DE102009021681A1

DE102009021681A1 - Staphylococcus aureus bindende Peptide, deren Verwendung und Verfahren und Kits zur Anreicherung, Immobilisierung und zum Nachweis von Staphylococcus aureus

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Publication number: DE102009021681A1
Application number: DE200910021681
Authority: DE
Inventors: Thidarat Juthong; Philipp Weber; Elke Dr.rer.nat.Ing.habil Boschke; Juliane Dr.-Ing. Steingroewer
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2009-05-13
Filing date: 2009-05-13
Publication date: 2010-11-25
Anticipated expiration: 2029-05-14
Also published as: DE102009021681B4

Abstract

Staphylococcus aureus bindendes Peptid, das einen mindestens acht Aminosäuren langen Abschnitt aus einer Aminosäuresequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 13 enthält.

Description

Die Erfindung betrifft Peptide, die affin an die Oberfläche bzw. die extrazellulären Strukturen von Staphylococcus aureus binden, die Verwendung dieser Peptide zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Staphylococcus aureus sowie Verfahren und Kits zur Anreicherung und zum Nachweis von Staphylococcus aureus. Die Erfindung betrifft weiterhin die Kopplung von therapeutisch wirksamen Substanzen an diese Peptide.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind insbesondere die Medizin, Tiermedizin Krankenhäuser, andere Gesundheits- und Pflegeeinrichtungen sowie weitere Gebiete mit hohen Hygienestandards, so z. B. die Lebensmittel- und Pharmaindustrie.
Staphylococcus aureus hat eine kugelförmige Morphologie, bei einem Durchmesser der Zellen von 0,8–1,2 μm. Es gehört zu den Gram-positiven Bakterien und ist nicht in der Lage, Endosporen zu bilden. Staphylococcus aureus ist ubiquitär verbreitet und besiedelt u. a. Schleimhäute. Unter Umständen kann Staphylococcus aureus pathogen sein und induziert Hautinfektionen, Lungenentzündungen, Endokarditis, Toxisches Schock-Syndrom und Sepsis.
Zum Nachweis von Staphylococcus aureus kommen derzeit verschiedene, z. T. in die amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG aufgenommene Untersuchungsmethoden zur Anwendung. Dabei handelt es sich um kulturelle, immunologische bzw. molekularbiologische Nachweisverfahren. Es ist möglich, diese Verfahren zu kombinieren.
Die konventionelle Detektion von Staphylococcus aureus, auch in Lebensmitteln, wird in der Regel folgendermaßen durchgeführt:

– Voranreicherung
– Isolierung auf Selektivnährböden
– Selektiv-Anreicherung in Flüssigkultur
– Koagulase-Test
– Biochemische Identifizierung

Auch die MPN ist eine etablierte Methode.
Bis zum ersten Ergebnis nach Isolierung der Keime auf Selektivnährböden wird ein Untersuchungszeitraum von mindestens 4 bis 6 Tagen benötigt.
Neben den klassischen Tests kommen auch immunologische Nachweisverfahren, wie Immunfluoreszenztests oder ELISA zum Einsatz.
Für den molekularbiologischen Nachweis von Staphylococcus aureus stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Er kann beispielsweise mittels Gensonden im Zuge der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung oder mit der Polymerase-Kettenreaktion erfolgen.
Den genannten modernen Verfahren ist der Nachteil eigen, dass die Sensitivität nicht ausreichend hoch ist, d. h. die Keime müssen nach wie vor auf eine Zellzahl größer als das notwendige Detektionslimit angereichert werden.
Mit Hilfe von superparamagnetischen, mit entsprechenden Liganden, z. B. Antikörpern, beschichteten Partikeln ist ein Aufkonzentrieren der Keime möglich.
Für den Nachweis und die Charakterisierung von Mikroorganismen und deren Dauerformen (Sporen) werden als nachzuweisende Zielmoleküle neben den von den Zellen ausgeschiedenen Stoffwechselprodukten und anderen Zellbestandteilen oder Molekülen auch die Zellen selbst verwendet. Hierzu werden die Zellen nach dem Stand der Technik mit speziellen Immunoglobulinen (Antikörpern), aber auch anderen bindenden Molekülen (z. B. Lektinen) markiert. Diesen Molekülen ist gemeinsam, dass sie spezielle Zellstrukturen erkennen und daran binden. Dabei ist die Selektivität des Nachweisverfahrens sehr stark von den zur Markierung eingesetzten Molekülen abhängig, weshalb z. B. der Einsatz von Lektinen bei Systemen mit einer hohen Diversität der stofflichen Zusammensetzung ungeeignet ist.
Auch der Einsatz von Antikörpern für Nachweisverfahren hat einige Nachteile. Zunächst müssen spezifische Antikörper hergestellt werden. Dies geschieht zunächst durch Immunisierung von Tieren mit dem Zielantigen oder einem Bestandteil daraus. Hierbei ist jedoch nicht sichergestellt, dass die gewünschte Immunantwort auch erzielt wird. Falls eine Immunantwort stattgefunden hat und das Serum nach einiger Zeit einen genügend hohen Titer an spezifischen Antikörpern gegen das Zielantigen aufweist, werden B-Lymphozyten und Antikörper aus dem Blut des Tieres isoliert und mittels bekannter Methoden aufgereinigt. Diese Antikörper werden unabhängig von ihrem Reinheitsgrad als polyklonale Antikörper bezeichnet. Sie reagieren auf alle Antigene, zu denen das Tier bis zum Zeitpunk der Isolation Kontakt hatte und auf die eine Immunantwort erfolgt ist. Unerwünschte Kreuzreaktionen mit fremden, den Zielantigenen nicht unbedingt verwandten Antigenen werden daher häufig beobachtet und stellen einen wesentlichen Nachteil dar. Die Antikörper können zwar in weiteren Arbeitsschritten für ein bestimmtes Antigen angereichert werden, dies ist jedoch extrem zeitaufwändig und mit hohen Kosten verbunden. Ein weiterer Nachteil polyklonaler Antikörper liegt in der begrenzten Lebensdauer der B-Lymphozyten. Diese können nicht kultiviert werden und sterben nach einer gewissen Zeit ab. Zwischen verschiedenen Chargen polyklonaler Antikörper gibt es daher immer unerwünschte Qualitätsschwankungen.
Des Weiteren ist es möglich, durch entsprechende Fusionstechniken einzelne Antikörper produzierende B-Lymphozyten mit einer Tumor-Zellinie zu Hybridoma-Zelllinien zu verschmelzen. Die entstehenden Hybridoma-Zellen können in vitro kultiviert werden. So lassen sich monoklonale Antikörper in Zellkulturen gewinnen. Die Hybridoma-Techniken sind jedoch langwierig und teuer. Die Entwicklung neuer monoklonaler Antikörper erfolgt in mehreren Teilschritten: Immunisierung, Fusion, Selektion, Screening und Charakterisierung. Eventuell folgen weitere Modifikationen, die die Eigenschaften der monoklonalen Antikörper verbessern. Zudem ist es nicht in allen Fällen ohne Probleme möglich, Antikörper gegen das Zielantigen zu gewinnen, besonders wenn es sich hierbei um ganze, intakte Zellen handelt. Teilweise kommt es auch zum Absterben der Hybridoma-Zelllinie. Dies stellt einen weiteren Nachteil dar, da entsprechende Kopplungsprotokolle für Nachweisverfahren zeitaufwändig neu etabliert werden müssen.
Aufgabe der Erfindung ist es, einfache, sensitive, spezifische und möglichst schnell durchführbare Verfahren zur Anreicherung, Immobilisierung, Markierung und/oder zum Nachweis von Staphylococcus aureus anzugeben, die nicht auf der Verwendung von Antikörpern basieren. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, die entsprechenden Nachweisreagenzien und Kits zur Durchführung dieser Verfahren anzugeben.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein oder mehrere Staphylococcus aureus bindende Peptide, das oder die einen mindestens zwölf Aminosäuren langen Abschnitt aus einer Aminosäuresequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 13 enthält.
Vorzugsweise ist die Aminosäuresequenz des Peptids eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 13.
Die erfindungsgemäßen Peptide binden überraschend affin und spezifisch an die Oberfläche bzw. an extrazelluläre Strukturen von Staphylococcus aureus und sind daher geeignet, in Anreicherungs- bzw. Nachweisverfahren zur Anreicherung und/oder zum Nachweis von Staphylococcus aureus eingesetzt zu werden.
Die aufwändige Herstellung und Verwendung von Antikörpern in entsprechenden Nachweisverfahren kann so auf vorteilhafte Weise vermieden werden. Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich zudem mit herkömmlichen Syntheseverfahren leicht und in sehr hoher Reinheit herstellen. Daher kann eine gleichbleibende, chargenunabhängige Produktqualität erzielt werden, insbesondere im Hinblick auf die Reinheit und Stabilität. Die Handhabung der in Immobilisierungs- und/oder Nachweisverfahren einzusetzenden Reagenzien wird ebenfalls vereinfacht, so dass insgesamt die Immobilisierung und/oder der Nachweis von Staphylococcus aureus schneller, mit höherer Reproduzierbarkeit und mit geringerem Gesamtaufwand ermöglicht wird. Zudem ist es einfacher, Nachweis- und/oder Immobilisierungsverfahren zu miniaturisieren und zu automatisieren, in denen statt Antikörpern Fängerpeptide verwendet werden.
Bevorzugt sind solche Peptide, die einen zumindest 10 Aminosäuren, bevorzugt 12 Aminosäuren, langen Ausschnitt einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 und/oder SEQ ID NO. 4 und/oder SEQ ID NO. 8 umfassen. Diese Peptide haben sich als besonders geeignet zum Binden an Staphylococcus aureus herausgestellt. Sie können auch in komplexen Proben spezifisch und mit hoher Ausbeute an Staphylococcus aureus binden.
Besonders bevorzugt sind Peptide der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 und SEQ ID NO. 4 und SEQ ID NO. 8 Diese Peptide sind besonders spezifisch für Staphylococcus aureus und weisen eine hohe Affinität für diesen Mikroorganismus auf. Sie sind daher in besonderer Weise geeignet, an Staphylococcus aureus in Proben zu binden.
Die erfindungsgemäßen Peptide besitzen eine Affinität für Staphylococcus aureus. Sie sind daher gut zur Verwendung als Sonden für Staphylococcus aureus einsetzbar. Dazu werden sie vorteilhafterweise mit einem leicht nachweisbaren Marker versehen. Geeignete Marker (wie z. B. Biotin, Fluoreszenzfarbstoffe oder auch Radionukleotide) sind dem Fachmann aus zahlreichen Anwendungen, beispielsweise aus ELISA, bekannt.
Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein erfindungsgemäßes Peptid, das einen detektierbaren Marker enthält.
Durch die Kopplung an den detektierbaren Marker eignen sich die erfindungsgemäßen Peptide vorteilhaft zur spezifischen Markierung und zum spezifischen Nachweis von Staphylococcus aureus
Bei dem detektierbaren Marker handelt es sich bspw. um partikuläre Marker (z. B. Goldpartikel), Fluorochrome, Isotope, Markerproteine, wie z. B. fluoreszierende Proteine (z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP)), Amplifikatoren, z. B. Enzyme, die eine Reaktion katalysieren, welche ein Signal in Form eines sichtbaren Farbstoffpräzipitates, einer sichtbaren Farbstoffabspaltung oder Chemo- bzw. Biolumineszenz liefert.
Die verschiedenen detektierbaren Marker werden mittels bekannter Verfahren an das erfindungsgemäße Peptid gekoppelt. Werden beispielsweise GFP oder enzymatisch aktive Amplifikatoren als detektierbare Marker eingesetzt, erfolgt die Kopplung des Peptides an den Marker geeigneterweise durch Fusion der für das Peptid kodierenden DNA-Sequenz mit der DNA-Sequenz von GFP bzw. des enzymatisch aktiven Amplifikators mittels üblicher gentechnischer Verfahren.
Es ist auch möglich, den Marker erst nach der Bindung an Staphylococcus aureus am Peptid anzubringen. Dies kann beispielsweise durch Vermittlung eines Linkers wie Biotin-Streptavidin bzw. Biotin-Avidin geschehen, indem das Peptid z. B. biotinyliert ist. Nach der Bindung des Peptids an Staphylococcus aureus werden Streptavidin und die biotinylierte katalytisch wirkende Einheit zugegeben. Streptavidin vermittelt dann die Bindung der katalytisch wirkenden Einheit an das Peptid.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid an einen Träger gebunden.
Bei dem Träger handelt es sich bevorzugt um eine feste Phase, insbesondere können die in bekannten Anreicherungs- bzw. Nachweisverfahren verwendeten festen Träger eingesetzt werden, z. B. Mikrotiterplatten, Biochips oder Dip-Sticks.
Als feste Träger geeignet sind Metallkörper, beispielsweise Goldfolien und goldbeschichtete Träger wie z. B. in Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (Surface Plasmon Resonance, SPR)-Systemen. Ferner können Kunststoffkörper bzw. kunststoffbeschichtete Körper als feste Träger verwendet werden, bspw. Polystyrol- oder Polymethylmethacrylat-Träger. Daneben können auch Glasträger, Gele oder andere, zur Herstellung von Biochips geeignete Träger, verwendet werden.
Indem das erfindungsgemäße Peptid an einen festen Träger gebunden ist, wird es auf vorteilhaft einfache Weise möglich, Staphylococcus aureus aus Proben zu immobilisieren, zu gewinnen und/oder z. B. für die nachfolgende Detektion anzureichern bzw. Staphylococcus aureus zu detektieren.
Das erfindungsgemäße Peptid wird durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren an den festen Träger gebunden, bspw. durch Adsorption an den festen Träger. Ein mit einer Beschichtung versehener Träger bewirkt ebenfalls die Bindung des Peptids, z. B. bindet ein mit Streptavidin beschichteter Träger das Peptid nach dessen Biotinylierung. Andere mögliche Beschichtungen zum Binden eines Peptids sind z. B. Serumalbumin oder Cystamindihydrochlorid ggf. in Kombination mit N-succinimidyl-3-maleimidopropionat. Das Peptid kann auch mit einem Nukleinsäure-Linker verbunden sein und in dieser Form an den Träger gebunden werden. Das Peptid kann weiterhin mit einem Oligonukleotid verbunden sein, das über ein an dem festen Träger gebundenes komplementäres Oligonukleotid die Bindung des Peptids an den Träger vermittelt.
Besonders vorteilhaft ist die Immobilisierung der erfindungsgemäßen Peptide an eine bewegliche feste Phase als Träger, wie z. B. bei der biomagnetischen Separation. Hierbei werden die Peptide mittels kovalenter Bindung beispielsweise über Amino- oder Carboxylgruppen an superparamagnetische Mikro- bzw. Nanopartikel (Beads) gekoppelt. Die Beads lassen sich durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes leicht mit den über die erfindungsgemäßen Peptide immobilisierten Staphylococcus aureus-Zellen aus Lösungen und Aerosolen abtrennen. Zudem besitzen die Beads eine hohe massenspezifische Oberfläche, so dass ein hoher Anteil des Probenvolumens in Kontakt mit dem Träger tritt. Die verwendeten Materialien sind preiswert und die Handhabung ist einfach In einer weiteren Ausgestaltung ist das erfindungsgemäße Peptid an ein pharmazeutisch wirksames Agens gebunden. Dieses kann auch eingeschlossen sein, z. B. in Mikrokapseln oder Hydrogele.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Nutzung dieser an pharmazeutisch wirksame Agenzien gekoppelten Peptide für therapeutische Zwecke.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Verfahren zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Staphylococcus aureus Die Durchführung dieser Verfahren erfolgt bevorzugt in festen und flüssigen Stoffsystemen zur Diagnostik und Analyse von Staphylococcus aureus
Ein bevorzugtes Verfahren zur Anreicherung bzw. Immobilisierung von Staphylococcus aureus aus einer Probe umfasst die folgenden Schritte:

a) Bindung mindestens eines erfindungsgemäßen Peptides an einen Träger und
b) Kontaktieren des trägergebundenen Peptides mit der zu untersuchenden Probe, um ein Binden des Peptides an Staphylococcus aureus zu ermöglichen.

Das erfindungsgemäße Peptid bindet sowohl an den Träger als auch an die zu immobilisierenden bzw. nachzuweisenden Staphylococcus aureus-Zellen. Dadurch stellt es auf vorteilhaft einfache Weise eine stabile und spezifische Verbindung zwischen dem Träger und den zu immobilisierenden bzw. nachzuweisenden Staphylococcus aureus-Zellen her. Die immobilisierten Staphylococcus aureus-Zellen können anschließend einfach von der Probe abgetrennt werden, beispielsweise indem der Träger absedimentiert, abzentrifugiert oder durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes abgetrennt wird.
Wenn der Träger ein Gefäß zur Aufnahme der Probe selbst ist, bspw. in Form einer Mikrotiterplatten-Vertiefung, so können die gebundenen Staphylococcus aureus-Zellen durch Waschen des Gefäßes mit einer entsprechenden Waschlösung von der übrigen Probe abgetrennt und somit aufgereinigt und angereichert werden.
Dabei ist die Reihenfolge, in der die Schritte a) und b) durchgeführt werden, nicht festgelegt. Es hat sich gezeigt, dass die Bindung von Peptiden an einen zu immobilisierenden Mikroorganismus behindert sein kann, wenn das Peptid vor der Bindung an den Mikroorganismus bereits an den festen Träger gebunden ist. In einem solchen Fall ist es vorteilhaft, den Schritt b) vor oder gleichzeitig mit dem Schritt a) durchzuführen, indem beispielsweise das Peptid und die zu untersuchende Probe durch Mischen miteinander in Kontakt gebracht werden, und gleichzeitig oder anschließend der Träger mit der Mischung in Kontakt gebracht wird. Wenn jedoch der Schritt a) vor dem Schritt b) durchgeführt wird, beispielsweise indem ein erfindungsgemäßes an einen Träger gebundenes Peptid wie zuvor beschrieben verwendet wird, so kann derselbe Träger mehrfach zum Immobilisieren von Mikroorganismen aus mehreren Proben oder zum Immobilisieren von Mikroorganismen aus einem Probenstrom verwendet werden. Ein solches Vorgehen kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn die zu untersuchenden Proben nur geringe Konzentrationen des nachzuweisenden Mikroorganismus besitzen, oder wenn die Proben zahlreiche Begleitsubstanzen enthalten, die unspezifisch an den festen Träger binden oder auf andere Weise die Bindung der Peptide an den nachzuweisenden Mikroorganismus stören.
Das erfindungsgemäße Anreicherungsverfahren erlaubt es, auch aus stark verdünnten Proben genügend hohe Zellzahlen von Staphylococcus aureus zu isolieren, um einen sicheren und spezifischen Nachweis von Staphylococcus aureus zu ermöglichen.
Die Peptide werden mittels dem Fachmann bekannter Verfahren bevorzugt an eine feste Phase als Träger gebunden. Als feste Phase werden vorzugsweise superparamagnetische Mikro- oder Nanopartikel (Beads) verwendet. Nach Kontakt mit einer Probe immobilisieren die Peptide durch ihre spezifische Bindungsfähigkeit die in der Probe enthaltenen Staphylococcus aureus-Zellen an die Trägerphase.
Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis von Staphylococcus aureus in einer Probe mit den Schritten

a) Kontaktierung der Probe mit mindestens einem erfindungsgemäßen Peptid, das einen detektierbaren Marker enthält, um ein Binden des Peptids an die nachzuweisenden Staphylococcus aureus-Zellen zu ermöglichen
b) Nachweis des detektierbaren Markers des Peptides.

Das Nachweisverfahren ermöglicht einen spezifischen und sensitiven Nachweis von Staphylococcus aureus auch in komplexen Proben.
Das Verfahren zum Nachweis des detektierbaren Markers richtet sich nach dem eingesetzten Marker.
Wie schon bei den zuvor beschriebenen Immobilisierungs- und Anreicherungsverfahren steht die Reihenfolge, in der die Schritte a) und b) durchgeführt werden, im Belieben des Fachmanns. Dieser kann anhand der Umstände des Einzelfalles leicht selbst entscheiden, welche Reihenfolge die besten Nachweisergebnisse liefert.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform des Nachweisverfahrens werden die in der Probe vorhandenen Staphylococcus aureus-Zellen vor dem Nachweisen des detektierbaren Markers mittels des erfindungsgemäßen Immobilisierungs- bzw. Anreichungsverfahrens aus der Probe angereichert bzw. an einem Träger immobilisiert.
Dazu erfolgt zunächst die Immobilisierung von Staphylococcus aureus-Zellen an erfindungsgemäßen trägergebundenen und nicht markierten Peptiden. Nach einem Waschschritt zur Entfernung der ungebundenen Probenbestandteile (Antigene, andere Zellen) wird ein weiteres erfindungsgemäßes nicht an einen Träger gebundenes Peptid mit einem detektierbaren Marker zugegeben, das an die Targets auf den nun ebenfalls an die feste Phase immobilisierten Zielzellen bindet und diese auf die oben beschriebene Art und Weise nachweist.
Auf diese Weise kann der nachzuweisende Mikroorganismus ohne großen Aufwand auch in stark verdünnten Proben oder in Proben mit den Nachweis stark störenden Begleitsubstanzen zuverlässig und mit hoher Sensitivität nachgewiesen werden.
Zweckmäßigerweise wird das Nachweisverfahren und/oder das Immobilisierungs- bzw. Anreicherungsverfahren in Form eines miniaturisierten Assays durchgeführt. Beispielsweise können verschiedene zu untersuchende Proben jeweils in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben und dort einem für die jeweilige Vertiefung spezifisch ausgestalteten Nachweisverfahren unterzogen werden. Auf diese Weise können große Probenmengen parallel verarbeitet werden.
Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Peptids zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Staphylococcus aureus.
Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch Testkits zur spezifischen Markierung, zum Nachweis, zur Immobilisierung und zur Anreicherung von Zellen, die neben den üblichen Bestandteilen mindestens eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide enthalten.
Ein bevorzugtes Kit zum Anreichern von Staphylococcus aureus enthält mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid und einen Träger, wobei das Peptid bevorzugt an den Träger gebunden ist.
Mit einem solchen Kit wird dem Fachmann auf einfache Weise eine Reagenzienzusammenstellung an die Hand gegeben, um die Bindung eines erfindungsgemäßen Peptids an einen festen Träger ohne großen Aufwand zu ermöglichen. Damit vereinfacht ein solcher Kit die Durchführung eines erfindungsgemäßen Immobilisierungs- bzw. Anreicherungsverfahrens. Partikelförmige feste Träger wie z. B. magnetische Beads (bevorzugt superparamagnetische Mikro- oder Nanopartikel) sind wegen der genannten Vorteile besonders bevorzugt.
Ein bevorzugtes Kit zum Nachweis von Staphylococcus aureus enthält mindestens ein mit einem detektierbaren Marker gekoppeltes erfindungsgemäßes Peptid.
Bestandteil der Erfindung sind auch Nukleinsäuren, die mindestens einen für eines der erfindungsgemäßen Peptide kodierenden Abschnitt enthalten. Vorteilhaft ermöglichen es die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die erfindungsgemäßen Peptide auf einfache Weise herzustellen, beispielsweise indem die für die Peptide kodierenden Nukleinsäuren in geeignete Organismen (z. B. Escherichia coli) eingebracht und die Peptide so rekombinant gewonnen werden.
In besonders bevorzugten Nukleinsäuren ist der für das erfindungsgemäße Peptid kodierende Abschnitt mit einer für ein Markerprotein kodierenden Nukleinsäure verbunden, so dass ein Fusionsprotein aus dem erfindungsgemäßen Peptid und dem Markerprotein, z. B. GFP und/oder einem enzymatisch aktiven Amplifikator gebildet wird.
Vorzugsweise enthalten die Nukleinsäuren mindestens eine der Sequenzen SEQ ID NO. 14 bis SEQ ID NO. 26:
Die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 14 kodiert dabei für ein Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 1, die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 15 für ein Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 usw.
Ausführungsbeispiele
Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert, ohne diese einzuschränken.
Darin werden folgende Abkürzungen verwendet:

CFU: Kolonie bildende Einheiten (clony forming units)
M: mol/l
RT: Raumtemperatur

Ausführungsbeispiel 1:
Erfindungsgemäß konnte ein Pool von Peptiden zur bioaffinen, spezifischen Bindung an Staphylococcus aureus mittels der Phagendisplay-Technik ermittelt werden. Dazu wurde eine kommerziell erhältliche M13 Phagenbibliothek (Ph.D.-12, New England Biolabs) eingesetzt, die an der Oberfläche der Phagen zufällige Peptide mit einer Länge von 12 Aminosäuren präsentiert. Die Peptide werden zusammen mit einem kurzen Spacer (Gly-Gly-Gly-Ser) am N-terminalen Ende des Hüllproteins gpIII expressiert (Typ 3 Bibliothek). Die Bibliothek hat laut Herstellerangaben eine Diversität von 2,7·10⁹ verschiedenen Peptidsequenzen. In mehreren Panningrunden wurden die an Staphylococcus aureus bindenden Phagen isoliert. Zur Erhöhung der Spezifität wurden außerdem entsprechende Subtraktionsrunden durchgeführt.
Die DNA der spezifisch bindenden Phagen wurde isoliert, mittels PCR vervielfältigt, aufgereinigt und anschließend von der Firma Seglab GmbH sequenziert.
Ausführungsbeispiel 2:
Die ausgewählten Peptide wurden synthetisiert (Seglab GmbH) und an paramagnetischen Aminobeads (Dynal) immobilisiert.
Ausführungsbeispiel 3:
Für die biomagnetische Separation der Staphylococcus aureus-Zellen wurde zunächst eine Übernachtkultur von Staphylococcus aureus DSM 1104 angelegt.
Die Zellkonzentration der Kultur wurde mittels Zählkammer ermittelt, die Zellkonzentration im Test durch Verdünnung mit Phosphate-buffered saline (0,01 M; pH 7,4) auf einen Wert von 10³ CFU ml^–1 eingestellt.
Aliquots von 100 μl der verdünnten Zellsuspension wurden in einem 2 ml Reaktionsgefäß mit je 100 μl der mit Peptid SA02 (SEQ ID NO. 2) beladenen Magnetbeads 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Bead-Zellverbände im magnetischen Feld (MPC^®-S, Dynal) aus der flüssigen Phase abgeschieden. Der Überstand wurde entfernt. Das Bead-Zell-Pellet wurde 4-mal mit 500 μl PBS-Tween (0,01 M; pH 7,4; 0,05% Tween 20) gewaschen und in 100 μl PBS resuspendiert.
Zur Bestimmung des Anteils der separierten Zellen wurden je 100 μl des resuspendierten Bead-Zell-Pellets auf PCA-(Merck)-Platten ausgestrichen. Gleichzeitig wurden 100 μl der verdünnten Übernachtkultur als Referenz zur Ermittlung des Anteils separierter Zellen ausgestrichen.
Die Ergebnisse der Biomagnetischen Separation für eine Versuchsserie mit dem Peptid SA02 (SEQ ID NO. 2) sind in 1 dargestellt.
1 zeigt die Abscheideraten in Abhängigkeit von der Beadkonzentration (5 × 10⁵ to 1 × 10⁷) im Test. (n = 3)
In den Versuchen hat sich gezeigt, dass es mit Hilfe der isolierten Ligandenpeptide möglich ist, Staphylococcus aureus erfolgreich aus flüssiger Phase zu isolieren.
Ausführungsbeispiel 4:
Zur Anwendung kam das SPR-Analysesystem des Fraunhofer-Instituts für Angewandte Optik und Feinmechanik, Jena (IOF-SPR).
Die Chips wurden wie folgt vorbereitet:

• Reinigung der Goldoberfläche mit 65% HNO₃,
• Funktionalisierung mit DTSSP bei 4°C über Nacht,
• Immobilisierung von je 50 μl Protein A (2 μg/μl) bzw. Casein (0,5 μg/μl) für 1 h bei RT,
• Blocken mit 50 μl Casein (0,5 μg/μl) für 1 h bei RT,
• Blocken mit 50 μl 0,1 M Tris-HCl für 1 h bei RT.

Parameter	Gewählte Versuchsbedingungen
Vorwäsche mit PBS	1 ml
Probenvolumen (Peptid SA01 (SEQ ID NO. 1) 4 mg/ml)	90 μl
Zwischenwäsche mit PBS	105 μl
Anzahl der Durchläufe	50
Volumen eines Durchlaufs	65 μl
Flussgeschwindigkeit	300 μl/min
Temperatur	30°C

2 zeigt SPR-Signale in Abhängigkeit von dem gewählten Liganden (Protein A und Casein) und Peptid SA01 (SEQ ID NO. 1) (4 mg/ml) als Analyt.
Es konnte nachgewiesen werden, dass Peptid SA01 (SEQ ID NO. 1) in der Lage ist, im Gegensatz zu Casein an das Staphylococcus aureus Protein A zu binden (2).

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Staphylococcus aureus bindendes Peptid, das einen mindestens acht Aminosäuren langen Abschnitt aus einer Aminosäuresequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 13 enthält.
Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Peptids eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 13 ist.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es einen detektierbaren Marker enthält.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es an einen Träger gebunden ist.
Peptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass superparamagnetische Mikro- oder Nanopartikel (Beads) als Träger verwendet werden.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es an ein pharmazeutisch wirksames Agens gebunden ist.
Verfahren zur Immobilisierung und/oder Anreicherung von Staphylococcus aureus aus einer Probe mit den folgenden Schritten: a. Binden mindestens eines Peptides nach einem der Ansprüche 1 oder 2 an einen Träger b. Kontaktieren des trägergebundenen Peptides mit der Probe.
Verfahren zum Nachweis von Staphylococcus aureus in einer Probe mit den folgenden Schritten: a. Kontaktieren mindestens eines markierten Peptides nach Anspruch 3 mit der Probe b. Nachweisen des detektierbaren Markers des Peptides.
Verwendung mindestens eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Staphylococcus aureus.
Kit zum Anreichern von Staphylococcus aureus, mindestens enthaltend: a. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und b. einen Träger.
Kit zum Nachweis von Staphylococcus aureus, mindestens enthaltend ein Peptid nach Anspruch 3.
Nukleinsäure mit einem für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 2 kodierenden Abschnitt.
Nukleinsäure nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Abschnitt mit einer Sequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO. 14 bis SEQ ID NO. 26 umfasst.