DE102014107933B4

DE102014107933B4 - Verfahren zur mikroskopischen Abbildung von Proben an Böden von mit Fluid befüllten Töpfchen einer Mikrotiterplatte

Info

Publication number: DE102014107933B4
Application number: DE102014107933.7A
Authority: DE
Inventors: Peter Schön; Thorsten Kues
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2014-06-05
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2020-02-06
Anticipated expiration: 2034-06-06
Also published as: CN105278090A; CN105278090B; US20150355446A1; DE102014107933A1

Abstract

Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe (14), die in einem Töpfchen (1) am Boden (3) des Töpfchens (1) anhaftet, wobei zur mikroskopischen Abbildung der Probe (14) folgende Schritte ausgeführt werden:(a) das Töpfchen (1) wird mit Beleuchtungsstrahlung (2) beleuchtet und(b) der beleuchtete Boden (3) des Töpfchens (1) wird von der Unterseite (15) her vergrößernd abgebildet und ein Bild (23a) des beleuchteten Bodens (3) aufgenommen, dadurch gekennzeichnet, dass eine töpfchenverursachte Ungleichmäßigkeit der Beleuchtung des Bodens (3) ausgeglichen wird, indem(c) ein probenloses Test-Töpfchen (22) bereitgestellt wird, das bis auf die fehlende Probe dem zu mikroskopierenden Töpfchen (1) entspricht,(d) an dem Test-Töpfchen (22) eine Referenzmessung mittels der Schritte (a) und (b) durchgeführt wird, wobei ein Referenzbild (24) aufgenommen wird, das den gesamten Boden (3) zeigt,(e) im Referenzbild (24) wird eine Helligkeitskorrekturangabe ermittelt, wobei die Helligkeitskorrekturangabe eine Helligkeitsschwankung als Funktion des Ortes auf dem Boden (3) des Test-Töpfchens (22) angibt,(f) das Bild (23b) des Bodens (3) des probenenthaltenden Töpfchens (1) wird mittels der Helligkeitskorrekturangabe korrigiert, wobei die Lage des Bildes (23b) am Boden (3) ermittelt und der zu dieser Lage gehörende Wert der Helligkeitskorrekturangabe verwendet wird.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe, die in einem befüllten Töpfchen am Boden des Töpfchens anhaftet, wobei zur mikroskopischen Abbildung der Probe folgende Schritte ausgeführt werden:

(a) das Töpfchen wird längs einer optischen Achse mit Beleuchtungsstrahlung beleuchtet und
(b) der beleuchtete Boden des Töpfchens wird von der Unterseite vergrößernd abgebildet und mindestens ein Bild des beleuchteten Bodens aufgenommen.

In den Biowissenschaften spielt die Mikroskopie lebender Zellen eine wichtige Rolle. Diese werden häufig in Mikrotiterplatten kultiviert, die Töpfchen aufweisen. Aber auch andere, einzelne Töpfchen werden verwendet. Die Zellen befinden sich am Boden und sind von einem Nährmedium umgeben. Mikroskopiert werden sie in der Regel mit einem inversen Mikroskop; bei diesem befindet sich das Objektiv unterhalb des Töpfchenbodens. Die Beleuchtung der Probe kann über Auflicht oder Durchlicht erfolgen. Für Durchlichtbilder wird eine Leuchte oberhalb des Töpfchens angebracht. Da aber biologische Zellen nur wenig absorbierende Bestandteile enthalten, sind Hellfeld-Durchlichtbilder typischerweise nur sehr schwach kontrastiert. Mit Hilfe diverser Durchlichtkontrastverfahren wie z. B. Phasenkontrast, DIC u. a. lässt sich der geringe Brechzahlunterschied der einzelnen Zellbestandteile zueinander und zum umgebenden Medium in einen Intensitätsunterschied umwandeln, der dann ein kontrastiertes Durchlichtbild liefert.
Die Erfindung befasst sich insbesondere mit der Durchlicht-Mikroskopie von Proben, die am Boden von Töpfchen einer Mikrotiterplatte anhaften. Die Böden werden im Durchlicht beleuchtet und hochauflösend in einem Mikroskop abgebildet. Diese Art der Mikroskopie unterscheidet sich von der im Stand der Technik in anderen Anwendungen gebräuchlichen Abbildung einer gesamten Mikrotiterplatte, wie es beispielsweise in der DE 102 00 541 A1 erfolgt. Werden die Böden einzeln oder in kleinen Gruppen vergrößernd im Durchlicht abgebildet, sind die Anforderungen an die Qualität der Durchlichtbeleuchtung um ein Vielfaches höher. Dies gilt insbesondere hinsichtlich der genannten Durchlichtkontrastverfahren.
Das Gebiet der Erfindung ist auch abzugrenzen gegen sogenannte Fluoreszenzreader, die überprüfen ob bzw. wie stark die Flüssigkeit in einem Töpfchen einer Mikrotiterplatte fluoresziert. Auch hier erfolgt in der Regel eine Erfassung aller Töpfchen einer Mikrotiterplatte gleichzeitig. Zudem ist die Qualität der Beleuchtung der Böden bei diesen Anwendungen irrelevant. Die US 6 074 614 A befasst sich mit einem solchen Einsatz von Mikrotiterplatten und sieht eine Abdeckplatte vor, welche passend zur Mikrotiterplatte eine Vielzahl von zylindrischen Vorsprüngen hat, die in die potentiell fluoreszierende Flüssigkeit der Mikrotiterplatte eintauchen. Das Ziel ist es, bei der Fluoreszenzanregung und -auslesung eine möglichst gleichmäßige Weglänge der Strahlung durch die Töpfchen der Mikrotiterplatte zu gewährleisten. Die Frage der Beleuchtung des Bodens einer Mikrotiterplatte spielt keine Rolle.
In der Mikroskopie ist die Bildqualität nicht nur von der verwendeten Abbildungsoptik, sondern auch von der Qualität der Beleuchtung abhängig. Das Abbildungssystem bestehend aus Objektiv, Tubuslinse, Okular oder Kamera hat zum Ziel, die Verhältnisse der Probenebene möglichst getreu abzubilden. Diese setzen sich aus der Probe selbst, sowie dem beleuchtenden Lichtfeld zusammen. Es ist gekennzeichnet durch eine Intensitätsverteilung im Objektfeld (Ausleuchtung), sowie eine Beleuchtungswinkelverteilung, d.h. aus welchem Raumwinkelbereich Licht jeden einzelnen Punkt des Objektfeldes erreicht (numerische Apertur (NA) der Beleuchtung). Die Beleuchtungseffekte sind in der Regel aber nicht Zweck der Untersuchungen, sondern es interessiert allein die Probe. Deshalb wird danach gestrebt, eine möglichst homogene Ausleuchtung zu realisieren, bei der jeder Objektfeldpunkt von Licht mit identischem Winkelspektrum beleuchtet wird. Das gilt sowohl für Durchlichtbeleuchtungen, bei denen das Licht die Probe durchstrahlt und auf der anderen Seite vom Objektiv gesammelt wird, als auch für Auflichtbeleuchtungen, bei denen die Beleuchtung durch das abbildende Objektiv realisiert wird.
Im Durchlicht werden diese Bedingungen am besten durch eine Köhlersche Beleuchtung erreicht. Aber selbst dann ist die Ausleuchtung nicht perfekt homogen. Bei okularbasierten Untersuchungen ist das unkritisch, da zum einen das menschliche Auge geringe Intensitätsunterschiede nur schlecht wahrnimmt und da zum anderen immer nur jeweils ein Bild betrachtet wird, nämlich das aktuelle Sehfeld. Selbst wenn also sichtbar die Intensität am Sehfeldrand etwas abnimmt, stört das häufig nicht. Bei Betrachtungen mit kamerabasierter Bildaufnahme stellt sich die Situation kritischer dar. Geringe Intensitätsunterschiede lassen sich leichter darstellen und werden dann vom Betrachter eher als störend empfunden. Insbesondere bei Panorama/Stitching-Aufnahmen wird dieser Effekt sichtbar. Dies kann im Extremfall sogar dazu führen, dass Stitching-Algorithmen mehr Zeit für die Bildregistrierung benötigen oder die Registrierung sogar unmöglich wird.
Um diesen Effekt zu vermeiden, kann eine Shading-Korrektur durchgeführt werden. Das geschieht z. B. dadurch, dass ein Referenzbild ohne Probe aufgenommen wird. Dieses Referenzbild enthält die Beleuchtungsartefakte, die eine perfekte Beleuchtung und Abbildung stören. Das sind z. B. die bereits weiter oben beschriebene inhomogene Ausleuchtung, aber auch Staub und Schmutz, der sich auf einzelnen Linsen, Spiegeln oder sonstigen Elementen im Strahlengang befinden kann, genauso wie die Effekte fehlerhafter Justage des Strahlengangs. All diese Effekte, die hier unter dem Begriff „Shading“ zusammengefasst werden, sind in jedem Bild vorhanden, das mit diesem Strahlengang aufgenommen wird. Wenn das Referenzbild bekannt ist, kann das Bild mit Probe korrigiert werden, mittels einer sogenannten Shading-Korrektur. Ein solches Verfahren wird zum Beispiel in US 2010/0188497 A1 beschrieben. Es gibt auch Verfahren, bei denen das Shading ohne vorherige Aufnahme eines Referenzbildes identifiziert und entfernt werden kann. Dazu sei auf WO 2013/094273 A1 verwiesen.
Alle genannten Verfahren erkennen und korrigieren jedoch nur strahlengangbezogenes Shading, d.h. ein Shading das unabhängig von der Probenposition ist, also fest mit dem Bezugssystem des Strahlenganges verbunden ist. Eine Verschiebung der Probe um ein oder mehrere Objektfelder in eine Richtung ändert an diesem strahlengangbezogenen Shading nichts. Das Referenzbild ist somit invariant gegenüber einer Probenverschiebung.
In US 2003/0039402 A1 wird ein Verfahren beschrieben, das es erlaubt, Kratzer oder andere Artefakte in einem gescannten Bild zu entfernen. Dieses Verfahren ist prinzipiell auch auf die Mikroskopie übertragbar und würde es ermöglichen, bestimmte Artefakte wie kleine Härchen in der Probenebene zu erkennen und zu entfernen. Um aber Shading zu erkennen, müsste bereits ein a priori Wissen über die Art der Artefakte vorhanden sein, denn sonst kann die Bildanalyse nicht entscheiden, welche Elemente des Bildes der Probe zugeordnet werden können und wo es sich um Shading handelt. Das Verfahren scheiterte außerdem bei einem probengefäßbasierten Shading, das nicht durch scharf umrissene Strukturen, sondern durch räumlich ausgedehnte Helligkeitsgradienten gekennzeichnet ist.
Weiter beschreibt die US 2006/0001954 A1 ein optisches System für das Screening von biologischen Proben mit einem hohen Durchsatz mit Hilfe von gestreutem Licht und einem Autofokus.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe, die in einem Töpfchen am Boden des Töpfchens anhaften, derart auszugestalten, dass die Wirkung der Beleuchtung des Bodens für die Abbildung verbessert ist.
Diese Ausgabe wird gelöst mit einem Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe, die in einem Töpfchen am Boden des Töpfchens anhaftet, wobei zur mikroskopischen Abbildung der Probe folgende Schritte ausgeführt werden:

(a) das Töpfchen wird mit Beleuchtungsstrahlung beleuchtet und
(b) der beleuchtete Boden des Töpfchens wird von der Unterseite der Mikrotiterplatte vergrößernd abgebildet und ein Bild des beleuchteten Bodens aufgenommen, wobei eine töpfchenverursachte Ungleichmäßigkeit der Beleuchtung des Bodens ausgeglichen wird, indem
(c) ein probenloses Test-Töpfchen bereitgestellt wird, das bis auf die fehlende Probe dem zu mikroskopierenden Töpfchen entspricht,
(d) an dem Test-Töpfchen wird eine Referenzmessung mittels der Schritte (a) und (b) durchgeführt, wobei ein Referenzbild aufgenommen wird, das den gesamten beleuchteten Boden zeigt,
(e) anhand des Referenzbildes wird eine Helligkeitskorrekturangabe ermittelt, wobei die Helligkeitskorrekturangabe eine Helligkeitsschwankung als Funktion des Ortes auf dem Boden des Test-Töpfchens angibt,
(f) das Bild des Bodens des probenenthaltenden Töpfchens wird mittels der Helligkeitskorrekturangabe korrigiert, wobei die Lage des Bildes am Boden ermittelt und der zu dieser Lage gehörende Wert der Helligkeitskorrekturangabe verwendet wird.

Die Erfindung geht von folgender Erkenntnis aus: Ein probengefäßbezogenes Shading, welches fest mit dem Bezugssystem des Probengefäßes verbunden ist, wird von den beschriebenen Verfahren nicht erkannt und kann folglich nicht korrigiert werden.
Ein probengefäßbezogenes Shading liegt dann vor, wenn die Struktur des Probengefäßes selbst zu einem Shading führt. Das tritt z. B. bei kleinen Gefäßen auf (Mikrotiterplatten), wie weiter unten beschrieben wird. Wird die Probe bewegt, wandert dieses Shading mit. Es ist also immer an derselben Stelle eines probengefäßbezogenen Bezugssystems, kann aber keiner festen Position eines strahlengangbezogenen Bezugssystems zugeordnet werden. Helligkeitsgradienten treten insbesondere bei der Durchlichtbeleuchtung von Mikrotiterplatten auf. Mikrotiterplatten sind Probengefäße, die insbesondere in der Lebendzellbeobachtung eingesetzt werden. Dabei handelt es sich um Platten, die mit einer definierten Anzahl von Töpfchen, z. B. 24,96 oder 384, in regelmäßigen Abständen ausgestattet sind. In jedes dieser Töpfchen kann eine Probe eingebracht werden, z. B. Zellen oder Embryonen. Für die mikroskopische Beobachtung sind die Töpfchen mit einem transparenten Boden aus z. B. Polystyrol oder Glas versehen. Die optischen Eigenschaften der Töpfchen stören die Ausleuchtung im Durchlicht erheblich. Im Folgenden wird dieser Effekt anhand einer Mikrotiterplatte erläutert, deren 96 Töpfchen eine Höhe von 11 mm und einen Durchmesser von 7 mm besitzen.
Der obere Rand des Töpfchens beschneidet den Lichtkegel der Durchlichtbeleuchtung, der einen bestimmten Punkt des Töpfchenbodens erreicht und der nach Passieren des Bodens vom Objektiv aufgefangen wird. Je nachdem, ob dieser Bodenpunkt im Töpfchenzentrum oder eher am Rand liegt, ist auch der nutzbare Lichtkegel ein anderer, d.h. jeder Punkt des Töpfchenbodens wird mit einer unterschiedlichen numerischen Apertur beleuchtet. Das kann bereits zu einem probengefäßabhängigen Shading führen, dessen Effekt umso größer ist, je stärker der Beleuchtungslichtkegel vom Töpfchen beschnitten wird und je ungleichmäßiger die Beleuchtungsintensität auf die verschiedenen Beleuchtungswinkel verteilt ist. Sofern hingegen die numerische Apertur des Objektivs groß genug ist, alle unterschiedlichen Beleuchtungskegel aufzunehmen und die Beleuchtung in jedem dieser Kegel eine annähernd gleiche Intensität zur Verfügung stellt, bleibt die Ausleuchtung des Töpfchenbodens homogen, obwohl der Töpfchenrand das Beleuchtungslicht beschneidet.
Das wässrige Medium, in dem sich die Probe befindet, bildet aber an seiner Oberfläche einen Meniskus aus. Die Grenzfläche zwischen Luft und Medium ist also gewölbt. Der Radius des Meniskus' hängt von der Art der Flüssigkeit, von Wandmaterial und Beschichtung der Töpfchen, sowie vom Befüllungsverfahren ab, also ob trockene oder bereits feuchte Töpfchen befüllt wurden, ob sie umgerührt wurden etc. In den meisten Fällen zieht sich die Flüssigkeit entlang der Töpfchenwand etwas nach oben, während der Flüssigkeitsspiegel in der Töpfchenmitte tiefer liegt.
Das führt dazu, dass ein paralleles einfallendes Strahlenbündel nach Passieren des Meniskus' divergiert. Diese Divergenz ist umso ausgeprägter, je kleiner der Radius des Meniskus' ausgebildet ist. Bei Objektiven mit einer hohen NA stellt das kein Problem dar, weil auch die divergierenden Strahlen aufgefangen werden können. Zahlreiche Applikationen erfordern jedoch schwach vergrößernde Objektive, die ein großes Feld abbilden und somit eine Übersichtsaufnahme der Probe ermöglichen. So kann zum Beispiel mit nur einem Bild eines 2,5x-vergrößernden Objektivs fast ein komplettes Töpfchen einer Mikrotiterplatte mit 96 Töpfchen abgebildet werden.
Typischerweise verfügen jedoch schwach vergrößernde Objektive nur über eine geringe NA, z. B. 0,08 oder 0,12. Die NA (NA = n*sin(α)) beschreibt den maximalen Winkel a, den ein Strahl mit der optischen Achse bilden kann, um noch vom Objektiv zur Abbildung gebracht zu werden. Hierbei ist n der Brechungsindex des Mediums zwischen Objektiv und Probe. Bei schwach vergrößernden Objektiven ist dies in der Regel Luft, also n = 1. Alle Beleuchtungsstrahlen, die durch den Meniskus zu größeren Winkeln hin gebrochen werden als dem durch die Objektiv-NA festgelegten Grenzwinkel, gelangen somit nicht in das Objektiv. Selbst wenn also Beleuchtungslicht jeden Teil des Töpfchenbodens erreicht, erzeugt der Meniskus-Effekt ein inhomogen ausgeleuchtetes Bild, da das Licht aus der Probe in Abhängigkeit vom Eintrittswinkel nicht zu gleichen Anteilen ins Objektiv gelangt. Das aufgenommene Bild weist somit ein helles Töpfchenzentrum und dunkle Randbereiche auf. Es entsteht also ein probengefäßbasiertes Shading, welches von den bekannten Verfahren zur Shading-Korrektur nicht behoben werden kann.
Die Erfindung verwendet eine Helligkeitskorrekturangabe, die eine Funktion des Ortes auf dem Boden des Töpfchens bezogen ist. Der Begriff „Töpfchen“ wird dabei zur Bezeichnung eines Probengefäßes verwendet. Es kann sich sowohl um ein einzelnes Gefäß handeln, als auch um ein Töpfchen einer Mikrotiterplatte. Soweit in der nachfolgenden Beschreibung auf den Singular („Töpfchen“) bezuggenommen wird, ist damit sowohl die Verwendung eines einzelnen Gefäßes als auch der Bezug auf einzelnes Töpfchen einer Mikrotiterplatte gemeint.
Das Test-Töpfchen entspricht dem Gefäß, welches die Probe enthält, bis auf den Unterschied, dass im Test-Töpfchen keine Probe vorhanden ist. Ist die am Boden des Töpfchens anhaftende Probe in einer Nährlösung, d.h. befindet sich im Töpfchen zusätzlich eine Flüssigkeit, ist es bevorzugt, diese Flüssigkeit auch im Test-Töpfchen vorzusehen. Letztlich ist es Aufgabe des Test-Töpfchens genau diejenigen optischen Bedingungen, d.h. diejenige Beeinflussung der Beleuchtungsstrahlung herzustellen, die auch im Töpfchen herrscht - jedoch ohne Probe. Dadurch kann die Helligkeitskorrekturangabe, die anhand des Test-Töpfchens ermittelt wurde, eine Funktion des Ortes am Boden des Töpfchens ist, anhand des Test-Töpfchens bestimmt werden und dann zur Korrektur einer ungleichmäßigen Helligkeitsverteilung bei der Abbildung der Probe im Töpfchen verwendet werden.
Die Helligkeitskorrekturangabe kann dabei auf verschiedene Weise bereitgestellt werden:

In einer ersten Ausführungsform wird der Boden des Test-Töpfchens durch mehrere Einzelbilder abgebildet und ein Referenzbild gewonnen. Die Helligkeitskorrekturangabe ist dann im wesentlichen die Helligkeitsverteilung über den gesamten Boden des Test-Töpfchens, d. h. über das Referenzbild. Die Abbildung eines Töpfchens mit Probe liefert ein Probenbild. Zur Korrektur des Probenbildes des Töpfchens, das aufgrund der vergrößerten Abbildung nur einen Ausschnitt des Bodens des Töpfchens zeigt, wird die Lage des Probenbildes am Boden ermittelt. Ein entsprechend gelegter Ausschnitt im Referenzbild liefert dann die erforderlichen Helligkeitskorrekturdaten für das Probenbild.

In einer zweiten Ausführungsform erfolgt eine funktionale Beschreibung der Helligkeitsverteilung im Referenzbild. Es wird für jeden Ort am Boden des Referenzbildes des Test-Töpfchens (beispielsweise für jedes Pixel) ein Korrekturfaktor ermittelt, der eine additive oder multiplikative Abweichung von einer gleichmäßigen Helligkeitsverteilung wiedergibt. Die Korrektur des Probenbildes erfolgt dann durch Ermittlung der Lage dessen Ausschnitt am Boden, Auslesen der entsprechenden Korrekturfaktoren für diese Lage aus der Helligkeitskorrekturangabe und Anwenden der Korrekturfaktoren (entweder additiv oder multiplikativ, je nach Ausgestaltung der Faktoren).
In einer dritten Ausführungsform, die besonders bei Töpfchen zur Anwendung kommen kann, die einen kreisförmigen Querschnitt haben, umfasst die Helligkeitskorrekturangabe einen Korrekturfaktor (wieder entweder additiv oder multiplikativ), der ausschließlich vom Abstand vom Zentrum des Bodens des Test-Töpfchens abhängt. Es genügt für diese Ausführungsform also, in der Referenzmessung des Schrittes (d) lediglich Bilder zu gewinnen, die lediglich einen Bereich links einer radialen Koordinate vom Zentrum des Bodens des Test-Töpfchens bis zu dessen Rand abdecken. Die Helligkeitskorrektur des Probenbildes erfolgt in Schritt (f) in dieser Ausführungsform dadurch, dass die radiale Koordinate der Bildpunkte des Bildes, d.h. der Abstand vom Zentrum des Bodens des Töpfchens ermittelt wird. Durch Auslesen der entsprechenden Korrekturwerte aus der Helligkeitskorrekturangabe durch Anwendung dieser Korrekturwerte ist dann die Helligkeitskorrektur erreicht.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:

1 zwei Schemadarstellungen zur Verdeutlichung der Bedeutung der numerischen Apertur eines Objektivs bei der Durchlichtmikroskopie von Proben, die am Boden einer Mikrotiterplatte angeordnet sind,
2 fünf Schemadarstellungen ähnlich der 1 zur Verdeutlichung der Bedeutung des Zusammenwirkens zwischen numerischer Apertur der Beleuchtung und der Abbildung,
3 eine Schemadarstellung eines Mikroskops zum Abbilden von Proben, die sich an Böden von Töpfchen einer Mikrotiterplatte befinden,
4 eine Funktion zur Verdeutlichung der Intensitätsverteilung am Boden eines Töpfchens, welche durch Einflüsse des Töpfchens auf die Beleuchtung verursacht wird,
5 ein Flussdiagramm zur Erläuterung des allgemeinen Prinzips der Korrektur einer ungleichmäßigen Ausleuchtung des Bodens eines Töpfchens,
6 eine Schemadarstellung zur Erläuterung der Korrektur gemäß 5 in einer ersten Ausführungsform,
7 ein Flussdiagramm zur Erläuterung einer zweiten Ausführungsform und
8 eine schematische Darstellung zur Erläuterung einer dritten Ausführungsform.

1 zeigt schematisch eine Schnittdarstellung durch ein Töpfchen 1 einer Mikrotiterplatte, das von einem Beleuchtungsstrahlenbündel 2 längs einer optischen Achse OA beleuchtet wird. An einem Boden 3 des Töpfchens befindet sich eine nicht weiter dargestellte Probe, beispielsweise eine Zellkultur. Im Töpfchen ist ein Fluid 4, beispielsweise ein Nährmedium für die Zellkultur, das an seiner Oberfläche einen Meniskus 5 ausbildet.
Das Beleuchtungsstrahlenbündel 2 fällt in der Darstellung der 1 von oben ein. Der derart beleuchtete Boden 3 wird in Durchlicht mit einem Objektiv aufgenommen, das einen Auffangkegel 6 aufweist.
Die Probe in dem Töpfchen 1 befindet sich in der Regel in einer wässrigen Umgebung, z. B. einem einfachen Puffer oder einem Nährmedium, um eine Lebendzellbeobachtung zu ermöglichen. Diese Flüssigkeit 4 bildet an ihrer Oberfläche den Meniskus 5 aus, die Grenzfläche zwischen Luft und Medium ist also gewölbt. Der Radius des Meniskus' 5 hängt von der Art der Flüssigkeit 4, von Wandmaterial und Beschichtung des Töpfchens 1, sowie von der Vorgeschichte der Befüllung ab, also ob trockene oder bereits feuchte Töpfchen 1 befüllt wurden, ob sie umgerührt wurden etc. In den meisten Fällen zieht sich die Flüssigkeit 4 entlang der Töpfchenwand etwas nach oben, während der Flüssigkeitsspiegel in der Töpfchenmitte tiefer liegt.
Das führt dazu, dass ein paralleles einfallendes Beleuchtungsstrahlenbündel 2 nach Passieren des Meniskus' 5 divergiert. Diese Divergenz ist umso ausgeprägter, je kleiner der Radius des Meniskus' 5 ausgebildet ist. Bei Objektiven mit einer hohen NA, also einem großen Auffangkegel 6, stellt das kein Problem dar, weil auch die divergierenden Strahlen aufgefangen werden können. Zahlreiche Applikationen erfordern jedoch schwach vergrößernde Objektive, die ein großes Feld abbilden und somit einen Übersichtseindruck eines Bodens ermöglichen sollen. So kann zum Beispiel mit nur einem Bild eines 2,5x-vergrößernden Objektivs fast ein kompletter Boden 3 des Töpfchens 1 einer Mikrotiterplatte mit 96 Töpfchen 1 abgebildet werden.
Typischerweise verfügen jedoch schwach vergrößernde Objektive nur über eine geringe NA, z. B. 0,08 oder 0,12. Die NA beschreibt den maximalen Winkel a des Auffangkegel 6, den ein Strahl mit der optischen Achse OA bilden kann, um noch vom Objektiv zur Abbildung gebracht zu werden, NA = n*sin(α). Hierbei ist n der Brechungsindex des Mediums zwischen Objektiv und Probe. Bei schwach vergrößernden Objektiven ist dies in der Regel Luft, also n = 1. Alle Beleuchtungsstrahlen, die durch den Meniskus 5 zu größeren Winkeln hin gebrochen werden als dem durch die Objektiv-NA festgelegten Grenzwinkel, gelangen somit nicht in das Objektiv. Selbst wenn also Beleuchtungslicht jeden Teil des Bodens 3 erreicht (wie im linken Teil der 1), erzeugt der Meniskus-Effekt ein inhomogenes Bild, da die Durchlichtbeleuchtung in Abhängigkeit vom Eintrittswinkel nicht zu gleichen Anteilen ins Objektiv gelangt.

1 geht von der idealisierten Situation eines parallel einfallenden Beleuchtungsstrahlenbündels 2 aus.

Eine typische Durchlichtbeleuchtung bietet allerdings ein deutlich breiteres Winkelspektrum an, und zwar bis zu dem Winkel, der durch die numerische Apertur (NA) der Beleuchtung beschrieben wird. Strahlenbündel anderer Einfallswinkel weisen für das oben erwähnte Objektiv
Mit NA = 0,12 die in 2 dargestellten Ausleuchtungsmuster auf. In den fünf Darstellungen der 2 ist die numerische Apertur der Beleuchtung 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 und 0,25.
Für jeden Einfallswinkel auf den Boden 3 ist das Ausleuchtungsmuster unterschiedlich. Bei allen Geometrien gilt jedoch, dass die Randbereiche nie oder weniger von für das Objektiv nutzbaren Strahlen erreicht werden. Das aufgenommene Bild entsteht aus der Summierung aller dieser einzelnen Strahlbündel. Es wird somit effektiv ein helles Töpfchenzentrum und dunkle Ränder aufweisen. Diese Überlegung gilt unabhängig von der Art der Durchlichtbeleuchtung, also gleich ob es sich um Köhlersche, kritische oder eine anders geartete Beleuchtung handelt. Egal was oberhalb des Töpfchens 1 unternommen wird, der beschriebene Effekt bleibt bestehen.
3 zeigt schematisch ein Mikroskop zum hochauflösenden Abbilden von Proben an 14 Böden 3 von Töpfchen einer Mikrotiterplatten 11. Anhand der 1 und 2 bereits beschriebene Elemente und Bauteile sind in 3 mit den selben Bezugszeichen versehen, um eine Wiederholung der Beschreibung zu vermeiden.
Das Mikroskop weist eine Beleuchtungsstrahlenquelle 16 auf, welche das Beleuchtungsstrahlenbündel 2 längs der optischen Achse OA auf die Mikrotiterplatte 11 abgibt. Diese ist so zur optischen Achse OA ausgerichtet, dass ein Töpfchen, das eine zu mikroskopierende Probe 14 enthält, passend im Beleuchtungsstrahlengang, d.h. im Beleuchtungsstrahlenbündel 2 liegt. Von einer Unterseite 15 der Mikrotiterplatte 11 her wird die derart im Durchlicht beleuchtete Probe 14 abgebildet. Dazu befindet sich unter der Mikrotiterplatte 11 ein entsprechender Abbildungsstrahlengang des Mikroskops, von dem exemplarisch ein Objektiv 17 sowie ein Empfänger 18 eingezeichnet sind. Der Abbildungsstrahlengang liegt auf der optischen Achse OA, d.h. ein Beleuchtungsstrahlengang, der mittels der Beleuchtungsstrahlenquelle 16 das Beleuchtungsstrahlenbündel 2 abgibt, liegt auf derselben optischen Achse OA wie der Abbildungsstrahlengang.
Ein Steuergerät 19 liest die Daten vom Empfänger 18 aus. Um die Töpfchen der Mikrotiterplatte 11 einzeln abbilden zu können, liegt diese mit ihrer Unterseite 15 auf einem Probentisch 20 auf, der über einen vom Steuergerät 19 angesteuerten Antrieb 21 so verstellbar ist, dass die einzelnen Töpfchen der Mikrotiterplatte 11 zur optischen Achse OA ausgerichtet werden können.
Eines der Töpfchen der Mikrotiterplatte 11 ist als Test-Töpfchen 22 ausgebildet. Es entspricht den übrigen Töpfchen der Mikrotiterplatte 11 mit dem einzigen Unterschied, dass sich am Boden 3 des Test-Töpfchens 22 keine Probe 14 befindet. Dies führt dazu, dass die Ausleuchtung des Bodens 3 des Test-Töpfchens 22 genau denselben Bedingungen unterliegt, wie die Ausleuchtung der Böden 3 der Töpfchen, welche Proben 14 enthalten.
Wie bereits anhand der 1 und 2 erläutert, hat ein Töpfchen 1 Auswirkung darauf, wie der Boden 3 des Töpfchens ausgeleuchtet wird. 4 zeigt dies exemplarisch in einem Diagramm, in dem Intensität I der Beleuchtung, d.h. die Helligkeit auf dem Boden 3 als Funktion des Abstands vom Zentrum des Töpfchens 1 abnimmt. Das Zentrum des Töpfchens kann beispielsweise der Lage der optischen Achse OA entsprechen. Dort liegt eine maximale Helligkeit, d.h. eine Intensität I₁ vor. Der Rand des für 4 exemplarisch als Kreiszylinder angenommenen Töpfchens befindet sich auf einem Radius r₁. Aufgrund der idealisiert angenommenen Kreiszylinderform des Töpfchens ist ausschließlich die radiale Koordinate r von Bedeutung. Am Rand des Töpfchens, d.h. bei r₁ ist die Beleuchtungsintensität minimal, z. B. Null. Die Intensität I bleibt mit zunehmendem Abstand r von der optischen Achse OA über einen längeren Zeitpunkt nahezu konstant und fällt zum Rand des Töpfchens ab, d.h. bei der radialen Koordinate r₁. Dieser Intensitätsverlauf der Beleuchtung, die im exemplarisch dargestelltem Beispiel der 3 eine Durchlichtbeleuchtung ist, wirkt sich natürlich auf die Erfassung einer Probe 14 aus. Ein ähnlicher Intensitätsverlauf stellt sich im übrigen auch bei einer Auflichtbeleuchtung ein, wenn die Beobachtungsebene nicht direkt am Töpfchenboden liegt, sondern etwas weiter in die Probe hineingeschaut wird, so dass die hier gegebene Beschreibung durchgängig auch für Mikroskope mit Auflichtbeleuchtung Gültigkeit hat.
Der Intensitätsabfall zum Rand wird in der Fachliteratur als „Shading“ bezeichnet. Er ist nicht durch den Strahlengang des Mikroskops, sondern durch das Probengefäß erzeugt. Für die Korrektur eines strahlengangbezogenen Shadings kommen alle in der Literatur bekannten Verfahren in Frage, die deshalb hier nicht erneut beschrieben werden. Erzeugt jedoch das Probengefäß ein probengefäßbasiertes Shading, kann dieses auf die im folgenden beschriebenen Arten und Weisen aus dem Probenbild entfernt werden. Bei all diesen Verfahren wird (ohne dass dies nachfolgend beschrieben ist) bevorzugt und optional zunächst das strahlengangbezogene Shading entfernt, so dass nur noch das probengefäßbasierte verbleibt.
Das probengefäßbasierte Shading wird mit einem Verfahren entfernt, das als Ablaufdiagramm schematisch in 5 gezeigt ist. 6 zeigt die einzelnen Bilder. In einem Schritt S1 wird das Test-Töpfchen 22 in den Strahlengang des Mikroskops gestellt. Es erfolgt eine Referenzaufnahme des Bodens 3 des Test-Töpfchens 22, d.h. ohne Probe 14. Die Auflösung durch das Objektiv 17 ist derart, dass das Objektfeld des Objektivs 17 nicht den gesamten Boden 3 erfassen kann. Die Abbildung erfolgt deshalb in Einzelbildern 23a, indem der Boden z. B. in Form einer Kachelaufnahme gescannt wird. Für diese Aufnahmen wird das Test-Töpfchen 22 senkrecht zur optischen Achse OA und parallel zum Boden 3 verschoben. Durch diese Aufnahmetechnik ändert sich bei jeder Stellung der Einfluss des Test-Töpfchens 22 auf die Ausleuchtung des Bodens 3. Dies verdeutlicht, dass es sich bei dem zu korrigierenden Shading um ein probengefäßbasiertes Shading handelt und nicht um ein Shading, das durch den Beleuchtungsstrahlengang selbst herbeigeführt ist. Ein solches wäre völlig unabhängig von der Positionierung des Töpfchens 22.
Die Einzelbilder 23a beim Abscannen des Bodens 3 enthalten damit Variationen der Beleuchtung des Bodens 3, die für die Lage des Einzelbildes 23a am Boden 3 charakteristisch ist. Am Ende des Schrittes S1 steht eine Referenzaufnahme 24 des Bodens 3 durch die mehreren Einzelbilder 23a, beispielsweise in Form einer Kachelaufnahme.
In einem nachfolgenden Schritt S2 wird die Helligkeitsverteilung im Referenzbild 24 ermittelt. Dies liefert eine Helligkeitskorrekturangabe, da die Abweichung von einer idealen homogenen Ausleuchtung einfach ermittelt werden kann. Die Abweichungen hängen vom Ort am Boden 3 des Töpfchens 22 ab.
Die Schritte S1 und S2 dienen dazu, eine Helligkeitskorrekturangabe zu ermitteln. Sie sind in der Ausführungsform der 5 weiteren Schritten S3 und S4 vorgeordnet, von denen S3 zum Mikroskopieren der Probe (n) dient und Schritt S4 eine Helligkeitskorrektur ist. Die Schritte S1 und S2 müssen jedoch nicht zwangsläufig vor dem Schritt S3 ausgeführt werden. Es ist durchaus möglich, die Erzeugung der Helligkeitskorrekturangabe durch die Schritte S1 und S2 und die Helligkeitskorrektur in Schritt S4 auch zu einem späteren Zeitpunkt und gegebenenfalls sogar erst dann auszuführen, wenn sich herausgestellt hat, dass die Abbildung der Proben 14 ohne eine solche Korrektur nicht ausreichend möglich ist.
Im Schritt S3 wird ein Töpfchen 1 abgebildet, auf dessen Boden 3 sich Probe 14 befindet.
In einem Schritt S4 erfolgt eine Korrektur unter Verwendung der Helligkeitskorrekturangabe; Schritt S4 setzt also voraus, dass die Schritte S1 und S2 ausgeführt wurden. Die Korrektur geschieht dadurch, dass ermittelt wird, wo am Boden 3 das Probenbild 23b im Schritt S3 lag. Nach Ermitteln dieser Ortsinformation wird die Helligkeitskorrekturangabe, die für diesen Ort des Bodens 3 gilt, ermittelt, und das im Schritt S3 erzeugte Probenbild 23b wird zu einem korrigierten Probenbild 23c verbessert. Das verbesserte Probenbild 23c enthält eine homogenisierte Ausleuchtung des Bodens 3, die um Einflüsse des probengefäßbasierten Shadings bereinigt ist.
In der Ausführungsform wird das komplette Probengefäß - bei Mikrotiterplatten z. B. ein Töpfchen 1 - gescannt, z. B. in Form einer Kachelaufnahme mit Einzelbildern 23a. Idealerweise wird dabei ein Test-Töpfchen 22 ohne Probe 14 verwendet. Sofern es sich bei dem Probengefäß um ein Gefäß handelt, in dem sich die Probe in einem flüssigen Medium befindet, liegt bevorzugt das Medium auch im Test-Töpfchen 22 vor. Das zusammengesetzte Referenzbild 24 enthält folglich das probengefäßbasierte Shading.
Um das Shading aus einem Probebild 23b mit Probe 14 herauszurechnen, muss bekannt sein, an welcher Stelle des Bodens 3 das Probenbild 23b aufgenommen wurde. Dazu können Elemente des probengefäßbasierten Shadings im Probenbild 23b erkannt werden. Ist im Probenbild 23b z. B. ein Teil des Randes des Töpfchens 1 sichtbar, kann das aktuelle Objekt einem entsprechenden Ausschnitt 25 des Referenzbildes 24 zugeordnet und das Shading aus dem Probenbild 23b heraus gerechnet werden.
Die einfachste Methode besteht darin, die Intensitätswerte der Pixel des Probenbildes 23b durch die Intensitätswerte der Pixel des passenden Ausschnittes 25 des Referenzbildes 24 zu dividieren und anschließend das Ergebnis zu renormieren. Diese Rechnung kommt auch bei vielen Verfahren zur strahlengangbasierten Shading-Korrektur zum Einsatz. Der fundamentale Unterschied besteht hier darin, dass das passende Referenzbild 24 erst aus einem größeren Übersichtsbild in Abhängigkeit von der Beobachtungsposition ermittelt wird.
Auf diese Weise wird ein korrigiertes Probenbild 23c erhalten, das gegenüber dem Probenbild 23b um Einflüsse des probegefäßbasierten Shadings korrigiert ist.
In dieser Ausführungsform kann der Fall auftreten, dass eine eindeutige Lokalisierung der Lage des Probenbildes 23b am Boden 3 und damit die Wahl des Ausschnittes 25 nicht eindeutig möglich ist. Erkennt man z. B. keinen eindeutigen Probengefäßrand im Probenbild 23b, weil das Probenfeld den Rand gerade nicht mehr erfasst, kann das probengefäßbasierte Shading nach wie vor stark ausgeprägt sein, ohne dass offensichtlich ist, welcher der passende Ausschnitt des Referenzbildes 24 ist, der für die Shading-Korrektur verwendet werden sollte.
Doch auch in diesem Fall ist eine Korrektur möglich, sofern der Antrieb 21 des Probentisches 20 eine Lagenrückmeldung der Probenpositionierung hat. Dies erlaubt es, die xy-Koordinaten jedes Punktes zu speichern, an dem ein Einzelbild 23a für das Referenzbild 24 aufgenommen wurde, d.h. die xy-Positionen eines jeden Punktes im Referenzbild 24 sind bekannt. Wird jetzt das Test-Töpfchen 22 durch das Töpfchen 1 mit Probe 14 ersetzt, ändern sich die xy-Positionen mit Bezug auf das Töpfchen 1 nicht. Egal an welcher Stelle nun das Bild 23b aufgenommen wird, kann der passende Ausschnitt 25 aus dem Referenzbild 24 ermittelt und die Korrektur wie oben beschrieben durchgeführt werden.
Bei Probengefäßen mit mehreren gleichartigen Untereinheiten wie z. B. einer Mikrotiterplatte 11 mit vielen gleichen Töpfchen 1, genügt eine einzelne Untereinheit - also z. B. ein Töpfchen - als Referenzgefäß. Die einzelnen Untereinheiten sind in einem festen Raster angeordnet, das entweder aus den Herstellerangaben bekannt ist oder leicht selbst ausgemessen werden kann. Somit kann an jedem xy-Tischkoordinatenpaar, an dem ein Probenbild 23b aufgenommen wird, direkt auf die Position des Probenfeldes innerhalb des jeweiligen Töpfchens 1 geschlossen werden und der dazu passende Ausschnitt 25 im Referenzbild 24 ausgewählt werden. Ein möglicher Ablauf dazu ist in 7 am Beispiel einer Mikrotiterplatte 11 dargestellt.
In 7 sind Schritte, die dem Ablaufdiagramm der 5 entsprechen, mit demselben Bezugszeichen gekennzeichnet, wobei Unterschritte durch Anhängen eines Suffix gekennzeichnet sind. In einem Schritt S1.1 wird für das Test-Töpfchen 22 der Mittelpunkt (x₀, y₀) gesucht. Anschließend wird das Referenzbild 24 des Bodens 3 des Test-Töpfchens 22, z. B. durch eine Kachelaufnahme gewonnen.
Im Schritt S3 wird die Helligkeitsverteilung des Referenzbildes 24 in eine Helligkeitskorrekturangabe, beispielsweise die Abweichung von einem mittleren Helligkeitswert in Form eines additiven oder multiplikativen Korrekturfaktors umgerechnet. Diese Helligkeitskorrekturangabe ist abhängig von der Koordinate (x, y) im Referenzbild 24.
Der Schritt S2 sieht die Aufnahme des Probenbildes 23b an bestimmten Koordinaten (x, y) vor.
In einem Schritt S4 wir der Abstandsvektor r vom Zentrum des Probenbildes 23b zum Mittelpunkt des entsprechenden Töpfchen einberechnet.
In einem Schritt S4.2 wird für diesen Abstandsvektor r eine entsprechende Korrekturangabe für den ermittelten Ausschnitt 25 in der Helligkeitskorrekturangabe ermittelt.
Schritt S4.3 liefert schließlich die Korrektur des probengefäßbasierten Shadings, indem die Helligkeitskorrekturangabe für den Bereich, der durch den Abstandsvektor r hinsichtlich seines Zentrums definiert wurde, angewendet wird.
Die Helligkeitskorrekturangabe kann entweder die Form des Referenzbildes 24 oder die Form eines daraus errechneten Korrekturwertbildes, das bei Verknüpfung mit dem Referenzbild (entweder additiv oder multiplikativ) eine einheitliche Helligkeit hat, haben. Sieht man die Helligkeitskorrekturangabe als Referenzbild 24 vor, muss die Ermittlung der Korrekturfaktoren aus der Helligkeitsverteilung des entsprechenden Ausschnittes 25, der aus dem Referenzbild 24 extrahiert wurde, im Korrekturschritt S4 folgen. Enthält die Helligkeitskorrekturangabe hingegen bereits die Korrekturfaktoren, wurde also die Ermittlung der Korrekturfaktoren bereits am Referenzbild 24 ausgeführt, muss im Schritt S4 das nicht erneut erfolgen. Hinsichtlich der Bedeutung für die Korrektur des probengefäßbasierten Shadings sind somit die Begriffe Referenzbild 24 und Helligkeitskorrekturangabe entweder identisch (erste Option), oder das Referenzbild 24 stellt eine Vorstufe der Helligkeitskorrekturangabe (zweite Option) dar, wobei die Umrechnung eine einfache mathematische Operation (z. b. Ermittlung der multiplikativen oder additiven Abweichung von einem Mittelwert etc.) ist.
8 zeigt das Vorgehen bei der Ausführungsform der 7. Dargestellt ist das Referenzbild 24 als Helligkeitskorrekturangabe. 8 zeigt, den Ablauf der 7 noch einmal anhand des Referenzbildes 24. Im Referenzbild 24 ist das Zentrum 26 bekannt. Für ein Probenbild 23b ist der Abstandsvektor r bekannt. Er bezeichnet das Zentrum des Probenbildes 23b. Für diesen Abstandsvektor r wird nun im Referenzbild 24 der Ausschnitt 25 gesucht, der denselben Abstandsvektor r zum Zentrum und dieselben Ausdehnungen hat, wie das Probenbild 23b. Der Ausschnitt 25 ist dann der Ausschnitt aus dem Referenzbild (oder der Helligkeitskorrekturangabe), der für die Korrektur heranzuziehen ist.
Sind die Töpfchen kreisförmig, kann es in einer vereinfachten Ausführungsform genügen, für den Abstandsvektor r nur dessen Betrag zu ermitteln. Für eine Verbesserung dieser Ausführungsform wird der Betrag des Abstandsvektors nicht nur für das Zentrum, sondern für jedes Pixel ermittelt.
Eine weitere mögliche Ausführungsform besteht darin, das Referenzbild 24 (bzw. die Helligkeitskorrekturangabe) in absoluten Pixelkoordinaten des Referenzbildes 24 anzugeben, wobei diese Pixelkoordinaten z. B. durch Auswertung der Positionsrückmeldung des Antriebs 21 des Probentisches 20 gewonnen werden. Für ein Probenbild 23b, das zu korrigieren ist, werden dann lediglich die Ortskoordinaten der Pixel im Probenbild 23b ermittelt, wobei diese Ortsangaben auf das Referenzbild 24 (bzw. die Helligkeitskorrekturangabe) bezogen sind. Die Ortsangaben erlauben es dann, aus dem Referenzbild 24 (bzw. der Helligkeitskorrekturangabe) die entsprechenden Korrekturfaktoren für jedes Pixel auszulesen und anzuwenden.
Für die Erfindung kommen folgende Abwandlungen und Weiterbildungen in Frage:

Selbstverständlich muss das Referenzbild 24 nicht als zusammengesetztes Bild vorliegen. Es genügt auch, die entsprechenden Einzelbilder 23a abzuspeichern und aus ihnen je nach Bedarf das passende Korrekturbild für das Probenbild 23b zu errechnen.

Der dargestellte Ablauf muss nicht notwendigerweise in dieser Reihenfolge abgearbeitet werden. Beispielsweise kann das Referenzbild 24 erst nachträglich aufgenommen werden, um zu einem späteren Zeitpunkt die Shading-Korrektur der Probenbilder 23b vorzunehmen. Bisher wurde der Fall beschrieben, bei dem auf den Detektor 18 jeweils nur ein Teil des Töpfchens abgebildet wird und deshalb zur vollständigen Generierung des Referenzbildes 24 mehrere Einzelbilder 23a nötig sind. Bei hinreichend schwach vergrößernden Objektiven und hinreichend kleinen Probengefäßen, bzw. Töpfchen 1 kann jedoch auch mit einer einzelnen Aufnahme der komplette Boden 3 abgebildet werden; eine Kachelaufnahme ist nicht mehr nötig. Ansonsten bleibt der oben beschriebene Ablauf weiterhin gültig.
Handelt es sich bei dem Probengefäß um ein rundes Gefäß, ist es nicht nötig, das komplette Gefäß als Referenzbild 24 aufzunehmen, wenn der Effekt des Shadings, hervorgerufen durch den Gefäßrand, korrigiert werden soll. In diesem Fall ist anzunehmen, dass auch das Shading radialsymmetrisch ist, bezogen auf den Mittelpunkt des Gefäßes. Das ist z. B. bei Petrischalen oder kreisrunden Töpfchen 1 einer Mikrotiterplatte 11 der Fall. Es genügt dann, zur Referenz eine Linie vom Mittelpunkt des Gefäßes bis zum Rand aufzunehmen, l₀(r). Um daraus für ein Probenbild das passende Korrekturbild erzeugen zu können, wird noch der Abstand jedes Bildpixels r_p = (x,y) vom Töpfchenmittelpunkt r₀ benötigt, d.h. r = / r_p -r₀/. Ob aus diesen Abständen r für jedes Pixel direkt der Korrekturwert l₀(r) auf das Probenbild 23b angewendet wird, oder zunächst ein komplettes Referenzbild 24 erzeugt wird, mit dem das Probenbild dann verrechnet wird, spielt keine Rolle. In beiden Varianten lässt sich das probengefäßbasierte Shading aus dem Probenbild entfernen.
Abhängig von der verwendeten Objektivvergrößerung und der Größe des Probengefäßes kann das Referenzbild 24 aus sehr vielen Einzelbildern 23a bestehen, deren Aufnahme viel Zeit und deren Speicherung bzw. Verarbeitung viel Speicherplatz benötigt. Im allgemeinen werden aber unterschiedliche Objektive ein unterschiedlich ausgeprägtes probenabhängiges Shading zeigen. Das lässt sich anhand eines Töpfchens 1 einer Mikrotiterplatte 11 gut veranschaulichen. Wie bereits weiter oben erläutert, sorgt der Flüssigkeitsmeniskus 5 im Töpfchen 1 dafür, dass einfallende Strahlen hin zu höheren Winkeln gebrochen werden, insbesondere diejenigen, die in der Nähe des Töpfchenrandes den Boden 3 passieren. Ein Objektiv 17 mit einer schwachen NA kann dieses Licht häufig nicht mehr verwerten, der Töpfchenrand erscheint deutlich dunkler als das Zentrum. Hingegen sammelt ein Objektiv 17 mit einer höheren NA weit mehr dieses Lichts ein, weshalb die Randabschattung geringer ausfällt, das probengefäßbasierte Shading ist ein anderes. Der Unterschied besteht aber nur in der Stärke des Shadings, nicht in seiner Art. Mit beiden Objektiven misst man diese Shading-Stärke im gleichen Objektfeld, im Prinzip genügt dazu ein Bild in der Mitte des Gefäßes und eines am Rand, um daraus den Faktor zu errechnen, die beiden Shadings voneinander unterscheidet. Anschließend genügt es, mit dem schwächer vergrößernden Objektiv das Referenzbild 24 aufzunehmen und dieses auch für das stärker vergrößernde Objektiv unter Berücksichtigung des entsprechenden Shadingstärkefaktors zu verwenden. Auf diese Weise kann das Referenzbild 24 aus deutlich weniger Einzelbildern 23 a zusammengesetzt werden, was Zeit und Speicherplatz sowie Rechenleistung spart. Außerdem muss bei einem Objektivwechsel kein neues Referenzbild zur Korrektur des probengefäßbasierten Shadings aufgenommen werden.

Claims

Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe (14), die in einem Töpfchen (1) am Boden (3) des Töpfchens (1) anhaftet, wobei zur mikroskopischen Abbildung der Probe (14) folgende Schritte ausgeführt werden: (a) das Töpfchen (1) wird mit Beleuchtungsstrahlung (2) beleuchtet und (b) der beleuchtete Boden (3) des Töpfchens (1) wird von der Unterseite (15) her vergrößernd abgebildet und ein Bild (23a) des beleuchteten Bodens (3) aufgenommen, dadurch gekennzeichnet, dass eine töpfchenverursachte Ungleichmäßigkeit der Beleuchtung des Bodens (3) ausgeglichen wird, indem (c) ein probenloses Test-Töpfchen (22) bereitgestellt wird, das bis auf die fehlende Probe dem zu mikroskopierenden Töpfchen (1) entspricht, (d) an dem Test-Töpfchen (22) eine Referenzmessung mittels der Schritte (a) und (b) durchgeführt wird, wobei ein Referenzbild (24) aufgenommen wird, das den gesamten Boden (3) zeigt, (e) im Referenzbild (24) wird eine Helligkeitskorrekturangabe ermittelt, wobei die Helligkeitskorrekturangabe eine Helligkeitsschwankung als Funktion des Ortes auf dem Boden (3) des Test-Töpfchens (22) angibt, (f) das Bild (23b) des Bodens (3) des probenenthaltenden Töpfchens (1) wird mittels der Helligkeitskorrekturangabe korrigiert, wobei die Lage des Bildes (23b) am Boden (3) ermittelt und der zu dieser Lage gehörende Wert der Helligkeitskorrekturangabe verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (d) mehrere Einzelbilder (23a) den gesamten Boden (3) des Töpfchens (1) abdecken und zu dem Referenzbild zusammengefügt werden und die Helligkeitskorrekturangabe die Helligkeitsschwankung im Referenzbild (24) als Funktion des Ortes angibt, und in Schritt (e) für das Bild des Bodens (3) ein zugeordneter Ausschnitt (25) im Referenzbild (24) und daraus die für diesen Ausschnitt (25) geltende Helligkeitskorrekturangabe ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Helligkeitskorrekturangabe die Helligkeitsschwankung als Funktion einer Lage zum Zentrum des Bodens (3) angibt.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Töpfchen einen runden Querschnitt hat und dass die Funktion ausschließlich eine radiale Koordinate ist, die den Abstand vom Zentrum des Bodens (3) bezeichnet.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Töpfchen (1) bei der in Schritt (b) erfolgenden Abbildung mittels eines Probenverstellmechanismus' (20, 21) relativ zu einer optischen Achse (OA) bewegt wird und dass die Helligkeitskorrekturangabe die Helligkeitsschwankung als Funktion der Einstellung des Probenverstellmechanismus' (20, 21) angibt, insbesondere als Funktion einer Koordinate (x,y).
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Helligkeitskorrekturangabe die Helligkeitsschwankung als Funktion eines in Schritt (b) verwendeten Objektivs (17) angibt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass für die Abbildung in Schritt (b) mehrere Objektive (17) mit unterschiedlicher numerischer Apertur zur Verfügung stehen, die Referenzmessung in Schritt (d) mit einem der Objektive (17), bevorzugt dem mit der kleinsten numerischen Apertur, durchgeführt werden und dass die Helligkeitskorrekturangabe die Helligkeitsschwankung als Funktion eines Shadingstärkefaktors angibt, der von der numerischen Apertur des für die Abbildung der probenenthaltenden Töpfchen (1) verwendeten Objektivs (17) abhängt.