DE1942900B2 - Verfahren zur abtrennung von l-asparaginase aus bakterienkulturen, danach hergestellte l-asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches mittel - Google Patents
Verfahren zur abtrennung von l-asparaginase aus bakterienkulturen, danach hergestellte l-asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches mittelInfo
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Description
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- :(
zeichnet, daß so viel Säure zugesetzt wird, daß ein pl I-Wert von etwa 3 bis 5 erreicht wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die in Lösung befindliche
L-Asparaginase durch Zusatz von Alkohol oder > eines Salzes ausgefällt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Asparaginase
selektiv von einem absorbierenden Substrat absorbiert wird. ;
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Carboxymethylzellulose als absorbierendes
Substrat verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Asparaginase
durch Kontaktierung mit einem Aluminiumhydroxidgel im wesentlichen pyrogenfrei gemacht wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß mit Glutaminsäure aktiviertes Aluminiumhydroxidgel
verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Bakterien der Gattung
Erwinia oder der Art Erwinia carotovora eingesetzt
werden.
10. L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9
hergestellt worden ist.
11. Mittel gegen Leukämie oder ausgebreiteten Krebs beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß
es eine Lösung vor. L-Asparaginase gemäß Anspruch 10 in physiologischer Kochsalzlösung mit
einer Konzentration von 10 bis 20 mg Protein/ml Lösung darstellt.
■c Kulturen der Gattung Erwinia gewonnen
WlrkUng ^n"insbesondere aus Stämmen der An
rarotovora Die L-Asparaginase ermöglich) , neue vielversprechende Therapie mancher halle
Leukämie und ausgebreitetem Krebs (Metastasen). L.euK.ai'1 ._ ΜοΛΐί«ρπ von Muman-Leu-
esigestellt worden ,^ . .merican Medical
Bd. 202, Nr. 9, S. il6.
40 Die Abtrennung von L-Asparag.nase aus Baktcr.cn-Icnhuren
in großem Maßstab ist jedoch .,hw.mg
durchzuführen weshalb L-Asparag.nase nur in geringen Mengen verfügbar ist, was die therapeutische Verwendung
dTeses Enzyms stark beeinträchl.gt.
Bis jetzt wurde die Abtrennung von L-Asparag.nase ■ IWn Mengen durch mechanisches Abbrechen
ιη größere" Menge Verfahren wird die
Sent e SuÄL-be oder mechanische
Prozesse wie Schallbestrahlung oder Zerreiben der
Zellen mit Aluminiumoxyd aufgebrochen, so daß der ^ Ih1I. austreten kann. Anschließend wiru die
ΐΑ evon anderen löslichen ZeHbestandtci.cn
L.-Asparag abgetrennt, normalerweise mn
«nium öd- Natriumsulfat. Die auf diese Weise
iuS te L-Asparaginase kann dann weiter gereinigt
werden ζ B. durch Säulenchromatographie.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, cn
Verfahren zur Abtrennung von L-Asparag.nase aus Bakterienkulturen zu entwickeln, das einfacher als die
mit mechanischem Aufbrechen arbeitenden Verfahren du chführbar ist, und danach hergestellte L-Asparaginase
ow^e ein diese enthaltendes therapeutisches M.ttel m
Größeren Mengen zur Verfügung zu stellen. 8 Gegenstand der Erfindung, womit diese Aufgabe
' gelöst wird, ist zunächst ein Verfahren zur Abtrennung Son L Asparaginase aus einer d.ese enthaltenden
Bakterienkultur, durch Aufbrechen der Bakter.enzellen
zweck Freisetzens eines Teils der Baktenenzellbe-Seile,
einschließlich der L-Asparag.nase in löslicher Form Trennen der L-Asparaginase von den Zellresten
undfcolierung der L-Asparaginase, mit dem Kennzeichen
dieSBakterienzellen chemisch durch E.nwirkung
eine, alkalischen Reagens be, einem pH-Wer im
Bereich von 9,0 bis 12,5, vorzugsweise 11,0 bis 12,5,
5°
55
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung von L-Asparaginase aus Bakterienkulturen,
danach hergestellte L-Asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches Mittel.
Das Enzym L-Asparaginase (3,5,1,1-L-Asparagiiiami- do
dohydrolase in der Nomenklatur der Internationalen Enzym-Kommission 1961) zeigt Antitumorwirkung,
wenn es aus bestimmten Ausgangssubstanzen gewonnen wird. Diese Wirkung wurde zuerst in Meerschweinchenserum
und später in Escherichia coli und Serratia <\s
marcescens festgestellt. In der gleichzeitig eingereichten
deutschen Patentanmeldung P 19 42 833.-41 ist angegeben, daß L-Asparaginase mit starker Antitumor-Durch
die binwirKung des alkalischen Reagens wird
ein Teil der Bakterienzellbestandteile, einschließlich der L-Asparaginase, in löslicher Form freigesetzt, so daß
man eine alkalische Lösung von L-Asparaginase gewinnt, die nach irgendeinem geeigneten üblichen
Abtrennverfahren behandelt werden kann, um die L-Asparaginase abzutrennen. Normalerweise weisen
diese Verfahren folgende Schritte auf: Neutralisieren der alkalischen Lösung, um unerwünschte Bakterienzellreste
auszufällen, während die L-Asparaginase in Lösung gehalten wird; Konzentrieren der L-Asparaginase
durch Ausfällen aus der Lösung mit Alkohol, durch Salzausfällen oder durch Absorption mittels eines
geeigneten Substrats; und eine Reinigung der L-Asparaginase durch erneutes Suspendieren in Wasser und
erneutes Ausfällen mittels Alkohol oder eines Salzzusatzes, oder durch Abtrennung mittels Säulenchromatographie.
Es ist ersichtlich, daß verschiedene Abwandlungen dieser Isolierungsverfahren, insbesondere in der
Reihenfolge der einzelnen Verfahrensschritte, möglich
erfindungsgemäCle Verfahren wird vorzugsweise
9 42
auf Bakterien der Gattung Erwinia, insbesondere der Art Erwinia carotovora angewendet, obwohl auch
Kulturen der Serratia marcesccns einsetzbar sind.
Dem Verfahren gemäß der Erfindung liegt die Entdeckung der ungewöhnlich hohen Stabilität der
L-Asparaginase, wie sie aus Erwinia und S. marcescens gewonnen wird gegenüber alkalischen Reagenzien
zugrunde. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist jedoch allgemein auch für andere Bakteriengattungen
anwendbar, die eine ähnlich gegenüber alkalischen Reagenzien stabile L-Asparaginase enthalten, vorausgesetzt,
daß die alkalischen Reagenzien die Bakterienzelle auflösen.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem L-Asparaginase, die nach dem Verfahren bei Einsatz von Bakterien
der Gattung Erwinia oder der Art Erwinia carotovora hergestellt ist.
Schließlich ist Gegenstand der Erfindung ein Mittel gegen Leukämie oder ausgebreiteten Krebs bei
Lebewesen, mit dem Kennzeichen, daß es eine Lösung von L-Asparaginase gemäß Anspruch 10 in physiologischer
Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 10 bis 20 mg Protein/ml Lösung darstellt.
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird vorteilhafterweise durchgeführt, indem eine Suspension einer
L-Asparaginase enthaltenden Bakterienkultur in einem geeignet gepufferten Mittel hergestellt und dann
sorgfältig der pH-Wert des Mittels auf etwa 9— 12,5 mit einem alkalischen Reagens, wie Natrium- oder Kaliumhydroxyd,
eingestellt wird. Bei diesem pH-Wert wird die Bakterienzelle aufgelöst, so daß anschließend die
L-Asparaginase aus der Suspension isoliert werden kann. Ein einfaches Isolieren besteht in der Neutralisierung
oder schwachen Ansäuerung (d. h., nicht unter einen pH-Wert von 3, um eine Zersetzung des Enzyms
zu vermeiden) der Suspension, so daß die Masse des unwirksamen Proteins und Zellrestes ausfällt.
Die Neutralisierung oder schwache Ansäuerung kann mit irgendeiner geeigneten Säure vorgenommen werden,
normalerweise mit einer relativ schwachen Säure wie Essigsäure. Das Enzym L-Asparaginase bleibt unter
diesen Bedingungen in der Lösung und kann aus ihr durch Zusatz einer ausreichenden Menge eines löslichen
Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, zur Lösung isoliert werden, um das Enzym aus der Lösung als Niederschlag
zu verdrängen. Wahlweise kann das Enzym durch Zusatz eines Alkohols zur wäßrigen Lösung ausgefällt
werden, oder das Enzym kann von einem Carboxyrnethylzellulose-Absorbens absorbiert werden.
Die Erfindung soll anhand der Beschreibung eines Ausführungsbeispiels der Abtrennung von L-Asparaginase
näher erläutert werden.
45 Erwinia carotovora (hinterlegt bei der National Collection of Plant Pathogenic Bacteria N. C. P. P. B.
Nr. 1065) wurde aerob auf 3,5%igem »Brauerhefeautolysat«
bei 30" C für 8 h gezüchtet. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren abgesetzt und bei Zimmertemperatur
in einer Pufferlösung gewaschen, die 30 mM Natriumchlorid, 1OmM 2-amino-2(hydroxymethyl)propan-1
:3-diol und 1 mM Äthylendiamintetraessigsäure
bei einem pH-Wert von 7 enthielt.
1000 ml einer Suspension der Bakterien mit 16,7 mg Bakterienprotein/ml wurden bei Zimmertemperatur
hergestellt (Stufe 1), und normales (n) Natriumhydroxyd wurde langsam unter starkem Umrühren zugesetzt, bis
ein pH-Wert von 12 erhalten war. Nach 30 min (Stufe 2)
wurde bei weiterem Umrühren der pH-Wert auf 5,5 durch langsamen Zusatz von 1 η-Essigsäure eingestellt.
Der Zusatz sowohl von Natriumhydroxyd als auch von Essigsäure wurde sorgfältig überwacht, um örtliche
Überkonzentrationen dieser Zusätze zu vermeiden.
Es wurde so viel Ammoniumsulfat zugesetzt, daß eine Sättigung von 35% (200C) erreicht wurde, und
unwirksames Protein wurde durch Zentrifugieren entfernt, so daß die L-Asparaginase in der Supematanz
(Stufe 3) übrigblieb. Weiteres Ammoniumsulfat wurde zugesetzt, um die Endkonzentration auf 65% Sättigung
zu bringen. Das ausgefallene Enzym wurde zurückgewonnen und durch Zentrifugieren abgesetzt (Stufe 4).
Das Enzym wurde in Wasser mit dem gleichen Gewicht gegeben, gegen einen 0,02 M Natriumphosphat-Puffer
mit dem pH-Wert 6 (0,02 M bezogen auf Na +) dialysiert und durch Zentrifugieren geklärt (Stufe 5).
Die Lösung der L-Asparaginase wurde bei einer Konzentration von etwa 1000 I.U./ml durch eine
Carboxymethylzellulose-Säule geschickt, die mit dem
gleichen Phosphatpuffer abgeglichen worden war. Etwa 1 cm3 Be'tvolumen der Zellulose wurde für jeweils
20 000 l.U. des zugeführten Enzyms verwendet. Die Säule mit dem adsorbierten Enzym wurde mit dem
5fachen Volumen des Puffers gewaschen, und dieser Teil über einer stark rot gefärbten Zone wurde entfernt und
in einem gleichen Volumen Wasser suspendiert. Der pH-Wert wurde auf 10 durch langsamen Zusatz von 1 η
NaOH zu der umgerührten Zellulose-Suspension eingestellt. Die erzeugte Enzymlösung (etwa 40 mg
Protein/ml) wurde aus der Zellulose mittels Filtration durch eine Sinterglassäule und Verdrängung des
adsorbierten Enzyms durch einen 0,01 M Natriumkarbonatpuffer mit dem pH-Wert 10 (0,02 M in bezug auf
Na + ) zurückgewonnen (Stufe 6). Der Extraktionswirkungsgrad
und die Produktwirkung für jede Stufe des Abtrennungsverfahrens sind in der folgenden Tabelle
angegeben.
Stufe
Enzymrückgewinnung
Spezifische Wirkung
(Intern. Einheiten
/mg Protein)
/mg Protein)
1. Bakteriensuspension
2. Nach Einstellung auf einen pH-Wert von
3. Supematanz vom Zentrifugieren mit 35% gesättigtem Ammoniumsulfat bei einem
pH-Wert von 5,5
4. Absatz vom Zentrifugieren mit 65%
Ammoniumsulfat
Ammoniumsulfat
5. Dialysiertes und geklärtes Ammoniumsulfat von Stufe 4
6. Carboxymethylzellulose (CM)-Produkt
100 88 73 |
3,7 3,7 29 |
62 | 53 |
60 | 60 |
55 | 450-500 |
Eine Untersuchung des Carboxymethylzelluloseprodukts
(CM-Produkts) durch Elektrophorese und analytisches Zentrifugieren zeigte das Vor/iandensein einer
vorherrschenden Komponente mit einigen kleineren Verunreinigungen, die etwa 20% des gesamten Produkts
bildeten.
Die intravenöse Injektion von weniger als 10 l.U. de;
CM-Produkts in eine C3H-Maus nach 4d Wachstum eines 6C3HED-Tumors bewirkte einen Rückgang des
Tumors. 4 mg CM-Produkt führten zu keinerlei toxischen Symptomen bei Verabreichung der Maus auf
dem gleichen Wege.
Klinische Erprobungen der L-Asparaginase, abgetrennt aus Erwinia carotovora durch das Verfahren
gemäß der Erfindung, haben das Vorhandensein von kleinen Mengen eines Stoffes gezeigt, der einen
Temperaturanstieg bei den Patienten verursacht, denen die L-Asparaginase verabreicht worden ist. Obwohl ein
derartiger pyrogener Stoff nicht notwendigerweise gefährlich ist, ist er in therapeutischen Substanzen
unerwünscht, so daß er vorzugsweise entfernt wird. Zweckmäßigerweise wird die Entfernung durch einen
weiteren Reinigungsschritt vorgenommen, bei dem eine Lösung der L-Asparaginase mit einem Aluminiunihydroxydgel
kontaktiert wird, so daß der pyrogene Stoff im wesentlichen vollständig durch das Gel entfernt wird.
Eine vorherige Kontaktierung des Aluminiumhydroxydgels mit Glutaminsäure erhöht die Wirkung und den
Wirkungsgrad des Gels bei der Entfernung des pyrogenen Stoffes.
L-Asparaginase, die aus Erwinia carotovora durch das Verfahren gemäß der Erfindung abgetrennt ist,
entspricht zwar einem Produkt, das 3,5,5,1,1-L-Asparagin-ämidohydrolase
in der Terminologie der Internationalen Enzym-Kommission genannt ist, weicht aber in
seinen Eigenschaften stark von der bisher bekannten L-Asparaginase ab, z. B. der aus Escherichia coli
gewonnenen. Eine Aminosäure-Analyse von Proben der L-Asparaginase aus E. coli, verglichen mit denen von
Erwinia carotovora, führte zu folgenden Ergebnissen:
Aminosäure | Esch. coli | Er. carotovora |
Asp | 180 | 131 |
Thr | 120 | 89 |
Ser | 60 | 64 |
GIu | 84 | 80 |
Pro | 48 | 49 |
GIy | 108 | 123 |
AIa | 120 | 105 |
VaI | 120 | 98 |
CyS | 6 | <2 |
Met | 24 | 33 |
He | 48 | 61 |
Leu | 84 | 104 |
Tyr | 54 | 48 |
Phe | 36 | 27 |
Lys | 84 | 67 |
His | 12 | 25 |
Arg | 36 | 68 |
Trp | 12 | 0 |
Ähnlich ergaben Vergleichsmessungen des isoelektrischen Punkts (durch isoelektrische Fokussierung) einen
pH-Wert von 5,2 (für E. coli) und etwa 8,5 (für Er. carotovora); ferner Glutaminasewirkungen von 2 — 3%
der Asparaginase (für E. coli) verglichen mit 5- 7% (für Er. carotovora). Außerdem sind die beiden Asparaginase-Arten
serologisch ziemlich unterschiedlich. Für beide gewonnene Antisera zeigen keine Gegen(cross)reaktion
gegenüber der anderen Asparaginase. Das hat den klinischen Vorteil, daß in Fällen, bei denen die
Behandlung mit einer Asparaginase eine Empfindlich keit aufkommen läßt (also eine allergische Reaktion sich
zeigt), mit der zweiten Asparaginase die Behandlung
fortgesetzt werden kann. Das Molekulargewicht der aus Erwinia gewonnenen Asparaginase beträgt normalerweise
etwa 130 000-150 000.
Die Behandlung von Leukämie und ausgebreitetem
Krebs wird normalerweise durch Injektion von L-Asparaginase in einer physiologischen Lösung, wie
der Kochsalzlösung, vorgenommen, obwohl unter gewissen Umständen auch eine orale Verabreichung
möglich ist. Typisch für eine intravenöse Injektion ist eine 10 — 20 mg Protein/mi-Lösung von L-Asparaginase
in physiologischer Kochsalzlösung. Eine typische Dosis beträgt etwa 0,05 —5,0 mg/kg Körpergewicht des
Patienten.
Claims (2)
1. Verfahren zur Abtrennung von L-Asparaginase aus einer diese enthaltenden Bakterienkultur durch s
Aufbrechen der Bakterien/eilen zwecks Freisetzens eines Teils der Bakterienzellbestandteile einschließlich
der L-Asparaginase in löslicher Form, Trennen der L-Asparaginase von den Zellresten und Isolierung
der L-Asparaginase, dadurch gekenn- n> zeichnet, daß die Bakterienzellen chemisch
durch Einwirkung eines alkalischen Reagens bei einem pH-Wert im Bereich von 9,0 bis 12,5,
vorzugsweise 11,0 bis 12,5, aufgebrochen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- >;
zeichnet, daß die alkalische Lösung mit Säure behandelt wird, um Bakterienzellreste auszufällen,
während die L-Asparaginase in Lösung gehalten
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |