DE19513152A1

DE19513152A1 - Verwendung eines "Immundefizienzvirus-supprimierenden Lymphokins (ISL)" zur Hemmung der Virusvermehrung, insbesondere von Retroviren

Info

Publication number: DE19513152A1
Application number: DE19513152A
Authority: DE
Inventors: Reinhard Prof Dr Kurth; Michael Dr Baier; Karin Metzner; Albrecht Dr Werner
Original assignee: Paul-Ehrlich-Institut; Bundesrepublik Deutschland
Current assignee: Paul-Ehrlich-Institut; Bundesrepublik Deutschland
Priority date: 1995-04-07
Filing date: 1995-04-07
Publication date: 1996-10-10
Also published as: WO1996031607A3; KR19980703704A; NZ307494A; JPH10507369A; EP0736600A2; US6383739B1; EP0736600A3; WO1996031607A2; AU712852B2; US5985613A; AU5686196A; KR100262420B1; CA2217450A1; MX9707674A; EP0821734A2

Description

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung eines "Immundefi zienzvirus-supprimierenden Lymphokins (ISL)" zur Hemmung der Virusvermeh rung.

Nomenklatur

Mit "ISL" wird die anti-virale Wirkung des Gewebekulturüberstands von aktivierten und nicht-aktivierten CD8⁺-Lymphozyten humaner (ISL-hu), oder animaler Herkunft (z. B. ISL-agm bei Lymphozyten von Afrikanischen Grünen Meerkatzen) bezeichnet.

Mit "ISL-1hu" wird das in Fig. 1 in seiner Sequenz abgebildete Molekül bezeich net. Der Zusatz "-1" soll andeuten, daß noch weitere von CD8⁺-Lymphozyten se zernierte anti-virale Stoffe in der Mischung enthalten sein könnten.

Der im folgenden beschriebene "Lymphocyte Chemoaftractant Factor" (LCF) hat eine ISL-Wirkung. Der Faktor wird deshalb ISL-1hu genannt.

Nachweis der ISL-Aktivität des "Lymphocyte Chemoaftractant Factor" (LCF)

Cruikshank und Center (Journal of Immunology 128, S. 2569-2574 (1982)) be schrieben erstmals einen von ihnen als "lymphocyte chemoaftractant factor" (LCF) bezeichnetes Produkt, welches von menschlichen Lymphozyten gebildet wird und in die Gruppe der Lymphokine einzuordnen ist. Nach entsprechender Reinigung durch Gelfiltration wurde ein einheitliches Produkt mit einem Molekulargewicht von ungefähr 56200 ermittelt, welche durch Sodiumdodecylsulfat in Monomere mit einem Molekulargewicht von ca. 14400 gespalten wird. Es wurde angenommen, daß dieses Lymphokin bei der Bildung und Verstärkung der Immunantwort vom verzögerten Typ (delayed type hypersensitivity-reaction) eine Rolle spielt.

Aus Cruikshank et al (Journal of Immunology 138, 3817-3823 (1987)) ist weiterhin bekannt, daß LCF die Expression von Interleukin 2 (IL2) Rezeptoren und HLA-DR Antigenen auf CD4⁺-Lymphozyten stimuliert. LCF wird daher auch als Wachs tumsfaktor bezeichnet. Ferner haben Cruikshank et al im Journal of Immunology 146, 2928-2934 (1991) beschrieben, daß LCF CD4-abhängige intrazytoplasma tische Signale in Lymphozyten induziert und darauf geschlossen, daß diese als Botenstoffe (messenger) zweiter Art wirken. Rand, Cruikshank et al beschreiben ferner im J. Exp. Med. 173, S. 1521-1528 (1991) die Stimulierung von mensch lichen Eosinophilen durch LCF und seine massenhafte Produktion durch aktivierte T-Lymphozyten. Schließlich wird von Cruikshank et al in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, S. 5109-5113 (1994) eine Klonierung von LCF durch Isolierung der LCF-cDNA aus einer Expressionsbibliothek aus mitogenstimulierten mono nukleären Blutzellen (PBMC: peripheral blood mononuclear cells) und Einführung in E. coli zur Herstellung von biologisch aktivem rekombinantem LCF-Protein (rLCF) beschrieben. Sowohl die Nucleotidsequenz der LCF-cDNA als auch die danach zu erwartende Aminosäuresequenz des Proteins sind in dieser Literatur stelle aufgeführt.

ISL-hu

Es ist bekannt, daß CD8⁺-T-Zellen humanen oder animalen Ursprungs, insbe sondere CD8⁺-, HLA-DR⁺-, CD28⁺- und CD11B⁻-Subtypen ein als "Immundefizi enzvirus supprimierendes Lymphokin" (ISL) bezeichnetes Protein sezernieren, welches in der Lage ist, in CD4⁺-Zellen, die mit HIV oder SIV infiziert sind, die Replikation der Viren zu hemmen. Verfahren zur Etablierung entsprechender Zellkulturen und zur zukünftigen Reinigung der produzierten antiviralen Faktoren sind beispielsweise in WO 94/23058 und WO 93/0883 sowie von Mackewicz et al (Lancet, 344, S. 1671-1673 (1994)); Mackewicz et al (AIDS Research and Human Retroviruses, Vol. 8, Nr. 6 S. 1039-1050 (1992); Castro, Walker et al (Cellular Immunology 132, S. 246-255, (1991)); Blackbourn et al (Journal of Medical Primatology Nr. 23, S. 343-354 (1994)); Chen et al (AIDS Research and Human Retroviruses Vol. 9, Nr. 11, S. 1079-1086 (1993)); Kannagi et al (The Journal of Immunology, Vol. 140, No. 7, S. 2237-2242 (1988)); Joag et al (Virology 200, S. 436-446 (1994)); Walker, Moody et al (Science, Vol. 234, S. 1563-1566 (1986)); Walker, Erickson et al (Journal of Virology, Vol. 65, Nr. 11, S. 5921-5927 (1991)); Walker, Thomson-Honnebier et al (Cellular Immunology 137, S. 420-428 (1991)); Knuchel, Bednarik et al (Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, Nr. 7, S. 438-446 (1994)); Ennen, Findeklee, Kurth et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, S. 7207-7211 (1994)) sowie durch Hsueh, Walker et al (Cellular Immuno logy 159, S. 271-279 (1994)) beschrieben.

Aus diesen Literaturstellen sind folgende Eigenschaften von ISL-hu bekannt:

1. ISL-hu wird sowohl von nicht-aktivierten (wenig) als auch von aktivierten CD8⁺-T-Lymphozyten produziert. Der Phänotyp der ISL-hu produzierenden Zelle ist wahrscheinlich CD8⁺, HLA-DR⁺, CD28⁺, CD11B⁻.
2. ISL-hu bindet an CD4⁺-Lymphozyten, möglicherweise an das CD4-Rezeptor molekül oder an ein mit dem CD4-Molekül assoziiertes Molekül. ISL-hu bindet möglicherweise an die Immunglobulin CDR3-ähnliche Region der ersten Do mäne des CD4-Moleküls, da monoklonale Antikörper mit dieser Spezifität vergleichbar mit der ISL-hu-Funktion die HIV-Transkription zu inhibieren vermögen.
3. ISL-hu kann die Vermehrung aller bisher getesteten HIV-1- und HIV-2- Stämme sowie aller bisher getesteten SIV-Stämme unterdrücken. Dabei ist der Effekt sowohl auf CD4⁺-Lymphozyten aus dem peripheren Blut als auch in einer Reihe von humanen CD4-positiven T-Zellymphomen zu beobachten.
4. ISL-hu wirkt interspezies-spezifisch, da zumindest das ISLagm der Afrikani schen Grünen Meerkatze die Vermehrung von HIV in humanen CD4⁺-Zellen zu unterdrücken vermag.
5. ISL-hu ist in seiner Funktion durch eine Inkompatibilität des MHC-Locus (major histocompatibility complex) nicht eingeschränkt.
6. ISL-hu wirkt nicht lytisch auf Zellen.
7. ISL-hu wird von den CD8 ⁺-Lymphozyten symptomloser HIV-Infizierter, weniger von den Zellen symptomatischer Patienten synthetisiert. ISL-hu wird auch von aktivierten CD8⁺-Zellen gesunder Blutspender gebildet. Das Ausmaß der ISL- hu-Synthese korreliert quantitativ mit dem klinischen Status HIV-Infizierter: Bei asymptomatischen HIV-Patienten ist die ISL-hu-Aktivität (bei ver gleichbarer Anzahl aktivierter CD8⁺-Lymphozyten) höher als bei symptomati schen Patienten.
8. Die anti-virale Wirkung von ISL-hu ist nicht identisch mit der bisher bekannter Lymphokine und Interferone.
9. ISL-Aktivität ist auch im Zellkulturüberstand aktivierter CD8⁺-Lymphozyten von HIV-infizierten und nicht-infizierten Schimpansen sowie von SIV-infizierten und nicht-infizierten Afrikanischen Grünen Meerkatzen, Rhesusaffen und Schopfmangaben (Sooty mangabees) nachgewiesen worden (Ennen, J., Findeklee, H. Dittmar, M.T., Norley, S.G. Ernst, M. & Kuth, R. (1994). CD8⁺ T- lymphocytes of African green monkeys secrete an immunodeficiency-virus suppressing lymphokine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7207-7211).
10. ISL vermag möglicherweise gegen Superinfektionen mit anderen HIV/SIV- Stämmen zu schützen (Cheng-Mayer, C., Quiroga, M., Tung, J.W. Dina, D. & Levy, J.A. (1990). Viral determinants of HIV-1 T-cell/macrophage tropism, cytopathicity, and CD4 antigen modulation. J. Virol. 64, 4390-4298).

Von ISL-hu ist bisher unbekannt:

1. seine biochemische Natur (Molekülaufbau), außer daß es sich um ein Protein handelt
2. sein(e) Gen oder Gene, falls es sich um mehrere Faktoren handelt
3. seine Wirkungsweise auf infizierte und uninfizierte CD4⁺-Zellen.
Es gibt vorläufige Hinweise dafür, daß die Wirkung von ISL auf einer Nega tivregulierung der Transkriptionsrate von der HIV-LTR (long terminal repeat) beruht.
4. Seine Wirkungsweise bei anderen Infektionen.
Es kann angenommen werden, daß Viren, deren Transkription durch ver gleichbare Transkriptionsfaktoren wie bei HIV reguliert wird, ebenfalls eine negative Regulation durch ISL erfahren.
5. Seine Wirkungsweise auf die normale und die maligne Zellproliferation.
Es kann nach gegenwärtigem Kenntnisstand nicht ausgeschlossen werden, daß ähnlich wie bei den Interferonen ein inhibitorischer Einfluß auf die nor male oder maligne Zellproliferation möglich ist.
6. ISL könnte die CD4-Expression modulieren.
7. Es ist ebenfalls unbekannt, warum es bei HIV-Infizierten über die Zeit zu einer in vitro meßbaren Abnahme der ISL-Aktivität kommt.
8. ISL könnte mitverantwortlich sein für die lange Latenzzeit zwischen Infektion und Krankheitsentwicklung bei HIV-infizierten Menschen, d. h. positiv korreliert sein mit positiver Prognose.

Es stellte sich daher die Aufgabe, durch molekulare Klonierung ISL-hu zu identi fizieren und abzuklären, ob es sich um einen oder mehrere Stoffe handelt sowie diese auf ihre therapeutische Wirkung gegen Immundefizienzviren und andere Viren zu untersuchen.

Da LCF einige der für ISL-hu beschriebenen Eigenschaften aufweist, wurde zu sätzlich zum Versuch der ISL-Klonierung aus einer cDNA-Bibliothek aktivierter humaner CD8⁺ Lymphozyten gezielt LCF kloniert, um letzteres auf eine mögliche anti-virale Wirksamkeit untersuchen zu können. Es konnte gezeigt werden, daß LCF eine ISL-Wirkung besitzt und sowohl die HIV- als auch die SIV-Vermehrung zu inhibieren vermag. Deshalb wird "LCF" im folgenden als "ISL-1hu" bezeichnet.

Folgende Verfahrensweisen wurden dabei durchgeführt:

Klonierung, Expression und Reinigung von ISL-1hu 1. RNA Isolation

5×10⁷ PBMC wurden mit 10 µg/ml Concanavalin A und 180 Units/ml IL-2 für 48 Stunden kultiviert. Zur Präparation der RNA wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit 5 ml Denaturierungslösung (RNA Isolation Kit, Stratagene) lysiert. Das Lysat wurde nach Zugabe von 1 ml Na-Acetat, 5 ml Phe nol und 1 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) für 15 Minuten auf Eis gehalten. Die wäßrige Phase wurde anschließend zur Präzipitation der RNA mit 6 ml Iso propanol versetzt und für 2 Stunden bei -20°C gelagert. Das Präzipitat wurde letztlich einmal mit absolutem Ethanol gewaschen und in 150 µl H₂O gelöst. Die Ausbeute wurde photometrisch bestimmt und betrug 120 µg.

2. cDNA-Synthese

Der Ansatz zur cDNA-Synthese enthielt 10 µg RNA, 0,2 µg Oligo-dT, 13 mM DTT und 5 µl Bulk First-Strand Reaction Mix (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Phar macia) in einem Volumen von 15 µl. Die Reaktion wurde 1 Stunde bei 37°C inku biert und anschließend bis zur späteren Verwendung bei -20°C gelagert.

3. Amplifikation und Klonierung der ISL-1hu-cDNA

Für die Amplifikation der ISL-1hu-cDNA mittels der PCR und die folgende Klonie rung wurden anhand der publizierten LCF-cDNA Sequenz (Cruikshank et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, S. 5109-5113 (1994)) folgende Oligonukleotide synthetisiert.

Primer 1: GCTGCCTCTCATATGGACCTCAACTCCTCCACTGACTCT
Primer 2: GATGGACAGGGATCCCTAGGAGTCTCCAGCAGCTGTGG.

Die Primer führen zusätzlich NdeI bzw. BamHI Schnittstellen ein.

Die PCR-Ansätze (100 µl Reaktionsvolumen) enthielten jeweils 1 µl cDNA (aus der Synthese in Abschnitt 3), je 50 µmol Primer 1 und 2,12,5 µmol dNTPs, 10 µl 10×TAQ-Puffer und 2,5 Units Taq-Polymerase (Perkin-Elmer).

Die Zyklusbedingungen waren 30 sec, 94°C, 1 min, 53°C und 1 min, 72°C. Es wurden 35 Zyklen durchlaufen.

Die PCR-Produkte wurden gereinigt und mit NdeI und BamHI für 16 Stunden bei 37°C verdaut. Zur Vorbereitung der Klonierung wurde der Vektor pET15b (Novagen) ebenfalls mit NdeI und BamHI geschnitten und anschließend über ein Agarosegel gereinigt.

Die Ligationen erfolgten in 20 µl Ansätzen mit 100 ng Vektor, 25 ng PCR-Produkt (Insert), 2 µl 10×Ligase-Puffer und 0,2 µl Ligase (New England Biolabs) für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Nach der Transformation durch Elektroporation bei 2,5 kVolt, 25 µFarad, 200 Ohm (BIO-RAD Elektroporator) in E. coli DH5 wurden die Zellen auf Ampizillin-Resistenz Platten gegeben.

Rekombinante Klone wurden durch Restriktionsanalyse von Plasmidpräparationen identifiziert (pMISL-1huB) und für die angestrebte Protein-Expression in den Stamm BL21-DE3 transformiert. Durch die Bestimmung der Nukleotidsequenzen konnte die Klonierung der ISL-1hu-cDNA zusätzlich bestätigt werden. Die gefun denen Sequenzen waren bis auf eine Abweichung im Kodon 96 in Übereinstim mung mit der publizierten LCF-Sequenz (Cruikshank et al in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, S. 5109-5113). Das Kodon 96 wird im Gegensatz zur publizierten Sequenz nicht durch die Basenfolge TTG sondern durch die Folge TTT gebildet und kodiert daher für Phenylalanin und nicht für Leucin. Die Sequenzierung weite rer ISL-1hu-Klone, die aus unabhängigen PCR-Amplifikationen hervorgingen, ergab eindeutig, daß die authentische ISL-1hu-Sequenz im Kodon 96 tatsächlich durch die Folge TTT repräsentiert ist.

Fig. 1: ISL-1hu-cDNA: Sequenz der kodierenden Region.

Die erfindungsgemäß ermittelte Sequenz unterscheidet sich im Codon 96 von der publizierten LCF-Sequenz (siehe Cruikshank J. Imm. 128, 5111(1994)).

In analoger Weise werden zu ISL-1hu homologe Proteine aus CD8-Lymphocyten enthaltenden Körperflüssigkeiten von mit Immundefizienzvirus infizierten Tieren isoliert, insbesondere solchen, welche ohne zu erkranken infiziert sind, beispiels weise Schimpansen, Afrikanische Grüne Meerkatze, Schopfmangaben). Diese können in gleicher Weise wie ISL-hu therapeutisch und in der Diagnostik verwen det werden.

4. Expression und Reinigung von rekombinantem, löslichem ISL-1hu

Die Expression des ISL-1hu erfolgt in dem Vektor pET15b aminoterminal in Fusi on mit einem Vorspann von 6 Histidin-Resten. Je 20 ml Übernachtkultur von pMISL-1huB wurden verwendet um je 2 Liter 2XTY/Ampizillin Medium zu beimp fen. Die Kulturen wurden bei 25°C geschüttelt und bei Erreichen einer OD₆₀₀ von 0,4 durch Zugabe von 1 ml 1M Isopropyl β-D-Thiogalaktosid induziert. Nach wei teren 4 Stunden wurden die Bakterien pelletiert und für 14 Stunden bei -70°C eingefroren.

Die Pellets wurden anschließend aufgetaut und mit 250 ml PBS einmal gewa schen. Die Lyse der Zellen erfolgte in 50 ml eiskaltem PBS durch Einstellen der Suspension auf 1% NP-40, 10 mM EDTA, 0,4 M NaCl und 50 µg/ml Lysozym. Das Lysat wurde nach 60 minütiger Inkubation auf Eis durch Zentrifugation von unlöslichen Bestandteilen befreit.

Das ISL-1hu mit dem aminoterminalen 6 Histidinresten (His6-ISL-1hu) wurde über einen Chromatographieschritt aufgereinigt. Hierzu wurde das Lysat auf 10 mM Imidazol, 0,5 M NaCl eingestellt und mit einer Flußrate von 0,1 ml/min über eine Ni²⁺-NTA-Agarose (Qiagen) Säule gegeben. Es wurden 0,25 ml Ni²⁺-NTA-Agar ose pro Liter Ausgangskultur verwendet. Die Säule wurde anschließend mit 20 Volumen PBS, 25 mM Imidazol gewaschen und das His6-ISL-1hu schließlich mit 4 ml PBS, 200 mM Imidazol eluiert.

In dieser Weise gewonnenes His6-ISL-1hu Fusionsprotein wies nach Überprüfung in der SDS-Gelelektrophorese einen Reinheitsgrad von über 90% auf. Die Aus beuten betrugen ca. 5 mg Protein pro Liter Ausgangskultur. Das gereinigte Protein wurde abschließend durch eine Gelfiltration über NAP-10 Säulen (Pharmacia) von niedermolekularen Verunreinigungen wie z. B. Imidazol befreit und in PBS überführt. Die Proteinkonzentrationen betrugen danach 0,5-1 mg/ml.

Fig. 2: Flußschema zur Reinigung von ISL-1hu.

Prüfung der HIV-Replikationshemmung von ISL-1hu auf T-Zellymphomlinien, primären Lymphozyten (PBMC) und gereinigten primären CD4⁺-Lympho zyten 1. Gewinnung der HIV-Virusstocks zur Infektion der Zellen

Die humanen Immundefizienzviren (HIV-1, HIV-2) und die simianen Immundefizi enzviren (SIV) replizieren sowohl in humanen T-Zellymphomlinien als auch in pri mären CD4⁺-Lymphozyten. Virushaltige Zellkulturüberstände, die von primären Lymphozytenkulturen (PBMC) gewonnen werden, enthalten in der Regel mehr infektiöse Viren als solche, die von T-Zellinien gewonnen werden. Im Falle des HIV-1-Stammes HIV-1_{SF 162} ist eine Vermehrung ausschließlich auf PBMC mög lich, da dieses Virus in keiner der bekannten T-Zellymphomlinien repliziert. Die in allen folgenden Experimenten verwendeten Standardvirusüberstände wurden daher auf primären Lymphozyten hergestellt. Dazu wurden über einen Ficoll-Gra dienten gereinigte und mit Phythämagglutinin (PHA) stimulierte PBMC (detaillierte Beschreibung der Methode siehe unten) mit den HIV-1-Stämmen HIV-1_SF2, HIV- 1_SF33 HIV-1SF₁₆₂ (Cheng-Mayer, C., Quiroga, M., Tung, J.W. Dina, D. & Levy, J.A. (1990). Viral determinants of HIV-1 T-cell/macrophage tropism, cytopathicity, and CD4 antigen modulation. J. Virol. 64, 4390-4298) und dem HIV-2-Stamm HIV-2_UC3 (Castro, B.A., Barnett, S.W. Evans, L.A. Moreau, J., Odehouri, k. & Levy, J.A. (1990). Biologic heterogeneity of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2). Virology 178, 527-534) infiziert. Diese Virusstämme wurden auch früher ausschließlich auf PBMC passagiert und die virushaltigen Zellkulturüberstände bei -70°C gelagert.

Zur Infektion wurden 120 × 10⁶ PBMC mit einer "multiplicity of infection" (MOI) von 0.1 bei 37°C für 2 Stunden inkubiert, die Zellen mit RPMI Medium gewaschen und in 40 ml Zellkulturmedium (RPMI 1640, 20% FKS, 2 mM Glutamin, 180 U/ml IL-2), entsprechend einer Zellzahl von 3 × 10⁶/ml Zellkulturmedium, für 12 Tage kulti viert. Am dritten Tag erfolgte ein Wechsel des Zellkulturmediums, wobei die Zellzahl wiederum auf 3 × 10⁶/ml Medium eingestellt wurde. An den Tagen 6, 9 und 12 wurde der Zellkulturüberstand entnommen, durch Zentrifugation Zellen und Zelldebris entfernt, sterilfiltriert (0.45 µm Porengröße) und in 0.5 ml Portionen bei -70°C gelagert.

2. Zellkulturbedingungen zur Propagierung von T-Zellymphomlinien

Die T-Zellymphomlinien H9, CEM, Molt 4 Klon 8, MT4 und C8166 werden in RPMI 1640 Medium, supplementiert mit 10% FKS und 2 mM Glutamin, bei 37°C und 5% CO₂-Atmosphäre kultiviert. Jeden dritten Tag werden die Zellen bei gleichzeitigem Mediumwechsel passagiert und die Zellzahl auf 1 × 10⁵/ml einge stellt.

3. Gewinnung und Propagierung von primären Blutlymphozyten (PBMC)

Die Präparation von peripheren Blutlymphozyten erfolgt aus "bufty coats", die von normalen Blutspendern gewonnen werden. Bei der Präparation von PBMC aus nicht-humanen Primaten, wie Afrikanischen Grünen Meerkatzen und Rhesusaffen, wird Vollblut verwendet. Dazu wird der "buffy coat" bzw. das Vollblut über einen Ficoll-Hypaque-Gradienten geschichtet und bei 1000 xg eine halbe Stunde zentrifugiert. Der Serumüberstand wird verworfen, die mononukleären Zellen entnommen und mehrmals in Hanks-Medium gewaschen. Die Zellen (3 × 10⁶/ml) werden in RPMI 1640, 20% FKS, 2mM Glutamin aufgenommen und für drei Tage mit 9 µg/ml Phythämagglutinin (PHA) stimuliert und mit 180 U/ml IL-2 zur Prolifera tion gebracht. Die Kultivierung der Zellen erfolgt bei 37°C und 5% CO₂-Atmo sphäre. Sodann wird ein kompletter Mediumwechsel durchgeführt und die Zellen werden ohne PHA bei einer Zellzahl von 3 × 10⁶/ml Kulturmedium weiterkultiviert bzw. in Experimenten verwendet.

4. Anreicherung der CD4⁺- und CD8⁺-Lymphozyten über MACS

Die mittels Ficoll-Gradienten aus einem "buffy coat" isolierten Lymphozyten wer den in 500 µl PBS-azid/1 × 10⁸ Zellen ("Phosphat Buffered Saline" ohne Ca²⁺ und Mg²⁺, 0.01% Natriumazid, 5 mM EDTA, pH 7.2) resuspendiert. Nach Zugabe von 20ml CD8-Microbeads/1 × 10⁷ zu erwartende Zellen (Maus anti-humanCD8- Antikörper, konjugiert mit magnetischen Partikeln, Miltenyi Biotec GmbH), erfolgt eine Inkubation bei 4°C über 15 min. Für weitere 5 min bei 4°C wird 2 mg DTAF/1 × 10⁷ zu erwartende Zellen (anti-Maus-IgG, FITC konjugiert, Firma Dianova) hin zugegeben. Nach Verdünnung mit 25 ml PBS-azid/1% BSA erfolgt eine erneute Zentrifugation (10 min, 1200 rpm, 4°C). Der Überstand wird verworfen, die Zellen in 2ml PBS/1% BSA resuspendiert und die Zellsuspension auf eine Säule, die sich in einem Magnetseparator (Miltenyi Biotec GmbH) befindet, aufgetragen. Die CD8⁺-Zellen, an die die CD8-Microbeads gekoppelt sind, werden in der Säule zurückgehalten, die Durchflußfraktion enthält dementsprechend alle Lymphozyten (ca. 80% CD4⁺-Zellen) mit Ausnahme der CD8⁺-Zellen. Nach Waschung wird die Säule aus der Halterung genommen und die CD8⁺-Zellfraktion mit PBS- azid/1% BSA eluiert. Die Durchfluß- und die CD8⁺-Zellfraktion werden zen trifugiert, in Zellkulturmedium (RPMI 1640, 20% FKS, 2 mM Glutamin, 180 U/ml IL-2) resuspendiert, die Zellzahl auf 3 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt und die Zellen mit PHA stimuliert (9 mg/ml). Die Qualität der Lymphozytensubpopulation strennung wird mittels FACS überprüft.

5. Titration der HIV-Virusstocks auf unterschiedlichen Wirtszellen

Als Wirtszellen wurden PBMC, CD4⁺-Lymphozyten und die T-Zellymphomlinien H9 (Popovic, M., Samgadharan, M.G., Read, E. & Gallo, R.C. (1984). Detection, isolation and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science 224, 497-500), Molt 4 Klon 8 (Kikukawa, R., Koyanagi, Y., H., Hatanaka, M. & Yamamoto, N. (1986). Differential susceptibility to be acquired immunodeficiency syndrome retrovirus in cloned cells of human leukemic T cell line Molt-4. J. Virol. 57, 1159-1162), C8166, MT4 und CEM (bezogen von der "American Type Culture Collection") benutzt. Die Titrationen werden in 96-well Platten durchgeführt.

a) Titration auf PBMC und CD4⁺-Lymphozyten

Die Virusstocks HIV-1_SF2, HIV-1_SF33, HIV-1SF₁₆₂ (Cheng-Mayer, C., Quiroga, M., Tung, J.W., Dina, D. & Levy, J.A. (1990) HIV-2_UC3 und SIV_agm (Kraus, G., Werner, A., Baier, M., Binninger, D., Ferdinand, F.J., Norley, S. & Kurth, R. (1989). Isolation of human immunodeficiency virus-related simian immu nodeficiency viruses from African gren monkeys. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2892-2896); Baier, M., Werner, A., Cichutek, K., Garber, C., Mueller, C., Kraus, G., Ferdinand, F.J., Hartung, S. Papas, T.S. & Kurth, R. (1989). Molecularly cloned simian immunodeficiency virus SIVagm3 is highly divergent from other SI- Vagm isolates and is biologically active in vitro and in vivo. J. Virol. 63, 5119- 5123) werden in 3er Schritten verdünnt und je 50 µl davon auf vier unabhängige PBMC- bzw. CD4⁺-Lymphozytenkulturen (je 1 × 10⁶ PBMC bzw. CD4⁺-Lympho zyten) in 100 µl Kulturmedium pipetiert und eine Stunde bei 37°C inkubiert. So dann werden nicht zellgebundene Viren durch waschen der Zellen mit Kulturme dium entfernt. Medienwechsel (Entnahme und Zugabe von je 100 µl Medium) finden 3, 6, 9 und 12 Tage nach Infektion statt. Die Zellkulturüberstände jeder ein zelnen Kultur von den Tagen 6, 9 und 12 werden auf ihren Virusgehalt getestet, indem entweder

a) ein Test auf "reverse Transkriptase", (nach Angaben des Testherstellers "Boehringer Mannheim"),
b) ein p24-Antigen ELISA (nach Angaben des Testherstellers "Abbott") oder
c) Infektionen von hoch suseptiblen Indikatorzellinien (Ennen, J., Findeklee, H. Dittmar, M.T., Norley, S.G. Ernst, M. & Kuth, R. (1994). CD8⁺ T-lymphocytes of African green monkeys secrete an immunodeficiency-virus suppressing lymphokine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7207-7211) durchgeführt werden.

b) Titration auf T-Zellymphomlinien H9, CEM, Molt4/8

Die Virusstocks werden in 3er Schritten verdünnt und je 50 µl davon auf vier un abhängige, Zellkulturen pipetiert (5 × 10⁴ Zellen in je 100 µl Kulturmedium in U- well 96-Zellkulturplatten) und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Waschung und Nachweis einer Infektion finden nach dem unter 2a) beschriebenen Schema statt. Die geringere Ausgangszellzahl gegenüber den PBMC-Kulturen ergibt sich durch die proliferative Kompetenz der T-Zellymphomlinien, die im Verlauf des Titrations tests bis zur kritischen Zelldichte in dem vorgegebenen Zellkulturvolumen der Mikrotiterplatten von maximal 250 µl heranwachsen.

c) Titration auf den T-Zellymphomlinien C8166 und MT4

Die Titrationen auf den T-Zellymphomlinien C8166 und MT4 finden nach dem un ter 2b beschriebenem Schema statt. Der Virusnachweis erfolgt dagegen nicht mit den oben angewendeten Nachweissystemen, sondern die Auswertung der Zell kulturen erfolgt lichtmikroskopisch. Im Falle einer Infektion durch die verwendeten Virusstämme HIV-1_SF2, HIV-1_SF33 und HIV-2_UC3 werden die C8166- bzw. MT4- Zellen durch die Proliferation der Viren abgetötet, was im Mikroskop einfach und schnell identifizierbar ist.

6. Berechnung der "tissue culture infectious dose 50" (TCID₅₀)

Die Berechnung der TCID₅₀ erfolgt nach der von Karber publizierten Methode (Karber, G. 1931. Assay for statistical analysis of pharmacological experiments. Arch. Exper. Path. V. Pharmakol. 162,148) nach der Formel:

logTCID₅₀ = L - d (s - 0.5)
L = log der geringsten Virusverdünnung
d = log der Virusverdünnung
s = Summe der viruspositiven Zellkulturen

7. Testung der HIV-Replikationshemmung durch ISL-1hu

Die Wirksamkeit von ISL-1hu auf die HIV-Replikation wird sowohl auf T-Zell-lym phomlinien als auch primären Lymphozyten getestet. Experimente zur Toxizität und Dosisfindung stehen am Anfang der Experimente, im weiteren Verlauf wird dann mit nur einer nichttoxischen, aber maximal wirksamen ISL-1hu-Konzentra tion weitergearbeitet. Diese Tests werden in 96-well-Mikrotiterplatten in Quadrupli katen getrennt für jede T-Zellinie und PBMC, sowohl auf Gesamt-PBMC als auch auf CD4⁺-Lymphozyten, durchgeführt.

a) Dosisfindungs- und Toxizitätsexperimente mit ISL-1hu auf T-Zellinien

5 × 10⁴ Zellen wurden mit unterschiedlich verdünntem (40 µg/ml bis 0.15 µg/ml) ISL-1hu für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann wurden die Zellen mit den unter 1. genannten Virusstocks infiziert. Die Infektion erfolgte für eine Stunde bei 37°C und 5% CO₂-Atmosphäre mit jeweils 50 TCID₅₀, die getrennt für jede Zellinie (siehe oben unter 2.) bestimmt und errechnet wurde. Nicht gebundenes Virus wurde durch Waschen der Zellen mit Kulturmedium entfernt. Die Zellen wur den in Zellkulturmedium resuspendiert und die ISL-1hu-Konzentration auf die An fangskonzentration eingestellt. Bei einigen Experimenten wurde ISL-1hu jeden Tag erneut zugegeben, da so gewährleistet war, daß die ISL-1hu-Konzentration relativ konstant blieb. An den Tagen 3, 6, 9 und 12 nach Infektion wurde jeweils ein Medienwechsel durchgeführt, wobei die Zellkulturüberstände der Tage 6, 9 und 12 mit den unter 2a beschriebenen Nachweissystemen quantitativ auf Virus gehalt untersucht wurden. Parallel dazu wurden Wachstumskurven der Kulturen erstellt (lichtmikroskopische Auszählung von mit Trypanblau gefärbten Zellen), die über die Toxizität von ISL-1hu Aufschluß gaben.

b) Dosisfindungs- und Toxizitätsexperimente mit ISL-1hu auf primären PBMC

Die Experimente wurden sowohl mit Gesamt-PBMC als auch mit angereicherten CD4⁺-Lymphozyten (Literatur 6) durchgeführt. Es wurden 1 × 10⁶ Zellen mit den unter 7a beschriebenen Bedingungen mit ISL-1hu inkubiert, mit HIV infiziert und an den Tagen 6, 9 und 12 nach Infektion die Zellkulturüberstände quantitativ auf Virusgehalt getestet. Die Toxizität von ISL-1hu auf PBMC wurde mit Hilfe von Trypanblaufärbungen und lichtmikroskopischer Auszählung der Zellen bestimmt.

c) Tests zum Wirkmechanismus von ISL-1hu

Es wurde untersucht, ob ISL-1hu auf der Ebene der de-novo Infektion oder bei der persistierenden HIV-Replikation seine hemmende Wirkung entfaltet. Dazu wurden Experimente durchgeführt, bei denen nur während der einstündigen Infektionszeit die vollwirksame Dosis von ISL-1hu in der Zellkultur anwesend war. Parallel dazu wurde in einem anderen experimentellen Ansatz zusätzlich eine konstante ISL- 1hu-Konzentration während der gesamten Testdauer im Zellkulturmedium auf recht erhalten. Dieses Experiment läßt eine Entscheidung zu, ob ISL-1hu die HIV- Infektion oder die HIV-Replikation hemmt, oder aber auf beiden Ebenen wirksam ist.

8. Wirkung von ISL-1hu auf die HIV-Replikation

Fig. 3: Hemmung der HIV-1_SF2-Replikation auf der T-Zellymphomlinie H9 durch gereinigtes rekombinantes ISL-1hu sowie durch Zellkulturüberstand von aktivier ten humanen CD8⁺-Lymphozyten (ISL-hu).

Mit folgenden HIV und SIV-Stämmen wurde eine quantitativ vergleichbare Hemmung der viralen Replikation gemessen: HIV-1_SF2, HIV-1_SF33, HIV-1SF₁₆₂, HIV-2_UC3 und SIV_agm.

Fig. 4: Hemmung der HIV-1_SF2-Replikation auf primären CD4⁺-Lymphozyten durch rekombinantes ISL-1hu.

LogTCID₅₀: Logarithmus der "tissue culture infectious dose₅₀" (Zellkultur infektiöse Dosis₅₀). Quantitativ vergleichbare Hemmungen werden mit folgenden Immun defizienzvirusstämmen gesehen: HIV-1_SF33, HIV-1SF₁₆₂, HIV-2_UC3 und SI- V_agm.

9. Qualitativer und quantitativer Nachweis von ISL-1hu in Körperflüssigkei ten und Zellkulturüberständen

Der Nachweis von ISL-1hu erfolgt über einen modifizierten "Enzyme Linked Immunosorbent Assay" (ELISA). Dazu werden monoklonale Antikörper gegen ISL- 1hu hergestellt. Diese werden in die Näpfchen einer ELISA-Plate absorbiert. Die auf ISL-1hu-Gehalt zu testende Flüssigkeit wird inkubiert, die monoklonalen Anti körper reagieren spezifisch mit ISL-1hu, das festgehalten wird. Der Nachweis von gebundenem ISL-1hu erfolgt über einen affinitätsgereinig ten polyklonalen anti-ISL-1hu-Antikörper (gewonnen durch ISL-1hu-Immunisation einer Ziege), der seinerseits durch einen mit Peroxidase gekoppelten anti-Ziegen- Antikörper über eine Farbreaktion sichtbar wird.

10. Direkter Nachweis von ISL-1hu produzierenden Zellen

Der oben beschriebene monoklonale Antikörper gegen ISL-1hu wird zum direkten Nachweis von ISL-1hu-produzierenden Zellen, entweder zu diagnostischen Zwec ken von Zellen aus Patienten oder von Zellen in Gewebekultur, herangezogen. Dazu werden die Zellen bei gleichzeitigem Aufschluß der Zellmembran mit Metha nol fixiert und mit dem Fluorescein isothiocyanate (FITC)-markierten monoklona len anti-ISL-1hu-Antikörper inkubiert. Die Auswertung erfolgt mit Hilfe eines "Fluorescence Activated Cell Sorters" (FACS).

Claims

1. Verwendung von ISL zur therapeutischen Behandlung bei retroviralen und anderen viralen Infektionen.

2. Verwendung von ISL zur therapeutischen Behandlung bei HIV-Infektionen.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das ISL der in Fig. 1 wiedergegebenen Proteinsequenz bzw. einem Oligomeren davon entspricht.

4. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das ISL aus einer pro- oder eukaryontischen Wirtszelle gewonnen ist, die mit ei ner cDNA - gemäß Figur 1 transfiziert ist.

5. Verwendung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirts zelle E. coli ist.

6. Arzneimittel zur Behandlung von retroviralen und anderen viralen Infektio nen, enthaltend ISL und geeignete, pharmazeutisch verträgliche Träger stoffe.

7. Arzneimittel zur Behandlung von HIV-Infektionen, enthaltend ISL und geeig nete, pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe.

8. Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln gemäß Ansprüchen 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß man geeignete Wirtszellen mit einer cDNA gemäß Fig. 1 transformiert oder transfiziert und vermehrt sowie aus dem Kulturüberstand das gebildete ISL mittels geeigneter Reinigungsmethoden gewinnt und dieses mit geeigneten Trägerstoffen vermischt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das ISL chro matographisch gereinigt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung des ISL affinitätschromatographisch, z. B. über trägergebundene Antikörper, erfolgt.

11. Verwendung von ISL zur therapeutischen Behandlung bei benignen und malignen proliferativen Erkrankungen.

12. Herstellung von ISL-Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise Tiere mit ISL behandelt und die sich bildenden Anti körper aus dem Blutserum gewinnt.

13. Therapeutische Verwendung von ISL-homologen Genen bzw. Proteinen aus Tieren, z. B. von solchen Tieren, die ohne zu erkranken natürlich mit einem Immundefizienzvirus infiziert sind (z. B. Schimpansen, Afrikanische Grüne Meerkatzen, Schopfmangaben) bei retroviralen und anderen viralen Infektionen, insbesondere HIV-Infektionen.

14. Diagnostische Bestimmung von ISL-Konzentrationen im Serum und anderen Körperflüssigkeiten sowie der Zahl der ISL-produzierenden CD8⁺-Lympho zyten, z. B. zum Nachweis akuter oder chronischer Infektionen (z. B. auch bei Blutspendern) oder zur Verlaufsbeobachtung von ((retro)viralen) Infektionen (z. B. bei AIDS), dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper, welche mit einem Fluoreszenzindikator oder einer radioaktiven oder enzymatischen Markierung versehen sind oder mit einem markierten Anti-antikörper zur Reaktion gebracht werden, mit ISL oder den ISL-produzierenden Zellen zusammenbringt, die Antigen/Antikörperkomplexe in an sich bekannter Weise abtrennt und ihre Konzentration über die Markierung bestimmt.