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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, welcher gentechnisch gegenüber
dem Wildtyp modifiziert und zur Herstellung von organischen Säuren,
insbesondere Bernsteinsäure, geeignet ist, Verwendungen eines
solchen Mikroorganismus sowie Verfahren zu dessen Herstellung.
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Stand der Technik und Hintergrund
der Erfindung
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Dicarbonsäuren
haben ein großes ökonomisches Potential, weil
sie als Vorläufersubstanzen für zahlreiche Chemikalien
verwendet werden können. Zum Beispiel dient Bernsteinsäure
als Vorstufe für die Herstellung von Kunststoffen auf der
Basis von 1,4-Butanediol, Tetrahydrofuran und Gamma-Butyrolacton.
Bernsteinsäure wird heute chemisch durch katalytische Hydrierung
von Maleinsäureanhydrid zu Bersteinsäureanhydrid und
nachfolgender Wasseranlagerung, bzw. durch direkte katalytische
Hydrierung von Maleinsäure hergestellt.
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Bernsteinsäure
wird auch von vielen Mikroorganismen ausgehend von Zuckern oder
Aminosäuren unter physiologischen Umgebungsbedingungen
gebildet. Unter anaeroben Bedingungen werden in der Regel neben
Bernsteinsäure weitere Gärendprodukte wie Ethanol,
Milchsäure, Essigsäure und Ameisensäure
gebildet. Die Biosynthese von Bernsteinsäure mit ihrem
hohen Sauerstoffanteil erfordert eine reduktive CO2-Fixierung.
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Bernsteinsäure
ist ein Metabolit, der normalerweise durch anaerobe Fermentationsprozesse
angereichert wird. Während die Ausbeute und Anreicherung
des Produktes unter anaeroben Bedingungen vielfach besser ist als
unter aeroben Bedingungen, liegt der Nachteil in einem ausschließlich
anaeroben Prozess in einer technischen Begrenzung der Biomassen-Herstellung
und einer geringen Produktivität des mikrobiellen Produzenten.
Somit ist ein relativ geringer Biomassen/Produkt Wirkungsgrad die
Folge. Zudem ist es schwierig, strikt anaerobe Mikroorganismen technisch
zu handhaben.
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Verschiedene
Mikroorganismen, die in Lage sind unter anaeroben Bedingungen Bernsteinsäure
zu synthetisieren, sind bekannt. Die Literaturstelle
US 5,143,834 beschreibt eine Variante
von A. succiniciproducens. Es handelt sich dabei um einen obligat
anaeroben Mikroorganismus, der nur moderate Mengen an Bernsteinsäure
herstellen kann und zudem nicht in der Lage ist, hohe osmotische
Drücke und Salzkonzentrationen zu tolerieren.
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Die
Literaturstelle
US 7,063,968 beschreibt
ein mikrobielles Isolat aus Rinder-Pansen, Mannheimia sp. 55E, welches
in der Lage ist, sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen
organische Säuren zu synthetisieren. Dabei handelt es sich
allerdings nicht um eine spezifische Anreicherung von Bernsteinsäure, sondern
um ein Gemisch aus verschiedenen organischen Säuren, wie
Ameisensäure, Essigsäure, Milchsäure und
Bernsteinsäure. Nachteil dieses Produzenten ist, dass eine ökonomische
Verwendung des Stammes nur schwer möglich, wenn nicht unmöglich
ist, da zur Gewinnung von Bernsteinsäure aufwendige Anreicherungs- und
Aufreinigungsverfahren angewendet werden müssten.
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Die
Literaturstelle
US 5,869,301 beschreibt
ein Verfahren zur Herstellung von Dicarbonsäuren in einem
zweistufigen Fermentationsprozesses mit E. coli AFP-111, wobei in
einer ersten Phase mikrobielle Biomasse unter aeroben Bedingungen
hergestellt und in einer zweiten Phase die Produktion von Bernsteinsäure anaerob
durchgeführt wird. Die erste Phase der Biomassengewinnung
ist in diesem Prozess limitiert, da die Glukose-Konzentration im
Fed-Batch Prozess auf 1 g/L beschränkt sein muss, um eine
Acetat-Anreicherung zu vermeiden, die sowohl den Biomassengewinnungsprozess,
als auch die Bernsteinsäureproduktion stört. Somit
ist die Biomassengewinnung mit diesem Prozess nur begrenzt möglich.
Des weiteren unterliegt der Biosyntheseweg für die Bernsteinsäure
in diesem Prozess einer starken Katabolit-Repression, da Gene der
Glykolyse, des Zitronensäurezyklus und Glyoxylatweges durch
Glukose stark reprimiert sind, wie aus der Literaturstelle (
DeRisi
et al. 1997) bekannt. Das hat zur Folge, dass die Synthese
von Bernsteinsäure in Gegenwart von Glukose weitestgehend
reprimiert und damit stark begrenzt ist.
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Aus
der Literaturstelle
US 6,190,914 sind
Mikroorganismen bekannt, bei welchen durch Modulation von geeigneten
Transkriptionsfaktoren und Kinasen die Glucose-Repression diverser
Gene vermindert wird. Die Herstellung von organischen Säuren
mittels solcher Mikroorganismen, insbesondere aber auch weitergehend
für die Produktion organischer Säuren optimierte
Mikroorganismen, sind nicht entnehmbar.
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Technisches Problem der Erfindung
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Der
Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, einen Mikroorganismus
anzugeben, mit welchem eine verbesserte Ausbeute an organischen
Säuren, insbesondere Bernsteinsäure, in mikrobiologischen Herstellungsverfahren
erzielbar ist.
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Grundzüge der Erfindung
und bevorzugte Ausführungsformen
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Zur
Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung
einen isolierten genetisch veränderten Mikroorganismus,
wobei gegenüber dem wild-Typ a) die Gene idh1 und idp1
deletiert oder inaktiert sind, und/oder b) die Gene sdh2 und sdh1
deletiert oder inaktiviert sind, und/oder c) das Gen PDC2 deletiert
oder inaktiviert ist oder unter der Kontrolle eines durch Exposition
des Mikroorganismus mit einer Induktorsubstanz reprimierbaren oder
induzierbaren Promotors steht, und/oder d) eines oder mehrere Gene
aus der Gruppe bestehend aus ICL1, MLS1, ACS1 und MDH3 ersetzt oder
ergänzt ist durch ein entsprechendes fremdes Gen bzw. entsprechende
fremde Gene aus einem Crabtree negativen Organismus.
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Das
fremde Gen, welches das Gen ICL1 ersetzt oder ergänzt,
kann mindestens 75% Homologie zu Sequenz Nr. 1 aufweisen. Das fremde
Gen, welches das Gen ACS1 ersetzt oder ergänzt, kann mindestens 75%
Homologie zu Sequenz Nr. 2 aufweisen. Das fremde Gen, welches das
Gen MLS1 ersetzt oder ergänzt, kann mindestens 75% Homologie
zu Sequenz Nr. 3 aufweisen. Das fremde Gen, welches das Gen MDH3
ersetzt oder ergänzt, kann mindestens 75% Homologie zu
Sequenz Nr. 4 aufweist. Vorzugsweise liegt die Homologie bei mehr
als 80%, insbesondere mehr als 90%, höchstvorzugsweise
mehr als 95%. Es kann jeweils natürlich auch hiermit identisch
sein.
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Mit
der Erfindung wird ein optimiertes Verfahren zur Herstellung von
Bernsteinsäure und anderen organischen Säuren
des respirativen Zentralmetabolismus mittels eines Hefestammes,
insbesondere eines Saccharomyces cerevisiae Hefestammes, erhalten.
Dieses Verfahren ermöglicht eine effizientere Produktion
organischer Carbonsäuren, insbesondere Dicarbonsäuren
und Hydroxyfettsäuren des respirativen Zentralmetabolismus
der Hefe, wie zum Beispiel Bernsteinsäure, hinsichtlich
der Produktionsdauer und -ausbeuten. Außerdem ermöglicht
es einen 2-stufigen Produktionsprozess durch Trennung von Wachstum-
und Produktionsphase ohne den Einsatz eines Antibiotikum-abhängigen
Promotorsystems.
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Mit
der Erfindung wird ein Prozess ermöglicht, bei dem zunächst
in einer ersten Wachstumsphase Biomasse angereichert und in einer
zweiten Phase effizient Bernsteinsäure produziert und in
das Kulturmedium abgegeben werden soll. Die Trennung von Wachstum
und Produktionsphase trägt in erheblichem Maße
zur Effizienz des gesamten Produktionsprozesses von organischen
Säuren in Hefe bei, da Wachstum der Zellen und Produktion
des gewünschten Metaboliten sonst immer konkurrierende
Faktoren darstellen.
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Während
der Produktionsphase ist die Bildung von Biomasse unerwünscht,
da hierfür eingesetzter Kohlenstoff bzw. Substrat verbraucht
wird, was letztendlich eine Verminderung der Ausbeute des zu produzierenden
Metaboliten, zum Beispiel Bernsteinsäure, zur Folge hat.
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Die
Trennung von Wachstums und Produktionsphase ist mittels eines gentechnisch
veränderten oder durch genetische Mutation veränderten
Mikroorganismus und ein dazugehöriges Fermentationsverfahren,
bei dem zunächst während einer ersten Phase ein
optimaler Biomasse-Zuwachs des mikrobiellen Produzenten gewährleistet
ist und anschließend, in einer zweiten Phase (Produktionsphase)
die Anreicherung von Carbonsäuren, beispielsweise Bernsteinsäure,
aus primären Kohlenstoff-Quellen (z. B. Glukose) und CO2 (anaplerotische Auffüllreaktion,
CO2 Fixierung), angeschlossen wird, realisierbar.
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Während
der Produktionsphase ist durch genetische Veränderung eines
Mikroorganismus, welcher in der nicht vorveröffentlichten
Patentanmeldung
PCT/DE 2008/000670 „Mikroorganismus
zur Herstellung von Bernsteinsäure” beschrieben
ist, der Citratzyklus (dort
1 a.)) nach
den Intermediaten Isocitrat und Succinat unterbrochen (in der dortigen
1 durch
schwarze Kreuze gekennzeichnet), während er in der Wachstumsphase
nicht unterbrochen ist und die Konfiguration des Wildtyps aufweist.
Diese Unterbrechungen führen dazu, dass Succinat nicht
weiter verstoffwechselt werden kann und sich als Endprodukt anreichert
und der Kohlenstofffluss in den Glyoxylatzyklus (dort,
1 b.))
umgeleitet wird. Bei der Produktion organischer Säuren über
den Glyoxylatzyklus ergibt sich der Vorteil, dass die beiden oxidativen
Decarboxylierungsschritte von Isocitrat zu Succinyl-CoA im Citratzyklus,
und somit der Verlust von Kohlenstoff in Form von zweimal CO
2 (siehe dort
1 c.)),
umgangen werden. Die beschriebenen Unterbrechungen nach den Intermediaten
Isocitrat und Succinat während der Produktionsphase werden
durch ein exogen regulierbares Promotorsystem realisiert, welches
den in der Produktionsphase zu reprimierenden Genen vorgeschaltet
wird. Die Repression der entsprechenden Gene während der
Produktionsphase erfolgt dann durch Zugabe eines tetracyclischen
Antibiotikums, zum Beispiel Tetracyclin, zum Kulturmedium. Die Anwendung
von Antibiotika in der Fermentation kann jedoch problembehaftet
sein, da diese einen zusätzlichen Kostenfaktor darstellen.
Außerdem müssen Antibiotika gegebenenfalls aus
dem Produkt oder der Kulturbrühe wieder entfernt werden,
was das ”downstream processing” erheblich aufwendiger
und kostenintensiver gestaltet.
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Demgegenüber
wird mit der Erfindung eine weitere, optimierte Möglichkeit
der Trennung von Wachstums- und Produktionsphase geschaffen, welche
den Einsatz von Antibiotika nicht erforderlich macht, sowie ein
optimiertes Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure
oder anderen organischen Säuren in Hefe.
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Zum
Merkmal a) ist folgendes auszuführen. Beispielsweise in
der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist trotz der Deletionen der Gene
sdh2 und idh1, welche zu einer Unterbrechung des Citratzyklus führen,
eine Wachstumsrate, derer einer unmodifizierten Wildtyphefe vergleichbar,
zu messen. Ein Wachstum eines Hefestammes mit einer idh1 Deletion
ist nur deshalb möglich, weil diese Deletion nicht zu einem
vollständigen Verschwinden der Isocitrat-Dehydrogenase
Aktivität führt. Der Grund hierfür sind
drei weitere Isoenzyme der Isocitrat-Dehydrogenase, welche den Wegfall
des dimeren Hauptenzyms, kodiert durch die Gene IDH1 und IDH2, bezüglich
der Bildung von α-Ketoglutarat kompensieren können.
Die Synthese von α-Ketoglutarat ist für ein Wachstum
der Hefezelle auf Minimalmedien zwingend erforderlich, da aus diesem
Intermediat die Aminosäure Glutamat gebildet wird, ohne
die kein Wachstum möglich ist. In einem 2-stufigen Fermentationsprozess zur
Herstellung von Bernsteinsäure mit Hefe ist die effektive
Trennung von Wachstums- und Produktionsphase also nur durch die
vollständige Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität
im Produktionsstamm möglich, weil dadurch eine Glutamat-Auxotrophie
gewährleistet ist, was zur Folge hat, dass die Hefe in
Medium ohne supplementiertem Glutamat kein Wachstum aufweist. Dies
kann genutzt werden, um über die Supplementierung von Glutamat
zum Kulturmedium den Fermentationsprozess zu steuern. Über
die Menge des zugegeben Glutamats zum Kulturmedium kann die Dauer
der Wachstumsphase, sowie die angestrebte Zelldichte in dieser Phase
effektiv gesteuert werden. Mit zunehmender Menge nehmen auch Dauer
und Zelldichte zu. Ist das Glutamat im Kulturmedium verbraucht,
ist kein weiters Wachstum möglich und sämtlicher
Kohlenstoff kann effektiv zur Synthese von Bernsteinsäure
genutzt werden, deren Bildung dann nicht in Konkurrenz zur Bildung
von Biomasse steht. Diese Trennung von Wachtums- und Produktionsphase
im Fermentationsprozess über die Supplementierung von Glutamat
wird realisiert, wenn zusätzlich zur Deletion des Gens
idh1 mindestens noch das Gen idp1 (Contreras-Shannon et
al. 2005), vorzugsweise auch die Gene idp2 und idp3, welche für
Isoenzyme der Isocitrat-Dehydrogenase kodieren, deletiert werden.
Eine praktisch vollständige Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase
Aktivität gewährleistet die dafür nötige
Glutamat-Auxotrophie. Ein weiterer Vorteil der vollständigen
Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität liegt
darin begründet, dass so sämtlicher Kohlenstoff
im respirativen System der Hefe in den Glyoxylatzyklus in Richtung
Bernsteinsäure umgeleitet wird und nicht zu α-Ketoglutarat
abfließen kann, was zu Ausbeuteverlusten führen
würde.
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Zum
Merkmal b) ist folgendes auszuführen. Um weitere Ausbeuteverluste
zu vermeiden bzw. zu verringern, sollte Bernsteinsäure
als Endprodukt angereichert werden und nicht durch die Hefezelle
weiter verstoffwechselt werden. Dies kann durch die singuläre
Deletion des Gens sdh2, nicht erreicht werden. Zusätzlich wird
erfindungsgemäß eine weitere Untereinheit des
heterotetrameren Enzyms Succinat-Dehydrogenase, kodiert durch das
Gen sdh1, deletiert. (Kubo et al. 2000) detektierten
eine Restaktivität der Succinat-Dehydrogenase in einem
Hefestamm mit einer sdh2 Deletion, welche durch zusätzliche
Deletion des Gens sdh1 unterbunden wurde. Ausbeuteverluste können
sich auch durch die Weiterverstoffwechselung des gebildeten Succinats über
das Enzym Succinat-semialdehyd Dehydrogenase ergeben. Dieses Enzym
ist Teil des Glutamat-Degradationsweges und katalysiert die Umsetzung
von Succinat zu Succinat-semialdehyd. Dieses Intermediat wird dann über
Gamma-amino Buttersäure zu Glutamat verstoffwechselt. Auf
diesem Wege können nicht nur Ausbeuteverluste entstehen,
sondern auch α-Ketoglutarat und Glutamat synthetisiert
werden, was eine Steuerung des Fermentationsprozesses über
Glutamatsupplementierung unmöglich macht. Deshalb ist die
zusätzliche Deletion des Gens uga2, welches für
die Succinat-semialdehyd Dehydrogenase kodiert, im Rahmen eines
optimierten Produktionsprozesses zur Herstellung von Bernsteinsäure
vorteilhaft. Glyoxylat, welches für den Umlauf des Glyoxylatzyklus
nötig ist, kann nicht nur aus der durch die Isocitrat-Lyase
katalysierten Reaktion, wobei Isocitrat in Succinat und Glyoxylat
gespalten wird, entstehen, sondern auch durch die Reaktion der Alanin-Glyoxylat-Aminotransferase.
Dieses Enzym katalysiert die Entstehung von Glyoxylat und Alanin
ausgehend von Pyruvat und Glycin. Wenn Glyoxylat nicht zwingend
aus der Isocitrat-Lyase Reaktion zur Verfügung gestellt
werden muss, kann der Umlauf des Glyoxylat-Zyklus auch durch die
Reaktion der Alanin-Glyoxylat-aminotransferase Reaktion, durch welche
Glyoxylat bereitgestellt wird, gewährleistet werden. In diesem
Fall ist die Isocitrat-Lyase Aktivität, durch welche das
angestrebte Produkt Succinat entsteht, nicht für den Umlauf
des Glyoxylatzyklus nötig, was zur Folge hat, dass die
Hefe zum Teil die durch die Alanin-Glyoxylat-aminotransferase katalysierte
Alternativ-Reaktion zur Glyoxylat-Synthese nutzt. Dabei entsteht
kein Succinat, was zu Ausbeuteverlusten führt. Deshalb
ist die zusätzliche Deletion des Gens agx1, welches für
die Alanin-Glyoxylat-aminotransferase kodiert, im Rahmen eines optimierten
Produktionsprozesses zur Herstellung von Bernsteinsäure
vorteilhaft.
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Zum
Merkmal c) ist folgendes auszuführen. Bei der Zellatmung
wird Kohlenstoff ausgehend vom Substrat, z. B. Glucose, nicht wie
bei der Gärung in Ethanol oder Glycerin umgewandelt, sondern
tritt in den respirativen Zentralmetabolismus, also in den Citratzyklus
bzw. den Glyoxylatzyklus ein. Beim Durchlaufen des Kohlenstoffes
durch diese beiden Zyklen werden Redoxequivalente in Form von NADH
bzw. NADPH gebildet, deren Elektronen auf den ersten Proteinkomplex
der Atmungskette, welche in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert
ist, übertragen werden. Diese Elektronen werden dann schrittweise über
weitere Proteinkomplexe der Atmungskette auf den finalen Elektronenakzeptor
Sauerstoff übertragen, welcher dabei zu Wasser reduziert
wird. Die freiwerdende Energie dieser kontrollierten Knallgasreaktion
wird genutzt, um Protonen gegen einen Gradienten in den Intermembranraum
der Mitochondrien zu befördern, welche dann beim Zurückfließen in
das Mitochondrium durch den Komplex V der Atmungskette die sogenannte ”Protonenpumpe” antreiben, wobei
Energie in Form von ATP generiert wird. Unter Gärungsbedingungen
produziert die Hefe neben Glycerin vor allem Ethanol und generiert
pro Molekül Glucose nur 2 Energieequivalente in Form von
ATP, im Vergleich zur Atmung, bei der pro Molekül Glucose
38 ATP generiert werden können. Bei der Gärung
wird NADH zu NAD durch die Synthese von Ethanol bzw. Glycerin reoxidiert
und nicht wie bei der Atmung durch Abgabe der Elektronen auf Sauerstoff,
da unter anaeroben Bedingungen Sauerstoff nicht als finaler Elektronenakzeptor
zur Verfügung steht. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae
ist ”Crabtree” positiv. Das bedeutet, dass die
Hefe auf primären Kohlenstoffquellen, wie zum Beispiel
Glucose, selbst unter aeroben Bedingungen gärt und nicht
atmet. Diese Gäraktivität ist schon ab einer Glucosekonzentration
von etwa 100 mg/l Glucose im Kulturmedium zu beobachten, da ab dieser
Konzentration die Grenze der respiratorischen Kapazität
der Hefezelle erreicht ist. Der Grund hierfür ist, dass
in Anwesenheit von Glucose eine Vielzahl der Gene des respirativen
Zentralmetabolismus, also des Citrat- und Glyolxylatzyklus (siehe 1 a.)
und b.)) und der Atmungskette trankriptionell stark reprimiert sind
(Gancedo 1998). Dieses Phänomen wird auch
als Glucose- oder Katabolit-Repression bezeichnet. Die Gärung
ist weiterer Aspekt, welcher sich bei der biotechnologischen Herstellung
von Bernsteinsäure nachteilig auswirken kann, da sie zur
Bildung unerwünschter Nebenprodukte führt. In
diesem Zusammenhang ist vor allem die Bildung von Glycerin, Acetat
und Ethanol problematisch, da sie zu gravierenden Ausbeuteverlusten
führt. Sämtliche Organismen, welche den Crabtree
Effekt aufweisen, wie zum Beispiel die Hefe Saccharomyces cerevisiae,
gären selbst unter aeroben Bedingungen. Bei der biotechnologischen Herstellung
von Bernsteinsäure in Hefe ist grundsätzlich die
Bildung von Gärendprodukten, vor allem von Ethanol, nicht
unerwünscht und zu vermeiden. Unter aeroben Bedingungen
kann dies zum Teil dadurch erreicht werden, dass eine kontinuierliche
Zudosierung einer geringen Glucosemenge zum Kulturmedium vorgenommen
wird, was die Glucose-Repression und somit die Gärung unter
aeroben Bedingungen verhindert bzw. reduziert. Unter anaeroben Bedingungen
steht Sauerstoff nicht als finaler Elektronenakzeptor zur Verfügung, weshalb
die Hefe in jedem Fall gären muss, um NADH zu reoxidieren
und somit metabolisch aktiv zu bleiben. Eine Möglichkeit
die alkoholische Gärung, also die Bildung von Ethanol zu
vermeiden, ist das Ausschalten der Ethanol Biosynthese ausgehend
von Pyruvat. Hierzu kann die Pyruvat-Decarboxylase Aktivität
abgeschaltet werden, welche in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
durch 3 Pyruvat-Decarboxylase Isoenzyme, kodiert von den Genen PDC1,
PDC5 und PDC6, katalysiert wird. PDC6 wird sowohl beim Wachstum
auf Glucose, als auch auf Ethanol nur sehr schwach exprimiert. (Velmurugan
et al. 1997). Das Gen PDC2 kodiert für einen transkriptionellen
Induktor, welcher vor allem für die Expression der Gene
PDC1 und PDC5 verantwortlich ist. Das Gen PDC2 bietet also die Möglichkeit
mit nur einer einzelnen Deletion den Hauptanteil der Pyruvat-Decarboxylase
Aktivität, welche von 3 Genen kodiert wird, in der Zelle
abzuschaffen. Natürlich kann alternativ oder zusätzlich
auch eines oder mehrere der Gene PDC1, PDC5 und/oder PDC6 deletiert
sein. Dies hat den großen Vorteil, dass somit die problematische
Ethanolbildung mit nur einer einzelnen Modifikation im Metabolismus der
Hefe vermieden werden kann. Um die Ausbeuteverluste bei der biotechnischen
Herstellung von Bernsteinsäure in Hefe zu minimieren bzw.
zu reduzieren, sollte die Nebenproduktbildung, vor allem von Ethanol
vermieden werden bzw. stark reduziert werden. Dies kann durch Deletion
des Gens PDC2 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae erreicht werden.
Da diese Deletion zu einem stark eingeschränkten Wachstum
auf Glucose führt, kann dem Gen PDC2 ein reprimierbarer
Promotor oder ein induzierbarer Promotor vorgeschaltet werden. Der
reprimierbare Promotor gewährleistet eine ausreichende
Transkription des nachgeschalteten Gens in der Wachstumsphase und
stoppt die Transkription in der Produktionsphase durch Zugabe eines
Zusatzes zum Kulturmedium. Der induzierbare Promotor wird während
der Wachstumsphase durch Zugabe eines Induktors zum Kulturmedium
induziert, wodurch das nachgeschaltete Gen PDC2 ausreichend transkribiert
wird und ein Wachstum der Hefekultur möglich wird. Ist
der Induktor aufgebraucht ist kein weiteres Wachstum möglich
und die Produktionsphase wird eingeleitet. Ohne Pyruvat-Decarboxylase
Aktivität ist kein Wachstum der Hefezelle möglich,
da nicht ausreichend Acetyl-CoA, gebildet über Acetaldehyd
und Acetat, für die Fettsäurebiosynthese zur Verfügung
steht.
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Zum
Merkmal d) ist folgendes auszuführen. Verschiedene Enzyme
des Citrat- und Glyoxylatzyklus, deren Gene transkriptionell durch
Glucose reprimiert sind, unterliegen auch auf Proteinebene der Regulation bzw.
Inaktivierung durch Glucose. Eine transkriptionelle Deregulation
dieser Gene alleine reicht also nicht aus, um in vollem Umfang ein
aktives Genprodukt zu erhalten. Für ein hinsichtlich der
Produktionsdauer und -ausbeuten optimiertes Verfahren zur Herstellung
von Bernsteinsäure müssen also auch Inaktivierungseffekte
auf Proteinebene umgangen werden. Ein Beispiel ist eines der Hauptenzyme
des Glyoxylatzyklus, die Isocitrat-Lyase. Dieses Enzym, welches
für die effiziente Produktion von organischen Säuren
essentiell ist, unterliegt in Anwesenheit von Glucose der Inaktivierung
durch Phosphorylierung und einem verstärkten proteolytischen Abbau
(Lopez-Boado et al. 1988; Ordiz et al.
1996). Für weitere Enzyme des respirativen Systems,
insbesondere des Glyoxylatzyklus, ist auch von Glucose-induzierten
negativen regulatorischen Effekten auf Proteinebene auszugehen.
Dies betrifft vor allem die Acetyl-CoA Synthetase (Acs1p), die Malat-Synthase
(M1s1p) und die Malat-Dehydrogenase (Mdh3p). Die Glucose-induzierte
protetolytische Degradation bzw. Inaktivierung dieser Enzyme kann
verhindert werden, indem heterologe Isoenzyme in der Hefe Saccharomyces
cerevisiae exprimiert werden. Diese Enzyme stammen aus einem Mikroorganismus,
welcher natürlicherweise einen Glyoxylatzyklus aufweist
und ”Crabtree” negativ ist, da Enzyme des Glyoxylatzyklus
aus einem solchen Organismus nicht der durch Glucose-induzierten
negativen Regulation, bzw. der proteolytischen Degradation auf Proteinebene
unterliegen. Ein aktiver Glyolylatzyklus ist für eine effiziente
Produktion von organischen Säuren mit hohen Ausbeuten auf
primären Kohlenstoffquellen essentiell. Als „Crabtree” negative
Spenderorganismen kommen beispielsweise in Frage Escherichia coli,
Anaerobiospirillum, Actinobacillus, Mannheimia oder Corynebacterium.
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Der
Begriff der Deletion eines Gens bezeichnet die vollständige
Entfernung des Gens aus dem Genom des Mikroorganismus und/oder die
Entfernung des dadurch codierten aktiven Enzyms aus dem Mikroorganismus.
Eine Inaktivierung eines Gens bezeichnet die Reduktion oder das
vollständige Ausschalten der Aktivität des durch
das Gen codierten Enzyms bzw. Proteins. Dies lässt sich überprüfen
durch eine Messung der betreffenden enzymatischen Aktivität
mit üblichen Standardtests oder durch eine Bestimmung des
betreffenden Enzyms bzw. Proteins mittels beispielsweise immunologischen
Nachweisreaktionen. Eine Inaktivierung kann beispielsweise durch
Reduktion oder Inhibierung der Genexpression (Transkription und/oder
Translation) erfolgen. Hierzu ist beispielsweise die Einführung
von antisense Nukleinsäuren (durch Zugabe oder durch Einbringen
von Nukleinsäuresequenzen in das Genom, welch zur antisense
Nukleinsäure transkribierbar sind), die Einführung
von Mutationen in das Endogen, welche die Aktivität des
Genproduktes reduzieren oder vollständig ausschalten, die
Einführung von Gen-spezifischen DNA-bindenden Faktoren,
beispielsweise Zinkfingertranskriptionsfaktoren, die eine Reduktion
der Genexpression bewirken, der Ersatz des Endogens durch ein fremdes
Gen, welches für ein entsprechendes, jedoch inaktiviertes
oder reduziert aktives Enzym bzw. Protein codiert. Auch kann ein
Promotor, unter dessen Kontrolle das betreffende Endogen steht,
deletiert oder mutiert werden, so dass eine Transkription reduziert
oder inhibiert ist.
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Die
Sequenzen (Nukleinsäuresequenzen und/oder Aminosäuresequenzen)
der im Rahmen der Erfindung inaktivierten Gene bzw. Enzyme bzw.
der angesprochenen Promotor sind unter den folgenden Gendatenbanknummern
erhältlich bzw. in den folgenden Literaturstellen beschrieben.
- SDH1: NC_001143.7
- PDC2: NC_001136.8
- IDP1: NC_001136.8
- IDP2: NC_001144.4
- IDP3: NC_001146.6
- AGX1: NC_001138.4
- UGA2: NC_001134.7
- MLS1: X64407 S50520
- ICL1: X65554
- MDH3: M98763
- ACS1: AY723758
- aceA: NC_000913.2
- acs: NC_004431.1
- aceB: NC_010473.1
- mdh: NC_000913.2
- ADH1: Lang C., Looman A. C., Appl Microbiol Biotechnol.
44(1–2): 147–156 (1995)
- tetO und tTA: Gari E. et al., Yeast 13: 837–848
(1997).
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Die
Transformation von Mikroorganismen, wie Hefezellen, kann in fachüblicher
Weise erfolgen und hierzu wird auf die Literaturstellen Schiestl
R. H., et al., Curr Genet. Dec, 16(5–6): 339–346
(1989), oder Manivasakam P., et al., Nucleic Acids
Res. Sep 11, 21(18): 4414–4415 (1993), oder Morgan
A. J., Experientia Suppl., 46: 155–166 (1983) verwiesen.
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Zur
Transformation geeignete Vehikel, insbesondere Plasmide, sind beispielsweise
aus den Literaturstellen Naumovski L., et al., J Bacteriol,
152(1): 323–331 (1982), Broach J. R.,
eta al., Gene, 8(1): 121–133 (1979), Sikorski
R. S., et al., Genetics, 122(1)_19–27 (1989).
Bei diesen vectoren handelt es sich um Yep24, Yep13, pRS-Vektorserie,
sowie um YCp19 oder pYEXBX.
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Die
Herstellung von im Rahmen der Erfindung geeigneten Expressionskassetten
erfolgt typischerweise durch Fusion des Promotors mit der für
das Gen kodierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. einem
Terminator nach üblichen Rekombinations- und Klonierungstechniken,
wie beispielsweise in den Literaturstellen Maniatis T.,
et al., Molecular Cloning: A Laboratiry Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989, oder Sihlavy
T. J., et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1984, oder Ausubel
F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing
Assoc. and Wiley-Interscience, 1987, beschrieben.
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Die
Erfindung betrifft desweiteren die Verwendung eines erfindungsgemäßen
Mikroorganismus zur Herstellung einer organischen Carbonsäure
des Glyoxylat- und/oder Zitrat-Zyklus, insbesondere einer organischen
Dicarbonsäure, vorzugsweise von Bernsteinsäure,
sowie dessen Verwendung in einem Verfahren zur Herstellung einer
organischen Carbonsäure des Glyoxylat- und/oder Zitrat-Zyklus,
insbesondere einer organischen Dicarbonsäure, vorzugsweise
von Bernsteinsäure, mit den folgenden Verfahrenstufen:
A) in einer Wachstumsverfahrenstufe wird der Mikroorganismus unter
vorzugsweise aeroben Bedingungen kultiviert und vermehrt, optional
unter Zugabe einer Induktorsubstanz zur Induktion des induzierbaren
Promotors und/oder von Glutamat, B) anschließend wird der
Mikroorganismus in einer Produktionsphase unter vorzugsweise anaeroben
Bedingungen kultiviert, optional unter Zugabe einer Induktorsubstanz
zur Repression des reprimierbaren Promotors, C) anschließend
an die Stufe B) oder während der Stufe B) wird die Carbonsäure
aus dem Kulturüberstand abgetrennt und optional aufgereinigt.
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Im
Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es
bevorzugt, wenn die Stufe A) bis zu einer Zelldichte von zumindest
100 g Biotrockenmasse/l, vorzugsweise zumindest 120 g/l, höchstvorzugsweise
zumindest 140 g/l, durchgeführt wird. Die Stufe b) kann
bis zu einer Carbonsäurekonzentration von zumindest 0,4 Mol/l,
vorzugsweise zumindest 0,8 Mol/l, höchstvorzugsweise zumindest
1,0 Mol/l, durchgeführt werden. In Stufe A) kann ein pH
im Bereich von 4 bis 9, vorzugsweise von 6 bis 8, und eine Salzkonzentration
im Bereich von 0,01 bis 0,5 Mol/l, vorzugsweise von 0,05 bis 0,2
Mol/l, höchstvorzugsweise von 0,05 bis 0,1 Mol/l, eingestellt
werden. In Stufe B) kann ein pH im Bereich von 4 bis 9, vorzugsweise
von 6 bis 8, und eine Salzkonzentration im Bereich von 0,01 bis
0,5 Mol/l, vorzugsweise von 0,05 bis 0,2 Mol/l, höchstvorzugsweise
von 0,05 bis 0,1 Mol/l, eingestellt werden. Die Stufe A) wird vorzugsweise
bei einer Temperatur von 20 bis 35°C, vorzugsweise von
28 bis 30°C, und für eine Dauer von 1 bis 1000
h, vorzugsweise von 2 bis 500 h, höchstvorzugsweise 2 bis
200 h, durchgeführt. In Stufe B) ist eine Durchführung
bei einer Temperatur von 15 bis 40°C, vorzugsweise von
20 bis 35°C, höchstvorzugsweise 28 bis 30°C,
und für eine Dauer von 1 bis 1000 h, vorzugsweise von 2
bis 500 h, höchstvorzugsweise 2 bis 200 h, bevorzugt.
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Als
Kulturmedien für die Stufe A) kommt beispielsweise WMVIII-Medium
(Lang C., Looman A. C., Appl Microbiol Biotechnol. 44(1–2):
147–156 (1995)) in Frage. Dabei liegt die Tetracyclin-Menge
im Kulturmedium vorzugsweise unterhalb von 20 mg/l, bevorzugt unterhalb
von 10 mg/l, höchstvorzugsweise unterhalb von 1 mg/l, bis
hin zu Werten, die unterhalb der Nachweisgrenze liegen und/oder
die CuSO4 Konzentration im Kulturmedium,
sofern eingesetzt, bevorzugt oberhalb von 1 μM, höchstvorzugsweise
oberhalb von 5 μM. Als Bereiche kommen beispielsweise 1
bis 3 μM oder 3 bis 15 μM in Frage.
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Als
Kulturmedium für die Stufe B) kommt beispielsweise WMVIII-Medium
in Frage, auch ist ein übliches Melasse-Medium einsetzbar.
Dabei liegt die Tetracyclin-Menge, sofern eingesetzt, bevorzugt
oberhalb von 1 mg/l, höchstvorzugsweise oberhalb von 3
mg/l. Als Bereiche kommen beispielsweise 1 bis 3 mg/l oder 3 bis
15 mg/l in Frage. Die eingesetzte CuSO4 Konzentration
im Kulturmedium liegt dabei vorzugsweise unterhalb von 20 μM,
bevorzugt unterhalb von 10 μM, höchstvorzugsweise
unterhalb von 1 μM, bis hin zu Werten, die unterhalb der
Nachweisgrenze liegen
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Die
Stufe C) kann anschließend an die Stufe B) durchgeführt
werden. Dann wird der Kulturüberstand von den Mikroorganismen
abgetrennt, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation.
Die Stufe C) kann aber auch während der Stufe B) durchgeführt
werden, und zwar kontinuierlich oder diskontinuierlich. In letzterem
Falle wird zumindest ein Teil des Kulturüberstandes entnommen
und durch neues Kulturmedium ersetzt und dieser Vorgang ggf. mehrfach
wiederholt. Aus dem entnommenen Kulturüberstand wird die
Bernsteinsäure gewonnen. Eine kontinuierliche Abtrennung
kann über geeignete Membranen oder durch Leiten eines Stromes
des Kulturmediums über eine Vorrichtung zur Abtrennung
der Bernsteinsäure erfolgen.
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Die
Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren zur Herstellung eines
erfindungsgemäß Mikroorganismus, wobei a) die
Gene idh1 und idp1 deletiert oder inaktiert werden, und/oder b)
die Gene sdh2 und sdh1 deletiert oder inaktiviert werden, und/oder
c) das Gen PDC2 deletiert oder inaktiviert wird oder unter die Kontrolle
eines durch Exposition des Mikroorganismus mit einer Induktorsubstanz
reprimierbaren oder induzierbaren Promotors gestellt wird, und/oder
d) eines oder mehrere Gene aus der Gruppe bestehend aus ICL1, MLS1, ACS1
und MDH3 ersetzt oder ergänzt werden durch ein entsprechendes
fremdes Gen bzw. entsprechende fremde Gene aus einem Crabtree negativen
Organismus.
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Grundsätzlich
gelten alle im Zusammenhang mit erfindungsgemäßen
Mikroorganismen angebrachten Erläuterungen analog auch
für die erfindungsgemäßen Verwendungen
und Verfahren.
-
Die
Bibliographieangaben zu den vorstehend und nachfolgend als Kurzzitat
genannten Literaturstellen sind wie folgt.
- Contreras-Shannon,
V., A. P. Lin, M. T. McCammon and L. McAlister-Henn (2005). "Kinetic
properties and metabolic contributions of yeast mitochondrial and
cytosolic NADP+-specific isocitrate dehydrogenases." J
Biol Chem 280(6): 4469–75.
- DeRisi, J. L., V. R. Iyer and P. O. Brown (1997). "Exploring
the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic
scale." Science 278(5338): 680–6.
- Gancedo, J. M. (1998). "Yeast carbon catabolite
repression." Microbiol Mol Biol Rev 62(2): 334–61.
- Guldener, U., S. Heck, T. Fielder, J. Beinhauer and
J. H. Hegemann (1996). "A new efficient gene disruption cassette
for repeated use in budding yeast." Nucleic Acids Res 24(13):
2519–24.
- Kubo, Y., H. Takagi and S. Nakamori (2000). "Effect
of gene disruption of succinate dehydrogenase on succinate production
in a sake yeast strain." J Biosci Bioeng 90(6): 619–24.
- Lang, C. and A. C. Looman (1995). "Efficient
expression and secretion of Aspergillus niger RH5344 polygalacturonase
in Saccharomyces cerevisiae." Appl Microbiol Biotechnol
44(1–2): 147–56.
- Lopez-Boado, Y. S., P. Herrero, T. Fernandez, R. Fernandez
and F. Moreno (1988). "Glucose-stimulated phosphorylation
of yeast isocitrate lyase in vivo." J Gen Microbiol 134(9):
2499–505.
- Ordiz, I., P. Herrero, R. Rodicio and F. Moreno (1996). "Glucose-induced
inactivation of isocitrate lyase in Saccharomyces cerevisiae is
mediated by the cAMP-dependent protein kinase catalytic subunits
Tpk1 and Tpk2." FERS Lett 385(1–2): 43–6.
- Velmurugan, S., Z. Lobo and P. K. Maitra (1997). "Suppression
of pdc2 regulating pyruvate decarboxylase synthesis in yeast." Genetics
145(3): 587–94.
-
Zur
Erläuterung der verschiedenen vorstehend beschriebenen
Synthesewege und deren Modifikation durch gentechnische Maßnahmen
der Erfindung dienen die Figuren. Es zeigen
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1:
eine Darstellung des Zitrat- und Glyoxylatzyklus mit den beteiligten
Genen, Metaboliten und Enzymen bzw. Proteinen, und
-
2:
Verstoffwechselung von Succinat zu Glutamat im wild Typ.
-
Im
Folgenden wird die Erfindung anhand von verschiedenen Beispielen
näher erläutert. Dabei werden einzelne erfindungsgemäße
Merkmale anhand von lediglich beispielhaften Mikroorganismen näher
beschrieben. Die beschriebenen gentechnischen sind natürlich
auch auf andere Mikroorganismen, insbesondere Hefen, übertragbar.
Ebenso können die verschiedenen gentechnischen Maßnahmen
auch in anderen Kombinationen vorgesehen sein.
-
Beispiel 1: Herstellung eines Mikroorganismus
mit einem Glyoxylatzyklus, welcher transkriptionell und auf Proteinebene
nicht der Glucose-Repression unterliegt zur Herstellung von organischen
Säuren des respirativen Zentralmetabolismus, insbesondere
von Bernsteinsäure
-
Verschiedene
Enzyme des Citrat- und Glyoxylatzyklus, deren Gene transkriptionell
durch Glucose reprimiert sind, unterliegen in der Hefe Saccharomyces
cerevisiae auch auf Proteinebene der Regulation bzw. Inaktivierung
durch Glucose. Eine transkriptionelle Deregulation dieser Gene reicht
also nicht aus, um ein aktives Genprodukt zu erhalten. Für
ein hinsichtlich der Produktionsdauer und -ausbeuten optimiertes
Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure müssen
also auch Inaktivierungseffekte auf Proteinebene umgangen werden.
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Die
Glucose-induzierte proteolytische Degradation bzw. Inaktivierung
der Enzyme des Glyoxylatzyklus kann verhindert werden, indem heterologe
Isoenzyme in der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimiert werden.
Diese Enzyme stammen aus einem Mikroorganismus, welcher natürlicherweise
einen Glyoxylatzyklus aufweist und ”Crabtree” negativ
ist, da Enzyme des Glyoxylatzyklus aus einem solchen Organismus
nicht der durch Glucose-induzierten negativen Regulation, bzw. der
proteolytischen Degradation auf Proteinebene unterliegen. Als Spenderorganismus
kommen hier zum Beispiel Escherichia coli, Anaerobiospirillum, Actinobacillus,
Mannheimia und Corynebacterium in Frage. Die transkriptionelle Deregulation
dieser Enzyme wird erreicht, indem die entsprechenden Gene unter
die Kontrolle eines konstitutiven Promotors gestellt werden.
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Dazu
werden die Gene acs (Acetyl-CoA Synthetase), aceA (Isocitrat-Lyase),
aceB (Malst-Synthase A), mdh (Malst-Dehydrogenase) aus bakterieller
DNA des Stammes E. coli JM109 mittels PCR amplifiziert und mit Restriktionslinkern
versehen und anschließend in das Hefe Chromosom unter der
Kontrolle des konstitutiven ADH1 Promotors integriert. Für
die deregulierte Expression dieses Gens in der Hefe Saccharomyces
cerevisiae wird der konstitutive ADH1 Promotor verwendet, der durch
Modifizierung der natürlichen Sequenz über einen
sehr langen Zeitraum zu einer konstitutiven, von Glucose und Ethanol
unabhängigen, Expression führt (Lang and Looman
1995).
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Die
kodierenden Nukleinsäuresequenz für die Expressionskassette
aus ADH1prom-acs(aceA, aceB, mdh)-TRP1term. wurde durch PCR unter
Verwendung von Standardmethoden aus dem Vektor pFlat1-acs (aceA,
aceB, mdh) amplifiziert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde nach einer
Klenow-Behandlung in den Vekor pUG6 in die EcoRV-Schnittstelle Blunt-end
einkloniert und ergab den Vektor pUG6-acs (aceA, aceB, mdh). Nach
Plasmidisolation wurde ein erweitertes Fragment aus dem Vektor pUG6-acs
(aceA, aceB, mdh) mittels PCR amplifiziert, so dass das resultierende
Fragment aus folgenden Komponenten besteht: loxP-kanMX-loxP-ADH1prom-acs(aceA,
aceB, mdh)-Tryptophan-Terminator. Als Primer wurden Oligonukleotid-Sequenzen
ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen
je die 5' oder die 3' Sequenz des acs(aceA, aceB, mdh)-Gens enthalten
und im annealenden Bereich die Sequenzen 5' der loxP-Regionen und
3' des Tryptophan-Terminators. So ist gewährleistet, dass
einerseits das gesamte Fragment inklusive KanR und acs (aceA, aceB,
mdh) amplifiziert werden und anderseits dieses Fragment anschließend
in Hefe transformiert werden kann und durch homologe Rekombination
dieses gesamte Fragment in den entsprechenden Genlocus der Hefe
integriert.
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Als
Selektionsmarker dient jeweils die Resistenz gegen G418. Um die
Resistenz gegen G418 anschließend jeweils wieder zu entfernen,
wird der jeweils entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor
pSH47 (Guldener et al. 1996) transformiert. Durch
diesen Vektor wird die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was
zur Folge hat, dass der Sequenz-Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen
heraus rekombiniert. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der
beiden loxP-Sequenzen und die jeweilige Expressions-Kassette in
dem ursprünglichen entsprechenden Genlocus enthalten bleibt.
Die Folge ist, das der Hefestamm die G418-Resistenz wieder verliert
und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses cre-lox Systems
in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47
kann daraufhin durch eine Gegenselektion auf YNB-Agarplatten supplimentiert
mit Uracil (20 mg/L) und FOA (5-Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder
entfernt werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid
tragen, zunächst unter nicht selektivien Bedingungen kultiviert
werden und anschließend auf FOA-haltigen Selektivplatten
angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich
Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren.
Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten.
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Beispiel 2: Herstellung eines Mikroorganismus
zur biotechnologischen Herstellung von Bernsteinsäure und
anderen organischen Säuren, welcher einen effizienteren
Herstellungsprozess durch Reduzierung von Ausbeuteverlusten ermöglicht.
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Um
Ausbeuteverluste bei der biotechnologischen Herstellung von Bernsteinsäure
in der Hefe Saccharomyces cerevisiae zu reduzieren, muss Bernsteinsäure
als Endprodukt angereichert werden und darf nicht durch die Hefezelle
weiter verstoffwechselt werden. Dies kann in vollem Maße
durch die singuläre Deletion des Gens sdh2 nicht erreicht werden.
Zusätzlich muss eine weitere Untereinheit des heterotetrameren
Enzyms Succinat-Dehydrogenase, kodiert durch das Gen sdh1, deletiert
werden.
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Ausbeuteverluste
können sich auch durch die Weiterverstoffwechselung des
gebildeten Succinats über das Enzym Succinat-semialdehyd
Dehydrogenase ergeben. Dieses Enzym ist Teil des Glutamat-Degradationsweges
und katalysiert die Umsetzung von Succinat zu Succinat-semialdehyd.
Dieses Intermediat wird dann über Gamma-amino Buttersäure
zu Glutamat verstoffwechselt. Auf diesem Wege können nicht
nur Ausbeuteverluste entstehen, sondern auch α-Ketoglutarat
und Glutamat synthetisiert werden, was eine Steuerung des Fermentationsprozesses über
Glutamatsupplementierung unmöglich macht. Deshalb ist die
zusätzliche Deletion des Gens uga2, welches für
die Succinat-semialdehyd Dehydrogenase kodiert, im Rahmen eines
optimierten Produktionsprozesses zur Herstellung von Bernsteinsäure
vorteilhaft.
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Glyoxylat,
welches für den Umlauf des Glyoxylatzyklus nötig
ist, kann nicht nur aus der durch die Isocitrat-Lyase katalysierten
Reaktion, wobei Isocitrat in Succinat und Glyoxylat gespalten wird,
entstehen, sondern auch durch die Reaktion der Alanin-Glyoxylat-Aminotransferase.
Dieses Enzym katalysiert die Entstehung von Glyoxylat und Alanin
ausgehend von Pyruvat und Glycin. Wenn Glyoxylat nicht zwingend
aus der Isocitrat-Lyase Reaktion zur Verfügung gestellt
werden muss, kann der Umlauf des Glyoxylat-Zyklus auch durch die
Reaktion der Alanin-Glyoxylat-aminotransferase Reaktion, durch welche
Glyoxylat bereitgestellt wird, gewährleistet werden. In
diesem Fall ist die Isocitrat-Lyase Aktivität, durch welche
das angestrebte Produkt Succinat entsteht, nicht für den
Umlauf des Glyoxylatzyklus nötig, was zur Folge hat, dass
die Hefe zum Teil die durch die Alanin-Glyoxylat-aminotransferase
katalysierte Alternativ-Reaktion zur Glyoxylat-Synthese nutzt. Dabei
entsteht kein Succinat, was zu Ausbeuteverlusten führt.
Deshalb ist die zusätzliche Deletion des Gens agx1, welches
für die Alanin-Glyoxylat-aminotransferase kodiert, im Rahmen
eines optimierten Produktionsprozesses zur Herstellung von Bernsteinsäure
vorteilhaft.
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Die
idh1 Deletion führt nicht zu einem vollständigen
Verschwinden der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität. Der
Grund hierfür sind 3 weitere Isoenzyme der Isocitrat-Dehydrogenase,
welche den Wegfall des dimeren Hauptenzyms, kodiert durch die Gene
IDH1 und IDH2, bezüglich der Bildung von α-Ketoglutarat
kompensieren können. Zusätzlich zur Deletion des
Gens idh1 muss mindestens noch das Gen idp1, welches für
ein Isoenzym der Isocitrat-Dehydrogenase kodiert, deletiert werden,
um die Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität auf Glucose vollständig
zu unterbinden. Die vollständige Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase
Aktivität hat den Vorteil, dass sämtlicher Kohlenstoff
im respirativen System der Hefe in den Glyoxylatzyklus in Richtung Bernsteinsäure
umgeleitet wird und nicht zu α-Ketoglutarat abfließen
kann, was zu Ausbeuteverlusten führen würde.
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Zusammengefasst
können Ausbeuteverluste bei der biotechnischen Herstellung
von Bernsteinsäure in Hefe minimiert bzw. reduziert werden,
indem die Gene sdh1, agx1, uga2 und idp1 zusätzlich zu
den Genen sdh2 und idh1 deletiert werden.
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Dazu
wurde die kodierende Nukleinsäuresequenz für die
Deletionskassette loxP-kanMX-loxP durch PCR unter Verwendung von
Standardmethoden aus dem Vektor pUG6 (Guldener et al. 1996)
amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten
besteht: loxP-kanMX-loxP. Als Primer wurden Oligonukleotid-Sequenzen
ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen
je die 5' oder die 3' Sequenz zu Beginn und am Ende des nativen
Locus der zu deletierenden Gene (sdh1, agx1, uga2, idp1) enthalten
und im annealenden Bereich die Sequenzen 5' der loxP-Region und
3' der zweiten loxP Region. So ist gewährleistet, dass
einerseits das gesamte Fragment loxP-kanMX-loxP amplifiziert wird
und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe transformiert
werden kann und durch homologe Rekombination dieses gesamte Fragment in
den zu deletierenden Genlocus der Hefe integriert.
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Als
Selektionsmarker dient die Resistenz gegen G418 (kodiert durch kanMX).
Um die Resistenz gegen G418 anschließend wieder zu entfernen
und so eine weitere Nutzung des kanMX Markers zu ermöglichen, wird
der entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47 (Guldener
et al. 1996) transformiert. Durch diesen Vektor wird die
cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hat, dass
der Sequenz-Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombiniert.
Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen
am deletierten Genlocus (sdh1, agx1, uga2, idp1) zurückbleibt.
Die Folge ist, das der Hefestamm die G418-Resistenz wieder verliert
und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses cre-lox Systems
in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47
kann daraufhin durch eine Gegenselektion auf YNB-Agarplatten supplimentiert
mit Uracil (20 mg/L) und FOA (5-Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder
entfernt werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid
tragen, zunächst unter nicht selektiven Bedingungen kultiviert
werden und anschließend auf FOA-haltigen Selektivplatten
angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich
Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren.
Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten.
So wurden iterativ alle zu deletierenden Gene (sdh1, agx1, uga2,
idp1) deletiert.
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Tabelle
1 zeigt exemplarisch die Ausbeuteerhöhungen durch oben
beschriebene Deletionen nach Kultivierung der in der Tabelle angegebenen
Stämme für 72 Stunden in WM8-Medium (Lang und
Looman, 1995) mit 3,52 g/l Ammoniumsulfat und 0,05 M Na2HPO4 und
0,05 M NaH2PO4 als Pfuffer, sowie mit Histidin 100 mg/l, Leucin
400 mg/l, Uracil 100 mg/l. Die C-Quelle war 5% Glucose. Es wurde
1%ig aus einer 48 h Vorkultur angeimpft. Kultiviert wurde in 100
ml Schüttelkolben auf einem Schüttelinkubator
bei 30°C und 150 rpm.
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Da
Stamm 5 und 6 nicht in Medium ohne Glutamat wächst wurde
mit diesen Stämmen zunächst Biomasse generiert
in 75 ml Standard WM8 Medium mit NaGlutamat und Glucose 5% in 250
ml Schikanekolben. Die Zellen wurden gewaschen und in dem oben angegebenen
Medium zur Weiterkultivierung resuspendiert. Tabelle 1: Succinat Titer nach 72 Stunden
Kultivierung der angegebenen Stämme in WM8-Medium unter
den oben beschriebenen Bedingungen
| | Stamm | Succinat
im Kulturüberstand in g/l |
| 1 | AH22ura3
(Wildtyp) | 0,12 |
| 2 | AH22ura3Δsdh2Δidh1 | 0,41 |
| 3 | AH22ura3Δsdh2Δsdh1Δidh1Δidp1 | 2,5 |
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In
Tabelle 1 ist zu sehen, dass sämtliche vorgenommenen Deletionen
zu einer im Vergleich zum Wildtyp höheren Succinatmenge
im Kulturüberstand führen. Die Quadrupeldeletionsmutante AH22ura3Δsdh2Δsdh1Δidh1Δidp1
reichert die höchste Menge an Succinat an. Entsprechende
Ergebnisse lassen sich auch mit anderen Mikroorganismen bzw. Hefen
erhalten.
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Beispiel 3: Herstellung eines Mikroorganismus
zur biotechnologischen Herstellung von Bernsteinsäure und
anderen organischen Säuren, welcher einen effizienteren
Herstellungsprozess durch Reduzierung von Nebenproduktbildung, insbesondere
von Ethanol und Acetat ermöglicht.
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Die
Gärung ist weiterer wesentlicher Aspekt, welcher sich bei
der biotechnologischen Herstellung von Bernsteinsäure nachteilig
auswirkt, da sie zur Bildung unerwünschter Nebenprodukte
führt. In diesem Zusammenhang ist vor allem die Bildung
von Acetat und Ethanol problematisch, da sie zu gravierenden Ausbeuteverlusten
führt.
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Eine
Möglichkeit die alkoholische Gärung, also die
Bildung von Ethanol zu vermeiden, ist das Ausschalten der Ethanol
Biosynthese ausgehend von Pyruvat. Dadurch wird auch die Acetatbildung über
Acetaldehyd vermieden. Hierzu muss die Pyruvat-Decarboxylase Aktivität
abgeschaltet werden, welche in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
durch 3 Pyruvat-Decarboxylase Isoenzyme, kodiert von den Genen PDC1,
PDC5 und PDC6, katalysiert wird. Das Gen PDC2 kodiert für
einen transkriptionellen Induktor, welcher vor allem für die
Expression der Gene PDC1 und PDC5 verantwortlich ist. Das Gen PDC2
bietet also die Möglichkeit mit nur einer einzelnen Deletion
den Hauptanteil der Pyruvat-Decarboxylase Aktivität, welche
von 3 Genen kodiert wird, in der Zelle abzuschaffen. Dies hat den
großen Vorteil, dass somit die problematische Ethanolbildung
mit nur einer einzelnen Modifikation im Metabolismus der Hefe vermieden
werden kann.
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Dies
kann durch Deletion des Gens PDC2 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
erreicht werden. Da diese Deletion zu einem stark eingeschränkten
Wachstum auf Glucose führt, kann dem Gen PDC2 ein induzierbarer
Promotor vorgeschaltet werden. Der induzierbare Promotor wird während
der Wachstumsphase durch Zugabe eines Induktors zum Kulturmedium
induziert, wodurch das nachgeschaltete Gen PDC2 ausreichend transkribiert
wird und ein Wachstum der Hefekultur gewährleistet ist.
Ist der Induktor aufgebraucht ist kein weiteres Wachstum möglich
und die Produktionsphase ohne Nebenproduktbildung in Form von Ethanol und
Acetat wird eingeleitet.
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Als
induzierbarer Promotor wurde der CUP1-Promotor gewählt
und chromosomal vor den „open reading frame” des
Gens PDC2 integriert, so dass dieses unter der Kontrolle des durch
Kupfer induzierbaren CUP1-Promotors steht.
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Dazu
wurde die kodierende Nukleinsäuresequenz für die
CUP1-Promotorkassette durch PCR unter Verwendung von Standardmethoden
amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten
besteht: loxP-kanMX-loxP-CUP1pr. Als Primer wurden Oligonukleotid-Sequenzen
ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen
je die 5' oder die 3' Sequenz des nativen Promotors des PDC2-Gens
enthalten und im annealenden Bereich die Sequenzen 5' der loxP-Region
und 3' des CUP1prom. So ist gewährleistet, dass einerseits
das gesamte Fragment inklusive kanMX und CUP1-Promotor amplifiziert
werden und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe
transformiert werden kann und durch homologe Rekombination dieses gesamte
Fragment in den PDC2-Genlocus der Hefe, vor den codierenden Bereich
des Gens PDC2, integriert.
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Als
Selektionsmarker dient die Resistenz gegen G418. Der resultierende
Stamm enthält eine Kopie des Genes PDC2 unter der Kontrolle
des Kupfer-regulierten CUP1-Promotors und des nativen PDC2-Terminators.
Um die Resistenz gegen G418 anschließend wieder zu entfernen,
wird der entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47
(Guldener et al. 1996) transformiert. Durch diesen
Vektor wird die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur
Folge hat, dass der Sequenz-Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen
heraus rekombiniert. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der
beiden loxP-Sequenzen und die CUP1-Promotorkassete vor der codierenden
Sequenz des Gens PDC2 enthalten bleibt. Die Folge ist, das der Hefestamm
die G418-Resistenz wieder verliert und damit geeignet ist, weitere
Gene mittels dieses cre-lox Systems in den Hefestamm zu integrieren
bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch eine Gegenselektion
auf YNB-Agarplatten supplimentiert mit Uracil (20 mg/L) und FOA
(5-Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder entfernt werden. Dazu müssen
die Zellen, die dieses Plasmid tragen, zunächst unter nicht
selektiven Bedingungen kultiviert werden und anschließend
auf FOA-haltigen Selektivplatten angezogen werden. Unter diesen
Bedingungen können lediglich Zellen wachsen, die nicht
in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren. Dies sind in
diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten.
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Beispiel 4: Herstellung eines Mikroorganismus
zur biotechnologischen Herstellung von Bernsteinsäure und
anderen organischen Säuren, welcher eine Trennung von Wachstum
und Produktionsphase über Glutamat Supplementierung ermöglicht.
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Im
Folgenden wird eine Möglichkeit der Trennung von Wachstums-
und Produktionsphase, welche nicht den Einsatz von Antibiotika erforderlich
macht, beschrieben. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist trotz
der Deletionen der Gene sdh2 und idh1, welche zu einer Unterbrechung
des Citratzyklus führen (siehe 1 schwarze
Kreuze), eine Wachstumsrate, derer einer unmodifizierten Wildtyphefe
vergleichbar, zu messen (im 100 ml Schüttelkolben in YPD-Medium
hat der Stamm AH22ura3Δsdh2Δidh1 eine im Vergleich
zu Stamm AH22ura3 (Wildtyp) nur um 11% geringere Wachstumsrate,
Quelle: eigene Daten).
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Ein
Wachstum eines Hefestammes mit einer idh1 Deletion ist nur möglich,
da diese Deletion nicht zu einem vollständigen Verschwinden
der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität führt. Der
Grund hierfür sind 3 weitere Isoenzyme der Isocitrat-Dehydrogenase,
welche den Wegfall des dimeren Hauptenzyms, kodiert durch die Gene
IDH1 und IDH2, bezüglich der Bildung von α-Ketoglutarat
kompensieren können. Die Synthese von α-Ketoglutarat
ist für ein Wachstum der Hefezelle auf Minimalmedien zwingend
erforderlich, da aus diesem Intermediat die Aminosäure
Glutamat gebildet wird, ohne die kein Wachstum möglich
ist.
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In
einem 2-stufigen Fermentationsprozess zur Herstellung von Bernsteinsäure
mit Hefe ist die effektive Trennung von Wachtums- und Produktionsphase
also nur durch die vollständige Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase
Aktivität im Produktionsstamm möglich, weil dadurch
eine Glutamat-Auxotrophie gewährleistet ist, was zur Folge
hat, dass die Hefe in Medium ohne supplementiertem Glutamat kein
Wachstum aufweist. Dies kann genutzt werden, um über die
Supplementierung von Glutamat zum Kulturmedium den Fermentationsprozess
zu steuern. Über die Menge des zugegeben Glutamats zum
Kulturmedium kann die Dauer der Wachstumsphase, sowie die angestrebte
Zelldichte in dieser Phase effektiv gesteuert werden. Mit zunehmender
Menge nehmen auch Dauer und Zelldichte zu.
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Ist
das Glutamat im Kulturmedium verbraucht ist kein weiteres Wachstum
möglich und sämtlicher Kohlenstoff kann effektiv
zur Synthese von Bernsteinsäure genutzt werden, deren Bildung
dann nicht in Konkurrenz zur Bildung von Biomasse steht. Dies trägt
ganz wesentlich zur Ausbeuteerhöhung und zur Steigerung der
Effizienz des Produktionsprozesses bei. Diese Trennung von Wachstums-
und Produktionsphase im Fermentationsprozess auf Glucose und anderen
fermentierbaren Kohlenstoffquellen über die Supplementierung von
Glutamat kann nur realisiert werden, wenn zusätzlich zur
Deletion des Gens idh1 mindestens noch das Gen idp1, welches für
ein Isoenzym der Isocitrat-Dehydrogenase kodiert, deletiert wird.
Nur die vollständige Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase
Aktivität gewährleistet die dafür nötige
Glutamat-Auxotrophie.
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Ein
weiterer Vorteil der vollständigen Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase
Aktivität liegt darin begründet, dass so sämtlicher
Kohlenstoff im respirativen System der Hefe in den Glyoxylatzyklus
in Richtung Bernsteinsäure umgeleitet wird und nicht zu α-Ketoglutarat
abfließen kann, was zu Ausbeuteverlusten führen würde
(siehe 1 e.)).
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Dazu
wurde die kodierende Nukleinsäuresequenz für die
Deletionskassette loxP-kanMX-loxP durch PCR unter Verwendung von
Standardmethoden aus dem Vektor pUG6 (Guldener et al. 1996)
amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten
besteht: loxP-kanMX-loxP. Als Primer wurden Oligonukleotid-Sequenzen
ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen
je die 5' oder die 3' Sequenz zu Beginn und am Ende des nativen
Locus des zu deletierenden Gens idp1 enthalten und im annealenden
Bereich die Sequenzen 5' der loxP-Region und 3' der zweiten loxP
Region. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte
Fragment loxP-kanMX-loxP amplifiziert wird und anderseits dieses
Fragment anschließend in Hefe transformiert werden kann
und durch homologe Rekombination dieses gesamte Fragment in den
zu deletierenden Genlocus der Hefe integriert.
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Als
Selektionsmarker dient die Resistenz gegen G418 (kodiert durch kanMX).
Um die Resistenz gegen G418 anschließend wieder zu entfernen
und so eine weitere Nutzung des kanMX Markers zu ermöglichen, wird
der entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47 (Guldener
et al. 1996) transformiert. Durch diesen Vektor wird die
cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hat, dass
der Sequenz-Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombiniert.
Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen
am deletierten Genlocus idp1 zurückbleibt. Die Folge ist,
das der Hefestamm die G418-Resistenz wieder verliert und damit geeignet
ist, weitere Gene mittels dieses cre-lox Systems in den Hefestamm
zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin
durch eine Gegenselektion auf YNB-Agarplatten supplimentiert mit
Uracil (20 mg/L) und FOA (5-Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder entfernt
werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid tragen,
zunächst unter nicht selektiven Bedingungen kultiviert
werden und anschließend auf FOA-haltigen Selektivplatten
angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich
Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren.
Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten.
-
Der
Produktionsstamm AH22ura3Δsdh1Δsdh2Δidh1Δidp1
wurde auf seine Wachstumseigenschaften mit und ohne supplementiertem
Glutamat evaluiert. Als Referenzstamm wurde AH22ura3Δsdh1Δsdh2Δidh1, also
der Stamm ohne zusätzliche Deletion von idp1, mitgeführt.
-
Die
beiden Stämme wurden in 20 ml WM8-Medium in 100 ml Kolben
einmal mit 3,52 g/l Ammoniumsulfat (als Sticksstoffquelle) und 0,05
M K2HPO4, sowie 0,05 M KH2PO4 als Pfuffer und in standard WM8-Medium
(Lang and Looman 1995), welches 10 g NaGlutamat als Stickstoffquelle
enthält, kultiviert. Nach 64 h wurde die optische Dichte
der 4 Kulturen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Optische Dichte der angegebenen
Stämme nach 64 stündiger Kultivierung in WM8 Medium
mit und ohne Glutamat. Im Medium ohne Glutamat wurde NH3SO4 als
Stickstoffquelle supplementiert.
| | Stamm | OD600/ml
in WM8 mit NaGlutamat | OD600/ml
in WM8 ohne NaGlutamat |
| 1 | AH22ura3Δsdh2Δsdh1Δidh1 | 26,4 | 10 |
| 2 | AH22ura3Δsdh2Δsdh1Δidh1Δidp1 | 29,5 | 0 |
-
In
Tabelle 2 ist zu sehen, daß die zusätzliche Deletion
von idp1 in einem idh1 Stamm zu einer Glutamat Auxotrophie auf Glucose
führt, da der Stamm AH22ura3Δsdh2Δsdh1Δidh1Δidp1
in Medium ohne Glutamat im Gegensatz zu AH22ura3Δsdh2Δsdh1Δidh1
kein Wachstum mehr aufweist. Die singuläre Deletion von
idh1 führt nicht zu einer Glutamat Auxotrophie. Die Trennung
von Wachstums- und Produktionsphase in einem 2-stufigen Produktionsprozess
zur Herstellung von Bernsteinsäure und anderen organischen
Säuren auf Glucose über Glutamat-Supplementierung
ist nur in einem Stamm mit den deletierten Genen idh1 und idp1 möglich.
Wenn eine weitere Stickstoffquelle, wie zum Beispiel Ammoniumsulfat,
zugegeben wird ist ein Wachstum einer Δidh1Δidp1
Mutante in Minimalmedium schon ab sehr geringen Mengen an supplementiertem
Glutamat möglich (etwa 20 mg/l).
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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