DE102006056526A1

DE102006056526A1 - Process for the stereoselective synthesis of chiral epoxides by ADH reduction of alpha-leaving group-substituted ketones and cyclization

Info

Publication number: DE102006056526A1
Application number: DE200610056526
Authority: DE
Inventors: Andreas Dr. Meudt; Richard Dr. Wisdom
Original assignee: Archimica GmbH
Current assignee: Euticals GmbH
Priority date: 2006-11-30
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2008-06-05
Also published as: WO2008064817A2; WO2008064817A3; EP2086952A2

Abstract

Verfahren zur Herstellung von chiralen Epoxiden durch Reduktion von alpha-Abgangsgruppen-substituierten Ketonen mit zellfreien (R)- oder (S)-selektiven Alkoholdehydrogenasen in Gegenwart eines Cofaktors und optional eines geeigneten Systems zur Regenerierung des oxidierten Cofaktors zu den chiralen Alkoholen und nachfolgende baseninduzierte Cyclisierung zu den chiralen Epoxiden (GLEICHTUNG 1), $F1 worin LG für F, Cl, Br, I, OSO2Ar, OSO2R4 oder OP(O)OR4R5 bedeuten kann und R1, R2 und R3 unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten C1-C20-Alkylrest steht, einen gegebenenfalls substituierten C3-C10-Cycloalkyl- oder Alkenylrest oder einen gegebenenfalls substituierten carbo- oder heterocyclischen Arylrest oder einen Rest aus der Gruppe CO2R4, CONR4R5, COSR4, CS2R4, C(NH)NR4R5, CN, CHal3, NR4R5, Cl, F, Br, I oder SiR4R5R6 darstellt, wobei R4, R5 und R6 unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls sub steht, einen gegebenenfalls substituierten C3-C10-Cycloalkyl-, Alkenylrest oder einen substituierten carbo- oder heterocyclischen Arylrest symbolisiert, und der intermediär gebildete chirale Alkohol II nicht isoliert wird.A process for producing chiral epoxides by reducing alpha-leaving group-substituted ketones with cell-free (R) or (S) -selective alcohol dehydrogenases in the presence of a cofactor and optionally a suitable system for regenerating the oxidized cofactor to the chiral alcohols and subsequent base-induced cyclization to the chiral epoxides (EQUATION 1), $ F1 where LG is F, Cl, Br, I, OSO 2 Ar, OSO 2 R 4 or OP (O) OR 4 R 5 and R 1 , R 2 and R 3 independently of one another is hydrogen, a branched or unbranched, optionally substituted C 1 -C 20 -alkyl radical, an optionally substituted C 3 -C 10 cycloalkyl or alkenyl radical or an optionally substituted carbo- or heterocyclic aryl radical or a radical from the group CO 2 R 4 , CONR 4 R 5 , COSR 4 , CS 2 R 4 , C (NH) NR 4 R 5 , CN, CHal 3 , NR 4 R 5 , Cl, F, Br, I or SiR 4 R 5 R 6 where R 4 , R 5 and R 6 independently of one another represents hydrogen, a branched or unbranched, optionally sub, an optionally substituted C 3 -C 10 cycloalkyl, alkenyl or a substituted carbo- or heterocyclic aryl radical , and the intermediately formed chiral alcohol II is not isolated.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur stereoselektiven Synthese von chiralen Epoxiden durch (R)- oder (S)-Alkoholdehydrogenase-Reduktion von α-Abgangsgruppen-substituierten Ketonen zu den entsprechenden chiralen Alkoholen und nachfolgende durch eine Base induzierte Cyclisierung zu den entsprechenden Epoxiden (GLEICHUNG 1).The The invention relates to a process for the stereoselective synthesis of chiral epoxides by (R) - or (S) -alkanol dehydrogenase reduction of α-leaving group-substituted Ketones to the corresponding chiral alcohols and subsequent base-induced cyclization to the corresponding epoxides (EQUATION 1).

GLEICHUNG 1

EQUATION 1

Der Anteil chiraler Verbindungen am Gesamtmarkt für Pharma-Feinchemikalien und -vorprodukte lag 2004 bereits bei über 40% und wächst mit hoher Dynamik. Insbesondere enzymatische Anwendungen fallen dabei durch die höchsten Wachstumsraten in der gesamten organischen Synthese auf, je nach Studie werden bis zu 35% jährlicher Wachstum bis zum Jahr 2010 vorhergesagt. Fast täglich erscheinen neue interessante Beschreibungen zur Herstellung von chiralen Zwischenprodukten verschiedenster Substanzklassen.Of the Share of chiral compounds in the overall market for pharmaceutical fine chemicals and -products already exceeded 40% in 2004 and is growing high dynamics. In particular, enzymatic applications are involved through the highest Growth rates in the entire organic synthesis, depending on Study will be up to 35% yearly Growth predicted by 2010. Almost daily new interesting descriptions appear for the preparation of chiral intermediates of various substance classes.

Umso erstaunlicher ist es, dass es nur wenige allgemein anwendbare Methoden zur Herstellung von chiralen Epoxiden gibt, vor allem da diese gespannten Dreiringether äußerst vielseitig in der organischen Synthese einsetzbar sind. Am häufigsten angewandt wird die Zerstörung des nicht gewünschten Enantiomeren durch Übergangsmetall-Katalyse oder durch enzymatische Katalyse und anschließende Isolierung des gewünschten Enantiomeren. Der große Nachteil dieser Methode ist der Verlust von mindestens 50% der Substratmenge durch die notwendige Zerstörung des falschen Enantiomeren. Verbunden mit weiteren Prozessproblemen resultieren oft nur Ausbeuten von 40% und weniger.more more astonishing is that there are only a few commonly applicable methods for the production of chiral epoxides, especially since these are tensioned Three-ring ether extremely versatile can be used in organic synthesis. Most frequently the destruction is used of not desired Enantiomers by transition metal catalysis or by enzymatic catalysis and subsequent isolation of the desired Enantiomers. The great Disadvantage of this method is the loss of at least 50% of the amount of substrate through the necessary destruction the wrong enantiomer. Connected with further process problems Often only yields of 40% and less result.

Katalytisch-enantioselektive chemische Standardverfahren für die enantioselektive Reduktion von Ketonen sind die asymmetrische Hydrierung mit homogenen Edelmetallkatalysatoren, die Reduktion durch Organoborane [ H. C. Brown, G. G. Pai, J. Org. Chem. 1983, 48, 1784 ], die aus Borhydriden und chiralen Diolen oder Aminoalkoholen [ K. Soai, T. Yamanoi, H. Hikima, J. Organomet. Chem. 1985, 290 ; H. C. Brown, B. T. Cho, W. S. Park, J. Org. Chem. 1987, 52, 4020 ] hergestellt werden, die Reduktion durch Reagenzien, hergestellt aus Boran und Aminoalkoholen [ S. Itsuno, M. Nakano, K. Miyazaki, H. Masuda, K. Ito, H. Akira, S. Nakahama, J. Chem. Soc., Perkin Trans 1, 1985, 2039 ; S. Itsuno, M. Nakano, K. Ito, A. Hirao, M. Owa, N. Kanda, S. Nakahama, ibid. 1985, 2615 ; A. K. Mandal, T. G. Kasar, S. W. Mahajan, D. G. Jawalkar, Synth. Commun. 1987, 17, 563 ], oder durch Oxazaborolidine [ E. J. Corey, R. K. Bakshi, S. Shibata, J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5551 ; E. J. Corey, S. Shibata, R. K. Bakshi, J. Org. Chem. 1988, 53, 2861 ]. Die großen Nachteile dieser Methoden sind die Verwendung von teuren chiralen Auxiliaren, die oftmals durch aufwendige Synthese dargestellt werden müssen, der Einsatz von Hydriden, die explosionsfähige Gase abspalten können, und der Einsatz von Schwermetallen, die das erhaltene Produkt oftmals kontaminieren und schwierig abzutrennen sind.Catalytic enantioselective standard chemical processes for the enantioselective reduction of ketones include asymmetric hydrogenation with homogeneous noble metal catalysts, reduction by organoborane [ HC Brown, GG Pai, J. Org. Chem. 1983, 48, 1784 ] derived from borohydrides and chiral diols or amino alcohols [ K. Soai, T. Yamanoi, H. Hikima, J. Organomet. Chem. 1985, 290 ; HC Brown, BT Cho, WS Park, J. Org. Chem. 1987, 52, 4020 ], the reduction by reagents prepared from borane and aminoalcohols [ S. Itsuno, M. Nakano, K. Miyazaki, H. Masuda, K. Ito, H. Akira, S. Nakahama, J. Chem. Soc., Perkin Trans 1, 1985, 2039 ; S. Itsuno, M. Nakano, K. Ito, A. Hirao, M. Owa, N. Kanda, S. Nakahama, ibid. 1985, 2615 ; AK Mandal, TG Kasar, SW Mahajan, DG Jawalkar, Synth. Commun. 1987, 17, 563 ], or by oxazaborolidines [ EJ Corey, RK Bakshi, S. Shibata, J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5551 ; EJ Corey, S. Shibata, RK Bakshi, J. Org. Chem. 1988, 53, 2861 ]. The major disadvantages of these methods are the use of expensive chiral auxiliaries, which often have to be prepared by complex synthesis, the use of hydrides, which can split off explosive gases, and the use of heavy metals, which often contaminate the product obtained and are difficult to separate.

Die katalytisch-enantioselektiven biochemischen Standardverfahren zur Herstellung von chiralen Epoxiden nutzen fermentativ Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) [ M. de Carvalho, M. T. Okamoto, P. J. S. Moran, J. A. R. Rodrigues, Tetrahedron 1991, 47, 2073 ] oder andere Mikroorganismen [ EP 0 198 440 B1 ,] im sogenannten „Whole-cell-Verfahren", Cryptococcus macerans [ M. Imuta, K. I. Kawai, H. Ziffer, J. Org. Chem. 1980, 45, 3352 ].The catalytic, enantioselective standard biochemical processes for the production of chiral epoxides use fermentatively baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) [ M. de Carvalho, M. Okamoto, PJS Moran, JAR Rodrigues, Tetrahedron 1991, 47, 2073 ] or other microorganisms [ EP 0 198 440 B1 , in the so-called "whole cell method", Cryptococcus macerans [ M. Imuta, KI Kawai, H.P., J. Org. Chem. 1980, 45, 3352 ].

Insbesondere die potentielle Kontamination der Produkte mit tierischen Krankheitserregern, wie z.B. im letzteren Fall, verbietet oft schon die Anwendung solcher Methoden in der Herstellung von Vorprodukten für die pharmazeutische Industrie.Especially the potential contamination of products with animal pathogens, such as. in the latter case, often prohibits the use of such Methods in the production of precursors for the pharmaceutical industry.

Ein weiterer großer Nachteil insbesondere von whole cell-Verfahren ist die aufwendige Aufarbeitung von Fermentationslösungen zur Isolierung der gewünschten Produkte. Insbesondere aber wird in der Literatur das Problem diskutiert, dass Zellen meist mehr als eine Ketoreductase enthalten, die zusätzlich oft verschiedene Enantioselektiväten aufweisen, so dass insgesamt nur ein geringer Enantiomerenüberschuß (enantiomeric excess, ee) erhalten wird.One another big one Disadvantage in particular of whole cell procedures is the elaborate Processing of fermentation solutions for isolation of the desired Products. In particular, however, the problem is discussed in the literature, that cells usually contain more than one ketoreductase, which in addition often different enantioselectivities so that overall only a small enantiomeric excess (enantiomeric excess, ee) is obtained.

In einer Reihe von Publikationen ist die enzymatische Reduktion von α-Halogen-ketonen mit Hilfe von isolierter Alkohol-Dehydrogenase in geringer Konzentration beschrieben. Die damit erhaltenen Halohydrin-Verbindungen, die einen mehr oder minder hohen ee-Wert aufweisen, werden isoliert und gereinigt. Es ist ferner bekannt, aus den Halohydrin-Verbindungen Epoxide herzustellen.In A number of publications use the enzymatic reduction of α-halo ketones of isolated alcohol dehydrogenase in low concentration. The resulting halohydrin compounds containing a more or less have lower ee value, are isolated and purified. It It is also known to produce epoxides from the halohydrin compounds.

In dem Verfahren gemäß US Statutory Invention Registration 1891 H ( Patel RN, Szarka LJ, Banerjee A and McNamee CG, 2000 ) werden α-Halogen-ketone enzymatisch mit Hilfe ganzer Zellen, z.B. von Escherichia coli, oder Zellsuspensionen reduziert. Dabei wird die Ketogruppe stereoselektiv zu einer sekundären Hydroxygruppe reduziert. Als Ausgangsmaterialien werden insbesondere α-Halogen-Ketone mit Carbaminsäureester-Gruppen verwendet, die bereits ein Chiralitätszentrum aufweisen. Aus diesen werden durch enzymatische Reduktion Verbindung mit zwei nebeneinander liegenden Chiralitätszentren erhalten. Die Reduktion erfolgt mit nur geringer bis mäßiger Ausbeute (in einigen Fällen nur 1%, bestenfalls 54%), auch die Diastereomerenreinheit ist in etlichen Fällen nicht ausreichend. Konkret offenbart ist die Reduktion von (1S)-(3-Chlor-2-oxo-1-benzyl-propyl)-carbaminsäure-tert.-butylester mit Hilfe ganzer Zellen oder zellfreier Extrakte und Cofaktor zu dem entsprechenden Halohydrin. Die typische Substratkonzentration liegt dabei im Bereich von 3 mM. Nach vollständiger Reaktion wird das Halohydrin durch Extrahieren isoliert und durch Umkristallisieren gereinigt. Es ist darüber hinaus offenbart, daß die chiralen Halohydrine unter der Einwirkung von Basen, wie KOH, in Epoxide umgewandelt werden können. Durch diese weitere Umsetzung bleibt die Gesamtausbeute bestenfalls gleich, in der Regel wird sie jedoch noch weiter zurückgehen. Das Verfahren ist dementsprechend großtechnisch unbrauchbar.In the process according to US Statutory Invention Registration 1891 H ( Patel RN, Szarka LJ, Banerjee A and McNamee CG, 2000 ) α-halo ketones are enzymatically reduced with the help of whole cells, such as Escherichia coli, or cell suspensions. The keto group is stereoselectively reduced to a secondary hydroxy group. The starting materials used are, in particular, α-halogen ketones with carbamic ester groups which already have a center of chirality. From these, by enzymatic reduction, connection with two adjacent chiral centers are obtained. The reduction is carried out with only a slight to moderate yield (in some cases only 1%, at best 54%), the diastereomeric purity is not sufficient in many cases. Specifically disclosed is the reduction of (1S) - (3-chloro-2-oxo-1-benzyl-propyl) -carbamic acid tert-butyl ester with the aid of whole cells or cell-free extracts and cofactor to the corresponding halohydrin. The typical substrate concentration is in the range of 3 mM. After complete reaction, the halohydrin is isolated by extraction and purified by recrystallization. It is also disclosed that the chiral halohydrins can be converted to epoxides under the action of bases such as KOH. As a result of this further implementation, the overall yield remains at best the same, but as a rule it will decline even further. Accordingly, the process is unusable industrially.

In DE 101 05 866 A1 (Forschungszentrum Juelich GmbH, 2002), ist ein Verfahren zur Herstellung von chiralen, propargylischen, terminalen Epoxiden offenbart. Diese werden aus α-Halogen-substituierten propargylischen Ketonen hergestellt, die zunächst enzymatisch unter der Einwirkung einer Alkohol-Dehydrogenase und eines Systems zur Cofaktor-Regenerierung zu chiralen, α-Halogen-substituierten propargylischen Alkoholen umgesetzt werden. Die Konzentration des als Ausgangsmaterials dienenden Ketons beträgt allgemein 10 mM. Anschließend werden die α-Halogen-substituierten propargylischen Alkohole mit einer Base behandelt. Dabei bilden sich die genannten chiralen, propargylischen Epoxide. Die chiralen Alkohole werden mit einem organischen Lösemittel extrahiert und dann säulenchromatographisch gereinigt. Anschließend werden sie zu den Epoxiden umgesetzt. Konkret offenbart ist die Reduktion von 4-tert.-Butyldimethylsilyl-1-chlor-3-butin-2-on zu (S)-4-tert.-Butyldimethylsilyl-1-chlor-3-butin-2-ol, das dann in einer weiteren Stufe unter Baseneinwirkung zu (S)-1-tert.-Butyldimethylsilyl-3,4-epoxy-but-1-in umgesetzt wird. Die Reaktion verläuft mit einer Ausbeute von 55% in der 1. Stufe und 69% in der 2. Stufe, insgesamt beträgt die Ausbeute damit gerade einmal 38%. Dieses Verfahren ist damit technisch unbrauchbar.In DE 101 05 866 A1 (Forschungszentrum Juelich GmbH, 2002) discloses a process for the preparation of chiral, propargylic, terminal epoxides. These are prepared from α-halo-substituted propargylic ketones which are first enzymatically reacted under the action of an alcohol dehydrogenase and a system for cofactor regeneration to chiral, α-halo-substituted propargylic alcohols. The concentration of the starting ketone is generally 10 mM. Subsequently, the α-halo-substituted propargylic alcohols are treated with a base. The mentioned chiral, propargylic epoxides are formed. The chiral alcohols are extracted with an organic solvent and then purified by column chromatography. Then they are converted to the epoxides. Specifically disclosed is the reduction of 4-tert-butyldimethylsilyl-1-chloro-3-butyn-2-one to (S) -4-tert-butyldimethylsilyl-1-chloro-3-butyn-2-ol which was then in a further step under base action to (S) -1-tert-butyldimethylsilyl-3,4-epoxy-but-1-in is reacted. The reaction proceeds with a yield of 55% in the first stage and 69% in the second stage, the total yield is thus just 38%. This method is thus technically unusable.

Bekannt war schließlich auch die Reduktion von α-Fluor-, α-Chlor- und α-Brom-acetophenon mit Pferdeleber-Alkoholhydrogenase (HLADH) und NADH2 [ D. D. Tanner, A. R. Stein, J. Org. Chem. 1988, 53, 1642 .]. Die Ausgangskonzentration an substituiertem Acetophenon betrug etwa 10 mM. Unter den dort angegebenen Reaktionsbedingungen wurde allein aus α-Chlor-acetophenon ein chiraler sekundärer Alkohol erhalten, und dieser auch nur in schlechter Ausbeute. Eine Umsetzung zu dem entsprechenden Epoxid ist nicht beschrieben.Finally, the reduction of α-fluoro-, α-chloro- and α-bromo-acetophenone with horse liver alcohol hydrogenase (HLADH) and NADH2 [ DD Tanner, AR Stein, J. Org. Chem. 1988, 53, 1642 .]. The starting concentration of substituted acetophenone was about 10 mM. Under the reaction conditions given there, a chiral secondary alcohol was obtained from α-chloro-acetophenone alone, and this only in poor yield. A reaction to the corresponding epoxide is not described.

Im Stand der Technik ist bisher kein Verfahren zur Herstellung von chiralen Epoxiden offenbart, das ökonomisch sinnvoll und industriell einsetzbar ist. In den bekannten Verfahren ist die Konzentration an Keton-Startmaterial und dementsprechend an daraus gebildetem Halohydrin gering und erfordert eine aufwendige Isolierung des Halohydrins, was sie für industrielle Anwendungen unbrauchbar macht. Durch die Isolierung und Reinigung müssen zudem Nebenprodukte abgetrennt werden, die sich ansonsten in Folgestufen anreichern und in die darin ablaufenden Reaktionen beeinträchtigen können. Diese zusätzlichen Schritte lassen die Gesamtausbeute stark zurückgehen.in the Prior art is not yet a method for the production of revealing chiral epoxies that makes economic sense and industrial can be used. In the known methods, the concentration to ketone starting material and accordingly formed therefrom Halohydrin low and requires a complex isolation of the halohydrin, what she for makes industrial applications useless. By the isolation and cleaning have to In addition, by-products are separated, which are otherwise in subsequent stages accumulate and interfere with the reactions taking place in it can. This extra Steps cause the overall yield to fall sharply.

Es wäre daher sehr wünschenswert, ein enzymatisches Verfahren zu haben, das, ausgehend von leicht zugänglichen α-Abgangsgruppen-substituierten Ketonen, möglichst stereoselektiv zu den entsprechenden chiralen Alkoholen führt, die sich durch eine nachfolgende, durch eine Base induzierte Cyclisierung in die entsprechenden chiralen Epoxiden in einer möglichst hohen Gesamtausbeute umsetzen lassen, ohne dass dabei die intermediär gebildeten chiralen Alkohole isoliert werden müssen. Der Enantiomerenüberschuß (ee) sollte dabei 90% oder mehr, bevorzugt 95% oder mehr, insbesondere 98 oder mehr, betragen. Durch geeignete Wahl der Alkohol-Dehydrogenase sollen beide Enantiomere prinzipiell zugänglich sein. Aufgrund der bekannten und bereits diskutierten Probleme beim Einsatz ganzer Zellen sollen zudem isolierte Alkoholdehydrogenasen Einsatz finden, die erst jüngst ausreichend zugänglich geworden sind.It would therefore be highly desirable to have an enzymatic process which, starting from readily available α-leaving group-substituted ketones, proceeds as stereoselectively as possible to the corresponding chiral alcohols, which undergo subsequent base-induced cyclization into the corresponding chiral epoxides can be implemented in the highest possible overall yield, without while the intermediately formed chiral alcohols must be isolated. The enantiomeric excess (ee) should be 90% or more, preferably 95% or more, in particular 98 or more. By suitable choice of the alcohol dehydrogenase, both enantiomers should be accessible in principle. Due to the known and already discussed problems in the use of whole cells also isolated alcohol dehydrogenases are to find use, which have become sufficiently accessible only recently.

Überraschend wurde nunmehr gefunden, daß sich die beschriebenen Probleme lösen lassen, wenn eine Base direkt dem Reaktionsgemisch hinzugefügt wird, unmittelbar nachdem die Biotransformation zur Bildung des Halohydrins abgeschlossen ist. Eine Isolierung des intermediär gebildeten Halohydrins ist dann nicht mehr erforderlich. Auch die proteinhaltige wässrige Phase muß nicht unbedingt abgetrennt werden. Auch kann das Keton in einer wesentlich höheren Konzentration als bisher möglich eingesetzt werden. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Epoxid ist zudem besonders rein.Surprised has now been found that solve the problems described when a base is added directly to the reaction mixture, immediately after the biotransformation to form the halohydrin is completed. An isolation of the intermediately formed halohydrin is then no longer necessary. Also the protein-containing aqueous phase does not have to necessarily be separated. Also, the ketone can be essential in one higher Concentration as previously possible be used. The produced by the process according to the invention Epoxy is also very pure.

Das vorliegende Verfahren betrifft demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von chiralen Epoxiden durch Reduktion von α-Abgangsgruppen-substituierten Ketonen mit einer zellfreien (R)- oder (S)-selektiven Alkoholdehydrogenase (ADH) in Gegenwart eines Cofaktors zu den entsprechenden chiralen Alkoholen und nachfolgende, baseninduzierte Cyclisierung zu den entsprechenden chiralen Epoxiden (GLEICHUNG 1),

GLEICHUNG 1 worin
LG für F, Cl, Br, I, OSO₂Ar, OSO₂R₄ oder OP(O)OR₄OR₅ steht und
R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten C₁-C₂₀ Alkylrest steht, einen gegebenenfalls substituierten C₃-C₁₀-Cycloalkyl-, Alkenylrest oder einen gegebenenfalls substituierten carbo- oder heterocyclischen Arylrest oder einen Rest aus der Gruppe CO₂R₄, CONR₄R₅, COSR₄, CS₂R₄, C(NH)NR₄R₅, CN, CHaI₃, OAr, SAr, OR₄, SR₄, CHO, OH, NR₄R₅, Cl, F, Br, I oder SiR₄R₅R₆ darstellt, wobei
R₄, R₅ und R₆ unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten C₁-C₂₀ Alkylrest steht, einen gegebenenfalls substituierten C₃-C₁₀-Cycloalkyl-, Alkenylrest oder einen gegebenenfalls substituierten carbo- oder heterocyclischen Arylrest symbolisiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der intermediär gebildete Alkohol II ohne Isolierung mit Hilfe der Base zu dem Epoxid umgesetzt wird.The present process accordingly relates to a process for the preparation of chiral epoxides by reduction of α-leaving group-substituted ketones with a cell-free (R) or (S) -selective alcohol dehydrogenase (ADH) in the presence of a cofactor to the corresponding chiral alcohols and subsequent, base-induced cyclization to the corresponding chiral epoxides (EQUATION 1),

EQUATION 1 wherein
LG represents F, Cl, Br, I, OSO ₂ Ar, OSO ₂ R ₄ or OP (O) OR ₄ OR ₅ and
R ₁ , R ₂ and R ₃ independently of one another represent hydrogen, a branched or unbranched, optionally substituted C ₁ -C ₂₀ -alkyl radical, an optionally substituted C ₃ -C ₁₀ -cycloalkyl, alkenyl radical or an optionally substituted carbo- or heterocyclic aryl radical or a radical from the group CO ₂ R ₄ , CONR ₄ R ₅ , COSR ₄ , CS ₂ R ₄ , C (NH) NR ₄ R ₅ , CN, CHal ₃ , OAr, SAr, OR ₄ , SR ₄ , CHO, OH, NR ₄ R ₅ , Cl, F, Br, I or SiR ₄ R ₅ R ₆ , where
R ₄ , R ₅ and R ₆ independently of one another represent hydrogen, a branched or unbranched, optionally substituted C ₁ -C ₂₀ -alkyl radical, an optionally substituted C ₃ -C ₁₀ -cycloalkyl, alkenyl radical or an optionally substituted carbo- or heterocyclic aryl radical symbolized, which is characterized in that the intermediately formed alcohol II is reacted without isolation with the aid of the base to the epoxide.

In einer bevorzugten Ausführungsform stellt R₁ Phenyl dar, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Halogenatomen und R₂ und R₃ sind Wasserstoffatome.In a preferred embodiment, R _{1 is} phenyl which is optionally substituted with one or more halogen atoms and R ₂ and R ₃ are hydrogen atoms.

Ar steht dabei, wie üblich, für einen einen ein- oder mehrkernigen, carbocyclischen oder heterocyclischen aromatischen Rest, bevorzugt für Phenyl, Naphthyl, Anthracenyl, Furanyl, Thiophenyl, Benzimidazolyl usw. Allgemein enthalten die carbocylischen aromatischen Reste 6 bis 20 Kohlenstoffatome als Ringglieder, bei den heterocyclischen aromatischen Resten können es auch weniger als 6 Kohlenstoffatome sein. Bei dem bzw. bei den Heteroatom(en) in den heterocyclischen aromatischen Resten handelt es sich vorzugsweise um ein oder mehrere Stickstoff-, Sauerstoff- und/oder Schwefelatom(e). Diese Erläuterungen gelten auch für die oben genannten Reste R₁ bis R₆, soweit es sich um carbo- oder heterocyclische Arylreste handelt.Ar is, as usual, a mononuclear or polynuclear, carbocyclic or heterocyclic aromatic radical, preferably phenyl, naphthyl, anthracenyl, furanyl, thiophenyl, benzimidazolyl, etc. Generally, the carbocyclic aromatic radicals contain from 6 to 20 carbon atoms as ring members the heterocyclic aromatic radicals may also be less than 6 carbon atoms. The heteroatom (s) in the heterocyclic aromatic radicals are preferably one or more nitrogen, oxygen and / or sulfur (s). These explanations also apply to the abovementioned radicals R ₁ to R ₆ , insofar as they are carbo- or heterocyclic aryl radicals.

Die Alkyl-, Cycloalkyl-, Alkenyl-, Aryl- oder Heteroarylreste können noch weiter substituiert sein, solange die Substituenten die Umsetzung nicht beeinträchtigen. Solche sind beispielsweise Halogenatome (F, Cl, Br, I), Alkylgruppen (Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl, tert.-Butyl usw.) oder Alkoxygruppen (Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, Isobutoxy, sec.-Butoxy, tert.-Butoxy usw.).The alkyl, cycloalkyl, alkenyl, aryl or heteroaryl radicals may be further substituted, as long as the substituents do not affect the reaction. Such are, for example, halogen atoms (F, Cl, Br, I), alkyl groups (methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, etc.) or alkoxy groups (methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, etc.).

Hal steht für ein Halogenatom, insbesondere Fluor, Chlor, Brom oder Jod.Hal stands for a halogen atom, in particular fluorine, chlorine, bromine or iodine.

Geeignete ADH-Enzyme sind (R)- oder (S)-Alkoholdehydrogenasen. Bevorzugt werden isolierte (zellfreie) ADH-Enzyme verwendet mit einer Enzymaktivität von 0,2 bis 200 kU pro Mol Substrat, besonders bevorzugt 0,5 bis 100 kU Enzymaktivität pro Mol Substrat, am meisten bevorzugt 1 bis 50 kU Enzymaktivität pro Mol Substrat.suitable ADH enzymes are (R) - or (S) -alcohol dehydrogenases. To be favoured isolated (cell-free) ADH enzymes used with an enzyme activity of 0.2 to 200 kU per mole of substrate, more preferably 0.5 to 100 kU enzyme activity per mole of substrate, most preferably 1 to 50 kU of enzyme activity per mole of substrate.

Vorzugsweise wird das Enzym in Bezug auf die Ausgangsverbindung katalytisch bis überstöchiometrisch eingesetzt. Geeignete ADH-Enzyme sind beispielsweise erhältlich von Biocatalytics Inc, Juelich Chiral Solutions GmbH or X-zyme GmbH, or Sigma-Aldrich Inc. Alternativ können sie auch aus natürlichen Quellen gewonnen werden. Verfahren zur Identifizierung, Charakterisierung, Klonierung und Exprimierung solcher Enzyme aus Zellmaterial sind zahlreich beschrieben und dem Fachmann bekannt. Bekannt ist auch eine Anzahl an Verfahren, mit denen sich die Eigenschaften der Enzyme verbessern lassen, insbesondere was deren Aktivität, Stabilität und Selektivität betrifft. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf die Verwendung von ADH-Enzymen aus bestimmten Quellen beschränkt.Preferably For example, the enzyme becomes catalytic to superstoichiometric with respect to the starting compound used. Suitable ADH enzymes are available, for example, from Biocatalytics Inc, Juelich Chiral Solutions GmbH or X-zyme GmbH, or Sigma-Aldrich Inc. Alternatively, you can they also made of natural Sources are obtained. Identification, characterization, Cloning and expression of such enzymes from cell material are numerous described and known in the art. It is also known a number of methods that address the properties of enzymes improve their activity, stability and selectivity. The inventive method is not limited to the use of ADH enzymes from certain sources.

Geeignete Cofaktoren sind NADPH₂, NADH₂, NAD oder NADP, oder deren Salze, wobei besonders bevorzugt NAD oder NADP verwendet werden. Bevorzugt ist eine Beladung mit 0,1 bis 10 g Cofaktor pro 10 Mol Substrat, besonders bevorzugt 0,5 bis 1,5 g Cofaktor pro 10 Mol Substrat. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren so ausgeführt, dass in Gegenwart eines geeigneten Systems zur Regenerierung des oxidierenden Cofaktors gearbeitet und dieser während des Verfahrens kontinuierlich wieder reduziert wird. Zur Reaktivierung der oxidierten Cofaktoren kommen typischerweise enzymatische oder andere dem Fachmann bekannte Methoden zum Einsatz.Suitable cofactors are NADPH ₂ , NADH ₂ , NAD or NADP, or salts thereof, more preferably NAD or NADP are used. Preference is given to loading with 0.1 to 10 g of cofactor per 10 mol of substrate, more preferably 0.5 to 1.5 g of cofactor per 10 mol of substrate. Preferably, the process according to the invention is carried out in such a way that, in the presence of a suitable system, the regeneration of the oxidizing cofactor is carried out and this is continuously reduced again during the process. For reactivating the oxidized cofactors, typically enzymatic or other methods known to those skilled in the art are used.

So wird beispielsweise durch Kopplung der Reduktion mit der Oxidation von Isopropanol zu Aceton mit ADH der Cofaktor kontinuierlich recycled und kann so in mehreren Oxidations/Reduktionscyclen eingesetzt werden.So for example, by coupling the reduction with the oxidation from isopropanol to acetone with ADH the cofactor is continuously recycled and can thus be used in several oxidation / reduction cycles.

Eine andere gebräuchliche Methode ist der Einsatz eines zweiten Enzymsystems im Reaktor. Zwei eingehend beschriebene Methoden sind beispielsweise der Einsatz von Formiatdehydrogenase zur Oxidation von Ameisensäure zu Kohlendioxid, oder der Einsatz von Glukose Dehydrogenase zur Oxidation von Glukose, um nur einige zu nennen.A other common ones Method is the use of a second enzyme system in the reactor. Two in depth Methods described are, for example, the use of formate dehydrogenase for the oxidation of formic acid to carbon dioxide, or the use of glucose dehydrogenase for Oxidation of glucose, just to name a few.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Reaktion in einem Lösungsmittel durchgeführt. Geeignete Lösungsmittel für die ADH-Reduktion sind dabei solche, die keine Nebenreaktionen ergeben, dies sind organische Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, lineare und verzweigte Alkohole, Ligroin, Butan, Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Cyclopentan, Cyclohexan, Cycloheptan, Cyclooctan, Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichlorethan, 1,1,2,2-Tetrachlorethan, Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Dimethylformamid, Diethylformamid, Dimethylacetamid, Diethylacetamid, Diethylether, Diisopropylether, tert.-Butyl-methylether, THF, Dioxan, Acetonitril, Toluol, Xylol oder Gemische aus diesen. Bevorzugt sind lineare oder verzweigte Alkohole oder lineare, verzweigte oder cyclische Ether, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, Diisopropylether, tert.-Butyl-methylether, Toluol, Xylol, Tetrahydrofuran (THF), Dioxan, oder Gemische aus diesen, ganz besonders bevorzugt sind Ethanol, Isopropanol, lineare und verzweigte Alkohole, Diethylether, Diisopropylether, tert.-Butyl-methylether, Toluol, Xylol, THF, Dioxan, oder Gemische aus diesen.In a preferred embodiment the reaction is in a solvent carried out. Suitable solvents for the ADH reduction are those that do not give side reactions, These are organic solvents such as methanol, ethanol, isopropanol, linear and branched alcohols, Ligroin, butane, pentane, hexane, heptane, octane, cyclopentane, cyclohexane, Cycloheptane, cyclooctane, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, 1,1,2,2-tetrachloroethane, methyl acetate, ethyl acetate, Propyl acetate, butyl acetate, dimethylformamide, diethylformamide, dimethylacetamide, Diethylacetamide, diethyl ether, diisopropyl ether, tert-butyl methyl ether, THF, dioxane, acetonitrile, toluene, xylene or mixtures of these. Preferred are linear or branched alcohols or linear, branched or cyclic ethers, such as methanol, ethanol, isopropanol, diisopropyl ether, tert-butyl methyl ether, Toluene, xylene, tetrahydrofuran (THF), dioxane, or mixtures of these, very particularly preferred are ethanol, isopropanol, linear and branched alcohols, diethyl ether, diisopropyl ether, tert-butyl methyl ether, Toluene, xylene, THF, dioxane, or mixtures of these.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren auch ohne Zusatz von Lösungsmittel durchgeführt werden.In a further preferred embodiment the process can also be carried out without addition of solvent.

Nach beendeter Epoxidierung kann die organische Phase auf einfache Weise von der wäßrigen Phase getrennt werden. Die Phasenseparation kann dabei durch einfaches Zusammenfließen erfolgen. Sie kann auch durch allgemein bekannte Mittel, wie Zentrifugieren oder Filtrieren unterstützt werden. Gegebenenfalls kann ein weiteres Lösungsmittel, ähnlich den oben genannten, hinzugefügt werden. Die wäßrige Phase kann zusätzlich mit organischen Lösungsmitteln extrahiert werden, um die Ausbeute noch weiter zu steigern. Falls erforderlich oder gewünscht, kann das Epoxid noch weiter gereinigt werden, beispielsweise durch Destillation oder, soweit es sich um einen Feststoff handelt, durch Umkristallisieren.To completed epoxidation, the organic phase in a simple manner separated from the aqueous phase become. The phase separation can be done by simply flowing together. It can also be by well-known means, such as centrifuging or filtering supports become. Optionally, another solvent, similar to the above, added become. The aqueous phase can additionally with organic solvents be extracted to further increase the yield. If necessary or desired, the epoxide can be further purified, for example by Distillation or, in the case of a solid, by Recrystallization.

In einigen Fällen empfiehlt es sich, der Reaktionslösung einen Puffer hinzuzusetzen, um den pH zu stabilisieren und sicher zu gehen, dass das Enzym in dem für seine Wirkung optimalen pH-Bereich reagieren kann. Der optimale pH-Bereich ist von Enzym zu Enzym unterschiedlich. Er liegt üblicherweise im Bereich von pH 3 bis 11. Geeignete Puffersysteme sind dem Fachmann bekannt, so dass an dieser Stelle nicht weiter darauf eingegangen werden muss.In some cases, it is advisable to add a buffer to the reaction solution in order to stabilize the pH and to ensure that the enzyme reacts in the optimal pH range for its action can. The optimal pH range varies from enzyme to enzyme. It is usually in the range of pH 3 to 11. Suitable buffer systems are known to the person skilled in the art, so that it is not necessary to discuss this further here.

Die Reduktion zu den Alkoholen (IIa) oder (IIb) kann dabei im allgemeinen bei Temperaturen im Bereich von 0 bis 90°C durchgeführt werden, bevorzugt sind Temperaturen im Bereich von 0 bis 60°C, besonders bevorzugt Temperaturen im Bereich von 0 bis +50°C, wobei tiefere Temperaturen im allgemeinen mit höheren Selektivitäten korreliert sind. Die Reaktionsdauer ist abhängig von der angewandten Temperatur und beträgt im allgemeinen 1 bis 72 Stunden, insbesondere 4 bis 45 Stunden. Die Reaktion läuft zweckmäßig in einem 2-Phasensystem ab. Dabei ist eine ausreichende Durchmischung notwendig, um einen ausreichenden Stoffaustausch an der Phasengrenze bei der enzymatischen Reduktion zum Alkohol wie auch bei der Umsetzung des Alkohols mit einer Base zum Epoxid zu gewährleisten. Durch Versuche im Labor- oder Technikumsmaßstab läßt sich bestimmen, welche Rührergeschwindigkeit am besten geeignet ist, um eine ausreichende Reaktionsgeschwindigkeit zu erreichen.The Reduction to the alcohols (IIa) or (IIb) can in general at temperatures ranging from 0 to 90 ° C, are preferred Temperatures in the range of 0 to 60 ° C, more preferably temperatures in the range from 0 to + 50 ° C, where lower temperatures generally correlate with higher selectivities are. The reaction time is dependent from the applied temperature and is generally 1 to 72 Hours, especially 4 to 45 hours. The reaction expediently runs in a 2-phase system from. In this case, sufficient mixing is necessary to a adequate mass transfer at the phase boundary at the enzymatic Reduction to alcohol as well as in the implementation of the alcohol with to ensure a base to the epoxide. By experiments in laboratory or pilot plant scale can be determined which stirrer speed is best suited to a sufficient reaction rate to reach.

Die ee-Werte der intermediär erzeugten Alkohole liegen dabei bei deutlich > 95%, in den meisten Fällen bei > 99%, bei gleichzeitig sehr hoher Toleranz gegenüber funktionellen Gruppen im Substrat.The ee values of the intermediate Alcohols produced are significantly> 95%, in most cases> 99%, with a very high tolerance across from functional groups in the substrate.

Die Cyclisierung der Alkohole (IIa) oder (IIb) zu den Epoxiden kann dabei im allgemeinen bei Temperaturen im Bereich von –100 bis +120°C durchgeführt werden, bevorzugt sind Temperaturen im Bereich von –30 bis +50°C, besonders bevorzugt Temperaturen im Bereich von 0 bis +40°C. Die Reaktionsdauer ist abhängig von der angewandten Temperatur und beträgt im allgemeinen 1 bis 72 Stunden, insbesondere 24 bis 60 Stunden. Ausreichender Umsatz kann hierbei z.B. durch GC- oder HPLC-Reaktionskontrolle sichergestellt werden.The Cyclization of the alcohols (IIa) or (IIb) to the epoxides can generally at temperatures in the range of -100 to + 120 ° C, preferred are temperatures in the range of -30 to + 50 ° C, more preferably temperatures in the range of 0 to + 40 ° C. The reaction time is dependent from the applied temperature and is generally 1 to 72 Hours, especially 24 to 60 hours. Sufficient sales can here e.g. by GC or HPLC reaction control be ensured.

Bevorzugt wird die Reaktionslösung vor Zugabe des ADH-Enzyms auf die Reaktionstemperatur temperiert.Prefers becomes the reaction solution Tempered to the reaction temperature before addition of the ADH enzyme.

Für die Cyclisierung sind prinzipiell alle Basen geeignet. Bevorzugt sind Aminbasen, Carbonate, Hydrogencarbonate, Hydroxyde, Hydride, Alkoholate, Phosphate, Hydrogenphosphate, besonders bevorzugt tertiäre Amine, ganz besonders bevorzugt Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Triethylamin oder Pyridin. Bevorzugt wird die Base dabei stöchiometrisch oder überstöchiometrisch in Bezug auf die Verbindung (IIa) oder (IIb) eingesetzt.For the cyclization Basically all bases are suitable. Preference is given to amine bases, Carbonates, hydrogencarbonates, hydroxides, hydrides, alcoholates, phosphates, Hydrogen phosphates, more preferably tertiary amines, most preferably Sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethylamine or pyridine. Prefers the base becomes stoichiometric or superstoichiometric with respect to the compound (IIa) or (IIb) used.

Die Isolierung der Produkte wird bevorzugt entweder destillativ oder durch Kristallisation vorgenommen. Im Allgemeinen sind durch die Eigenschaften der Enzyme die ee-Werte deutlich größer 99%, wodurch keine weitere Aufreinigung erforderlich ist.The Isolation of the products is preferred either by distillation or made by crystallization. In general, by the Properties of the enzymes the ee values are significantly greater than 99%, whereby no further purification is required.

Die Substratbreite dieser neuen Technologie ist sehr hoch. Es können α-Abgangsgruppen-substituierte Ketone mit Arylresten unterschiedlichen Substitutionsmusters ebenso gut eingesetzt werden wie aliphatische Halogenmethylketone. Chloracetylketone reagieren hierbei in besonders guten Ausbeuten und hohen ee-Werten.The Substrate width of this new technology is very high. There may be α-leaving group-substituted Ketones with aryl residues of different substitution pattern as well are well used as aliphatic halomethyl ketones. Chloracetylketone react in particularly good yields and high ee values.

Das neue Verfahren liefert damit in sehr hohen Ausbeuten, von > 85%, meist > 90%, und sehr hohen ee-Werten eine breite Palette an chiralen Epoxiden, wobei in Abhängigkeit vom eingesetzten Enzym beide Enantiomere erhalten werden können.The new process delivers in very high yields,> 85%, mostly> 90%, and very high ee values a wide range of chiral epoxides, depending on From the enzyme used both enantiomers can be obtained.

Das erfindungsgemäße Verfahren soll durch die nachfolgenden Beispiele erläutert werden, ohne die Erfindung darauf zu beschränken:The inventive method should be illustrated by the following examples, without the invention to limit it to:

Beispiel 1: (S)-2-(4-Fluor-phenyl)-oxiranExample 1: (S) -2- (4-fluoro-phenyl) -oxirane

Eine Mischung aus 150 ml Na-Phosphat-Puffer (0,1 M, pH 7,0), 22,2 g 2-Chlor-4'-fluor-acetophenon, 60 ml Isopropanol, 50 ml Diisopropylether, 30 mg NADP-Natriumsalz und 2750 U Lactobacillus brevis Alcoholdehydrogenase von Jülich Fine Chemicals GmbH wurde bei 20°C 64 Stunden gerührt. Die Reaktionskontrolle ergab einen Umsatz von 95%. Zu dieser Lösung wurde 20 ml Natriumhydroxid-Lösung (10 M) gegeben und weitere 2 Stunden gerührt. Die Reaktionskontrolle zeigte vollständigen Umsatz des Alkohols ins Epoxid. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 2 g Celite Hyflo gegeben, filtriert und das Filtrat anschließend mit Methyl-tert.-butylether (MTBE) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden destilliert. Es wurden 13.8 g Produkt isoliert (Ausbeute 92%, ee > 99%, chirale GC (Cyclodextrin β, BetaDex-Supelco), Reinheit 99% (GC a/a).A Mixture of 150 ml of Na phosphate buffer (0.1 M, pH 7.0), 22.2 g of 2-chloro-4'-fluoro-acetophenone, 60 ml Isopropanol, 50 ml diisopropyl ether, 30 mg NADP sodium salt and 2750 U Lactobacillus brevis Alcoholdehydrogenase from Jülich Fine Chemicals GmbH was at 20 ° C Stirred for 64 hours. The reaction control gave a conversion of 95%. To this solution was 20 ml of sodium hydroxide solution (10 M) and stirred for a further 2 hours. The reaction control showed complete Conversion of alcohol into epoxy. To this reaction mixture were added 2 g of Celite Hyflo, filtered and the filtrate then with Extracted methyl tert-butyl ether (MTBE). The organic extracts were distilled. There were 13.8 g of product isolated (yield 92%, ee> 99%, chiral GC (cyclodextrin β, BetaDex-Supelco), purity 99% (GC a / a).

Beispiel 2: (R)-2-(3-Chlor-phenyl)-oxiranExample 2: (R) -2- (3-Chloro-phenyl) -oxirane

Eine Mischung aus 1 ml Na-Phosphat-Puffer (0,1 M, pH 7,0), 240 mg Magnesiumsulfat, 46 mg 2-Chlor-3'-chlor-acetophenon, 270 μL Isopropanol, 300 μL Diisopropylether, 0,5 mg NADP-Natriumsalz und 20 U Rhodococus spec. Alkoholdehydrogenase wurde bei 20°C 30 Stunden gerührt. Die Reaktionskontrolle ergab einen Umsatz von > 90%. Zu dieser Lösung wurde 2 ml Natriumhydroxid-Lösung (10 M) gegeben und weitere 2 Stunden gerührt. Die Reaktionskontrolle zeigte vollständigen Umsatz des Alkohols ins Epoxid ee > 99% (chirale GC, Cyclodextrin β, BetaDex-Supelco). GC-Ausbeute 92% (a/a).A Mixture of 1 ml of Na phosphate buffer (0.1 M, pH 7.0), 240 mg of magnesium sulfate, 46 mg 2-chloro-3'-chloro-acetophenone, 270 μL isopropanol, 300 μL diisopropyl ether, 0.5 mg NADP sodium salt and 20 U Rhodococus spec. alcohol dehydrogenase was at 20 ° C Stirred for 30 hours. The reaction control gave a conversion of> 90%. To this solution was added 2 ml of sodium hydroxide solution (10 M) and stirred for a further 2 hours. The reaction control showed complete Conversion of the alcohol into the epoxide ee> 99% (chiral GC, cyclodextrin β, Betadex-Supelco). GC yield 92% (a / a).

Beispiel 3: (R)-2-(4-Brom-phenyl)-oxiranExample 3: (R) -2- (4-Bromo-phenyl) -oxirane

Eine Mischung aus 2 g 2-Chlor-4'-brom-acetophenon und 10,3 g Toluol wurde hergestellt und auf 45°C erwärmt. 1 ml dieser Substrat-Mischung (entsprechend etwa 160 mg 2-Chlor-4'-brom-acetophenon) wurde dann hinzugefügt zu einer Mischung aus 2,1 ml Tris·HCl Puffer (0,1 M, pH 7,1), 0,2 mg Magnesiumsulfat, 600 μL Isopropanol, 1 mg NADP-Natriumsalz und 19 U Thermoanaerobium sp. Alcoholdehydrogenase. Die Suspension wurde bei 45°C 190 Minuten lang geschüttelt. Eine Probe zeigte danach einen 94%igen Umsatz des eingesetzten Ketons zu dem entsprechenden Alkohol. Nach Hinzufügen von 0,1 ml 10 M NaOH und weiterem Schütteln bei 45°C für 1 Stunde war der Alkohol zum Epoxid umgesetzt. Dieser zeigte einen ee-Wert von mehr als 99,5% (bestimmt durch chirale HPLC unter Verwendung einer Chiralpak AD-RH Säule).A Mixture of 2 g of 2-chloro-4'-bromo-acetophenone and 10.3 g of toluene was prepared and heated to 45 ° C. 1 ml of this substrate mixture (corresponding to about 160 mg of 2-chloro-4'-bromo-acetophenone) was then added to a Mixture of 2.1 ml Tris.HCl Buffer (0.1 M, pH 7.1), 0.2 mg of magnesium sulfate, 600 μL of isopropanol, 1 mg NADP sodium salt and 19 U Thermoanaerobium sp. Alcoholdehydrogenase. The suspension was at 45 ° C Shaken for 190 minutes. A sample then showed a 94% conversion of the ketone used to the corresponding alcohol. After adding 0.1 ml of 10 M NaOH and further shaking at 45 ° C for 1 hour the alcohol was converted to the epoxide. This showed an ee value greater than 99.5% (determined by chiral HPLC using a Chiralpak AD-RH column).

Die Verwendung einer Alkoholdehydrogenase entgegengesetzter Stereoselektivität aus Lactobacillus brevis bei der Biotransformation führte zu (S)-4-Brom-phenyloxiran mit einem ee > 99,5%The Use of an alcohol dehydrogenase of opposite stereoselectivity from Lactobacillus brevis resulted in biotransformation to (S) -4-bromo-phenyloxirane with an ee> 99.5%

Beispiel 4 (S)-2-(4-Iod-phenyl)-oxiranExample 4 (S) -2- (4-iodo-phenyl) -oxirane

Eine Mischung aus 5 g 2-Chlor-4'-iod-acetophenon und 20 ml Toluol wurde hergestellt und auf 45°C erwärmt. 2 ml dieser Substrat-Mischung (entsprechend etwa 400 mg 2-Chlor-4'-iod-acetophenon) wurde dann vermischt mit einer Mischung aus 3,1 ml Tris·HCl Puffer (0,1 M, pH 7,0), 1 mg Magnesiumsulfat, 1 ml Isopropanol, 2 mg NADP-Natriumsalz und 83 U Lactobacillus brevis Alkoholdehydrogenase. Die Lösung wurde bei 45°C 64 Stunden lang geschüttelt. Das Keton war danach zu 89% zum Alkohol umgesetzt, wie sich an einer Probe bestimmen ließ. Nach Hinzufügen von 0,2 ml 10 M NaOH und weiterem Schütteln bei 40°C war der Alkohol zum Epoxid umgesetzt. Dieser hatte einen ee > 99% (Chirale HPLC mit einer Chiralpak AD-RH Säule).A Mixture of 5 g of 2-chloro-4'-iodo-acetophenone and 20 ml of toluene was prepared and heated to 45 ° C. 2 ml of this substrate mixture (corresponding to about 400 mg of 2-chloro-4'-iodo-acetophenone) was then mixed with a mixture of 3.1 ml Tris.HCl buffer (0.1 M, pH 7.0), 1 mg of magnesium sulfate, 1 ml of isopropanol, 2 mg of NADP sodium salt and 83 U Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase. The solution was at 45 ° C Shaken for 64 hours. The ketone was then converted to 89% to the alcohol, as reflected in a sample let determine. After adding 0.2 ml of 10 M NaOH and further shaking at 40 ° C was the Alcohol converted to epoxy. This had an ee> 99% (chiral HPLC with a Chiralpak AD-RH column).

Bei Verwendung einer Alkoholdehydrogenase entgegengesetzter Stereoselektivität aus Thermoanaerobium sp. Bei der Biotransformation wurde das (R)-Enantiomer mit einem ee > 99,5% erhalten.at Use of an alcohol dehydrogenase of opposite stereoselectivity from Thermoanaerobium sp. In the biotransformation, the (R) -enantiomer with a ee> 99.5% received.

Beispiel 5: Chirales 2-Oxiranyl-pyridinExample 5: Chiral 2-oxiranyl-pyridine

Zu 2 ml einer Lösung von 2-Chlor-1-pyridin-2-yl-ethanon in Toluol wurden eine Mischung aus 1 ml 0,05 M Natriumphosphate Puffer, pH 7, 1,5 mg NADP-Natriumsalz, 1,4 mg Magnesiumsulfate, 0,3 ml Isopropanol and 124 U Lactobacillus brevis Alcoholdehydrogenase hinzugegeben. Nach Schütteln bei 40 C für 17 Stunden zeigte eine Analyse eine 85% Umsetzung des 2-Chlor-1-pyridin-2-yl-ethanon zu dem chiralen Alkohol. Durch Behandeln mit NaOH wurde das entsprechende Epoxide mit einem ee-Wert von 98% erhalten (bestimmt durch chirale GC, Cyclodextrin β, BetaDex-Supelco).To 2 ml of a solution of 2-chloro-1-pyridin-2-yl-ethanone in toluene became a mixture from 1 ml of 0.05 M sodium phosphate buffer, pH 7, 1.5 mg NADP sodium salt, 1.4 mg magnesium sulphate, 0.3 ml isopropanol and 124 U lactobacillus brevis alcoholdehydrogenase added. After shaking at 40 C for For 17 hours, analysis showed 85% conversion of 2-chloro-1-pyridin-2-yl-ethanone to the chiral alcohol. By treatment with NaOH was the corresponding Epoxides with an ee value of 98% (determined by chiral GC, cyclodextrin β, Betadex-Supelco).

Bei Verwendung einer Alkoholdehydrogenase entgegengesetzter Stereoselektivität aus Thermoanaerobium sp. wurde das spiegelbildliche Epoxid-Enantiomer mit einem ee of 98,5% erhalten.at Use of an alcohol dehydrogenase of opposite stereoselectivity from Thermoanaerobium sp. was the mirror-image epoxide enantiomer with an ee of 98.5% received.

Beispiel 6: Chirales 3-Oxiranyl-pyridinExample 6: Chiral 3-oxiranyl-pyridine

In einem Verfahren ähnlich dem im Beispiel 5 beschriebenen wurde Lactobacillus brevis Alkoholdehydrogenase für die biologische Reduktion von 2-Chlor-1-pyridin-3-yl-ethanon eingesetzt. Nach 17 Stunden bei at 40°C war ein Umsatz von 99% erreicht. Die Behandlung mit Alkali führte zu einer vollständigen Umsetzung des Alkohols zum Oxiran. Dieses hatte einen ee-Wert von 98,4% (bestimmt durch chirale GC, Cyclodextrin-gamma, modifiziert mit Trifluoressigsäure (TFA)).In similar to a procedure Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase was described in Example 5 for the biological reduction of 2-chloro-1-pyridin-3-yl-ethanone used. After 17 hours at 40 ° C a turnover of 99% was achieved. Treatment with alkali resulted a complete Conversion of the alcohol to oxirane. This had an ee value of 98.4% (determined by chiral GC, cyclodextrin-gamma, modified with trifluoroacetic acid (TFA)).

Beispiel 7: 2-Thiophen-3-yl-oxiran.Example 7: 2-Thiophen-3-yl-oxirane.

292 mg 2-Chlor-1-thiophen-3-yl-ethanon wurde in 4 ml Toluol gelöst und auf 2 Reaktionskolben verteilt. In jeden Kolben wurden dann 0,3 ml Isopropanol, 1,5 ml 0,05 M Natriumphosphat Puffer, pH 7,1, 2 mg NADP-Natriumsalz und 2 mg Magnesiumsulfat gegeben. Der ersten Reaktionsmischung wurden 110 U Thermoanaerobium sp. Alkoholdehydrogenase hinzugefügt, der zweiten 120 U Lactobacillus brevis Alkoholdehydrogenase. Nach Schütteln bei 40°C für 64 Stunden war ein Umsatz von > 99% erreicht (bestimmt durch GC). In jeden Kolben wurden dann 0,25 ml 10 M Natriumhydroxid gegeben und das Schütteln anschließend eine weitere Stunde lang fortgesetzt. Die Umsetzung zum Epoxid war dann vollständig. Eine polarimetrische Analyse der organischen Phase zeigte einen Drehwert von –0,34° bei Verwendung von Lactobacillus brevis Alkoholdehydrogenase, während sie bei Verwendung von Alkoholdehydrogenase aus Thermoanaerobium sp. einen Drehwert von +0,33° aufwies (die Werte gelten für die verdünnte Lösung).292 mg of 2-chloro-1-thiophen-3-yl-ethanone was dissolved in 4 ml of toluene and distributed over 2 reaction flasks. To each flask was then added 0.3 ml of isopropanol, 1.5 ml of 0.05 M sodium phosphate buffer, pH 7.1, 2 mg NADP sodium salt and 2 mg of magnesium sulfate. The first reaction mixture was 110 U Thermoanaerobium sp. Added alcohol dehydrogenase, the second 120 U Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase. After shaking at 40 ° C for 64 hours, a conversion of> 99% was achieved (determined by GC). 0.25 ml of 10M sodium hydroxide was then added to each flask and shaking continued for an additional hour. The reaction to the epoxide was then complete. A polarimetric analysis of the organic phase showed a rotation of -0.34 ° when using Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase, whereas when using alcohol dehydrogenase from Thermoanaerobium sp. a rotation value of + 0.33 ° (the values apply to the diluted solution).

Beispiel 8: (R)- 2-(4-Chlor-phenyl)-oxiranExample 8: (R) -2- (4-Chloro-phenyl) -oxirane

Ein Reaktionskolben, der 0,3 g 2-Chlor-4'-chlor-acetophenon, 2 ml Toluol, 2,5 ml Tris·HCl Puffer (0,1 M, pH 7), 2,5 mg Magnesiumsulfat, 800 μL Isopropanol, 2 mg NADP-Natriumsalz und 76 U Thermoanaerobium sp. Alkoholdehydrogenase enthielt, wurde bei 40°C für 18 Stunden geschüttelt. Anhand einer Probe zeigte sich die Umsetzung zum Alkohol (> 99%). Eine Behandlung mit 0,2 ml 10 M NaOH und weitere 30 min Schütteln führte zu einer vollständigen Umsetzung zum Epoxid mit einem ee > 99,5% (bestimmt durch chirale HPLC unter Verwendung einer Chiralpak AD-RH Säule).One Reaction flask containing 0.3 g of 2-chloro-4'-chloro-acetophenone, 2 ml of toluene, 2.5 ml of Tris.HCl Buffer (0.1 M, pH 7), 2.5 mg magnesium sulfate, 800 μL isopropanol, 2 mg NADP sodium salt and 76 U Thermoanaerobium sp. alcohol dehydrogenase contained at 40 ° C for 18 Shaken for hours. A sample showed the conversion to alcohol (> 99%). A treatment with 0.2 ml 10 M NaOH and a further 30 min shaking resulted in a complete reaction to the epoxide with an ee> 99.5% (determined by chiral HPLC using a Chiralpak AD-RH Pillar).

Bei Verwendung von Lactobacillus brevis Alkoholdehydrogenase wurde das (S)-Enantiomer mit einem ee von 99% erhalten.at Use of Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase was the (S) -enantiomer with received an ee of 99%.

Claims

Process for the preparation of chiral epoxides by reduction of α-leaving group-substituted ketones with cell-free (R) or (S) -selective alcohol dehydrogenases in the presence of a cofactor to the corresponding chiral alcohols and subsequent base-induced cyclization to the corresponding chiral epoxides (EQUATION 1) .

Wherein LG is F, Cl, Br, I, OSO ₂ Ar, OSO ₂ R ₄ or OP (O) OR ₄ OR ₅ and R ₁ , R ₂ and R _{3 are} independently hydrogen, branched or unbranched, optionally substituted C ₁ -C ₂₀ alkyl radical, an optionally substituted C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl or alkenyl radical or an optionally substituted carbo- or heterocyclic aryl radical or a radical from the group CO ₂ R ₄ , CONR ₄ R ₅ , COSR ₄ , CS ₂ R ₄ , C (NH) NR ₄ R ₅ , CN, CHal ₃ , OAr, SAr, OR ₄ , SR ₄ , CHO, OH, NR ₄ R ₅ , Cl, F, Br, I or SiR ₄ R ₅ R ₆ , where R ₄ , R ₅ and R _6, independently of one another, are hydrogen, a branched or unbranched, optionally substituted C ₁ -C ₂₀ -alkyl radical, an optionally substituted C ₃ -C ₁₀ -cycloalkyl, alkenyl radical or a substituted carbo- or heterocyclic aryl radical, characterized in that the intermediately formed chiral alcohol II is not isolated.

Method according to claim 1, characterized in that that the Reduction is carried out in a 2-phase system and that the phase with the intermediary formed alcohol before the base-induced epoxide formation separated becomes.

A method according to claim 2, characterized in that the alcohol formed in an intermediate dissolved organic solvent.

Method according to claim 1, 2 or 3, characterized that (R) - or (S) -alcohol dehydrogenases with an enzyme activity of 0.2 up to 200 kU per mole of substrate can be used.

Method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the enzymatic reduction in the presence of a cofactor such as NADPH ₂ , NADH ₂ , NAD or NADP is performed.

Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the oxidized cofactor is reduced again becomes.

Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that LG is F, Cl, Br, or I.

Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the reaction is in an organic solvent carried out becomes.

Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the reduction and the subsequent Cyclization at -100 up to + 120 ° C carried out becomes.

Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the ee values of the intermediately generated Alcohols and epoxides> 95% ee are lying.

Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that as the base for the cyclization to the epoxide an amine, preferably triethylamine or pyridine, a carbonate Bicarbonate, an alkali metal hydroxide, an alkali metal, alkaline earth metal or transition metal alcoholate, a phosphate or a hydrogen phosphate is used.

Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the reaction solution prior to addition of the ADH enzyme is heated to the reaction temperature.

Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the enzyme with respect to the starting compound catalytic to superstoichiometric is used.

Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the isolation of the products by distillation or by crystallization.

A process according to any one of the preceding claims characterized in that R _{1 is} phenyl optionally substituted with one or more halogen atoms and R ₂ and R _{3 are} hydrogen atoms.