2000-08-04 2003-08-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protein-injektionszubereitungen
WO2003074087A1 (de) 2002-03-06 2003-09-12 Biotechnologie - Gesellschaft Mittelhessen Mbh Kopplung von proteinen an ein modifiziertes polysaccharid
US20040126838A1 (en) 2001-11-28 2004-07-01 Neose Technologies, Inc. Follicle stimulating hormone: remodeling and glycoconjugation of FSH
US20040132640A1 (en) 2001-10-10 2004-07-08 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US20040137557A1 (en) 2001-10-10 2004-07-15 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
US20040142856A1 (en) 2001-10-10 2004-07-22 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation methods and proteins/peptides produced by the methods
WO2005014050A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
EP1527188A1 (de) 2002-07-31 2005-05-04 LEK Pharmaceuticals D.D. Verfahren zur herstellung erhöhter mengen an richtig gefalteten heterologen proteinen in einschlussteilchen
WO2005039620A1 (de) 2003-10-20 2005-05-06 Hexal Biotech Forschungs Gmbh Stabile wässrige g-csf-haltige zusammensetzungen
WO2005042024A1 (en) 2003-11-04 2005-05-12 Lek Pharmaceuticals D.D. Stable pharmaceutical composition comprising granulocyte-colony stimulating factor
WO2005055946A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2005092928A1 (en) 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
WO2005092391A2 (en) 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2006074467A2 (en) 2005-01-10 2006-07-13 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2006097944A2 (en) 2005-03-17 2006-09-21 Zenotech Laboratories Limited Process for the purification of recombinant granulocyte-colony stimulating factor
WO2006128460A2 (en) 2005-06-01 2006-12-07 Maxygen Holdings Ltd. Pegylated g-csf polypeptides and methods of producing same
WO2007031266A2 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4126983A1 (de) * 1991-08-15 1993-02-18 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung von humanprotein-enthaltenden, konservierten arzneimitteln fuer infusions- oder injektionszwecke
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US6540672B1 (en) * 1998-12-09 2003-04-01 Novo Nordisk A/S Medical system and a method of controlling the system for use by a patient for medical self treatment
CN101072789B (zh) * 2004-01-08 2013-05-15 生物种属学股份公司 肽的o-连接的糖基化
DE102004036909B4 (de) 2004-07-29 2007-04-05 Infineon Technologies Ag Halbleiterbasisbauteil mit Verdrahtungssubstrat und Zwischenverdrahtungsplatte für einen Halbleiterbauteilstapel sowie Verfahren zu deren Herstellung
DE102006009437A1 (de) 2006-03-01 2007-09-13 Bioceuticals Arzneimittel Ag G-CSF-Flüssigformulierung
ITMI20061624A1 (it) 2006-08-11 2008-02-12 Bioker Srl Mono-coniugati sito-specifici di g-csf
CN101796063B (zh) 2007-04-03 2017-03-22 拉蒂奥法姆有限责任公司 使用糖聚乙二醇化g‑csf的治疗方法
US8207112B2 (en) * 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate

Patent Citations (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4055635A (en) 1973-07-05 1977-10-25 Beecham Group Limited Fibrinolytic compositions
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4088538A (en) 1975-05-30 1978-05-09 Battelle Memorial Institute Reversibly precipitable immobilized enzyme complex and a method for its use
US4414147A (en) 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
US5675941A (en) 1983-12-09 1997-10-14 Dykmans; Maximiliaan J. Method and apparatus for constructing prestressed structures utilizing a membrane and floating dome assembly
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
WO1987001132A1 (en) 1985-08-23 1987-02-26 Kirin-Amgen, Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US5582823A (en) 1985-08-23 1996-12-10 Amgen Inc. Methods of treating bacterial inflammation and granulocytopoiesis by administering human pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US5580755A (en) 1985-08-23 1996-12-03 Amgen Inc. Human pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US6004548A (en) 1985-08-23 1999-12-21 Amgen, Inc. Analogs of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
EP0719860A1 (de) 1988-05-13 1996-07-03 Amgen Inc. Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Infektionen bei Tieren
US5218092A (en) 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
US5824778A (en) 1988-12-22 1998-10-20 Kirin-Amgen, Inc. Chemically-modified G-CSF
US5416195A (en) 1990-04-30 1995-05-16 Zeneca Limited Polypeptide derivatives of granulocyte colony stimulating factor
EP0456200A1 (de) 1990-05-08 1991-11-13 Roche Diagnostics GmbH Muteine des Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors (G-CSF)
US5399345A (en) 1990-05-08 1995-03-21 Boehringer Mannheim, Gmbh Muteins of the granulocyte colony stimulating factor
WO1994001483A1 (en) 1992-07-02 1994-01-20 Collagen Corporation Biocompatible polymer conjugates
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US6166183A (en) 1992-11-30 2000-12-26 Kirin-Amgen, Inc. Chemically-modified G-CSF
WO1994020069A1 (en) 1993-03-08 1994-09-15 Amgen Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
WO1995021629A1 (en) 1994-02-08 1995-08-17 Amgen Inc. Oral delivery of chemically modified proteins
EP0744409A1 (de) 1994-02-23 1996-11-27 Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha Beschleuniger des plättchenwachstums
WO1996011953A1 (en) 1994-10-12 1996-04-25 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
EP0822199A2 (de) 1994-10-12 1998-02-04 Amgen Inc. N-terminal modifizierte Polypeptide, und Herstellungsprozess
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
WO1997030148A1 (en) 1996-02-15 1997-08-21 Novo Nordisk A/S Conjugation of polypeptides
US6399336B1 (en) 1997-01-16 2002-06-04 Neose Technologies, Inc. Practical in vitro sialylation of recombinant glycoproteins
EP0921131A1 (de) 1997-06-06 1999-06-09 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Chemisch modifitierte polypeptide
WO2001004154A1 (fr) 1999-07-08 2001-01-18 Aventis Pharma S.A. Procede de purification de facteur de stimulation de colonies de granulocytes
WO2001051510A2 (en) 2000-01-10 2001-07-19 Maxygen Holdings Ltd G-csf conjugates
US6555660B2 (en) 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
EP1260230A1 (de) 2000-02-29 2002-11-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Langfristig stabilisierte präparate
US20030040037A1 (en) 2000-05-12 2003-02-27 Neose Technologies, Inc. In vitro modification of glycosylation patterns of recombinant glycopeptides
WO2001087329A1 (en) 2000-05-15 2001-11-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivate
WO2001087925A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
WO2002009766A1 (en) 2000-07-29 2002-02-07 Park Myung Ok Highly reactive branched polymer and proteins or peptides conjugated with the polymer
EP1336410A1 (de) 2000-08-04 2003-08-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protein-injektionszubereitungen
EP1329224A1 (de) 2000-09-01 2003-07-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Über lange zeit stabilisierte lösungen
US20040137557A1 (en) 2001-10-10 2004-07-15 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
US20040142856A1 (en) 2001-10-10 2004-07-22 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation methods and proteins/peptides produced by the methods
US20040132640A1 (en) 2001-10-10 2004-07-08 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US20040126838A1 (en) 2001-11-28 2004-07-01 Neose Technologies, Inc. Follicle stimulating hormone: remodeling and glycoconjugation of FSH
EP1458757A1 (de) 2001-12-19 2004-09-22 LEK Pharmaceuticals D.D. Prozess für die aufreinigung und isolierung von biologisch-aktivem granulozyten-koloniestimulierungsfaktor
WO2003051922A1 (en) 2001-12-19 2003-06-26 Lek Pharmaceuticals D.D. Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor
WO2003074087A1 (de) 2002-03-06 2003-09-12 Biotechnologie - Gesellschaft Mittelhessen Mbh Kopplung von proteinen an ein modifiziertes polysaccharid
EP1527188A1 (de) 2002-07-31 2005-05-04 LEK Pharmaceuticals D.D. Verfahren zur herstellung erhöhter mengen an richtig gefalteten heterologen proteinen in einschlussteilchen
WO2005014050A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2005039620A1 (de) 2003-10-20 2005-05-06 Hexal Biotech Forschungs Gmbh Stabile wässrige g-csf-haltige zusammensetzungen
WO2005042024A1 (en) 2003-11-04 2005-05-12 Lek Pharmaceuticals D.D. Stable pharmaceutical composition comprising granulocyte-colony stimulating factor
WO2005055946A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2005092928A1 (en) 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
WO2005092390A2 (en) 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2005092391A2 (en) 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2006074467A2 (en) 2005-01-10 2006-07-13 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2006097944A2 (en) 2005-03-17 2006-09-21 Zenotech Laboratories Limited Process for the purification of recombinant granulocyte-colony stimulating factor
WO2006128460A2 (en) 2005-06-01 2006-12-07 Maxygen Holdings Ltd. Pegylated g-csf polypeptides and methods of producing same
WO2007031266A2 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Filgrastim Concentrated Solution" PharmEur. Vol. 19, No. 1, Jan. 2007
http://neupogen.com, und ROTE LISTE 2007
http://www.neulasta.com, und ROTE LISTE 2007
http://www.tosohbiosep.de
Komatsu, Y. et al. 1987, Cloning of granulocyte colony-stimulating factor cDNA from human macrophages and its expression in Escherichia coli, Jpn. J. Cancer Res. (1987) 78: 1179-1181
Nagata et al. (1986) Nature 319: 415-418
Nagata, S. et al. (1986)
Nagata, S. et al. 1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor, Nature (1986) 319: 415-418
Nohynek, G.J. et al. 1997, Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factors in neutropenic and non-neutropenic CD rats, Cancer Chemother. Pharmacol. (1997) 39, 259-266
Shirafuji, N. et al. 1989, A new bioassay for human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) using murine myeloblastic NFS-60 cells as targets and estimation of its levels in sera from normal healthy persons and patients with infectious and hematological disorders, Exp. Hematol. (1989) 17, 116-119
Souza, L. M. et al. 1986, Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects an normal and leukemic myeloid cells, Science (1986) 232: 61-65
Stute, N., et al. "Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in children 1" (1992) Blood 79 (11), pages 2849-2854
Stute, N., et al. "Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in children" (1992) Blood 79 (11), Seiten 2849-2854
Tanaka, H. et al. 1991, Pharmacokinetics of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor conjugated to polyethylene glycol in rats, Cancer Research (1991) 51, 3710-3714

Also Published As

Publication number Publication date
CA2696594C (en) 2019-03-19
AU2008292186B2 (en) 2014-02-27
US20110053844A1 (en) 2011-03-03
BRPI0815975B8 (pt) 2021-05-25
HRP20140590T1 (hr) 2014-08-15
AU2008292186A1 (en) 2009-03-05
CN104689333A (zh) 2015-06-10
EA201070315A1 (ru) 2010-08-30
AU2008292186B9 (en) 2014-07-03
KR20100052501A (ko) 2010-05-19
EP2197919A1 (de) 2010-06-23
JP5836351B2 (ja) 2015-12-24
EP2197919B1 (de) 2014-04-09
CA2696594A1 (en) 2009-03-05
CY1115908T1 (el) 2017-01-25
BRPI0815975A2 (pt) 2015-02-18
WO2009027437A1 (en) 2009-03-05
DK2197919T3 (da) 2014-07-07
UA98001C2 (uk) 2012-04-10
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