DE102005061425B4

DE102005061425B4 - Rückgesteuerte Fragmentierung in Ionenfallen-Massenspektrometern

Info

Publication number: DE102005061425B4
Application number: DE102005061425A
Authority: DE
Inventors: Ralf Hartmer
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2025-12-23
Also published as: DE102005061425A1; GB0624787D0; US7586089B2; US20070158544A1; GB2436437A; GB2436437B

Abstract

Verfahren zur Aufnahme von Tochterionenspektren von Peptidionen in einem Ionenfallen-Massenspektrometer, mit den Schritten:
(a) Füllung der Ionenfalle mit Ionen und Aufnahme eines Massenspektrums,
(b) Untersuchung dieses Massenspektrums und Auswahl einer Elternionensorte, von der ein Tochterionenspektrum gemessen werden soll,
(c) Füllung der Ionenfalle mit Ionen und Isolierung der ausgewählten Elternionensorte,
(d) Fragmentierung der Ionen der ausgewählten Elternionensorte,
(e) Aufnahme des Tochterionenspektrums,
(f) Untersuchung des Tochterionenspektrums auf das Vorkommen einer dominanten Ionensorte, und
(g) im Falle des Vorkommens einer dominanten Ionensorte: Auswahl einer Elternionensorte zur Aufnahme eines zweiten Tochterionenspektrums unter erweiterten oder veränderten Fragmentierungsbedingungen und Wiederholung der Schritte c) bis e), wobei zwischen den Schritten d) und e) eine resonante Anregung der dominanten Ionensorte erfolgt.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Aufnahmeverfahren für Fragment-Ionenspektren von Peptiden in Hochfrequenz-Ionenfallen-Massenspektrometern, in der Regel mit separierenden Trennverfahren wie Chromatographie oder Kapillarelektrophorese gekoppelt.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, das jedes gemessene Fragment-Ionenspektrum auf das Auftreten einer dominanten Ionensorte untersucht, wobei dieses Auftreten zu einer Wiederholung der Messung führt, jedoch mit einer zusätzlichen Stoßanregung der dominanten Ionensorte. Die anfängliche Fragmentierung kann dabei durch Stöße oder Elektronen induziert werden.
Stand der Technik
Die heutige massenspektrometrische Forschung an Biopolymeren wie Peptiden, Proteinen oder auch genetischem Material ist häufig gekoppelt mit schnellen Trennverfahren wie Flüssigkeitschromatographie (LC) oder Kapillarelektrophorese (CE). Dabei tritt häufig die Aufgabe auf, Ionen der Biopolymere im Massenspektrometer zu fragmentieren, um Auskünfte über die Sequenzen der Bausteine des Biopolymers und über weitergehende Modifikationen zu erhalten; im Falle der Peptide und Proteine also Auskünfte über die Sequenz der Aminosäuren, und weitere Auskünfte über Phosphorylierungen, Glykosylierungen und andere Veränderungen des ursprünglichen Protein-Bauplans, der jeweils durch ein Gen festgelegt ist. Es sollen also informationsreiche Fragment-Ionenspektren aufgenommen werden. Die dazu notwendigen Arten von Massenspektrometern sind unter dem Begriff „Tandem-Massenspektrometer" bekannt geworden. Die Verfahren der Aufnahme von Fragment-Ionenspektren mit Tandem-Massenspektrometern werden häufig als MS/MS oder MS² abgekürzt.
Tandem-Massenspektrometer bestehen aus einem ersten Massenspektrometer, mit dem Ionen einer bestimmten Art ausgewählt werden, einer Fragmentierungseinrichtung, in der diese ausgewählten Ionen fragmentiert werden, und einem weiteren Massenspektrometer, mit dem die Fragment-Ionen analysiert werden. In Ionenfallen-Massenspektrometern können diese Vorgänge der Auswahl, der Fragmentierung und der Analyse der Fragment-Ionen auch nacheinander in derselben Ionenfalle ausgeführt werden, man spricht dann von „tandem-in-time", statt von „tandem-in-space" bei räumlich getrennten Massenspektrometern. Aus der Patentschrift EP 0 898 297 B1 ist etwa bekannt, dass ein Quadrupolfilter mit einem diskontinuierlichen Massenspektrometer (z. B. einem Flugzeitmassenspetrometer) zu einem Tandem-Massenspektrometer gekoppelt wird.
Insbesondere in Ionenfallen-Massenspektrometern können leicht weitere Ionengenerationen erzeugt werden, wie beispielsweise aus Patentschrift DE 693 28 979 T2 bekannt ist. Bei diesen sogenannten MSⁿ-Verfahren wird jeweils eine einzige Ionensorte der vorhergehenden Ionengeneration isoliert und anschließend fragmentiert. In DE 693 28 979 T2 werden die isolierten Ionen mit durch das Anlegen einer Resonanzfrequenz zu Schwingungen in der Ionenfalle angeregt, wobei sie mit den in der Ionenfalle enthaltenen Gasmolekülen (meist Helium, seltener Stickstoff) stoßen, dabei Energie aufnehmen und schließlich zerfallen. Der Wert n bezieht sich dabei auf die Anzahl der Ionengenerationen.
In der Proteomik geht es häufig um die Analyse von Tausenden von Peptiden, die aus einem enzymatischen Verdau eines komplexen Proteingemisches gewonnen und flüssigchromatographisch oder elektrophoretisch getrennt wurden. Qualitativ gute Fragment-Ionenspektren enthalten Informationen über die Sequenz der Aminosäuren, aber es werden leider bei der automatischen Aufnahmetechnik nur relativ wenige qualitativ gute Fragment-Ionenspektren gemessen. Hier setzt die Erfindung an, die im Folgenden besonders im Lichte dieser sehr komplexen Peptidgemische beschrieben wird. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Verwendung von Hochfrequenz-Ionenfallen-Massenspektrometern nach Wolfgang Paul, die einerseits für diese Aufgabe in besonderer Weise geeignet sind, die andererseits aber auch gegenüber anderen Arten von Tandem-Massenspektrometern charakteristische Besonderheiten haben.
Eine Ionenfalle nach Wolfgang Paul besteht in der Regel aus einer Ring-Elektrode und zwei Endkappen-Elektroden. Eine Hochfrequenzspannung an der Ring-Elektrode spannt im Inneren ein quadrupolares Hochfrequenzwechselfeld auf, das Ionen ungeachtet ihrer Polarität jeweils in das Zentrum zurücktreibt. Ohne Stoßgas oszillieren die Ionen in der Ionenfalle in diesem rücktreibenden Feld. Die Ionenfalle ist aber gewöhnlich mit einem Stoßgas eines Druckes von etwa 10^–2 Pascal befüllt, meist Helium, daher wird die Oszillation in wenigen Millisekunden durch eine Vielzahl sanfter Stöße gedämpft und die Ionen finden sich in relativer Ruhe im Zentrum der Ionenfalle in einer kleinen Wolke ein. Auch die energetischen Zustände im Inneren der Moleküle werden reduziert, man spricht hier von einer „Kühlung" durch das Stoßgas. Der Durchmesser der Ionenwolke im Zentrum der Ionenfalle bestimmt sich aus dem Gleichgewicht zwischen der zentripetalen Kraft des Hochfrequenzfeldes und der zentrifugalen Kraft der Coulombschen Abstoßung zwischen den Ionen. Die Ionen können durch eine dipolare Anregungswechselspannung über beide Endkappenelektroden hinweg zu schwingenden Oszillationen angeregt werden, insbesondere, wenn die Anregungsfrequenz mit der Oszillationsfrequenz übereinstimmt. In diesem Fall spricht man von „resonanter Anregung".
Die Ionen können aus der Ionenfalle durch mehrere bekannte Verfahren massenselektiv herausgeworfen und so in einem Ionendetektor als Massenspektrum gemessen werden. Für die Aufnahme eines Fragment-Ionenspektrums werden zunächst alle Ionensorten einer Ionenquelle eingelagert, sodann werden die nicht zu untersuchenden Ionensorten durch bekannte Verfahren herausgeworfen, sodass nur die als „Eltern-Ionen" zu untersuchende Ionensorte in der Ionenfalle verbleibt. Diesen Vorgang nennt man die „Isolation" der ausgewählten Eltern-Ionen. Diese Eltern-Ionen können nun fragmentiert werden, beispielsweise durch erzwungene Stöße mit dem Stoßgas unter steter resonanter Anregung. Die als Ionen zurückbleibenden Bruchstücke können dann massenselektiv ausgeworfen und als Fragment-Ionenspektrum gemessen werden. Das Fragment-Ionenspektrum wird auch „Tochter-Ionenspektrum" genannt.
Die Befüllung der Ionenfalle mit Ionen für eine anschließende Isolierung der Eltern-Ionen muss entsprechend geregelt werden, um noch genügend viele Ionen für die Aufnahme des Tochter-Ionenspektrums zur Verfügung zu haben. Eine solche Regelung ist beispielsweise in der Offenlegungsschrift DE 197 09 086 A1 beschrieben (entsprechend GB 2 322 961 B , US 5 936 241 A ).
Neben dieser meist „dreidimensionale Ionenfalle" genannten Ionenfallenart gibt es auch eine Ionenfalle, die „zweidimensional" oder „linear" genannt wird und aus vier Polstäben mit lochblendenartigen Endelektroden besteht. Auf die Funktionsweise dieser linearen Ionenfalle soll hier nicht eingegangen werden: sie ist aber in den Erfindungsgedanken einzubeziehen, da dieser von der Art der Ionenfalle unabhängig ist, so lange diese Ionenfalle quadrupolare Hochfrequenz-Wechselfelder mit der Möglichkeit zur Stoßfragmentierung aufweist.
Die Ionenfallen-Massenspektrometer sind für den genannten Zweck der Strukturaufklärung von Peptiden mit Elektrosprüh-Ionenquellen ausgestattet, die in der Regel nicht nur einfach geladene Ionen der Verdaupeptide liefert, sondern auch doppelt und dreifach geladene Ionen, die sich für eine aussagekräftige Fragmentierung besonders gut eignen. Die klassische Art der Fragmentierung ist dabei eine Stoßfragmentierung (CID = collision induced dissociation) durch eine resonante Anregung der Ionen zu Schwingungen durch die Ionenfalle, wobei sie mit den in der Ionenfalle enthaltenen Stoßgasmolekülen (meist Helium, seltener Stickstoff) stoßen, dabei Energie aufnehmen und schließlich zerfallen. Moderne Ionenfallen-Massenspektrometer sind des Weiteren mit Fragmentierungseinrichtungen versehen, die auf einer Übertragung von Elektronen beruhen und ein anderes Fragmentierungsmuster ergeben. Diese Fragmentierung kann auf verschiedene Arten erzeugt werden; diese werden hier unter dem Sammelnamen „elektroneninduzierte Fragmentierung" zusammengefasst (EID = electron induced dissociation). Diese Fragmentierung resultiert entweder aus dem Einfang sehr niederenergetischer Elektronen (ECD = electron capture dissociation), aus einem Transfer der Elektronen von negativ geladenen Ionen auf die positiv geladenen Analytionen (ETD = electron transfer dissociation) oder aus dem Transfer von Elektronen aus hoch angeregten Neutralteilchen (MAD = metastable-atom-induced dissociation).
Die beiden grundsätzlich verschiedenen Fragmentierungsverfahren CD und EID enthalten komplementäre Informationen, werden also vorzugsweise beide auf die gleiche Ionensorte, wenn auch vorzugsweise auf Ionen verschiedener Ladungszustände dieser Ionensorte, angewandt.
Es ist ein Charakteristikum der Stoßfragmentierung CD, dass längere oder schwerere modifizierende Seitenketten, beispielsweise Phosphoryl-, Sulfat- oder Glykogruppen, bevorzugt als neutrale Bruchstücke von der Kette der Aminosäuren abgespalten werden, weil sie in der Regel mit geringer Bindungsenergie gebunden sind. Das Fragment-Ionenspektrum spiegelt daher nur die nackte Kette der Aminosäuren wider, nicht deren Modifizierungen. Die Kenntnis über die Modifizierung geht ganz verloren, wenn ihre Abspaltung nicht Veränderungen der Aminosäuren selbst zurücklässt, wie beispielsweise die Entstehung von Dehydroxi-Serin bei der Dephosphorylierung von Serin.
In der Kette der Aminosäuren spalten sich bei der Stoßfragmentierung CD die peptidischen Bindungen, das sind die Bindungen der Stickstoff-Atome zum Kohlenstoff auf der N-terminalen Seite des Stickstoffs. Die so entstehenden Ionen werden als b-Fragment-Ionen bezeichnet, wenn das N-terminale Bruchstück mit einem Proton geladen als Ion zurückbleibt, sonst als y-Fragment-Ion für das C-terminale Bruchstück-Ion. Wird von doppelt geladenen Ionen ausgegangen, so entstehen häufig beide Ionen des komplementären b- und y-Fragment-Ionenpaares.
Im Gegensatz dazu spalten bei elektroneninduzierter Fragmentierung die Bindungen der Stickstoff-Atome in der Kette der Aminosäuren auf der C-terminalen Seite. Die entstehenden Ionen werden c-Ionen oder z-Ionen genannt. Die Fragmentierung greift durch einen Umlagerungsbruch punktförmig dort an, wo ehemals das Proton anlagerte, das durch das Elektron neutralisiert wurde. Die Fragmentierung ist außerordentlich sanft, alle Modifizierungen bleiben erhalten. Es ist hier günstig, von dreifach geladenen Eltern-Ionen auszugehen. Der Vergleich dieses EID-Fragment-Ionenspektrums mit einem CD-Spektrum zeigt sofort auf, welche der Ionen im CD-Spektrum vom b-Typ und welche vom y-Typ sind, da immer feste Massenabstände von 17 atomaren Masseneinheiten zwischen den b-Ionen des CD-Spektrums und den c-Ionen des EID-Spektrums herrschen. Komplementär dazu sind die y-Ionen immer um 16 atomare Masseneinheiten größer als die z-Ionen. Außerdem wird anhand ungewöhnlicher Massen für die Massenabstände zwischen den Ionensignalen im EID-Spektrum sofort sichtbar, welche der Aminosäuren die Modifizierung trägt und welche Masse diese Modifizierung hat. Es ist also günstig, für jedes Peptid sowohl das CD- wie auch das EID-Fragment-Ionenspektrum zu messen. Ist das aus Zeitgründen nicht möglich, so sollen die EID-Fragment-Ionenspektren zumindest für die modifizierten Peptid-Ionen gemessen werden. Modifizierte Peptid-Ionen sind häufig an Verlusten neutraler Bruchstücke bestimmter Masse zu erkennen, beispielsweise die Dephosphorylierung an der Masse m/z = 98 atomaren Masseneinheiten.
Das vorgeschaltete Trennverfahren für die Biopolymere bietet dem Massenspektrometer die Analytsubstanz, also im speziellen Fall ein Verdaupeptid, nur wenige Sekunden lang an. Bei den oben geschilderten komplexen Gemischen werden zu einem Zeitpunkt häufig mehrere Verdaupeptide gleichzeitig angeliefert, nicht selten sogar zehn bis zwanzig Verdaupeptide gleichzeitig. Ein Ionenfallen-Massenspektrometer kann pro Sekunde etwa drei bis fünf Massenspektren aufnehmen, es ist also mit den Messungen sparsam umzugehen. Die Steuerungsprogramme dieser Ionenfallen-Massenspektrometer enthalten Verfahren zur automatischen Aufnahme von Fragmentmassenspektren, diese seien hier kurz geschildert:
Es werden bis zu einer Unerbrechung für die Aufnahme eines Fragment-Ionenspektrums zunächst normale Massenspektren in steter Folge aufgenommen, die dann digital im Speicher des Massenspektrometers abgelegt werden. Für jedes Massenspektrum ist dann in Echtzeit durch ein Auswerteprogramm zu ermitteln, ob überhaupt ein oder mehrere Verdaupeptide in genügender Konzentration angeliefert werden. In diesem Fall ist dann durch eine mathematische Analyse des Massenspektrums eine Auswahl zu treffen, welche Ionensorte für die Aufnahme eines Fragment-Ionenspektrums am günstigsten zu fragmentieren ist. Solche Untersuchungen sind dem einschlägigen Fachmann bekannt; dabei ist es insbesondere bekannt, wie einfach, doppelt oder dreifach geladene Ionensorten durch die Massenabstände im Isotopenmuster erkannt werden können. Für die Stoßfragmentierung sind doppelt geladene Ionen am besten geeignet, somit wird für gewöhnlich für die jetzt anstehende Aufnahme eines Fragment-Ionenspektrums die intensivste Ionensorte verwendet, die innerhalb eines vorbestimmtem Massenbereiches doppelt geladen vorkommt und nicht in einer Ausschlusstabelle steht. Die Ausschlusstabelle enthält die Massenwerte solcher Peptide, die bereits in vorherigen Messzyklen analysiert wurden oder von vornherein als nicht interessant markiert wurden. Daraufhin wird in der nächsten Spektrenaufnahme diese ausgewählte Eltern-Ionensorte in der Ionenfalle isoliert, durch resonante Anregung fragmentiert, und die Fragment-Ionen werden in Form eines Fragment-Ionenspektrums gemessen.
Ist eine Einrichtung für elektroneninduzierte Fragmentierung vorhanden, so wird für die Aufnahme eines EID-Fragment-Ionenspektrums am günstigsten von dreifach geladenen Eltern-Ionen ausgegangen. Ist genügend Zeit vorhanden, so ist es zweckmäßig, für alle auftretenden Ionensorten sofort sowohl die CID- wie auch die EID-Fragment-Ionenspektren zu messen.
Für beide Fragmentierungsarten gibt es Verfahrensparameter, die für gewöhnlich von der automatisch arbeitenden Steuersoftware blind so eingestellt werden, wie es sich für Ionen eines Verdaupeptids dieser Masse im Durchschnitt als günstig erwiesen hat. Für Peptide ohne Modifikationen hat sich dieses Verfahren auch einigermaßen gut bewährt, aber gerade für modifizierte Peptide erscheint dieses Verfahren als nicht ausreichend. In einem mehrstündigen Lauf einer einzigen flüssigkeitschromatographischen Trennung mit automatischer massenspektrometrischer Analyse werden etwa ein bis mehrere Tausend gut auswertbarer Tochter-Ionenspektren gemessen, was bei naiver Betrachtung als guter Erfolg gewertet werden könnte. Da in diesem Lauf aber insgesamt 10 000 bis 100 000 Fragment-Ionenspektren aufgenommen werden, ist die Anzahl qualitativ guter Tochter-Ionenspektren viel zu gering. Untersuchungen zeigen, dass die Anzahl der qualitativ ausreichend guten Fragment-Ionenspektren häufig nicht über zehn Prozent, sehr selten über 20 Prozent der aufgenommenen Fragment-Ionenspektren hinauskommt. Die analytische Aufgabe einer Erfassung möglichst aller Analytsubstanzen wird bisher nicht ausreichend gelöst, was sich leider sehr häufig erst bei der Verwendung dieser Tochter-Ionenspektren zur Identitäts- und Struktursuche mit Hilfe von „Suchmaschinen" in Proteinsequenzdatenbanken erweist.
Untersucht man die Stoßfragmentierungsspektren näher, so kann man feststellen, dass insbesondere die modifizierten Peptide häufig keine guten Fragmentspektren liefern. In vielen Fällen spaltet dabei eine Modifizierungsgruppe als neutrales Bruchstück vom Peptid ab, das Restpeptid wird dann nicht mehr resonant angeregt, stattdessen im Stoßgas schnell gekühlt; es kann unter diesen Umständen nicht mehr weiter zerfallen. Das Fragmentspektrum besteht dann im Wesentlichen aus nur einer einzigen dominanten Ionensorte, die noch die gleiche Anzahl von Ladungen trägt wie die Elternionen, aber eine geringere Masse hat.
Auch Peptidionen, die mit Alkali-Ionen komplexiert sind, zeichnen sich durch das Auftreten einer dominanten Ionensorte im Fragment-Ionenspektrum aus, wobei aber die dominante Ionensorte eine Ladung weniger trägt als die ausgewählten Eltern-Ionen. Es tritt hier der Verlust des Alkali-Ions auf.
Aber auch die Spektren elektroneninduzierter Fragmentierung zeigen häufig nur einen einzigen dominanten Peak, in der Regel ein nicht eigenständig weiter zerfallenes Radikalion, das allerdings eine geringere Ladung trägt als das Eltern-Ion.
Als grobe Faustregel kann gelten, dass etwa fünf bis fünfzehn Prozent aller Fragment-Ionenspektren ein solches dominantes Ionensignal zeigen.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, in Analysenläufen mit Peptidgemischen die Anzahl derjenigen Tochter-Ionenspektren zu erhöhen, die mit genügend guter Qualität für eine Identifizierung des Peptids anhand der Aminosäurenkette und für die Identifizierung und Lokalisierung der Modifikationen nutzbar sind. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, die unbrauchbaren Fragment-Ionenspektren mit dominanten Ionensorten in Spektren guter Qualität umzuwandeln, um so einen erheblichen Zuwachs an qualitativ guten und informationsreichen Spektren zu erhalten.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das in Echtzeit jedes Fragment-Ionenspektrum darauf untersucht, ob es ein dominantes Ionensignal enthält, und gegebenenfalls die Messung an derselben Ionensorte wiederholt, dabei aber das Ergebnis dadurch verbessert, dass die Ionen des dominanten Ionensignals einer zusätzlichen Stoßfragmentierung durch eine resonante Anregung unterworfen werden. Dabei kann als erste Fragmentierungsart sowohl eine stoßinduzierte wie auch eine elektroneninduzierte Fragmentierung verwendet werden. Die zusätzliche Stoßfragmentierung kann in der Wiederholungsmessung durch ein MS/MS/MS (MS³) genanntes Verfahren erzeugt werden, wobei die Ionen der dominanten Ionensorte auch einer Isolation unterworfen werden; günstiger und zeitsparender ist es jedoch, diese Ionensorte in der Wiederholungsmessung nach der ersten Fragmentierung ohne weitere Isolation einer zweiten Fragmentierung durch resonante Anregung zu unterwerfen.
Sollte sich nach der zweiten Fragmentierung wieder ein dominantes Ionensignal im Fragment-Ionenspektrum ergeben, so kann das Verfahren nochmals unter Fragmentierung dieses neuen, dominanten Ionensignals wiederholt werden, um auch die sequentielle Abspaltung von zwei Modifizierungsgruppen zu erfassen. Es kommen durchaus in geringer Zahl dreifach phosphorylierte Peptide vor so dass ein weiterer Schritt dieser Art sinnvoll sein kann, im Allgemeinen können aber diese Versuche nach der zweiten Wiederholung abgebrochen werden, da es sich dann mit hoher Wahrscheinlichkeit überhaupt nicht um ein Peptid, sondern um eine Verunreinigung handelt.
Wurde als erste Fragmentierungsart die elektroneninduzierte Fragmentierung verwendet, so hat die Wiederholungsmessung meist sofortigen Erfolg. Es handelt sich dann bei dem dominierenden Ionensignal überwiegend um Radikal-Ionen, die durch den Elektronenübertrag entstanden und nicht sofort weiter zerfallen sind. Hier genügt meist eine relativ kleine Hilfe durch Stöße aus resonanter Anregung, um weiter zu zerfallen. Das Ergebnis sind Spektren, wie sie aus elektroneninduzierter Fragmentierung stammen, nicht etwa solche, die der Stoßfragmentierung ähneln.
Die entscheidende Festlegung, was unter einer „dominanten Ionensorte" zu verstehen ist, kann dabei weitgehend frei festgesetzt werden: Es kann sich um eine Ionensorte handeln, deren Intensität mehr als doppelt so groß ist wie die nächst häufigere Ionensorte, es kann sich aber auch um eine Ionensorte handeln, die mehr als zehnmal größer ist als alle anderen Ionensorten zusammen. Es ist zweckmäßig, diese Bedingung einstellbar zu halten, damit sie an die analytische Aufgabe angepasst werden kann.
Beschreibung der Abbildung
1 zeigt drei Fragment-Ionenspektren, die im automatischen Messablauf von einem dreifach geladenen modifizierten Peptid (Aminosäuresequenz: IGRFSEPHAR) aufgenommen wurden. Die Aminosäure Serin an Position 5 ist phosphoryliert.
1A zeigt das durch Stoßfragmentierung gewonnene Tochterionenspektrum; durch die Stoßfragmentierung ist der Neutralverlust von H₃PO₄ besonders begünstigt, so dass das Restpeptid-Ion im Spektrum als dominantes Signal (mit einem „♦" gekennzeichnet) auftritt. Das Auftreten dieses dominanten Ionensignals führt nach dieser Erfindung zur automatischen Messung der Spektren 1B und 1C.
1B zeigt ein Fragmentspektrum, das aus einer Stoßfragmentierung des dominanten Ionensignals ohne weitere Isolierung gewonnen wurde. Das Fragment-Ionenspektrum ist immer noch von mäßiger Qualität, aber deutlich besser als das Spektrum aus 1A.
1C zeigt ein Spektrum der Fragment-Ionen, die durch Elektronen-Transfer-Dissoziierung hergestellt wurden, getriggert und automatisch aufgenommen durch das Auftreten des dominanten Ionensignals im Spektrum der 1A. Dieses ETD-Fragment-Ionenspektrum ist von ausgezeichneter Qualität und zeigt die gesamte Abfolge der Aminosäuren als c-Ionen, alle in einer Intensität von 10 bis 20%, wobei die Phosphorylierung des Serins erhalten bleibt.
Günstige Ausführungsformen
Die Erfindung ist in Anspruch 1 dargelegt, mit weiteren Ausführungsformen in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 7. Sie stellt ein Verfahren bereit, das anhand der Form des Fragment-Ionenspektrums abschätzt, ob von einem Peptid ein zweites Fragment-Ionenspektrum unter erweiterten oder veränderten Fragmentierungsbedingungen aufgenommen werden soll. Die Untersuchung des Fragment-Ionenspektrums ist auf die Feststellung ausgerichtet, ob in diesem Spektrum eine dominante Ionensorte vorkommt.
Die verschiedenen Ausführungsformen dieses Verfahrens zur Aufnahme von Tochterionenspektren von Peptidionen in einem Ionenfallen-Massenspektrometer laufen dabei immer nach dem gleichen Grundschema ab, das auch das Gerüst der Erfindung darstellt:

a) Es wird die Ionenfalle mit Ionen befüllt, wie sie von der Ionenquelle geliefert werden, und es wird ein normales Massenspektrum aufgenommen,
b) dieses Massenspektrum, das in digitaler Form im Speicher des Massenspektrometers vorliegt, wird mathematisch untersucht, und es wird in üblicher Weise nach vorgegebenen Regeln eine Eltern-Ionensorte ausgewählt, von der ein Tochter-Ionenspektrum gemessen werden soll,
c) die Ionenfalle wird wiederum mit Ionen befüllt, und die ausgewählte Eltern-Ionensorte wird durch Auswurf aller anderen Ionensorten in üblicher Weise in der Ionenfalle isoliert,
d) die Ionen dieser ausgewählten Eltern-Ionensorte werden nun in der Ionenfalle fragmentiert, wobei Fragment-Ionen entstehen,
e) es wird das Tochter-Ionenspektrum der Fragment-Ionen gemessen,
f) das Tochter-Ionenspektrum, das in digitaler Form im Speicher des Massenspektrometers vorliegt, wird auf das Vorkommen einer dominanten Ionensorte untersucht, und
g) im Falle des Vorkommens einer dominanten Ionensorte wird eine Elternionensorte zur Aufnahme eines zweiten Tochter-Ionenspektrums unter erweiterten oder veränderten Fragmentierungsbedingungen ausgewählt und es werden die Schritte b) bis e) wiederholt, wobei zwischen Schritten d) und e) eine resonante Anregung der dominanten Ionensorte erfolgt, um diese zu fragmentieren.

Eine erste günstige Ausführungsform dieses allgemeinen Schemas verwendet als Fragmentierungsart für die Peptid-Ionen in Schritt d) die gewöhnliche Stoßfragmentierung, die als softwaregesteuertes Verfahren in jedem Ionenfallen-Massenspektrometer enthalten ist. Diese stoßinduzierte Fragmentierung ergibt für modifizierte Peptide häufig nur Tochter-Ionenspektren, die im Wesentlichen aus einer dominanten Ionensorte bestehen, mit sehr wenigen und meist niedrig intensiven weiteren Ionensorten. Diese letzteren weiteren Ionensorten geringer Intensität sind häufig wegen schlechten Verhältnisses von Signal zu Rauschen kaum auswertbar. Der Grund für das Auftreten der dominanten Ionensorten ist, wie oben schon kurz beschrieben, die Abspaltung der Modifizierungsgruppe in Form eines neutralen Bruchstücks, und die schnelle Kühlung des Restpeptid-Ions. Die Modifizierungsgruppen sind häufig mit geringerer Bindungsenergie gebunden als die Bindungen längs der Kette aus Aminosäuren, sie spalten daher sehr leicht ab.
Die dominante Ionensorte besteht also hier aus den Restpeptid-Ionen nach Abspaltung der Modifizierungsgruppe von den Eltern-Ionen. Die Abspaltung einer neutralen Modifizierungsgruppe ist daran zu erkennen, dass die dominante Ionensorte die gleiche Anzahl von Ladungen pro Ion trägt wie die Eltern-Ionen. Wurden als Eltern-Ionen für eine günstige Stoßfragmentierung die doppelt geladenen Eltern-Ionen ausgewählt, dann liegen auch die Ionen der dominanten Ionensorte doppelt geladen vor. Sind jetzt keine weiteren Modifizierungsgruppen mehr vorhanden, so wird eine Stoßfragmentierung dieser dominanten Ionensorte ein informationsreiches Tochter-Ionenspektrum ergeben.
Eine Fragmentierung einer Ionensorte aus einem Tochter-Ionenspektrum wird im Allgemeinen durch eine Aufnahme eines Enkel-Ionenspektrums in einem MS/MS/MS genannten Verfahren vorgenommen. Dabei wird die Ionenfalle zunächst mit Ionen befüllt, dann werden die Eltern-Ionen isoliert und fragmentiert, dann wird die weiter zu untersuchende Tochter-Ionensorte isoliert und fragmentiert, und schließlich werden deren Fragment-Ionen als Enkel-Ionenspektrum gemessen. Ein solches Verfahren ist in vielen Ionenfallen-Massenspektrometern standardmäßig enthalten. Dieses Verfahren kostet aber Zeit. Es ist für das erfindungsgemäße Verfahren aber die weitere Isolation der dominanten Ionensorte nicht notwendig, so dass hier kein vollständiges MS/MS/MS-Verfahren durchgeführt werden muss.
In Schritt b) sollte zu diesem Zweck für die Wiederholungsmessung die gleiche Eltern-Ionensorte mit gleicher Anzahl von Ladungen pro Ion, also bevorzugt doppelte Ladung, ausgesucht werden. Nach Isolierung und Fragmentierung dieser Eltern-Ionensorte wird dann sofort eine weitere Stoßfragmentierung der so entstandenen dominanten Ionensorte vorgenommen, ohne die dominante Ionensorte vorher zu isolieren. Die Fragmentierung dieser Restpeptid-Ionen kann das Tochter-Ionenspektrum qualitativ verbessern und ein auswertbares Spektrum ergeben, es tritt aber diese Verbesserung nicht immer in gewünschten Umfang ein. 1B zeigt ein solches Fragment-Ionenspektrum einer dominanten Ionensorte, das hier immer noch nicht in genügender Qualität vorliegt.
Da es mehrfach modifizierte Peptide gibt, kann auch das so erstellte Quasi-Enkel-Ionenspektrum wieder aus einer dominanten Ionensorte bestehen. Es kann in diesem Fall das Verfahren unter weiterer Fragmentierung dieser nun dominanten Ionensorte wiederholt werden.
Für dieses Verfahren einer Stoßfragmentierung in Schritt d) und Abspaltung eines Neutralbruchstücks sollte die Festlegung, was unter einer dominanten Ionensorte zu verstehen ist, nicht zu scharf gezogen werden. Das Auftreten einer Ionensorte, die mehr als fünfmal größer ist als die nächst intensive Ionensorte, rechtfertigt bereits dieses Verfahren, da in der Regel das Tochter-Ionenspektrum verbessert wird.
Es kann die Untersuchung des Tochter-Ionenspektrums aber auch ergeben, dass zwar eine dominante Ionensorte vorliegt, diese aber eine Ladung pro Ion weniger trägt als die Eltern-Ionen. Es liegt hier die Abspaltung eines leicht zu entfernenden Kations vor. In der Regel tritt diese Abspaltung eines Kations auf, wenn das Peptid-Ion mit einem Alkali-Ion komplexiert ist. Häufig ist die Abspaltung von Natrium-Ionen (23 atomare Masseneinheiten), Kalium-Ionen (39 Masseneinheiten) oder Ammonium-Ionen (18 Masseneinheiten); es kommen aber auch komplexere Kationen zur Abspaltung. In diesem Fall sollte in Schritt b) für die Wiederholungsmessung wenn möglich eine Eltern-Ionensorte ausgewählt werden, die eine Ladung pro Ion mehr trägt als die vorher gemessene Eltern-Ionensorte, damit die zweite Fragmentierung eine mehrfach geladenen Ionensorte betrifft.
Eine zweite günstige Ausführungsform des Verfahrens bedingt ein Ionenfallen-Massenspektrometer, das mit einer Einrichtung für eine elektroneninduzierte Fragmentierung versehen ist. Diese Einrichtung kann eine Ionenquelle zur Erzeugung negativer Reaktant-Ionen umfassen, die dann nach Isolierung der Eltern-Ionen in die Ionenfalle eingefüllt werden und dort unter Abgabe von Elektronen mit den positiv geladenen Eltern-Ionen unter Bildung von Bruchstück-Ionen reagieren. Die Einrichtung kann aber auch eine Quelle für hoch angeregte Neutralatome enthalten, beispielsweise eine Fast-Atom-Bombardment-Quelle (FAB), die hoch angeregte, aber gut fokussierte Helium-Atome liefert, mit der die isolierten Eltern-Ionen in der Ionenfalle beschossen werden können und dort unter Übertragung eines Elektrons die elektroneninduzierte Fragmentierung einleiten (MAID).
In Ionenfallen-Massenspektrometern mit Einrichtung zur EID-Fragmentierung ist es zweckmäßig, immer abwechselnd CID-Fragment-Ionen und EID-Fragment-Ionen zu messen. Die Gründe dafür sind oben beschrieben, Es ist aber manchmal aus Zeitgründen nicht möglich, eine so aufwendige Messserie durchzuführen. Dann ist es im Sinne dieser Erfindung zweckmäßig, ein EID-Fragment-Ionenspektrum immer genau dann zu messen, wenn das CID-Fragment-Ionenspektrum ein dominantes Ionensignal zeigte. Es ist dann die Wahrscheinlichkeit groß, dass dann eine Modifizierung vorliegt, deren Identität und Lokalisierung durch das EID-Fragment-Ionenspektrum angezeigt wird.
Auch bei elektroneninduzierter Fragmentierung ist häufig zu beobachten, dass Tochter-Ionenspektren generiert werden, die im Wesentlichen aus einer einzigen, dominanten Ionensorte mit ihren Isotopenpeaks besteht. Das Auftreten ist unabhängig davon, ob die EID-Fragment-Ionenspektren durch dominante Ionensorten getriggert oder durch abwechselnde Aufnahme mit beiden Fragmentierungsarten gewonnen wurden. Es handelt sich hier überwiegend um Fälle, in denen die Übertragung des Elektrons nicht sofort zu einem Umlagerungsbruch der Peptidkette führt, sondern zur Bildung eines Peptid-Ionenradikals, das neben dem aufgenommenen Elektron auch noch das Proton enthält. Diese Ionen entsprechen in ihrer Masse genau dem Eltern-Ion, haben aber eine Ladung weniger und damit ein anderes m/z. Diese Radikal-Ionen zerfallen relativ leicht, die Wiederholungsmessung bedarf daher einer nur schwachen resonanten Anregung. Das ermöglicht es, bei einer niedrigen Hochfrequenzspannung zu fraktionieren, wodurch auch sehr kleine Bruchstück-Ionen noch in der Ionenfalle gehalten werden können.
Die für diese Verfahren notwendigen Steuerungen der Messabläufe in der Ionenfalle sind dem einschlägigen Fachmann bekannt. Sie werden in der Steuersoftware für das Ionenfallen-Massenspektrometer implementiert.
Die heutigen Arten der Flüssigkeitschromatographie, einschließlich der Nano-LC, bieten dem direkt gekoppelten Massenspektrometer die aufgetrennten Peptide jeweils etwa fünf bis zwanzig Sekunden lang an. Eine Analytsubstanz steht also mehrere Sekunden lang für die Messung zur Verfügung. Damit besteht für heutige Ionenfallen-Massenspektrometer, die mehrere Fragment-Ionenspektren pro Sekunde aufnehmen können, die Möglichkeit, zwar aussichtsreiche, aber nicht genügend gute Fragment-Ionenspektren noch einmal zu messen. Für solche Massenspektrometer, die sowohl die stoßinduzierte wie auch die elektroneninduzierte Fragmentierung zur Verfügung haben, besteht die Möglichkeit, die Tochter-Ionenspektren genau dann mathematisch zu untersuchen, wenn gerade die andere Fragmentierungsart auf die Eltern-Ionen angewandt wird. Dadurch steht für eine sorgfältige Auswertung praktisch beliebig lange Zeit zur Verfügung. Aber auch ohne diese Möglichkeit zur abwechselnden Messung geht nicht sehr viel Zeit verloren, da schnelle Algorithmen durchaus in der Lage sind, die Tochter-Ionenspektren in wenigen Millisekunden (oder sogar in weniger als einer Millisekunde) auf das Auftreten von dominanten Ionensorten und auf die Feststellung von deren Ladungszustand zu untersuchen.
Das Separationsverfahren braucht aber nicht unbedingt direkt mit der Massenspektrometrie gekoppelt zu sein, um Nutzen aus der vorliegenden Erfindung ziehen zu können. Ein immer häufiger angewendetes Messverfahren ist die nicht-direkte Kopplung der Flüssigkeitschromatographie mit einem Massenspektrometer, das feste Proben auf einem Probenträger mit matrix-unterstützter Laserdesorption ionisiert („LC-MALDI"). Das Eluat aus dem Flüssig keitschromatographen wird dabei in vielen einzelnen Tröpfchen auf vorpräparierte Probenträger aufgegeben, die Hunderte oder sogar Tausende von Proben aufnehmen können. Die Probentröpfchen werden getrocknet und dann der Massenspektrometrie zugeführt. Die vorliegende Erfindung kann allerdings für LC-MALDI erst richtig zum Einsatz kommen, wenn es gelingt, mehrfach geladene Ionen zu erzeugen, die für eine Fragmentierung günstiger sind als einfach geladene.

Claims

Verfahren zur Aufnahme von Tochterionenspektren von Peptidionen in einem Ionenfallen-Massenspektrometer, mit den Schritten: (a) Füllung der Ionenfalle mit Ionen und Aufnahme eines Massenspektrums, (b) Untersuchung dieses Massenspektrums und Auswahl einer Elternionensorte, von der ein Tochterionenspektrum gemessen werden soll, (c) Füllung der Ionenfalle mit Ionen und Isolierung der ausgewählten Elternionensorte, (d) Fragmentierung der Ionen der ausgewählten Elternionensorte, (e) Aufnahme des Tochterionenspektrums, (f) Untersuchung des Tochterionenspektrums auf das Vorkommen einer dominanten Ionensorte, und (g) im Falle des Vorkommens einer dominanten Ionensorte: Auswahl einer Elternionensorte zur Aufnahme eines zweiten Tochterionenspektrums unter erweiterten oder veränderten Fragmentierungsbedingungen und Wiederholung der Schritte c) bis e), wobei zwischen den Schritten d) und e) eine resonante Anregung der dominanten Ionensorte erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) eine stoßinduzierte Fragmentierung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Falle des Vorkommens einer dominanten Ionensorte der Ladungszustand dieser dominanten Ionensorte festgestellt wird, und dass für die Wiederholungsmessung die gleiche Elternionensorte im gleichen Ladungszustand verwendet wird, wenn der Ladungszustand der dominanten Ionensorte mit dem Ladungszustand der ausgewählten Elternionensorte übereinstimmt, dass aber für die Wiederholungsmessung eine Elternionensorte eines höheren Ladungszustands ausgewählt wird, wenn der Ladungszustand der dominanten Ionensorte geringer ist als der Ladungszustand der zunächst ausgewählten Elternionensorte.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) nach Möglichkeit eine drei- oder mehrfach geladene Elternionensorte ausgewählt und in Schritt d) eine elektroneninduzierte Fragmentierung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass abwechselnd in Schritt d) stoß- und elektroneninduzierte Fragmentierungen durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die Auswahl der Elternionensorte in Schritt b) als auch die Entscheidung über das Vorhandensein einer dominanten Ionensorte in Schritt e) nach vorgegebenen Regeln automatisch erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass 1) die Peptide durch ein Separationsverfahren wie Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese getrennt werden, 2) das Ionenfallen-Massenspektrometer mit dem Separationsverfahren direkt gekoppelt ist, 3) die Aufnahme der Tochterionenspektren automatisch abläuft, und 4) die Untersuchungen der Spektren in Echtzeit erfolgen.