DE1955638A1 - Process for the production of water-insoluble enzyme and antigen preparations of high activity and stability - Google Patents
Process for the production of water-insoluble enzyme and antigen preparations of high activity and stabilityInfo
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Description
Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen
Enzym- und Antigenpräparaten hoher
Aktivität und Stabilität Process for the production of water-insoluble enzyme and antigen preparations of high
Activity and stability
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung
von wasserunlöslichen Enzym- und Antigenpräparaten hoher Aktivität und Stabilität durch Zugabe von 1 oder mehreren
wasserlöslichen Monomerenj von denen mindestens 1 im Laufe der ·
Polymerisation zur Vernetzung fähig ist, zur wäßrigen Lösung
des Enzyms oder des Antigens.The invention relates to a process for the production of water-insoluble enzyme and antigen preparations of high activity and stability by adding 1 or more water-soluble monomers, of which at least 1 is capable of crosslinking in the course of the polymerization, to the aqueous solution
the enzyme or the antigen.
Die in Wasser unlöslichen Enzyme können als heterogene
spezifische Katalysatoren in Form von Dispersionen oder Säuren beziehungsweise Solen angewandt werden. Sie können leicht aus
dem Reaktionsgemisch entfernt und wiederholt verwendet werden. Die wasserunlöslichen Antigene können in ähnlicher Weise für
das Entfernen der entsprechenden Antikörper aus Gemischen Verwendung
finden.The water-insoluble enzymes can be considered heterogeneous
specific catalysts in the form of dispersions or acids or sols are used. They can easily be removed from the reaction mixture and used repeatedly. The water-insoluble antigens can be used in a similar manner
the removal of the corresponding antibodies from mixtures can be used.
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Zur Herstellung wasserunlöslicher Enzyme und Antigene sind mehrere Verfahren bekannt. Die meisten bestehen darin, daß durch eine spezifische chemische Reaktion zwischen einer reaktionsfähigen Stelle des Enzyms oder des Antigens und einem unlöslichen Polymer eine kovalente Bindung gebildet wird. Ein Nachteil dieser Verfahren liegt darin, daß sie zur Veränderung der funktioneilen Gruppen der Enzyme oder Antigene führen, womit eine Verminderung ihrer Aktivität verbunden ist. Die Enzyme weisen im allgemeinen nur 1 aktive Stelle oder eine geringe Zahl aktiver Stellen auf. Wenn die Bildung der kovalenten Bindung eine funktioneile Gruppe der aktiven Stelle betrifft, so kann die Enzymaktivität vollkommen verlorengehen. Außerdem ist für W die Bindung der einzelnen Enzyme oder Antigene eine gründliche Kenntnis ihrer Struktur notwendig; weiterhin muß für jedes Verfahren eine komplizierte mehrstufige Synthese ausgearbeitet werden.Several methods are known for producing water-insoluble enzymes and antigens. Most consist of the formation of a covalent bond between a reactive site on the enzyme or antigen and an insoluble polymer through a specific chemical reaction. A disadvantage of these methods is that they lead to a change in the functional groups of the enzymes or antigens, which is associated with a reduction in their activity. The enzymes generally have only 1 active site or a small number of active sites. If the formation of the covalent bond involves a functional group of the active site, the enzyme activity may be completely lost. In addition, the binding of the individual enzymes or antigens have a thorough knowledge of the structure is necessary for W; furthermore, a complicated multi-step synthesis must be worked out for each process.
Ein einfacheres und in weiterem Umfang anwendbares Verfahren als die spezifischen chemischen Reaktionen ist durch die adsorptive Bindung der Enzyme oder Antigene an eine unlösbare Skelettsubstanz gegeben. In diesem Falle wird jedoch das adsorptiv gebundene Enzym oder Antigen im Laufe der Verwendung zum Teil desorbiert.A simpler and more widely applicable process than the specific chemical reactions is through the adsorptive binding of the enzymes or antigens to an insoluble skeletal substance. In this case, however, that adsorptively bound enzyme or antigen in the course of use partly desorbed.
fe In der Herstellung der wasserunlöslichen Enzyme und Antigene bedeutete der Einschluß der Enzyme und Antigene in dicht vernetzte Polymere, wobei diese Polymere durch in situ erfolgende Polymerisation von sich vernetzenden Monomeren erzeugt wurden, einen Fortschritt· Durch dieses Verfahren ist es gelungen, unterschiedliche Enzyme und Antigene in den wasserunlöslichen Zustand zu bringen· Dieses Verfahren ist Je- t doch mit wesentlichen Nachteilen behaftet. Infolge der allgemein bekannten Wärmeempfindlichkeit der Enzyme und Antigene werden nämlich Redoxsysterne alt Initiatoren für die Polymerisation der Monomere verwendet· Diese Mehrkomponentensysteme bestehen meist aus Peroxyden (Persulfaten) und Aminen, unter Umständen auch aus Metallsalzen. An der Zersetzungsreaktionfe In the production of water-insoluble enzymes and antigens, the inclusion of the enzymes and antigens in densely crosslinked polymers, these polymers being produced by in situ polymerization of crosslinking monomers, meant a step forward. This process enabled different enzymes and antigens to be produced to bring in the water-insoluble state · This method is JE t but suffers from significant drawbacks. Because of the well-known heat sensitivity of enzymes and antigens, redox systems are used as initiators for the polymerization of the monomers. At the decomposition reaction
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können nicht nur die sum Redoxsystem gehörenden Amine, sondern auch die Amingruppea des Enzyms oder des Antigens teilnehmen, wodurch eine Schädigung der Enzyme und Antigene hervorgerufen wird· Die zugesetzten Initiatoren werden beim Polymerisationsvorgang nur teilweise verbraucht und ihr im Präparat zurückbleibender Anteil kann eine weitere Schädigung herbeiführen· Ein wesentlicher Nachteil der Redoxsysterne besteht weiterhin darin» daß sie nur in eines bestimmten Temperatur- und pH-Bereich anwendbar sind. So kann in der Praxis eine Erwärmung auf 30 bis 400G nicht vermieden werden, wodureh aber die biologisch aktiven Substanzen bereits geschädigt werden· Bekanntlich kömnen mit den bei tieferen Temperaturen, beispielsweise unter 250O, wirksamen Initiatoren das Vermischen * der Seaktionsteilnehmer, das Entlüften und andere vorbereitende Arbeitsgänge nicht mit ausreichender Sicherheit durchgeführt werden, und besonders in vernetzten Systemen kann kein homogenes Produkt erzielt werden. Ein weiterer Naohteil der mit Bedoxsystemen hergestellten vernetzten Präparate liegt darin, daß die Enzyme und Antigene aus ihnen durch anhaltende Extraktion in beträchtlichem Maße ausgezogen werden können· Die Photoinitiierung ist nur in optisch reinen Systemen anwendbar und bewirkt selbst in diesen Systemen bereits in Tiefen von einigen Millimetern keine gleichmäßige Vernetzung; außerdem ist das Einmischen eines Photoinitiators notwendig.Not only the amines belonging to the redox system, but also the amine groups of the enzyme or antigen can participate, which causes damage to the enzymes and antigens · A major disadvantage of redox systems is that they can only be used in a certain temperature and pH range. It can not, in practice, heating to 30 to 40 0 G be avoided, but any misuse the biologically active substances are already damaged · known, kömnen with at lower temperatures, for example below 25 0 O, effective initiators mixing * the Seaktionsteilnehmer that Venting and other preparatory operations are not carried out with sufficient safety and, particularly in networked systems, a homogeneous product cannot be achieved. Another important part of the crosslinked preparations made with Bedox systems is that the enzymes and antigens can be drawn out of them to a considerable extent by sustained extraction no uniform networking; In addition, it is necessary to mix in a photoinitiator.
wasserunlöslichen Präparat nicht mehr als 2 bis 5% der ursprünglichen Snzymaktivität mit Hilfe des aus dem Schrifttum bekannten Verfahrens gewonnen werden und auch die Stabilität der in dieser Weise hergestellten Präparate ist nicht zufriedenstellend. water-insoluble preparation no more than 2 to 5% of the original Enzyme activity with the help of literature known method can be obtained and the stability of the preparations produced in this way is unsatisfactory.
Besonders ungeeignet ist das auf der Anwendung von Redoxinitiatoren beruhende Verfahren für die Herstellung von in eine poröse Trägersubstanz eingebauten organischen oder anorganischen wasserunlöslichen Enzym- und Antigenpräparaten, da das vollkommene Entfernen der Initiatorrückstände und derThe process based on the use of redox initiators is particularly unsuitable for the production of Organic or built into a porous carrier substance inorganic water-insoluble enzyme and antigen preparations, since the complete removal of the initiator residues and the
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Spaltprodukte aus einer derartigen Trägersubstanz nicht oder nur sehr schwer durchzuführen ist. Wegen der vollkommen oder teilweise undurchsichtigen porösen Trägersubstanzen ist die EhotoinitÜerung von vornherein ausgeschlossen·Cleavage products from such a carrier substance cannot be carried out or can only be carried out with great difficulty. Because of the perfect or partially opaque porous carrier substance is the Ehotoinition excluded from the start
Die Erfindung richtet sich auf die Herstellung von hochaktiven, sehr stabilen und wasserunlöslichen Enzym- und Antigenpräparaten, die auch für den Einbau in organische oder anorganische poröse Trägersubstanzen geeignet sind·The invention is directed to the production of highly active, very stable and water-insoluble enzyme and Antigen preparations, which are also suitable for incorporation into organic or inorganic porous carrier substances are suitable
Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß dieses Ziel durch Bestrahlen der wäßrigen Lösung des gewünschten Enzyme oder Antigene und 1 oder mehrerer wasserlöslicher Monomere mit Röntgen- oder ^-Strahlen niedriger oder mittlerer Dosisleistung tu erreichen ist·The invention is based on the finding that this goal by irradiating the aqueous solution of the desired Enzymes or antigens and 1 or more water-soluble monomers with X-rays or ^ -rays of low or medium dose rate tu can be achieved
Diese Feststellung 1st überraschend, da es allgemein bekannt 1st, daß die biologisch aktiven Substanzen, so auch die Enzyme und Antigene, durch Röntgen- und g-Strahlung stark geschädigt werden· In Gegenwart der erwähnten Monomere war Jedoch keine Schädigung zu beobachten und die Aktivität und Stabilität der hergestellten Präparate waren sogar größer al· diejenigen der durch andere Verfahren (beispielsweise mit Redoxinitiatoren) hergestellten Präparate·This finding is surprising as it is well known If it is that biologically active substances, so too Enzymes and antigens, badly damaged by X-rays and g-radiation · In the presence of the monomers mentioned, however, no damage was observed and the activity and stability of the preparations produced were even larger than those produced by other processes (for example with Redox initiators)
Ferner wurde von der Anmelderin festgestellt, daß die oben dargelegte Ausbildung der vernetzten Matrix und die Bindung der Enzyme ode» Antigene auch in den Poren einer organischen oder anorganischen porösen Trägersubstans durchführbar 1st und somit wasserunlösliche Enzym- oder Antigenpräparate beliebiger Form, beispielsweise als Perlen, Folien, Rohre, usw·, hergestellt werden können·Furthermore, it was found by the applicant that the above-mentioned formation of the crosslinked matrix and the bond the enzymes or antigens also in the pores of an organic or inorganic porous carrier substance is feasible and thus water-insoluble enzyme or antigen preparations of any shape, for example as beads, foils, tubes, etc., are produced can be
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Enzym- und Antigenpräparaten hoher Aktivität und Stabilität durch Zugabe von 1 oder mehreren wasserlöslichen Momomeren, von denen mindestens 1 im Laufe derThe invention relates to a process for the production of water-insoluble enzyme and antigen preparations of high levels Activity and stability by adding 1 or more water-soluble monomers, of which at least 1 over the course of the
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Polymerisation zur Vernetzung fähig let, zur wäßrigen Lösung des Enzyms oder des Antigens« welches dadurch gekennzeichnet ist, daß, gegebenenfalls nach Zugabe einer organischen oder anorganischen vorgeformten porösen Trägeraubstanz zur Enzym- oder Antigenlösung, das System bis zu einer Umsetzung von mindestens 80% der Monomere mit Röntgen- oder ^»Strahlung von 300 bis 30 000 rad/Stunde Dosisleistung bestrahlt wird.Polymerization capable of crosslinking to form an aqueous solution of the enzyme or the antigen «which is characterized by this is that, optionally after adding an organic or inorganic preformed porous support substance to the enzyme or Antigen solution, the system up to a conversion of at least 80% of the monomers with X-rays or ^ »radiation of 300 to 30,000 rad / hour dose rate is irradiated.
Ss ist zweckmäßig, ein Gemisch aus Acrylamid und Bisacrylamid als Monomere zu verwenden· Bei diesen Monomeren ist für die Polymerisation von 80% der Monomere eine Bestrahlung von 40 Minuten bei 200C und in Gegenwart von Borax- oder Acetatpuffer erforderlich· ™Ss is expedient to a mixture of acrylamide and bisacrylamide monomers using · These monomers is required for the polymerization of 80% of the monomers, irradiation of 40 minutes at 20 0 C and in the presence of borax or acetate · ™
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird poröses Polyvinylchlorid, poröses Polystyrol, Harnstoff -Formaldehyd-, Polyurethan- oder PoIyvinylalkoholsohaumstoff, Filz oder Baumwollwatte als poröse Trägersubstanz verwendet·According to an advantageous embodiment of the method according to the invention, porous polyvinyl chloride becomes porous Polystyrene, urea formaldehyde, polyurethane or polyvinyl alcohol foam, Felt or cotton wool used as a porous carrier substance
Die wesentlichsten Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind wie folgt: The main advantages of the method according to the invention are as follows:
a) Weitgehend unabhängig vom Typ und vona) Largely independent of the type and of
der chemischen Zusammensetzung des jthe chemical composition of the j
Enzyms oder des Antigens ermöglicht es in einfacher Weise die Herstellung hochaktiver und sehr stabiler Präparate.Enzyme or the antigen enables it to be produced in a simple manner highly active and very stable preparations.
b) Es ist bei die Enzyme und Antigene nicht schädigenden tiefen Temperaturen und beliebigen pH-Werten durchführbar·b) It is at the enzymes and antigens non-damaging low temperatures and any pH values feasible
c) Die vorbereitenden Arbeitsgänge und die Ausbildung des vernetzten Gerüstes selbst können voneinander bequem getrennt werden·c) The preparatory work steps and the formation of the networked framework themselves can be comfortably separated from each other will·
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d) Da« Verfahre* ist für den Einbau dta wasserunlöslichen Ensym- odar Antigenpräparates in tin· vorgeformt· porös· Trägersubstans Torsüglioh geeignet, wodurch mechanisch hochgradig atabil· Präparat· erhalten wtrdtn können.d) There «move * is for the installation dta water-insoluble Ensym- odar antigen preparation in tin preformed porous · carrier substance Torsüglioh suitable, making mechanical highly unstable preparation could be obtained.
Die Erfindung wird an Hand dtr folgenden nioht al· Beschränkung aufzufassenden Beispiele näher erläutert·The invention is not considered to be a limitation in terms of the following Examples to be understood are explained in more detail
Ee wurden 200 ag Acrylamid, 120 ag Bisaorylamid und 3 Bg Trypsin in 10 cm' Borax-Pufferlösung mit einem pH-Wert von SM gelöst· Öle in dieser Weise hergestellte Lösung wurde nach den Durchspülen mit sauerstoff freiest Argon bei 200G 50 Minuten lang der Bestrahlung von einem bei 150 kV und 10 aA arbeitenden Röntgenapparat ausgesetst. Im Laufe dieser Behandlung erhielt die Lösung eine Gesamtdosis von J 000 rad· Infolge der Bestrahlung polymerisieren etwa 90% der. Monomere und ergaben einen dichten an Sauermilch erinnernden Niederschlag, der zentrifugiert und mit Borax-Pufferlösung gewaschen wurde · Naoh wiederholtem Zentrifugieren wurde die Trypsinaktivität der Waschflüssigkeit mittels der Oaseinverdauungsverfahrensweise ermittelt· Nach 6-maligem Waschen war in der Waschflüssigkeit keine Aktivität nachweisbar· Nun wurde die Trypsinaktivität des Niederschlages bestimmt! Sie betrug 15% der Gesamtaktivität des ursprünglich angewandten Trypsins· Der Niederschlag wurd· durch Zentrifugieren gewonnen, 2-mal wie oben gewaschen und wieder sur Caseinverdauung verwendet· Diese Folge wurde 40-mal wiederholt. Beim 4-ten Terdauungsversuoh fiel die Aktivität auf etwa 6% der Aktivität des ursprünglich verwendeten Trypsin· surück und dieser Wert blieb nun in den nachfolgenden 36 Verdauungsversuohen praktisch konstant· Durch 1 Tag· lang·· Stehenlassen wurde die Trypsinaktivität immer wieder etwas erhöht· Auf Grund der Untersuchungen könnt· festgestellt werden, daflEe was dissolved 200 ag acrylamide, 120 ag Bisaorylamid and 3 Bg trypsin in 10 cm 'borax buffer solution having a pH of SM · oils in this way prepared solution according to the flushing with oxygen-freiest argon at 20 0 G 50 minutes, long exposed to radiation from an X-ray machine operating at 150 kV and 10 aA. In the course of this treatment, the solution received a total dose of J 000 rad · As a result of the radiation, about 90% of the polymerize. Monomers and gave a dense precipitate reminiscent of sour milk, which was centrifuged and washed with borax buffer solution · Naoh repeated centrifugation, the trypsin activity of the washing liquid was determined by means of the oasis digestion method · After washing 6 times, no activity was detectable in the washing liquid · Now the trypsin activity became of precipitation determined! It was 15% of the total activity of the originally applied trypsin. The precipitate was recovered by centrifugation, washed twice as above and used again for casein digestion. This sequence was repeated 40 times. In the 4th digestion attempt, the activity dropped to about 6% of the activity of the originally used trypsin and this value remained practically constant in the following 36 digestion attempts The reason for the investigations can be established that
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•Im b«d«ut*nd«r Τ·11 des verwendeten Try pe ine stabil in den Niederschlag eingebaut wurde.• In the b «d« ut * nd «r Τ · 11 of the try pe ine stable in the Precipitation was incorporated.
Beieplel 2Beieplel 2
Ee wurde wie im Beiepiel 1 beachrieben vorgegangen, Je-Aooh nit de« Unterschied, daß dl· Lösung dee Trypsin· und der Monomer· vor der Bestrahlung von serkleinertem Polyurethansohaumstoff .unter ana^roben Verhältnissen aufgesaugt wurd·. Die Bestrahlung ward· duroh «im· robalt-60-^-Quelle rorge-Β·ΜΙ·&| w»b»i das Präparat während 1 Stund· «in· Strahlendosis Ton 10 000 rad erhielt, Die Waeohflüeeigkeiten βeigten naoh dem 7-ten Waeehen kein· Aktivität mehr. Der Bohaumetoff I •elbet seigte stark· Oaeeinverdauungaaktivität bei ^- aufeinanderfolgenden Bestimmungen·*Ee proceeded as described in Example 1, Je-Aooh There is no difference that the solution is the trypsin and the Monomer · before irradiation of crushed polyurethane foam . was sucked up under ana ^ robic conditions. The irradiation was duroh in the robalt-60 - ^ - source rorge-Β · ΜΙ · & | w »b» i the preparation for 1 hour · «in · radiation dose Ton 10 000 rad received, the waeoh fluids tended after the 7th labor no more activity. The Bohaumetoff I • elbet showed strong digestive activity in ^ - successive Regulations *
Beieplel 3Beieplel 3
Xs wurde wie im Beispiel 2 vorgegangen, die Lösung des Trypsiae umd der Monomer· wurd· jedooh vor der Bestrahlung von 0,5 g Watt· auf geeäugt. Naoh dsm Auswasohsn behielt die Watt· in 10 aufeinanderfolgenden Cassinverdauungsuntersuohungen etwa 10% der Aktivität des anfänglich verwendeten Trypsias bsi·The procedure was as in Example 2, the solution of the Trypsiae and the monomer were, however, before the irradiation from 0.5 g watt to eyed. Naoh dsm Auswasohsn kept the Watt · in 10 consecutive Cassin digestive examinations about 10% of the activity of that initially used Trypsias bsi
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