DE19913862C2

DE19913862C2 - Process for the biocatalyzed conversion of poorly water-soluble substances

Info

Publication number: DE19913862C2
Application number: DE1999113862
Authority: DE
Inventors: Guenther Schmitz; Rald Takors; Dirk Weuster-Botz; Christian Wandrey
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2003-04-10
Anticipated expiration: 2019-03-27
Also published as: DE19913862A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umsetzung von in Wasser schwer löslichen Verbindungen in einem wässrigen Milieu mittels eines Biokatalysators.The invention relates to a method for the implementation of sparingly soluble in water Compounds in an aqueous environment using a biocatalyst.

Die Umsetzung schlecht wasserlöslicher Substrate mit biologischen Systemen ist im einfachen Satzreaktor meist unökonomisch, wenn aufgrund geringer Wasserlöslichkeit nur geringe Substratkonzentrationen vorgelegt und damit geringe Produktkonzentrationen erreicht werden. Dies gilt gleichermaßen für eine Umsetzung mit einem zellfreien System, wobei die Umsetzung mit reinen Enzymen durchgeführt wird, als für eine Umsetzung mit bestimmten ausgesuchten Zellen.The implementation of poorly water-soluble substrates with biological systems is in the simple batch reactor mostly uneconomical, if due to less Water solubility presented only low substrate concentrations and thus low product concentrations can be achieved. This applies equally to one Implementation with a cell-free system, the implementation with pure Enzymes are carried out as for implementation with certain selected cells.

Eine erste Verbesserung sieht vor, das Verfahren kontinuierlich mit Rückhaltung des Katalysators im Reaktionsraum durchzuführen. Diese Ausführung führt zu einer Verbesserung der Produktivität durch eine entsprechende Erhöhung der Raum-Zeit-Ausbeute und dadurch zu einer Verringerung der Kapitalkosten. Die Produktkonzentration im Reaktionsraum bleibt jedoch weiterhin niedrig. Darüberhinaus muß unter Umständen noch eine Abtrennung des nicht umgesetzten Restsubstrates vom Produkt erfolgen.A first improvement provides for the process to be continued with restraint perform the catalyst in the reaction chamber. This execution leads to an improvement in productivity by a corresponding increase in Space-time yield and thereby a reduction in the cost of capital. The However, product concentration in the reaction space remains low. In addition, it may not be necessary to separate the implemented residual substrate from the product.

Daher sieht eine weitere Verbesserung vor, dem Reaktionssystem üblicherweise eine organische Phase als zweite nichtmischbare Flüssigphase zuzusetzen (z. B. DE-A-44 36 149 und DE-A-39 13 367). Diese organische Flüssigphase wird so gewählt, dass aufgrund des Verteilungskoeffizienten des Substrates zwischen organischer Phase und Wasserphase keine Übersättigung der wässrigen Phase eintreten kann, in der die Reaktion stattfindet. Die organische Phase stellt also ein Substratreservoir dar. Gleichzeitig dient diese nicht mischbare organische Phase zur Extraktion des bei der Reaktion gebildeten Produktes. Durch eine 'Mixer-Settler'-Anordnung wird die organische Phase nach Ablauf der Reaktion von der wässrigen Phase mit dem Biokatalysator getrennt. In der organischen Phase können damit hohe Produktkonzentrationen erreicht werden. Der Auswahl der organischen Phase ist dabei selbstverständlich nicht frei, sondern wird durch das Löslichkeitsverhalten der umzusetzenden Verbindung vorgegeben.Therefore, there is a further improvement, usually the reaction system add an organic phase as a second immiscible liquid phase (e.g. DE-A-44 36 149 and DE-A-39 13 367). This organic liquid phase becomes like this chosen that due to the distribution coefficient of the substrate between organic phase and water phase no oversaturation of the aqueous phase can occur in which the reaction takes place. So the organic phase represents a substrate reservoir. At the same time, this serves as immiscible organic Extraction phase of the product formed in the reaction. By a 'Mixer-settler' arrangement becomes the organic phase after the reaction separated from the aqueous phase with the biocatalyst. In the organic In this phase, high product concentrations can be achieved. The selection the organic phase is of course not free, but is by predefined the solubility behavior of the connection to be implemented.

Die Verwendung einer organischen Phase, die ideale Verteilungskoeffizienten für Substrat und Produkt ermöglicht, führt jedoch oft zu einer Zerstörung des biologischen Katalysators in der wässrigen Phase. Sowohl Proteine als auch intakte Zellen reagieren sehr empfindlich auf das Vorhandensein nicht- physiologischer Komponenten in ihrem Umfeld und bereits relativ geringe Mengen organischer Lösungsmittel können eine Denaturierung der Proteine oder eine Abnahme der Vitalität der Zellen hervorrufen. Zur Lösung dieses Problems wird deswegen versucht, durch den Einsatz von Membranverfahren einen direkten Kontakt zwischen Biokatalysator und organischer Phase zu verhindern (gemäß DE-C-35 33 615 und US-A-5,077,217). Die Bereitstellung einer großen Phasentrennfläche ist jedoch umständlich und scheidet dadurch sogar völlig aus, wenn das Verfahren in größerem Maßstab betrieben werden soll.The use of an organic phase, the ideal distribution coefficient for Enables substrate and product, but often leads to destruction of the biological catalyst in the aqueous phase. Both proteins and intact cells are very sensitive to the presence of non- physiological components in their environment and already relatively small Amounts of organic solvents can denaturate the proteins or cause a decrease in the vitality of the cells. To solve this problem is therefore attempted by using membrane processes to prevent direct contact between the biocatalyst and the organic phase (according to DE-C-35 33 615 and US-A-5,077,217). The provision of a large phase separation area is cumbersome and even separates completely out if the process is to be operated on a larger scale.

Ein anderer Ansatz zur Bereitstellung von schlecht wasserlöslichem Substrat ist die Suspendierung des Substrates als mikrokristalliner Feststoff im wässrigen Reaktionsmedium ('mikrokristalline Feststoff-Fermentation'). Das während der Reaktion gebildete Produkt fällt in der Regel ebenfalls im Reaktor aus, so dass nach vollständigem Umsatz lediglich eine Fest-Flüssig- und eine Fest-Fest- Trennung durchgeführt werden muss, um das Produkt zu erhalten. Dieses Verfahren ist jedoch nicht anwendbar, wenn das gebildete Produkt bei Konzentrationen unterhalb der Sättigungsgrenze für den Biokatalysator toxisch ist und ist auch wenig praktikabel, wenn bei der Reaktion eine Produkthemmung eintritt. Another approach to providing poorly water soluble substrate is that Suspension of the substrate as a microcrystalline solid in aqueous Reaction medium ('microcrystalline solid fermentation'). That during the The reaction product usually also precipitates in the reactor, so that after complete sales, only one solid-liquid and one solid-solid Separation must be done to get the product. This However, the method is not applicable if the product formed Concentrations below the saturation limit for the biocatalyst is toxic and is also not very practical if the reaction inhibits the product entry.

Es steht somit kein befriedigendes Verfahren zur Verfügung, um schlecht in Wasser lösliche Verbindungen mit Einsatz biologischer Hilfsmittel umzusetzen. Ein solches Verfahren wird jedoch als sehr wünschenswert angesehen, da die rein chemischen Umsetzungen, die selbstverständlich unter Einsatz sämtlicher verfügbarer organischer Lösungsmittel durchgeführt werden können, häufig nicht die gewünschte Reaktionsselektivität besitzen, was z. B. bei stereoselektiven Synthesen einen großen Nachteil darstellen kann. Außerdem wird man in solchen Fällen, wo das Produkt der Umsetzung an Versuchstieren oder Menschen verabreicht werden soll, sicherlich ein Herstellverfahren, das ohne Einsatz möglicherweise toxischer Lösungsmittel auskommt, bevorzugen.There is therefore no satisfactory procedure available to get bad in Implement water-soluble compounds using biological aids. A however, such a process is considered very desirable since it is pure chemical implementations, of course, using all available organic solvents can often be performed have the desired reaction selectivity, which z. B. in stereoselective Syntheses can be a major disadvantage. You will also be in such cases where the product of implementation on experimental animals or People should be administered, certainly a manufacturing process, without Prefer to use potentially toxic solvents.

Es war die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Umsetzung einer ersten, schlecht in Wasser löslichen Verbindung (Substrat) in eine zweite Verbindung (Produkt) verfügbar zu stellen, das unter Einsatz biologischer Hilfsmittel abläuft und zu einer akzeptablen Ausbeute führt. Das Verfahren soll insbesondere geeignet sein, in technischem Maßstab benutzt zu werden. Außerdem soll das Verfahren sich zur Herstellung von jeglichen Produkten eignen, wobei es z. B. keine Rolle spielt, ob diese Produkte mehr oder weniger toxisch für den Biokatalysator sind.It was the object of the present invention, a method for implementation a first, poorly water-soluble compound (substrate) into a second To provide the compound (product) using biological aids expires and leads to an acceptable yield. The procedure is supposed to be particularly suitable to be used on an industrial scale. In addition, the process is intended to manufacture any product are suitable, z. B. does not matter whether these products more or less are toxic to the biocatalyst.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Patentanspruch 1 gelöst.This object is achieved by the method according to claim 1 solved.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass eine Trennung der Bestandteile des Verfahrens vorgenommen wird, wobei die erste Verbindung und der Biokatalysator in dem Bioreaktor verbleiben und die zweite Verbindung aus dem Bioreaktor ausgeschieden wird, und wobei die erste Verbindung als mikrokristalline Kristalle vorliegt.The object is achieved in that a separation of the components of the Procedure is made, the first connection and the Biocatalyst remain in the bioreactor and the second compound from the Bioreactor is excreted, and being the first compound as microcrystalline crystals are present.

Ausgangspunkt im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Umsetzung von schlecht in Wasser löslichen Verbindungen. Dabei ist keine Grenze zur Löslichkeit der ersten Verbindung in Wasser anzugeben. Es ist offensichtlich, dass bei Durchführung des Verfahrens in großtechnischem Maßstab bereits eine relativ geringfügige Einschränkung der Ausbeute durch verminderte Löslichkeit nicht hinnehmbar ist, wohingegen im Labormaßstab eine solche Einschränkung u. U. noch toleriert werden kann.The starting point in the method according to the invention is the implementation of poorly water-soluble compounds. There is no limit to solubility to indicate the first compound in water. It is obvious that at Carrying out the process on an industrial scale is already a relative not a slight restriction of the yield due to reduced solubility Is acceptable, whereas on the laboratory scale such a restriction u. U. can still be tolerated.

Die in Wasser schlecht löslichen Verbindungen sind als Gruppe nicht in irgendeiner Weise eingeschränkt. Sämtliche Verbindungen kommen im erfindungsgemäßen Verfahren grundsätzlich in Betracht. Bedarf kann in einer Reihe von theoretisch denkbaren Umständen angenommen werden. Es gibt viele Fälle, wo die reine Chemie zur Umsetzung einer ersten Verbindung in eine bestimmte weitere Verbindung versagt, weil aus irgendwelchen Gründen die Reaktion eine zu geringe Ausbeute aufweist, oder im Bioreaktor eine Mischung von Produkten und/oder Ausgangsverbindungen entsteht, welche sich unter Einsatz üblicher Verfahren und Hilfsmittel einer Aufreinigung verschließt. Es ist insbesondere bei Herstellungen die eine ganz bestimmte Konfiguration des Moleküls ansteuern, wie z. B. bei einer stereoselektiven Herstellung, manchmal ein unlösbares Problem, eine solche Herstellung befriedigend ablaufen zu lassen. Außerdem ist immer zu beachten, dass ein Verfahren gebraucht wird, das auch industriell anwendbar ist und deswegen keine unnötig aufwendigen und komplizierten Schritte aufweisen soll.The compounds which are poorly soluble in water are not in as a group restricted in any way. All connections come in method according to the invention in principle. Can be in one A range of theoretically conceivable circumstances can be assumed. There is many cases where the pure chemistry to convert a first compound into one certain further connection fails because for some reason the Reaction has too low a yield, or a mixture in the bioreactor of products and / or starting compounds, which can be found under Uses customary methods and cleaning aids. It is especially in the manufacture of a very specific configuration of the Control molecule, such as B. in a stereoselective production, sometimes a insoluble problem to make such a production run satisfactorily. In addition, it should always be noted that a process is needed that also is industrially applicable and therefore not unnecessarily complex and complicated steps.

Es besteht desweiteren ein praktischer Bedarf, Metabolite von Arzneimitteln herstellen zu können. Solche Metabolite können z. B. dann von Interesse sein, wenn man sich von diesen Metaboliten eine andere therapeutische Wirkung oder eine Verbesserung der therapeutischen Breite verspricht oder wenn durch Anwendung der Metabolite eine Verbesserung der Aufnahme im Körper des Patienten bewirkt werden kann. Neben diesen Möglichkeiten, wo im Grunde der Metabolit selbst als Arzneimittel untersucht und weiterentwickelt werden soll, gibt es noch einen weiteren Bedarf, wo es sich um gezielte pharmakokinetische und toxikologische Untersuchungen innerhalb der Arzneimittelentwicklung handelt. Fragen nach besondere Eigenschaften der Metaboliten gehören allmählich zum Standardpaket einer Arzneimittelentwicklung und es ist eine ganz besondere Anforderung an einer Entwicklungsabteilung, die gewünschten Mengen der Metabolite bereitzustellen. Insbesondere solche Fragestellungen können im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wesentlich einfacher und mit weniger Aufwand aufgegriffen werden.There is also a practical need for drug metabolites to be able to manufacture. Such metabolites can e.g. B. then be of interest if you look at these metabolites a different therapeutic effect or promises to improve the therapeutic range or if by Use of the metabolites improves absorption in the body of the body Patient can be effected. In addition to these options, where basically the Metabolite itself is to be investigated and developed as a drug there is another need where it is targeted pharmacokinetic and toxicological studies within drug development. Questions about special properties of the metabolites are gradually being asked to the standard package of a drug development and it's a whole special requirements for a development department, the desired ones Provide amounts of metabolites. Such questions in particular can be much easier in the context of the inventive method and can be taken up with less effort.

Die erste, schlecht in Wasser lösliche Verbindung liegt im Bioreaktor in teilweise festem Zustand vor. Dies ist logischerweise bedingt durch seine Eigenschaft der schlechten Löslichkeit in Wasser und durch die Tatsache, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine solche Ausführungsform aufweist, dass eine Berührung mit organischen Lösungsmitteln weitgehend ausgeschlossen ist. Die Möglichkeit, im Bioreaktor oder in einer dem Bioreaktor zugeordneten Anordnung eine zweite flüssige Phase vorzulegen, welche eine flüssige Phase auf der Grundlage eines organischen Lösungsmittels ist, wird im erfindungsgemäßen Verfahren bewusst umgangen. Es ist jedoch offensichtlich, dass eine Vorgehensweise, wo dem Bioreaktor die erste Verbindung einfach zugesetzt wird, dann zu weniger ansprechenden Ergebnissen führt, wenn lediglich eine äußerst niedrige Konzentration im wässrigen Milieu erzielt wird. Aus diesem Grund sieht das erfindungsgemäße Verfahren vor, dass die erste Verbindung im wässrigen Milieu in mikrokristalliner Form vorliegt. Als Mikrokristalle werden üblicherweise feste Partikel bezeichnet, die eine Korngröße im Bereich von 1 bis 30 µm aufweisen. Wenn die erste Verbindung im wässrigen Milieu eine Korngröße in diesem Bereich aufweist, wird überraschenderweise beobachtet, dass die Umsetzung der ersten Verbindung in die zweite Verbindung wesentlich schneller und mit einer größeren Ausbeute abläuft.The first, poorly water-soluble compound is partially in the bioreactor solid state before. This is logically due to its property poor solubility in water and by the fact that that The inventive method has such an embodiment that a Contact with organic solvents is largely excluded. The Possibility in the bioreactor or in an arrangement assigned to the bioreactor submit a second liquid phase, which has a liquid phase on the The basis of an organic solvent is in the invention Procedure deliberately avoided. However, it is obvious that one Procedure where the first compound is simply added to the bioreactor, leads to less appealing results if only one extremely low concentration is achieved in the aqueous environment. Because of this, looks the inventive method that the first compound in the aqueous Milieu in microcrystalline form. Usually used as microcrystals solid particles referred to, which have a grain size in the range of 1 to 30 microns exhibit. If the first compound in the aqueous medium has a grain size in this range, it is surprisingly observed that the Implementation of the first connection into the second connection is much faster and runs with a greater yield.

Das erfindungsgemäße Verfahren sieht konkret vor, dass die erste schlecht in Wasser lösliche Verbindung mikrokristallin in dem wässrigen Milieu mit dem Biokatalysator suspendiert wird. Die Herstellung einer solchen Suspension kann mit geläufigen Methoden durchgeführt werden. Eine vorteilhafte Art der Zugabe des Substrates in einen Reaktor kann die Verwendung eines vollständig mit Wasser mischbaren Lösungsmittels darstellen, in dem die erste Verbindung gut lösbar ist. Durch Zugabe eines kleinen Lösungsmittelpulses mit dem gelösten Substrat in einen Bereich höchster Turbulenz im Reaktor wird das mit Wasser vollständig mischbare Lösungsmittel schlagartig verteilt. Dabei fällt das zuvor gelöste Substrat im Reaktor mikrokristallin aus. Diese Zugabe, welche manuell oder gemäß einer bevorzugten Ausführungsform rechnergesteuert durchgeführt werden kann, hat sich als sehr effektiv und gut durchführbar erwiesen. Es widerspricht zwar dem Ziel des erfindungsgemäßen Verfahrens, um ohne organische Lösungsmittel auszukommen, aber es hat sich gezeigt, dass die erforderliche Menge des organischen Lösungsmittels gering ist und die schlagartige Verteilung in dem wässrigen Milieu zu einer äußerst niedrigen Konzentration des organischen Lösungsmittels in dem wässrigen Milieu führt. Aus diesem Grund stellt die Anwesenheit des organischen Lösungsmittels keine Belastung des Verfahrens dar. Sollte trotzdem im Rahmen eines bestimmten Prozesses für die Herstellung der mikrokristallinen Suspension eine größere Menge eines unverträglichen Lösungsmittels erforderlich sein, hat der Fachmann immerhin die Möglichkeit zunächst die Suspension der mikrokristallinen ersten Verbindung herzustellen und im zweiten Schritt, also bevor der Biokatalysator zugefügt wird, das organische Lösungsmittel zu entfernen oder zumindest seine Konzentration auf einem akzeptablen Niveau zu reduzieren. Da dieser Schrift das Verfahren jedoch kompliziert, sieht diese bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens jederzeit vor, zur Herstellung der mikrokristallinen Suspension eine Lösung der ersten Verbindung in einem verträglichen Lösungsmittel vorzulegen.The method according to the invention specifically provides that the first is poor in Water-soluble compound microcrystalline in the aqueous medium with the Biocatalyst is suspended. The preparation of such a suspension can be carried out using common methods. An advantageous way of adding of the substrate in a reactor can use a completely with Water miscible solvent in which the first compound is good is solvable. By adding a small pulse of solvent with the dissolved The substrate in an area of maximum turbulence in the reactor becomes water completely miscible solvents suddenly distributed. That falls before dissolved substrate in the reactor microcrystalline. This encore, which is manual or, according to a preferred embodiment, computer-controlled has proven to be very effective and workable. It contradicts the aim of the method according to the invention, without get along with organic solvents, but it has been shown that the required amount of the organic solvent is small and the abrupt distribution in the watery environment to an extremely low one Concentration of the organic solvent in the aqueous medium leads. Out for this reason, the presence of the organic solvent is not an issue Burden of the procedure. Should nevertheless within the framework of a certain Process for the production of the microcrystalline suspension a larger amount of an incompatible solvent must be known to the person skilled in the art after all, the possibility of initially suspending the microcrystalline first Establish connection and in the second step, i.e. before the biocatalyst is added to remove the organic solvent or at least its Reduce concentration to an acceptable level. Because of this writing However, the process complicates this preferred embodiment of the Process according to the invention at any time before, for the production of the microcrystalline Suspension a solution of the first compound in a compatible Submit solvent.

Die Umsetzung der ersten schlecht in Wasser löslichen Verbindung wird im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem biologischen System (Biokatalysator) durchgeführt. Der Biokatalysator kann ein bestimmtes Enzym oder eine Kombination mehrerer Enzyme sein. Diese meist einfache Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ohne Anwesenheit von Ganzzellen hat viele praktische Vorteile, wird jedoch häufig nicht zum gewünschten Erfolg führen, wenn es mehr komplizierte Umsetzungen betrifft. Ein solcher Biokatalysator kann im Rahmen der Erfindung ebenfalls ein System sein, das bestimmte Zellen umfasst. Dabei wird die Auswahl der Zellen sich nach der Fragestellung richten. Wenn das Verfahren mit Mikroorganismen durchführbar ist, wie z. B. mit Bakterien, Pilzen oder Hefen, wird es viele Vorteile haben, diese Variante zu wählen. Es gibt jedoch genausogut die Überlegung zur Durchführung des Verfahrens pflanzliche Zellen oder Zellen tierischen Ursprungs zu wählen. Es wurde bereits vorstehend erwähnt, dass eine Anwendung zur Herstellung von Metaboliten von Arzneimitteln im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens nahe liegt. Eine solche Herstellung kann naturgemäß hervorragend mit den natürlichen metabolisierenden Zellen, wie z. B. Leberzellen von Mensch oder Tier, durchgeführt werden.The implementation of the first poorly water-soluble compound is in Framework of the method according to the invention with a biological system (Biocatalyst). The biocatalyst can be a specific enzyme or a combination of several enzymes. This is mostly simple Embodiment of the method according to the invention without the presence of Whole cells have many practical advantages, but often do not become desired success if it concerns more complicated implementations. A such a biocatalyst can also be a system within the scope of the invention, that includes certain cells. The selection of cells will change according to the Direct question. If the procedure can be carried out with microorganisms is how B. with bacteria, fungi or yeast, there will be many advantages to this Choose variant. However, there is also the consideration of the Carrying out the process of plant cells or cells of animal origin to choose. It has already been mentioned above that an application for Manufacture of metabolites of drugs under the inventive method is obvious. Such manufacture can naturally excellent with the natural metabolizing cells, such as e.g. B. liver cells of humans or animals.

Es ist außerdem davon auszugehen, dass die Verbesserung der gentechnologischen Verfahren zu weiteren Möglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens führen wird.It can also be assumed that the improvement in genetic engineering methods for further possibilities of method according to the invention will perform.

Die erste, in Wasser schwer lösliche Verbindung wird durch den Biokatalysator in eine zweite Verbindung umgesetzt. Die Art der Umsetzung ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht in irgendwelcher Weise eingeschränkt. Es kann sich somit um jede mit Biokatalysatoren durchführbare Reaktion handeln. Da das erfindungsgemäße Verfahren als Merkmal aufweist, dass eine in Wasser schwer lösliche Verbindung umgesetzt wird, wird die zweite Verbindung häufig eine mehr polare Verbindung sein, welche durch einen oxidativen Reaktionsvorgang aus der ersten Verbindung entstanden ist. Es sind jedoch ebenfalls Reaktionen denkbar, wo die zweite Verbindung die gleiche Polarität wie die erste Verbindung aufweist und die Löslichkeit in Wasser sich u. U. nicht verändert hat. Es wird im Rahmen der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens von einer ersten, schwer in Wasser löslichen Verbindung gesprochen, welche das Ausgangsprodukt im Verfahren darstellt und somit auch als Substrat bezeichnet werden kann. Diese erste Verbindung wird durch den Biokatalysator in eine zweite Verbindung umgesetzt. Diese zweite Verbindung ist die Verbindung, welche am Ende des Verfahrens aus dem Bioreaktor gewonnen wird. Es ist demnach nicht erforderlich, dass die zweite Verbindung in einem einzelnen Schritt aus der ersten Verbindung entstanden ist, es ist in vielen Fällen sogar bekannt, dass die Umsetzung eine Kette von einzelnen Schritten umfasst, wobei die erste Verbindung demnach zunächst in eine andere Verbindung umgesetzt wird bevor am Ende des Verfahrens die zweite Verbindung gebildet wird. Auch solche Reaktionen werden jedoch ausdrücklich vom erfindungsgemäßen Verfahren umfasst.The first compound that is poorly soluble in water is the biocatalyst in implemented a second connection. The type of implementation is within the The method according to the invention is not restricted in any way. It can therefore be any reaction that can be carried out with biocatalysts. Since the method according to the invention has the feature that one in water poorly soluble connection is implemented, the second connection is common be a more polar compound, which is characterized by an oxidative Reaction process has arisen from the first connection. However, there are reactions also conceivable where the second connection has the same polarity as the first compound has and the solubility in water u. May not has changed. It is within the scope of the description of the invention Spoken of a first, sparingly water-soluble compound, which is the starting product in the process and therefore also as a substrate can be designated. This first connection is through the biocatalyst implemented in a second connection. This second connection is the Compound obtained from the bioreactor at the end of the process becomes. It is therefore not necessary for the second connection to be in one single step has arisen from the first connection, it is in many cases even known that the implementation involves a chain of individual steps, the first connection accordingly first into another connection is implemented before the second connection is formed at the end of the process becomes. However, such reactions are also expressly from method according to the invention comprises.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem Bioreaktor durchgeführt. Als Bioreaktor werden die Behältnisse bezeichnet, in denen biologische Umsetzungen mit Biokatalysatoren durchgeführt werden. Bioreaktoren sind speziell entworfen, um die erforderlichen optimalen Bedingungen für die Umsetzung herzustellen. Jeder Biokatalysator benötigt sehr spezifische Bedingungen hinsichtlich Temperatur, pH-Wert und Nährstoffkonzentration und der Bioreaktor ist mit solchen Hilfsmitteln ausgestattet, um diese Bedingungen optimal erfüllen zu können. Der Bioreaktor ist üblicherweise mit einem Rührsystem ausgestattet, um eine gute Vermischung der Bestandteile zu gewährleisten, mit einem Wärmetransportsystem um die optimale Temperatur einstellen zu können und mit Mitteln um Nährstoffe und Sauerstoff zuzuführen. Außerdem kann es erforderlich sein, den Bioreaktor mit Hilfsmitteln auszustatten, welche es ermöglichen, das Verfahren steril durchzuführen, was insbesondere bei Verfahren die mit Ganzzellsystemen durchgeführt werden, üblicherweise eine Anforderung sein wird. Auch die Auswahl des Trennverfahrens spielt eine Rolle bei der genauen Ausgestaltung des Bioreaktors.The process according to the invention is carried out in a bioreactor. As Bioreactor are the containers in which biological Reactions are carried out with biocatalysts. Are bioreactors specially designed to provide the necessary optimal conditions for the To implement implementation. Every biocatalyst needs very specific ones Conditions regarding temperature, pH and nutrient concentration and the bioreactor is equipped with such aids to meet these conditions to be able to fulfill optimally. The bioreactor is usually one Mixing system equipped to ensure good mixing of the ingredients ensure with a heat transfer system at the optimal temperature to be able to adjust and with means to supply nutrients and oxygen. It may also be necessary to equip the bioreactor with aids which make it possible to carry out the process in a sterile manner, which in particular in processes that are carried out with whole cell systems, usually one Requirement will be. The selection of the separation process also plays a role in the exact design of the bioreactor.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird naturgemäß in einem wässrigen Milieu durchgeführt werden. Ein wässriges Milieu kann demineralisiertes Wasser, destilliertes Wasser, Leitungswasser oder gepuffertes Wasser sein, üblicherweise jedoch wird im Rahmen der Erfindung eine Nährlösung benutzt werden, die Wasser als flüssige Phase aufweist, aber ein Reihe von Komponenten aufweist, die zur optimalen Funktion der Zellen erforderlich sind. Zur Instandhaltung einer gleichbleibenden Produktivität einer Zellkultur wird es erforderlich sein, dem Milieu, welches die Zellen enthält, eine konstante Zusammensetzung zu verschaffen. Dabei ist auf einen pH-Wert innerhalb eines bestimmten kleinen Rahmens zu achten, sowie auf die permanente Anwesenheit ausreichender Mengen an Grundstoffen, und es ist ebenfalls zu gewährleisten, dass bestimmte Stoffwechselprodukte ständig aus dem Milieu entfernt werden. Verfahren und Mittel, um konstante Bedingungen im Verfahren einzuhalten, sind dem Biotechnologen bekannt und werden nicht weiter erörtert werden.The process according to the invention is naturally carried out in an aqueous environment be performed. An aqueous environment can contain demineralized water, distilled water, tap water or buffered water, usually however, a nutrient solution will be used within the scope of the invention, the Has water as the liquid phase but has a number of components which are necessary for the optimal functioning of the cells. To maintain a constant productivity of a cell culture will require that Milieu, which contains the cells, a constant composition procure. Doing so is at a pH within a certain small Framework, as well as the permanent presence of sufficient Amounts of raw materials, and it is also necessary to ensure that certain Metabolic products are constantly removed from the milieu. Procedure and The means to maintain constant conditions in the process are Biotechnologists are known and will not be discussed further.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur biokatalysierten Umsetzung schlecht wasserlöslicher Substanzen zeichnet sich dadurch aus, dass das Substrat in dem wässrigen Reaktionsmedium mit dem Biokatalysator suspendiert wird und eine Trennung der Bestandteile im Verfahren vorgenommen wird. Die erste, in Wasser schlecht lösliche Verbindung und der Biokatalysator verbleiben im Bioreaktor, während die zweite Verbindung aus dem Bioreaktor ausgeschieden wird. Diese Maßnahme stellt eine überraschende Verbesserung der bekannten Verfahren dar und führt zu erheblich höheren Ausbeuten der gebildeten zweiten Verbindung. Es ist an sich keine unbekannte Maßnahme im Rahmen biotechnologischer Prozesse, Endprodukte aus dem Reaktor zu entfernen, wie z. B. bei der Herstellung von Produkten, die selber eine negative Auswirkung auf den Reaktionsablauf haben. Bei diesen bekannten Verfahren liegt die Notwendigkeit und der Vorteil der Entfernung der zweiten Verbindung primär in der Eigenschaft dieser zweiten Verbindung, einen Einfluss auf die Reaktion im Reaktor auszuüben. Demgegenüber lässt sich der Vorteil der Abtrennung der zweiten Verbindung beim erfindungsgemäßen Verfahren bei solchen Umsetzungen feststellen, die von einer ersten, schlecht in Wasser löslichen und als mikrokristalline Kristalle vorliegenden Verbindung ausgehen.The process according to the invention for biocatalyzed conversion is poor Water-soluble substances are characterized in that the substrate in the aqueous reaction medium is suspended with the biocatalyst and a Separation of the components in the process is made. The first, in water poorly soluble compound and the biocatalyst remain in the bioreactor, while the second compound is excreted from the bioreactor. These Measure represents a surprising improvement of the known methods and leads to considerably higher yields of the second formed Connection. It is not an unknown measure in itself biotechnological processes to remove end products from the reactor, such as e.g. B. in the manufacture of products that themselves have a negative impact have the course of the reaction. In these known methods is the Necessity and advantage of removing the second connection primarily in the property of this second compound, an influence on the reaction in the Exercise reactor. In contrast, the advantage of separating the second compound in the method according to the invention in such Find implementations from an initial, poorly water soluble and go out as microcrystalline crystals present compound.

Die Trennung der im Bioreaktor vorliegenden Bestandteile ist ein wesentlicher Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Dabei ist vorgesehen eine Trennung der zweiten Verbindung von den weiteren Bestandteilen im Bioreaktor, insbesondere von dem Biokatalysator und der ersten Verbindung vorzunehmen. Die Trennung bietet daraufhin die Möglichkeit, die zweite Verbindung aus dem Bioreaktor auszuscheiden. Die erste Verbindung und der Biokatalysator verbleiben weiterhin in dem Bioreaktor. Es spricht von selber, dass diese Ausführungsform des Verfahrens sich am besten eignet in einem kontinuierlichen Prozess angewandt zu werden. Die umgekehrte Vorgehensweise, wobei die erste Verbindung und der Biokatalysator aus dem Bioreaktor ausgeschieden werden, kommt zwar grundsätzlich ebenso in Betracht, eignet sich jedoch weniger für eine kontinuierliche Durchführung. Das Verfahren kann jedoch jederzeit als einen einzigen Ansatz durchgeführt werden und bei Versuchsvorhaben, welche lediglich eine einmalige Herstellung einer bestimmten zweiten Verbindung vorsehen, gibt es auch keinen Grund, das Verfahren nicht als einziger Ansatz durchzuführen, aber es wird doch vermutet, dass die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sich am ehesten bei einer Anwendung in einem kontinuierlichen Prozess zeigen werden.The separation of the components present in the bioreactor is essential Part of the present invention. A separation of the second connection of the other components in the bioreactor, in particular of the biocatalyst and the first compound. The separation then offers the option of the second connection from the bioreactor to be eliminated. The first compound and the biocatalyst remain in the bioreactor. It goes without saying that this embodiment of the The process is best used in a continuous process to become. The reverse procedure, with the first connection and the biocatalyst is excreted from the bioreactor comes basically also considered, but less suitable for one continuous implementation. The procedure can, however, at any time as one single approach and in the case of experimental projects, which only a one-time establishment of a certain second connection there is also no reason not to use the procedure as the only approach perform, but it is believed that the benefits of The method according to the invention is most likely to be used in one continuous process.

Durch die Ausscheidung der ersten Verbindung aus dem Bioreaktor wird ihre Konzentration auf einem ständig niedrigen Niveau gehalten, was für den Ablauf der Reaktion äußerst günstig ist. Es ist im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, dem Bioreaktor mit einem Erfassungssystem auszustatten, damit die Konzentration der zweiten Verbindung ständig überwacht werden kann. Es ist eine mehr bevorzugte Ausführungsform, dieses Erfassungssystem so auszubilden, dass die Erfassung on-line durchgeführt werden kann und die Regelung der Trennung automatisch gesteuert wird. Die on-line-Erfassung der zweiten Verbindung kann beliebig durchgeführt werden, bevorzugt wird ein apparativ einfaches Vorgehen, wie z. B. eine spektrophotometrische Erfassung der Konzentration der zweiten Verbindung. Kompliziertere Systeme sind jedoch ebenfalls denkbar und dem Fachmann stehen in der Literatur eine Reihe von Maßnahmen zur Verfügung.The first compound is eliminated from the bioreactor Concentration kept at a constantly low level, which is for the process the reaction is extremely favorable. It is under a preferred Embodiment provided, the bioreactor with a detection system equip so the concentration of the second compound is constant can be monitored. It is a more preferred embodiment of this Design the acquisition system so that the acquisition is carried out on-line can be and the regulation of the separation is controlled automatically. The on-line registration of the second connection can be carried out arbitrarily, an apparatus-simple procedure is preferred, such as e.g. Legs spectrophotometric detection of the concentration of the second compound. However, more complicated systems are also conceivable and the expert There are a number of measures available in the literature.

Die Art der Trennung kann beliebig ausgestaltet werden. Sie wird praktisch dadurch bedingt sein, wie sich im speziellen Fall die Eigenschaften der zweiten Verbindung von jenen der ersten Verbindung und dem Biokatalysator unterscheiden. Eine relativ einfache Trennung kann durchgeführt werden, wenn die zweite Verbindung ein verändertes Löslichkeitsprofil in Wasser zeigt, wobei dieses veränderte Löslichkeitsprofil im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens häufig eine Erhöhung der Löslichkeit in Wasser sein wird. Da die erste Verbindung in Wasser lediglich in sehr geringen Mengen vorliegt, kann für die Trennung der ersten Verbindung von der zweiten Verbindung ein Filtrationsverfahren gewählt werden, wobei das Filtrat in gelöster Form die zweite Verbindung aufweist und die Oberfläche des Filtermittels die dispergierten Teilchen der ersten Verbindung zurückhält. Da das Verfahren die erste Verbindung als Mikrokristalle vorsieht, muss selbstverständlich eine ausreichende Filtrationsleistung des Filtermittels beachtet werden. Ob bei dem Trennvorgang, insbesondere bei einem Filtrationsvorgang, der Biokatalysator ebenfalls mit der ersten Verbindung zusammen abgetrennt wird, wird dadurch bedingt ob dieser ebenfalls wie die erste Verbindung abtrennbar ist. Liegt der Biokatalysator als Mikroorganismus oder als Zellen vor, so wird er einfach mit der ersten Verbindung von der flüssigen Phase abgetrennt werden. Sogar wenn der Biokatalysator ein Enzym umfasst, welches nicht an feste Partikel gebunden ist, sondern frei gelöst in dem wässrigen Milieu vorliegt, scheidet eine Abtrennung durch Filtration nicht aus, muss jedoch eine spezielle Methode selektiert werden. Es müssen dann Filtermittel (Membrane) eingesetzt werden, die eine Trenngrenze unterhalb der Größe der eingesetzten Enzyme haben, wie Ultrafiltrationsmembrane mit einem entsprechenden cut-off, im Gegensatz zu Mikrofiltrationsmembranen. Entsprechendes gilt, wenn der Biokatalysator mehr als ein Enzym umfasst.The type of separation can be designed as desired. It becomes practical be dependent on how the properties of the second one differ in the special case Connection of those of the first compound and the biocatalyst differentiate. A relatively simple separation can be done if the second compound shows a changed solubility profile in water, where this changed solubility profile in the context of the invention Process will often be an increase in solubility in water. Because the first Compound in water is only present in very small amounts, for the Disconnect the first connection from the second connection Filtration process can be chosen, the filtrate in solution the second Has compound and the surface of the filter medium the dispersed Retains particles of the first compound. Since the procedure is the first Connection as microcrystals, of course, must be sufficient Filtration performance of the filter medium must be observed. Whether in the separation process, especially in a filtration process, the biocatalyst also with the first connection is disconnected depends on whether this also how the first connection can be disconnected. Is the biocatalyst as Microorganism or as cells, so it becomes easy with the first connection be separated from the liquid phase. Even if the biocatalyst is on Enzyme includes, which is not bound to solid particles, but freely dissolved in the aqueous environment, there is no separation by filtration a special method must be selected. Then it must Filter media (membrane) are used that have a separation limit below the Size of the enzymes used, such as ultrafiltration membrane with a corresponding cut-off, in contrast to microfiltration membranes. The same applies if the biocatalyst comprises more than one enzyme.

Eine Filtration stellt sicherlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine bevorzugte Ausführungsform zur Abtrennung der zweiten Verbindung dar. Filtrationsverfahren stellen generell in der Technik und insbesondere auch in biotechnologischen Verfahren eine gut bekannte und bevorzugte Methode dar und werden in vielen denkbaren Fällen als Mittel der Wahl angesehen werden. Die Ausführung der Filtration kann dabei als Oberflächenfiltration ausgestaltet sein, wobei allerdings die Bildung eines Filterkuchens im Rahmen eines kontinuierlichen Prozesses häufig keinen Vorteil darstellen wird, weshalb hier bevorzugt die Querstromfiltration angewandt wird, wobei eine Strömung parallel zur Filteroberfläche erzeugt wird und sich keinen Filterkuchen bildet. Es stellt ebenfalls eine bevorzugte Ausführungsform dar, als Filtrationsprinzip ein Rotationsfilter zu verwenden.Filtration is certainly a part of the present invention preferred embodiment for separating the second connection. Filtration processes generally apply in technology and especially in biotechnology is a well known and preferred method and will be seen as the means of choice in many conceivable cases. The filtration can be designed as surface filtration be, however, the formation of a filter cake in the context of a continuous process will often not be an advantage, which is why here cross flow filtration is preferably used, with a flow parallel is generated to the filter surface and no filter cake forms. It puts also represents a preferred embodiment as a filtration principle Use rotary filters.

Die Ausgestaltung des Bioreaktors wird durch das ausgewählte Trennverfahren stark beeinflusst werden. Bei einer Ausgestaltung als Filtration wird der Filtrationsvorgang üblicherweise in einem dem Bioreaktor zugeordneten Bypass durchgeführt werden. Bei der bevorzugten Querstrom-Filtration wird die wässrige Suspension an dem Filter in einem solchen Bypass vorbeigeführt. Demgegenüber kann ein Rotationsfilter direkt in der Flüssigphase des Bioreaktors installiert werden und wird die Anordnung des Bioreaktors keinen Bypass enthalten. Sieht das Verfahren ein Rotationsverfahren vor, so kann der Bioreaktor selbst als drehbare Zentrifuge ausgestaltet sein. Diese Anordnung des Bioreaktors enthält ebenfalls keinen Bypass.The design of the bioreactor is based on the selected separation process be strongly influenced. In the case of a configuration as a filtration, the Filtration process usually in a bypass assigned to the bioreactor be performed. In the preferred cross-flow filtration, the aqueous one Suspension past the filter in such a bypass. In contrast, a rotary filter can be used directly in the liquid phase of the bioreactor be installed and the arrangement of the bioreactor will not bypass contain. If the process provides for a rotation process, the bioreactor can itself be designed as a rotatable centrifuge. This arrangement of the Bioreactor also does not contain a bypass.

Die Abtrennleistung der Fest-Flüssig-Trennung muss mit Hilfe des Volumenstroms des abgetrennten wässrigen Reaktionsmediums mit dem gelösten Produkt so eingestellt werden, dass weder eine toxische Konzentration der zweiten Verbindung im Reaktor überschritten wird, noch eine Ausfällung des Produktes im Reaktor erfolgt.The separation performance of the solid-liquid separation must be based on the volume flow of the separated aqueous reaction medium with the dissolved product so be set that neither a toxic concentration of the second Connection in the reactor is exceeded, still a precipitation of the product in the Reactor takes place.

Eine Regelung des Volumenstroms des abgetrennten wässrigen Reaktionsmediums mit der gelösten zweiten Verbindung kann durch die online- Messung der Produktkonzentration im wässrigen Reaktionsmedium ermöglicht werden: Bei Überschreitung einer vorgegeben Grenzkonzentration wird der Volumenstrom des abgetrennten wässrigen Reaktionsmediums erhöht. Bei Unterschreitung wird dieser Volumenstrom reduziert.A regulation of the volume flow of the separated aqueous Reaction medium with the dissolved second compound can be Measurement of the product concentration in the aqueous reaction medium enables : If a specified limit concentration is exceeded, the Volume flow of the separated aqueous reaction medium increased. At If this is not reached, this volume flow is reduced.

Um eine sichere kontinuierliche Abtrennung von Biokatalysator und mikrokristallinem Substrat zu erreichen, müssen die physikalischen Eigenschaften auf denen die gewählte Fest-Flüssig-Trennung beruht, zwischen Biokatalysator und dem Substrat möglichst ähnlich sein.To ensure safe continuous separation of biocatalyst and To achieve microcrystalline substrate, the physical properties on which the selected solid-liquid separation is based, between biocatalyst and be as similar as possible to the substrate.

Wird eine Querstromfiltration zur kontinuierlichen Abtrennung eingesetzt, müssen die Partikelgrößen von Biokatalysator und Substrat oberhalb der Porengröße der verwendeten Membran liegen. If cross-flow filtration is used for continuous separation, the particle sizes of the biocatalyst and substrate above the pore size of the membrane used.

Wird ein Zentrifugalseparator, Sedimenter oder Dekanter zur kontinuierliche Abtrennung eingesetzt, müssen die Sinkgeschwindigkeiten von Biokatalysator und Substrat größer als die notwendige Grenzsinkgeschwindigkeit sein.Becomes a centrifugal separator, sediment or decanter for continuous Separation used, the sink rates of biocatalyst and substrate must be greater than the required limit sink rate.

Die aufkonzentrierten Feststoffe (Biokatalysator und Substrat) werden nach der Fest-Flüssig-Trennung in den Suspensionsreaktor zurückgeführt.The concentrated solids (biocatalyst and substrate) are after the Solid-liquid separation is returned to the suspension reactor.

Das abgetrennte wässrige Reaktionsmedium mit dem gelösten Produkt wird kontinuierlich abgeführt.The separated aqueous reaction medium with the dissolved product is continuously dissipated.

Um ein gewünschtes Reaktionsvolumen aufrecht zu erhalten, wird gleichzeitig ein entsprechender Volumenstrom Wasser für die Biokatalyse in den Suspensionsreaktor dosiert, wobei dem Wasser gegebenenfalls Nährstoffe oder Cosubstrate zugesetzt sein können.To maintain a desired reaction volume, simultaneously a corresponding volume flow of water for biocatalysis in the Suspension reactor metered, the water optionally nutrients or Co-substrates can be added.

Das erfindungsgemäße Verfahren ruft eine Reihe von Verbesserungen hervor. Nicht nur eignet sich das Verfahren zur Durchführung der Umsetzung von schlecht in Wasser löslichen Verbindungen, ebenfalls wird es möglich sein, das Verfahren einzusetzen, wenn eine erste Verbindung umgesetzt werden soll, welche stark toxische Eigenschaften besitzt, was bei der Anwendung von Mikroorganismen oder Zellen als Biokatalysator einen großen Nachteil darstellt. Bei einer solchen toxischen ersten Verbindung ist demnach das Problem nicht, dass keine höhere Konzentrationen im wässrigen Milieu erreichbar sind, sondern dass solche höhere Konzentrationen im Hinblick auf einen dauerhaften Betrieb der Umsetzung zu vermeiden sind.The method according to the invention produces a number of improvements. The method is not only suitable for carrying out the implementation of poorly water-soluble compounds, it will also be possible that Use procedures when a first connection is to be implemented, which has highly toxic properties, which is the result of the application of Microorganisms or cells as a biocatalyst is a major disadvantage. With such a toxic first compound, the problem is not that no higher concentrations can be reached in the aqueous environment, but that such higher concentrations with a view to permanent operation implementation should be avoided.

Ein weiterer Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt die Möglichkeit dar, relativ gut in Wasser lösliche Substrate vor der Umsetzung in eine schwer lösbare Form zu überführen, um diese kristallin im Reaktor zurückzuhalten. Eine Möglichkeit ist die Komplexierung gut in Wasser löslicher Substrate mit Cyclodextrinen. Ein solcher Komplex ist schwer in Wasser löslich. Das Verfahren wird in der Technik bereits eingesetzt, um in der Umwelttechnik toxische Verbindungen für Mikroorganismen verfügbar zu machen (siehe z. B. A. Schwartz, R. Bar; Appl. Environ. Microbiol. 61, 7 (1995): 2727-2731). Another aspect of the method according to the invention is the possibility substrates that are relatively soluble in water before being converted into a difficult to remove Transfer form to retain it crystalline in the reactor. A It is possible to complex substrates that are readily soluble in water Cyclodextrins. Such a complex is hardly soluble in water. The procedure is already used in technology to be toxic in environmental technology To make compounds available for microorganisms (see, for example, A. Schwartz, R. Bar; Appl. Environ. Microbiol. 61: 7 (1995): 2727-2731).

Auch die Möglichkeit, die das erfindungsgemäße Verfahren bietet, gleichzeitig den Biokatalysator und sein Substrat im Bioreaktor zurückzuhalten, ist sehr vorteilhaft. Insbesondere im Rahmen eines kontinuierlichen Verfahrens, wobei es das Ziel ist, über längere Zeiträume eine bestimmte Umsetzung vorzunehmen, wobei während des Verfahrens die Ausscheidung des Reaktionsprodukts vorgenommen wird, macht es keinen Sinn, ein Trennverfahren zu wählen, das auch eine Trennung von Biokatalysator und erster Verbindung hervorruft, weil diese beide Bestandteile im Verfahren ohnehin später wieder zusammengeführt werden müssen. Das Verfahren so auszugestalten, dass nur abgetrennt wird, was abgetrennt werden muss und zusammen lässt, was zusammen bleiben soll, entspricht nicht nur der Logik des Verfahrenstechnikers, sondern es vermeidet auch jegliche unnötige Verschwendung von Aufwand und Ressourcen.The possibility offered by the method according to the invention is also simultaneous holding back the biocatalyst and its substrate in the bioreactor is very advantageous. Especially in the context of a continuous process, where it the goal is to carry out a certain implementation over longer periods of time, wherein during the process the excretion of the reaction product it makes no sense to choose a separation method that also causes a separation of the biocatalyst and the first compound because these two components were later brought together again in the process anyway Need to become. To design the process so that it is only separated, what needs to be separated and leaves together, what should stay together, not only corresponds to the logic of the process engineer, but avoids it also any unnecessary waste of effort and resources.

Wenn bei einer Umsetzung eine toxische zweite Verbindung gebildet wird, hat das erfindungsgemäße Verfahren den großen Vorteil, auf einfacher Weise diese toxische Verbindung aus dem Bioreaktor abtrennen zu können. Es ist kein Problem, das Verfahren so auszugestalten, dass die Konzentration der toxischen zweiten Verbindung durch eine angepasste Regelung des Trennvorgangs, welcher, wie vorstehend ausgeführt, geschickterweise durch eine on-line- Überwachung gesteuert wird, unterhalb eines vorgegebenen niedrigen Wertes zu halten. Es ist offensichtlich, dass dabei diese ausgesprochen nützliche Möglichkeit sogar angewandt werden kann, wenn sowohl erste wie zweite Verbindung wasserlöslich sind, da es in diesem Fall sehr vorteilhaft ist, die erste Verbindung durch entsprechende Vorbereitung als Mikrokristalle im Bioreaktor vorzulegen. Durch diese Anpassung der Korngröße der ersten Verbindung, welche bei dieser besonders bevorzugten Ausführungsform wasserlöslich sein kann, wird die einfache Möglichkeit der Abtrennung der toxischen zweiten Verbindung im Verfahren auf künstliche Weise hergestellt.If a toxic second compound is formed during a reaction, the method according to the invention has the great advantage of being simple to be able to separate toxic compound from the bioreactor. It is not Problem to design the process so that the concentration of toxic second connection through an adapted regulation of the separation process, which, as stated above, cleverly through an on-line Monitoring is controlled below a predetermined low value to keep. It is obvious that doing this is extremely useful Possibility can even be applied when both first and second Compound are water-soluble, since it is very advantageous in this case, the first Connection by appropriate preparation as microcrystals in the bioreactor to submit. By adjusting the grain size of the first compound, which in this particularly preferred embodiment are water-soluble can, the easy way of separating the toxic second Connection made in the process in an artificial way.

Daß das erfindungsgemäße Verfahren außerdem auf sehr vorteilhafte Weise die Anwendung von einer zusätzlichen organischen flüssigen Phase vermeidet, ist im Anbetracht der vorstehenden Beschreibung nunmehr offensichtlich. That the inventive method is also very advantageous avoids the use of an additional organic liquid phase, is now apparent in light of the above description.

Dieses Vermeiden ist in mehrerer Hinsicht vorteilhaft. Nicht nur wird eine Kostenerhöhung bedingt durch die Anschaffung solcher Lösungsmittel vermieden, am Ende wird auch eine weitere finanzielle Konsequenz vermieden, wenn es um die Entsorgung solcher Lösungsmittel geht. Auch hier kann angemerkt werden, dass bereits relativ geringe Kostenvorteile im industriellen Maßstab eine große Bedeutung erhalten können.This avoidance is beneficial in several ways. Not just one Cost increase due to the purchase of such solvents avoided, in the end another financial consequence is also avoided, when it comes to the disposal of such solvents. Here too it should be noted that already relatively small cost advantages in industrial Scale can be of great importance.

Da das erfindungsgemäße Verfahren auf geschickte und überraschende Weise verschiedene Aspekte eines Umsetzungsverfahrens vereint, kann mit dem Verfahren eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute erzielt werden.Since the method according to the invention is clever and surprising How different aspects of an implementation process can be combined with the Process a high space-time yield can be achieved.

Die folgenden Anwendungsgebiete bieten sich für das erfindungsgemäße Verfahren an: eine biotechnologische Produktion von Pharmazeutika in der Pharmaindustrie, eine biotechnologische Produktion von Feinchemikalien in der Chemieindustrie und eine biotechnologische Produktion von Aromastoffen in der Lebensmittelindustrie.The following fields of application are suitable for the invention Process to: a biotechnological production of pharmaceuticals in the Pharmaceutical industry, a biotechnological production of fine chemicals in the Chemical industry and a biotechnological production of flavorings in the Food industry.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Abbildungen näher erläutert:The invention is illustrated by the following figures:

Fig. 1 stellt die schematische Abbildung eines Bioreaktors zur Durchführung des Verfahrens dar, Fig. 1 shows the schematic diagram illustrates a bioreactor for carrying out the method,

Fig. 2 ist die Darstellung der regioselektiven Oxidation von Terfenadin im Rührreaktor. Fig. 2 is the representation of the regioselective oxidation of terfenadine in the stirred reactor.

Die Abb. 1 zeigt einen Bioreaktor 1, welcher sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet. Der Bioreaktor 1 besteht im wesentlichen aus einem Behältnis aus rostfreiem Stahl, das von einem Mantel 2, welcher Heiz- bzw. Kühlmittel zur Einhaltung der optimalen Temperatur aufweist, umgeben wird. Im Bioreaktor 1 befindet sich die Reaktionslösung 6, welche eine wässrige Lösung ist. Der Bioreaktor 1 ist mit einer Leitung 3 zum Zufuhr von Sauerstoff oder Luft (oder ein anderes Sauerstoff haltendes Gasgemisch) ausgestattet. Ein Motor 4 treibt ein Rührmittel 5 an. Eine Anfuhrleitung 7 führt die erste Verbindung zum Reaktor, wird diese erste Verbindung als Mikrokristalle im System gewünscht, wird über dieser Anfuhrleitung die Lösung der ersten Verbindung in einem organischen Lösungsmittel in die wässrige Lösung 6 geschossen. Eine weitere Zufuhrleitung 8 führt die wässrige Lösung an, welche wässrige Lösung gegebenenfalls Cosubstrat oder weitere im Prozess benötigte Hilfsstoffe enthält. Über noch eine weitere Zufuhrleitung 9 kann ein eventuell erforderliches Korrekturmittel zugeführt werden, was z. B. eine Chemikalie zur Einstellung des richtigen pH-Wertes sein kann. Über eine Leitung 10 kann ein Teil der Gasphase entfernt werden. Dem Bioreaktor 1 ist ein Bypass zugeordnet, welcher ein Filter 13 und eine Leitung 12 stromaufwärts und eine Leitung 14 stromabwärts des Filters umfasst. In der Leitung 12 befindet sich eine Pumpe 11. Fig. 1 shows a bioreactor 1 , which is suitable for performing the method according to the invention. The bioreactor 1 essentially consists of a container made of stainless steel, which is surrounded by a jacket 2 , which has heating or cooling agents to maintain the optimum temperature. The reaction solution 6 , which is an aqueous solution, is located in the bioreactor 1 . The bioreactor 1 is equipped with a line 3 for supplying oxygen or air (or another oxygen-containing gas mixture). A motor 4 drives a stirring means 5 . A feed line 7 leads the first connection to the reactor. If this first connection is desired as microcrystals in the system, the solution of the first compound in an organic solvent is shot into the aqueous solution 6 via this feed line. A further feed line 8 leads to the aqueous solution, which aqueous solution optionally contains cosubstrate or further auxiliaries required in the process. A possibly required correction means can be supplied via yet another supply line 9 . B. can be a chemical to adjust the correct pH. Part of the gas phase can be removed via a line 10 . A bypass is assigned to the bioreactor 1 , which comprises a filter 13 and a line 12 upstream and a line 14 downstream of the filter. A pump 11 is located in line 12 .

Nicht dargestellt in der Abbildung sind Mittel um die Konzentration der zweiten Verbindung in der wässrigen Lösung zu bestimmen. Solche Mittel werden zweckmäßig in der Leitung 12 angeordnet. Für eine automatische Steuerung des Verfahrens werden solche Mittel in einem ebenfalls nicht dargestellten Rechnersystem integriert werden, das zur Regelung der Filterleistung die Wirkung der Pumpe 11 steuert.Means for determining the concentration of the second compound in the aqueous solution are not shown in the figure. Such means are expediently arranged in line 12 . For automatic control of the method, such means will be integrated in a computer system, also not shown, which controls the action of the pump 11 to regulate the filter output.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren in einer Anlage wie in der Abb. 1 dargestellt durchgeführt wird, wird die wässrige Reaktionslösung 6, welche das wässrige Milieu, den Biokatalysator und die erste Verbindung sowie die zweite Bindung enthält durch die Wirkung der Pumpe 11 durch das Filter 13 gepumpt. Das Filter 13 kann gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ein Querstrommikrofilter sein.If the process according to the invention is carried out in a plant as shown in FIG. 1, the aqueous reaction solution 6 , which contains the aqueous medium, the biocatalyst and the first compound and the second bond, is pumped through the filter 13 by the action of the pump 11 . According to a preferred embodiment of the method, the filter 13 can be a cross-flow microfilter.

Durch die Filterwirkung wird eine Trennung erzielt, wobei sich in der Leitung 14 eine aufkonzentrierte Suspension befindet, welche die erste, schlecht in Wasser lösliche Verbindung und den Biokatalysator aufweist und das Filtrat 15 das abgetrennte wässrige Milieu mit der gelösten zweiten Verbindung darstellt. Die aufkonzentrierte Suspension wird über die Leitung 14 in den Bioreaktor zurückgeführt. Das Filtrat mit der gelösten zweiten Verbindung wird kontinuierlich abgeführt. A separation is achieved by the filter effect, with a concentrated suspension being in line 14 , which has the first, poorly water-soluble compound and the biocatalyst and the filtrate 15 represents the separated aqueous medium with the dissolved second compound. The concentrated suspension is returned to the bioreactor via line 14 . The filtrate with the dissolved second compound is continuously removed.

In einer nicht gezeigten Anordnung wird die Isolierung der zweiten Verbindung aus dem Filtrat vorgenommen. Diese Isolierung kann mit gängigen Mitteln vorgenommen werden. Nach Entfernung der zweiten Verbindung aus dem Filtrat kann dieses wieder im Verfahren benutzt werden, um ein gewünschtes Reaktionsvolumen aufrecht zu erhalten. Sollte im Verfahren nicht vorgesehen werden, das Filtrat nach der Isolierung der zweiten Verbindung wiederzuverwenden, muss durch eine andere Maßnahme gewährleistet sein, dass das Volumen im gesamten System konstant bleibt.In an arrangement not shown, the insulation of the second connection made from the filtrate. This insulation can be done with common means be made. After removing the second connection from the Filtrate can be used again in the process to make a desired Maintain reaction volume. Should not be included in the procedure the filtrate after isolation of the second compound reuse must be ensured by another measure, that the volume remains constant throughout the system.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert werden. Dieses Beispiel betrifft die regioselektive Oxidation von Terfenadin.The method according to the invention is based on an exemplary embodiment are explained. This example concerns the regioselective oxidation of Terfenadine.

example Terfenadine

Bei Terfenadin handelt es sich um ein Antihistaminikum, welches aufgrund seiner nicht-sedativen Wirkung seit seiner Markteinführung im Jahre 1985 bis ca. 1991 den Markt dominiert hat. Wegen seiner Nebenwirkungen (Herzrhythmusstörungen bei Überdosierung bzw. bei bestimmten Kombinationen mit weiteren Medikamenten) hat es seit 1991 stetig an Marktanteil verloren und lag Ende 1996 bei ca. 18% (Medical Sci. Bull., 1996; 19 (2), 3).Terfenadine is an antihistamine, which is due to its Non-sedative effect since its market launch in 1985 to around 1991 dominated the market. Because of its side effects (irregular heartbeat in case of overdose or in certain combinations with others Medicines) has steadily lost market share since 1991 and was at the end 1996 at approx. 18% (Medical Sci. Bull., 1996; 19 (2), 3).

Genauere Untersuchungen der Wirkung von Terfenadin ergaben, dass es in der Leber durch Cytochrom P450 (CYP3A4) zu Fexofenadin oxidiert wird (J. E, Coutant, Journal of Chromatography, 1991; 570,139-148).Closer examination of the effects of terfenadine revealed that Liver is oxidized to fexofenadine by cytochrome P450 (CYP3A4) (J.E, Coutant, Journal of Chromatography, 1991; 570,139-148).

Erst dieses Oxidationsprodukt ist pharmakologisch wirksam. Von großem Interesse war dabei, dass die Nebenwirkungen aber durch das nicht-oxidierte Terfenadin erzeugt werden. Only this oxidation product is pharmacologically active. Of great interest was that the side effects were due to the non-oxidized terfenadine be generated.

Aus diesem Grund wurde 1998 der Wirkstoff Fexofenadin als verschreibungspflichtiges Antihistaminikum in Deutschland eingeführt, um die Nebenwirkungen von Terfenadin zu umgehen.For this reason, the active ingredient fexofenadine in 1998 Prescription antihistamines introduced in Germany to help Bypass side effects of terfenadine.

Zur Synthese von Fexofenadin sind inzwischen verschiedene Wege veröffentlicht (S. H. Kawei, Journal of org. Chem., 1994; 59, 2620-2622; S. Patel, Synthetic Communication, 1996; 4699-4710; Schwartz et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996; 44, 731-734).Various routes have now been published for the synthesis of fexofenadine (S. H. Kawei, Journal of org. Chem., 1994; 59, 2620-2622; S. Patel, Synthetic Communication, 1996; 4699-4710; Schwartz et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996; 44, 731-734).

Von offensichtlichem Interesse ist jedoch eine Syntheseroute, bei der man auf den bestehenden Produktionskapazitäten von Terfenadin aufbauen könnte und somit nur den letzten Schritt, also die regioselektive Oxidation zusätzlich durchführt. Dies ist mit rein chemischen Methoden in guten Ausbeuten nicht durchführbar.Of obvious interest, however, is a synthesis route that focuses on could build up Terfenadin's existing production capacity and thus only the last step, ie the additional regioselective oxidation carries out. This is not possible in good yields with purely chemical methods feasible.

Alternativen bietet hier die Möglichkeit der Biotransformation mit ganzen Zellen. So ist die prinzipielle Fähigkeit der Oxidation von Terfenadin-ähnlichen Substanzen durch den Pilz Cunninghamella blakesleeana durch Schwartz et al. (Schwartz et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996; 44, 731-734) gezeigt worden. Das Reaktionsschema zeigt die Umsetzung von Terfenadin I in seine Carbonsäure III über den Alkohol II.The possibility of biotransformation with whole cells offers alternatives. This is the basic ability to oxidize terfenadine-like Substances caused by the fungus Cunninghamella blakesleeana by Schwartz et al. (Schwartz et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996; 44, 731-734). The reaction scheme shows the conversion of terfenadine I into his Carboxylic acid III over alcohol II.

Es war im Rahmen der Erfindung das Ziel, eine Aktivierung der tertiären Butylgruppe zu erzielen. Eine Umsetzung der Ausgangsverbindung I in den Alkohol II stellt eine erhebliche Verbesserung dar, weil die weitere Umsetzung des Alkohols II in das eigentliche Fexofenadin - also die Carbonsäure III - ohne große Probleme durchführbar ist.The aim of the invention was to activate the tertiary To achieve butyl group. A conversion of the starting compound I into the Alcohol II represents a significant improvement because the further implementation of the Alcohol II in the actual fexofenadine - i.e. the carboxylic acid III - without great Problems is feasible.

Reaction conditions

Ein 1.2 l Rührkesselreaktor mit Querstrom-Mikrofiltration (Microdyn MD020TP2N, Porengröße 0.2 µm, 3 Rohre mit einem Innendurchmesser von 5.5 mm und einer Länge von 0.75 m aus Polypropylen, Membranfläche 0.036 m²) im Bypass, der mit 1.8 l sterilem Medium (siehe Tab. 1) gefüllt ist, wird mit einer 4 Tage alten sporulierten Agar-Kultur nach Homogenisation per Ultra-Turrax (30000 rpm, 30 s) beimpft. Der Bypassvolumenstrom wird auf 2.0 l/min eingestellt.A 1.2 l stirred tank reactor with cross-flow microfiltration (Microdyn MD020TP2N, pore size 0.2 µm, 3 tubes with an inner diameter of 5.5 mm and a length of 0.75 m made of polypropylene, membrane area 0.036 m ² ) in the bypass, which is filled with 1.8 l sterile medium (see tab 1) is filled, is inoculated with a 4-day-old sporulated agar culture after homogenization using an Ultra-Turrax (30,000 rpm, 30 s). The bypass volume flow is set to 2.0 l / min.

Table 1 Minimal medium used

GlucosemonohydratGlucose monohydrate 20,0 g/l20.0 g / l (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 12,0 g/l12.0 g / l KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 2,8 g/l,2.8 g / l, MgSO_4.7H₂OMgSO ₄ 7H ₂ O 2,5 g/l2.5 g / l CaCl_2.2H₂OCaCl ₂ 2H ₂ O 0,2 g/l0.2 g / l ElementlösungElement solution 2,0 ml/l2.0 ml / l

Element solution

MnCl_2.4H₂OMnCl _2. 4H ₂ O 2,0 g/l2.0 g / l ZnSO_4.7H₂OZnSO _4. 7H ₂ O 4,0 g/l4.0 g / l CuSO_4.5H₂OCuSO _4. 5H ₂ O 2,0 g/l2.0 g / l FeNH₄CitratFeNH ₄ citrate 20,0 g/l20.0 g / l Na₂MoO_4.2H₂ONa ₂ MoO ₄ 2H ₂ O 0,03 g/l0.03 g / l CoCl_2.6H₂OCoCl _2. 6H ₂ O 0,01 g/l0.01 g / l EDTAEDTA 5,0 g/l5.0 g / l

Es wird eine Reaktionstemperatur von 30°C und ein pH zwischen 6.5-7.2 im Reaktor eingeregelt. Der pO₂ wird mit der Begasungsrate als Stellgröße (20- 1000 ml/min) auf 60% geregelt (Rührerdrehzahl: 1200 rpm). Nach Verbrauch der vorgelegten Glucosemenge (off-line überprüft durch Glucosemessung) werden jeweils 20 g/l, Glucosemonohydrat zudosiert, bis eine Gesamtmenge von 60 g/l Glucosemonohydrat erreicht ist. Danach werden 6 g/(ld) Glycerin zudosiert.A reaction temperature of 30 ° C and a pH between 6.5-7.2 is regulated in the reactor. The pO ₂ is regulated with the gassing rate as a manipulated variable (20-1000 ml / min) to 60% (stirrer speed: 1200 rpm). After consumption of the amount of glucose submitted (checked off-line by glucose measurement), 20 g / l of glucose monohydrate are metered in until a total of 60 g / l of glucose monohydrate is reached. Then 6 g / (ld) glycerol are added.

Availability of terfenadine

Die Löslichkeit von Terfenadin ist sehr gering (21 mg/l, bei pH 7.5 in Wasser). Um eine möglichst hohe Umsetzungsgeschwindigkeit im Rührreaktor zu erreichen, muss sichergestellt sein, dass zumindest die Löslichkeitsgrenze zu jedem Zeitpunkt im Rührreaktor erreicht wird. Daher wurde die Reaktion als 'mikrokristalline Fermentation' durchgeführt: Hierzu wird Terfenadin in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie z. B. Methanol, Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und in den Rührreaktor eingetragen. Wenn sich das Lösungsmittel im wässrigen Medium verteilt, kristallisiert Terfenadin aus. Um eine möglichst feine Dispergierung des Eduktes, und damit eine große Feststoffoberfläche im Reaktor zu erreichen, erfolgte der Eintrag der Terfenadinlösung an der Stelle im Rührreaktor mit höchster lokaler Energiedissipation. The solubility of terfenadine is very low (21 mg / l, at pH 7.5 in water). Around to achieve the highest possible conversion rate in the stirred reactor, it must be ensured that at least the solubility limit for each Time in the stirred reactor is reached. Therefore the reaction was called 'Microcrystalline fermentation' carried out: Terfenadine is combined with this Water-miscible organic solvents such as B. methanol, Dimethylformamide (DMF) or dimethyl sulfoxide (DMSO) dissolved and in the Stirred reactor entered. If the solvent is in the aqueous medium distributed, terfenadine crystallizes out. In order to disperse the Educt, and thus to achieve a large solid surface in the reactor, the terfenadine solution was introduced at the point in the stirred reactor highest local energy dissipation.

Die Terfenadinzugabe wurde automatisiert, indem rechnergesteuert definierte Mengen einer alkoholischen Terfenadinlösung mit Druckluftimpulsen (4 bar) in den Rührreaktor 'geschossen' wurden.The addition of terfenadine was automated by defining it under computer control Amounts of an alcoholic terfenadine solution with compressed air pulses (4 bar) in the 'stirred reactor' was 'shot'.

Retention of substrate and biocatalysts through microfiltration in the bypass

Es wurde mit Beginn der Glycerindosierung ein Filtralvolumenstrom von 50 ml/h aus dem Rührreaktor mit Querstrom-Mikrofiltration im Bypass entnommen (siehe Abb. 1). Die Ergebnisse einer mikrokristallinen Fermentation zur regioselektiven Oxidation von Terfenadin in diesem Rührreaktor mit Querstrom-Mikrofiltration sind in Abb. 2 dargestellt.At the beginning of the glycerin metering, a filtrate volume flow of 50 ml / h was removed from the stirred reactor with crossflow microfiltration in the bypass (see Fig. 1). The results of a microcrystalline fermentation for the regioselective oxidation of terfenadine in this stirred reactor with cross-flow microfiltration are shown in Fig. 2.

In dieser Abb. 2 stellen die rechteckigen Symbole die real gemessenen Werte der Konzentration des Alkohols II im Verfahren dar, während die kreisförmigen Symbole fiktive Werte sind, welche die Konzentration des Alkohols II in dem Bioreaktor darstellen, welche ohne Abtrennung durch Filtration theoretisch in dem Bioreaktor realisiert wären.In this Fig. 2, the rectangular symbols represent the real measured values of the concentration of alcohol II in the process, while the circular symbols are fictitious values which represent the concentration of alcohol II in the bioreactor, which theoretically in the bioreactor without separation by filtration would have been realized.

Man erkennt, dass durch Einstellung des Filtratvolumenstroms auf 50 ml/h die Konzentration des Alkohols II im Reaktor auf ca 200 mg/l, begrenzt werden konnte. Die insgesamt erzeugte Produktmenge übersteigt mit (bilanzierten) 900 mg/l, die bei der mikrokristallinen Fermentation ohne Mikrofiltration nach 200 h maximal erzeugte Menge um 50%.It can be seen that by setting the filtrate volume flow to 50 ml / h Concentration of alcohol II in the reactor limited to about 200 mg / l could. The total amount of product produced exceeds (balanced) 900 mg / l, the microcrystalline fermentation without microfiltration after 200 h maximum amount produced by 50%.

Integrated product separation through selective adsorption

Darüberhinaus ist es möglich, den gebildeten Alkohol II mit einem Adsorptionsverfahren (XAD-4 Adsorberharz) selektiv aus dem Filtratstrom zu entfernen und in einem Schritt um den Faktor 10 zu konzentrieren (Eluation mit Methanol, Ausbeute: 95%).In addition, it is possible to use the alcohol II formed with a Adsorption process (XAD-4 adsorber resin) selectively from the filtrate stream remove and concentrate in one step by a factor of 10 (elution with Methanol, yield: 95%).

Claims

1. A method for converting a first compound (substrate) into a second compound (product) in a bioreactor containing an aqueous medium by means of a biocatalyst, the first compound being a poorly water-soluble compound, and
the components of the process are separated, the first compound and the biocatalyst remaining in the bioreactor and
the second compound is excreted from the bioreactor, characterized in that the first compound is present as microcrystalline crystals.

2. The method of claim 1, wherein the separation of the components is carried out continuously.

3. The method of claim 1 or 2, wherein the biocatalyst Is microorganism.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the separation of the Components are made with a membrane separation process.

5. The method of claim 4, wherein the membrane separation process Cross flow filtration is.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the separation of the second connection regulated by on-line recording of its concentration becomes.

7. The method according to any one of claims 1 to 6 for the implementation of Terfenadine.