DE19823073A1

DE19823073A1 - Verbesserter Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay

Info

Publication number: DE19823073A1
Application number: DE19823073A
Authority: DE
Inventors: Charles Cheng; Kathryn Sarah Schwenzer; Raymond Thomas Wong
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-05-22
Filing date: 1998-05-22
Publication date: 1998-12-24
Also published as: FR2763691A1; US6066505A; FR2763691B1; JP4115588B2; JPH1183855A; IT1302564B1; ITMI981044A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, um bei Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassays die Hintergrundfluoreszenz-Inten sität oder die endogene Fluoreszenz und damit das Rauschen zu vermindern und die Analytwiedergewinnung zu verbessern. Ein Grund für die Hintergrundfluoreszenz-Intensität ist die Gegenwart von Bilirubin, hauptsächlich gebundenem Bilirubin, in einer Testprobe, z. B. einer klinischen Probe, die analy siert werden soll, um die Konzentration eines bestimmten Zielanalyten in der Probe quantitativ auszuwerten, z. B. einer physiologisch aktiven Substanz oder Verbindung (z. B. eines therapeutischen Arzneimittels). Es wurde nun gefunden, daß dann, wenn eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe umfassend 1,10-Phenanthrolin, 8-Hydroxy-7-iod-5-chinolin und Naphthalin-1-sulfonsäure und deren Salze (im folgenden auch als "Additive" bezeichnet) der Probe zugegeben werden, bei einer Reagenzmischung oder Reagenzmischung, die einen Ziel analyten enthält, bei einem Fluoreszenz-Polarisations-Immuno assay die Hintergrundintensität oder Fluoreszenz wirksam reduziert wird. Außerdem wird die Wiedergewinnung des Analy ten verbessert. Die Verminderung der Hintergrundfluoreszenz und die Verbesserung der Wiedergewinnung erhöhen die Genauig keit der Ergebnisse, die mit Fluoreszenz-Polarisations-Assays erhalten werden. Außerdem beeinflußt das erfindungsgemäße Verfahren die Leistung des Fluoreszenz-Polarisations-Assays ansonsten nicht.

Bei einem Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay (FPIA) wird ein im Handel erhältlicher fluoreszierender Farbstoff, z. B. ein mit Fluorescein markierter Analyt (als Tracer oder Fluo resceinkonjugat bezeichnet) verwendet, um in einem homogenen Testsystem mit nicht markiertem Analyten in einer Probe um die Bindung an einen spezifischen Antikörper zu konkurrieren. Das Prinzip des Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays wurde zuerst von W.B. Dandliker und G.A. Feigen in "Quantification of the Antigen-Antibody Reaction by the Polarization of Fluo rescence", Biochem. Biophys. Res. Comm. 5 : 299 (1981) beschrieben. Der Test beruht auf dem Prinzip, daß ein kleines Molekül eines mit Fluorescein markierten Analyten, wenn es nicht gebunden ist, frei drehbar ist, daß aber, wenn der mit Fluorescein markierte Analyt an ein großes Antikörpermolekül gebunden ist, die freie Drehung stark eingeschränkt ist. Das Ausmaß der Tracerdrehung wird umgekehrt proportional durch den Wert für die Fluoreszenzpolarisation angezeigt, der ein Wert ist, der aus gemessener horizontaler und vertikaler Fluoreszenzintensität von gebundenem und freiem mit Fluo rescein markierten Analyten in Lösung berechnet wird. Der Wert für die Fluoreszenzpolarisation (mP) wird bestimmt, indem die gemessenen polarisierten Fluoreszenzintensitäten in der folgenden Gleichung verwendet werden:

T_h: Horizontale Testintensität
T_v: Vertikale Testintensität
B_h: Horizontale Hintergrundintensität
B_v: Vertikale Hintergrundintensität

Zuerst wird eine Standardkurve erstellt unter Verwendung der Fluoreszenz-Polarisationswerte der Kalibratoren, wie später beschrieben. Wenn der Fluoreszenz-Polarisationswert der Probe gegen eine Standardkurve abgelesen wird, kann die Analytkon zentration bestimmt werden.

Fluoresceinmarkierungen sind im Stand der Technik wohlbekannt und schließen z. B. 5-[(4,6-dichlortriazin-2-yl-amino]fluores cein und Fluoresceinisothiocyanat ein.

Es ist wünschenswert, die Hintergrundfluoreszenz in dem Test soweit wie möglich zu minimieren, um eine größere Analyse genauigkeit zu erreichen. Es ist anzumerken, daß bei dem Ver such, die Genauigkeit zu erhöhen, die Testintensität auch um die Hintergrundintensität korrigiert wird bei der Berechnung des Fluoreszenz-Polarisationswertes. Jedoch bleibt die Hin tergrundintensität während des Meßzeitraumes möglicherweise nicht konstant. Wenn die Hintergrundintensität verglichen mit der Intensität des Tracers relativ gering ist, wird der Fluo reszenz-Polarisationswert möglicherweise durch einen wider sprüchlichen Hintergrundintensitätswert nicht beeinflußt. Wenn jedoch die Anfangshintergrundintensität, d. h. die Inten sitätswerte B_h und B_v in der Formel oben, hoch sind und/oder instabil sind oder sich verändern, führt dies zu einer Wider sprüchlichkeit bei der abschließenden Berechnung. Genauer können die Inkonsistenzen die abschließende Berechnung der Polarisierung (mP) erheblich beeinflussen aufgrund der Tat sache, daß der Anfangshintergrundintensitätswert, d. h. B_h und Bv, der für die abschließende Berechnung verwendet wird, sich von der letzten oder tatsächlichen Hintergrundintensität zum Zeitpunkt, wenn die gesamte Testintensität, d. h. T_h und T_v gemessen wird, unterscheiden. Die Testintensität besteht aus horizontalen und vertikalen Komponenten der tatsächlichen Hintergrundintensität und Tracerintensität zum Zeitpunkt, zu dem die Probenmessung erfolgt.

Bei einem Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay wird typi scherweise eine Lichtquelle mit einer Wellenlänge im Bereich von 475 bis 495 nm verwendet, um die Reaktionsmischung anzu regen. Ein mit Fluorescein markierter Analyt emittiert, wenn er Licht absorbiert, Licht in weniger als 10 Nanosekunden mit einer Wellenlänge im Bereich von 505 bis 530 nm.

Serum, Plasma oder Urin können selbst Licht mit einer Wellen länge im Bereich von 510 bis 520 nm emittieren und daher die Messung der Fluoreszenzpolarisation stören. Die Störung kann nicht nur auf die Gegenwart von Bilirubin in den Proben begrenzt sein. Proben, die einen geringen Bilirubingehalt haben, können andere endogene oder exogene Verbindungen ent halten, die eine sehr hohe Fluoreszenz-Hintergrundintensität erzeugen oder Licht im Bereich von 510 bis 520 nm emittieren. Solche Proben können eine hohe Hintergrundintensität oder instabile Hintergrundintensität erzeugen und die bei den Fluoreszenz-Polarisations-Assays erhaltenen Ergebnisse für die diagnostische oder analytische Zwecke unzuverlässig machen. Daher ist eine Verminderung und/oder Stabilisierung der Hintergrundintensität bei einem Fluoreszenz-Polarisa tions-Immunoassay für eine zuverlässige klinische diagnosti sche oder analytische Verwendung erforderlich.

Der Einfluß verschiedener Additive auf die Hintergrundinten sität und Analytwiedergewinnung wurde bei Immunoassays in Betracht gezogen, einschließlich solchen mit erhöhtem oder instabilem Fluoreszenzhintergrund, um einen Immunoassay zu erhalten, der ein annehmbares Ergebnis für alle klinischen (Proben liefern kann, z. B. Serum-, Plasma- oder Urinproben. Siehe U.S. Patent Nr. 4 252 783 und U.S. Patent Nr. 4 492 762.

Erfindungsgemäß wurde nun festgestellt, daß dann, wenn minde stens eine der Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe beste hend aus 1,10-Phenanthrolin, 8-Hydroxy-7-iod-5-chinolin, Naphthalin-1-sulfonsäure oder Salzen davon oder einer Kombi nation dieser Verbindungen, in die Reaktionsmischung, die einen Analyt enthält, bei einem Fluoreszenz-Polarisations- Assay eingearbeitet wird, die Genauigkeit des Testes wesent lich erhöht wird aufgrund der Abnahme der Hintergrundfluores zenz und/oder einer verbesserten Wiedergewinnung des Analy ten.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Menge eines in einer Testprobe vorhandenen Analyten mit einem Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay, wobei der Analyt entweder in der klinischen Probe oder einer Reagenzmischung, die den Analyten enthält, mit mindestens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1,10-Phenanthrolin, 8-Hydroxy-7-iod-5-chinolin, Naphthalin-1- sulfonsäure und Salzen davon und irgendeiner Kombination davon, in Kontakt gebracht wird.

Die Erfindung betrifft auch einen Fluoreszenz-Polarisations- Immunoassay für einen Zielanalyten in einer Testprobe mit vermindertem Hintergrundrauschen und/oder verbesserter Analytwiedergewinnung, wobei die den Analyt enthaltende klinische Probe oder eine den Analyt enthaltende Reagenz mischung mit einer wirksamen Menge mindestens einer Verbin dung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1,10-Phenanthro lin, 8-Hydroxy-7-iod-5-chinolin, Naphthalin-1-sulfonsäure, Salzen davon und irgendeiner Kombination davon in Kontakt gebracht wird.

Der Ausdruck "Wiedergewinnung" eines Analyten bedeutet eine genaue Messung des richtigen Wertes des Analyten in einer Probe, der eine bekannte Menge des Analyten "zugegeben wurde", d. h. die Probe wurde mit dem Analyten "versetzt". "Wiedergewinnung" des Analyten ist ein wichtiger Parameter, um die Genauigkeit eines Fluoreszenz-Polarisations-Assays festzustellen. So bedeutet eine 100%ige "Wiedergewinnung", daß der Test den exakten Wert der richtigen Menge des Analy ten in der Probe lieferte. Ein Wert unter 100% bedeutet, daß der Test die Menge des tatsächlich in der Probe vorhandenen Analyten zu niedrig angibt. Analog zeigt ein Wert über 100%, daß der Test die Menge an Analyt in der Probe zu hoch angibt.

Bevorzugt sind die ausgewählten Verbindungen in Kombination Naphthalin-1-sulfonsäure und 1,10-Phenanthrolin oder Naphtha lin-1-sulfonsäure und 8-Hydroxy-7-iod-5-chinolin.

Die Verbindungen 1,10-Phenanthrolin, 8-Hydroxy-7-iod-5-chino lin und Naphthalin-1-sulfonsäure bilden die entsprechenden üblichen Salze, z. B. bildet Naphthalin-1-sulfonsäure ein Lithium- oder Natriumsalz.

Die Erfindung betrifft auch einen Reagenziensatz zur Durch führung eines Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays für die quantitative Bestimmung eines Analyten in einer Testprobe, und enthält mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1,10-Phenanthrolin, 8-Hydroxy-7-iod-5- chinolin und Salzen davon, und gegebenenfalls Naphthalin-1- sulfonsäure.

Dieser Satz von Reagenzien umfaßt geeigneterweise:

1. Lithiumdodecylsulfat in einem Bereich von etwa 0,5 bis etwa 2%;
2. Hydroxypropylbetacyclodextrin im Bereich von etwa 10% bis etwa 30%;
3. 1,10-Phenanthrolin im Bereich von etwa 0,06 bis etwa 0,25% und
4. Alkaliazid im Bereich von etwa 0,09 bis etwa 3,0%.

Das Alkaliazid ist gewöhnlich Natriumazid.

Der Reagenziensatz umfaßt bevorzugt weiterhin Naphthalin-1- sulfonsäure im Bereich von etwa 0,75 bis etwa 5%.

Ein besonders interessanter Reagenziensatz ist ein Einzelrea genz, das ungefähr 0,85% Naphthalin-1-sulfonsäure, 20% Natri umsalz von Hydroxypropylbetacyclodextrin, 0,20% 1,10-Phenan throlinmonohydrat, 1,25% Lithiumsalz von Dodecylsulfat und 0,09% Natriumazid enthält.

Ein typischer Test wird wie folgt durchgeführt:

Reagenzienmischung

Eine erfindungsgemäße Reagenzienmischung, die in Fluoreszenz- Polarisations-Immunoassays verwendet wird, enthält typischer weise die unten beschriebenen Komponenten A, B, C und D.

Komponente A: Probe

Serum, Plasma oder Urin, die auf die Gegenwart von Verbindun gen (Analyten), wie Barbiturate oder Benzodiazepine, getestet werden sollen.

Komponente B: Verdünnungsmittel

Lithiumdodecylsulfat im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 2%; Naphthalin-1-sulfonsäure im Bereich von etwa 0,75 bis etwa 5% oder mehr (Steigerung der Rückgewinnung); 1,10-Phenanthrolin im Bereich von etwa 0,06 bis etwa 0,25% (die Hintergrundfluo reszenz reduzierendes Mittel); Hydroxypropylbetacyclodextrin im Bereich von etwa 10% bis etwa 30%; 8-Hydroxy-7-iod-5- chinolin (die Hintergrundfluoreszenz verminderndes Mittel) im Bereich von etwa 0,06 bis etwa 0,25% und Alkaliazid, z. B. Natriumazid, im Bereich von etwa 0,09 bis etwa 3,0%.

Komponente C: Antikörperreagenz

Serumbarbiturat-Schafantiseren oder Serumbenzodiazepin-Schaf antiseren. Die Antiseren werden in Schafen mit üblichen Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, gezüchtet.

Komponente D: Tracerreagenz

Mit Fluorescein markiertes Barbiturat oder mit Fluorescein markiertes Benzodiazepin in einem geeigneten Puffer.

Gerät

COBAS® INTEGRA (Roche Diagnostic Systems, Inc., Branchburg, N.J.) oder irgendein geeignetes Analysegerät, um einen Fluo reszenz-Polarisations-Immunoassay durchzuführen.

Protokoll zur Durchführung des Assays

Antikörperreagenz, Verdünnungsmittel und eine Probe des Blut serums, Plasmas oder Urins werden aufeinanderfolgend in eine Küvette gegeben. Nach Vermischen und Inkubieren über eine kurze Zeit (132 Sekunden beim COBAS® INTEGRA) wird die Hin tergrundintensität gemessen. Anschließend wird Tracer zugege ben, die entstehende Mischung eine bestimmte Zeit lang (beim COBAS® INTEGRA typischerweise 90 Sekunden) inkubiert und die abschließende Testintensität gemessen.

Bestimmung einer Standardkurve

Eine Standardkurve wird erstellt unter Verwendung von Stan dardkonzentrationen des Analyten (wie im folgenden in den Beispielen 5 und 6 beschrieben), um den Analytgehalt durch Bezugnahme auf die Standardkurve zu bestimmen.

Die folgenden Beispiele dienen nur dazu, verschiedene Ausfüh rungsformen der Erfindung zu erläutern.

Die Erfindung wird weiter durch Fig. 1 erläutert, die ein Säulendiagramm ist, das die Fähigkeit der in Beispiel 1 beschriebenen Additive darstellt, die Hintergrundfluoreszenz des Serums zu vermindern.

Beispiel 1 Verminderung der Serumfluoreszenz bei ikterischen Serumproben unter Verwendung von erfindungsgemäßen Additiven

Probe:
Klinische ikterische Serumproben

Verdünnungsmittel Verdünnungsmittel 1 - Kontrolle

20% Hydroxypropyl-β-cyclo dextrin (HPC), 1,25% Lithi umdodecylsulfat (LDS)

Verdünnungsmittel 2

Kontrolle plus 0,2% 1,10- Phenanthrolin, 0,85% Naph thalin-1-sulfonsäure (alpha)

Verdünnungsmittel 3

Kontrolle plus 0,2% 8- Hydroxy-7-iod-5-chinolin

Verdünnungsmittel 4

Kontrolle plus 0,2% 1,10- Phenanthrolin

Verdünnungsmittel 5

Kontrolle plus 0,2% 8-Hy droxy-7-iod-5-chinolin, 0,85% Naphthalin-1-sulfon säure (alpha)

Antikörperreagenz

Polyklonaler Antikörper, der gegen Nordiazepam mit bekannten Methoden gezüchtet wurde. In den Beispielen 1 bis 3 ist der Antikörper der, der derzeit in dem ONLINE®-Benzodiazepinassay von Roche Diagnostic Systems enthalten ist.

Tracerreagenz

Mit Fluorescein markiertes Nordiazepam

Gerät

COBAS® INTEGRA

Protokoll

90 µl Antikörperreagenz, 45 µl Probenverdünnungsmittel und 14 µl Probe wurden aufeinanderfolgend in eine Küvette gegeben. Nach kurzem Vermischen und Inkubieren (typischerweise etwa 132 Sekunden) wurde die Hintergrundintensität der entstehen den Mischung gemessen. Anschließend wurden 20 µl Tracer zuge geben, die Mischung eine kurze Zeit lang (wiederum typischer weise etwa 90 Sekunden) inkubiert und die abschließende Testintensität gemessen. Die sich ergebenden Meßergebnisse sind unten in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Zusammenfassung der Ergebnisse

Wie oben in Tabelle 1 gezeigt, ist das Verdünnungsmittel 2 sehr wirksam zur Reduktion der Hintergrundfluoreszenz. Dies wird sichtbar gemacht durch die Reduktion von Hintergrund intensität/Testintensität im Vergleich zu Verdünnungsmittel 1 (Kontrolle).

In ähnlicher Weise ist auch Verdünnungsmittel 3, das die Kon trolle unter Zugabe von 8-Hydroxy-7-iod-5-chinolin enthält, sehr wirksam zur Absenkung der Serumfluoreszenz im Vergleich zu Verdünnungsmittel 1 und ist sogar noch wirksamer, wenn es mit Naphthalin-1-sulfonsäure (Probe Verdünnungsmittel 5) ver einigt wird.

Verdünnungsmittel 4, das die Kontrolle zusammen mit 1,10- Phenanthrolin enthält, ist auch sehr wirksam zur Absenkung der Hintergrundfluoreszenz, was durch die Reduktion von Hin tergrundintensität/Testintensität auch im Vergleich zu Ver dünnungsmittel 1 gezeigt wird.

Die in Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse werden auch in gra phischer Form in Fig. 1 zusammengefaßt, mit dem Vorbehalt, daß bei den Ergebnissen von Fig. 1 ein zusätzliches Verdünnungsmittel verwendet wurde, nämlich Kontrolle plus 0,85% Naphthalin-1-sulfonsäure, das nicht in Tabelle 1 angegeben ist.

Beispiel 2 Wiedergewinnung von Nordiazepam aus klinischen ikterischen Proben nach Zugabe von 1,10-Phenanthrolin Probe

Klinische ikterische Serumproben wurden mit 70 ng/ml Nordia zepam versetzt unter Verwendung einer Vorratslösung mit 7 µg/ml.

Verdünnungsmittel

1% Lithiumdodecylsulfat, 15% Hydroxypropyl-β-cyclodextrin mit oder ohne 0,15% 1,10-Phenanthrolin (PAE)

Antikörperreagenz

Polyklonaler Antikörper gezüchtet gegen Nordiazepam

Tracerreagenz

Mit Fluorescein markiertes Nordiazepam

Gerät

COBAS® INTEGRA

Protokoll

95 µl Antikörperreagenz, 57 µl Probenverdünnungsmittel und 18 µl Probe wurden aufeinanderfolgend in eine Küvette gegeben. Nach kurzem Vermischen und Inkubieren wurde die Hinter grundintensität gemessen. Anschließend wurden 20 µl Tracer zugegeben, die Mischung eine kurze Zeit lang inkubiert und die abschließende Testintensität gemessen. Die sich ergebenden Meßergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

Zusammenfassung der Ergebnisse

Wie in Tabelle 2 gezeigt, erzeugte die Verwendung von 18 µl ikterischer Serumprobe eine hohe Hintergrundintensität von bis zu 60% des Tracersignals (siehe Spalte 7). Die Hinter grundintensitäten bei diesen Proben mit hoher Hintergrund intensität wurden beträchtlich unterdrückt (abgesenkt), um bis zu 78% vermindert, durch die Zugabe von 1,10-Phenanthro lin (siehe Spalte 9). Proben mit Hintergrundintensitäten von mehr als 32% ergaben jedoch sogar bei Zugabe von 1,10-Phenan throlin (siehe Spalte 8, z. B. letzte 3 Einträge) Ergebnisse für die Wiedergewinnung von Nordiazepam in Serum, die unan nehmbar gering für einen diagnostischen Test waren. Dies bedeutet unter Bezugnahme auf Spalte 6, letzte zwei Einträge, daß die gemessene Menge an Analyt beträchtlich unter 100% war. In analoger Weise lieferten bestimmte Proben (siehe wie derum Spalte 6) zu hohe Werte für den zugegebenen Analyten (über 100% Wiedergewinnung). Es ist auch festzustellen, daß obwohl es eine Verminderung der Hintergrundfluoreszenz gab, eine befriedigende analytische Wiedergewinnung des Analyten in diesen Proben nur durch Verwendung von 1,10-Phenanthrolin nicht erreicht werden konnte.

Beispiel 3 Genaue Wiedergewinnung von Nordiazepam aus ikterischen Serum proben nach Zugabe von Naphthalin-1-sulfonsäure Probe

Klinische ikterische Proben wurden mit 150 ng/ml Nordiazepam versetzt unter Verwendung einer Vorratslösung mit 15 µg/ml.

Verdünnungsmittel

1,25% Lithiumdodecylsulfat, 20% Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, 0,2% 1,10-Phenanthrolin mit und ohne 0,85% Naphthalin-1-sul fonsäure.

Antikörperreagenz

Polyklonaler Antikörper, der gegen Nordiazepam gezüchtet wurde.

Tracerreagenz

Mit Fluorescein markiertes Nordiazepam

Gerät

COBAS® INTEGRA (Roche Diagnostic Systems, Inc., Branchburg, N.J.)

Protokoll ohne Naphthalin-1-sulfonsäure

95 µl Antikörperreagenz, 45 µl Probenverdünnungsmittel ohne Naphthalin-1-sulfonsäure und 14 µl Probe wurden aufeinander folgend in eine Küvette gegeben. Nach kurzem Vermischen und Inkubieren wurde die Hintergrundintensität gemessen. Anschließend wurden 20 µl Tracer zugegeben, die Mischung eine kurze Zeit lang inkubiert und die endgültige Testintensität gemessen.

Protokoll mit 0,85% Naphthalin-1-sulfonsäure

90 µl Antikörperreagenz, 45 µl Probenverdünnungsmittel, das 0,85% Naphthalin-1-sulfonsäure enthielt, und 14 µl Probe wur den aufeinanderfolgend in eine Küvette gegeben. Nach kurzem Vermischen und Inkubieren wurde die Hintergrundintensität gemessen. Anschließend wurden 20 µl Tracer zugegeben, die Mischung eine kurze Zeit lang inkubiert und die endgültige Testintensität gemessen.

Die Ergebnisse dieser Messungen sind unten in Tabelle 3 ange geben.

Tabelle 3

Tabelle 3 zeigt das Problem der "erhöhten Wiedergewinnung" von Analyt in normalem humanem Serum, das mit Bilirubin ange reichert wurde. Das Bilirubin stört die Messung und liefert ein Testergebnis, das höher ist als der wahre Gehalt des Ana lyten in der Probe. So ist in Spalte 4 der sich ergebende Analytwert, der ohne zugegebene Naphthalin-1-sulfonsäure erhalten wurde, wesentlich höher als der bekannte richtige Wert von 100%. Im Gegensatz dazu ist bei Zugabe von Naphtha lin-1-sulfonsäure der entsprechende Meßwert deutlich näher an dem bekannten richtigen Wert von 100% (siehe Spalte 5).

Beispiel 4 Genaue Wiedergewinnung von Secobarbital bei ikterischen Serumproben nach Zugabe von Naphthalin-1-sulfonsäure Probe

Klinische ikterische Proben wurden mit 1000 ng/ml Secobarbi tal versetzt unter Verwendung einer Vorratslösung mit 100 µg/ml.

Probenverdünnungsmittel

Antikörperreagenz

Polyklonaler Antikörper wurde gegen Secobarbital gemäß bekannten Verfahren gezüchtet. In den Beispielen 4 und 5 ist der Antikörper der derzeit in dem ONLINE® Secobarbital-Assay von Roche Diagnostic Systems verwendete.

Tracerreagenz

Mit Fluorescein markiert es Secobarbital

Gerät

COBAS® INTEGRA

Protokoll ohne Naphthalin-1-sulfonsäure

95 µl Antikörperreagenz, 45 µl Probenverdünnungsmittel ohne Naphthalin-1-sulfonsäure und 4 µl Probe wurden aufeinander folgend in eine Küvette gegeben. Nach kurzem Vermischen und Inkubieren wurde die Hintergrundintensität gemessen.

Anschließend wurden 20 µl Tracer zugegeben, die Mischung eine kurze Zeit lang inkubiert und die endgültige Testintensität gemessen.

Protokoll mit 0,85% Naphthalin-1-sulfonsäure

90 µl Antikörperreagenz, 45 µl Probenverdünnungsmittel, das 0,85% Naphthalin-1-sulfonsäure enthielt, und 4 µl Probe wur den aufeinanderfolgend in eine Küvette gegeben. Nach kurzem Vermischen und Inkubieren wurde die Hintergrundintensität gemessen. Anschließend wurden 20 µl Tracer zugegeben, die Mischung eine kurze Zeit lang inkubiert und die endgültige Testintensität gemessen.

Die Ergebnisse dieser Messungen sind unten in Tabelle 4 ange geben.

Tabelle 4

Tabelle 4 zeigt auch beispielhaft die Korrektur der "erhöhten Wiedergewinnung" des Analyten bei mit Analyt versehenen Pro ben durch die Verwendung von Naphthalin-1-sulfonsäure.

Beispiel 5 Reagenzienset (oder Reagenzienzusammenstellung) für Serumbarbiturat-Assays

Konzentration der Komponenten des Serumbarbiturat-Antikörper reagenzes, 0,1 M, pH 7,5: Inhaltsstoffe:
0,1 M Tris-Puffer, pH 7,5, enthaltend 1% Ethylenglycol, 0,056% Riboflavin bindendes Protein, 0,09% Natriumazid und Schafserum, das gegen Secobarbital gezüchtet wurde, in einer geeigneten Verdünnung oder mit einem geeigneten Titer.

Konzentration der Komponenten des Serumbarbiturat-Tracerrea genzes, 0,1 M, pH 8,0: Inhaltsstoffe:
0,1 M Phosphatpuffer, pH 8, enthaltend 0,01% Rindergammaglo bulin, 0,09% Natriumazid und einen Tracer, der Secobarbital markiert mit Fluorescein ist.

Verdünnungsmittelkomponente, Konzentration: Inhaltsstoffe:
0,85% Naphthalin-1-sulfonsäure, 20% Natriumsalz von Hydroxy propyl-β-cyclodextrin, 0,20% 1,10-Phenanthrolinmonohydrat, 1,25% Lithiumsalz von Dodecylsulfat, 0,09% Natriumazid.

Serumbarbiturat-Kalibratoren (auch als Standards bezeichnet):
Es wurden Kalibratoren hergestellt, indem arzneimittelfreies normales Humanserum mit Secobarbital in einem Anteil von 0, 0,5, 1, 2 und 4 µg/ml versetzt wurde.

Die Fluoreszenzpolarisation wurde nach der Inkubation abgele sen. Die Polarisationsmeßwerte veränderten sich und ließen die Erstellung einer Standardkurve zu. Unbekannte Proben wur den auf gleiche Weise getestet und der Analytgehalt, z. B. Barbiturat, Benzodiazepingehalt und dgl., wurde berechnet unter Verwendung der Standardkurve.

Beispiel 6 Satz (oder Zusammenstellung) von Reagenzien für Serumbenzo diazepin-Assays

Konzentration der Komponenten des Serumbenzodiazepin-Antikör perreagenzes, 0,1 M, pH 7,5: Inhaltsstoffe:
0,1 M Tris-Puffer, pH 7,5, enthaltend 1% Ethylenglycol, 0,056% Riboflavin bindendes Protein, 0,09% Natriumazid und Schafserum, das gegen Benzodiazepin gezüchtet wurde, in einer geeigneten Verdünnung oder mit einem geeigneten Titer.

Konzentration der Komponenten des Serumbenzodiazepin-Tracer reagenzes, 0,1 M, pH 7,0: Inhaltsstoffe:
0,1 M ACES-Puffer mit pH 7,0 enthaltend 1% Ethylenglycol, 0,01% Rindergammaglobulin, 0,09% Natriumazid und einen Tracer, der Nordiazepam markiert mit Fluorescein ist.

Verdünnungsmittelinhaltsstoffe:
85% Naphthalin-1-sulfonsäure (alpha), 20% Natriumsalz von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, 0,20% 1,10-Phenanthrolinmono hydrat, 1,25% Lithiumsalz von Dodecylsulfat, 0,09% Natrium azid.

Serumbenzodiazepin-Kalibratoren:
Die Kalibratoren wurden mit normalem Humanserum hergestellt unter Verwendung von Nordiazepam in einem Anteil von 0, 25, 50, 100 und 200 ng/ml, wie vorher für Secobarbital beschrie ben.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Menge eines Analyten, der in einer Testprobe vorhanden ist, mit einem Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt entweder in der klini schen Probe oder einer Reagenzienmischung, die den Analyt enthält, mit mindestens einer Verbindung, ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus 1,10-Phenanthrolin, 8-Hydroxy-7-iod-5-chinolin, Naphthalin-1-sulfonsäure und Salzen davon und irgendeiner Kombination davon, in Kon takt gebracht wird.

2. Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay für einen Zielana lyten in einer Testprobe mit vermindertem Hinter grundrauschen, dadurch gekennzeichnet, daß die analythaltige klinische Probe oder eine analythaltige Reagenzmischung mit einer wirksamen Menge mindestens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1,10-Phenanthrolin, 8-Hydroxy-7-iod-5-chinolin, Naphthalin-1-sulfonsäure, Salzen davon und irgendeiner Kombination davon, in Kontakt gebracht wird.

3. Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay für einen Zielana lyten in einer Testprobe mit verbesserter Analytwieder gewinnung, dadurch gekennzeichnet, daß die analythaltige klinische Probe oder eine analythaltige Reagenzmischung mit einer wirksamen Menge mindestens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1,10-Phenanthro lin, 8-Hydroxy-7-iod-5-chinolin, Naphthalin-1-sulfon säure, Salzen davon und irgendeiner Kombination davon, in Kontakt gebracht wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Testprobe eine klinische Probe ist ausgewählt aus Serum, Plasma oder Urin.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die ausgewählte Verbindung 1,10- Phenanthrolin oder 8-Hydroxy-7-iod-5-chinolin ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die ausgewählten Verbindungen in Kombination Naphthalin-1-sulfonsäure und 1,10-Phenan throlin oder Naphthalin-1-sulfonsäure und 8-Hydroxy-7- iod-5-chinolin sind.

7. Verwendung mindestens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1,10-Phenanthrolin, 8-Hydroxy- 7-iod-5-chinolin, Naphthalin-1-sulfonsäure und den Salzen davon, zur Reduktion des Hintergrundrauschens bei einem Fluoreszenz-Polarisations-Assay.

8. Verwendung mindestens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1,10-Phenanthrolin, 8-Hydroxy- 7-iod-5-chinolin, Naphthalin-1-sulfonsäure und den Salzen davon, zur Verbesserung der Analytwiedergewinnung bei einem Fluoreszenz-Polarisations-Assay.

9. Reagenziensatz zur Durchführung eines Fluoreszenz-Pola risations-Immunoassays zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Testprobe, dadurch gekennzeich net, daß er mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1,10-Phenanthrolin, 8-Hydroxy- 7-iod-5-chinolin und Salzen davon, und gegebenenfalls Naphthalin-1-sulfonsäure enthält.

10. Reagenziensatz nach Anspruch 9 enthaltend:

1. Lithiumdodecylsulfat im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 2%;
2. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin im Bereich von etwa 10 bis etwa 30%;
3. 1,10-Phenanthrolin im Bereich von etwa 0,06 bis etwa 0,25% und
4. Alkaliazid im Bereich von etwa 0,09 bis etwa 3,0%.

11. Reagenziensatz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem Naphthalin-1-sulfonsäure im Bereich von etwa 0,75 bis etwa 5% enthält.

12. Reagenziensatz nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekenn zeichnet, daß das Alkaliazid Natriumazid ist.

13. Reagenziensatz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Einzelreagenz ist, das ungefähr 0,85% Naph thalin-1-sulfonsäure, 20% Natriumsalz von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, 0,20% 1,10-Phenanthrolinmonohydrat, 1,25% Lithiumsalz von Dodecylsulfat und 0,09% Natrium azid enthält.