DE102023110966A1 - FERMENTATIVE PRODUCTION OF BEVERAGES FROM THE PULP OF THE COCOA FRUIT - Google Patents
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- Non-Alcoholic Beverages (AREA)
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine fermentative Verarbeitung von Kakaofruchtbestandteilen außer Kakaobohnen, insbesondere Kakaopulpe, mit einem pilzlichen Mikroorganismus. Die Fermentationsprodukte der Erfindung eignen sich als Nahrungsbestandteile, beispielsweise in Getränken. Die Erfindung stellt Verfahren zur Fermentation, Verfahren zur Getränkeherstellung und Verfahrung zur Identifikation von geeigneten Mikroorganismen, als auch Fermentationsprodukte und Nahrungsmittel wie Getränke bereit.The present invention relates to a fermentative processing of cocoa fruit components other than cocoa beans, in particular cocoa pulp, with a fungal microorganism. The fermentation products of the invention are suitable as food components, for example in beverages. The invention provides methods for fermentation, methods for beverage production and methods for identifying suitable microorganisms, as well as fermentation products and foods such as beverages.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine fermentative Verarbeitung von Kakaofruchtbestandteilen außer Kakaobohnen, insbesondere Kakaopulpe, mit einem pilzlichen Mikroorganismus. Die Fermentationsprodukte der Erfindung eignen sich als Nahrungsbestandteile, beispielsweise in Getränken. Die Erfindung stellt Verfahren zur Fermentation, Verfahren zur Getränkeherstellung und Verfahrung zur Identifikation von geeigneten Mikroorganismen, als auch Fermentationsprodukte und Nahrungsmittel wie Getränke bereit.The present invention relates to a fermentative processing of cocoa fruit components other than cocoa beans, in particular cocoa pulp, with a fungal microorganism. The fermentation products of the invention are suitable as food components, for example in beverages. The invention provides methods for fermentation, methods for producing beverages and methods for identifying suitable microorganisms, as well as fermentation products and foods such as beverages.
BESCHREIBUNGDESCRIPTION
Jährlich werden rund 5,2 Millionen Tonnen Kakaobohnen produziert. Kakao (Theobroma cacao L.) wird in tropischen und subtropischen Regionen, wie der Elfenbeinküste, Kamerun, Ecuador und auch Indonesien angebaut. Mit dem Kakaoanbau gehen soziale, ökologische und ökonomische Probleme einher. Durch den niedrigen internationalen Kakaopreis leben die meisten Kleinbauern zumeist unterhalb der Armutsgrenze. Die anfallenden Nebenströme, die bis zu 90% des Gesamtgewichts von Kakaofrüchten ausmachen, können durch unsachgemäße Entsorgung zu Umweltproblemen und Baumkrankheiten führen. Diese Nebenströme können allerdings auch vorteilhafte, natürliche Inhaltsstoffe enthalten und bieten so ein Potenzial für die Weiterverwertung.Around 5.2 million tons of cocoa beans are produced every year. Cocoa (Theobroma cacao L.) is grown in tropical and subtropical regions such as the Ivory Coast, Cameroon, Ecuador and Indonesia. Cocoa cultivation is associated with social, ecological and economic problems. Due to the low international price of cocoa, most small farmers live below the poverty line. The resulting side streams, which make up to 90% of the total weight of cocoa fruit, can lead to environmental problems and tree diseases if disposed of improperly. However, these side streams can also contain beneficial, natural ingredients and thus offer potential for further use.
Einen dieser Nebenströme stellt das Fruchtfleisch dar, die sogenannte Kakaopulpe. Bei traditioneller Nutzung als Fermentationssubstrat entstehen pro Tonne zu fermentierender Kakaobohnen ca. 100 - 150 L verflüssigter Kakaopulpe, auch Sweatings oder Kakaohonig genannt. Neben dem Verlust eines hochwertigen Rohstoffs kann der Eintrag in den Boden diesen und die Gewässer verunreinigen und zu einem erhöhten Risiko für Schädlingsbefall führen. Studien haben bereits nachgewiesen, dass die Entfernung eines Teils der Kakaopulpe vor der Fermentation keine negativen Auswirkungen auf die spätere Qualität des Kakaos hat, oder die Qualität bei bestimmten Kakaosorten durch die Reduzierung der Pulpe sogar erhöht werden kann, da zu viel Fruchtfleisch zu einer Übersäuerung der Bohnen führen kann. Als Kakaopulpe wird in diesem Kontext das frische Fruchtfleisch verstanden, was unmittelbar nach Öffnen der Kakaofrüchte durch verschiedene Methoden (z.B. mittels Depulper, bestehend aus horizontal angeordneten rotierenden Trommeln) entfernt und zu Zwecken der Haltbarmachung pasteurisiert werden kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die vorstehend beschriebenen Nachteile des Standes der Technik bei der Nutzung von Kakaofrüchten zu vermeiden und den Produzenten zusätzliche Nutzungsmöglichkeiten zu eröffnen.The object of the present invention is to avoid the above-described disadvantages of the prior art in the use of cocoa fruits and to open up additional usage possibilities for producers.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNGBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
Im Folgenden wird die Erfindung in ihren allgemeinen Aspekten und Elementen beschrieben, die die oben genannte Aufgabe lösen.In the following, the invention is described in its general aspects and elements that solve the above-mentioned problem.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verarbeitung von Kakaofruchtbestandteilen, die nicht Kakaobohnen sind und/oder keine Kakaobohnen enthalten, als Ausgangsprodukt, das Verfahren umfassend einen Schritt einer Fermentation des Ausgangsprodukts, mittels eines pilzlichen Mikroorganismus, um ein fermentiertes Produkt zu erhalten, wobei das fermentierte Produkt veränderte Geruchs- und Geschmackseigenschaften im Vergleich zu einem nicht fermentierten Ausgangsprodukt aufweist und das für eine Verwendung in Nahrungsmitteln oder als Nahrungsmittel geeignet ist.In a first aspect, the invention relates to a method for processing cocoa fruit components which are not cocoa beans and/or do not contain cocoa beans as a starting product, the method comprising a step of fermenting the starting product by means of a fungal microorganism to obtain a fermented product, wherein the fermented product has altered odor and taste properties compared to a non-fermented starting product and which is suitable for use in foodstuffs or as a foodstuff.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein fermentiertes Kakaofruchtprodukt hergestellt nach oder herstellbar nach einem Verfahren des ersten Aspekts.In a second aspect, the invention relates to a fermented cocoa fruit product produced by or producible by a process of the first aspect.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Auswahl eines pilzlichen Mikroorganismus, der geeignet ist zur Herstellung von Nahrungsmitteln oder Nahrungsmittelbestandteilen aus Kakaopulpe, das Verfahren umfassend die Schritte:
- (a) Bereitstellen eines pilzlichen Kandidatenorganismus;
- (b) In Kontaktbringen des pilzlichen Kandidatenorganismus mit Kakaopulpe als Ausgangsprodukt zur Herstellung eines fermentierten Produkts;
- (c) Durchführen einer sensorischen Überprüfung der Geruchs- und Geschmackseigenschaften des fermentierten Produkts im Vergleich zum Ausgangsprodukts, und/oder im Vergleich zu einem fermentierten Kontrollprodukt;
- (a) providing a candidate fungal organism;
- (b) bringing the candidate fungal organism into contact with cocoa pulp as a starting material for the production of a fermented product;
- (c) carrying out a sensory assessment of the odour and flavour characteristics of the fermented product in comparison to the starting product and/or in comparison to a fermented control product;
Wobei eine Verbesserung der Geruchs- und Geschmackseigenschaften im Vergleich zum nicht fermentierten Ausgangsprodukt anzeigt, dass der pilzlichen Kandidatenorganismus geeignet ist zur Herstellung eines Nahrungsmittels oder Nahrungsmittelbestandteils aus Kakaopulpe.An improvement in the odor and taste properties compared to the non-fermented starting product indicates that the fungal candidate organism is suitable for the production of a food or food ingredient from cocoa pulp.
In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung eines fermentierten Kakaofruchtprodukts nach einem der vorstehenden Aspekte als Getränk oder bei der Herstellung eines Getränks.In a fourth aspect, the invention relates to a use of a fermented cocoa fruit product according to any of the preceding aspects as a beverage or in the production of a beverage.
In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Getränks, wobei das Verfahren die Verwendung eines fermentierten Kakaofruchtprodukts der Erfindung umfasst, oder wobei das Verfahren die Verfahrensschritte gemäß einem der vorstehenden Aspekte umfasst.In a fifth aspect, the invention relates to a process for producing a beverage, the process comprising the use of a fermented cocoa fruit product of the invention, or the process comprising the process steps according to any of the preceding aspects.
In einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung ein Getränk, welches ein fermentiertes Produkt gemäß der Erfindung umfasst.In a sixth aspect, the invention relates to a beverage comprising a fermented product according to the invention.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Im Folgenden werden die Elemente der Erfindung beschrieben. Diese Elemente sind mit spezifischen Ausführungsformen aufgeführt, es sollte jedoch verstanden werden, dass sie in beliebiger Weise und in beliebiger Anzahl kombiniert werden können, um zusätzliche Ausführungsformen zu schaffen. Die verschiedenen beschriebenen Beispiele und bevorzugten Ausführungsformen sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie die vorliegende Erfindung nur auf die explizit beschriebenen Ausführungsformen beschränken. Diese Beschreibung sollte verstanden werden, um Ausführungsformen zu unterstützen und zu umfassen, die zwei oder mehr der explizit beschriebenen Ausführungsformen kombinieren oder eine oder mehrere der explizit beschriebenen Ausführungsformen mit einer beliebigen Anzahl der offengelegten und/oder bevorzugten Elemente kombinieren. Darüber hinaus sollten alle Permutationen und Kombinationen aller beschriebenen Elemente in dieser Anwendung als durch die Beschreibung der vorliegenden Anwendung offengelegt betrachtet werden, es sei denn, der Kontext deutet auf etwas anderes hin.The following describes the elements of the invention. These elements are listed with specific embodiments, but it should be understood that they can be combined in any manner and in any number to create additional embodiments. The various examples and preferred embodiments described should not be construed to limit the present invention to only the explicitly described embodiments. This description should be understood to support and include embodiments that combine two or more of the explicitly described embodiments, or that combine one or more of the explicitly described embodiments with any number of the disclosed and/or preferred elements. Furthermore, all permutations and combinations of all described elements in this application should be considered to be disclosed by the description of the present application, unless the context indicates otherwise.
Die vorliegende Erfindung betrifft die fermentative Behandlung von Kakaopulpe zur Herstellung von Nahrungsmitteln oder Nahrungsmittelbestandteilen mit angenehmen Geruchs- und Geschmackseindrücken.The present invention relates to the fermentative treatment of cocoa pulp for the production of foods or food ingredients with pleasant odor and taste impressions.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verarbeitung von Kakaofruchtbestandteilen, die nicht Kakaobohnen sind und/oder keine Kakaobohnen enthalten, als Ausgangsprodukt, das Verfahren umfassend einen Schritt einer Fermentation des Ausgangsprodukts, mittels eines pilzlichen Mikroorganismus, um ein fermentiertes Produkt zu erhalten, wobei das fermentierte Produkt veränderte Geruchs- und Geschmackseigenschaften im Vergleich zu einem nicht fermentierten Ausgangsprodukt aufweist und das für eine Verwendung in Nahrungsmitteln oder als Nahrungsmittel geeignet ist.In a first aspect, the invention relates to a method for processing cocoa fruit components which are not cocoa beans and/or do not contain cocoa beans as a starting product, the method comprising a step of fermenting the starting product by means of a fungal microorganism to obtain a fermented product, wherein the fermented product has altered odor and taste properties compared to a non-fermented starting product and which is suitable for use in foodstuffs or as a foodstuff.
Als Kakaopulpe bezeichnet man das süß-säuerliche, essbare Fruchtfleisch, das die Kakaobohnen in der Kakaoschote umgibt. Der Kakaobaum (Theobroma cacao L.) ist die Pflanze, aus der die Kakaobohnen gewonnen werden, und das Fruchtfleisch ist der fleischige Teil der Frucht, der die Kakaobohnen umhüllt. Es hat einen saftigen und leicht säuerlichen Geschmack, der an tropische Früchte wie Mango, Ananas oder Zitrusfrüchte erinnert. Die Kakaopulpe wird geerntet, wenn die Kakaoschoten reif sind. Nach dem Öffnen der Schoten werden die Bohnen und das Fruchtfleisch normalerweise zusammen entnommen. Die Bohnen werden später fermentiert und getrocknet und anschließend für verschiedene Zwecke wie die Herstellung von Schokolade, Kakaopulver und Kakaobutter verwendet.Cocoa pulp is the sweet and sour edible pulp that surrounds the cocoa beans inside the cocoa pod. The cocoa tree (Theobroma cacao L.) is the plant from which cocoa beans are obtained, and the pulp is the fleshy part of the fruit that encases the cocoa beans. It has a juicy and slightly sour taste reminiscent of tropical fruits such as mango, pineapple or citrus fruits. Cocoa pulp is harvested when the cocoa pods are ripe. After the pods are opened, the beans and pulp are usually removed together. The beans are later fermented and dried and then used for various purposes such as making chocolate, cocoa powder and cocoa butter.
Der Begriff „Kakaopulpe“ im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet daher einen pflanzlichen Bestandteil der aus der Kakofrucht (Schote) gewonnen wird, und keine Kakobohnen enthält, bzw. von den Kakaobohnen abgetrennt wurde. Kakaopulpe wird aus einer Pflanze oder Pflanzen der Gattung Theobroma gewonnen. Die Pflanzengattung umfasst Theobroma angustifolium, Theobroma bicolor (mocambo), Theobroma cacao, Theobroma canumanense, Theobroma grandiflorum (cupuagu), Theobroma mammosum, Theobroma microcarpum, Theobroma obovatum, Theobroma simiarum, Theobroma speciosum, Theobroma stipulatum, Theobroma subincanum und Theobroma sylvestre. Vorzugsweise wird das Fruchtfleisch aus Kakao, Cupuaca und Mocambo und deren Mischungen ausgewählt, vorzugsweise aus Kakao. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Pulpe“ insbesondere auf die schleimartige Umhüllung der einzelnen Bohnen innerhalb der Frucht. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „Kakaopulpe“ auch getrocknete Kakaopulpe, zum Beispiel in Form eines Pulvers. Wird jedoch beispielsweise der Begriff „getrocknete Kakaopulpe“ verwendet, so ist die Kakaopulpe auf getrocknete Kakaopulpe beschränkt. Die Herkunft oder Quelle der Kakaopulpe ist vielfältig und soll im Rahmen der Erfindung als nicht eingeschränkt angesehen werden, und alle bekannten Sorten von Kakaoschoten können die Pulpe liefern. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat der Begriff „Extrakt“ die übliche Bedeutung für den Fachmann, d. h. ein Teil der Kakaopulpe, der einen oder mehrere Bestandteile der Kakaomasse umfasst, wobei ein oder mehrere Bestandteile der ursprünglichen Kakaopulpe entfernt wurden, um den Extrakt zu erhalten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird das in der Kakaopulpe enthaltene Wasser nicht als Extrakt betrachtet, d. h. der Kakaopulpenextrakt ist kein Wasser. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt der Kakaopulpenextrakt in Form eines Pulvers vor, d. h. der Kakaopulpenextrakt wurde getrocknet, um Wasser zu entfernen.The term "cocoa pulp" in the context of the present invention therefore refers to a plant component that is obtained from the cocoa fruit (pod) and does not contain cocoa beans or has been separated from the cocoa beans. Cocoa pulp is obtained from a plant or plants of the genus Theobroma. The plant genus includes Theobroma angustifolium, Theobroma bicolor (mocambo), Theobroma cacao, Theobroma canumanense, Theobroma grandiflorum (cupuagu), Theobroma mammosum, Theobroma microcarpum, Theobroma obovatum, Theobroma simiarum, Theobroma speciosum, Theobroma stipulatum, Theobroma subincanum and Theobroma sylvestre. Preferably, the pulp is selected from cocoa, cupuaca and mocambo and mixtures thereof, preferably from cocoa. In the context of the present invention, the term "pulp" refers in particular to the mucilaginous coating of the individual beans within the fruit. In the context of the present invention, the term "cocoa pulp" also includes dried cocoa pulp, for example in the form of a powder. However, if, for example, the term "dried cocoa pulp" is used, the cocoa pulp is limited to dried cocoa pulp. The origin or source of the cocoa pulp is diverse and should be considered as non-limiting in the context of the invention, and all known varieties of cocoa pods can provide the pulp. In the context of the present invention, the term "extract" has the usual meaning for the person skilled in the art, i.e. a part of the cocoa pulp that comprises one or more components of the cocoa mass, wherein one or more components of the original cocoa pulp have been removed in order to obtain the extract. In the context of the present invention, the water contained in the cocoa pulp is not considered to be an extract, i.e. the cocoa pulp extract is not water. In one embodiment of the present invention, the cocoa pulp extract is in the form of a powder, ie the cocoa pulp extract has been dried to remove water.
Als „Ausgangsprodukt“ der Verfahren und Verwendungen der vorliegenden Erfindungen sollen solche Zusammensetzungen angesehen werden, die Kakopulpe enthalten oder aus dieser bestehen. Als Ausgangsprodukte kommen insbesondere Nebenströme aus den Verarbeitungsabläufen der Kakaofrucht in Betracht. Ein Ausgangsprodukt im Sinne der Erfindung soll insbesondere keine Kakaobohnen oder deren abgeleitete Produkte enthalten.The "starting product" of the processes and uses of the present inventions should be considered to be those compositions that contain or consist of cocoa pulp. Starting products that can be considered are, in particular, side streams from the processing of the cocoa fruit. A starting product within the meaning of the invention should in particular not contain cocoa beans or their derived products.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Kakaofruchtbestandteilen um Kakaopulpe als Ausgangsprodukt, wobei ein solches Ausgangsprodukt vorzugsweise nicht aus Kakaobohnen besteht und keine von Kakaobohnen abgeleiteten Produkte enthält. Ein solches Ausgangsprodukt gemäß der Erfindung liegt vorzugsweise in einer Reinheit von über 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, besonders bevorzugt 95%, des Gesamtkakaofruchtanteils vor. „Reinheit“ in diesem Zusammenhang soll eine Reinheit im Sinne einer Abwesenheit von Kakobohnen bezeichnen. Die Erfindung betrifft also insbesondere Verfahren, in denen keine Fermentation von Kakaobohnen durchgeführt wird, sondern eine Fermentation von Nebenströmen einer Kakaobohnenverarbeitung.In the context of the present invention, the cocoa fruit components are cocoa pulp as a starting product, whereby such a starting product preferably does not consist of cocoa beans and does not contain any products derived from cocoa beans. Such a starting product according to the invention is preferably present in a purity of over 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, particularly preferably 95%, of the total cocoa fruit content. "Purity" in this context is intended to refer to a purity in the sense of an absence of cocoa beans. The invention therefore relates in particular to processes in which no fermentation of cocoa beans is carried out, but rather a fermentation of side streams from cocoa bean processing.
Ein pilzlicher Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Offenbarung ist vorzugsweise ein Pilz der Abteilung der Basidiomycota. Ein solcher Organismus wird vorzugsweise ausgewählt aus einer der hier getesteten Organismen wie beispielsweise ein Pilz aus Tabelle 1, insbesondere aus Agrocybe aegerita, Agaricus arvensis, Antrodia xantha, Coprinus comatus, Flammulina velutipes, Fomitopsis pinicola, Grifola frondosa, Hericium erinaceus, Hericium coralloides, Hypsizygus tessulatus, Irpex consors, Kuehneromyces mutabilis, Laetiporus montanus, Laetiporus persicinus, Laetiporus portentosus, Laetiporus sulphureus, Lentinula edodes, Lepista nuda, Macrolepiota procera, Meripilus giganteus, Mycetinis scorodonius, Pholiota nameko, Piptoporus betulinus, Pleurotus citrinopileatus, Pleurotus eryngii, Pleurotus floridanus, Pleurotus ostreatus, Pleurotus salmoneo-stramineus, Pleurotus sapidus, Psathyrella piluliformis, Psathyrella candolleana, Pycnoporus coccineus, Sparassis crispa, Stropharia rugosoannulata, Suillus variegatus, und Wolfiporia cocos. Besonders bevorzugt ist ein pilzlicher Mikroorganismus der Spezies Laetiporus montanus, Laetiporus persicinus, Laetiporus portentosus und Laetiporus sulphureus.A fungal microorganism according to the present disclosure is preferably a fungus of the division Basidiomycota. Such an organism is preferably selected from one of the organisms tested here, such as a fungus from Table 1, in particular from Agrocybe aegerita, Agaricus arvensis, Antrodia xantha, Coprinus comatus, Flammulina velutipes, Fomitopsis pinicola, Grifola frondosa, Hericium erinaceus, Hericium coralloides, Hypsizygus tessulatus, Irpex consors, Kuehneromyces mutabilis, Laetiporus montanus, Laetiporus persicinus, Laetiporus portentosus, Laetiporus sulphureus, Lentinula edodes, Lepista nuda, Macrolepiota procera, Meripilus giganteus, Mycetinis scorodonius, Pholiota nameko, Piptoporus betulinus, Pleurotus citrinopileatus, Pleurotus eryngii, Pleurotus floridanus, Pleurotus ostreatus, Pleurotus salmoneo-stramineus, Pleurotus sapidus, Psathyrella piluliformis, Psathyrella candolleana, Pycnoporus coccineus, Sparassis crispa, Stropharia rugosoannulata, Suillus variegatus, and Wolfiporia cocos. A fungal microorganism of the species Laetiporus montanus, Laetiporus persicinus, Laetiporus portentosus and Laetiporus sulphureus is particularly preferred.
Der hier verwendete Begriff „Fermentation“ bezieht sich im Allgemeinen auf alle Aktivitäten oder Prozesse, die eine enzymatische Zersetzung (Verdauung) von organischem Material durch Mikroorganismen beinhalten. Der Begriff „Fermentation“ umfasst sowohl anaerobe als auch aerobe Prozesse sowie Prozesse, die eine Kombination oder Abfolge von einer oder mehreren anaeroben und/oder aeroben Stufen beinhalten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst die Fermentation vorzugsweise die Zersetzung (Verdauung) von Pflanzenmaterial, und besonders vorzugsweise von einem hier definierten Ausgangsprodukt. Eine „konventionelle“ Fermentation bezieht sich auf typische oder übliche Verfahren zur Fermentierung von Kakaofruchtbestandteilen, die keine Kakaobohnen sind und keine Kakaobohnen enthalten, z. B. Nebenströme der Kakaobohnenverarbeitung. Der Begriff „Fermentation“ umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, die Verwendung einer der hier offenbarten Pilzarten als präpariertes Pilz-Inokulum, um einen Fermentationsprozess (des Ausgangsproduktes) mit diesem Organismus einzuleiten und/oder eine bestimmte Phase des Fermentationsprozesses mit diesem Organismus einzuleiten. In einigen Fällen findet eine ergänzende Fermentation vor, während oder nach einer herkömmlichen Fermentation statt. In einigen Ausführungsformen findet die zusätzliche Fermentation nach einem herkömmlichen Fermentationsschritt statt. In manchen Fällen findet die zusätzliche Fermentation vor, nach oder während eines Trocknungsschritts statt. In anderen Ausführungsformen findet die ergänzende Fermentation im Anschluss an einen herkömmlichen Fermentationsschritt und vor einem Trocknungsschritt statt.The term "fermentation" as used herein generally refers to any activity or process that involves enzymatic decomposition (digestion) of organic material by microorganisms. The term "fermentation" includes both anaerobic and aerobic processes as well as processes that involve a combination or sequence of one or more anaerobic and/or aerobic stages. In the context of the present invention, fermentation preferably comprises the decomposition (digestion) of plant material, and particularly preferably of a starting product defined herein. A "conventional" fermentation refers to typical or usual processes for fermenting cocoa fruit components that are not cocoa beans and do not contain cocoa beans, e.g. side streams of cocoa bean processing. The term "fermentation" includes, but is not limited to, the use of one of the fungal species disclosed herein as a prepared fungal inoculum to conduct a fermentation process. (of the starting product) with that organism and/or to initiate a certain phase of the fermentation process with that organism. In some cases, a supplemental fermentation takes place before, during or after a conventional fermentation. In some embodiments, the additional fermentation takes place after a conventional fermentation step. In some cases, the additional fermentation takes place before, after or during a drying step. In other embodiments, the supplemental fermentation takes place following a conventional fermentation step and before a drying step.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen auch den Schritt der Bereitstellung eines Pilz-Inokulums. Das Pilz-Inokulum zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung kann ein Pilz aus der Abteilung der Basidiomycota (Ständerpilze) sein und vorzugsweise ein Organismus ausgewählt aus Tabelle 1, weiter vorzugsweise Laetiporus montanus, Laetiporus persicinus, Laetiporus portentosus oder Laetiporus sulphureus.The methods of the invention also comprise the step of providing a fungal inoculum. The fungal inoculum for use with the present invention may be a fungus from the division Basidiomycota (basidiomycota) and preferably an organism selected from Table 1, more preferably Laetiporus montanus, Laetiporus persicinus, Laetiporus portentosus or Laetiporus sulphureus.
Eine Fermentation gemäß der Erfindung wird vorzugsweise durch das In-Kontaktbringen eines Mycels des pilzlichen Mikroorganismus mit dem Ausgangsprodukt unter geeigneten Kulturbedingungen durchgeführt. Vor der Fermentation kann das Ausgangsprodukt einem oder mehreren vorbereitenden Schritten unterzogen werden, wie beispielsweise der Versetzung mit Wasser, um das Ausgangsprodukt für die Fermentation vorzubereiten. Weiter kann ein Pilz-Inokulum vorbereitet werden, welches dann dem Ausgangsprodukt für die eigentliche Fermentation zugeführt wird.A fermentation according to the invention is preferably carried out by bringing a mycelium of the fungal microorganism into contact with the starting product under suitable culture conditions. Before fermentation, the starting product can be subjected to one or more preparatory steps, such as addition of water, in order to prepare the starting product for fermentation. Furthermore, a fungal inoculum can be prepared, which is then added to the starting product for the actual fermentation.
In einigen Ausführungsformen kann eine Fermentation auch durch eine enzymatische Behandlung mittels eines Zellfreien Enzymextraktes aus einem der hier genannten pilzlichen Mikroorganismen ersetzt werden. Insbesondere kann ein Enzym oder ein Enzymgemisch als Fermentationsersatz verwendet werden, wobei das Enzym oder Enzymgemisch von einem der vorstehend genannten Mikroorganismen exprimiert wird, oder daraus extrahiert wurde.In some embodiments, fermentation can also be replaced by an enzymatic treatment using a cell-free enzyme extract from one of the fungal microorganisms mentioned here. In particular, an enzyme or an enzyme mixture can be used as a fermentation substitute, wherein the enzyme or enzyme mixture is expressed by one of the microorganisms mentioned above or has been extracted from it.
Als weitere vorbereitende Maßnahme kann das Verfahren der Erfindung eine Abtrennung der Kakaobohnen von den restlichen Kakaofruchtbestandteilen vorsehen, um ein geeignetes Ausgansprodukt für die Fermentation der Erfindung zu erhalten. Weiterhin können in einigen Ausführungsformen die Kakaofruchtbestandteile, die keine Kakaobohnen sind und/oder keine Kakaobohnen enthalten, als Ausgangsprodukt vorbehandelt werden, vorzugsweise pasteurisiert werden.As a further preparatory measure, the method of the invention may provide for a separation of the cocoa beans from the remaining cocoa fruit components in order to obtain a suitable starting product for the fermentation of the invention. Furthermore, in some embodiments, the cocoa fruit components that are not cocoa beans and/or do not contain cocoa beans can be pretreated as a starting product, preferably pasteurized.
Eine Fermentation gemäß der Erfindung kann je nach pilzlichem Mikroorganismus und gewünschter Veränderung der Geruchs- und Geschmackseigenschaften kürzer oder länger durchgeführt werden. Eine variable Fermentationsdauer führt zu einer variablen Veränderung der Geruchs- und Geschmackseigenschaften des Ausgangsprodukts. Vorzugsweise soll die Fermentation unter geeigneten Bedingungen aber für 6 h bis 240 h Stunden durchgeführt werden, vorzugsweise für 30 min bis 120 h, und weiter bevorzugt für 30 min bis 96 h, noch weiter bevorzugt für 30 min bis 76 h, zum Beispiel für 40 h bis 60 h, oder ca. 48 h (+/- 5 h).A fermentation according to the invention can be carried out for a shorter or longer period depending on the fungal microorganism and the desired change in the odor and taste properties. A variable fermentation period leads to a variable change in the odor and taste properties of the starting product. Preferably, however, the fermentation should be carried out under suitable conditions for 6 hours to 240 hours, preferably for 30 minutes to 120 hours, and more preferably for 30 minutes to 96 hours, even more preferably for 30 minutes to 76 hours, for example for 40 hours to 60 hours, or about 48 hours (+/- 5 hours).
Weiterhin soll eine Fermentation der Erfindung bei 10 °C bis 40 °C durchgeführt werden, vorzugsweise bei 14 - 30 °C, 18 - 28 °C und besonders bevorzugt bei 20 - 26 °C.Furthermore, a fermentation of the invention should be carried out at 10 °C to 40 °C, preferably at 14 - 30 °C, 18 - 28 °C and particularly preferably at 20 - 26 °C.
Eine Fermentation der Erfindung kann weiter in besonderen Ausführungen unter Zufuhr von Luft oder Luft-Gasgemischen durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Fermentation unter Rühren des Fermentationsmediums und unter Luftzufuhr stattfinden, in anderen Worten es findet eine aktive Begasung mit einer oder mehreren sauerstoffhaltigen Gasmischungen statt. Auch kann bereits als vorbereitende Maßnahme eine Einstellung eines ausreichenden Sauerstoffgehalts im Fermentationsmedium vorgenommen werden.A fermentation according to the invention can also be carried out in special embodiments with the supply of air or air-gas mixtures. For example, the fermentation can take place with stirring of the fermentation medium and with the supply of air, in other words there is active gassing with one or more oxygen-containing gas mixtures. A sufficient oxygen content can also be set in the fermentation medium as a preparatory measure.
Eine Fermentation gemäß der Erfindung kann bevorzugt als Emerskultur oder Submerskultur durchgeführt werden. Als Emerskultur wird eine Kultivierung oder Fermentation bezeichnet, bei der die Kultivierung auf einem Festbettmedium mit einem Wassergehalt von beispielsweise ca. 60% stattfindet. Im Gegenteil hierzu handelt es sich bei einer Submerskultur um eine Kultivierung, die vollständig unter Wasser durchgeführt wird.A fermentation according to the invention can preferably be carried out as an emersed culture or submerged culture. Emersed culture refers to a cultivation or fermentation in which the cultivation takes place on a fixed bed medium with a water content of, for example, approximately 60%. In contrast, a submerged culture is a cultivation that is carried out completely under water.
Zur Beendigung des Fermentationsschrittes kann der Fachmann bekannte Verfahren zum Inaktivieren der Mikroorganismen anwenden, wie beispielsweise Pasteurisierung, Sterilisation, Einkochen, Ultrahocherhitzung oder Tyndallisation.To terminate the fermentation step, the person skilled in the art can use known methods for inactivating the microorganisms, such as pasteurization, sterilization, boiling, ultra-high temperature treatment or tyndallization.
In einer besonderen Ausführungsform wird das fermentierte Produkt aus dem Kulturüberstand gewonnen oder ist der Kulturüberstand. Die Gewinnung kann weiterhin verschiedene Schritte der Aufreinigung wie beispielsweise Filterungen oder Zentrifugationen umfassen. Derartige Schritte sind dem Fachmann bestens bekannt.In a particular embodiment, the fermented product is obtained from the culture supernatant or is the culture supernatant. The extraction can further comprise various purification steps such as filtering or centrifugation. Such steps are well known to the person skilled in the art.
Veränderte Geruchs- und Geschmackseigenschaften in Kontext der vorliegenden Erfindung sind insbesondere eine Veränderung Geruchs- und Geschmackseigenschaften in Richtung einer oder mehrerer (bevorzugt aller) Geruchs- und Geschmackseindrücke ausgesucht aus süß, sauer, Maracuja, Pfirsich, tropisch, Mango, Kokos, Aprikose, und Citrus. Insbesondere in die Richtungen Pfirsich tropisch und Mango.Altered odor and taste properties in the context of the present invention are in particular a change in odor and taste properties in the direction of one or more (preferably all) odor and taste impressions selected from sweet, sour, passion fruit, peach, tropical, mango, coconut, apricot, and citrus. In particular in the directions of peach tropical and mango.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein fermentiertes Kakaofruchtprodukt hergestellt nach oder herstellbar nach einem Verfahren des ersten Aspekts.In a second aspect, the invention relates to a fermented cocoa fruit product produced by or producible by a process of the first aspect.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Auswahl eines pilzlichen Mikroorganismus, der geeignet ist zur Herstellung von Nahrungsmitteln oder Nahrungsmittelbestandteilen aus Kakaopulpe, das Verfahren umfassend die Schritte:
- (a) Bereitstellen eines pilzlichen Kandidatenorganismus;
- (b) In-Kontaktbringen des pilzlichen Kandidatenorganismus mit Kakaopulpe als Ausgangsprodukt zur Herstellung eines fermentierten Produkts;
- (c) Durchführen einer sensorischen Überprüfung der Geruchs- und Geschmackseigenschaften des fermentierten Produkts im Vergleich zum Ausgangsprodukts, und/oder im Vergleich zu einem fermentierten Kontrollprodukt;
- (a) providing a candidate fungal organism;
- (b) bringing the candidate fungal organism into contact with cocoa pulp as starting material for the production of a fermented product;
- (c) carrying out a sensory assessment of the odour and flavour characteristics of the fermented product in comparison to the starting product and/or in comparison to a fermented control product;
In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung eines fermentierten Kakaofruchtprodukts nach einem der vorstehenden Aspekte als Getränk oder bei der Herstellung eines Getränks.In a fourth aspect, the invention relates to a use of a fermented cocoa fruit product according to any of the preceding aspects as a beverage or in the production of a beverage.
In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Getränks, wobei das Verfahren die Verwendung eines fermentierten Kakaofruchtprodukts der Erfindung umfasst, oder wobei das Verfahren die Verfahrensschritte gemäß einem der vorstehenden Aspekte umfasst.In a fifth aspect, the invention relates to a process for producing a beverage, the process comprising the use of a fermented cocoa fruit product of the invention, or the process comprising the process steps according to any of the preceding aspects.
Ein solches Verfahren zur Herstellung eines Getränks umfasst vorzugsweise die Verfahrensschritte gemäß einem der vorstehenden Aspekte, wobei der Geruch und der Geschmack des Getränks durch Auswahl eines pilzlichen Mikroorganismus und/oder der Fermentationszeit eingestellt wird.Such a method for producing a beverage preferably comprises the process steps according to one of the preceding aspects, wherein the smell and taste of the beverage are adjusted by selecting a fungal microorganism and/or the fermentation time.
Das Herstellungsverfahren gemäß der Erfindung kann in weiteren Ausführungsformen umfassen, dass das fermentierte Produkt mit mindestens einem weiteren Getränkebestandteil oder Getränkezusatz vermischt wird, zum Beispiel einem Fruchtsaft, Fruchtsaftextrakt, Wasser, Ethanol, Geschmacksverstärker, Geschmacksstoffe, Farbstoffe, Zucker oder Zuckerersatzstoffe (Süßungsmittel).The production process according to the invention may, in further embodiments, comprise mixing the fermented product with at least one further beverage ingredient or beverage additive, for example a fruit juice, fruit juice extract, water, ethanol, flavour enhancers, flavourings, colourings, sugar or sugar substitutes (sweeteners).
Weiterhin kann eine Getränkeherstellung gemäß der Erfindung einen Schritt des Karbonisierens des Getränks (versetzen mit Kohlensäure) umfassen. Weitere Möglichkeiten betreffen ein Vermischen mit Wasser, Ethanol, Kohlendioxid, Zucker, Lebensmittelzusatzstoffen oder Aroma.Furthermore, beverage production according to the invention can include a step of carbonating the beverage (adding carbon dioxide). Other possibilities include mixing with water, ethanol, carbon dioxide, sugar, food additives or flavoring.
In einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung ein Getränk, welches ein fermentiertes Produkt gemäß der Erfindung umfasst.In a sixth aspect, the invention relates to a beverage comprising a fermented product according to the invention.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch die Extraktion eines Geschmacks- oder Geruchsstoffes aus einem fermentierten Produkt der Erfindung. Verfahren zur Extraktion von Geschmacks- oder Geruchstoffen sind dem Fachmann bekannt und beispielhaft in der vorliegenden Offenbarung beschrieben.In a further aspect, the present invention also relates to the extraction of a flavor or odor substance from a fermented product of the invention. Methods for extracting flavor or odor substances are known to the person skilled in the art and are described by way of example in the present disclosure.
Die Erfindung kann auch alternativ in Anbetracht der obigen Beschreibung gemäß der folgenden nummerierten Ausführungsformen verstanden werden:
- Ausführung 1: Ein Getränk, umfassend ein Fermentat, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dieses aus mindestens einem Nebenstrom der Kakaobohnenproduktion gewonnen ist, vornehmlich der Kakaopulpe, wobei diese nach Öffnen der Früchte abgetrennt und pasteurisiert wurde oder anderweitig vorbehandelt sein kann.
- Ausführung 2: Verfahren zur Herstellung eines Getränks gemäß Ausführung 1, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst:
- (a) Bereitstellung des Nebenstroms als Bestandteil des Fermentationsmediums, wobei das Fermentationsmedium eine Suspension aus Kakaopulpe in Wasser ist;
- (b) Inokulation des gemäß Schritt a. bereitgestellten Fermentationsmediums mit Myzel mindestens eines Pilzes der Abteilung Basidiomycota;
- (c) Fermentation des gemäß Schritt b. inokulierten Fermentationsmediums über einen festgelegten Zeitraum;
- (d) Gewinnung des Getränks durch Abtrennung der wässrigen von der Festphase des fermentierten Mediums (beispielsweise durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren).
- Ausführung 3: Verfahren gemäß Ausführung 2, dadurch gekennzeichnet, dass es einen der folgenden Schritte umfassen kann: Vermischen des gewonnenen Getränks mit weiteren Bestandteilen, beispielsweise Wasser, Ethanol, Kohlendioxid, Zucker, Lebensmittelzusatzstoffe oder Aroma.
- Ausführung 4: Verfahren gemäß Ausführung 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentationsbedingungen unter folgenden Bedingungen ablaufen:
- - Temperatur zwischen 18 und 30°C
- - Fermentationsdauer zwischen 6 und 168 h
- Ausführung 5: Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ausführungen 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei mindestens einem Pilz der Abteilung Basidiomycota um einen Pilz der folgenden Liste handelt: Laetiporus montanus, Laetiporus persicinus, Laetiporus portentosus und Laetiporus sulphureus.
- Version 1: A beverage comprising a fermentate, which is characterized in that it is obtained from at least one side stream of cocoa bean production, primarily the cocoa pulp, which has been separated and pasteurized after opening the fruits or may have been otherwise pretreated.
- Version 2: Process for producing a beverage according to version 1, characterized in that it comprises the following steps:
- (a) providing the side stream as a component of the fermentation medium, wherein the fermentation medium is a suspension of cocoa pulp in water;
- (b) inoculating the fermentation medium provided according to step a. with mycelium of at least one fungus of the division Basidiomycota;
- (c) fermenting the fermentation medium inoculated according to step b. for a specified period of time;
- (d) Obtaining the beverage by separating the aqueous phase from the solid phase of the fermented medium (for example by decanting, filtration or centrifugation).
- Embodiment 3: Process according to embodiment 2, characterized in that it may comprise one of the following steps: mixing the obtained beverage with further components, for example water, ethanol, carbon dioxide, sugar, food additives or flavouring.
- Version 4: Process according to version 2 or 3, characterized in that the fermentation conditions take place under the following conditions:
- - Temperature between 18 and 30°C
- - Fermentation time between 6 and 168 hours
- Embodiment 5: Method according to one of the preceding embodiments 1 - 4, characterized in that at least one fungus of the division Basidiomycota is a fungus from the following list: Laetiporus montanus, Laetiporus persicinus, Laetiporus portentosus and Laetiporus sulphureus.
Die hier verwendeten Ausdrücke „der [vorliegenden] Erfindung“, „gemäß der Erfindung“, „nach der Erfindung“ und dergleichen Ausdrücke beziehen sich auf alle Aspekte und Ausführungsformen der hier beschriebenen und/oder beanspruchten Erfindung.As used herein, the terms “the [present] invention,” “according to the invention,” “after the invention,” and like terms refer to all aspects and embodiments of the invention described and/or claimed herein.
Der Begriff „umfassend“ ist im Kontext dieser Offenbarung so zu verstehen, dass er sowohl „einschließlich“ als auch „bestehend aus“ umfasst, wobei beide Bedeutungen ausdrücklich beabsichtigt sind, und daher einzeln offengelegte Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung darstellen. Der Begriff „und/oder“ wie hier verwendet ist als spezifische Offenbarung jedes der beiden angegebenen Merkmale oder Komponenten mit oder ohne das andere zu verstehen. So ist z. B. „A und/oder B“ als spezifische Offenbarung von (i) A, (ii) B und (iii) A und B zu verstehen, so als ob jedes Merkmal hier einzeln aufgeführt wäre. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnen die Begriffe „ungefähr“, „um die“ und „annähernd“ ein Genauigkeitsintervall, das der Fachmann so versteht, dass in diesem Intervall die technische Wirkung des betreffenden Merkmals noch gewährleistet ist. Der Begriff bezeichnet typischerweise eine Abweichung von dem angegebenen Zahlenwert um ±20%, ±15%, ±10% und beispielsweise ±5%. Wie dem Fachmann bekannt ist, hängt die spezifische Abweichung eines numerischen Wertes für eine bestimmte technische Wirkung von der Art der technischen Wirkung ab. So kann beispielsweise ein natürlicher oder biologischer technischer Effekt im Allgemeinen eine größere Abweichung aufweisen als ein vom Menschen geschaffener oder technischer Effekt. Die spezifische Abweichung eines Zahlenwerts für einen bestimmten technischen Effekt hängt von der Art des technischen Effekts ab, wie der Laie erkennen kann. So kann beispielsweise eine natürliche oder biologische technische Wirkung im Allgemeinen eine größere Abweichung aufweisen als eine von Menschenhand geschaffene oder technische Wirkung.The term "comprising" in the context of this disclosure is to be understood as including both "including" and "consisting of", both meanings being expressly intended, and therefore representing individually disclosed embodiments according to the present invention. The term "and/or" as used herein is to be understood as a specific disclosure of each of the two specified features or components with or without the other. For example, "A and/or B" is to be understood as a specific disclosure of (i) A, (ii) B, and (iii) A and B, as if each feature were listed individually here. In the context of the present invention, the terms "approximately", "around" and "approximately" refer to an accuracy interval that the person skilled in the art understands to mean that in this interval the technical effect of the feature in question is still guaranteed. The term typically refers to a deviation from the specified numerical value by ±20%, ±15%, ±10% and, for example, ±5%. As will be known to the person skilled in the art, the specific deviation of a numerical value for a given technical effect depends on the nature of the technical effect. For example, a natural or biological technical effect may, in general, have a larger deviation than a man-made or technical effect. The specific deviation of a numerical value for a given technical effect depends on the nature of the technical effect, as will be known to the person skilled in the art. For example, a natural or biological technical effect may, in general, have a larger deviation than a man-made or technical effect.
Es versteht sich, dass die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein spezifisches Problem oder eine spezifische Umgebung und die Einbeziehung von Variationen der vorliegenden Erfindung oder zusätzlicher Merkmale (wie z. B. weitere Aspekte und Ausführungsformen) im Rahmen der Möglichkeiten einer Person liegen, die über gewöhnliche Fachkenntnisse auf dem Gebiet der Technik im Lichte der hier enthaltenen Lehren verfügt.It is to be understood that the application of the teachings of the present invention to a specific problem or environment and the incorporation of variations of the present invention or additional features (such as further aspects and embodiments) are within the scope of one having ordinary skill in the art in light of the teachings contained herein.
Sofern der Kontext nichts anderes vorschreibt, sind die Beschreibungen und Definitionen der oben dargelegten Merkmale nicht auf einen bestimmten Aspekt oder eine bestimmte Ausführungsform der Erfindung beschränkt und gelten gleichermaßen für alle Aspekte und Ausführungsformen, die beschrieben werden.Unless the context dictates otherwise, the descriptions and definitions of the features set out above are not limited to a particular aspect or embodiment of the invention. cation and apply equally to all aspects and embodiments described.
Sämtliche Referenzen und Patente oder Patentveröffentlichungen gelten als in dieser Offenbarung durch Verweis als vollständig mit einbezogen.All references and patents or patent publications are deemed to be fully incorporated by reference into this disclosure.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN UND TABELLENBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES AND TABLES
Die Abbildungen und Tabellen zeigen:
Tabelle 1: Übersicht über die in Emerskultur getesteten Pilze, deren Herkunft und Standard-Kultivierungsmedium. Alle Pilze zählen zur Abteilung Basidiomycota. Verwendete Abkürzungen und deren Bedeutung sind: CBS: Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, Utrecht, NL; DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, DE; GÖT: Institut für Molekulare Holzbiotechnologie & Technische Mykologie, Göttingen, DE; LCB: institutseigene Sammlung, Gießen, DE; InterMedDiscovery GmbH; M: Mycelia; MEA: Malzextrakt-Agar; Die für die submerse Herstellung des Getränks beispielhaft genutzten Pilze sind in Fettdruck markiert.Table 1: Overview of the fungi tested in emersed culture, their origin and standard cultivation medium. All fungi belong to the Basidiomycota division. Abbreviations used and their meanings are: CBS: Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, Utrecht, NL; DSMZ: German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, DE; GÖT: Institute for Molecular Wood Biotechnology & Technical Mycology, Göttingen, DE; LCB: institute's own collection, Gießen, DE; InterMedDiscovery GmbH; M: Mycelia; MEA: Malt Extract Agar; The fungi used as examples for the submerged production of the drink are marked in bold.
Tabelle 2: Zusammensetzungen der Emers- und Submerskulturmedien; (*): Kakaopulpe wurde getrennt von Agar autoklaviert; (**): Kakaopulpe wurde nicht autoklaviert und unter sterilen Bedingungen in autoklaviertes Wasser gegeben.Table 2: Compositions of emersed and submerged culture media; (*): Cocoa pulp was autoclaved separately from agar; (**): Cocoa pulp was not autoclaved and placed in autoclaved water under sterile conditions.
Tabelle 3: Konzentrationen an zugegebenem Standard zur Quantifizierung mittels Standardadditionsverfahren sowie zur Quantifizierung gewähltes Masse-zu-Ladungsverhältnis.Table 3: Concentrations of standard added for quantification using the standard addition method and mass-to-charge ratio chosen for quantification.
Tabelle 4: Screening von 36 Basidiomyceten auf Kakaopulpe-Agar gegenüber Malzextrakt-Agar als Referenz; Geruchseindrücke exemplarisch für jeweils einen Kulturtag angegeben.Table 4: Screening of 36 basidiomycetes on cocoa pulp agar versus malt extract agar as reference; odor impressions given as examples for one culture day each.
Tabelle 5: Olfaktorische Geruchseindrücke (o) und gustatorische Geschmackseindrücke (g) der Kultivierung der vier Schwefelporlinge auf KP-Medium an den Kulturtagen 1-5; E= Eindruck, U= Gesamturteil; I= Intensität; („- -“: sehr schlecht; „-“: schlecht, „0“: neutral, „+“: gut, „+ +“: sehr gut"); (n=2).Table 5: Olfactory impressions (o) and gustatory taste impressions (g) of the cultivation of the four sulphur polypore fungi on KP medium on culture days 1-5; E= impression, U= overall assessment; I= intensity; ("- -": very bad; "-": bad, "0": neutral, "+": good, "+ +": very good"); (n=2).
Tabelle 6: Vergleich der RI mit Standard-RI (RINIST & RISTD) auf polarer VF-Wax-Säule und unpolarer DB5-Säule der mittels dISBSE-GC-MS/MS(O) identifizierten und vorläufig identifizierten Aromastoffe im Kakaopulpe-Medium (vorläufig identifiziert, wenn keine Identifizierung auf unpolarer Säule möglich).Table 6: Comparison of RI with standard RI (RI NIST & RI STD ) on polar VF-Wax column and non-polar DB5 column of the aroma compounds identified and provisionally identified by dISBSE-GC-MS/MS(O) in cocoa pulp medium (provisionally identified if no identification on non-polar column possible).
Tabelle 7: Vergleich der RI mit Standard-RI (RINIST & RISTD) auf polarer VF-Wax-Säule und unpolarer DB5-Säule der mittels dISBSE-GC-MS/MS(O) identifizierten und vorläufig identifizierten Aromastoffe im fermentierten Getränk aus Kakaopulpe-Medium und 48-stündiger Fermentation durch L. persicinus (vorläufig identifiziert, wenn keine Identifizierung auf unpolarer Säule möglich).Table 7: Comparison of RI with standard RI (RI NIST & RI STD ) on polar VF-Wax column and non-polar DB5 column of the aroma compounds identified and provisionally identified by dISBSE-GC-MS/MS(O) in the fermented beverage from cocoa pulp medium and 48 h fermentation by L. persicinus (provisionally identified if no identification on non-polar column possible).
Tabelle 8: GC-Parameter zur Einstellung der benötigten Splitratios (SR) und damit der Flavour-Dilution-Faktoren (FD) für die ADA an der TDU-GC-MS/MS-O; variabel sind dabei der purge flow to split vent und der vent flow.Table 8: GC parameters for setting the required split ratios (SR) and thus the flavour dilution factors (FD) for the ADA on the TDU-GC-MS/MS-O; the purge flow to split vent and the vent flow are variable.
BEISPIELEEXAMPLES
Bestimmte Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung werden nun anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die hierin enthaltenen Beschreibungen, Abbildungen und Tabellen erläutert. Solche Beispiele für die Verfahren, Verwendungen und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind nur repräsentativ und sollten nicht so verstanden werden, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung nur auf solche repräsentativen Beispiele beschränkt ist.Certain aspects and embodiments of the invention will now be explained by way of example and with reference to the descriptions, figures and tables contained herein. Such examples of the methods, uses and other aspects of the present invention are only representative ative and should not be construed as limiting the scope of the present invention to such representative examples only.
Die Beispiele zeigen:The examples show:
1. Materialien1. Materials
Die für die Untersuchungen verwendete Kakaopulpe wurden in frischer, pasteurisierter Form verwendet. Die Lagerung erfolgte bei -20°C, zur Nutzung wurden jeweils Aliquote (Teilportionen) bei Raumtemperatur aufgetaut.The cocoa pulp used for the investigations was fresh and pasteurized. It was stored at -20°C and aliquots (partial portions) were thawed at room temperature before use.
Insgesamt wurden von den Erfindern beispielhaft 36 Pilze auf ihre Eignung zur Fermentation der Kakaopulpe getestet. Als Kakaopulpe wird hier das frische Fruchtfleisch verstanden, was unmittelbar nach Öffnen der Kakaofrüchte durch verschiedene Methoden (z.B. mittels Depulper, bestehend aus horizontal angeordneten rotierenden Trommeln) entfernt und pasteurisiert wurde. Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die untersuchten Pilze unter Angabe der Bezugsquelle und des Standard-Kulturmediums. Alle verwendeten Pilze zählen zur Abteilung der Basidiomycota. Tabelle 1: Übersicht über die in Emerskultur getesteten Pilze, deren Herkunft und Standard-Kultivierungsmedium. Alle Pilze zählen zur Abteilung Basidiomycota. Verwendete Abkürzungen und deren Bedeutung sind: CBS: Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, Utrecht, NL; DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, DE; GÖT: Institut für Molekulare Holzbiotechnologie & Technische Mykologie, Göttingen, DE; LCB: institutseigene Sammlung, Gießen, DE; IMD: InterMedDiscovery GmbH; M: Mycelia; MEA: Malzextrakt-Agar; die für die Herstellung des Getränks in Submerskultur beispielhaft genutzten Pilze sind in Fettdruck markiert
Die für die Fermentation der Kakaopulpe beispielhaft verwendeten Basidiomyceten (Tabelle 1) zeigen, dass Pilze aus der Abteilung Basidiomycota verwendet werden können, um das fermentierte Getränk herzustellen, und zwar in Abhängigkeit von der jeweils verwendeten Spezies mit individuellem Aroma.The basidiomycetes used as examples for the fermentation of cocoa pulp (Table 1) show that fungi from the division Basidiomycota can be used to produce the fermented beverage, with individual flavor depending on the species used.
2. Stammhaltung2nd trunk holding
Die beispielhaft untersuchten Pilze (Tabelle 1) werden zur Stammhaltung auf Malzextrakt-Agarmedium (MEA) kultiviert. Die Zusammensetzungen der Medien sind in Tabelle 2 aufgeführt; alle Medien werden mit Trinkwasser angesetzt und für 20 min bei 121 °C sterilisiert (Tuttnauer, Breda, Niederlande). Tabelle 2: Zusammensetzungen der Emers- und Submerskulturmedien; (*): Kakaopulpe wurde getrennt von Agar autoklaviert; (**): Kakaopulpe wurde nicht autoklaviert und unter sterilen Bedingungen in autoklaviertes Wasser gegeben.
Zur Kultivierung wird jeweils ein ca. 1,0 cm2 großes Myzelstück des Pilzes einer zu etwa 80% bewachsenen Malzextrakt-Agarplatte auf eine neue Malzextrakt-Agarplatte gesetzt, die Platte mit Parafilm® verschlossen und bei 24 °C im Dunkeln inkubiert.For cultivation, a piece of mycelium of approximately 1.0 cm 2 from a malt extract agar plate that is approximately 80% covered with growth is placed on a new malt extract agar plate, the plate is sealed with Parafilm® and incubated at 24 °C in the dark.
3. Screening auf Kakaopulpe:3. Screening for cocoa pulp:
Die Kultivierung der Pilze auf der Kakaopulpe erfolgt beispielhaft zunächst in Emerskultur. Hierbei dient die Kakaopulpe als alleinige Nährstoffquelle (s. Tabelle 2). Die Screeningplatten werden mit den 36 ausgewählten Pilzen (Tabelle 1) analog zur Stammhaltung inokuliert und bei 24 °C im Dunkeln inkubiert.The cultivation of the fungi on the cocoa pulp is initially carried out in emersed culture, for example. The cocoa pulp serves as the sole source of nutrients (see Table 2). The screening plates are inoculated with the 36 selected fungi (Table 1) in the same way as the stock culture and incubated at 24 °C in the dark.
4. Sensorische Analyse4. Sensory analysis
Für die Auswahl geeigneter Pilz-Substrat-Kombinationen wird der Geruch der Pilze auf den Substratmedien herangezogen. Die Oberflächenkulturen werden je nach Wachstum des Pilzes sensorisch von geschultem Personal (n=2) mit einer beschreibenden Prüfung bewertet. Die Bewertung des Gesamteindruckes erfolgt auf einer Skala von 0 (sehr negativ, „- -“) bis 5 (sehr positiv, „++“). Als Vergleich wird der Geruch der nicht inokulierten Agarplatte herangezogen. Fachkundigen Personen ist bekannt, wie derartige sensorische Analysen und Bewertungen im Einzelnen durchzuführen sind, sodass eine genauere Beschreibung an dieser Stelle nicht erforderlich ist.The smell of the fungi on the substrate media is used to select suitable mushroom-substrate combinations. The surface cultures are assessed sensorially by trained personnel (n=2) using a descriptive test, depending on the growth of the fungus. The evaluation of the overall impression The odor is assessed on a scale from 0 (very negative, "- -") to 5 (very positive, "++"). The odor of the non-inoculated agar plate is used for comparison. Experts know how to carry out such sensory analyses and assessments in detail, so a more detailed description is not necessary at this point.
5. Kultivierung und Optimierung zur Getränke-Herstellung5. Cultivation and optimization for beverage production
Die Kultivierung ausgewählter Pilze (in Tabelle 1 fett markiert) in Submerskultur zur Herstellung des Getränks findet unter Food Grade-Bedingungen statt; alle Lösungen werden mit Trinkwasser hergestellt. Zunächst werden Vorkulturen mit 2% ME-Medium (Tabelle 2) angesetzt. Dazu wird ein Stück der mit Pilzmyzel bewachsenen Agarplatte entnommen und mit einem Dispergiergerät (10.000 U/min, 30 s, IKA, Staufen, DE) im Vorkulturmedium homogenisiert. Die Kulturen werden anschließend bei 150 U/min, 24 °C und Lichtausschluss kultiviert. Nach spezifischer Vorkulturdauer je Pilz (z.B. 8 Tage für Laetiporus persicinus, Laetiporus sulfureus, Laetiporus portentosus und Laetiporus montanus) wird die bewachsene Vorkultur homogenisiert (10.000 U/min, 30 s). Um das Malzextraktmedium aus der Vorkultur gänzlich zu entfernen, wird die Vorkultur drei Mal mit derselben Menge an autoklaviertem Trinkwasser gewaschen (zentrifugieren (4311 g, 10 min, RT), abdekantieren, Wasserzugabe). Das Hauptkulturmedium (Tabelle 2) wird anschließend mit 10% homogenisierter und gewaschener Vorkultur angeimpft. Die Kultivierung der Hauptkultur erfolgt ebenfalls bei 150 U/min, 24 °C und Lichtausschluss. Nach Abschluss der Kultivierung wird die gesamte Kultur zentrifugiert (4311 g, 10 min, RT), der Überstand abdekantiert und das Myzel verworfen. Die Überstände werden zur sensorischen Beurteilung (vgl. Abschnitt 6) und Analytik (vgl. Abschnitt 7) verwendet.The cultivation of selected fungi (marked in bold in Table 1) in submerged culture to produce the drink takes place under food grade conditions; all solutions are prepared with drinking water. First, pre-cultures are prepared with 2% ME medium (Table 2). For this purpose, a piece of the agar plate covered with fungal mycelium is taken and homogenized in the pre-culture medium using a disperser (10,000 rpm, 30 s, IKA, Staufen, DE). The cultures are then cultivated at 150 rpm, 24 °C and exclusion of light. After a specific pre-culture period for each fungus (e.g. 8 days for Laetiporus persicinus, Laetiporus sulfureus, Laetiporus portentosus and Laetiporus montanus), the covered pre-culture is homogenized (10,000 rpm, 30 s). In order to completely remove the malt extract medium from the pre-culture, the pre-culture is washed three times with the same amount of autoclaved drinking water (centrifugation (4311 g, 10 min, RT), decantation, addition of water). The main culture medium (Table 2) is then inoculated with 10% homogenized and washed pre-culture. The main culture is also cultivated at 150 rpm, 24 °C and exclusion of light. After cultivation is complete, the entire culture is centrifuged (4311 g, 10 min, RT), the supernatant is decanted and the mycelium is discarded. The supernatants are used for sensory assessment (see section 6) and analysis (see section 7).
Aus diesem Screening geht hervor, dass die vier Laetiporus Spezies L. persicinus (LPER), L. sulfureus (LSU), L. portentosus (LPO) und L. montanus (LMO) die interessantesten Aromaveränderungen zeigen und zwar innerhalb der ersten vier Kultivierungstage. Daher werden diese vier Kulturen im Anschluss täglich sowie in 12-stündigen Abständen geruchlich als auch geschmacklich beurteilt.This screening shows that the four Laetiporus species L. persicinus (LPER), L. sulfureus (LSU), L. portentosus (LPO) and L. montanus (LMO) show the most interesting aroma changes within the first four days of cultivation. Therefore, these four cultures are subsequently evaluated daily and at 12-hour intervals for smell and taste.
Der nach der Fermentation, d.h. der Kultivierung mit mindestens einem ausgewählten Pilz erhaltene Kulturüberstand stellt bereits das erfindungsgemäße Getränk in einer ersten Ausgestaltungsform dar. Aus diesem durch Fermentation hergestellten Getränk können weitere Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Getränks hergestellt werden, um unterschiedliche, konsumentenseitig gewünschte Aromavariationen bereitzustellen und/oder lebensmittelrechtliche Vorgaben zu erfüllen.The culture supernatant obtained after fermentation, i.e. cultivation with at least one selected fungus, already represents the beverage according to the invention in a first embodiment. From this beverage produced by fermentation, further embodiments of the beverage according to the invention can be produced in order to provide different flavor variations desired by consumers and/or to meet food law requirements.
6. Kulturbegleitende Sensorik6. Culture-accompanying sensory analysis
Für die Auswahl der Pilze werden die Emerskulturen von 2-3 Prüfpersonen hinsichtlich ihres Geruchs in einer einfach beschreibenden Prüfung und mittels Bewertung auf einer Skala von 0 (--) bis 5 (++) beschrieben. Die Verkostung der Getränke des L. persicinus während der Kultivierungsoptimierung wird mittels Bewertung der vorgegebenen Geruchs- und Geschmacksattribute auf einer Skala von 0 (--) bis 5 (++) durchgeführt. Die Durchführung und Auswertung derartiger sensorischer Prüfungen erfolgen entsprechend der jeweiligen DIN-Norm.To select the mushrooms, the emersed cultures are described by 2-3 test persons in terms of their smell in a simple descriptive test and by rating on a scale from 0 (--) to 5 (++). The tasting of the L. persicinus drinks during cultivation optimization is carried out by rating the specified smell and taste attributes on a scale from 0 (--) to 5 (++). The implementation and evaluation of such sensory tests are carried out in accordance with the respective DIN standard.
Die hier beschriebene Vorgehensweise bei der Durchführung der Fermentation/Getränke-Herstellung ist nicht als einschränkend für das Herstellungsverfahren anzusehen, sondern als beispielhaft. Fachkundigen Personen ist bekannt, dass Parameter wie u.a. Fermentationsdauer, Rührergeschwindigkeit, pH-Wert, Temperatur, in weiten Bereichen variiert werden können, ohne den Umfang der Erfindung zu verlassen. Es ist insbesondere auch bekannt, dass bei Vergrößerung des Kulturvolumens im Produktionsmaßstab andere Werte der Verfahrensparameter gewählt werden können oder müssen, um die Fermentation in gewünschter Weise durchzuführen.The procedure described here for carrying out the fermentation/beverage production is not to be regarded as limiting the production process, but as an example. Experts are aware that parameters such as fermentation time, stirrer speed, pH value, temperature, among others, can be varied within wide ranges without departing from the scope of the invention. It is also known in particular that when the culture volume is increased on a production scale, other values of the process parameters can or must be selected in order to carry out the fermentation in the desired manner.
7. Kulturbegleitende Analytik7. Culture-accompanying analytics
Der pH-Wert-Verlauf während der Fermentation bzw. der Getränke-Herstellung wird mittels pH-Meter (Mettler Toledo, Gießen, DE) in einem Aliquot des Überstandes bestimmt.The pH value during fermentation or beverage production is determined using a pH meter (Mettler Toledo, Gießen, DE) in an aliquot of the supernatant.
Die während der Fermentation durch den Basidiomyceten gebildete Oxalsäure wird nach Membranfiltration in den Überständen mittels lonenchromatographie (IC) quantifiziert. Die Messung erfolgt an einem Metrohm 883 Basic IC plus mit Leitfähigkeitsdetektor (Metrohm, Filderstadt, DE), ausgestattet mit einer Metrosep A supp 4-250/4.0 Trennsäule und einer Metrosep A supp 4/5 Guard 4.0 Vorsäule. Der Eluent setzt sich aus 1,8 mM Na2CO3, 1,7 mM NaHCO3 und 2% Aceton (Fluss 1 mL/min isokratisch) zusammen, die Suppressorlösung besteht aus 50 mM H2SO4 (Fluss 0,3 mL/min bei 18 U/min). Das Injektionsvolumen beträgt 20 µL und die Messung erfolgt bei Raumtemperatur.The oxalic acid formed during fermentation by the basidiomycetes is quantified in the supernatants after membrane filtration using ion chromatography (IC). The measurement is carried out on a Metrohm 883 Basic IC plus with conductivity detector (Metrohm, Filderstadt, DE), equipped with a Metrosep A supp 4-250/4.0 separation column and a Metrosep A supp 4/5 Guard 4.0 pre-column. The eluent consists of 1.8 mM Na 2 CO 3 , 1.7 mM NaHCO 3 and 2% acetone (flow 1 mL/min isocratic), the sup pressor solution consists of 50 mM H 2 SO 4 (flow 0.3 mL/min at 18 rpm). The injection volume is 20 µL and the measurement is carried out at room temperature.
Der Gehalt an Glucose, Fructose und Saccharose wird mittels Enzymkit von Megazyme (KSUFRG) untersucht. Dazu wird eine definierte Menge des Getränks Carrez-geklärt, verdünnt und im Anschluss nach Anleitung vermessen.The glucose, fructose and sucrose content is analyzed using an enzyme kit from Megazyme (KSUFRG). For this purpose, a defined amount of the Carrez-clarified beverage is diluted and then measured according to the instructions.
8. GC-MS/MS(-O)-Analyse8. GC-MS/MS(-O) analysis
Die Identifizierung der Aromastoffe erfolgt beispielhaft für die Submerskulturen von Laetiporus persicinus auf verdünnter Kakaopulpe mittels GC-MS/MS-O nach dISBSE (direct immersion stir bar sorptive extraction) und einer Thermal Desorption Unit (TDU) und Kryofokussierung (Kaltaufgabesystem; KAS) in 5 mL Kulturüberstand für 30 min bei Raumtemperatur. Die Probenaufgabe erfolgt mit Split 4:1.The identification of the aroma substances is carried out for the submerged cultures of Laetiporus persicinus on diluted cocoa pulp using GC-MS/MS-O after dISBSE (direct immersion stir bar sorptive extraction) and a thermal desorption unit (TDU) and cryofocusing (cold application system; KAS) in 5 mL culture supernatant for 30 min at room temperature. The sample is applied with a split of 4:1.
Zur Identifizierung der Substanzen werden 0,1 bis 1 mg Reinsubstanz in 1 mL Methanol gelöst. Hiervon werden 2 µL in 1 mL n-Heptan verdünnt. Bei flüssigen Substanzen werden direkt 2 µL Reinsubstanz in 1 mL n-Heptan gelöst. 1 µL der Standardlösungen werden in den Gaschromatographen injiziert.To identify the substances, 0.1 to 1 mg of pure substance is dissolved in 1 mL of methanol. 2 µL of this is diluted in 1 mL of n-heptane. For liquid substances, 2 µL of pure substance is dissolved directly in 1 mL of n-heptane. 1 µL of the standard solutions is injected into the gas chromatograph.
Die GC-Analyse wird an einem 8890 GC (Agilent Technologies) mit polarer Agilent VF-WAXms-Säule (30 m × 0,25 mm i.D. × 0,25 µm) und unpolarer DB5ms-Säule (30 m × 0,25 mm i.D. × 0,25 µm), gekoppelt mit einem Agilent 7010B GC Triple Quadrupol Massenspektrometer sowie einem Olfaktometrie-Detektor-Port (ODP 4) (GERSTEL) durchgeführt. Als Trägergas wird Helium (5.0) mit einem konstanten Fluss von 1,56 mL/min verwendet. Die Ofentemperatur wird zu Beginn für 3 min bei 40 °C gehalten, anschließend um 5 °C/min auf 240 °C erhöht und hier wiederum für 7 min gehalten.The GC analysis is carried out on an 8890 GC (Agilent Technologies) with a polar Agilent VF-WAXms column (30 m × 0.25 mm i.D. × 0.25 µm) and a non-polar DB5ms column (30 m × 0.25 mm i.D. × 0.25 µm), coupled to an Agilent 7010B GC triple quadrupole mass spectrometer and an olfactometry detector port (ODP 4) (GERSTEL). Helium (5.0) is used as the carrier gas with a constant flow of 1.56 mL/min. The oven temperature is initially kept at 40 °C for 3 min, then increased by 5 °C/min to 240 °C and held there for another 7 min.
Der Gasfluss wird mit einem Split von 1:1 in das MS und in den ODP geleitet. Weitere Einstellungen sind im Folgenden aufgeführt: Septum Purge-Fluss 3 mL/min, MS-Modus scan im Q1, Scan-Bereich m/z 33 - 300, Ionisationsenergie 70 eV, El-Quellen-Temperatur 230 °C, Quadrupol-Temperaturen 150 °C, MS Transferline-Temperatur 250 °C, He Quench-Gas 2,25 mL/min, N2 Kollisionsgas 1,5 mL/min, ODP 4 Transferline-Temperatur 250 °C, ODP Mischkammer-Temperatur 150 °C, ODP Makeup-Gas N2.The gas flow is directed into the MS and the ODP with a split of 1:1. Further settings are listed below: Septum purge flow 3 mL/min, MS mode scan in Q1, scan range m/z 33 - 300, ionization energy 70 eV, El source temperature 230 °C, quadrupole temperatures 150 °C, MS transfer line temperature 250 °C, He quench gas 2.25 mL/min, N 2 collision gas 1.5 mL/min, ODP 4 transfer line temperature 250 °C, ODP mixing chamber temperature 150 °C, ODP makeup gas N 2 .
Zur Differenzierung von für das Gesamtaroma wichtigen Substanzen wird eine Aromaverdünnungsanalyse (ADA) durchgeführt. Hierzu werden die Proben schrittweise 1:1 durch Einstellen der Split-Verhältnisse an der TDU und dem KAS verdünnt (vgl. Tabelle 8) und von drei Personen so lange olfaktometrisch untersucht, bis kein Geruchseindruck mehr wahrnehmbar ist. Zur Ermittlung des Flavour-Dilution-Faktors (FD) wird der Median der geringsten Verdünnungsstufe gewählt, bei welcher der Aromastoff durch die Teilnehmer noch wahrgenommen werden kann.To differentiate between substances that are important for the overall aroma, an aroma dilution analysis (ADA) is carried out. For this purpose, the samples are diluted step by step 1:1 by setting the split ratios on the TDU and the KAS (see Table 8) and examined olfactometrically by three people until no odor impression can be perceived any more. To determine the flavor dilution factor (FD), the median of the lowest dilution level at which the aroma substance can still be perceived by the participants is chosen.
Die Schlüsselaromastoffe werden mittels Standardaddition quantifiziert. Tabelle 3 zeigt die verwendeten Konzentrationen. Die Quantifizierung erfolgt ebenfalls mittels dISBSE wie zuvor beschrieben anhand der für das Molekül spezifischen Masse-zu-Ladungsverhältnisse. Tabelle 3: Konzentrationen an zugegebenem Standard zur Quantifizierung mittels Standardadditionsverfahren sowie zur Quantifizierung gewähltes Masse-zu-Ladungsverhältnis
Beispiel 1: Screening der PilzeExample 1: Screening of the fungi
Die Emerskulturen der 36 getesteten Pilze auf Kakaopulpe-Agar zeigen substratspezifisch sowohl unterschiedliche Wachstumsgeschwindigkeiten als auch unterschiedliche sensorische Eindrücke. Für jede Pilz-Substrat-Kombination ist in Tabelle 4 exemplarisch für einen Kulturtag das Ergebnis der sensorischen Beschreibung auf Kakaopulpe-Agar und Malzextrakt-Agar als Referenz auf dem Kontrollmedium gezeigt. Allgemein ist zu beobachten, dass die Pilze auf der Kakaopulpe in den meisten Fällen andere Geruchseindrücke als auf dem Referenzmedium Malzextrakt ausbilden. Die Geruchseindrücke können dabei positiver oder negativer sein. Auch die Wachstumsgeschwindigkeiten unterscheiden sich deutlich. Während beispielsweise Wolfiporia cocos und Pleurotus ostreatus an Tag 2 bzw. Tag 4 bereits die besten Geruchseindrücke auf Kakaopulpe zeigen, benötigt Laetiporus portentosus 16 Tage, um ein angenehmes Aroma auszubilden. Wenige Pilze zeigen über die gesamte Kulturdauer kein ansprechendes Aroma. Tabelle 4: Screening von 36 Basidiomyceten auf Kakaopulpe-Agar gegenüber Malzextrakt-Agar als Referenz; Geruchseindrücke exemplarisch für jeweils einen Kulturtag angegeben.
Auf Grundlage der sensorischen Bewertung und des Wachstums der Pilze werden die Pilz-Substrat-Kombinationen beispielhaft für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Die Pilze L. persicinus, L. sulfureus, L. portentosus und L. montanus werden für die Fermentation der Kakaopulpe am besten bewertet. Alle bilden zeitabhängig tropisch-fruchtige Noten aus, wie beispielsweise Pfirsich-, Passionsfrucht- und Kokosnoten. Diese vier Pilze werden aufgrund des gebildeten Aromas für ein weiterführendes Screening ausgewählt, um ein Getränk zu etablieren.Based on the sensory evaluation and growth of the fungi, the fungi-substrate combinations are selected as examples for further investigations. The fungi L. persicinus, L. sulfureus, L. portentosus and L. montanus are rated best for the fermentation of cocoa pulp. All of them develop tropical fruity notes over time, such as peach, passion fruit and coconut notes. These four fungi are selected for further screening based on the aroma they produce in order to establish a beverage.
Beispiel 2: Screening des GetränksExample 2: Screening the drink
Für das Screening zur Produktion des Getränks werden beispielhaft die vier Pilze L. persicinus, L. sulfureus, L. portentosus und L. montanus in Submerskultur untersucht. Die Pilze und deren sensorische Eindrücke sind in Tabelle 5 gezeigt. Die Erntezeitpunkte werden im 24 Stunden Rhythmus gewählt. Verglichen mit den sensorischen Beschreibungen der Emerskulturen (Tabelle 4) zeigen sich Übereinstimmungen bei den Geruchseindrücken für alle Pilze. Von den Testpersonen werden alle Getränke an bestimmten Tagen als sehr positiv bewertet, mit abnehmender Tendenz ab 96 Stunden Fermentationszeit (Tabelle 5). Anhand der Bewertungsparameter Fermentationsdauer, geruchlicher und geschmacklicher Beurteilung sowie gebildetem Oxalsäuregehalt wurde der Pilz L. persicinus beispielhaft als vielversprechendster Vertreter für die Herstellung eines Getränks ausgewählt.
For the screening for the production of the drink, the four fungi L. persicinus, L. sulfureus, L. portentosus and L. montanus are examined in submerged culture as examples. The fungi and their sensory impressions are shown in Table 5. The harvest times are chosen in 24-hour cycles. Compared with the sensory descriptions of the emersed cultures (Table 4), there are similarities in the odor impressions for all fungi. The test subjects rated all drinks as very positive on certain days, with a decreasing trend from 96 hours of fermentation time (Table 5). Based on the evaluation parameters of fermentation time, odor and taste assessment and oxalic acid content formed, the fungus L. persicinus was selected as an example as the most promising representative for the production of a drink.
Beispiel 3: Kulturbegleitende SensorikExample 3: Culture-accompanying sensory analysis
Für das mittels Kultur von L. persicinus auf Kakaopulpe-Medium hergestellte Getränk wird eine sensorische Beschreibung im Panel (n=20) vorgenommen. Hierbei werden vorgegebene Attribute auf einer Skala von 0 (nicht wahrnehmbar) bis 5 (sehr stark wahrnehmbar) sowie die allgemeine Präferenz bewertet. Die Verkostung wird für fermentierte Getränke des L. persicinus im Abstand von 24 h durchgeführt.
Sowohl im Geruch als auch im Geschmack zeigt sich die stärkste Ausprägung der tropisch-fruchtigen Noten wie „tropisch“, „Mango“, „Kokos“, „Aprikose“ und „Maracuja“ nach 48-stündiger Fermentation. Die süße Note ist nach Fermentation stärker ausgeprägt, die saure Note geht etwas zurück. Ebenfalls ist zu beobachten, dass die Intensität der zuvor beschriebenen Merkmale nach 48 Stunden wieder abnehmen. Das spiegelt sich auch in der Präferenz wider, die nach 48 Stunden mit 3,7 von 5,0 für den Geruch und 4,2 von 5,0 für den Geschmack deutlich am höchsten ist. Das Kakaopulpe-Medium ohne Fermentation liegt hingegen nur bei 2,9 für den Geruch und bei 2,1 für den Geschmack.In both smell and taste, the strongest expression of tropical fruity notes such as "tropical", "mango", "coconut", "apricot" and "passion fruit" is evident after 48 hours of fermentation. The sweet note is more pronounced after fermentation, while the sour note decreases somewhat. It can also be observed that the intensity of the previously described characteristics decreases again after 48 hours. This is also reflected in the preference, which is clearly highest after 48 hours with 3.7 out of 5.0 for smell and 4.2 out of 5.0 for taste. The cocoa pulp medium without fermentation, on the other hand, is only 2.9 for smell and 2.1 for taste.
Beispiel 4: Kulturbegleitende AnalytikExample 4: Culture-accompanying analytics
In
Der Glucosegehalt wird beispielhaft während der 48-stündigen Fermentation vom Kakaopulpe-Medium durch L. persicinus von 8,1 ± 0,1 g/L auf 6,8 ± 0,1 g/L reduziert. Der Fructosegehalt von 6,4 ± 0,1 g/L im Kakaopulpe-Medium ändert sich nur minimal zu 6,6 ± 0,1 g/L. Insgesamt wird der Zuckergehalt von 14,5 ± 0,1 g/L auf 13,4 ± 0,1 g/L reduziert. Der pH-Wert ändert sich kaum von 3,75 im Kakaopulpe-Medium auf 3,67 (vgl.
Tabelle 6 zeigt zunächst die identifizierten und vorläufig identifizierten flüchtigen Komponenten im Kakaopulpe-Medium. Zu diesen gehören unter anderem die Aromastoffe Essigsäure-2-pentylester (Geruch: unreife Früchte, Banane, leicht nussig), Acetophenon (Geruch: süßlich, Mandel, stechend) und α-Terpineol (Geruch: Citrus, harzig, blumig). Es ist zu beachten, dass Kakaopulpe abhängig von ihrer Herkunft, den äußeren Bedingungen, der Sorte und den Vorbehandlungsmaßnahmen unterschiedliche Aromastoffe aufweisen kann.Table 6 first shows the identified and provisionally identified volatile components in the cocoa pulp medium. These include, among others, the aroma substances acetic acid 2-pentyl ester (odor: unripe fruit, banana, slightly nutty), acetophenone (odor: sweet, almond, pungent) and α-terpineol (odor: citrus, resinous, floral). It should be noted that cocoa pulp can have different aroma substances depending on its origin, external conditions, variety and pre-treatment measures.
Während der Fermentation der Kakaopulpe können durch den Pilz L. persicinus einige für den bereits erwähnten tropisch-fruchtigen Geruch entscheidende Aromastoffe gebildet werden (Tabelle 7). Auch werden Aromastoffe, die in der unbehandelten Kakaopulpe bzw. dem Kulturmedium natürlicherweise enthalten sind, abgebaut; dies führt unter anderem ebenfalls zur Änderung des Geruchs im Laufe der Kultivierung. Um im Vorfeld aromaaktive Substanzen von nicht-aromaaktiven Substanzen abzugrenzen und die Wichtigkeit einzelner Aromastoffe abschätzen zu können, wurde eine Aromaverdünnungsanalyse (ADA) durchgeführt. Die hieraus resultierenden Aromaverdünnungsfaktoren (FD)-Faktoren für das Getränk sind ebenfalls in Tabelle 7 dargestellt.During the fermentation of the cocoa pulp, the fungus L. persicinus can produce some of the aroma substances that are crucial for the tropical-fruity smell mentioned above (Table 7). Aroma substances that are naturally contained in the untreated cocoa pulp or the culture medium are also broken down; this also leads, among other things, to a change in the smell during the course of cultivation. In order to be able to differentiate aroma-active substances from non-aroma-active substances in advance and to be able to estimate the importance of individual aroma substances, an aroma dilution analysis (ADA) was carried out. The resulting aroma dilution factors (FD) for the beverage are also shown in Table 7.
Verschiedene Aromastoffe konnten über den Olfaktometrie-Detektor-Port spezifischen Gerüchen zugeordnet werden. (R)-Linalool trägt zum citrusartigen, blumigen und süßlichen Aroma des Getränks entscheidend bei, während 5-Butyl-2(5H)furanon mit einem kokos-artigen Geruch den höchsten FD-Faktor aufwies. Trans-Nerolidol trägt hingegen zum süßlichen, blumigen und holzigen Aroma des Getränks bei. Die weiteren Kokos-, Maracuja- und Pfirsich-Noten sind auf nicht näher spezifizierte Sesquiterpenoide zurückzuführen. Im fermentierten Getränk wurden 1,5 ± 0,1 µg/L 2-Nonanon, 165,0 ± 1,6 µg/L (R)-Linalool, 36,4 ± 3,8 µg/L trans-Nerolidol, 0,4 ± 0,1 µg/L Methylbenzoat, 0,6 ± 0,1 µg/L Essigsäure-1-phenylethylester sowie 192,8 ± 0,8 µg/L 2-Phenylethanol quantifiziert. Tabelle 6: Vergleich der RI mit Standard-RI (RINIST & RISTD.) auf polarer VF-Wax-Säule und unpolarer DB5-Säule der mittels dISBSE-GC-MS/MS(-O) identifizierten und vorläufig identifizierten Aromastoffe im Kakaopulpe-Medium (vorläufig identifiziert, wenn keine Identifizierung auf unpolarer Säule möglich).
Die in Tabelle 7 bislang identifizierten Aroma-/Geschmacksstoffe stellen keine abschließende Liste dar. Ggf. fehlen einzelne Stoffe, ohne dadurch den Umfang der Erfindung zu verlassen.The aroma/flavoring substances identified so far in Table 7 do not represent an exhaustive list. Individual substances may be missing without thereby departing from the scope of the invention.
Die vorgesehene Fermentation wird beispielsweise in einem Temperaturbereich von 14 °C bis 30 °C durchgeführt. Für die Fermentation mit Basidiomyceten ist, abhängig von der jeweiligen Basidiomyceten-Spezies, ein Temperaturbereich von 18 °C bis 28 °C, und vor allem von 20 °C bis 26 °C besonders gut geeignet.The intended fermentation is carried out, for example, in a temperature range of 14 °C to 30 °C. For fermentation with basidiomycetes, a temperature range of 18 °C to 28 °C, and especially from 20 °C to 26 °C, is particularly suitable, depending on the respective basidiomycete species.
Die Dauer der Fermentation zur Herstellung des Getränks beträgt zwischen 15 min und 72 h oder zwischen 30 min und 36 h.The duration of fermentation to produce the beverage is between 15 minutes and 72 hours or between 30 minutes and 36 hours.
Der Sauerstoffbedarf des Pilzes variiert bei der aeroben Fermentation in Abhängigkeit vom eingesetzten Basidiomycetenstamm. Der Sauerstoff wird entweder durch Rühren des Fermentationsmediums an Luft oder durch aktive Begasung mit einer oder mehreren sauerstoffhaltigen Gasmischungen zugeführt. Möglich ist aber auch, dass bereits der in dem Fermentationsmedium vorhandene Sauerstoffgehalt zur Fermentation ausreicht. Es kann zweckmäßig sein, den Sauerstoffgehalt im Medium im Verlauf der Fermentation zu variieren. Beispielsweise fand bereits ein erfolgreiches Upscaling im 5 L-Bioreaktor statt, bei dem das Aromaprofil vergleichbar dem der Ansätze aus Schüttelkolben war.The fungus' oxygen requirement varies during aerobic fermentation depending on the basidiomycete strain used. The oxygen is supplied either by stirring the fermentation medium in air or by actively gassing it with one or more oxygen-containing gas mixtures. However, it is also possible that the oxygen content in the fermentation medium is already sufficient for fermentation. It can be useful to vary the oxygen content in the medium during the course of fermentation. For example, a successful upscaling has already taken place in a 5 L bioreactor, where the aroma profile was comparable to that of the shake flask batches.
Des Weiteren sieht die Erfindung vor, dass die Fermentation nach Erhalt des gewünschten Getränks durch Inaktivierung oder durch Abtrennung des Basidiomyceten gestoppt wird. Zur Inaktivierung sind Verfahren zur Pasteurisation, Sterilisation, Einkochen, Ultrahocherhitzung und Tyndallisation besonders gut geeignet. Diese Methoden können gegebenenfalls in einem oder mehreren Verfahrensstadien wiederholt werden, um das Produkt des jeweiligen Verfahrensschrittes haltbar zu machen.Furthermore, the invention provides that the fermentation is stopped after the desired beverage has been obtained by inactivation or by separating the basidiomycete. Processes for pasteurization, sterilization, boiling, ultra-high heating and tyndallization are particularly suitable for inactivation. These methods can be repeated in one or more process stages if necessary in order to preserve the product of the respective process step.
Daneben können weitere Verfahrensschritte vorgesehen sein. Hierzu zählen insbesondere Maßnahmen zur Klärung eines Zwischenproduktes oder des Endproduktes. Hierbei kommen vor allem folgende u.a. Zentrifugation, Grobfiltration, ein- oder mehrstufige Feinfiltration sowie Mikrofeinfiltration in Betracht, die jeweils für sich alleine oder nacheinander durchgeführt werden können.In addition, further process steps can be provided. These include, in particular, measures for clarifying an intermediate product or the end product. The following are particularly important here: centrifugation, coarse filtration, single- or multi-stage fine filtration and microfine filtration, which can each be carried out individually or one after the other.
Denkbar ist weiterhin, dass das Fermentationsprodukt oder das Getränk in einem weiteren, möglicherweise nachgeschalteten Verfahrensschritt mit einem Saft, einem Saftkonzentrat, Wasser, Tee, einem anderen Getränk oder einer Getränkebase, einem alkoholischen Getränk, wie einem Wein (auch Apfelwein oder Reiswein, Schaumwein, Perlwein etc.), einem Bier, einem Likör oder einem Branntwein, gemischt wird, wobei die Verwendung eines natürlich hergestellten Produkts bevorzugt ist. Tabelle 8: GC-Parameter zur Einstellung der benötigten Splitratios (SR) und damit der Flavour-Dilution-Faktoren (FD) für die ADA an der TDU-GC-MS/MS-O; variabel sind dabei der purge flow to split vent und der vent flow
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