DE1617397B2

DE1617397B2 - Herstellung eines tumorstatisch wirkenden Mittels durch Züchten von Streptococcus haemolyticus

Info

Publication number: DE1617397B2
Application number: DE1617397A
Authority: DE
Inventors: Saburo Koshimura; Hajime Okamoto
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-03-08
Filing date: 1967-03-06
Publication date: 1979-05-03
Also published as: US3477914A; BE695122A; NO121972B; CS150186B2; YU45267A; GB1132676A; CH526959A; DE1617397C3; NL6703623A; YU33209B; ES337684A1; SE348943B; FR6516M; CA950847A; DE1617397A1; SU520055A3; DK115652B

Description

Bekanntlich besitzen lebende Zellen von haemolytischen Streptococcen, die die Fähigkeit zur Bildung von Streptolysin S haben, das eines der haemolytischen Streptococcentoxine ist, carcinostatische Wirkung. Diese lebenden Zellen werden seit kurzem zur Therapie von Tumoren verwendet; vgl. S. Koshimura u. Mitarb., The Japanese Journal of Experimental Medicine, Bd. 25 (1965), S. 93 bis 102.

Die pathogene Wirkung der haemolytischen Streptococcen (worunter im folgenden auch die Virulenz oder die Toxizität verstanden werden soll) nimmt ab und die anticarcinomatöse Wirkung zu, wenn die Zellen der haemolytischen Streptococcen kurze Zeit bei etwa 37° C in einem Medium behandelt werden, das Penicillin in verhältnismäßig hoher Konzentration enthält (vgl. S. Koshimura, R. Shimizu, A. Fujimura und H. O kam ο to, Gann, Bd. 55 [1964], S. 233 bis 236).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein tumorstatisch wirkendes Mittel durch Züchten von Streptococcus haemolyticus zu schaffen, das einerseits nicht mehr virulent ist und keine haemolytische Aktivität aufweist, andererseits eine verstärkte tumorstatische Wirkung besitzt. Diese Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 gelöst. Die Lösung beruht auf dem überraschenden Befund, daß Zellen von Streptococcus haemolyticus, die nach dem Züchten in einem Nährmedium ohne zusätzliche Glucose, Abtrennen der Zellen und Suspendieren in einem ein Penicillin in einer Konzentration von mindestens 25 000 Einheiten/ml enthaltenden Suspendiermedium 10 bis 30 min bei Temperaturen von 30 bis 38° C inkubiert werden, nach weiterem Erhitzen auf Temperaturen von 38 bis 50° C während 20 bis 60 min keine der vorstehenden Nachteile aufweisen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren kommen selbstverständlich lebende Zellen aller haemolysierenden Streptococcen (Streptococcus haemolyticus) in Frage, die anticarcinomatöse Wirkung besitzen, insbesondere haemolysierende Streptococcen der Gruppe A (Klassifikation nach Lancefield), die Streptolysin S bilden (vgl. auch The Japanese Journal of Exptl. Med., Bd. 25 [1955], S. 93 bis 102).

Als Nährmedium kann z. B. Fleischbrühe und am besten 0,5 bis 1 Gewichtsprozent pro Volumteil Ribonucleinsäure (RN A) und bzw. oder Ribonucleinsäurehydrolysat (RNC) enthaltende Nährbrühe verwendet werden. Anstelle von Fleischbrühe können auch andere natürliche oder halbsynthetische Nährmedien zur Züchtung verwendet werden, doch soll Glucose diesen Medien nicht zugegeben werden, da die Gegenwart von Glucose die Antitumorwirkung der Zellpräparate erheblich verringert.

Die Züchtungsdauer der Streptococcen beträgt am besten etwa 13 bis 20 Stunden. Geringe Schwankungen

ίο sind möglich. Dies hängt von der Art des Nährmediums und der Menge des eingeimpften Mikroorganismus ab. Die Züchtung des Mikroorganismus erfolgt in stationärer Kultur bei etwa 30 bis 39° C. Nach dieser Züchtung werden die erhaltenen Zellen des Mikroorganismus, nachstehend als Kokken bezeichnet, aus der Kulturflüssigkeit abgetrennt, z. B. abzentrifugiert. Die erhaltenen sedimentierten Kokken in einem geeigneten Suspendiermedium suspendiert, z. B. einer Salzlösung, am günstigsten in Bernheimer's Basalmedium, nachstehend als BBM bezeichnet, einer Maltose, KH2PO4 und MgSÜ4 · 7 H₂H in destilliertem Wasser enthaltenden und einen pH-Wert von 6,8 bis 7,0 aufweisenden wäßrigen Lösung. Als Suspendiermedium kann auch phosphatgepufferte Kochsalzlösung verwendet werden.

Das Penicillin kann dem Suspendiermedium vorher oder der Suspension der Kokken in dem Suspendiermedium einverleibt werden. Die Menge an einem Penicillin liegt oberhalb 25 000 Einheiten pro ml, insbesondere zwischen 27 000 und 60 000 Einheiten pro ml.

Die auf diese Weise erhaltene Kokken-Suspension, die ein Penicillin enthält, wird zunächst 10 bis 30 Minuten bei 30 bis 38° C inkubiert und anschließend 20 bis 60 Minuten auf 38 bis 50° C erhitzt. Beste Ergebnisse werden erhalten, wenn die Inkubierung 20 Minuten bei 37°C und das anschließende Erhitzen 30 Minuten bei 45° C durchgeführt wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die tumorstatische Wirkung der Zellen von Streptococcus haemolyticus erhöht werden, unabhängig davon, ob die Kokken virulent oder avirulent sind. Gleichzeitig nimmt die Virulenz der Kokken erheblich ab und ihre Fähigkeit zur Bildung von Streptolysin S ist vollständig verlorengegangen.
Zur Herstellung eines Arzneipräparates wird die Kokkensuspension selbstverständlich aseptisch gemacht und auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Die Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

Vergleichsbeispiel

Tumorstatische Wirkung verschiedener

Streptococcen-Präparate bei mit
Ehrlich-Ascitestumoren infizierten Mäusen

Lebende Zellen von Streptococcus haemolyticus ATCC 21060, hinterlegt am 24. 2.1967, aus 300 ml einer 20 Stunden alten Kulturflüssigkeit wurden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 15 ml BBM suspendiert. Die ursprüngliche Kokken-Suspension wurde mit BBM weiter in einem Verhältnis von 1 :5 verdünnt.

i) 30 ml der 1 :5 verdünnten Kokken-Suspension wurden mit 6 ml einer 16 χ ΙΟ⁴ Einheiten/ml enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung von Penicillin versetzt.

ii) 30 ml der 1 :5 verdünnten Kokken-Suspension wurden mit 6 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt.

Ein Teil der jeweils erhaltenen Suspensionen wurde folgendermaßen behandelt:

a) Die physiologische Kochsalzlösung enthaltende Kokken-Suspension wurde 20 Minuten bei 37°C inkubiert (Präparat A).

b) Die physiologische Kochsalzlösung enthaltende Kokken-Suspension wurde 20 Minuten bei 37° C inkubiert und 30 Minuten auf 45° C erhitzt (Präparat B).

c) Die Penicillin enthaltende Kokken-Suspension wurde 20 Minuten bei 37° C inkubiert (Präparat C).

d) Die Penicillin enthaltende Kokken-Suspension wurde 20 Minuten bei 37° C inkubiert und 30 Minuten auf 45° C erhitzt (Präparat D, erfindungsgemäß hergestellt).

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß von den 4 Streptococcen-Präparaten das Präparat D, das erfindungsgemäß hergestellt worden war, am wirksamsten ist.

Ferner wurden folgende Vergleichspräparate hergestellt:

e) BBM-physiologische Kochsalzlösung, 20 Minuten bei 37° C inkubiert (Präparat A').

f) BBM-physiologische Kochsalzlösung, 20 Minuten bei 37⁰C inkubiert und 30 Minuten auf 45° C erhitzt (Präparat B')·

g) BBM-Penicillingemisch, 20 Minuten bei 37°C inkubiert (Präparat C).

h) BBM-Penicillingemisch, 20 Minuten bei 37⁰C inkubiert und 30 Minuten auf 45°C erhitzt (Präparat D').

Die tumorstatische Wirkung der Zellpräparate wurde folgendermaßen bestimmt:

Die milchige Ascitesflüssigkeit, die aus der Bauchhöhle von Mäusen abgezogen wurde, die 8 Tage alte Ehrlich-Ascitestumoren enthielten, wurde unmittelbar mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 23 χ WCarcinomzellen pro ml verdünnt.

Mäusen in Versuchsgruppen von jeweils 6 Tieren wurden 0,2 ml der Carcinomzellensuspension intraperitoneal injiziert. 24 Stunden später wurden den Versuchstieren 0,5 ml der Zellpräparate ebenfalls intraperitoneal injiziert. Die gleiche Dosis wurde an 4 aufeinanderfolgenden Tagen verabfolgt. In Tabelle I sind die erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt:

Tabelle I

Bestimmung der tumorstatischen Wirkung von 4 verschiedenen Streptococcen-Präparaten

Ausgangsmaterial

Zeil- Zahl der überlebenden

präparat Tiere nach Tagen

10 20 30 40 50

1 :5 verdünnte	A	6	4	2	2	2*)
Kokken-Suspen	B	6	5	5	4	3*)
sion in BBM	C	6	4	2	2	2*)
	D	6	6	6	6	6*)
Kontrollversuch	A'	6	0	_	_	_
ohne Kokken	B'	6	0	-	—	-
	C	6	0	-	-	-
	D'	6	0	_	_	_

*) Die Tiere wurden getötet und der Autopsie unterworfen. Es wurden keine Tumoren festgestellt.

Beispiel

100 ml Fleischbrühe wurden so mit RNC versetzt, daß ίο die Konzentration 0,8% RNC im Medium betrug. Das Medium wurde sterilisiert (pH 7,56).

Das erhaltene Medium wurde mit einer 20 Stunden alten Kultur von Streptococcus haemolyticus ATCC 21060 beimpft und 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Kulturflüssigkeit abgekühlt und zentrifugiert, die sedimentierten Kokken wurden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in Ji ml BBM suspendiert, das aus 675 mg Maltose, 6 ml 20prozentiger KH₂PO₄-Lösung (eingestellt auf pH 6,9 mit NaOH), 12 ml 2prozentiger MgSO₄ · 7 H₂O-Lösung und 66 ml destilliertem Wasser besteht.

Die erhaltene Kokken-Suspension wurde mit BBM weiter zu einer 1Ofach verdünnten Suspension verdünnt. 2,5 ml dieser verdünnten Kokkensuspension wurden mit 0,5 ml einer Penicillinlösung versetzt, die gesondert durch Auflösen des Kaliumsalzes von Benzylpenicillin in physiologischer Kochsalzlösung bis zu einer Konzentration von 16 χ 10⁴ Einheiten/ml hergestellt worden war. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend 30 Minuten auf 45° C erhitzt.

Die erhaltene Kokken-Suspension wurde mit 1 ml Ehrlich Ascitestumoren-Suspension versetzt, und das Gemisch wurde 60 Minuten bei 37° C inkubiert. Dann wurden 0,5 ml des Gemisches Mäusen intraperitoneal injiziert. 50 Tage nach der Injektion wurde die Zahl der überlebenden Tiere bestimmt. Nur eine von 6 Mäusen starb an Krebs. Die 5 überlebenden Tiere wurden getötet und der Autopsie unterworfen. Es wurden keine Tumoren festgestellt. Bei Kontrollversuchen, bei denen nur BBM und penicillinhaltiges BBM verwendet wurden, starben alle 6 Mäuse innerhalb 35 Tagen nach der Injektion.

Die Ascitestumoren-Suspension wurde folgenderma-Ben hergestellt: 30 ml milchige trübe Ascitesflüssigkeit, die aus der Bauchhöhle von Mäusen abgezogen wurde, die 8 Tage alte Ehrlich Ascitestumoren enthielten, wurde 5 Minuten bei 1500 Umdrehungen/Min., zentrifugiert. Die sedimentierten Krebszellen wurden einmal mit eisgekühlter Kochsalzlösung und einmal mit eisgekühltem BBM gewaschen und in BBM so resuspendiert, daß im ml 60 χ ΙΟ⁶ Zellen enthalten waren.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann zur Vorbehandlung der abgetrennten Kokken in dem Suspendiermedium jedes auf natürlichem Wege, d. h. durch Fermentation, oder halbsynthetisch hergestellte Penicilline verwendet werden. Typische Beispiele für solche Penicilline sind Penicillin G, d. h. Benzylpenicillin, und _ 60 2,6-Dimethoxyphenylpenicillin und deren Natriumsalze. Ribonucleinsäurehydrolysat wird gemäß W. A. Bernheimer und M. Rodwardt, The Journal of Experimental Medicine, Bd. 88 (1948), S. 149, durch Hydrolyse von Ribonucleinsäure mit Ribonuclease und Fällung des Hydrolysates mit Äthanol hergestellt. Es ist die nach vollständiger Ribonuclease-Hydrolyse der RNS säureunlöslich bleibende Fraktion.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines tumorstatisch wirkenden Mittels durch Züchten von Streptococcus haemolyticus in einem Nährmedium ohne zusätzliche Glucose, Abtrennen der Zellen, Suspendieren in einem ein Penicillin in einer Konzentration von mindestens 25 000 Einheiten/ml enthaltenden Suspendiermedium und Inkubieren der Suspension während 10 bis 30 Minuten bei Temperaturen von 30 bis 38°C, dadurch gekennzeichnet, daß man die Suspension nach dem Inkubieren weitere 20 bis 60 Minuten auf Temperaturen von 38 bis 50°C erhitzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart von 0,5—1 Gew.-°/o pro Volumen Ribonucleinsäure oder Ribonucleinsäurehydrolysat durchführt.