DE10261480A1

DE10261480A1 - Using random oligomers as reference standards in competitive hybridization of multiple samples, particularly microarray tests, to normalize for experimental variations

Info

Publication number: DE10261480A1
Application number: DE2002161480
Authority: DE
Inventors: Dieter Dr. Newrzella; Oliver Dr. Sorgenfrei; Verena Schenk
Original assignee: Axaron Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2002-12-23
Filing date: 2002-12-23
Publication date: 2004-07-01

Abstract

Use of random oligomers (A) as universal references for competitive hybridization of at least two samples, for normalization of experimental variations. Independent claims are also included for the following: (1) method for comparing expression profiles of different samples by competitive hybridization; and (2) kit for comparing different samples by competitive hybridization.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Zufallsoligomeren als Referenz für kompetitive Hybridisierungsreaktionen bei Mikroarray-Analysen, sowie ein Verfahren zur Standardisierung von Hybridisierungsergebnissen unter Verwendung besagter Zufallsoligomere.The invention relates to the use of random oligomers as a reference for competitive hybridization reactions in microarray analyzes, as well as a standardization process hybridization results using said random oligomers.

Im Zuge zahlreicher Genomsequenzierungsprojekte entstanden in jüngster Zeit für eine Vielzahl von Modellorganismen bereits nahezu vollständige sogenannte Genbanken, mit deren Auswertung die Prozesse des Lebens auf genetischer Ebene besser verstanden werden können, da sie eine mögliche Korrelierung der genetischen Information mit der biologischen Funktion erlauben. In den neuen Technologien, die sich unter dem Begriff der „funktionellen Genomik" zusammen fassen lassen, werden Roboter- bzw. Computergestützte Ansätze in die klassische Molekularbiologie integriert, um möglichst viele Informationen innerhalb kurzer Zeit aus den Genen bzw. den davon kodierten Proteinen zu gewinnen.In the course of numerous genome sequencing projects emerged in recent years time for a large number of model organisms are already almost completely so-called Genebanks, with their evaluation the processes of life on genetic Level can be better understood since it is a possible correlation allow genetic information with biological function. In the new technologies, which come under the concept of “functional Genomics "together robotic or computer-aided approaches in classical molecular biology integrated to the greatest possible extent a lot of information from the genes or the of which to encode proteins.

Die Analyse umfassender Genexpressionsmuster, die sogenannte Expressionsprofilierung, nimmt in diesem Zusammenhang eine Schlüsselrolle ein, da der physiologische Zustand einer Zelle oder eines Organismus im Wesentlichen durch das Zusammenspiel der zu einem gegebenen Zeitpunkt exprimierten Gene determiniert wird. Veränderungen in fast allen biologischen Systemen, sei es als Teil normaler zellulärer Vorgänge wie Wachstum, Differenzierung und Homöostase, oder als Antwort auf Veränderungen in der Umwelt, durch biologische Faktoren, durch pharmakologische Substanzen oder durch Krankheiten, sind häufig von einem veränderten Expressionsmuster bestimmter Gene begleitet. Dies äußert sich unter anderem in der unterschiedlichen Häufigkeit bestimmter Transkripte (Boten-RNA, mRNA). Kenntnis über eine veränderte Genexpression in Abhängigkeit vom Zellzustand trägt daher sehr viel zum Verständnis über die genetische Regulation biologischer Systeme bzw. über die Gene, die daran beteiligt sind, bei.Analysis of comprehensive gene expression patterns, the so-called expression profiling takes place in this context a key role because the physiological state of a cell or an organism essentially through the interplay of the at a given time expressed genes is determined. Changes in almost all biological Systems, be it as part of normal cellular processes such as growth, differentiation and homeostasis, or in response to changes in the environment, through biological factors, through pharmacological Substances or diseases are often changed by one Expression patterns of certain genes accompanied. This manifests itself among other things in the different frequency of certain transcripts (Messenger RNA, mRNA). Knowledge of a changed one Gene expression dependent from the cell state therefore a lot to understand about the genetic regulation of biological systems or the genes involved in them are at.

Eine dem Fachmann bekannte, effiziente Methode zum Studium von zellulären Genexpressionsmustern ist die Verwendung von (DNA-)Mikrorrays (z.B. EP-B 0 804 731 ; EP-B 0373 203 ; Brown und Botstein, Nature Genetics 1999, 21, S. 33–36). Das Prinzip eines Mikroarrays entspricht dem einer sogenannten reversen Southern Blot – Hybridisierung, namentlich ein zu analysierendes, ggf. markiertes Probengemisch (DNA oder RNA) hybridisiert mit einer Nukleinsäure-Sonde, die an einer festen Trägermatrix immobilisiert ist. DNA-Mikroarrays bestehen aus einer Vielzahl (bis zu Tausenden) von individuellen DNA-Sequenzen, komplementär zu interessierenden Bestandteilen des Probengemisches, die in dichter Anordnung ("Array") auf einem nicht-porösen Träger (z.B. modifizierte Glasoberflächen) aufgebracht ("Spotting") werden. In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden die auf den Träger aufgebrachten DNA-Sequenzen auch als "Sonden" bezeichnet.An efficient method for the study of cellular gene expression patterns known to the person skilled in the art is the use of (DNA) micro-arrays (e.g. EP-B 0 804 731 ; EP-B 0373 203 ; Brown and Botstein, Nature Genetics 1999, 21, pp. 33-36). The principle of a microarray corresponds to that of a so-called reverse Southern blot hybridization, namely a sample mixture (DNA or RNA) to be analyzed, possibly labeled, hybridizes with a nucleic acid probe which is immobilized on a solid carrier matrix. DNA microarrays consist of a large number (up to thousands) of individual DNA sequences, components of the sample mixture that are complementary to those of interest, which are applied in a dense arrangement ("array") to a non-porous support (eg modified glass surfaces) ("spotting" ) become. In connection with the present invention, the DNA sequences applied to the support are also referred to as "probes".

Bei den Sonden handelt es sich meist um synthetische Oligonukleotide oder PCR-Fragmente. Neben der Verwendung von Oligo- oder Polynukleotiden, sind praktisch alle anderen Moleküle mit spezifischen Bindungseigenschaften als Sondenmoleküle in einem Mikroarray geeignet, z.B. Oligomere aus Nukleinsäureanaloga wie „Peptide Nucleic Acids" (PNAs) und „Locked Nucleic Acids" (LNAs), Peptide und Proteine (speziell Antikörper) oder Polysaccharide. Neben den Mikroarrays, die durch Ablage fertiger DNA-Sequenzen hergestellt werden, sind solche von Bedeutung, bei denen die Oligonukleotid-Sonden in einem kombinatorischen Ansatz direkt auf der Oberfläche synthetisiert werden, z.B. durch Photolithographie (WO-A1 92/10588). Die miniaturisierten Mikroarrays erlauben ein hohes Maß an Automatisierung und Standardisierung, sowie eine hohe Sensitivität.The probes are mostly synthetic oligonucleotides or PCR fragments. In addition to using Oligo- or polynucleotides, are practically all other molecules with specific ones Binding properties suitable as probe molecules in a microarray, e.g. Oligomers from nucleic acid analogs like "peptides Nucleic Acids "(PNAs) and "Locked Nucleic Acids "(LNAs), Peptides and proteins (especially antibodies) or polysaccharides. In addition to the microarrays that are made by storing finished DNA sequences of importance are those in which the oligonucleotide probes are in a combinatorial Approach directly on the surface be synthesized, e.g. by photolithography (WO-A1 92/10588). The miniaturized microarrays allow a high degree of automation and standardization, as well as high sensitivity.

Die Genexpressionsprofilierung mittels Mikroarrays erlaubt es, relative Veränderungen der Expression vieler einzelner Gene, die durch komplementäre Sonden auf dem Array repräsentiert werden, zwischen zwei (oder mehr) unterschiedlichen Nukleinsäure-Proben in einem parallelen Ansatz zu bestimmen. Bei den Nukleinsäureproben handelt es sich meistens um RNA-Gemische oder, unter Erhalt der Mengenverhältnisse, davon abgeleitete (ggf. markierte) Nukleinsäure-Gemische.Gene expression profiling using Microarrays allow relative changes in the expression of many individual genes represented by complementary probes on the array between two (or more) different nucleic acid samples to determine in a parallel approach. For the nucleic acid samples are mostly RNA mixtures or, while maintaining the Proportions, derived (possibly marked) nucleic acid mixtures.

Üblicherweise werden Proben für die Mikroarray-Analyse mit Fluoreszenzfarbstoffen, wie Cyanine-3^TM und Cyanine-5^TM, markiert, z.B. durch reverse Transkription des zu analysierenden RNA-Gemisches unter Verwendung von fluoreszenten Desoxynukleotidanaloga oder durch chemische Umsetzung mit reaktiven Derivaten von Fluoreszenzfarbstoffen. Während der Hybridisierung binden die verschiedenen Bestandteile der Probe an den komplementären Sonden des Arrays und führen so zu einem Fluoreszenzsignal an der entsprechenden Stelle. Die Fluoreszenzsignale an den Sonden des Arrays können mit Hilfe geeigneter Fluoreszenzscanner analysiert werden. Aus den Veränderungen der Signalintensitäten an den Sonden in einem Vergleich zweier Proben können die Veränderungen der entsprechenden Transkriptmengen bestimmt werden. Dabei werden die gemessenen Signalintensitäten üblicherweise zunächst normalisiert, z.B. auf die mittlere Signalintensität einer Probe, um Schwankungen in der Probengesamtmenge und in der Markierungseffizienz auszugleichen. Neben dem Vergleich von RNA-Gemischen (Genexpressionsprofilierung) eignen sich Mikroarrays auch zur vergleichenden Analyse von Mischungen anderer Biomoleküle (z.B. genomische DNAs oder Proteingemische).Samples for microarray analysis are usually labeled with fluorescent dyes, such as Cyanine-3 ^TM and Cyanine-5 ^TM , for example by reverse transcription of the RNA mixture to be analyzed using fluorescent deoxynucleotide analogs or by chemical reaction with reactive derivatives of fluorescent dyes. During the hybridization, the various components of the sample bind to the complementary probes of the array and thus lead to a fluorescence signal at the corresponding point. The fluorescence signals at the probes of the array can be analyzed with the help of suitable fluorescence scanners. The changes in the corresponding amounts of transcript can be determined from the changes in the signal intensities on the probes in a comparison of two samples. The measured signal intensities are usually first normalized, for example to the mean signal intensity of a sample, in order to compensate for fluctuations in the total sample quantity and in the labeling efficiency. In addition to the comparison of RNA mixtures (gene expression profiling), microarrays are also suitable for the comparative analysis of mixtures of other biomolecules (eg genomic DNAs or protein mixtures).

Die Analyse der Proben mit dem Array kann sowohl durch kompetitive als auch nicht-kompetitive Hybridisierung erfolgen. Bei einer nicht-kompetitiven Hybridisierung werden die zu untersuchenden Proben einzeln mit jeweils einem Array hybridisiert, wobei die verwendeten Arrays möglichst identisch sein müssen. Diese Methode hat den Nachteil, dass etwaige experimentelle Schwankungen (z.B. unterschiedliche Hybridisierungsbedingungen oder unterschiedliche Mengen an Sondenmaterial auf dem Array) die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Messergebnisse beeinträchtigen können. Hingegen bei einer kompetitiven Hybridisierung werden die beiden zu analysierenden Proben nach Markierung mit unterscheidbaren Markern gemischt und gleichzeitig mit einem Array hybridisiert ( EP-A 0 800 587 ; EP-B 0 834 576 ; Shalon et al., 1996, Genome Res. Vol. 6, Seiten 639–645; Schena et al., 1995, Science Vol. 270, Seiten 467–479). Dabei kompetitieren die unterschiedlich markierten, hinsichtlich ihrer Sequenz aber gleichartigen Probenmoleküle der beiden Proben um die komplementären Sonden des Arrays und binden entsprechend ihrer Mengenverhältnisse. Die Änderung der Menge eines bestimmten Transkripts zwischen zwei zu analysierenden Proben kann direkt aus der Messung der Signalintensitäten beider Marker an der entsprechenden, komplementären Sonde des Arrays bestimmt werden. Dadurch werden ungenaue Messungen aufgrund experimenteller Variationen minimiert. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf kompetitive Hybridisierungen.The analysis of the samples with the array can be carried out by both competitive and non-competitive hybridization. With a non-competitive Hybridization, the samples to be examined are hybridized individually with one array each, the arrays used being as identical as possible. This method has the disadvantage that any experimental fluctuations (eg different hybridization conditions or different amounts of probe material on the array) can impair the accuracy and reproducibility of the measurement results. In contrast, in the case of competitive hybridization, the two samples to be analyzed are mixed after labeling with distinguishable markers and simultaneously hybridized with an array ( EP-A 0 800 587 ; EP-B 0 834 576 ; Shalon et al., 1996, Genome Res. Vol. 6, pages 639-645; Schena et al., 1995, Science Vol. 270, pages 467-479). The differently labeled, but identical sequence of the sample molecules of the two samples compete for the complementary probes of the array and bind according to their quantitative relationships. The change in the amount of a specific transcript between two samples to be analyzed can be determined directly from the measurement of the signal intensities of both markers on the corresponding, complementary probe of the array. This minimizes inaccurate measurements due to experimental variations. The present invention relates to competitive hybridizations.

Der direkte Vergleich von zwei Proben in einer kompetitiven Hybridisierung ermöglicht somit eine sehr genaue und reproduzierbare Bestimmung der Veränderungen der Genexpressionsprofile der beiden Proben, weitgehend unabhängig von experimentellen Variationen. Allerdings ist der direkte kompetitive Vergleich nur bedingt geeignet für die Durchführung von Experimenten, in denen viele Proben miteinander verglichen werden sollen (siehe 1). Ein experimentelles Design, bei dem jede Probe mit jeder anderen direkt verglichen wird, ist bei einer größeren Anzahl von Proben aufgrund des damit verbundenen hohen Aufwands wenig zweckmäßig. So würde ein solcher Vergleich von n Proben n·(n – 1)/2 Hybridisierungen und eine entsprechende Menge an Probenmaterial erfordern.The direct comparison of two samples in a competitive hybridization thus enables a very precise and reproducible determination of the changes in the gene expression profiles of the two samples, largely independently of experimental variations. However, the direct competitive comparison is only of limited suitability for carrying out experiments in which many samples are to be compared (see 1 ). An experimental design, in which each sample is compared directly with each other, is of little use for a larger number of samples due to the high outlay involved. Such a comparison of n samples would require n · (n - 1) / 2 hybridizations and a corresponding amount of sample material.

Dem Fachmann sind verschiedene experimentelle Designs für Vergleiche vieler Proben bekannt (Yang und Speed, 2002, Nat. Rev. Gen. Vol. 3, Seiten 579–588). Ein übliches und besonders zweckmäßiges experimentelles Design ist der Vergleich aller zu analysierenden Proben gegen eine bestimmte, gemeinsame Referenz. Die gemeinsame Referenz dient dazu, Variationen zwischen den Arrays zu normalisieren. Jede Probe des Experiments wird in einer kompetitiven Hybridisierung mit der gemeinsamen Referenz verglichen. Der Vergleich zwischen zwei beliebigen Proben des Experiments ergibt sich aus dem Verhältnis der relativen Signale bezogen auf die Referenz (indirekter Vergleich).Various experimental are known to those skilled in the art Designs for Comparisons of many samples are known (Yang and Speed, 2002, Nat. Rev. Gene. Vol. 3, pages 579-588). A common one and particularly useful experimental Design is the comparison of all samples to be analyzed against one certain common reference. The common reference serves Normalize variations between the arrays. Every sample of the Experiments will be carried out in a competitive hybridization with the common reference compared. The comparison between any two samples of the experiment results from the relationship the relative signals related to the reference (indirect comparison).

Aus dem Stand der Technik sind einige Beispiele für die Wahl einer solchen gemeinsamen Referenz bekannt. So kann beispielsweise eine der Proben aus dem Experiment als Referenz für alle Proben heran gezogen werden. Dieser Ansatz ist in Experimenten zweckmäßig, in denen der Vergleich der einzelnen Proben mit der als Referenz dienenden Probe von besonderem Interesse ist (z.B. RNA aus unbehandelten Zellen als Referenz und RNA aus unterschiedlich behandelten Zellen als Proben). Diese Methode hat jedoch den Nachteil, dass die Referenzprobe in großen Mengen benötigt wird, damit sie für alle zu untersuchenden Proben ausreicht. Außerdem kann es vorkommen, dass in der Referenzprobe nicht alle Gene exprimiert sind, so dass indirekt über die Referenz gewonnene Vergleiche zwischen zwei Proben für diese Gene keine definierten Verhältnisse ergeben.Some are from the prior art examples for the choice of such a common reference is known. For example one of the samples from the experiment as a reference for all samples to be pulled. This approach is useful in experiments, in which the comparison of the individual samples with that serving as a reference Sample of particular interest (e.g. RNA from untreated cells as reference and RNA from differently treated cells as Rehearse). However, this method has the disadvantage that the reference sample in large Quantities needed so that it is for everyone sufficient samples to be examined. It can also happen that not all genes are expressed in the reference sample, so indirectly via the reference Comparisons between two samples obtained for these genes did not define any conditions result.

Eine möglichst komplette Abdeckung aller Gene kann durch die Verwendung einer Mischung aller Proben des Experiments ("Pool") als Referenz erreicht werden. Ein solcher "Pool" ist als Referenz aussagekräftig, da alle Gene, die in den einzelnen Proben vorkommen, möglichst gleichermaßen repräsentiert sind. Nachteilig ist die Verwendung einer solchen Referenz jedoch, wenn im Verlauf des Experiments neue Proben, in denen bisher nicht berücksichtige Gene exprimiert sind, hinzu kommen. Eine Aktualisierung der Referenz würde eine Wiederholung der bereits durchgeführten Vergleichshybridisierungen erfordern. Ein Proben-Pool ist somit nur als Referenz für ein bestimmtes Experiment zweckmäßig, aber nicht als universelle Referenz, auf welche die Proben verschiedener Experimente oder gar verschiedener Labore bezogen und so miteinander verglichen werden können.The most complete coverage possible of all genes can be obtained by using a mixture of all samples of the experiment ("pool") as a reference become. Such a "pool" is meaningful as a reference, because all genes that occur in the individual samples, if possible equally represents are. The disadvantage of using such a reference is, however, if in the course of the experiment new samples in which so far not consider Genes are expressed. An update of the reference would one Repetition of the comparative hybridizations already carried out require. A sample pool is therefore only a reference for a specific one Experiment useful, however not as a universal reference to which the samples of different Experiments or even different laboratories related and so together can be compared.

Als universelle Referenz kann genomische DNA der entsprechenden Spezies eingesetzt werden (Eisen und Brown, 1999, Enzymology, Vol. 303, S. 179–205; Weil et al., 2002, Biotechn. Vol. 32, S. 1310–1314). In einer genomischen DNA-Probe sind die Gene im Wesentlichen gleichmäßig repräsentiert. Allerdings enthält genomische DNA häufig Bereiche mit nicht-genspezifischen Sequenzen (z.B. Introns oder repetitive Sequenzen), die zur Hybridisierung mit den Sonden nicht beitragen. Diese können, zumal sie ebenfalls markiert werden, zu unspezifischen Hintergrundsignalen führen und die Qualität der Arrayhybridisierung beeinträchtigen. Darüber hinaus sind Markierungsverfahren für DNA oftmals aufwendiger durchzuführen als für RNA. Kommerziell angebotene Lösungen für eine universelle Referenz stellen RNA-Gemische verschiedener Zellen und Gewebe einer bestimmten Spezies dar, in denen die verschiedenen Gene möglichst umfassend und gleichmäßig repräsentiert sind (z.B. von Stratagene oder Clontech). Die RNA-Gemische werden in großem Maßstab hergestellt, so dass die Proben vieler Experimente oder auch verschiedener Labore auf die gleiche Referenz bezogen und somit untereinander verglichen werden können. Da die Herstellung solcher Referenz-RNA-Gemische jedoch sehr aufwändig ist, kann der routinemäßige Einsatz im Labor sehr kostenintensiv sein.Genomic DNA of the corresponding species can be used as a universal reference (Eisen and Brown, 1999, Enzymology, Vol. 303, pp. 179-205; Weil et al., 2002, Biotechn. Vol. 32, pp. 1310-1314). In a genomic DNA sample, the genes are represented essentially evenly. However, genomic DNA often contains areas with non-gene-specific sequences (eg introns or repetitive sequences) that do not contribute to hybridization with the probes. These can, especially since they are also marked, lead to unspecific background signals and impair the quality of the array hybridization. In addition, labeling procedures for DNA are often more complex to carry out than for RNA. Commercially available solutions for a universal reference are RNA mixtures of different cells and tissues of a certain species, in which the different genes are represented as comprehensively and evenly as possible (eg from Stratagene or Clontech). The RNA mixtures are produced on a large scale so that the samples from many experiments or from different laboratories can be related to the same reference and thus compared with one another. However, since the production of such reference RNA mixtures is very complex, routine use in the laboratory can be very cost-intensive.

Schließlich kennt der Fachmann aus dem Stand der Technik spezifische, markierte Oligonukleotide, die mit einer allgemeinen Sequenz aller Sonden hybridisieren (z.B. WO-A1 01/42512; WO-A 02/1655; EP-A 1 203 945 ; Dudley et al. 2002, PNAS Vol. 99, S. 7554–7559) und so für die Berücksichtigung von Variationen zwischen Arrays herangezogen werden können. In diesem Fall geschieht die Hybridisierung von dem spezifischen Oligonukleotid und der jeweiligen Probe mit dem Array zwar gleichzeitig aber nicht kompetitiv, denn Oligonukleotid und Probenbestandteile kompetitieren nicht um die gleichen Sondensequenzen. Nachteilig an der Verwendung solcher spezifischer Oligonukleotide als Referenz ist, dass sie nur für bestimmte Arrays mit speziellen Sondenelementen geeignet sind, die eine entsprechende allgemeine Sequenz aufweisen.Finally, the person skilled in the art knows specific, labeled oligonucleotides which hybridize with a general sequence of all probes (for example WO-A1 01/42512; WO-A 02/1655; EP-A 1 203 945 ; Dudley et al. 2002, PNAS Vol. 99, pp. 7554–7559) and can thus be used to take variations between arrays into account. In this case, the hybridization of the specific oligonucleotide and the respective sample with the array occurs simultaneously but not competitively, since the oligonucleotide and sample components do not compete for the same probe sequences. A disadvantage of using such specific oligonucleotides as a reference is that they are only suitable for certain arrays with special probe elements that have a corresponding general sequence.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit das Problem zugrunde, dass nach bisherigem Stand der Technik für den Vergleich von Genexpressionsprofilen vieler Proben mittels kompetitiver Hybridisierung mit Mikroarrays keine universelle Referenz verfügbar ist, welche die beschriebenen Nachteile nicht aufweist.The present invention lies thus based on the problem that according to the prior art for the Comparison of gene expression profiles of many samples using competitive Hybridization with microarrays no universal reference is available which does not have the disadvantages described.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass sich markierte Zufallsoligomere zur Verwendung als Referenz bei kompetitiven Hybridisierungen eigenen. Solche Zufallsoligomere wurden nach bisherigem Stand der Technik nur für die Qualitätskontrolle von Mikroarrays verwendet (WO-A1 01/72766). Da die Zufallsoligomere relativ gleichmäßig mit allen Sondenelementen eines beliebigen Arrays hybridisieren, können sie als universelle Referenz in kompetitiven Arrayhybridisierungen verwendet werden.It has now surprisingly been found that labeled random oligomers for use as a reference own in the case of competitive hybridizations. Such random oligomers according to the current state of the art only for quality control of microarrays used (WO-A1 01/72766). Because the random oligomers relatively even with they can hybridize all probe elements of any array used as a universal reference in competitive array hybridizations become.

Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich „Probe" auf ein Molekül oder eine Mischung von Molekülen, deren Anwesenheit, Menge und/oder Identität bestimmt werden soll. Bei den Molekülen handelt es sich typischer Weise um Makromoleküle wie Polynukleotide oder Polypeptide. Pobenmoleküle und die entsprechenden, Sondenmolekülen gehen unter Hybridisierungsbedingungen eine spezifische Bindung ein.According to the present invention "sample" refers to a molecule or a Mixture of molecules, whose presence, quantity and / or identity is to be determined. at the molecules it is typically macromolecules such as polynucleotides or Polypeptides. Pollen molecules and the corresponding, probe molecules go under specific hybridization conditions on.

„Sonde" bezieht sich auf ein Molekül oder eine Anzahl von Molekülen, welche mit bestimmten Probenmolekülen eine spezifische Bindung eingehen können. Bei den Sonden kann es sich z.B. um Nukleinsäurestränge handeln, die unter Hybridisierungsbedigungen mit komplementären Nukleinsäuresträngen der Probe eine spezifische Bindung eingehen können, oder z.B. um Antikörper, die mit den entsprechenden Antigenen der Probe eine spezifische Bindung eingehen können."Probe" refers to a molecule or one Number of molecules, which have a specific bond with certain sample molecules can enter into. The probes can e.g. are nucleic acid strands that operate under hybridization conditions with complementary Nucleic acid strands of the A specific bond, or e.g. to antibodies that specific binding with the corresponding antigens of the sample can enter into.

„Array" bezieht sich auf eine lineare oder zweidimensionale Anordnung von vorzugsweise diskreten Regionen von immobilisierten Sonden auf der Oberfläche eines festen Trägers. Üblicherweise unterscheiden sich die Sonden verschiedener Regionen eines Arrays in der Art (z.B. Nukleotidsequenz bei der Verwendung von Nukleinsäuren als Sonden) und/oder Konzentration der Sondenmoleküle."Array" refers to a linear or two-dimensional Arrangement of preferably discrete regions of immobilized Probes on the surface of a solid support. Usually the probes of different regions of an array differ in kind (e.g. nucleotide sequence when using nucleic acids as Probes) and / or concentration of the probe molecules.

„Mikroarray" bezieht sich auf eine miniaturisierte Array-Anordnung, wobei die Dichte von diskreten Sonden-Regionen üblicherweise mindestens etwa 100/cm² beträgt."Microarray" refers to a miniaturized array arrangement, the density of discrete probe regions usually being at least about 100 / cm ² .

„Zufallsoligomer" bezieht sich auf ein Gemisch von Oligomeren deren Monomeren-Sequenz und -Zusammensetzung zufällig ist, so dass vorzugsweise alle möglichen Sequenzen möglichst gleichmäßig im Gemisch vertreten sind. Die Länge der verschiedenen Vertreter eines Zufallsoligomers ist vorzugsweise einheitlich. Ein Zufallsoligomer kann z.B. ein Oligonukleotid der allgemeinen Sequenz N₂₀ sein, wobei N die Desoxynukleotide dA, dC, dG oder dT repräsentiert."Random oligomer" refers to a mixture of oligomers whose monomer sequence and composition is random, so that preferably all possible sequences are represented as evenly as possible in the mixture. The length of the different representatives of a random oligomer is preferably uniform. A random oligomer can, for example, be an oligonucleotide of the general sequence N ₂₀ , where N represents the deoxynucleotides dA, dC, dG or dT.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Zufallsoligomeren als universelle Referenz für die kompetitive Hybridisierung von mindestens zwei Proben zur Normalisierung von experimentellen Variationen, wie Schwankungen zwischen zwei Arrays.Object of the present invention is the use of random oligomers as a universal reference for the competitive hybridization of at least two samples for normalization of experimental variations, such as fluctuations between two Arrays.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die kompetitive Hybridisierung mit den Sonden eines Mikroarrays.In a particularly preferred embodiment competitive hybridization takes place with the probes of a microarray.

Die als Referenz verwendeten Zufallsoligomere lassen sich erfindungsgemäß auf verschiedene Arten, die dem Fachmann bekannt sind, herstellen. In Frage kommen entweder biologische oder chemische Synthese, wobei die chemische Synthese die bevorzugte Methode ist. Die Zufallsoligomere können nach Standardmethoden, wie sie in handelsüblichen Synthese-Vorrichtungen Verwendung finden, synthetisiert werden.The random oligomers used as reference can be according to the invention in different ways, that are known to those skilled in the art. Either come into question biological or chemical synthesis, chemical synthesis the preferred method is. The random oligomers can be after Standard methods as used in commercially available synthesis devices Find use, be synthesized.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Zufallsoligomere Nukleotid-Oligomere wie DNA-Oligomere, RNA-Oligomere, oder Nukelotidanaloga-Oligomere wie PNA-Oligomere (Peptide Nucleic Acid) und/oder LNA-Oligomere (Locked Nucleic Acid) sein. Ebenso ist die Verwendung von Peptid-Oligomeren als Referenz für Antikörper-Arrays möglich.According to the present invention can they Random oligomeric nucleotide oligomers such as DNA oligomers, RNA oligomers, or nucleotide analog oligomers such as PNA oligomers (peptide nucleic acid) and / or LNA oligomers (Locked Nucleic Acid). The same is the use of peptide oligomers possible as a reference for antibody arrays.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zufallsoligomeren um DNA-Oligomere.In a particularly preferred embodiment the random oligomers are DNA oligomers.

Die Zufallsoligomere der vorliegenden Erfindung weisen eine Länge von 5 bis 100 Nukleotiden oder Nukleotidanaloga auf. Bevorzugt weisen die Zufallsoligonukleotide eine Länge von 10 bis 50 Nukleotiden oder Nukleotidanaloga auf. Besonders bevorzugt weisen die Zufallsoligonukleotide eine Länge von 15 bis 30 Nukleotiden oder Nukleotidanaloga auf. Ganz besonders bevorzugt sind Zufallsoligonukleotide mit einer Länge von 20 bis 25 Nukleotiden oder Nukleotidanaloga.The random oligomers of the present Invention have a length from 5 to 100 nucleotides or nucleotide analogs. Preferably point the random oligonucleotides are 10 to 50 nucleotides in length or nucleotide analogs. The random oligonucleotides particularly preferably have a length of 15 to 30 nucleotides or nucleotide analogs. Most notably random oligonucleotides with a length of 20 to 25 nucleotides or nucleotide analogs.

Zum Zweck der erfolgreichen Hybridisierung sind dem Fachmann eine Vielzahl von Hybridisierungsbedingungen bekannt (siehe Sambrook et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Habour Press). Die Inkubationsbedingungen sind so gewählt, dass die hinsichtlich Spezifität und Sensitivität optimalste komplementäre Bindung an die Sondenelemente stattfinden kann. Die Zufallsoligonukleotide der vorliegenden Erfindung hybridisieren in einem weiten Stringenzbereich mit den Sondenelementen eines Arrays. Der bevorzugte Temperaturbereich für die Hybridisierung liegt zwischen 30° und 65°C.A variety of hybridization conditions are known to those skilled in the art for the purpose of successful hybridization (see Sambrook et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Habour Press). The incubation conditions are chosen so that the optimal complementary binding to the probe elements can take place in terms of specificity and sensitivity. The random oligonucleotides of the present invention hybridize to the probe elements of an array in a wide range of stringency. The preferred temperature range for hybridization is between 30 ° and 65 ° C.

Die Zufallsoligonukleotide liegen für die erfindungsgemäße Verwendung bereits markiert vor (z.B. mit Cyanine-5^TM).The random oligonucleotides are already labeled for the use according to the invention (for example with Cyanine-5 ^TM ).

Sie können aber auch so vorliegen, dass sie auf einfache Weise markiert werden können. Dann sind die Zufallsoligonukleotide beispielsweise mit einem Aminolinker versehen, der eine Markierung mit N-Hydroxysuccimid- (NHS)-Ester-konjugierten Fluoreszenzfarbstoffen erlaubt. Außerdem können die Zufallsoligomere mit einer Biotingruppe versehen sein, so dass die Markierung mit Avidin- oder Streptavidinkonjugierten Fluoreszenzfarbstoffen erfolgt. Dabei ist es gegebenenfalls unerheblich, ob die Markierung am 5'-, am 3'- , an beiden Enden oder innerhalb der Sequenz vorgenommen wird. Dem Fachmann stehen geeignete Markierungssubstanzen und Protokolle zur Verfügung. Handelt es sich bei den Zufallsoligomeren um Peptidoligomere kann eine geeignete Markierung am amino-, am carboxyterminalen, an beiden Enden oder an internen Aminosäuren vorgenommen werden.But they can also exist that they can be marked easily. Then the random oligonucleotides for example, provided with an amino linker that has a label with N-hydroxysuccimide (NHS) ester conjugated fluorescent dyes allowed. Moreover can the random oligomers are provided with a biotin group, so that labeling with avidin or streptavidin conjugated fluorescent dyes he follows. It may be irrelevant whether the marking at the 5'-, at the 3'-, at both ends or within the sequence. Stand by the specialist suitable labeling substances and protocols are available. These The random oligomers can be a suitable peptide oligomer Marking at the amino, carboxy terminal, at both ends or of internal amino acids be made.

Die markierende Substanz kann grundsätzlich jede Substanz sein, die zur Markierung von Nukleinsäuren und/oder Peptiden geeignet ist. Als Beispiele für solche Markierungen seien genannt Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin, Digoxigenin, Radioisotope, Antikörper, Enzyme und Rezeptoren. Je nach Markierung erfolgt der Nachweis der Zufallsoligonukleotide über Fluoreszenzmessungen, Konjugation an Streptavidin und/oder Avidin, Antigen-Antikörper- und/oder Antikörper-Antikörper-Wechselwirkungen, Messung der Radioaktivität, sowie katalytische und/oder Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen. Eine für die Erfindung geeignete Markierung ist auch die Anheftung eines sogenannten Aminolink, der mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten NHS-Estern gekoppelt werden kann. Damit lasst sich die gleiche Referenz mit verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen in sogenannten "Flip"-Vergleichen verwenden (z.B.: Probe-A(Cyanine-5^TM) vs. Referenz(Cyanine-3^TM) und ProbeA(Cyanine-3^TM) vs. Referenz(Cyanine-5^TM)).The labeling substance can in principle be any substance that is suitable for labeling nucleic acids and / or peptides. Examples of such labels are fluorescent dyes, biotin, digoxigenin, radioisotopes, antibodies, enzymes and receptors. Depending on the labeling, the detection of the random oligonucleotides takes place via fluorescence measurements, conjugation to streptavidin and / or avidin, antigen-antibody and / or antibody-antibody interactions, measurement of radioactivity, and catalytic and / or receptor-ligand interactions. A label suitable for the invention is also the attachment of a so-called aminolink, which can be coupled with fluorescent dye-conjugated NHS esters. This means that the same reference can be used with different fluorescent labels in so-called "flip" comparisons (e.g.: Probe-A (Cyanine-5 ^TM ) vs. reference (Cyanine-3 ^TM ) and ProbeA (Cyanine-3 ^TM ) vs. reference ( Cyanine-5 ^TM )).

Bevorzugt für die vorliegende Erfindung ist die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen zur Markierung der Zufallsoligonukleotide. Dem Fachmann zur Verfügung stehen Fluoreszenzfarbstoffe beispielsweise wie Fluoreszein, Dichlorofluoreszein, Hexachlorofluoreszein, BODIPY^TM-Varianten, ROX, Tetramethylrhodamin, Rhodamin X, Cyanine-2^TM, Cyanine-3^TM, Cyanine-5^TM, Cyanine-7^TM, IRD40, FluorX, Oregon Green^TM, Alexa^TM-Varianten und ähnliches.Preferred for the present invention is the use of fluorescent dyes for labeling the random oligonucleotides. Fluorescent dyes are available to the person skilled in the art, for example such as fluorescein, dichlorofluoreszein, hexachlorofluoreszein, BODIPY ^™ variants, ROX, tetramethylrhodamine, rhodamine X, cyanine-2 ^TM , cyanine-3 ^TM , cyanine-5 ^TM , cyanine-7 ^TM , IRD40, FluorX, Oregon Green ^TM , Alexa ^TM variants and the like.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zufallsoligonukleotide mit Cyanine-3^TM oder Cyanine-5^TM markiert.In a preferred embodiment, the random oligonucleotides are labeled with Cyanine-3 ^TM or Cyanine-5 ^TM .

In einer weiteren Ausführungsform kommen für die erfindungsgemäße Verwendung auch Varianten der Zufallsoligonukleotide mit einer geringere Komplexität in Betracht. Diese Varianten der Zufallsoligonukleotide sind dann wünschenswert für die vorliegende Erfindung, wenn die erfindungsgemäßen Zufallsoligonukleotide unter stringenten Bedingungen nicht mit den entsprechend gewählten Negativkontrollen des Arrays hybridisieren sollen. Negativkontrollen sind spezielle Sonden des Arrays, mit denen die zu untersuchende Probe unter stringenten Bedingungen nicht hybridisieren sollte. Entsprechend dem Stand der Technik werden häufig nur solche Signalintensitäten als spezifisch betrachtet, die signifikant über den Messwerten der Negativkontrollen liegen. In diesem Zusammenhang kann es für die Erfindung vorteilhaft sein, wenn die Zufallsoligonukleotide nicht oder nur geringfügig mit den Negativkontrollen hybridisieren.In another embodiment come for the use according to the invention variants of the random oligonucleotides with a lower complexity are also considered. These variants of the random oligonucleotides are then desirable for the present Invention if the random oligonucleotides according to the invention under stringent conditions not with the correspondingly chosen negative controls of the array should hybridize. Negative controls are special Probes of the array with which the sample to be examined under stringent conditions should not hybridize. According to the state of the art frequently only such signal intensities considered as specific, significantly above the measurement values of the negative controls lie. In this connection, it can be advantageous for the invention be if the random oligonucleotides do not or only slightly hybridize the negative controls.

In diesem Fall werden Varianten der Zufallsoligonukleotide gewählt, die komplex genug sind, um universell mit den Sonden zu hybridisieren, jedoch nicht mit den Negativkontrollen. Als Beispiel für solche Varianten sei genannt Zufallsoligonukleotide mit der allgemeinen Formel ([C/G/T]₃N₃)₄, wenn die Negativkontrolle auf dem Array die allgemeine Formel (T₂[C/A/G])₂₀ aufweisen. Ein weiteres Beispiel könnte ein Zufallsoligonukleotid der allgemeinen Formel ([C/G/T]₂N)₈ sein, wenn die Negativkontrolle auf dem Array die allgemeine Formel (T[C/A/G])₃₀ aufweist. Die vorstehend genannten Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und schränken die Erfindung nicht auf die genannten Beispiele ein. Generell kommen für die vorliegende Erfindung sämtliche Varianten von Zufallsoligonukleotiden in Frage, die den vorstehend genannten Kriterien folgen.In this case, variants of the random oligonucleotides are chosen which are complex enough to hybridize universally with the probes, but not with the negative controls. An example of such variants is random oligonucleotides with the general formula ([C / G / T] ₃ N ₃ ) ₄ if the negative control on the array has the general formula (T ₂ [C / A / G]) ₂₀ . Another example could be a random oligonucleotide of the general formula ([C / G / T] ₂ N) ₈ if the negative control on the array has the general formula (T [C / A / G]) ₃₀ . The examples mentioned above are only illustrative and do not limit the invention to the examples mentioned. In general, all variants of random oligonucleotides that follow the criteria mentioned above are suitable for the present invention.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kommen als Probe sämtliche Moleküle in Betracht, deren Vorhandensein bzw. Häufigkeit in einem gegebenen Versuchsaufbau nachgewiesen werden soll. Die Erfindung schließt beispielsweise als Probe Moleküle ein wie RNA, DNA, Oligonukleotide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Proteine, Peptide, Antikörper, Toxine, virale Epitope, Hormone und Hormonrezeptoren, Enzyme, Enzymsubstrate, Kofaktoren und pharmazeutische Substanzen ein.In connection with the present All come as a sample molecules into consideration, their presence or frequency in a given Experimental setup should be demonstrated. The invention includes, for example as a sample molecules such as RNA, DNA, oligonucleotides, oligosaccharides, polysaccharides, Proteins, peptides, antibodies, Toxins, viral epitopes, hormones and hormone receptors, enzymes, enzyme substrates, Cofactors and pharmaceutical substances.

Bevorzugt ist die Probe ein DNA- oder RNA-Gemisch, das unter Erhalt der Mischungsanteile in ein markiertes Nukleinsäuregemisch umgesetzt wird (z.B. ein markiertes cDNA-Gemisch, das aus einem mRNA-Gemisch revers transkribiert wird).The sample is preferably a DNA or RNA mixture, which contains the mixture in a labeled nucleic acid mixture is implemented (e.g. a labeled cDNA mixture consisting of a reverse mRNA mixture is transcribed).

Die als Ausgangsmaterial für die markierte Probe verwendete mRNA wird nach Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, aus Zellen oder Gewebe isoliert. Die Zellen oder Gewebe können dabei aus praktisch jedem Organismus stammen. Eingeschlossen sind sowohl pro- als auch eukaryontische Organismen, Einzeller und vielzellige Organismen wie Pflanzen und Tiere. Beispiele für Zellen und Gewebe sind Kulturzellen, Biopsien oder andere Gewebepräparationen sowie Körperflüssigkeiten wie Blut und Speichel.The mRNA used as the starting material for the labeled sample is isolated from cells or tissue by methods known to those skilled in the art. The cells or tissues can come from practically any organism. Both pro- and eukaryotic organs are included nisms, unicellular organisms and multicellular organisms such as plants and animals. Examples of cells and tissues are culture cells, biopsies or other tissue preparations as well as body fluids such as blood and saliva.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammt die zu isolierende mRNA aus Hefen oder anderen Mikroorganismen (z.B. Fermentationsstämme oder pathogene Stämme).In a further preferred embodiment the mRNA to be isolated comes from yeast or other microorganisms (e.g. fermentation strains or pathogenic strains).

Die Probe kann mit einer der vorstehend genannten Substanzen und Methoden markiert werden. Außerdem kann die Probe ein chemisch markiertes mRNA-Gemisch sein.The sample can be made with one of the above mentioned substances and methods are marked. Besides, can the sample be a chemically labeled mRNA mixture.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe mit Cyanine-3^TM oder Cyanine-5^TM markiert.In a preferred embodiment, the sample is labeled with Cyanine-3 ^TM or Cyanine-5 ^TM .

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vergleich der Expressionsprofile verschiedener Proben miteinander mittels kompetitiven Hybridisierungen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst

(i) Bereitstellung eines Mikroarrays mit bekannten Sonden,
(ii) Bereitstellung einer ersten, markierten Probe,
(iii) Bereitstellung einer zweiten oder mehreren weiteren, markierten Proben,
(iv) Bereitstellung eines markierten Zufallsoligomers mit einer von den Proben unterscheidbaren Markierung,
(v) Inkontaktbringen eines ersten Mikroarrays unter Hybridisierungsbedingungen mit der ersten Probe und dem Zufallsoligomer, und Inkontaktbringen weiterer Mikroarrays mit jeweils einer weiteren Probe und dem Zufallsoligomer, wobei für alle Hybridisierungen Zufallsoligomer aus der gleichen Produktion verwendet wird
(vi) Nachweis der Markierungen und
(vii) Bestimmung der Signalintensitätsverhältnisse der jeweiligen Probe im Vergleich zu denen der Zufallsoligomere,
(viii) Bestimmung der relativen Veränderungen zwischen zwei beliebigen der in das Experiment eingegangenen Proben aus dem unter (vii) bestimmten Verhalten der Signalintensitäten

wobei die Markierung der ersten und der weiteren Proben identisch oder verschieden sein können und wobei die Markierungen der ersten und der weiteren Proben von der Markierung des Zufallsoligomers verschieden sind.The present invention further relates to a method for comparing the expression profiles of different samples with one another by means of competitive hybridizations, the method comprising the following steps

(i) provision of a microarray with known probes,
(ii) provision of a first, labeled sample,
(iii) provision of a second or more further, labeled samples,
(iv) providing a labeled random oligomer with a label distinguishable from the samples,
(v) contacting a first microarray under hybridization conditions with the first sample and the random oligomer, and contacting further microarrays with another sample and the random oligomer, using random oligomer from the same production for all hybridizations
(vi) evidence of the markings and
(vii) determining the signal intensity ratios of the respective sample in comparison to that of the random oligomers,
(viii) Determination of the relative changes between any two of the samples entered into the experiment from the behavior of the signal intensities determined under (vii)

wherein the labeling of the first and the further samples can be identical or different and the labeling of the first and the further samples are different from the labeling of the random oligomer.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit für die Analyse von Proben mittels kompetitiven Hybridisierungen unter Verwendung von Zufallsoligomeren als universelle Referenz. Das Kit enthält neben einer Versuchsanleitung mindestens ein markiertes Zufallsoligomer oder ein zur Markierung vorbereitetes Zufallsoligomer (z.B. mit Aminolink). Darüber hinaus kann es zur Durchführung des Verfahrens gegebenenfalls erforderliche Puffer, Nukleotide (dNTPs), Markierungsreagenzien und Enzyme, wie Polymerasen und reverse Transkriptasen enthalten. Ebenfalls in dem Kit enthaltend kann ein mit bekannten Sonden versehener Mikroarray sein, der mit dem Zufallsoligomer als Referenz verwendet werden soll.Finally, the present concerns Invention a kit for the analysis of samples using competitive hybridizations Use of random oligomers as a universal reference. The kit contains alongside a test instruction at least one labeled random oligomer or a random oligomer prepared for labeling (e.g. with Aminolink®). About that it can also be carried out any necessary buffers, nucleotides (dNTPs) of the method, Labeling reagents and enzymes such as polymerases and reverse transcriptases contain. Also included in the kit can be one with known ones Microarray provided with the random oligomer as Reference should be used.

Die erfindungsgemäße Verwendung markierter Zufallsoligomere als Referenz bei kompetitiven Hybridisierungen weist gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen Methoden erhebliche Vorteile auf.The use of labeled random oligomers according to the invention as a reference for competitive hybridizations points towards the methods described in the prior art have considerable advantages on.

Grundsätzlich wird damit die Durchführung kompetitiver Hybridisierungen bei Mikroarray-Analysen mit hoher Probenanzahl erheblich vereinfacht. Kompetitive Hybridisierungen sind nicht-kompetitiven Hybridisierungen im allgemeinen vorzuziehen, da dabei weniger experimentelle Schwankungen, welche die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Messergebnisse beeinträchtigen, auftreten.Basically, this makes implementation more competitive Hybridizations in microarray analyzes with a high number of samples considerably simplified. Competitive hybridizations are non-competitive hybridizations generally preferable because there is less experimental variation, which the accuracy and reproducibility of the measurement results affect occur.

Gegenüber der Wahl einer der Proben aus dem Experiment als gemeinsame Referenz bietet die Wahl markierter Zufallsoligomere den Vorteil, dass die Bereitstellung einer ausreichenden Referenzmenge für alle zu untersuchenden Proben gewährleistet ist. Darüber hinaus muss man bei Verwendung markierter Zufallsoligomere nicht darauf achten, dass in der Referenz alle Gene gleichermaßen repräsentiert sind.Towards choosing one of the samples from the experiment as a common reference offers the choice marked Random oligomers have the advantage of providing sufficient Reference quantity for all samples to be examined is guaranteed. Furthermore one does not have to use labeled random oligomers on it make sure that all genes are represented equally in the reference are.

Gegenüber einem "Pool" (Mischung aller Proben des Experiments) als Referenz weisen Zufallsoligomere den Vorteil auf, dass sie nicht aktualisiert werden müssen, wenn im Verlauf des Experiments eine weitere Probe dazu kommt. Zufallsoligomere sind somit auch geeignet als universelle Referenz, auf die Proben verschiedener Experimente oder verschiedener Labore bezogen und miteinander verglichen werden können.Opposite a "pool" (mix of all samples in the experiment) have random oligomers as a reference the benefit of the fact that they don't need to be updated if another sample is added in the course of the experiment. Are random oligomers therefore also suitable as a universal reference to the samples of different Experiments or different laboratories related and compared can be.

Gegenüber genomischer DNA als Referenz weisen die erfindungsgemäßen Zufallsoligomere den Vorteil auf, dass sie bereits markiert sind oder sich leicht markieren lassen. Darüber hinaus erzeugen DNA-Proben aufgrund ihrer repetitiven Sequenzen häufig unspezifische Hintergrundsignale. Die Verwendung von RNA-Gemischen als Referenz hingegen ist im Vergleich mit Zufallsoligomeren mit erheblichem Kostenaufwand verbunden. Außerdem weisen Zufallsoligomere gegenüber RNA-Gemischen Vorteile hinsichtlich Lagerung und Haltbarkeit auf.Point towards genomic DNA for reference the random oligomers according to the invention the advantage that they are already marked or are easy have it marked. About that In addition, DNA samples often generate non-specific ones due to their repetitive sequences Background signals. The use of RNA mixtures as a reference on the other hand, in comparison with random oligomers it is considerable Associated costs. Moreover face random oligomers RNA mixtures have advantages in terms of storage and shelf life.

Schließlich haben Zufallsoligomere gegenüber spezifischen Oligonukleotiden, die mit einer allgemeinen Sequenz aller Sonden hybridisieren, den Vorteil, dass sie nicht auf bestimmte Arrays mit speziellen Sonden, die eine solche allgemeine Sequenz aufweisen, beschränkt sind.After all, have random oligomers across from specific oligonucleotides with a general sequence of all probes hybridize, the advantage that they are not specific Arrays with special probes that have such a general sequence, limited are.

Beschreibung der Zeichnungdescription the drawing

1:
Schematische Darstellung der verschiedenen Methoden, die Expressionsprofile vieler Proben (A-H) miteinander zu vergleichen. Für zwei Proben bietet sich der direkte Vergleich in einer kompetitven Hybridisierung an. Sollen aber viele (n) Proben auf diese Weise (jede mit jeder) verglichen werden, so ist eine Vielzahl von Hybridisierungen (n·(n – 1)/2) nötig, dargestellt in 1a durch die Verbindungslinien zwischen den Proben. Alternativ ist es möglich, jede Probe in einer einzelnen nicht kompetitiven Hybridisierung zu analysieren (1b), wobei die verwendeten Arrays möglichst identisch hergestellt sein müssen, da Qualitätsschwankungen die Vergleichsergebnisse beeinflussen. Die Verwendung einer Referenz (1c und d), gegen die jede einzelne Probe kompetitiv Verglichen wird, umgeht diesen Nachteil. Der Vergleich zweier Proben lässt sich indirekt aus den zwei Vergleichen der beiden Proben gegen die Referenz ermitteln. Auf diese Weise ist nur eine geringe Anzahl von Hybridisierungen nötig (n – 1, bzw. n). Die Verwendung einer Probe als Referenz (1 c) bietet sich dann an, wenn der Vergleich mit dieser Probe von besonderer Bedeutung ist (z.B. Vergleich einer Wildtyp-Probe mit verschiedenen Mutanten). Die Verwendung einer allgemeinen Referenz (1d) ist dann sinnvoll, wenn alle Proben gleichberechtigt sind und jeder Vergleich zwischen den einzelnen Proben gleichwichtig sein kann (z.B. Vergleich der Proben aus einem Fermentationsverlauf). 1 :
Schematic representation of the different methods of comparing the expression profiles of many samples (AH). For two samples, a direct comparison in a competitive hybridization is useful. But should many samples in this way (each with each) are compared, a large number of hybridizations (n · (n - 1) / 2) are necessary, shown in 1a through the connecting lines between the samples. Alternatively, it is possible to analyze each sample in a single, non-competitive hybridization ( 1b ), whereby the arrays used must be made as identical as possible, since quality fluctuations influence the comparison results. Using a reference ( 1c and d ), against which each individual sample is competitively compared, circumvents this disadvantage. The comparison of two samples can be determined indirectly from the two comparisons of the two samples against the reference. In this way, only a small number of hybridizations is necessary (n - 1 or n). Using a sample as a reference ( 1 c) lends itself when the comparison with this sample is of particular importance (eg comparison of a wild-type sample with different mutants). Using a general reference ( 1d ) makes sense if all samples have equal rights and each comparison between the individual samples can be of equal importance (eg comparison of the samples from a fermentation process).

2:
Ergebnis der Hybridisierung eines Mikroarrays mit einem Cyanine-5^TM-markierten Zufallsoligomer entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen. 2a zeigt den Cyanine-5^TM-Scan des Mikroarrays. Wie die quantitative Auswertung (Häufigkeit der an den Sonden gemessenen Signalstärken) zeigt, hybridisiert das Zufallsoligomer weitegehend gleichmäßig mit den verschiedenen Sonden des Arrays (2b). 2 :
Result of the hybridization of a microarray with a cyanine-5 ^™ -labeled random oligomer according to the conditions described in Example 1. 2a shows the cyanine-5 ^TM scan of the microarray. As the quantitative evaluation (frequency of the signal strengths measured on the probes) shows, the random oligomer hybridizes largely evenly with the various probes in the array ( 2 B ).

3:
Kompetitive Hybridisierung eines Mikroarrays mit einem Cyanine-5^TM-markierten Zufallsoligomer und einer Cyanine-3^TM-markierten Probe entsprechend der in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen. 3a zeigt den Cyanine-5^TM-Scan (Zufallsoligomer) und den Cyanine-3^TM-Scann (Probe) des Mikroarrays. In 3b ist die Häufigkeitsverteilung der Signalintensitäten über alle Sonden für das Zufallsoligomer und für die Probe dargestellt. Es ist erkennbar, dass die Signalstärken für das Zufallssoligomer und die Probe im gleichen Bereich liegen. Dies ist eine Voraussetzung für die Verwendung des Zufallsoligomers als Referenz in einer kompetitiven Hybridisierung. Der Bereich der Signalintensitäten des Zufallsoligomers kann durch experimentelle Parameter den Erfordernissen der Proben angepasst werden (z.B. durch Verwendung anderer Konzentrationen oder anderer Markierungsintensitäten des Zufallsoligomers). Die Signalstärke des Zufallsoligomers wird durch die Kompetition mit der Probe nicht komplett verdrängt. Dies ist ebenfalls eine Voraussetzung für die Verwendung des Zufallsoligomers als Referenz in einer kompetitiven Hybridisierung. 3 :
Competitive hybridization of a microarray with a cyanine-5 ^™ -labeled random oligomer and a cyanine-3 ^™ -labeled sample according to the conditions described in Example 2. 3a shows the Cyanine-5 ^TM scan (random oligomer) and the Cyanine-3 ^TM scan (sample) of the microarray. In 3b the frequency distribution of the signal intensities over all probes for the random oligomer and for the sample is shown. It can be seen that the signal strengths for the random soligomer and the sample are in the same range. This is a prerequisite for using the random oligomer as a reference in a competitive hybridization. The range of the signal intensities of the random oligomer can be adapted to the requirements of the samples by means of experimental parameters (for example by using other concentrations or other labeling intensities of the random oligomer). The signal strength of the random oligomer is not completely suppressed by competition with the sample. This is also a prerequisite for using the random oligomer as a reference in a competitive hybridization.

4:
4 zeigt das Ergebnis des Vergleichstest aus Beispiel 3. Zwei verschiedenen Proben aus Saccharomyces cervisiae RNA wurden in unterschiedlicher Weise miteinander verglichen: (A) als direkter kompetitiver Vergleich auf einem Mikroarray; (B) als indirekter Vergleich durch Hybridisierungen der beiden Proben gegen ein markiertes Zufallsoligomer als gemeinsame Referenz, (C) als indirekter Vergleich durch Hybridisierung der beiden Proben gegen eine Probenmischung als gemeinsame Referenz; (D) als Vergleich zweier getrennt durchgeführter, nicht kompetitiver Hybridisierungen der beiden Proben. In 4a sind für die einzelnen Sonden die direkt ermittelten Expressionsverhältnisse (A) denen gegenübergestellt, die mit der Methode (B) bestimmt wurden. In 4b sind für die einzelnen Sonden die direkt ermittelten Expressionsverhältnisse (A) denen gegenübergestellt, die mit der Methode (C) bestimmt wurden. In 4c sind für die einzelnen Sonden die direkt ermittelten Expressionsverhältnisse (A) denen gegenübergestellt, die mit der Methode (D) bestimmt wurden. Die Methoden (B) und (C) korrelieren gut mit der Methode (A) (r = 0.97, bzw. r = 0.99). Die Korrelation der Methode (D) mit der Methode (A) ist dagegen schlecht (r = 0.53). 4 :
4 shows the result of the comparison test from Example 3. Two different samples of Saccharomyces cervisiae RNA were compared in different ways: (A) as a direct competitive comparison on a microarray; (B) as an indirect comparison by hybridizing the two samples against a labeled random oligomer as a common reference, (C) as an indirect comparison by hybridizing the two samples against a sample mixture as a common reference; (D) as a comparison of two separately performed, non-competitive hybridizations of the two samples. In 4a the directly determined expression ratios (A) for the individual probes are compared to those determined using method (B). In 4b the directly determined expression ratios (A) for the individual probes are compared with those determined using method (C). In 4c the directly determined expression ratios (A) for the individual probes are compared to those determined using method (D). Methods (B) and (C) correlate well with method (A) (r = 0.97 and r = 0.99, respectively). The correlation of method (D) with method (A) is poor (r = 0.53).

5:
5 zeigt das Ergebnis des Vergleichstest aus Beispiel 4. Zwei verschiedenen Proben aus Maus-RNA wurden in unterschiedlicher Weise miteinander verglichen, wie in 4 beschrieben. In 5a sind für die einzelnen Sonden die direkt ermittelten Expressionsverhältnisse (A) denen gegenübergestellt, die mit der Methode (B) bestimmt wurden. In 5b sind für die einzelnen Sonden die direkt ermittelten Expressionsverhältnisse (A) denen gegenübergestellt, die mit der Methode (C) bestimmt wurden. In 5c sind für die einzelnen Sonden die direkt ermittelten Expressionsverhältnisse (A) denen gegenübergestellt, die mit der Methode (D) bestimmt wurden. Wie bei dem in 4 dargestellten Versuch korrelieren die Methoden (B) und (C) deutlich besser mit der Methode (A) (r = 0.86, bzw. r = 0.95) als die Methode (D) mit der Methode (A) (r = 0.63). 5 :
5 shows the result of the comparison test from Example 4. Two different samples of mouse RNA were compared in different ways, as in 4 described. In 5a the directly determined expression ratios (A) for the individual probes are compared to those determined using method (B). In 5b the directly determined expression ratios (A) for the individual probes are compared with those determined using method (C). In 5c the directly determined expression ratios (A) for the individual probes are compared to those determined using method (D). Like the one in 4 In the experiment shown, methods (B) and (C) correlate much better with method (A) (r = 0.86 or r = 0.95) than method (D) with method (A) (r = 0.63).

In den folgenden Beispielen soll die vorliegende Erfindung näher erläutert werden:The following examples are intended the present invention in more detail explained become:

Beispiel 1:Example 1:

Gleichmäßige Hybridisierung aller Sonden eines Hefe-Mikroarrays mit einem Cyanine5^TM-markierten Zufallsoligomer.Uniform hybridization of all probes of a yeast microarray with a Cyanine5 ^™ -labeled random oligomer.

Die verwendeten Mikroarrays wurden durch robotergesteuerte Ablage mittels handelsüblicher Pins (SMP5, Telechem, ca. 0.5nl Übertragungsvolumen) von etwa 3000 PCR-Fragmenten (je ca. 100ng/μl in 150mM Phosphat-Puffer, pH 8) als Sonden auf eine modifizierte Glasoberfläche (Aminosilanbeschichtung, Schott) hergestellt. Die verwendeten PCR-Fragmente sind spezifisch für Saccharomyces cervisiae Gene. Nach der Ablage der PCR-Fragmente wurden die Glasträger mit 240 mJ UV (LTV/Stratalinker 2400, Stratagene) behandelt, gewaschen (5min 0.1% SDS, 3 × 5min Wasser), anschließend 4 min in kochendem Wasser inkubiert (denaturieren der gebundenen PCR-Fragmente) und im N₂-Strom getrocknet.The microarrays used were placed on a modified glass surface by robotic placement using commercially available pins (SMP5, Telechem, approx. 0.5nl transmission volume) of approx. 3000 PCR fragments (approx. 100ng / μl each in 150mM phosphate buffer, pH 8) ( Aminosilane coating, Schott). The PCR fragments used are specific for Saccharomyces cervisiae genes. After filing the PCR frag The glass slides were then treated with 240 mJ UV (LTV / Stratalinker 2400, Stratagene), washed (5 min 0.1% SDS, 3 × 5 min water), then incubated for 4 min in boiling water (denaturing the bound PCR fragments) and in N ₂ Stream dried.

Als Hybridisierungsprobe wurde ein handelsübliches Zufallsoligomer (Synthese mittels Phosphoramidit-Chemie) mit der Sequenz N₂₁ und einer Cyanine5^TM-Modifikation am 5'-Ende als 7.5μM Lösung in einem Standard-Hybridisierungspuffer (5 × SSC [0.75M Natriumchlorid; 0.075M Natriumcitrat, pH7], 0.02% SDS, 0.1% N-Laurosylsarcosin, 1% Blocking-Reagenz (Roche), 30% Formamid) eingesetzt. Die Hybridisierungsprobe wurde 14h bei 40C mit einem Mikroarray in Kontakt gebracht. Die Hybridisierung wurde in einem Volumen von 40μl unter einem Deckglas (24 × 50mm) in einer Feuchtekammer durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurde der Mikroarray gewaschen (5 min 5 × SSC, 0.1% SDS und 5 min 0.06 × SSC [9mM Natriumchlorid; 0.9mM Natriumcitrat, pH7]) und im N₂-Strom getrocknet. Der Mikroarray wurde in einem handelsüblichen Scanner (G2565AA Microarray Scanner System; Agilent) analysiert (2a). Die Verteilung der Signalintensitäten an den Sonden des Mikroarrays (2b) zeigt, dass das markierte Zufallsoligonukleotid in einer gleichmäßigen Verteilung mit den Sonden des Arrays hybridisiert.A commercially available random oligomer (synthesis using phosphoramidite chemistry) with the sequence N ₂₁ and a Cyanine5 ^™ modification at the 5 'end as a 7.5μM solution in a standard hybridization buffer (5 × SSC [0.75M sodium chloride; 0.075M sodium citrate , pH7], 0.02% SDS, 0.1% N-laurosyl sarcosine, 1% blocking reagent (Roche), 30% formamide). The hybridization sample was contacted with a microarray at 40C for 14h. The hybridization was carried out in a volume of 40 μl under a cover glass (24 × 50 mm) in a moisture chamber. After the hybridization, the microarray was washed (5 min 5 × SSC, 0.1% SDS and 5 min 0.06 × SSC [9 mM sodium chloride; 0.9 mM sodium citrate, pH7]) and dried in a stream of N ₂ . The microarray was analyzed in a commercially available scanner (G2565AA Microarray Scanner System; Agilent) ( 2a ). The distribution of the signal intensities on the probes of the microarray ( 2 B ) shows that the labeled random oligonucleotide hybridizes in a uniform distribution with the probes of the array.

Beispiel 2:Example 2:

Kompetitive Hybridisierung von Cyanine-3^TM-markierter Probe zusammen mit einem Cyanine-5^TM-markierten Zufallsoligomer.Competitive hybridization of cyanine-3 ^TM -labeled sample together with a cyanine-5 ^TM -labeled random oligomer.

Ein aus Saccaxomyces cervisiae Zellen (logarithmische Wachstumsphase) gewonnenes RNA-Gemisch (15μg Gesamt-RNA) wurde mit einem handelsüblichen Kit (CyScribe Post-Labelling-Kit, Amersham) nach den Herstellerangaben mittels reverser Transkription mit Cyanine-3^TM markiert. Die Probe wurde zusammen mit 0.3nmol Cyanine-5^TM markiertem Zufallsoligomer in einem Volumen von 40μl (Puffer wie in Bsp. 1) zur Hybridisierung (Bedingungen und Mikroarray wie in Bsp. 1) eingesetzt. Die Analyse des Mikroarrays mittels Fluoreszenzscanner (s. Bsp. 1) ist in 3a dargestellt. 3b zeigt die Verteilung der Signalintensitäten des Cyanine-5^TM-markierten Zufallsoligomer und der Cyanine-3^TM-markierten Probe für die Sonden des Mikroarrays bei gleichzeitiger, kompetitiver Hybridisierung. Es ist festzustellen, dass die Sonden auch in Gegenwart von kompetitiver Probe ein signifikantes Hybridisierungs-Signal ergeben. Dies ist Voraussetzung dafür, das Zufallsoligomer als Referenz für die Probe verwenden zu können. Würde das Signal durch die Probe komplett verdrängt, dann wäre das auf die Referenz normierte Probensignal für die entsprechenden Sonden nicht definiert. Es ist erkennbar, dass die Signalstärken für das Zufallsoligomer und die Probe im gleichen Bereich liegen. Dies ist eine Voraussetzung, um bei der Verwendung des Zufallsoligomers als Referenz in einer kompetitiven Hybridisierung gute Resultate zu erzielen. Der Bereich der Signalintensitäten des Zufallsoligomers kann durch experimentelle Parameter den Erfordernissen der Proben angepasst werden (z.B. durch Verwendung anderer Konzentrationen oder anderer Markierungsintensitäten des Zufallsoligomers).An RNA mixture (15 μg total RNA) obtained from Saccaxomyces cervisiae cells (logarithmic growth phase) was labeled with a commercially available kit (CyScribe post-labeling kit, Amersham) according to the manufacturer's instructions by means of reverse transcription with Cyanine-3 ^TM . The sample was used together with 0.3 nmol of cyanine-5 ^TM- labeled random oligomer in a volume of 40 μl (buffer as in Example 1) for hybridization (conditions and microarray as in Example 1). The analysis of the microarray using a fluorescence scanner (see Example 1) is shown in 3a shown. 3b shows the distribution of the signal intensities of the cyanine-5 ^™ -labeled random oligomer and the cyanine-3 ^™ -labeled sample for the probes of the microarray with simultaneous, competitive hybridization. It can be seen that the probes give a significant hybridization signal even in the presence of a competitive sample. This is a prerequisite for being able to use the random oligomer as a reference for the sample. If the signal were completely displaced by the sample, the sample signal standardized to the reference would not be defined for the corresponding probes. It can be seen that the signal strengths for the random oligomer and the sample are in the same range. This is a prerequisite for achieving good results when using the random oligomer as a reference in a competitive hybridization. The range of the signal intensities of the random oligomer can be adapted to the requirements of the samples by means of experimental parameters (for example by using other concentrations or other labeling intensities of the random oligomer).

Beispiel 3:Example 3:

Vergleich der Expressionsverhältnisse zwischen zwei unterschiedlichen RNA-Proben aus Saccharomyces cervisiae, die gewonnen wurden (a) durch direkte kompetitive Hybridisierung beider Proben, (b) durch getrennte Hybridisierung der beiden Proben jeweils kompetitiv mit einem Zufallsoligomer als Referenz, (c) durch getrennte Hybridisierung der beiden Proben jeweils kompetitiv mit einem Pool aus beiden Proben als Referenz, (d) durch getrennte, nicht-kompetitive Hybridsierung der beiden Proben.Comparison of expression ratios between two different RNA samples from Saccharomyces cervisiae, which were obtained (a) by direct competitive hybridization both samples, (b) by separate hybridization of the two samples each competitively with a random oligomer as a reference, (c) by separate hybridization of the two samples competitively with a pool of both samples for reference, (d) by separate, non-competitive hybridization of the two samples.

Zwei aus Saccharomyces cervisiae Zellen (Proben A: logarithmische Wachstumsphase; Probe B: stationäre Phase) gewonnene RNA-Gemische (je 15μg Gesamt-RNA) wurde wie in Bsp. 2 beschrieben mit Cyanine-3^TM bzw. mit Cyanine-5^TM markiert. Im Fall (a) wurden die Cyanine-3^TM-markierte Probe A und die Cyanine-5^TM-markierte Probe B zusammen zur Hybridisierung mit einem Mikroarray eingesetzt. Im Fall (b) wurden die Cyanine-3^T ^M-markierte Probe A zusammen mit 0.3nmol Cyanine-5^TM-markiertem Zufallsoligomer zur Hybridisierung mit einem Mikroarray und in einem anderen Ansatz die Cyanine-3^TM-markierte Probe B zusammen mit 0.3nmol Cyanine-5^TM-markiertem Zufallsoligomer zur Hybridisierung mit einem weiteren Mikroarray eingesetzt. Im Fall (c) wurden die Cyanine-3^TM-markierte Probe A zusammen mit einer Cyanine-5^TM-markierten 1:1-Mischung beider Proben zur Hybridisierung mit einem Mikroarray und in einem anderen Ansatz die Cyanine-3^TM-markierte Probe B zusammen einer Cyanine-5^TM-markierten 1:1-Mischung beider Proben zur Hybridisierung mit einem weiteren Mikroarray eingesetzt. Im Fall (d) wurde die Cyanine-3^TM-markierte Probe A zur Hybridisierung mit einem Mikroarray und in einem anderen Ansatz die Cyanine-3^TM-markierte Probe B zur Hybridisierung mit einem weiteren Mikroarray eingesetzt. Alle Hybridisierungen fanden unter den in Bsp.1 beschriebenen Bedingungen und mit den in Bsp.1 beschriebenen Mikroarrays statt. Alle Mikroarrays wurden wie in Bsp.1 beschrieben analysiert. Die Expressionsverhältnisse zwischen den beiden Proben wurden für die verschiedenen Gene der entsprechenden Sonden entweder (a) direkt aus einer kompetitiven Hybridisierung, oder (b) indirekt aus zwei kompetitiven Hybridisierungen jeweils gegen das Zufallsoligomer als Referenz, oder (c) indirekt aus zwei kompetitiven Hybridisierungen jeweils gegen den Pool aus beiden Proben als Referenz, oder (d) aus zwei getrennten, nicht kompetitiven Hybridisierungen mit Mikroarrays aus der gleichen Produktion ermittelt. In 4a-c sind die Korrelationen der Vergleiche (b), (c), und (d) gegen die direkte Bestimmung (a) dargestellt. Es ist davon auszugehen, dass der direkte Vergleich (a) die beste Näherung an die wirklichen Expressionsverhältnisse ergibt. Diese Art des Vergleichs ist aber ungünstig, wenn viele Proben miteinander verglichen werden sollen, da dann eine sehr hohe Anzahl von Hybridisierungen erforderlich wird. Indirekte Vergleiche gegen eine gemeinsame Referenz (b und c) korrelieren gut mit den Ergebnissen des direkten Vergleichs (a) und sind darüber hinaus geeignet Vergleiche vieler Proben miteinander zu handhaben. Die Standardisierung der Hybridisierungsergebnisse gegen eine gemeinsame Referenz erlaubt, alle Proben, die gegen eine gemeinsame Referenz hybridisiert wurden, auch in verschiedenen Laboratorien, miteinander zu vergleichen. Die Verwendung von einem Pool aus den zu vergleichenden Proben als Referenz (c) ergab eine etwas bessere Korrelation mit dem direkten Vergleich (a) als die Verwendung von Zufallsoligomer als Referenz (b), allerdings sinkt die Ähnlichkeit des Pools mit den einzelnen Proben und damit die Eignung als Referenz, wenn viele unterschiedliche Proben miteinander verglichen werden müssen. Die Korrelation der Expressionsverhältnisse aus der nicht-kompetitiven Hybridisierung (d) mit dem direkten Vergleich (a) ist mit Abstand am schlechtesten. In einem Vergleich vieler Proben ist somit die Verwendung einer kompetitiven Hybridisierung gegen eine Referenz (b und c) der nicht kompetitiven Hybridisierung vorzuziehen.Two RNA mixtures (15 μg total RNA each) obtained from Saccharomyces cervisiae cells (samples A: logarithmic growth phase; sample B: stationary phase) were labeled with cyanine-3 ^TM or with cyanine-5 ^TM as described in Example 2. In case (a), the cyanine-3 ^™ -labeled sample A and the cyanine-5 ^™ -labeled sample B were used together for hybridization with a microarray. In case (b), the cyanine-3 ^T ^M -labeled sample A together with 0.3 nmol of cyanine-5 ^TM -labeled random oligomer for hybridization with a microarray and, in another approach, the cyanine-3 ^TM -labeled sample B together with 0.3 nmol Cyanine-5 ^TM -labeled random oligomer used for hybridization with another microarray. In case (c), the cyanine-3 ^™ -labeled sample A was combined with a cyanine-5 ^™ -labeled 1: 1 mixture of both samples for hybridization with a microarray and, in another approach, the cyanine-3 ^™ -labeled sample B used together with a cyanine-5 ^TM -labelled 1: 1 mixture of both samples for hybridization with another microarray. In case (d), the cyanine-3 ^™ -labeled sample A was used for hybridization with a microarray and, in another approach, the cyanine-3 ^™ -labeled sample B for hybridization with another microarray. All hybridizations took place under the conditions described in Example 1 and with the microarrays described in Example 1. All microarrays were analyzed as described in Example 1. The expression ratios between the two samples were determined for the different genes of the corresponding probes either (a) directly from a competitive hybridization, or (b) indirectly from two competitive hybridizations, each against the random oligomer as a reference, or (c) indirectly determined from two competitive hybridizations against the pool from both samples as a reference, or (d) from two separate, non-competitive hybridizations with microarrays from the same production. In 4a-c the correlations of comparisons (b), (c), and (d) against direct determination (a) are shown. It can be assumed that the direct comparison (a) gives the best approximation to the real expression ratios. However, this type of comparison is disadvantageous if many samples are to be compared with one another, since a very high number of hybridizations is then required. Indirect comparisons against a common reference (b and c) correlate well with the results of direct comparison (a) and are also suitable for handling comparisons between many samples. The standardization of the hybridization results against a common reference makes it possible to compare all samples that have been hybridized against a common reference, even in different laboratories. The use of a pool of the samples to be compared as reference (c) gave a somewhat better correlation with the direct comparison (a) than the use of random oligomer as reference (b), however the similarity of the pool with the individual samples decreases and therefore the suitability as a reference when many different samples have to be compared. The correlation of the expression ratios from the non-competitive hybridization (d) with the direct comparison (a) is by far the worst. In a comparison of many samples, the use of a competitive hybridization against a reference (b and c) is therefore preferable to the non-competitive hybridization.

Beispiel 4:Example 4:

Beispiel 4 ist ein analoger Vergleich zu Beispiel 3, jedoch in einem anderen Modellsystem (Maus-RNA, Oligonukleotid-Mikroarray, andere Hybridisierungsbedingungen).Example 4 is an analog comparison to Example 3, but in a different model system (mouse RNA, oligonucleotide microarray, other hybridization conditions).

Vergleich der Expressionsverhältnisse zwischen zwei unterschiedlichen Maus-RNA, die gewonnen wurden (a) durch direkte kompetitive Hybridisierung beider Proben, (b) durch getrennte Hybridisierung der beiden Proben jeweils kompetitiv mit einem Zufallsoligomer als Referenz, (c) durch getrennte Hybridisierung der beiden Proben jeweils kompetitiv mit einem Pool aus beiden Proben als Referenz, (d) durch getrennte, nicht-kompetitive Hybridsierung der beiden Proben.Comparison of expression ratios between two different mouse RNAs obtained (a) by direct competitive hybridization of both samples, (b) by separate hybridization of the two samples competitively with a random oligomer for reference, (c) by separate hybridization each of the two samples competitively with a pool of both samples for reference, (d) by separate, non-competitive hybridization of the two samples.

Zwei aus Mausgewebe (Probe A: Hirn; Probe B: Niere) gewonnene RNA-Gemische (je 10μg Gesamt-RNA) wurde wie in Bsp. 2 beschrieben mit Cyanine-3^TM bzw. mit Cyanine-5^TM markiert. Im Fall (a) wurden die Cyanine-3^TM-markierte Probe A und die Cyanine-5^TM-markierte Probe B zusammen zur Hybridisierung mit einem Mikroarray eingesetzt. Im Fall (b) wurden die Cyanine-3^TM-markierte Probe A zusammen mit 0.3nmol Cyanine-5^TM-markiertem Zufallsoligomer zur Hybridisierung mit einem Mikroarray und in einem anderen Ansatz die Cyanine-3^TM-markierte Probe B zusammen mit 0.3nmol Cyanine-5^TM-markiertem Zufallsoligomer zur Hybridisierung mit einem weiteren Mikroarray eingesetzt. Im Fall (c) wurden die Cyanine-3^TM-markierte Probe A zusammen mit einer Cyanine-5^TM-markierten 1:1-Mischung beider Proben zur Hybridisierung mit einem Mikroarray und in einem anderen Ansatz die Cyanine-3^TM-markierte Probe B zusammen einer Cyanine-5^TM-markierten 1:1-Mischung beider Proben zur Hybridisierung mit einem weiteren Mikroarray eingesetzt. Im Fall (d) wurde die Cyanine-3^TM-markierte Probe A zur Hybridisierung mit einem Mikroarray und in einem anderen Ansatz die Cyanine-3^TM-markierte Probe B zur Hybridisierung mit einem weiteren Mikroarray eingesetzt. Alle Hybridisierungen fanden unter den in Bsp.1 beschriebenen Bedingungen, jedoch bei 52°C statt.Two RNA mixtures (each 10μg total RNA) obtained from mouse tissue (sample A: brain; sample B: kidney) were labeled with cyanine-3 ^TM or with cyanine-5 ^TM as described in example 2. In case (a), the cyanine-3 ^™ -labeled sample A and the cyanine-5 ^™ -labeled sample B were used together for hybridization with a microarray. In case (b), the cyanine-3 ^™ -labeled sample A together with 0.3 nmol of cyanine-5 ^™ -labeled random oligomer for hybridization with a microarray and in another approach the cyanine-3 ^™ -labeled sample B together with 0.3 nmol of cyanine -5 ^TM -labeled random oligomer used for hybridization with another microarray. In case (c), the cyanine-3 ^™ -labeled sample A was combined with a cyanine-5 ^™ -labeled 1: 1 mixture of both samples for hybridization with a microarray and, in another approach, the cyanine-3 ^™ -labeled sample B used together with a cyanine-5 ^TM -labelled 1: 1 mixture of both samples for hybridization with another microarray. In case (d), the cyanine-3 ^™ -labeled sample A was used for hybridization with a microarray and, in another approach, the cyanine-3 ^™ -labeled sample B for hybridization with another microarray. All hybridizations took place under the conditions described in Example 1, but at 52 ° C.

Die verwendeten Mikroarrays wurden durch robotergesteuerte Ablage mittels handelsüblicher Pins (SMP5, Telechem, ca. 0.5nl Übertragungsvolumen) von etwa 4000 Aminolink-modifizierten Oligonukleotiden (Sigma-Genosys, je ca. 40pmol/μl und 65 Basen Länge; in 150mM Phosphat-Puffer, pH 8) als Sonden auf eine modifizierte Glasoberfläche (3DLink, Motorola) hergestellt. Die verwendeten Oligonukleotide sind spezifisch für Gene der Maus. Nach der Ablage der Oligonukleotide wurden die Glasträger über Nacht bei 70% Luftfeuchte und Raumtemperatur inkubiert, anschließend 4 min in kochendem Wasser inkubiert (denaturieren der gebundenen Oligonukleotide) und im N₂-Strom getrocknet.The microarrays used were robot-controlled storage using commercially available pins (SMP5, Telechem, approx.0.5nl transfer volume) of approx.4,000 amino link-modified oligonucleotides (Sigma-Genosys, each approx. 40 pmol/μl and 65 bases in length; in 150mM phosphate buffer, pH 8) as probes on a modified glass surface (3DLink, Motorola). The oligonucleotides used are specific for mouse genes. After the oligonucleotides had been deposited, the glass slides were incubated overnight at 70% atmospheric humidity and room temperature, then incubated for 4 min in boiling water (denaturing the bound oligonucleotides) and dried in a stream of N ₂ .

Alle Mikroarrays wurden wie in Bsp.1 beschrieben analysiert. Die Expressionsverhältnisse zwischen den beiden Proben wurden für die verschiedenen Gene der entsprechenden Sonden entweder (a) direkt aus einer kompetitiven Hybridisierung, oder (b) indirekt aus zwei kompetitiven Hybridisierungen jeweils gegen das Zufallsoligomer als Referenz, oder (c) indirekt aus zwei kompetitiven Hybridisierungen jeweils gegen den Pool aus beiden Proben als Referenz, oder (d) aus zwei getrennten, nicht kompetitiven Hybridisierungen mit Mikroarrays aus der gleichen Produktion ermittelt. In 5a-c sind die Korrelationen der Vergleiche (b), (c), und (d) gegen die direkte Bestimmung (a) dargestellt. Es ist davon auszugehen, dass der direkte Vergleich (a) die beste Näherung an die wirklichen Expressionsverhältnisse ergibt. Diese Art des Vergleichs ist aber ungünstig, wenn viele Proben miteinander verglichen werden sollen, da dann eine sehr hohe Anzahl von Hybridisierungen erforderlich wird. Indirekte Vergleiche gegen eine gemeinsame Referenz (b und c) korrelieren gut mit den Ergebnissen des direkten Vergleichs (a) und sind darüber hinaus geeignet Vergleiche vieler Proben miteinander zu handhaben. Die Standardisierung der Hybridisierungsergebnisse gegen eine gemeinsame Referenz erlaubt, alle Proben, die gegen eine gemeinsame Referenz hybridisiert wurden, auch in verschiedenen Laboratorien, miteinander zu vergleichen. Die Verwendung von einem Pool aus den zu vergleichenden Proben als Referenz (c) ergab eine etwas bessere Korrelation mit dem direkten Vergleich (a) als die Verwendung von Zufallsoligomer als Referenz (b), allerdings sinkt die Ähnlichkeit des Pools mit den einzelnen Proben und damit die Eignung als Referenz, wenn viele unterschiedliche Proben miteinander verglichen werden müssen. Die Korrelation der Expressionsverhältnisse aus der nicht-kompetitiven Hybridisierung (d) mit dem direkten Vergleich (a) ist mit Abstand am schlechtesten. In einem Vergleich vieler Proben ist somit die Verwendung einer kompetitiven Hybridisierung gegen eine Referenz (b und c) der nicht kompetitiven Hybridisierung vorzuziehen.All microarrays were analyzed as described in Example 1. The expression ratios between the two samples were determined for the different genes of the corresponding probes either (a) directly from a competitive hybridization, or (b) indirectly from two competitive hybridizations, each against the random oligomer as reference, or (c) indirectly from two competitive hybridizations, respectively against the pool from both samples for reference, or (d) from two separate, non-competitive hybridizations with microarrays from the same production. In 5a-c the correlations of comparisons (b), (c), and (d) against direct determination (a) are shown. It can be assumed that the direct comparison (a) gives the best approximation to the real expression ratios. However, this type of comparison is disadvantageous if many samples are to be compared with one another, since a very high number of hybridizations is then required. Indirect comparisons against a common reference (b and c) correlate well with the results of direct comparison (a) and are also suitable for handling comparisons between many samples. The standardization of the hybridization results against a common reference allowed all samples against a common reference were hybridized, even in different laboratories, to compare. The use of a pool of the samples to be compared as reference (c) gave a somewhat better correlation with the direct comparison (a) than the use of random oligomer as reference (b), however the similarity of the pool with the individual samples decreases and therefore the suitability as a reference when many different samples have to be compared. The correlation of the expression ratios from the non-competitive hybridization (d) with the direct comparison (a) is by far the worst. In a comparison of many samples, the use of a competitive hybridization against a reference (b and c) is therefore preferable to the non-competitive hybridization.

Claims

Use of random oligomers as universal Reference for competitive hybridization of at least two samples for normalization of experimental variations.

Use according to claim 1, characterized in that the competitive hybridization on one Microarray takes place.

Use according to claims 1 and 2, characterized in that the random oligomers are selected from the group consisting of nucleotide oligomers, nucleotide analog oligomers and Peptide oligomers.

Use according to a of claims 1 to 3, characterized in that the random oligomeric nucleotide and / or nucleotide analog oligomers.

Use according to a of claims 1 to 4, characterized in that the random oligomers are nucleotide oligomers, especially DNA oligomers.

Use according to claims 4 and 5, characterized in that the random oligomers have a length of Have 5 to 100 nucleotides or nucleotide analogs.

Use according to a of claims 4 to 6, characterized in that the random oligomers length of Have 10 to 50 nucleotides or nucleotide analogs.

Use according to a of claims 4 to 7, characterized in that the random oligomers a length of Have 15 to 30 nucleotides or nucleotide analogs.

Use according to a of claims 4 to 8, characterized in that the random oligomers a length of Have 20 to 25 nucleotides or nucleotide analogs.

Use according to a of claims 1 to 9, characterized in that the random oligomers with fluorescent dyes are marked.

Use according to claim 10, characterized in that the fluorescent dyes are selected from the group consisting of fluorescein, dichlorofluoreszein, hexachlorofluoreszein, BODIPY ^™ variants, ROX, tetramethylrhodamine, rhodamine X, cyanine-2 ^TM , cyanine-3 ^TM , cyanine-5 ^TM , Cyanine-7 ^TM , IRD40, FluorX, Oregon GreenTM and Alexa ^TM variants are marked.

Use according to one of claims 10 and 11, characterized in that the fluorescent dyes are Cyanine-3 ^TM and / or Cyanine-5 ^TM .

Use according to a of claims 1 to 9, characterized in that the random oligomers for a label are prepared with a fluorescent dye.

Use according to claim 13, characterized in that the random oligomers one or have more amino linkers.

Use according to claim 13, characterized in that the random oligomers one or more Have biotin groups.

Use according to a of claims 1 to 15, characterized in that the random oligomer variants with reduced complexity are under strict conditions not with the negative controls hybridize the array.

Use according to a of claims 1 to 16, characterized in that the sample is selected from the group consisting of RNA, DNA and peptides.

Use according to claim 17, characterized in that the sample is a labeled DNA or RNA mixture is.

Use according to claims 17 and 18, characterized in that the sample is from an mRNA mixture reverse transcribed cDNA mixture.

Use according to claims 17 and 18, characterized in that the sample is a chemically labeled mRNA mixture.

Use according to claims 19 and 20, characterized in that the mRNA from microorganisms or comes from plant or animal cells.

Use according to a of claims 1 to 21, characterized in that the sample with a fluorescent dye is marked.

Method for comparing the expression profiles of different Sample with each other using competitive hybridizations, the Procedure includes the following steps: (i) Provision a microarray with known probes, (ii) Deployment a first, marked sample, (iii) Provision of a second or more other marked samples, (iv) Deployment of a labeled random oligomer with one distinguishable from the samples Mark, (v) contacting a first microarray under hybridization conditions with the first sample and the random oligomer, and contacting further microarrays, each with a further sample and the random oligomer, being for all hybridizations used random oligomer from the same production becomes (vi) evidence of the markings and (vii) determination the signal intensity ratios of the respective sample in comparison to that of the random oligomers, (Viii) Determination of the relative changes between any two of the samples entered into the experiment from the behavior of the signal intensities determined under (vii) in which the marking of the first and the further samples is identical or can be different and the markings of the first and further samples of the labeling of the random oligomer are different.

Method according to claim 23, characterized in that the sample is a labeled RNA or DNA mixture is.

Process according to claims 23 and 24, characterized in that the sample is from an mRNA mixture reverse transcribed cDNA mixture.

Process according to claims 23 and 24, characterized in that the sample is a chemically labeled mRNA mixture.

Procedure according to a of claims 23 to 26, characterized in that the random oligomer is selected from the group consisting of nucleotide oligomers, nucleotide analog oligomers and peptide oligomers.

Method according to claim 27, characterized in that the random oligomer is a nucleotide or nucleotide analog oligomers.

Process according to claims 27 and 28, characterized in that the random oligomer is a nucleotide oligomer, is in particular a DNA oligomer.

Kit for comparing different samples by means of competitive hybridizations, the kit containing at least a labeled random oligomer and / or a random oligomer prepared for labeling, optionally buffers, nucleotides, enzymes and optionally microarray equipped with probe elements as well as experimental instructions.