DE102011108254A1 - Diagnosing malignant diseases, preferably cancer, comprises providing sample obtained from bodily fluid or bodily waste, and determining concentration of microRNA including microRNA-1246 and microRNA-1290 in the sample - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von malignen Erkrankungen, das auf der Bestimmung des Gehalts an bestimmten micro-RNAs, mir miR-1246 und miR-1290, in unterschiedlichen Körperflüssigkeiten beruht sowie ein Kit zur Diagnose solcher Erkrankungen und die Verwendung dieser micro-RNAs und dafür spezifischer Primer zur Diagnose solcher Erkrankungen.The invention relates to a method for the diagnosis of malignant diseases, which is based on the determination of the content of certain micro-RNAs, miR-1246 and miR-1290, in different body fluids and a kit for the diagnosis of such diseases and the use of these micro-RNAs and specific primers for the diagnosis of such diseases.
Micro-RNAs (miRNAs) sind kleine regulatorische RNA-Moleküle, die im Bereich der 3'UTR-Regionen verschiedener Zielgene binden. miRNAs mit einer typischen Länge von 22 Nukleotiden binden an messenger-RNA (mRNA) und inhibieren die post-transkriptionelle Genexpression durch Hemmung der mRNA-Translation und Spaltung von mRNA. Prinzipiell können alle Gene mit einer ausreichend großen 3'UTR-Region durch miRNAs reguliert werden; andererseits können einzelne miRNA-Moleküle an diverse Gene binden und diese in pleiotroper Weise regulieren. MiRNAs werden in unterschiedlichen Zelltypen in spezifischer Weise exprimiert. In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass miRNAs an der Pathogenese von Tumorerkrankungen beteiligt sind.Micro RNAs (miRNAs) are small regulatory RNA molecules that bind to the region of the 3'UTR regions of different target genes. miRNAs with a typical length of 22 nucleotides bind to messenger RNA (mRNA) and inhibit post-transcriptional gene expression by inhibiting mRNA translation and cleavage of mRNA. In principle, all genes with a sufficiently large 3'UTR region can be regulated by miRNAs; On the other hand, individual miRNA molecules can bind to diverse genes and regulate them in a pleiotropic manner. MiRNAs are specifically expressed in different cell types. Various studies have shown that miRNAs are involved in the pathogenesis of tumor diseases.
In unterschiedlichen Körperflüssigkeiten wie Blut, Ascites, Pleuraerguss, Liquor cerebrospinalis und Urin sind miRNAs mittels RNA- bzw. DNA-Amplifikationstechniken nachweisbar. In diversen Tumorarten finden sich spezifische Expressionsmuster von miRNAs.In different body fluids such as blood, ascites, pleural effusion, cerebrospinal fluid and urine, miRNAs can be detected by RNA or DNA amplification techniques. Various tumor types contain specific expression patterns of miRNAs.
Bisher sind keine Untersuchungen zu den microRNAs miR-1246 und miR-1290 in Blut, Ascites, Pleuraerguss, Liquor cerebrospinalis, Stuhl oder Urin von Patienten mit neoplastischen Erkrankungen berichtet worden. In einer Studie wurde lediglich gezeigt, dass miR-1246 in humanem Milchsekret gesunder Spender detektierbar istSo far, no studies have been reported on the microRNAs miR-1246 and miR-1290 in blood, ascites, pleural effusion, cerebrospinal fluid, stool or urine of patients with neoplastic disease. In one study, it was only shown that miR-1246 is detectable in human milk secretion from healthy donors
Trotz bedeutender Fortschritte im Bereich der Onkologie in den letzten Jahrzehnten sind die bösartigen Neubildungen auch weiterhin nach den Krankheiten des Kreislaufsystems die zweithäufigste Todesursache für beide Geschlechter in Deutschland. Zurzeit stirbt ungefähr jeder Vierte an einer Krebskrankheit. Die bisher v. a. zur Beurteilung des Krankheitsverlaufs eingesetzten Tumormarker sind körpereigene Substanzen, die bei manchen Tumorerkrankungen im Blut vermehrt vorkommen können. Die Tumorzellen bilden diese Substanzen selbst oder regen ihre Bildung an.Despite significant advances in oncology in recent decades, malignant neoplasms continue to be the second leading cause of death for both sexes in Germany after circulatory diseases. Currently about one in four dies of a cancer. The previously v. a. Tumor markers used to assess the course of the disease are endogenous substances that can be found more frequently in some tumor diseases in the blood. The tumor cells form these substances themselves or stimulate their formation.
Entsprechend wäre es wünschenswert, über einen Tumormarker zu verfügen, der mit hoher Sensitivität und Spezifität auf das Vorliegen einer malignen Erkrankung hinweist. Insbesondere besteht ein Bedarf an einem Tumormarker, der unabhängig vom Tumortyp aussagekräftige Werte liefert und in der Differentialdiagnostik einsetzbar ist.Accordingly, it would be desirable to have a tumor marker that is highly sensitive and specific for the presence of a malignant disease. In particular, there is a need for a tumor marker which provides meaningful values regardless of the tumor type and can be used in differential diagnosis.
Entsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von malignen Erkrankungen, das die folgenden Schritte aufweist:
- – Bereitstellen einer aus einer Körperflüssigkeit oder einer Körperausscheidung gewonnenen Probe sowie
- – Bestimmen der Konzentration wenigstens einer der micro-RNAs miR-1246 und miR-1290.
- Provide a sample obtained from a body fluid or a body exudate and
- Determining the concentration of at least one of the micro RNAs miR-1246 and miR-1290.
Die erfindungsgemäß als Marker dienenden micro-RNAs haben die folgende Nukleotid-Sequenz (
- – miR-1246 AAUGGAUUUUUGGAGCAGG (Seq. 1)
- – miR-1290 UGGAUUUUUGGAUCAGGGA (Seq. 2)
- - miR-1246 AAUGGUUUUUGGAGCAGG (Seq. 1)
- - miR-1290 UGGAUUUUUGGAUCAGGGA (Seq. 2)
Im Rahmen eines Forschungsprojektes wurde das Material (Serum, Blut, Aszites, Pleuraerguss, Liquor cerebrospinalis und Urin), das als flüssige Phase durch Abzentrifugation der zellulären Komponenten gewonnen wird, molekulargenetisch hinsichtlich der Expression verschiedener miRNAs untersucht. MicroRNAs waren mittels quantitativer real-time Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) detektierbar und es ist gelungen den Zusammenhang zwischen der Expression bestimmter miRNAs in den aufgelisteten Körperflüssigkeiten und der Diagnose des Malignoms zu demonstrieren, Es wurde gezeigt, dass eine signifikante Korrelation zwischen der Überexpression der miR-1246 und miR-1290 und den häufigsten Malignomentitäten, wie Brustkarzinom, Bronchialkarzinom, Kolorektalem Karzinom, Prostatakarzinom, Pankreaskarzinom, Magenkarzinom und Ovarialkarzinom besteht. Damit konnten nicht nur gesunde Patienten von kranken unterschieden werden, sondern auch Patienten mit Malignomen von Patienten mit differentialdiagnostisch relevanten entzündlichen Veränderungen. Beispielsweise wurde bei der Untersuchung des Serums der Patienten mit kolorektalem Karzinom eine hohe Sensitivität von 94.1% bei einer Spezifität von 90.0% erzielt.As part of a research project, the material (serum, blood, ascites, pleural effusion, cerebrospinal fluid and urine), which is obtained as a liquid phase by centrifugation of the cellular components, molecular genetically examined for the expression of various miRNAs. MicroRNAs were detectable by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and the association between the expression of certain miRNAs in the listed body fluids and the diagnosis of malignancy was demonstrated 1246 and miR-1290 and the most common Malignomentitäten, such as breast carcinoma, bronchial carcinoma, colorectal carcinoma, prostate cancer, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma and ovarian carcinoma. This not only distinguished healthy patients from the sick, but also patients with malignancies of patients with inflammatory changes relevant for differential diagnosis. For example, a high sensitivity of 94.1% with a specificity of 90.0% was achieved in the examination of the serum of patients with colorectal carcinoma.
Der Einsatz der Biomarker miR-1246 und miR-1290 beschränkt sich nicht nur auf die Erst- bzw. Frühdiagnose der malignen Erkrankungen. Die Daten der Experimente zeigen, dass sie ebenfalls als Verlaufsmarker und als prädikative Marker eingesetzt werden können. Es wurde festgestellt, dass die Expression der miR-1246 und miR-1290 mit dem Krankheitsverlauf korreliert. Beim guten klinischen Ansprechen auf eine Chemotherapie sinkt die Konzentration von miR-1246 und miR-1290. Entsprechend ist das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Behandlung von malignen Erkrankungen von Wert.The use of the biomarkers miR-1246 and miR-1290 is not limited to the first or early diagnosis of malignant diseases. The data from the experiments show that they can also be used as progression markers and predicative markers. The expression of miR-1246 and miR-1290 was found to correlate with disease progression. Good clinical response to chemotherapy decreases the concentration of miR-1246 and miR-1290. Accordingly, the method according to the invention is also of value for the treatment of malignant diseases.
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die miRNAs in den untersuchten Körperflüssigkeiten einen vielversprechenden Pantumormarker zur Diagnose und zur Beurteilung des Verlaufes eines Malignoms darstellen. Bisher sind keine Pantumormarker, die ähnliche Sensitivität oder Spezifität für die breite Anzahl an Tumorentitäten besitzt, beschrieben worden. The results clearly show that the miRNAs in the examined body fluids represent a promising pantomime marker for the diagnosis and evaluation of the course of a malignancy. So far, no pantomime markers that have similar sensitivity or specificity for the wide variety of tumor entities have been described.
Das erfindungsgemäße Verfahren sieht vor, dass die Konzentration von wenigstens einer für das Vorliegen oder die Abwesenheit einer malignen Erkrankung des Patienten aussagekräftigen micro-RNA, miR-1246 oder miR-1290 oder auch beide in Kombination, bestimmt wird. Eine qualitative Bestimmung kann mit Hilfe einer für miR-1246 und/oder miR-1290 spezifischen Sonde erfolgen. Da beide micro-RNAs auch in gesunden Patienten in geringen Mengen nachweisbar sind, wird der ermittelte Gehalt mit einem Referenzwert verglichen. Ein solcher Referenzwert kann einerseits ein Normwert sein, wobei der gefundene Wert mit dem Wert eines gesunden Patienten (Normwert) verglichen wird, ist aber in der Regel ein Relativwert, da dieser einfacher zu bestimmen ist. Solche relativen Quantifizierungen sind an und für sich bekannt und benötigen einen Referenzwert. Ein solcher Referenzwert kann die Expression einer unbeeinflussten micro-RNA, also einer micro-RNA, die in gesunden und erkrankten Patienten unverändert exprimiert wird, sein, oder aber auch eine zugesetzte synthetische micro-RNA, deren relative Konzentration in der Probe bekannt ist. Eine solche synthetische micro-RNA ist beispielsweise syn-cel-54, die für solche Referenzzwecke als miRNA-Mimic entwickelt wurde. Relative Quantifizierungen können beispielsweise in Form der quantitativen realtime PCR (qRT-PCR) vorgenommen werden.The inventive method provides that the concentration of at least one for the presence or absence of a malignant disease of the patient meaningful micro-RNA, miR-1246 or miR-1290 or both in combination, is determined. A qualitative determination can be made using a miR-1246 and / or miR-1290 specific probe. Since both microRNAs are detectable even in healthy patients in small amounts, the determined content is compared with a reference value. On the one hand, such a reference value can be a standard value, the value found being compared with the value of a healthy patient (standard value), but as a rule it is a relative value, since this is easier to determine. Such relative quantifications are known per se and require a reference value. Such a reference value may be the expression of an unaffected microRNA, ie a microRNA which is expressed unchanged in healthy and diseased patients, or else an added synthetic microRNA whose relative concentration in the sample is known. For example, such a synthetic microRNA is syn-cel-54, which has been developed as a miRNA mimic for such reference purposes. Relative quantifications can be carried out, for example, in the form of quantitative real-time PCR (qRT-PCR).
Zweckmäßigerweise wird der Gesamtgehalt an micro-RNAs in einer Probe ggf. nach Amplifikation durch Fluoreszenzmessung bestimmt. Quantitative Bestimmungen erfolgen über auf die entsprechenden micro-RNAs spezifische Primer, also durch Primer für miR-1246 und/oder miR-1290.Expediently, the total content of microRNAs in a sample is optionally determined after amplification by fluorescence measurement. Quantitative determinations are made using primers specific for the corresponding microRNAs, ie by primers for miR-1246 and / or miR-1290.
Die Erfindung betrifft ferner ein Kit zur Diagnose von malignen Erkrankungen, das wenigstens eine Sonde und/oder einen Primer zum Nachweis wenigstens einer der micro-RNAs miR-1246 und miR-1290 enthält. Das Kit enthält zweckmäßigerweise ferner eine Referenz-micro-RNA samt zugehöriger Sonde und/oder zugehörigem Primer.The invention further relates to a kit for the diagnosis of malignant diseases, which contains at least one probe and / or a primer for detecting at least one of the miRNAs miR-1246 and miR-1290. The kit expediently also contains a reference microRNA together with the associated probe and / or associated primer.
Die Erfindung betrifft schließlich die Verwendung von miR-1246 und/oder miR-1290 zur Diagnose von malignen Erkrankungen sowie die Verwendung von auf diese micro-RNAs spezifischen Sonden und/oder Primer. Die Sonden sind insbesondere auch auf miR-1246 und miR-1290 spezifische Primer, also damit hybridisierende Oligonukleotide.Finally, the invention relates to the use of miR-1246 and / or miR-1290 for the diagnosis of malignant diseases, and to the use of probes and / or primers specific for these microRNAs. The probes are in particular also miR-1246 and miR-1290 specific primers, thus hybridizing oligonucleotides.
Die Erfindung ermöglicht insbesondere eine Differentialdiagnose zwischen nicht-malignen Erkrankungen und Neoplasien. In den Proben der Patienten mit einer Krebserkrankung ergab sich eine Überexpression wenigstens einer der erfindungsgemäßen micro-RNAs, miR-1246 und miR-1290 micro-RNAs in der Probe eines nicht unter einer Krebserkrankungen leidenden Patienten oder eines gesunden Probanden.In particular, the invention enables a differential diagnosis between non-malignant diseases and neoplasias. In the samples of patients with cancer, overexpression of at least one of the microRNAs according to the invention, miR-1246 and miR-1290 microRNAs in the sample of a non-cancer patient or a healthy subject was found.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren benötigten Techniken zur Anreicherung/Amplifikation der miRNAs über Primer, zum qualitativen und quantitativen Nachweis der miRNAs wie auch zur Aufreinigung und Gehaltsbestimmung sind an und für sich bekannt.The techniques required for the process according to the invention for enrichment / amplification of the miRNAs via primers, for the qualitative and quantitative detection of the miRNAs as well as for the purification and content determination are known per se.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.The invention is explained in more detail by the following examples.
• Probenaufbereitung• Sample preparation
- • Proben (Serum, Vollblut, Ascites, Pleuraerguss, Urin und Liquor cerebrospinalis) wurden innerhalb von 60 min nach der Entnahme zentrifugiert (500 × g, 10 min, RT) und der Überstand bei –80°C gelagert.• Samples (serum, whole blood, ascites, pleural effusion, urine and cerebrospinal fluid) were centrifuged within 60 minutes of collection (500 × g, 10 min, RT) and the supernatant stored at -80 ° C.
• RNA-Extraktion• RNA extraction
Aus dem Material wurde der gesamte RNA-Gehalt unter Verwendung eines miRVana RNA Isolation Kits (Ambion, Austin, USA) nach der Anleitung des Herstellers extrahiert. Tiefgefrorene Proben wurden dazu auf Eis aufgetaut und 0,17 ml davon mit dem gleichen Volumen miRVana PARIS 2X denaturing solution verdünnt und anschließend 5 min auf Eis inkubiert. Daraufhin wurden in die Proben zum Zweck der Normalisierung jeweils 5 μl der synthetisierten miRNA-Mimic syn-cel-54 in einer Konzentration von 5 fmol/ml hinzugefügt. Gleiche Volumina Saure/Phenol/Chloroform (Ambion) wurden jedem Aliquot zugesetzt und die Proben anschließend 5 min bei 10.000 × g zentrifugiert. Zu der wässerigen Phase wurde Glycogen gegeben, wonach 1,25 Volumina 100%iges Ethanol zugemischt wurden. Nach der Passage durch eine miRVana PARIS Säule wurden entsprechend den Vorschriften des Herstellers mehrere Waschschritte durchgeführt. Schließlich wurde die RNA in 100 μl nuclease-freiem Wasser eluiert. Die RNA-Konzentration wurde durch Messung eines 2 μl Aliquots auf einem NanoDropR ND-3300 Fluorospektrometer bestimmt.From the material, total RNA content was extracted using a miRVana RNA isolation kit (Ambion, Austin, USA) according to the manufacturer's instructions. Frozen samples were then thawed on ice and 0.17 ml of it diluted with the same volume miRVana PARIS 2X denaturing solution and then incubated on ice for 5 min. Thereafter, 5 μl of the synthesized miRNA mimic syn-cel-54 at a concentration of 5 fmol / ml were added to the samples for the purpose of normalization. Equal volumes of acid / phenol / chloroform (Ambion) were added to each aliquot and the samples then centrifuged for 5 min at 10,000 x g. Glycogen was added to the aqueous phase, after which 1.25 volumes of 100% ethanol were added. After passing through a miRVana PARIS column several washing steps were carried out according to the manufacturer's instructions. Finally, the RNA was eluted in 100 μl of nuclease-free water. The RNA concentration was determined by measuring a 2 μl aliquot on a NanoDrop R ND-3300 fluorospectrometer.
• MiRNA-Expressionsbestimmung durch quantitative real-time Polymerasekettenreaktion• Determination of miRNA expression by quantitative real-time polymerase chain reaction
Qiagen-miRNA-Assays (Qiagen, Hilden, Deutschland) wurden nach den Vorschriften des Herstellers zur Quantifizierung des Gehalts an microRNA herangezogen: 2 μl der gesamten RNA-Lösung wurden in die Reverse-Transkription-Reaktion (37°C über 60 min und 95°C über 5 min, gefolgt von 4°C) eingesetzt. Die real-time-qPCR wurde auf einem Opticon 2 System (MJ Research, Waltham, MA) nach dem Protokoll des Herstellers (Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Die allgemeinen Zyklus-Bedingungen waren wie folgt: 95°C über 15 min, 40 Zyklen von 15 s bei 94°C, 30 s bei 55°C und 30 s bei 70°C. Jede Probe wurde mindestens doppelt analysiert. Mittlere Schwellenwert-Zykluswerte (Ct-Werte) und Standardabweichungen wurden für alle micro-RNAs berechnet. Die Konzentration von syn-cel-54 in den jeweiligen Proben wurde ebenfalls gemessen. Die Menge an Ziel-micro-RNA wurde relativ zur Menge an syn-cel-54 normalisiert.Qiagen miRNA assays (Qiagen, Hilden, Germany) were quantitated according to the manufacturer's instructions 2 μl of the total RNA solution was used in the reverse transcription reaction (37 ° C for 60 min and 95 ° C for 5 min, followed by 4 ° C). The real-time qPCR was performed on an Opticon 2 system (MJ Research, Waltham, MA) according to the manufacturer's protocol (Qiagen, Hilden, Germany). The general cycle conditions were as follows: 95 ° C over 15 minutes, 40 cycles of 15 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C and 30 seconds at 70 ° C. Each sample was analyzed at least twice. Mean threshold cycle values (Ct values) and standard deviations were calculated for all microRNAs. The concentration of syn-cel-54 in the respective samples was also measured. The amount of target microRNA was normalized relative to the amount of syn-cel-54.
Entsprechend der Angaben von
- • miR-1246 AAUGGAUUUUUGGAGCAGG miR-1290 UGGAUUUUUGGAUCAGGGA
- • miR-1246 AAUGGUUUUUGGAGCAGG miR-1290 UGGAUUUUUGGAUCAGGGA
Micro-RNA-Expressionsprofile von Patienten mit folgenden Erkrankungen zeigten eine Überexpression von miR-1246 und miR-1290:
- • Neoplasien:
- • Pankreaskarzinom
- • Kolorektales Karzinom
- • HCC
- • CCC
- • Lungenkarzinom
- • Nierenzellkarzinom
- • Blasenkarzinom
- • Non-Hodgkin-Lymphom
- • Primäres-ZNS-Lymphom
- • Ovarialkarzinom
- • Prostatakarzinom
- • Magenkarzinom
- • Pleuramesotheliom
- • Peritonelmesotheliom
- • Erkrankungen die als Differentialdiagnose in Frage kommen:
- • bakterielle Peritonitis
- • Pneumonie
- • Leberzirrhose
- • Kardiale Dekompensation
- • Pankreatitis
- • CED
- • Kollagenosen
- • Sarkoidose
- • neoplasias:
- • pancreatic carcinoma
- • Colorectal carcinoma
- • HCC
- • CCC
- • lung carcinoma
- • renal cell carcinoma
- • bladder carcinoma
- • Non-Hodgkin's lymphoma
- • Primary CNS lymphoma
- • ovarian carcinoma
- • prostate cancer
- • gastric carcinoma
- • Pleural mesothelioma
- • Peritoneal mesothelioma
- • Diseases that may be considered as differential diagnosis:
- • bacterial peritonitis
- • Pneumonia
- • liver cirrhosis
- • Cardiac decompensation
- • pancreatitis
- • CED
- • collagenoses
- Sarcoidosis
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