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DE20019928U1 - Vorrichtung zur Herstellung biologischer Prothesen - Google Patents

Vorrichtung zur Herstellung biologischer Prothesen

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DE20019928U1
DE20019928U1 DE20019928U DE20019928U DE20019928U1 DE 20019928 U1 DE20019928 U1 DE 20019928U1 DE 20019928 U DE20019928 U DE 20019928U DE 20019928 U DE20019928 U DE 20019928U DE 20019928 U1 DE20019928 U1 DE 20019928U1
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hollow cylinder
cells
valve
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Description

Beschreibung Vorrichtung zur Herstellung biologischer Prothesen
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Herstellung von biologischen Prothesen aus dezellularisiertem allogenem bzw. xenogenem oder aus künstlichem Fremdmaterial, das mit körpereigenen Zellen beschichtet wird, insbesondere von Substituten für die Herz- und Gefäßchirurgie.
Die Transplantation von Organen, Gefäßen und Haut wird chirurgisch im allgemeinen gut beherrscht. Probleme bereitet jedoch die Bereitstellung geeigneter Transplantäte, die möglichst gut einwachsen und lange haltbar sein sollen und im Körper des Empfängers möglichst noch mitwachsen und sich regenerieren können.
Ein wichtiger Bereich der Transplantationstechnik ist der 0 Blutkreislauf und hier insbesondere das Herz mit seinem sensiblen, stark beanspruchten Klappensystem, dessen Funktion aus den unterschiedlichsten Gründen beeinträchtigt sein kann. Bei einem bestimmten Schweregrad der Herzklappenerkrankung, das heißt, wenn eine medikamentöse <25 Behandlung keinen Erfolg verspricht, ist ein Herzklappenersatz erforderlich. Besonders bewährt haben sich dabei unter den biologischen Herzklappen die sogenannten Homografts aus menschlichem Gewebe, die aber nur beschränkt zur Verfügung stehen, und die gerüstfreien oder gerüsteten Bioprothesen porcinen Ursprungs oder aus Rinderperikardium gefertigte Prothesen, die eine ähnlich günstige Hämodynamik wie die Homografts aufweisen und zudem in jeder Größe und Anzahl verfügbar sind.
Aufgrund der erforderlichen Konservierung enthalten diese Bioprothesen kein lebendes Gewebe und ein Zellwachstum
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ist praktisch nicht möglich. Auch solche Herzklappen sind daher nicht regenerationsfähig, nicht wachstumsfähig und zudem einem allmählichen Verschleiß unterworfen. Außerdem werden diese Prothesen vom Immunsystem des Empfängerorganismus als &ldquor;fremd" eingestuft und durch immunkompetente Zellen bekämpft.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Herstellung von biologischen, den natürlichen Verhältnissen hinsichtlich der Zellbeschichtung nahekommenden Prothesen, insbeson-dere von Herzklappen und Blutgefäßen, anzugeben, die in der Lage ist, eine gleichmäßige, ebenflächige und vollständige Besiedlung des Ausgangsmaterials mit körpereigenen Zellen zu bewirken.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mit einer Vorrichtung gemäß den Merkmalen des Schutzanspruches 1 gelöst.
Die Vorrichtung ist so ausgebildet, daß die Beschichtung der Matrix in einem an die natürlichen Strömungsbedingungen in den betreffenden Organen, Organteilen oder Gefäßen angenäherten Zellsuspensionsstrom erfolgt. Durch eine solche dynamische Beschichtung lernen die aufzutragenden Zellen bereits in der Beschichtungs- und ersten Wachstumsphase, sich an die natürlichen Zustände während der späteren Funktion des Organ(teils), z.B. Strömungsbedingungen und Wandbewegungen oder -dehnungen, bezüglich ihrer Anordnung, Form und Haftung anzupassen, so daß eine vollständige, allseitige und schnelle sowie sicher wachsende Besiedlung erreicht werden kann und die neue körpereigene Zellschicht in den später blutdurchströmten Bereichen Widerstands- und reibungsarme Strömungsbedingungen schafft.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt einen separat handhabbaren, in Längs- und Querrichtung von Hand oder motorisch drehbaren Bioreaktor, der mit der Zellsuspension gefüllt wird und in dem das zu beschichtende Implantat axial zur Durchströmungsrichtung straff fixiert wird. Für den Durchströmungs- bzw. Zellkonditionierungsvorgang ist der Bioreaktor in eine Ringleitung eingebunden, die zur Erzeugung eines pulsierenden, in der Geschwindigkeit veränderlichen Flüssigkeitsstromes an eine entsprechende Pumpe angeschlossen ist.
Aus den Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispieles ergeben sich weitere Merkmale und vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es möglich, mit körpereigenen Zellen beschichtete biologische Implantate aus xenogenem bzw. allogenem oder künstlichem Fremdmaterial herzustellen, die über die bekannten Vorteile der Verwendung körpereigener Zellen hinaus auch in ihrer dynamischen Wirkung den natürlichen Verhältnissen weitestgehend entsprechen, eine lange Lebensdauer aufweisen sowie einen hohen Lebenskomfort gewährleisten.
£>5 Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird für die Herstellung einer gerüstfreien Aortenklappe anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Ansicht einer erfin-0 dungsgemäßen Vorrichtung zur Beschichtung
einer azellularisierten porcinen Aortenklappe in einem Strömungskreislauf aus einer mit körpereigenen Endothelzellen des vorgesehenen Empfängers versetzten 5 Nährlösung; und
Fig. 2 eine Schnittansicht eines in den Strömungskreislauf eingebundenen Bioreaktors, in dem die zu beschichtende Aortenklappe fixiert ist.
5
Bevor die Vorrichtung zum Einsatz kommt, werden aus dem Körper des künftigen Empfängers der Bioprothese von einer Gefäßinnenhaut venöse oder arterielle, das heißt, besonders glatte Endothelzellen in einem Durchströmungsverfahren mit Collagenase P 1.0 %ig gewonnen und mit üblichen Verfahren in einem Inkubator bei 370C, 98 % Luftfeuchtigkeit und einem CO2-Gehalt von 5 % in einem Zuchtmedium aus DMEM, 20 % Serum, bFGF, Antibiotika, L-Glutamin und HEPES-Puffer gezüchtet, so daß schließlich eine Zellsuspension mit mindestens 8 Millionen körpereigenen Zellen zur Verfügung steht.
Parallel zur Züchtung der Zellen wird eine geeignete Aortenklappe menschlichen oder tierischen Ursprungs, hier 0 eine Aortenklappe vom Schwein, von der überschüssiges Gewebe entfernt und die auf eine bestimmte Länge zugeschnitten wurde, in Desoxycholsäure azellularisiert und anschließend mit physiologischer Kochsalzlösung oder einer Phosphatpufferlösung solange behandelt, bis die Desoxycholsäure restlos entfernt ist. Die so gewonnene Kollagen/Elastin-Matrix der ursprünglich eingesetzten porcinen Aortenklappe wird mit einem natürlichen Klebstoff, hier Pronectin + L-Laminin, bei 37°C behandelt, um bei der Besiedlung der Matrix mit körpereigenen Zellen 0 deren Adhäsion an der Matrixoberfläche zu erhöhen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Besiedlung mit körpereigenen Zellen ist in den Figuren 1 und 2 dargestellt und umfaßt eine Ringleitung 1, in die ein die 5 zu behandelnde Aortenklappe 3 aufnehmender Bioreaktor 2, eine Membranpumpe 3 und eine dem Bioreaktor 2 unmittelbar
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nachgeschaltete Ausgleichskammer 4 eingebunden sind. Die Membranpumpe 3 ist in bekannter Weise als eine Blutpumpe ausgebildet, wie sie auch hilfsweise beim Menschen zur Erzeugung eines dem natürlichen Blutstrom nachempfundenen, mechanisch erzeugten Blutstroms eingesetzt wird. Die Membranpumpe 3 ist über eine Schlauchleitung 5 an eine Antriebseinheit (nicht dargestellt) angeschlossen. In die beiden Anschlüsse der Membranpumpe 3 an die Ringleitung 1 sind ein Auslaßventil 6 und ein Einlaßventil 7, deren Funktion etwa der einer Herzklappe entspricht, integriert. Auf das Auslaßventil 6 kann jedoch bei der Beschichtung von Herzklappen, wie unten erläutert, auch verzichtet werden.
Das Kernstück der Vorrichtung ist der Bioreaktor 2 zur Herstellung bzw. Behandlung einer Bioprothese, hier einer porcinen Aortenklappe 8. Der Bioreaktor 2 besteht aus einem transparenten Hohlzylinder 9 aus Piacryl mit an den offenen Stirnseiten zentrisch und abdichtend fixierten Einsatzstücken 10 und 11 aus Teflon, die über Anschlußstutzen 12, 13 mit der Ringleitung 1 verbunden sind und jeweils einen in den Hohlzylinder 9 ragenden Befestigungsabschnitt 14, 15 mit radial am Umfang angeordneten Befestigungslöchern 16, 17 zum straffen Halten der Aortenklappe 8 unter Spannung an deren stirnseitigen Rändern aufweisen. Der Außendurchmesser der beiden Befestigungsabschnitte 14, 15 der Einsatzstücke 10, 11 entspricht etwa dem Durchmesser der Aortenklappe 8. Das in Strömungsrichtung hintere Einsatzstück 11 ist über einen Bundsteg 18 und eine erste Dichtung 27 an der Innenseite eines mit dem Hohlzylinder 9 verbundenen Ringsteges 20 verspannbar, und zwar mit Hilfe eines Schraubringes 21, dessen Innengewinde in ein Außengewinde am Einsatzstück 11 eingreift. Das Einsatzstück 10 weist einen Bund 22 auf, der an der Stirnfläche des Hohlzylinders 9 zur Anlage kommt und mit dieser unter Verwendung
einer Schraubkappe 23 mit Innengewinde, das in ein Außengewinde am Hohlzylinder 9 eingreift, verspannbar ist. Zur flüssigkeitsdichten Befestigung ist eine zweite Dichtung
19 vorgesehen. Das dem Bioreaktor nachgeschaltete
Schlauchstück der Ringleitung 1 besteht aus flexiblem
Material (Silikon), so daß die Durchströmung aufgrund der pulsierenden Pumpwirkung gewährleistet ist. Sämtliche
Teile der Vorrichtung, die mit dem Zellmaterial während
der Beschichtung in Berührung kommen, bestehen aus biologisch abstoßendem Material, an dem die Zellen nicht haften
können.
Aufgrund der zuvor beschriebenen Ausbildung und Anordnung der Einsatzstücke 10, 11 kann außerhalb des Hohlzylinders 9 eine entsprechend vorbereitete, das heißt, dezellularisierte, mit dem natürlichen Kleber Pronectin + L-Laminin
behandelte und zugeschnittene Aortenklappe 8 an den
gegenüberliegenden Befestigungsabschnitten 14, 15 der
Einsatzstücke 10, 11 angenäht werden. In dieser Form wird die Aortenklappe 8 in den Hohlzylinder 9 eingebracht, und zwar so, daß die Strömungsrichtung in der Vorrichtung mit der natürlichen Strömungsrichtung durch das Implantat im
menschlichen Körper übereinstimmt. Aufgrund dessen, daß
mit dem Auslaßventil 6 und der Aortenklappe 8 zwei quasi
gleichartige Ventile hintereinander geschaltet sind,
könnte in diesem Fall auf das Auslaßventil 6 der Membranpumpe 3 verzichtet werden. Wenn aber Blutgefäße in der
gleichen Weise mit Körperzellen beschichtet werden, ist
das Auslaßventil 6 in der Membranpumpe 3 weiterhin erforderlich.
Für die Besiedelung der Aortenklappe liegen aus der oben
beschriebenen Zellzüchtung die als lebensfähig nachgewiesenen Endothel-Zellen in einer Anzahl von mindestens 8
Millionen in dem auch bei der Zellzüchtung verwendeten
Medium vor, das zu 20 % aus Serum des Empfängers, den
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handelsüblichen Zeilwachstumsmitteln DMEM und bFGF sowie Antibiotika, L-Glutamin und gegebenenfalls einem HEPES-Puffer besteht. Diese Zellsuspension wird über einen der von der Ringleitung 1 gelösten Anschlußstutzen 12, 13 oder ein Füll- und Ablaßventil 24, 25 in den Bioreaktor gefüllt. Nach dem Schließen des von der Ringleitung 1 gelösten Bioreaktors 2 an den Anschlußstutzen 12, 13 mit Stopfen oder Abdeckkappen (nicht dargestellt) wird als erster Besiedlungsschritt durch wiederholtes Drehen des in einer Drehvorrichtung (nicht dargestellt) gehaltenen Bioreaktors 2 sowohl um seine Längsachse als auch um seine Querachse und dazwischenliegende Absetzphasen eine Verteilung der Endothelzellen auf den Flächen der Aortenklappe 8, und zwar sowohl unter der Wirkung der Schwerkraft als auch von Zentrifugalkräften, vorgenommen. Das Drehen kann vorzugsweise auch manuell unter gleichzeitiger visueller Beobachtung durchgeführt werden. Bei an den Bioreaktor 2 angeschlossener Ringleitung 1 erfolgt anschließend ein erster Zellkonditionierungsschritt, 0 indem über die Membranpumpe 3 ein pulsierender Zellsuspensionsstrom mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 l/min in Richtung des Pfeils erzeugt wird. Die Strömungsrichtung der Zellsuspension entspricht der Strömungsrichtung des Blutes in implantiertem Zustand der Bioprothese. Bei der impulsartigen Strömung der Zellsuspension über die Innenflächen (Strömungsflächen) der Aortenklappe 8 werden bei zunächst geringer Strömungsgeschwindigkeit allmählich die Endothelzellen durch den ständig wiederholten Strömungsreiz in ihrer Form und Ausrichtung an die Strömungs-0 richtung und -kräfte sowie die Bewegungen der Implantatwände angepaßt, d.h. die Zellen werden konditioniert und lernen, sich so auszubilden und anzuordnen, daß in der Wachstumsphase eine glatte, der Strömung einen möglichst geringen Widerstand entgegensetzende einschichtige Endothelzellenflache entsteht. Das heißt, in der sich an den ersten Zellkonditionierungsschritt anschließenden Ruhe-
phase, die mit einem diskontinuierlichen Drehen des Bioreaktors 2 verbunden sein kann, haben die Endothelzellen Gelegenheit, in der durch die zuvor eingegebene Strömungsreize erlernten Form und Richtung an der Kollagen-Matrix zu wachsen. Beim Durchströmen gegebenenfalls abgelöste Zellen werden in dieser Phase wieder angesiedelt.
In dem darauffolgenden zweiten Zellkonditionierungsschritt mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 l/min werden die Endothelzellen mit entsprechend stärkeren Informationsreizen versorgt, um sich entsprechend diesen veränderten Strömungsbedingungen auszubilden und zu wachsen.
Nach einer weiteren Ruhe- und Wachstumsphase (Zwischeninkubation) ohne Strömungsbewegung der Zellsuspension, jedoch wahlweise bei einer Drehbewegung des Bioreaktors 2, folgt ein dritter Zellkonditionierungsschritt mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 l/min, an den sich wieder eine Nachinkubationsphase (Erholungs- und Wachstumsphase) anschließt.
Der gesamte zuvor beschriebene Vorgang der Zellbeschichtung in dem Bioreaktor 2 findet in einem Inkubator (nicht
«25 dargestellt) statt, in dem ständig eine Temperatur von 370C herrscht und eine Luftfeuchtigkeit von 98 % sowie ein CO2-Gehalt von 5 % aufrechterhalten werden. Der Zugang dieser Atmosphäre bzw. der entsprechenden Medien zum Bioreaktor 2 wird über mindestens ein semipermeables Membranventil 26 realisiert, das von außen gasdurchlässig ist, aber in umgekehrter Richtung nicht flüssigkeitsdurchlässig ist. Die Membranventile 26 können an einer geeigneten Stelle des Bioreaktors 2, z.B. in den Einsatzstücken 10, 11 oder auch in der Ringleitung 1 angeordnet sein.
Im Ergebnis dieses Prozesses der allmählichen Besiedlung und Ausbildung der Endothelzellen bei sich stufenweise erhöhender und dabei schonend und mit Lernfunktion auf die Zellen wirkender pulsierender Strömungsgeschwindigkeit mit zwischen- und nachgeschalteten Erholungs- und Wachstumsphasen wird unter physiologischen, den Funktionen des menschlichen Herzens entsprechenden Fließbedingungen auf der mit einer Submatrix aus Fibronectin versehenen Kollagen-Matrix der Bioprothese (Aortenklappe 8) eine geschlossene, einschichtige Endothelfläche aus körpereigenen Zellen gebildet, die der Endothelschicht an den Gefäß- und Klappenwänden des Prothesen-Empfängers hinsichtlich Form, Größe und Ansiedlung der Zellen sowie Stärke und Ebenflächigkeit der Zellschicht weitestgehend entspricht.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden somit Implantate für die Herz- und Gefäßchirurgie bereitgestellt, deren Anwendung nicht mit der Gefahr von Immunreaktionen und viralen Infektionen verbunden ist. Von wesentlicher Bedeutung gegenüber dem nächstliegenden Stand der Technik ist hier die Tatsache, daß die auf das Implantat aufgebrachte Zellschicht weitestgehend annähernd den physiologischen Vorgängen im menschlichen
'2 5 Organismus, hier der spezifischen Dynamik im Bereich des Herzens und der Gefäße, ausgebildet ist. Die mit der Vorrichtung erreichte Ausbildung der Endothelzellenschicht gewährleistet im implantierten Zustand der Bioprothese mit den natürlichen Verhältnissen übereinstimmende Strömungsverhältnisse, so daß die Verschleißerscheinungen deutlich minimiert und damit die Lebensdauer des Implantats erhöht werden kann.
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Bezugszeichenliste
1 Rmgleitung
2 Bioreaktor
3 Membranpumpe
4 Ausgleichskammer
5 Schlauchleitung (für 3)
6 Auslaßventil
7 Einlaßventil
8 Aortenklappe (Bioprothese)
9 Hohlzylinder
10 erstes Einsatzstück (in Strömungsrichtung vorn)
11 zweites Einsatzstück (in Strömungsrichtung
hinten)
12 Anschlußstut zen
13 Anschlußstutzen
14 Befestigungsabschnitt
15 Befestigungsabschnitt
16 Befestigungslöcher
17 Befestigungslöcher
18 Bundsteg von 11
19 erste Dichtung
20 Ringsteg von 9
21 Schraubring
22 Bund von 10
23 Schraubklappe
24 Füll- und Ablaßventil
25 Füll- und Ablaßventil
26 Membranvent i1
27 Zweite Dichtung

Claims (12)

1. Vorrichtung zur Herstellung von biologischen Prothesen aus dezellularisiertem allogenem bzw. xenogenem oder aus künstlichem Fremdmaterial, das mit körpereigenen Zellen beschichtet wird, insbesondere von Substituten für die Herz- und Gefäßchirurgie, gekennzeichnet durch eine Ringleitung (1) mit an diese zur Erzeugung eines pulsierenden Flüssigkeitsstromes veränderlicher Geschwindigkeit angeschlossener Pumpe (3) und einen in die Ringleitung (1) lösbar eingebundenen Bioreaktor (2), in dem das zu behandelnde Implantatmaterial (8) in Durchströmungsrichtung der Zellsuspension axial angeordnet und unter Vorspannung fixierbar ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Bioreaktor (2) aus einem Hohlzylinder (9) mit an dessen gegenüberliegenden Stirnseiten lösbar und abdichtend gehaltenen Einsatzstücken (10, 11) gebildet ist, wobei die Einsatzstücke (10, 11) jeweils einen verschließbaren oder an die Ringleitung (1) anschließbaren Anschußstutzen (12, 13) sowie einen Befestigungsabschnitt (14, 15) zum beidseitigen zentrischen Fixieren der Bioprothese (8) im Hohlzylinder (9) aufweisen.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Befestigungsabschnitte (14, 15) kreisringförmig ausgebildet und mit am Umfang verteilten Befestigungslöchern (16, 17) zum Annähen der zu beschichtenden Bioprothese (8) versehen sind.
4. Vorrichtung nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Einsatzstück (10) von innen und das andere Einsatzstück (11) von außen mit einem Befestigungsmittel (21, 23) an dem Hohlzylinder (9) gehalten ist und beide Einsatzstücke (10, 11) in der gleichen Richtung in den Hohlzylinder (9) einführbar bzw. aus diesem entnehmbar sind.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Befestigungsmittel als Schraubring (21), dessen Innengewinde mit einem am Einsatzstück (10) vorgesehenen Außengewinde in Eingriff steht, bzw. als am Umfang des Hohlzylinders (9) verschraubbare Schraubkappe (23) ausgeführt sind.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß in die Ringleitung (1) Füll- und Ablaßventile (24, 25) zum Zuführen der Zellsuspension in den Bioreaktor (2) für die Beschichtung der Kollagen- Matrix mit körpereigenen Zellen des Empfängers bzw. zum Abziehen des Mediums aus dem Bioreaktor (2) und der Ringleitung (1) eingebunden sind.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch deren Anordnung in einem Inkubator, wobei in dem Bioreaktor (2) und/oder der Ringleitung (1) ein von außen gasdurchlässiges und von innen für Flüssigkeiten undurchlässiges semipermeables Membranventil (26) bzw. eine Membran zum Gasaustausch mit der Atmosphäre im Inkubator vorgesehen ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in Strömungsrichtung hinter dem Bioreaktor (2) in die Ringleitung (1) eine Ausgleichskammer (4) zum Ausgleich der Druckspitzen des pulsierenden Flüssigkeitsstroms eingebunden ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pumpe (3) eine Membranpumpe ist und ein Auslaß- und ein Einlaßventil (6, 7) aufweist, wobei das Auslaßventil (6) bei der Herstellung von Herzklappenprothesen entfällt.
10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mit den körpereigenen Zellen in Berührung kommenden Bauteile aus einem der Zellhaftung entgegenstehenden, biologisch abstoßenden Material bestehen.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Einsatzstücke (10, 11) aus Teflon bestehen und der Hohlzylinder (9) aus Piacryl gebildet ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Ringleitung (1) aus flexiblem Material, beispielsweise Silikon, besteht.
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