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DE19749091C1 - New Antibodies against vasodilator-stimulated phosphoprotein - Google Patents

New Antibodies against vasodilator-stimulated phosphoprotein

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DE19749091C1
DE19749091C1 DE19749091A DE19749091A DE19749091C1 DE 19749091 C1 DE19749091 C1 DE 19749091C1 DE 19749091 A DE19749091 A DE 19749091A DE 19749091 A DE19749091 A DE 19749091A DE 19749091 C1 DE19749091 C1 DE 19749091C1
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Abstract

Antibodies against vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) which only bind VASP as an antigen when VASP is present in phosphorylated form. Reagents are thus provided for the evaluation and modulation of endothelial function. An Independent claim is also included for a hybridoma cell line which produces a monoclonal antibody.

Description

Die Erfindung betrifft einen Antikörper gegen VASP (Vasodilator-Stimuliertes Phospho­ protein), der VASP nur dann als Antigen bindet, wenn VASP in phosphorylierter Form vorliegt, Hybridomzellen zu dessen Herstellung, sowie die Verwendung des Antikörpers bzw. der Antikörperfragmente als Diagnostikum und/oder Therapeutikum.The invention relates to an antibody against VASP (vasodilator-stimulated phospho protein), which only binds VASP as an antigen if VASP is in phosphorylated Form is present, hybridoma cells for its production, as well as the use of the Antibody or the antibody fragments as a diagnostic and / or therapeutic agent.

Erkrankungen des Gefäßsystems sind für einen großen Teil chronischer und lebensbedrohlicher Erkrankungen wie Herzinfarkt, Schlaganfall, arterielle Verschlußerkrankung und viele Formen des Nierenversagens verantwortlich.Vascular system diseases are for a large part chronic and life-threatening diseases such as heart attack, stroke, arterial Occlusive disease and many forms of kidney failure are responsible.

Von besonderer Bedeutung für die Regulation des Gefäßsystems sind insbesondere die Endothelzellen, die unter anderem das Blutgerinnungssystem, den Funktionszustand der Thrombozyten, die Einwanderung von Entzündungs- und Tumorzellen in die Gefäßwand, den Kontraktions- und Wachstumszustand von glatten Muskelzellen und damit auch Blutdruck und Gefäßwandstruktur sowie die Gefäßneubildung kontrollieren. Viele dieser Gefäßwandfunktionen sind bei wichtigen vaskulären Erkrankungen gestört, was letztendlich zu Herzinfarkt, Schlaganfall und vielen Formen des Nierenversagens führen kann.Are of particular importance for the regulation of the vascular system especially the endothelial cells, which include the blood coagulation system, the functional status of platelets, the immigration of inflammatory and Tumor cells in the vascular wall, the contraction and growth state of smooth muscle cells and thus also blood pressure and vascular wall structure as well as the Check new vessel formation. Many of these vascular wall functions are included major vascular disorders, ultimately leading to heart attack, Stroke and many forms of kidney failure.

Das Endothel bildet die wichtigen Substanzen Prostacyclin (PGI2) und Stickstoffmonoxid (NO), bekannt auch als endothelium-derived relaxing factor (EDRF), die sowohl die Thrombozyten als auch die Gefäßmuskelzellen hemmen. Die Endothelfunktionen werden durch die genannten Endothelfaktoren wie beispielsweise Prostacyclin (PGI2) oder EDRF z. B. NO, gesteuert.The endothelium forms the important substances prostacyclin (PGI 2 ) and nitrogen monoxide (NO), also known as endothelium-derived relaxing factor (EDRF), which inhibit both platelets and vascular muscle cells. The endothelial functions are affected by the endothelial factors mentioned, such as prostacyclin (PGI 2 ) or EDRF z. B. NO controlled.

Für die gezielte Behandlung von Krankheiten, die mit einer endothelialen Dysfunktion einhergehen, ist es somit erforderlich biochemische Parameter zu entwickeln, die eine Diagnostik und Verlaufskontrolle einer endothelialen Dysfunktion ermöglichen. For the targeted treatment of diseases with an endothelial Dysfunction is accompanied by biochemical parameters develop a diagnosis and follow-up of an endothelial Allow dysfunction.  

Wünschenswert ist die möglichst frühzeitige Erkennung von endothelialen Dysfunktionen, also in einem Stadium, in dem sich durch endotheliale Dysfunktionen hervorgerufenen irreversible Schäden wie beispielsweise artherosklerotische Läsionen noch nicht manifestiert haben.Early detection of endothelial cells is desirable Dysfunction, i.e. at a stage in which endothelial Dysfunctional irreversible damage such as artherosclerotic lesions have not yet manifested.

Eine frühzeitige Bestimmung einer endothelialen Dysfunktion ermöglicht die Entwicklung von neuen therapeutischen Ansätzen, die eine reversible Behandlung der endothelialen Dysfunktion bewirken können.The early determination of endothelial dysfunction enables the Development of new therapeutic approaches involving reversible treatment endothelial dysfunction.

Bekannten Methoden zur Bestimmung der in vivo Endothelfunktionen sind invasive Nachweisverfahren wie beispielsweise die quantitative Angiographie oder aber auch nicht-invasive, bildgebende Verfahren. Nachteil dieser Methoden ist, daß diese Untersuchungen direkt am Patienten durchgeführt werden, schwer quantifizierbar und sehr teuer sind.Known methods for determining in vivo endothelial functions are invasive Detection methods such as quantitative angiography or non-invasive imaging. The disadvantage of these methods is that Examinations are carried out directly on the patient, difficult to quantify and are very expensive.

Es ist daher wünschenswert, auch biochemische-immunbiologische Methoden zur Verfügung zu haben, die eine schnelle und einfache ex vivo Bestimmung der Endothelfunktionen in biologischen Material, beispielsweise in Zell- oder Blutproben mit Hilfe von Routineuntersuchungen im Labor ermöglichen.It is therefore desirable to also use biochemical-immunobiological methods To have available a quick and easy ex vivo determination of the Endothelial functions in biological material, for example in cell or Allow blood tests with the help of routine tests in the laboratory.

Kürzlich wurde das humane VASP (Vasodilator-Stimuliertes Phosphosprotein) entdeckt, isoliert und molekulargenetisch charakterisiert (Haffner et al., EMBO J. 14, 19-27, 1995), das in Thrombozyten und Gefäßwandzellen in Antwort auf blutdrucksenkende (vasodilatorische) Hormone und Pharmaka phosphoryliert wird.Recently the human VASP (Vasodilator-stimulated phosphos protein) discovered, isolated and characterized by molecular genetics (Haffner et al., EMBO J. 14, 19-27, 1995) that in platelets and vascular wall cells in response to blood pressure lowering (vasodilatory) hormones and pharmaceuticals is phosphorylated.

VASP ist eine wichtige Komponente des physiologisch, pathophysiologisch und pharmakologisch sehr wichtigen Signalwegs ANF/NO/cGMP/cGMP-Proteinkinase sowie des cAMP/cAMP-Proteinkinasesignalwegs. VASP wird in fast allen humanen und tierischen Zellen exprimiert, besonders hohe Konzentrationen findet man in Thrombozyten, vaskulären glatten Muskelzellen und Fibroblasten. In kultivierten Zellen ist VASP mit fokalen Kontakten (Zell-Matrix-Kontakstellen), Zell-Zell- Kontakten, Mikrofilamenten und dynamischen Membranregionen (z. B. Leading edge) assoziiert (Walter et al., Agents and Actions 45S, 255-268, 1995). VASP is an important component of the physiological, pathophysiological and pharmacologically very important signaling pathway ANF / NO / cGMP / cGMP protein kinase and the cAMP / cAMP protein kinase signaling pathway. VASP is used in almost all human and animal cells, particularly high concentrations can be found in Platelets, vascular smooth muscle cells and fibroblasts. In cultivated Cells is VASP with focal contacts (cell-matrix contact points), cell-cell Contacts, microfilaments and dynamic membrane regions (e.g. leading edge) (Walter et al., Agents and Actions 45S, 255-268, 1995).  

Die Phosphorylierung von VASP im Gefäßsystem korreliert mit der Hemmung der Thrombozytenadhäsion/-aggregation, der Hemmung der glatten Muskelkontraktion/- migration sowie der Hemmung der parazellulären endothelialen Permeabilität.The phosphorylation of VASP in the vascular system correlates with the inhibition of the Platelet adhesion / aggregation, inhibition of smooth muscle contraction / migration and inhibition of paracellular endothelial permeability.

VASP wird an drei unterschiedlichen Stellen phosphoryliert und dephosphoryliert (Serin 157, Serin 239 und Threonin 278, s. Horstrup et al., Eur. J. Biochem. 225, 21-27 (1994)). Serin 239 wird gelegentlich auch als Serin 238 bezeichnet, und zwar dann, wenn das erste Methionin von VASP nicht mitgezählt wird.VASP is phosphorylated and dephosphorylated at three different locations (Serin 157, Serin 239 and Threonin 278, see Horstrup et al., Eur. J. Biochem. 225, 21-27 (1994)). Serine 239 is sometimes also called Serin 238, namely when the first methionine from VASP is not counted.

Eine Serin 239-Phosphorylierung des VASP erfolgt in intakten humanen vaskulären Zellen (Thrombozyten, Endothelzellen, glatten Muskelzelten) in Antwort auf physiologische und pharmakologische NO-Donoren sowie Thrombozyteninhibitoren und Vasodilatoren.Serin 239 phosphorylation of the VASP takes place in intact human vascular Cells (platelets, endothelial cells, smooth muscle tents) in response to physiological and pharmacological NO donors as well as platelet inhibitors and vasodilators.

Die Serin 239-Phosphorylierung des VASP wird insbesondere von cGMP- abhängigen Proteinkinasen vermittelt, die über das cGMP von wichtigen Hormonen wie beispielsweise Natriuretische Peptide oder NO-freisetzende Substanzen und Pharmaka aktiviert werden. Serin 239-Phosphorylierung des VASP wird desweiteren auch von cAMP-abhängigen Proteinkinasen vermittelt, die über cAMP erhöhende Hormone und Pharmaka aktiviert werden.The serine 239 phosphorylation of the VASP is particularly by cGMP dependent protein kinases mediated by the cGMP of important hormones such as natriuretic peptides or NO-releasing substances and Pharmaceuticals are activated. Serine 239 phosphorylation of the VASP will also continue also mediated by cAMP-dependent protein kinases that increase via cAMP Hormones and pharmaceuticals are activated.

cAMP-abhängigen Proteinkinasen phosphorylieren hauptsächlich die Serin 157 Position aber auch die Serin 239-Position des VASP. Auch wurde eine enge Korrelation der VASP-Phosphorylierung an Position Serin 157 und der Inhibierung der Bindung von Fibrinogen an Glykoprotein IIb-IIIa in menschlichen Bluttplättchen beobachtet (Horstrup et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 14509-14517).cAMP-dependent protein kinases mainly phosphorylate serine 157 Position but also the serine 239 position of the VASP. Also became a close one Correlation of VASP phosphorylation at position serine 157 and inhibition the binding of fibrinogen to glycoprotein IIb-IIIa in human platelets observed (Horstrup et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 14509-14517).

Die Bestimmung des Phosphorylierungsgrads von VASP in biologischen Material, beispielsweise in Extrakten von Geweben und Zellen, insbesondere die Bestimmung der VASP-Phosphorylierung an Position 239 und/oder Position 157 wäre ein wichtiger biochemischer Parameter, dessen Bestimmung als diagnostisches Nachweissystem für alle cGMP- und/oder cAMP erhöhende Hormone oder Pharmaka, wie beispielsweise Atrialer natriuretischer Faktor (ANF), Guanylin, NO-freisetzende Substanzen und Pharmaka ermöglichen würde und ferner Rückschlüße über die in vivo Endothelfunktionen zulässt.Determination of the degree of phosphorylation of VASP in biological material, for example in extracts of tissues and cells, especially those Determination of VASP phosphorylation at position 239 and / or position 157 would be an important biochemical parameter whose determination as diagnostic detection system for all cGMP and / or cAMP elevators Hormones or pharmaceuticals, such as, for example, atrial natriuretic factor (ANF),  Guanylin, NO-releasing substances and pharmaceuticals would enable and further allows conclusions about the in vivo endothelial functions.

Endothelfunktionen sind solche Funktionen, die durch Endothelfaktoren, wie beispielsweise Prostacyclin (PgI2) oder EDRF z. B. NO, gesteuert werden.Endothelial functions are functions which are influenced by endothelial factors, such as prostacyclin (PgI 2 ) or EDRF z. B. NO, can be controlled.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war nun die Entwicklung von biochemisch- immunbiologischen Methoden, die eine schnelle und einfache qualitative und/oder quantitative Bestimmung des Phosphorylierungsstatus von VASP in biologischen Material, beispielsweise in menschlichen Zell- oder Blutproben ermöglicht.The object of the present invention was now the development of biochemically immunobiological methods that are quick and easy qualitative and / or quantitative determination of the phosphorylation status of VASP in biological Material, for example in human cell or blood samples.

Diese Aufgabe wurde gelöst durch die Bereitstellung eines Antikörpers, der VASP nur als Antigen bindet, wenn dieses in phosphorylierter Form vorliegt (s. auch U. Walter, Blick 1/97 Universität Würzburg, S. 79-81, 1997).This problem was solved by providing an antibody, the VASP only binds as antigen if it is in phosphorylated form (see also U. Walter, Blick 1/97 University of Würzburg, pp. 79-81, 1997).

Die Erfindung betrifft somit den monoklonalen Antikörper 16C2 DSM ACC 2330 und dessen Fragmente, die das VASP oder Peptide, die die Peptidsequenz um das Serin 239 von VASP umfassen nur dann als Antigen binden, wenn das Serin an Position 239 phosphoryliert ist (Phosphoserin 239-VASP).The invention thus relates the monoclonal antibody 16C2 DSM ACC 2330 and its fragments, the the VASP or peptides that are the peptide sequence around serine 239 of VASP include bind as antigen only if the serine at position 239 is phosphorylated (phosphoserine 239-VASP).

Unter dem Begriff VASP im Sinne der Erfindung sind auch Derivate von VASP zu verstehen, d. h. funktionell äquivalente Teile, Mutanten, Fragmente oder Varianten des VASP, beispielsweise Phosphoserin 239-VASP, das zusätzlich an Position Serin 157 und/oder Threonin 278 phosphoryliert ist, aber beispielsweise auch Glykolysierungsmutanten, sowie andere kovalente Modifikationen und Strukturelemente, die für die Protein-Protein-Wechselwirkungen von Bedeutung sind. Der Begriff VASP im Sinne der Erfindung umfaßt sowohl das menschliche VASP als auch VASP aus anderen Spezies, insbesonders aus Säugetieren wie beispielsweise Ratte, Maus, Kaninchen, Hund, Schwein oder Affe.Derivatives of VASP are also included under the term VASP in the sense of the invention understand d. H. functionally equivalent parts, mutants, fragments or variants  of the VASP, for example phosphoserine 239-VASP, which is also in position Serine 157 and / or threonine 278 is phosphorylated, but also for example Glycolysis mutants, as well as other covalent modifications and Structural elements that are important for protein-protein interactions are. The term VASP in the sense of the invention includes both human VASP as well as VASP from other species, especially from mammals such as for example rat, mouse, rabbit, dog, pig or monkey.

Bevorzugt sind desweiteren monoklonale Antikörper, die die oben genannten Eigenschaften aufweisen und in der Durchflußzytometrie eingesetzt werden können. Dies setzt voraus, daß die Spezifität der erfindungsgemäßen Antikörper auch dann erhalten bleibt, wenn das Antigen Bedingungen ausgesetzt wird, die die Konformation des Antigens verändern können, wie es bei den in der Durchflußzytometrie überlicherweise angewandten Fixierungsschritten zu erwarten ist. Die erfindungsgemäßen Antikörper können bespielsweise durch einfaches Austesten daraufhin untersucht werden, ob sie zum Einsatz in der Durchflußzytometrie geeignet sind.Preference is also given to monoclonal antibodies which are those mentioned above Have properties and can be used in flow cytometry. This presupposes that the specificity of the antibodies according to the invention also then is preserved when the antigen is exposed to conditions that the Conformation of the antigen can change, as in the in the Flow cytometry of the fixation steps commonly used can be expected is. The antibodies according to the invention can be, for example, simple Testing will then be examined to see if they are used in the Flow cytometry are suitable.

Der erfindungsgemäße Antikörper kann nach dem Fachmann an sich bekannten Verfahren hergestellt werden. Für die Herstellung des monoklonalen Antikörpers sei insbesonders die Herstellung von Hybridomzellen nach der von Köhler und Milstein beschriebenen Technik genannt (Köhler und Milstein, Nature 256; 495, 1975). Die Spezifität der gereinigten Antikörper läßt sich beispielsweise durch folgende Testverfahren überprüfen:
The antibody according to the invention can be produced by methods known per se to the person skilled in the art. For the production of the monoclonal antibody, the production of hybridoma cells according to the technique described by Köhler and Milstein (Köhler and Milstein, Nature 256; 495, 1975) should be mentioned in particular. The specificity of the purified antibodies can be checked, for example, using the following test methods:

  • a) Western blot mit rekombinanten VASP, das durch cAMP- bzw. cGMP- abhängige Proteinkinasen unterschiedlich stark phosphoryliert ist, wobei ein positives Signal nur mit phosphorylierten VASP zu beobachten sein darf.a) Western blot with recombinant VASP, which by cAMP or cGMP dependent protein kinases are phosphorylated to different extents, with a positive signal can only be observed with phosphorylated VASP.
  • b) Western blot mit Extrakten von Zellen, beispielsweise Pkt2-Zelllen, die mit humanen VASP bzw. verschiedenen mutierten VASP, bei denen jeweils eine der drei Phosphorylierungsstellen mutiert und dadurch eliminiert ist ((S157A) VASP, (S239A)VASP und (T278A)VASP) und jeweils der humanen cGMP-Proteinkinase transfiziert sind. Geeignet sind solche Antikörper, bei denen durch die S239A Mutation, nicht aber durch die beiden anderen Mutation die positiven Signale im Western blot eliminiert werden.b) Western blot with extracts of cells, for example Pkt2 cells, which with human VASP or various mutant VASP, each of which has one of the  three phosphorylation sites are mutated and thereby eliminated ((S157A) VASP, (S239A) VASP and (T278A) VASP) and each of the human cGMP protein kinase are transfected. Antibodies are suitable in which the S239A Mutation, but not the positive signals in the other two mutations Western blot can be eliminated.
  • c) Western blot mit humanen Thrombozyten, die mit verschiedenen Vasodilatoren (z. B. Prostacyclin, NO-Donoren) bzw. Aktivatoren der cAMP- oder cGMP-Proteinkinase behandelt worden sind. Geeignet ist der Antikörper dann, wenn nur mit phosphorylierten VASP eine spezifische Bande im Extrakt detektiert ist. Analog können die Antikörper auch mit humanen Fibroblasten sowie Thrombozyten der Ratte und Maus durchgetestet werden.c) Western blot with human platelets with different Vasodilators (e.g. prostacyclin, NO donors) or activators of the cAMP or cGMP protein kinase have been treated. The antibody is then suitable if only with phosphorylated VASP a specific band is detected in the extract is. Analogously, the antibodies can also be used with human fibroblasts Platelets from the rat and mouse are tested.
  • d) Immunfluoreszenzuntersuchungen mit fixierten humanem Thrombozyten und Endothelzellen. Ein positives Signal wird beobachtet, wenn VASP als Phosphoprotein vorhanden ist.d) immunofluorescence studies with fixed human platelets and Endothelial cells. A positive signal is observed when VASP is considered Phosphoprotein is present.

Die Erfindung betrifft ferner die Hybridomzelllinien 16C2 DSM ACC 2330 die den monoklonalen Antikörper 16C2 produziert.The invention further relates to the hybridoma cell lines 16C2 DSM ACC 2330 that produces the 16C2 monoclonal antibody.

Die Hybridomzellinie 16C2 DSM ACC 2330, die den monoklonalen Antikörper 16C2 produziert, wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Marschroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig hinterlegt.The 16C2 DSM ACC 2330 hybridoma cell line, which produces the 16C2 monoclonal antibody, was with the German under the terms of the Budapest Treaty Collection of microorganisms and cell cultures, Marschroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig deposited.

Der erfindungsgemäße Antikörper eignet sich zur qualitativen und/oder quantitativen, vorzugsweise zur quantitativen Bestimmung sowohl der unter in vitro- Bedingungen als auch unter in vivo-Bedingungen auftretenden Serin 239 Phosphorylierung des VASP. The antibody according to the invention is suitable for qualitative and / or quantitative, preferably for quantitative determination of both the in vitro Conditions as well as occurring under in vivo conditions Serine 239 Phosphorylation of the VASP.  

Der erfindungsgemäße Antikörper eignet sich ferner zur qualitativen und/oder quantitativen, vorzugsweise zur quantitativen Bestimmung von Phosphoserin 239-VASP in biologischen Material.The antibody of the invention is also suitable for qualitative and / or quantitative, preferably for the quantitative determination of Phosphoserine 239-VASP in biological material.

Unter biologischen Material wird beispielsweise verstanden: Zellextrakte, Gewebeextrakte, Zellschnitte, Zellgewebe, Zellen wie zum Beispiel Thrombozyten, Leukozyten, Endothelzellen, glatte Muskelzellen, Fibroblasten. Das biologische Material kann vom Menschen oder auch von anderen Säugetieren wie beispielsweise Ratte, Maus, Kaninchen, Hund, Schwein oder Affe stammen. Bevorzugt ist biologisches Material, das vom Menschen stammt.Biological material is understood to mean, for example: cell extracts, Tissue extracts, cell sections, cell tissue, cells such as platelets, Leukocytes, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts. The biological Material can be from humans or other mammals such as for example rat, mouse, rabbit, dog, pig or monkey. Biological material that comes from humans is preferred.

Eine quantitative Bestimmung von Phosphoserin 239-VASP in biologischen Material mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper ist beispielsweise durch eine quantitative Auswertung von Autoradiogrammen von Western Blots nach dem Fachmann bekannten Methoden, beispeilsweise mittels NHI-gel blotting Image 1.6 Software, oder auch durch Immunfluoreszenz möglich.A quantitative determination of Phosphoserine 239-VASP in biological Material with the help of the antibodies according to the invention is, for example, by a quantitative evaluation of autoradiograms from Western blots after the Methods known to those skilled in the art, for example using NHI-gel blotting Image 1.6 Software, or also possible by immunofluorescence.

Aufgrund der Korrelation zwischen der Phosphorylierung von Serin 239 des VASP und der Aktivität cGMP-abhängiger Proteinkinasen eignet sich der erfindungsgemäße Antikörper auch als Diagnostikum für cGMP- Signalwege.Because of the correlation between the phosphorylation of serine 239 of the VASP and the activity of cGMP-dependent protein kinases the antibody according to the invention is also suitable as a diagnostic agent for cGMP Signal paths.

Die Bestimmung von Phosphoserin 239-VASP in biologischen Material mittels Western Blot-technik und Immunfluoreszenz mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper ermöglicht auch den diagnostischen Nachweis für cGMP-erhöhende Substanzen, Hormone oder Pharmaka. Beispielsweise seien genannt: ANF, Guanylin, NO-freisetzende Substanzen oder Pharmaka. Beispielsweise kann die Therapie- und Verlaufskontrollen von NO-Donoren verfolgt werden was unter anderem Erkenntnisse über eventuell auftretende Nitrattoleranzphänomene erlaubt. Determination of Phosphoserine 239-VASP in Biological Material Using Western blot technique and immunofluorescence with the help of the invention Antibody also enables diagnostic evidence for cGMP-elevating Substances, hormones or pharmaceuticals. Examples include: ANF, Guanylin, NO-releasing substances or pharmaceuticals. For example, the Therapy and follow-up controls of NO donors are tracked under what other knowledge about possible nitrate tolerance phenomena.  

Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragmente davon in Diagnostik und/oder Therapie.The invention thus also relates to the use of the invention Antibody or fragments thereof in diagnostics and / or therapy.

Bei den erfindungsgemäßen Diagnostierverfahren handelt es sich um Verfahren, die außerhalb des menschlichen Körpers (ex vivo) im Labor durchgeführt werden können.The diagnostic methods according to the invention are methods that outside the human body (ex vivo) in the laboratory can.

Der erfindungsgemäße Antikörper kann zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrad von VASP in biologischen Material eingesetzt werden, daß aus verschieden Spezies stammt. Beispielhaft seien genannt: Mensch, Ratte, Maus, Kaninchen, Hund, Schwein oder Affe. Bevorzugt ist Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper zur Bestimmung von phosphorylierten VASP in biologischen Material von Mensch, Ratte, Maus oder Hund. Besonders bevorzugt ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper zur Bestimmung von phosphorylierten VASP in biologischen Material vom Menschen.The antibody of the invention can be used to determine the Degree of phosphorylation of VASP can be used in biological material that comes from different species. Examples include: human, rat, mouse, Rabbit, dog, pig or monkey. Use of the is preferred Antibodies according to the invention for the determination of phosphorylated VASP in biological material from humans, rats, mice or dogs. Is particularly preferred the use of the antibodies according to the invention for the determination of phosphorylated VASP in human biological material.

Der erfindungsgemäße Antikörper oder Fragmente davon können auch in Biosensoren eingesetzt werden. Biosensoren sind dem Fachmann an sich bekannt. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, wobei ein zweiter spezifischer Bindungspartner, wie z. B. ein Antikörper, ein Lectin oder ein Rezeptor eingesetzt wird. Zum Nachweis und zur Quantifizierung kann dabei einer der spezifischen Bindungspartner ein nachweisbares Label tragen. Diese Label sind dem Fachmann an sich bekannt und können z. B. ein Chromophor, ein Luminophor, ein Fluorophor, ein Enzym, ein radioaktives Isotop oder ein gefärbter oder auch ungefärbter Partikel sein. Bevorzugt ist ein Verfahren, wobei der nicht-markierte spezifische Bindungspartner nach dem Fachmann an sich bekannten Verfahren, direkt oder indirekt, z. B. über einen weiteren Antikörper oder eine Biotin-Avidin Brücke an eine Festphase gekoppelt ist. The antibody according to the invention or fragments thereof can also be used in Biosensors are used. Biosensors are known per se to the person skilled in the art. A method is particularly preferred, a second more specific Binding partners, such as B. an antibody, a lectin or a receptor becomes. One of the specific ones can be used for detection and quantification Binding partners have a verifiable label. These labels are for the specialist known per se and can e.g. B. a chromophore, a luminophore, a fluorophore, an enzyme, a radioactive isotope or a colored or uncolored particle be. A method is preferred, the unlabeled specific one Binding partner according to methods known per se to the person skilled in the art, directly or indirectly, e.g. B. via another antibody or a biotin-avidin bridge to one Fixed phase is coupled.  

Der erfindungsgemäße Antikörper oder dessen Fragmente können auch nach dem Fachmann bekannten Methoden radioaktiv markiert werden, um sie für die Immunszintigraphie bzw. auch für die Immuntherapie einzusetzen. Zusätzlich können diese monoklonalen Antikörper als Wirkstoffträger eingesetzt werden und zur Therapie von durch endotheliale Dysfunktionen hervorgerufen Erkrankungen eingesetzt werden.The antibody according to the invention or its fragments can also be after the Methods known to those skilled in the art are radiolabelled to use them for Use immunoscintigraphy or also for immunotherapy. In addition these monoclonal antibodies can be used as drug carriers and for the therapy of diseases caused by endothelial dysfunctions be used.

Auch die Erzeugung von Antikörperkonstrukten, z. B. durch Einsetzen der hypervariablen Regionen in ein humanes MAK-Gerüst ist nach der Analyse der vollständigen Nukleotidsequenz der V-Gene des MAK 16C2 technisch möglich (Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Verhoyen et al., Science 239, 1534-1536, 1988).The generation of antibody constructs, e.g. B. by inserting the is hypervariable regions in a human MAK scaffold after analysis of the complete nucleotide sequence of the V genes of the MAK 16C2 technically possible (Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Verhoyen et al., Science 239, 1534-1536, 1988).

Bevorzugt ist die Quantifizierung des Antigen-gebundenen Antikörpers in Blutplättchen mittels Durchflußzytometrie, beispielsweise an Vollblutproben, die gegebenenfalls nach dem Fachmann bekannten Methoden fixiert wurden. Methoden der Durchflußzytometrie sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise wie in G. Otten und W. M. Yokoyama (1992) Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan, Current Protocols in Immunology, 5.4.1-5.4.19 beschrieben durchgeführt werden.The quantification of the antigen-bound antibody is preferred in Platelets by means of flow cytometry, for example on whole blood samples were optionally fixed by methods known to those skilled in the art. Flow cytometry methods are known to the person skilled in the art and can for example as in G. Otten and W. M. Yokoyama (1992) Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan, Current Protocols in Immunology, 5.4.1-5.4.19 described.

Die durchflußzytometrische Analyse der VASP-Serin 239-Phosphorylierung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Antikörpers ist nicht auf humane Thrombozyten beschränkt sondern kann auch an anderen Zelltypen wie zum Beispiel Lymphozyten, Monozyten, Leukozyten, Endothelzellen, glatten Muskelzellen durchgeführt werden.The flow cytometric analysis of the VASP-Serin 239 phosphorylation using the antibody of the invention not limited to human platelets but can also be used on others Cell types such as lymphocytes, monocytes, leukocytes, endothelial cells, smooth muscle cells are performed.

Die Bestimmung von Phosphoserin 239-VASP mit Hilfe des erfindungsgemäßen Antikörpers in frisch entnommenen humanen Thrombozyten mittels Durchflußzytometrie erlaubt die ex vivo Bestimmung der in vivo Aktivität der Endothelfaktoren wie beispielsweise NO, Prostacyclin und somit eine Beurteilung der Endothelfunktion bzw. Endotheldysfunktion bei kardiovaskulären Erkrankungen, wie man sie beispielsweise bei Arteriosklerose, Hypertonie, Diabetes, Herzinsuffizienz und Nierensuffizienz findet.The determination of phosphoserine 239-VASP with the help of the antibody according to the invention in freshly removed human platelets using flow cytometry allows ex vivo Determination of the in vivo activity of endothelial factors such as NO, Prostacyclin and thus an assessment of endothelial function or Endothelial dysfunction in cardiovascular disease, how to get it  for example in arteriosclerosis, hypertension, diabetes, heart failure and Kidney failure takes place.

Die Bestimmung der VASP-Serin 239- Phosphorylierung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Antikörpers ermöglicht ferner eine Therapiekontrolle der obengenannten Krankheiten. Auch kann die Entwicklung von Therapieresistenzen, wie beispielsweise Nitrattoleranz bestimmt werden.Determination of VASP Serine 239 Phosphorylation with the aid of the antibody according to the invention also enables a therapy control of the above diseases. Development can also of therapy resistance, such as nitrate tolerance.

Der erfindungsgemäße Antikörper kann auch als Therapeutikum eingesetzt werden, indem er den Phosphorylierungsstatus und oder die Protein- Wechselwirkung von VASP in biologischen Material beinflussen.The antibody according to the invention can also be used as a therapeutic agent by checking the phosphorylation status and or the protein Influence the interaction of VASP in biological material.

Die Erfindung betrifft somit auch pharmazeutische Zubereitungen enthaltend den erfindungsgemäßen Antikörper.The invention thus also relates to pharmaceutical preparations containing the antibodies of the invention.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können enteral (oral), parenteral (intravenös), rektal oder lokal (topisch) angewendet werden. Sie können in Form von Lösungen, Pulvern (Tabletten, Kapseln einschließlich Mikrokapseln), Liposomenpräparaten, Lipid-Komplexen, kolloidalen Dispersionen, Injektionslösungen oder Suppositorien verabreicht werden. Als Hilfsstoffe für derartige Formulierungen kommen die pharmazeutisch üblichen flüssigen oder festen Füllstoffe und Streckmittel, Lösemittel, Emulgatoren, Gleitstoffe, Geschmackskorrigentien, Farbstoffe und/oder Puffersubstanzen in Frage. Als zweckmäßige Dosierung werden 0.1-100 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Sie werden zweckmäßig in Dosierungseinheiten verabreicht, die mindestens die wirksame Tagesmenge der erfindungsgemäßen Antikörper, z. B. 30-3000 mg enthalten.The preparations according to the invention can be enterally (orally), parenterally (intravenously), rectally or locally (topically). You can get in shape of solutions, powders (tablets, capsules including microcapsules), Liposome preparations, lipid complexes, colloidal dispersions, Injection solutions or suppositories can be administered. As auxiliaries for such formulations come in the usual liquid or pharmaceutical form solid fillers and extenders, solvents, emulsifiers, lubricants, Flavors, colorants and / or buffer substances in question. As Appropriate dosage is administered 0.1-100 mg / kg body weight. she are expediently administered in dosage units which are at least the effective daily amount of the antibodies of the invention, e.g. B. 30-3000 mg contain.

Die zu verabreichende Tagesdosis ist abhängig vom Körpergewicht, Alter, Geschlecht und Zustand des Säugers. Unter Umständen können jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber in mehreren kleineren Dosierungseinheiten als auch durch Mehrfachgabe unterteilter Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen.The daily dose to be administered depends on body weight, age, Sex and condition of the mammal. Under certain circumstances, however, can also higher or lower daily doses may be appropriate. The administration of the Daily dose can be given both as a single dose Dosage unit or in several smaller dosage units as well  by giving divided doses several times at certain intervals.

Für die Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen kann der erfindungsgemäße Antikörper in therapeutisch inerten organischen und anorganischen Trägern verarbeitet werden. Beispiele von solchen Trägern für Tabletten, Dragees und Hartgelatinekapseln sind Laktose, Maisstärke oder Derivate davon, Talg und Stearinsäure oder Salze davon. Geeignete Träger für die Herstellung von Lösungen sind Wasser, Polyole, Saccharose, Invertzucker und Glucose. Geeignete Träger für Injektionslösungen sind Wasser, Alkohole, Polyole, Glycerol und pflanzliche Öle. Geeignete Träger für Suppositorien sind pflanzliche und gehärtete Öle, Wachse, Fette und halbflüssige Polyole. Die pharmazeutischen Zubereitungen können auch Konservierungsmittel, Lösemittel, Stabilisierungsmittel, Netzmittel, Emulgatoren, Süßstoffe, Farbstoffe, Geschmacksmittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks, Puffer, Überzugsmittel, Antioxidantien, sowie ggf. andere therapeutische Wirkstoffe enthalten.For the production of pharmaceutical preparations, the Antibodies according to the invention in therapeutically inert organic and inorganic carriers can be processed. Examples of such carriers for Tablets, coated tablets and hard gelatin capsules are lactose, corn starch or Derivatives thereof, tallow and stearic acid or salts thereof. Suitable carriers for the Solutions are made up of water, polyols, sucrose, and invert sugar Glucose. Suitable carriers for injection solutions are water, alcohols, polyols, Glycerol and vegetable oils. Suitable carriers for suppositories are vegetable and hardened oils, waxes, fats and semi-liquid polyols. The pharmaceutical Preparations can also contain preservatives, solvents, stabilizers, Wetting agents, emulsifiers, sweeteners, colorants, flavoring agents, salts for Change in osmotic pressure, buffers, coating agents, antioxidants, as well possibly contain other therapeutic agents.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der erfindungsgemäße Antikörper mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und gegebenenfalls weiteren geeigneten Wirk, Zusatz- oder Hilfsstoffen in eine geeignete Darreichungsform gebracht wird. The invention also relates to a method for producing an inventive Medicament, which is characterized in that the Antibodies according to the invention with a pharmaceutically suitable and physiologically compatible carriers and, where appropriate, other suitable active ingredients, Additives or auxiliary substances are brought into a suitable dosage form.  

VASP ermöglicht über die Bindung an Prolin-reiche Peptide, wie sie zum Beispiel Zyxin und Vinculin darstellen und die gleichzeitige Bindung seiner eigenen Prolin- reichen Aminosäure-Domäne an Profilin die Bildung von fadenförmigen Actin, wobei VASP als Adaptermolekül fungiert. Eine Störung dieser Protein-Protein- Wechselwirkung kann zu einer fehlerhaften Thrombozytenaggregation oder Gefäßkontraktion führen. So ist die Ausbildung von Actin-Myosin-Brücken Voraussetzung für die Kontraktion von z. B. Glattmuskelzellen. Es wurde gefunden, daß die Phosphorylierung von VASP an der Position Serin 157 mit der Hemmung des Fibrinogenrezeptors Glykoprotein IIb/IIIa korreliert (Horstrup et al., Eur. J. Biochem., 225, 21-27, 1994). Die Bestimmung der VASP-Phosphorylierung an Position Serin 157 ermöglicht somit die systematische Suche nach Substanzen oder Pharmaka, die die Wechselwirkung von VASP mit seinen intrazellulären Bindungspartnern beeinflußt und beispielsweise zur Therapie von Herz- Kreislauferkrankungen, die mit Gefäßschäden einhergehen, geeignet sind.VASP enables through binding to proline-rich peptides, such as, for example Zyxin and Vinculin represent and the simultaneous binding of its own proline rich amino acid domain to profilin, forming filiform actin, wherein VASP acts as an adapter molecule. Disrupting this protein-protein Interaction can lead to defective platelet aggregation or Perform vascular contraction. Such is the formation of actin-myosin bridges Prerequisite for the contraction of z. B. smooth muscle cells. It was found, that the phosphorylation of VASP at the serine 157 position with the inhibition of the fibrinogen receptor glycoprotein IIb / IIIa correlated (Horstrup et al., Eur. J. Biochem., 225, 21-27, 1994). Determination of VASP phosphorylation Position Serin 157 thus enables the systematic search for substances or Pharmaceuticals showing the interaction of VASP with its intracellular Affected binding partners and for example for the therapy of cardiac Circulatory diseases that are associated with vascular damage are suitable.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung und schränken sie in keiner Weise ein.The following examples serve to illustrate the invention and limit it in no way.

BeispieleExamples Beispiel 1example 1 Gewinnung eines monoklonalen Antikörpers gegen Phosphoserin 239-VASPObtaining a monoclonal antibody against phosphoserine 239-VASP

Je ein phosphoryliertes und nicht-phosphoryliertes Peptid, das die Peptidsequenz K LRK VS239 KQ um das Serin 239 umfaßt, wird unter Verwendung eines Applied Biosystem-Peptidsynthesizers (Modell 431A) gemäß der dem Fachmann geläufigen Fmoc-Chemie synthetisiert. Das Phosphoserin im phosphorylierten Peptid wird während der Peptidsynthese mittels Fmoc-Serin [PO(Obzl)OH-OH] der Firma Calbiochem eingebaut. MS-bestätigte Peptide werden mittels RPC und einer VYDAC 218TP-Säule gereinigt (Reinheitsgrad < 98%).One phosphorylated and one non-phosphorylated peptide, which comprises the peptide sequence K LRK VS 239 KQ around the serine 239, is synthesized using an applied biosystem peptide synthesizer (model 431A) according to the Fmoc chemistry known to the person skilled in the art. The phosphoserine in the phosphorylated peptide is incorporated during the peptide synthesis using Fmoc-Serin [PO (Obzl) OH-OH] from Calbiochem. MS-confirmed peptides are purified using RPC and a VYDAC 218TP column (purity <98%).

Die so hergestellten Peptide werden nach Aktivierung durch Bromessigsäure mit thioliertem KLH (Keyhole limpet hemocyanoin, nano Tools) konjugiert. Weibliche Balb/c Mäuse (6 Wochen alt) werden s. c. mit dem KLH-Phosphopeptid (10 µg/Maus) 4 × in 14-täglichem Intervall immunisiert mit kompletten Freunds-Adjuvant in der ersten bzw. imkompletten Adjuvans in den folgenden 3 Injektionen. Anschließend (2 Wochen später) erhalten die Mäuse an drei aufeinander folgenden Tagen Booster- Injektionen mit 10 mg Immunogen in PBS (Phosphate buffer saline). 1 Tag nach der letzten Booster-Injektion werden die Mäuse getötet und die Milz entfernt. Milzzellen werden isoliert und unter Verwendung der etablierten Köhler/Milstein-Methodik mit nicht-produzierenden Myelomzellen (z. B. PAI-Zellen, J. W. Stocker et al. (1982) Res. Disclosure, 21713) fusioniert.After activation by bromoacetic acid, the peptides thus produced are mixed with thiolated KLH (Keyhole limpet hemocyanoin, nano Tools) conjugated. Female Balb / c mice (6 weeks old) become s. c. with the KLH phosphopeptide (10 µg / mouse) Immunized 4 × in a 14-day interval with complete Freund's adjuvant in the first or incomplete adjuvant in the following 3 injections. Then (2nd Weeks later), the mice receive boosters on three consecutive days. Injections with 10 mg immunogen in PBS (Phosphate buffer saline). 1 day after the The last booster injection kills the mice and removes the spleen. Spleen cells are isolated and using the established Köhler / Milstein methodology non-producing myeloma cells (e.g. PAI cells, J.W. Stocker et al. (1982) Res. Disclosure, 21713).

Hybridomzellen werden auf ihre Fähigkeit, Antikörper gegen Phosphoserin 239- VASP zu sezernieren, mit einem differentiellen Screening-Verfahren unter Verwendung von phosphoryliertem/nicht-phosphoryliertem Peptid sowie phosphoryliertem/nicht-phosphoryliertem rekombinanten humanen VASP getestet.Hybridoma cells are tested for their ability to raise antibodies against phosphoserine 239- To secrete VASP using a differential screening procedure Use of phosphorylated / non-phosphorylated peptide as well phosphorylated / non-phosphorylated recombinant human VASP tested.

Zur Testung mit phosphoryliertem/nicht-phosphoryliertem Peptid werden diese Peptide an DNA-BIND-ELISA-Platten (Fa. Costar) kovalent gekoppelt und die Hybridomaüberstände unter Verwendung des ELISA-Verfahrens durchgetestet.For testing with phosphorylated / non-phosphorylated peptide these peptides covalently coupled to DNA-BIND-ELISA plates (from Costar) and hybridoma supernatants were assayed using the ELISA method.

Phosphopeptid-erkennende Überstände werden zusätzlich auf ihre Fähigkeit untersucht, komplett phosphoryliertes rekombinantes (E. coli-System) humanes VASP, nicht aber entsprechend dephosphoryliertes VASP zu erkennen.Phosphopeptide-recognizing supernatants are additionally based on their ability examined, completely phosphorylated recombinant (E. coli system) human VASP, but not correspondingly dephosphorylated VASP.

Monoklonale Antikörper aus den Überständen der durch die oben beschriebenen Verfahren als positiv erkannten Hybridomzellen lassen sich aus vorzugsweise Serum-freien Hybridomzellkulturen durch thiophile Adsorptionschromatographie (POROS 50-OH, nano Tools) reinigen. Monoclonal antibodies from the supernatants described by those above Hybridoma cells recognized as positive can preferably be obtained from Serum-free hybridoma cell cultures by thiophilic adsorption chromatography (POROS 50-OH, nano Tools) clean.  

Unter Verwendung verschiedener Testverfahren konnte einer der gewonnenen Antikörper (Klon 16C2) als monoklonaler Antikörper der Mausklasse IgG1K identifiziert und charakterisiert werden, der VASP nur dann erkennt, wenn dieses Protein an der Position Serin 239 phosphoryliert ist. Andere Proteine und andere VASP-Phosphorylierungsstellen werden von dem Antikörper 16C2 unter den verwendeten Bedingungen nicht erkannt.Using various test methods, one of the obtained Antibody (clone 16C2) as a monoclonal antibody of the mouse class IgG1K identified and characterized, the VASP only recognizes when this Protein is phosphorylated at the serine 239 position. Other proteins and others VASP phosphorylation sites are identified by the antibody 16C2 used conditions not recognized.

Monoklonale Antikörper, die spezifisch Phosphoserin 157-VASP bzw. Phosphothreonin 278-VASP erkennen, können analog dem oben beschriebenen Verfahren gewonnen werden, indem als Antigen phosphorylierte Peptide eingesetzt werden, die die bekannten Peptidsequenzen um das Serin 157 bzw. Threonin 278 des VASP-Proteins umfassen.Monoclonal antibodies that specifically phosphoserine 157-VASP or Recognizing phosphothreonine 278-VASP can be analogous to that described above Methods are obtained by using phosphorylated peptides as the antigen the known peptide sequences around the serine 157 and threonine 278 of the VASP protein include.

Beispiel 2Example 2 Durchflußzytometrische Analyse der VASP-Serin 239-Phosphorylierung:Flow cytometric analysis of VASP serine 239 phosphorylation: Analyse der VASP-Serin 239-Phosphorylierung in gewaschenen humanen ThrombozytenAnalysis of VASP serine 239 phosphorylation in washed human Platelets

Die Präparation humaner Thrombozyten sowie die Stimmulierung der VASP- Phosphorylierung durch Inkubation mit vasoaktiven Substanzen wird durchgeführt wie beschrieben (Eigenthaler et al., Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992). Das Abstoppen der Reaktion erfolgt durch Fixierung mittels Formaldehyd in einer Endkonzentration von ca. 3,5% für 10 min bei Raumtemperatur. Nach einem Waschvorgang (optional) werden die Zellen mit Triton X-100 permeabilisiert und anschließend gewaschen. Die Färbung erfolgt durch Inkubation mit dem entsprechenden Antikörper, welcher entweder direkt Fluoreszenz-markiert ist oder durch einen Fluoreszenz-markierten Zweitantikörper angefärbt wird.The preparation of human platelets and the stimulation of VASP Phosphorylation by incubation with vasoactive substances is carried out as described (Eigenhaler et al., Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992). The The reaction is stopped by fixing with formaldehyde in a Final concentration of approx. 3.5% for 10 min at room temperature. After one Washing process (optional), the cells are permeabilized with Triton X-100 and then washed. The coloring is done by incubation with the corresponding antibody, which is either directly fluorescence-labeled or is stained by a fluorescence-labeled second antibody.

Zweckmäßigerweise werden hierzu 0,5-5 µg/ml, bevorzugt 1-2 µg/ml Primärantikörper eingesetzt. Bei Verwendung des MAK 16C2 als Primärantikörper sind beispielsweise 1.7 µg/ml geeignet. Die Bestimmung und Analyse der Bindung des Antikörpers 16C2 im Durchflußzytometer erfolgt dann wie beispielsweise in G. Otten und W. M. Yokoyama (1992) Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan, Current Protocols in Immunology, 5.4.1-5.4.19 beschrieben.0.5-5 µg / ml, preferably 1-2 µg / ml, are expediently used Primary antibodies used. When using the MAK 16C2 as primary antibody 1.7 µg / ml are suitable, for example. Determination and analysis of binding of the 16C2 antibody in the flow cytometer is then carried out as in G.  Otten and W. M. Yokoyama (1992) Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan, Current Protocols in Immunology, 5.4.1-5.4.19.

Beispiel 3Example 3 Bestimmung der VASP-Serin 239-Phosphorylierung in Zell-Extraktern mittels Western-blotDetermination of VASP-Serin 239 Phosphorylation in Cell Extractors Using Western blot

Die parallel zur Durchflußzytometrie (Beispiel 2) durchgeführte Bestimmung der Phosphorylierung von VASP in Zellextrakten mittels Western blots erfolgt nach dem Fachmann geläufigen Methoden, beispielsweise wie in Eigenthaler et al. (Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992) beschrieben. Die Konzentration des verwendeten Antikörpers beträgt zweckmäßigerweise zwischen 0,1 und 5, bevorzugt 0,5 bis 1,0 µg/ml, je nach Gehalt des VASP in der zu bestimmenden Probe. Für menschliche Thrombozyten sowie Thrombozyten aus Ratten ist beispielsweise die Verwendung von 0,5 µg/ml Antikörper, für menschliche Nabelschnurendothelzellen 1,0 µg/ml Antikörper vorteilhaft. Die Analyse der VASP-Serin 239-Phosphorylierung im Zellextrakt durch Western-blot Analyse sowie an fixierten Zellen mittels Durchflußzytometrie lieferte prinzipiell identische Ergebnisse.The determination of the parallel to the flow cytometry (example 2) VASP is phosphorylated in cell extracts using Western blots after the Methods familiar to those skilled in the art, for example as in Eigenhaler et al. (Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992). The concentration of the used Antibody is advantageously between 0.1 and 5, preferably 0.5 to 1.0 µg / ml, depending on the content of the VASP in the sample to be determined. For human Platelets and platelets from rats are examples of use of 0.5 µg / ml antibody, for human umbilical cord endothelial cells 1.0 µg / ml Antibodies beneficial. Analysis of VASP serine 239 phosphorylation in Cell extract by Western blot analysis as well as on fixed cells Flow cytometry basically gave identical results.

Beispiel 4Example 4 Analyse der VASP-Serin 239-Phosphorylierung in Vollblut oder Plättchenreichen Plasma (PRP)Analysis of VASP-Serin 239 phosphorylation in whole blood or platelet rich Plasma (PRP)

Vollblut oder PRP werden mit vasoaktiven Substanzen inkubiert und die Inkubation durch Fixierung mittels Formaldehyd in einer Endkonzentration von ca. 3,5% für 10 min bei Raumtemperatur gestoppt. PRP aus Vollblut wird wie in Eigenthaler et al. (Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992) beschrieben gewonnen werden.Whole blood or PRP are incubated with vasoactive substances and the incubation by fixation with formaldehyde in a final concentration of approx. 3.5% for 10 min stopped at room temperature. PRP from whole blood is, as in Eigenhaler et al. (Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992).

Thrombozyten in PRP werden durch Zentrifugation pelletiert und in physiologischen Puffer resuspendiert (Eigenthaler et al., 1992, supra). Die Permeabilisierung und anschließende Färbung der Thrombozyten erfolgt wie oben für gewaschene Thrombozyten beschrieben. Platelets in PRP are pelleted by centrifugation and in physiological Buffer resuspended (Eigenhaler et al., 1992, supra). Permeabilization and the platelets are subsequently stained as for washed ones Platelets.  

Beispiel 5Example 5 Zeitverlauf der Stimmulierung der VASP-Serin 239-Phosphorylierung in humanen gewaschenen Thrombozyten nach Behandlung mit Natriumnitroprussid (SNP).Time course of the stimulation of the VASP-Serin 239 phosphorylation in human washed platelets after treatment with sodium nitroprusside (SNP).

Humane Thrombozyten wurden mit 100 µM SNP behandelt. Zellproben wurden zum Zeitpunkt 0, 1, 3 und 5 Minuten entnommen. Die Bestimmung der VASP-Serin 239- Phosphorylierung mittels des Antikörpers 16C2 erfolgte parallel durch Westernblot- Analyse von Zellextrakten der entnommenen Zellproben und durch durchflußzytrometische Bestimmung an wie oben beschriebenen fixierten und permeabilisierten humanen Thrombozyten. Die Autoradiogramme der Westernblots wurden quantitativ mittels NIH-gel blotting image 1.6 Software analysiert.Human platelets were treated with 100 µM SNP. Cell samples were Time taken 0, 1, 3 and 5 minutes. Determination of VASP Serine 239 Phosphorylation by means of the 16C2 antibody was carried out in parallel by Western blot Analysis of cell extracts from the cell samples taken and by flow cytometric determination on fixed and as described above permeabilized human platelets. The autoradiograms of the Western blots were analyzed quantitatively using NIH-gel blotting image 1.6 software.

In Tabelle 1 ist die Zunahme der Bindung des Antikörpers 16C2 Phosphoserin 239- VASP aufgeführt (% Anstieg (5 min-Wert = Maximaleffekt = 100%)):Table 1 shows the increase in binding of antibody 16C2 phosphoserine 239- VASP listed (% increase (5 min value = maximum effect = 100%)):

Tabelle 1 Table 1

Beispiel 6Example 6 Analyse der Phosphorylierung von rekombinanten VASP durch die cAMP- bzw. cGMP-abhängige Proteinkinase unter Verwendung des Antikörpers 16C2Analysis of the phosphorylation of recombinant VASP by the cAMP or cGMP-dependent protein kinase using the 16C2 antibody

Gereinigtes, rekombinantes Hexahistidin-markiertes VASP (25 µg/ml) wurde durch gereinigte katalytische Untereinheit (11 µg/ml) der cAMP-Proteinkinase (cAPK) oder durch gereinigte cGMP-Proteinkinase (cGPK; 24 µg/ml) phosphoryliert. Aliquots wurden dem Reaktionsansatz zu den angegebenen Zeiten entfernt, sofort mit einer SDS-haltigen "Stop"-Lösung gemischt, gekocht und durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die VASP-Phosphorylierung wurde analysiert durch Coommassie-Blaufärbung und durch Western blots unter Verwendung eines polyklonalen VASP-Antikörpers (M4, Halbrügge M. Et al. J. Biol. Chem. 265, 3088-3093 (1990) erhältlich: Alexis Corporation, Alte Hauensteinstraße 4, CH-4448 Läufelfingen, Schweiz) oder des monoklonalen VASP-Antikörpers 16C2. Die Bande in der Coomassie-Blaufärbung unter VASP ist die cAPK, die oberhalb von VASP die cGMP-PK. Die durchgeführte SDS-Page zeigte die Änderung des VASP Laufverhalten von 46 nach 50 kDA bedingt durch die Phosphorylierung von Serin157, das von der cAPK bevorzugt wird. Die Phosphorylierung von Serin 239 (nachgewiesen durch den 16C2- Antikörper) wird von der cGMP-PK bevorzugt.Purified, recombinant hexahistidine-labeled VASP (25 µg / ml) was by  purified catalytic subunit (11 µg / ml) of the cAMP protein kinase (cAPK) or phosphorylated by purified cGMP protein kinase (cGPK; 24 µg / ml). Aliquots were removed from the reaction batch at the times indicated, immediately with a "Stop" solution containing SDS mixed, boiled and separated by SDS-PAGE. VASP phosphorylation was analyzed by Coommassie blue staining and by Western blots using a polyclonal VASP antibody (M4, Halbrügge M. Et al. J. Biol. Chem. 265, 3088-3093 (1990): Alexis Corporation, Alte Hauensteinstrasse 4, CH-4448 Laufelfingen, Switzerland) or des VASP 16C2 monoclonal antibody. The gang in the Coomassie blue dye under VASP is the cAPK, above VASP is the cGMP-PK. The carried out SDS-Page showed the change in VASP running behavior from 46 to 50 kDA due to the phosphorylation of Serin157, which is preferred by the cAPK becomes. The phosphorylation of serine 239 (demonstrated by the 16C2 Antibody) is preferred by the cGMP-PK.

Beispiel 7Example 7 Analyse der Phosphorylierung von transfizierten VASP mit diversen Mutationen der Phosphorylierung in Ptk2-ZellenAnalysis of the phosphorylation of transfected VASP with diverse mutations of the Phosphorylation in Ptk2 cells

Die Phosphorylierung von transfizierten humanem VASP und VASP-Mutanten wurde in Ptk2-Zellen untersucht. Wildtyp-VASP und VASP-Mutanten mit jeweils mutierten (inaktivierten) Phosphorylierungsstellen (Änderung des Serin 157, Serin 238 bzw. Threonin 277) wurden in Ptk2-Zellen zusammen mit der humanen cGMP- Proteinkinase 1β transfiziert und unter dem CMV-Promoter exprimiert. Ptk2-Zellen enthalten sehr wenig endogenes VASP und cGMP-Proteinkinase. Zwei Tage nach Transfektion wurden die Zellen mit 30 µM 8pCPT-cGMP für 30 min inkubiert und anschließend Zellextrakte gewonnen. Diese Zellextrakte wurden im Western blot hinsichtlich VASP-Phosphorylierung untersucht unter Verwendung des polyklonalen Antikörpers M4 und des monoklonalen Antikörpers 16C2. Eine phosphorylierungsbedingte Änderung von VASP von 46 kDa nach 50 kDa war nicht mehr vorhanden, wenn Serin 157 inaktiviert war (Mutation S157A). Ein Signal, das vom Antikörper 16C2 erkannt wird, war nicht mehr vorhanden, wenn Serin 239 inaktiviert war (S239A). Mutationen von Threonin 277 verhielten sich bei diesen Analysen wie Wildtyp-VASP.Phosphorylation of transfected human VASP and VASP mutants was examined in Ptk2 cells. Wild-type VASP and VASP mutants with each mutated (inactivated) phosphorylation sites (change in serine 157, serine 238 or threonine 277) were in Ptk2 cells together with the human cGMP Protein kinase 1β transfected and expressed under the CMV promoter. Ptk2 cells contain very little endogenous VASP and cGMP protein kinase. Two days after The cells were incubated with 30 μM 8pCPT-cGMP for 30 min and transfection then cell extracts obtained. These cell extracts were blotted in the Western for VASP phosphorylation was investigated using the polyclonal Antibody M4 and the monoclonal antibody 16C2. A There was no phosphorylation-related change in VASP from 46 kDa to 50 kDa more present when serine 157 was inactivated (mutation S157A). A signal that  recognized by antibody 16C2 was no longer present when serine 239 was inactivated (S239A). Mutations of threonine 277 behaved in these Analyzes like wild-type VASP.

Beispiel 8Example 8 Analyse der VASP-Phosphorylierung in humanen Thrombozyten nach Stimulation mit diversen Vasodilatatoren und cAMP-/cGMP-AnalogaAnalysis of VASP phosphorylation in human platelets after stimulation with various vasodilators and cAMP / cGMP analogues

Gewaschene humane Thrombozyten (0,7 × 109 Zellen/ml) wurden mit 1 µM Pg-I2 (Prostazyklin), 0,5 mM 5,6-DCl-cBIMPS (zellmembranpermeables cAMP-Analog), 10 µM SNP (Natrium-Nitroprussid) oder 1 mM 8pCPTcGMP (zellmembranpermeables cGMP-Analog) inkubiert. Aliquots (2,8 × 107 Zellen) wurden nach den angegebenen Zeiten entfernt, mit der SDS-"Stop"-Lösung gemischt und gekocht und dann hinsichtlich der VASP Phosphorylierung im Western blot-Verfahren untersucht. Die Analyse erfolgte mit dem polyklonalen Antikörper M4 bzw. dem monoklonalen Antikörper 16C2. Die Serin 157- Phosphorylierung wurde durch den "shift" von VASP von 46 nach 50 kDa quantifiziert, die Serin 239-Phosphorylierung über das Signal des 16C2 Antikörpers.Washed human platelets (0.7 × 10 9 cells / ml) were washed with 1 μM Pg-I 2 (prostacyclin), 0.5 mM 5,6-DCl-cBIMPS (cell membrane permeable cAMP analog), 10 μM SNP (sodium Nitroprusside) or 1 mM 8pCPTcGMP (cell membrane permeable cGMP analog). Aliquots (2.8 x 10 7 cells) were removed after the indicated times, mixed with the SDS "Stop" solution and boiled and then examined for VASP phosphorylation in the Western blot method. The analysis was carried out with the polyclonal antibody M4 or the monoclonal antibody 16C2. The serine 157 phosphorylation was quantified by the "shift" of VASP from 46 to 50 kDa, the serine 239 phosphorylation by the signal of the 16C2 antibody.

Beispiel 9Example 9 VASP Phosphorylierung in Ratten-ThrombozytenVASP phosphorylation in rat platelets

Rattenthrombozyten (0,7 × 109 Zellen/ml) wurden ohne, mit 100 µM Natriumnitroprussid (SNP) oder mit 10 µM Prostaglandin E1 (PgE1) für 5 min inkubiert. Die Extrakte dieser Rattenthrombozyten wurden im Western blot analysiert. Der Blot zeigte den Phosphorylierungbedingten "shift" von VASP von 46 kDa nach 50 kDa (Serin157-Phosphorylierung) sowie das phosphorylierungsbedingte Signal des 16C2-Antikörpers (Serin 239- Phosphorylierung) auch in Rattenthrombozyten. Ähnliche Ergebnisse werden auch mit Mäuse-Thrombozyten erzielt. Rat platelets (0.7 × 10 9 cells / ml) were incubated for 5 min without, with 100 μM sodium nitroprusside (SNP) or with 10 μM prostaglandin E1 (PgE1). The extracts of these rat platelets were analyzed by Western blot. The blot showed the phosphorylation-induced "shift" of VASP from 46 kDa to 50 kDa (serine 157 phosphorylation) and the phosphorylation-related signal of the 16C2 antibody (serine 239 phosphorylation) also in rat platelets. Similar results are also achieved with mouse platelets.

Beispiel 10Example 10 Immunfluoreszenzuntersuchungen von VASP und Phospho-VASP an humanen ThrombozytenImmunofluorescence studies of VASP and phospho-VASP in human Platelets

Humane Thrombozyten (im platelet rich plasma PRP) wurden auf einen Glasobjektträger aufgetragen und konnten sich 45 min lang ansetzen und ausbreiten. Dann wurden diese Thrombozyten auf dem Glasobjektträger 15 min lang ohne (A und C) oder mit 100 µM 8pCPTcGMP (B und D) inkubiert. Die Zellen wurden dann sofort mit 4% Paraformaldehyd fixiert und dann mit 0,2% Triton X-100 permeabilisiert. Anschließend erfolgte eine Inkubation mit dem polyklonalen Antikörper M4 (1 : 1000) bzw. dem monoklonalen Antikörper 16C2 gefolgt von den üblichen Sekundärantikörpern. Die Bilder zeigen das Auftreten des phosphorylierungsbedingten Signals mit dem 16C2 Antikörper, während das Signal mit dem polyklonalen M4-Antikörper (in der Immunfluoreszenz die Summe von 46 und 50 kDa VASP, da keine Auftrennung) phosphorylierungsunabhängig ist.Human platelets (in platelet rich plasma PRP) were screened for one Glass slides applied and could sit for 45 minutes and spread. Then these platelets were placed on the glass slide for 15 min incubated long without (A and C) or with 100 µM 8pCPTcGMP (B and D). The cells were then immediately fixed with 4% paraformaldehyde and then with 0.2% Triton X-100 permeabilized. This was followed by incubation with the polyclonal Antibody M4 (1: 1000) or the monoclonal antibody 16C2 followed by the usual secondary antibodies. The pictures show the appearance of the phosphorylation-related signal with the 16C2 antibody while the signal with the polyclonal M4 antibody (in immunofluorescence the sum of 46 and 50 kDa VASP, since no separation) is independent of phosphorylation.

Claims (12)

1. Monoklonaler Antikörper 16C2 DSM ACC 2330 oder dessen Fragmente.1. Monoclonal antibody 16C2 DSM ACC 2330 or its fragments. 2. Verwendung des Antikörpers gemäß Anspruch 1 zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Phosphoserin 239-VASP in biologischem Material.2. Use of the antibody according to claim 1 for qualitative and / or quantitative determination of phosphoserine 239-VASP in biological Material. 3. Verwendung des Antikörpers gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem biologischen Material um menschliche Thrombozyten oder menschliches Vollblut handelt.3. Use of the antibody according to claim 2, characterized characterized in that the biological material is human Platelets or whole human blood. 4. Verwendung des Antikörpers gemäß Anspruch 2 und/oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung von Phosphoserin 239-VASP mit Hilfe der Western Blot Technik erfolgt.4. Use of the antibody according to claim 2 and / or 3, thereby characterized that the determination of phosphoserine 239-VASP using the Western blot technique is used. 5. Verwendung des Antikörpers gemäß Anspruch 2 und/oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung von Phosphoserin 239-VASP mit Hilfe der Durchflußzytometrie erfolgt.5. Use of the antibody according to claim 2 and / or 3, characterized characterized that the determination of phosphoserine 239-VASP using the flow cytometry. 6. Verwendung des Antikörpers gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5 zur Bestimmung der in vivo-Aktivität von Endothelfaktoren.6. Use of the antibody according to one or more of the Claims 2 to 5 for determining the in vivo activity of endothelial factors. 7. Verwendung des Antikörpers gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 6 zum Nachweis einer endothelialen Dysfunktion.7. Use of the antibody according to one or more of the Claims 2 to 6 for the detection of endothelial dysfunction. 8. Verwendung des Antikörpers gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 7 zum Aufspüren von Substanzen, die den cGMP und/oder cAMP-Spiegel in biologischen Material beeinflussen.8. Use of the antibody according to one or more of the Claims 2 to 7 for the detection of substances that cGMP and / or Affect cAMP levels in biological material. 9. Monoklonaler Antikörper 16C2, DSM ACC 2330, dadurch gekennzeichnet, daß er von der Hybridomzelllinie 16C2, DSM ACC 2330 produziert wird. 9. Monoclonal antibody 16C2, DSM ACC 2330, characterized in that it is produced by the hybridoma cell line 16C2, DSM ACC 2330.   10. Hybridomzelllinie 16C2, DSM ACC 2330, dadurch gekennzeichnet, daß sie den monoklonalen Antikörper 16C2, DSM ACC 2330 produziert.10. Hybridoma cell line 16C2, DSM ACC 2330, characterized in that it produced the monoclonal antibody 16C2, DSM ACC 2330. 11. Arzneimittel oder Diagnostikum, enthaltend den Antikörper gemäß Anspruch 1.11. Medicines or Diagnostic agent containing the antibody according to claim 1. 12. Verwendung des Antikörpers gemäß Anspruch 1 als Diagnostikum für cGMP-erhöhende Substanzen, Hormone oder Pharmaka.12. Use of the antibody according to claim 1 as a diagnostic for cGMP-increasing substances, hormones or pharmaceuticals.
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