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DE102005051643A1 - Verfahren zur Detektion von pathogenen Mikroorganismen und/oder chemischen Gefahrenstoffen sowie Nachweisvorrichtung für pathogene Mikroorganismen und/oder chemische Gefahrenstoffe - Google Patents

Verfahren zur Detektion von pathogenen Mikroorganismen und/oder chemischen Gefahrenstoffen sowie Nachweisvorrichtung für pathogene Mikroorganismen und/oder chemische Gefahrenstoffe Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von pathogenen Mikroorganismen und/oder chemischen Gefahrenstoffen in Flüssigkeiten und/oder Lebensmitteln, wobei die zu untersuchende Flüssigkeit bzw. das zu untersuchende Lebensmittel einer Bestrahlung durch einen Laserpuls im nahen Infrarotbereich (Wellenlängen zwischen 700 nm und 1200 nm) mit einem Fokusvolumen des Laserpulses von weniger als 3 mum·3· ausgesetzt wird, wobei nachfolgend die von der zu untersuchenden Flüssigkeit bzw. dem zu untersuchenden Lebensmittel emittierte Strahlung erfasst wird, deren Emission durch den Laserpuls angeregt wird, wobei die erfasste Strahlung hinsichtlich der Intensität, der spektralen Zusammensetzung und/oder der Emissionsabklingkinetik ausgewertet wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft nach Anspruch 1 ein Verfahren zur Detektion von pathogenen Mikroorganismen und/oder chemischen Gefahrenstoffen in Flüssigkeiten oder Lebensmitteln sowie nach Anspruch 3 eine Nachweisvorrichtung für pathogene Mikroorganismen und/oder chemische Gefahrenstoffe in biologischen Geweben, Flüssigkeiten und/oder Lebensmitteln.
  • Die Erfindung betrifft ein optisches Verfahren und eine Vorrichtung zur bildgebenden Detektion von pathogenen Mikroorganismen – wie Bakterien, Sporen, Pilzen und Viren – und/oder chemischen Gefahrenstoffen in Geweben, Flüssigkeiten und/oder Nahrungsmitteln.
  • Der Nachweis von biologischen und chemischen Gefahrenstoffen mit typischen Abmessungen im Sub-Mikrometerbereich und Mikrometerbereich in biologischen Geweben wie der Haut und Schleimhäuten sowie in Gewässern und Lebensmitteln erfolgt jedoch bislang mit aufwändigen biochemischen, immun-histochemischen und gentechnischen Untersuchungsmethoden. So werden beispielsweise Abstriche gewonnen oder invasiv Gewebeproben entnommen, aufbereitet und mittels Nährlösungen und Agar-Medien die zu detektierenden Mikroorganismen üblicherweise zunächst amplifiziert, dann an spezielle Marker-Moleküle gebunden und diese dann z. B. mit optischen Methoden außerhalb der betroffenen Person bzw. außerhalb des betroffenen Lebensmittels detektiert.
    •
  • Der vorliegenden Erfindung liegt das Problem zu Grunde, ein Verfahren vorzuschlagen, mit dem die beschriebenen pathogenen Mikroorganismen und/oder chemischen Gefahrenstoffe mit einer einfachen Untersuchungsmethode in einer kurzen Zeitspanne mit vergleichsweise guter Zuverlässigkeit erkannt werden können. Weiterhin soll mit der vorliegenden Erfindung auch eine Nachweisvorrichtung vorgeschlagen werden, die sich zum Einsatz im medizinischen Bereich zur Diagnose am menschlichen Körper eignet.
  • Diese Aufgabe wird nach der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst, indem die zu untersuchende Flüssigkeit bzw. das zu untersuchende Lebensmittel einer Bestrahlung durch einen Laserpuls im nahen Infrarotbereich (Wellenlängen zwischen 700 nm und 1200 nm) mit einem Fokusvolumen des Laserpulses von weniger als 3 μm3 ausgesetzt wird, wobei nachfolgend die von der zu untersuchenden Flüssigkeit bzw. dem zu untersuchenden Lebensmittel emittierte Strahlung erfasst wird, deren Emission durch den Laserpuls angeregt wird, wobei die erfasste Strahlung hinsichtlich der Intensität, der spektralen Zusammensetzung und/oder der Emissionsabklingkinetik ausgewertet wird.
  • Durch dieses bildgebende, hochauflösende Verfahren zur Detektion von bestimmten pathogenen Mikroorganismen und chemischen Agenzien in Lebensmitteln und Flüssigkeiten, wie z. B. Trinkwasser und Getränken können unerwünschte Kontaminationen mit biologischen und/oder chemischen Gefahrenstoffen sensitiv und hochauflösend nachgewiesen werden.
  • Außerdem können dadurch Aussagen zum Einfluss dieser Stoffe auf den Atmungsstoffwechsel von Zellen und zur möglichen Akkumulation dieser Agenzien in den Zellkernen getroffen werden.
  • Weiterhin ergibt sich eine Lösung der Aufgabe auch im Einsatzgebiet der Medizin durch eine Nachweisvorrichtung nach Anspruch 3, indem die Nachweisvorrichtung eine Laseranordnung aufweist, mittels der ein Laserpuls im nahen Infrarotbereich (Wellenlängen zwischen 700 nm und 1200 nm) mit einem Fokusvolumen des Laserpulses von weniger als 3 μm3 emittierbar ist, wobei weiterhin eine Erfassungseinrichtung für die von dem zu untersuchenden biologischen Gewebe, der unterzusuchenden Flüssigkeit und/oder dem zu untersuchenden Lebensmittel emittierte Strahlung vorhanden ist, deren Emission durch den Laserpuls angeregt wurde, wobei weiterhin eine Auswertungseinheit vorhanden ist, mittels der die erfasste Strahlung hinsichtlich der Intensität, der spektralen Zusammensetzung und/oder der Emissionsabklingkinetik auswertbar ist.
  • Mittels dieser Vorrichtung können bestimmte pathogene Mikroorganismen und/oder chemische Agenzien auch in tierischen und humanen Geweben mittels der Laser-Anordnung bildgebend und hochauflösend detektiert werden.
  • Die Wirkungsweise des Verfahrens und der Nachweisvorrichtung lässt sich durch die nichtlinearen Prozesse der Zweiphotonen-Fluoreszenzanregung, der Dreiphotonen- Fluoreszenzanregung, der Second Harmonic Generation (SHG) und der Triple Harmonic Generation (THG) erklären.
  • Die zu detektierenden Substanzen werden selektiv zur Strahlungsemission angeregt. Die emittierte Strahlung der Substanzen unterscheidet sich von der emittierten Strahlung der Mikroumgebung hinsichtlich der Intensität und/oder der spektralen Zusammensetzung und/oder der Emissionsabklingkinetik. Diese Größen können messtechnisch erfasst und ausgewertet werden.
  • Die nichtlinearen Prozesse werden dabei durch fokussierte Femtosekunden-Laserstrahlung im nahen infraroten (NIR) Spektralbereich von 700 nm bis 1200 nm in einem geringen Fokusvolumen von weniger als 3 μm3 ausgelöst.
  • Bei der Ausgestaltung des Verfahrens nach Anspruch 2 werden die zu untersuchende Flüssigkeit bzw. das zu untersuchende Lebensmittel und die Laseranordnung derart gegeneinander verschoben, dass aus den untersuchten Teilvolumina ein untersuchtes Gesamtvolumen zusammen gesetzt wird.
  • Durch das Beam-Scanning, bei dem der Laserstrahl über das zu untersuchende Target verschoben wird, oder durch das Objekt-Scanning, bei dem bei fest positioniertem Laserstrahl das Target verschoben wird, wird das zu untersuchende Target abgerastert und die emittierte Strahlung in Abhängigkeit von der Position des Anregungsvolumens detektiert.
  • Das Verfahren und die Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung sind wegen der einfachen Untersuchungsmethode und dem schnellen Vorliegen von Ergebnissen vorzugsweise zum Nachweis des Eindringens von pathogenen Mikroorganismen in Geweben und Lebensmitteln im Bereich Bioterrorismus und Lebensmittelsicherheit einsetzbar.
  • Die unerwünschten biologischen und chemischen Stoffe können beispielsweise Anthrax-Sporen, gefährliche Bakterien und Viren sowie Schimmel- und Hefepilze in biologischen Geweben sowie in Lebensmitteln sein. Üblicherweise beträgt die Längendimension einzelner Bakterien 0,25 μm bis 10 μm (z. B. Bacillus anthracis 3 – 10 μm, Clostridium botulinum 3 – 8 μm, Escheria coli 1.5 μm, Staphylococcus aureus 0.9 μm, Salmonella species 1 – 3 μm, Mycoplasma pneumoniae 0.25 μm, Sporen 0.5 – 2 μm). Virendimensionen liegen im Bereich 0,02 μm bis 1 μm (z. B. Ebola virus 1 μm, Poxviridae 0.14 – 0.45 μm, Rhinovirus 0.023 μm) und Pilzdimensionen im Längenbereich bis 10 μm (z. B. Aspergillus 3 – 8 μm, Candida albicans 3 – 8 μm). Die genannten Mikroorganismen können zudem dreidimensionale Cluster bilden. Um eine schnelle in situ Frühdiagnose durchführen zu können, sind hochauflösende in situ Nachweisverfahren gefordert.
  • Durch die mit der vorliegenden Erfindung vorgeschlagene Nachweisvorrichtung wird es beispielsweise möglich, bildgebend und dreidimensional hochauflösend in situ Sporen und gefährliche Bakterien auf bzw. in kontaminierten Hautarealen möglicherweise betroffener Personen zu untersuchen und mit den ermittelten Daten eine Schnelldiagnose zu treffen.
  • Mikroorganismen und viele chemische Agenzien besitzen eine Autofluoreszenz im sichtbaren Spektralbereich. Typischerweise zeichnen sich Mikroorganismen durch eine Fluoreszenz im blaugrünen Spektralbereich aus, die üblicherweise mit ultravioletter (UV) Strahlung induziert werden kann. Einige pathogene Mikroorganismen synthestisieren zudem gelb und rot fluoreszierende Zink-Porphyrine und metallfreie Porphyrine, die optimal mit Strahlung um 400 nm angeregt werden können (König, Schneckenburger: Laser-Induced Autofluorescence for Medical Diagnosis. J. Fluorescence 4(1)(1994)17-40). Jedoch ist die Eindringtiefe von UV und kurzwelliger sichtbarer Strahlung in Geweben und Lebensmitteln aufgrund hoher Absorptions- und Streukoeffizienten gering und ermöglichen keine sensitive hochauflösende Detektion von pathogenen Mikroorganismen und chemischen Stoffen in der Objekttiefe.
  • Ein neueres Verfahren ist die Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie, bei der durch Zweiphotonen-Anregung mittels naher infraroter Femtosekunden-Laserstrahlung exogene Fluorophore in Einzelzellen nachgewiesen werden können (Patent US 5.034.613). Zudem ist es möglich, schwache Eigenfluoreszenzen in den Mitochondrien durch Präsenz des reduzierten Koenzyms NAD(P)H zu detektieren (König et al. Two-photon excited lifetime imaging of autofluorescence in cells during UVA and NIR photostress. J. Microsc. 183(1996)197-204). Zellkerne zeigen keine sichtbare Autofluoreszenz.
    •
  • Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt. Die Figuren zeigen dabei:
  • 1. Die Strahlung eines NIR Femtosekundenlasers (1) wird mittels Optik (2) in einen flexiblen Wellenleiter, z. B. eine Photonic Crystal Fiber, (3) mit Kollimator (4) fokussiert und zu einem x,y Galvoscanner (5), und durch eine Scanoptik (6) und einen Strahlteiler (7) sowie eine piezoverstellbare Fokussieroptik (8) geleitet und auf das zu untersuchende Objekt (9) geleitet. Die biologischen und/oder chemischen Gefahrenstoffe sowie die Mikroumgebung emittieren. Die Emissionsstrahlung wird durch den Strahlteiler (7) von der Laser-Streustrahlung separiert und mittels wellenlängen-selektivem Element (10) zeitaufgelöst mittels schnellem Detektor (11) sensitiv, z. B. mittels des Verfahrens der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung mit Zeitauflösungen im Pikosekundenbereich, detektiert. Die Bildverarbeitung erfolgt in dem Modul (12) anhand der Detektorsignale und der Position des x,y Scanners (5) und der Fokussieroptik (8).
  • 2. Die Strahlung eines NIR Femtosekundenlasers (1) wird mittels Optik (2) in einen flexiblen Wellenleiter, z. B. eine Photonic Crystal Fiber, (3) mit piezo-verstellbarer Fokussieroptik (13) fokussiert. Die Strahlposition ist fixiert. Es wird das auf einer Verstelleinheit (14) befindliche Objekt (9) bewegt (Objektscanning).
  • 3. Die Strahlung eines NIR Femtosekundenlasers (1) wird durch einen x,y Galvoscanner (5), Scanoptik (6), Strahlteiler (15), piezoverstellbarer Fokussieroptik (16) und einer stäbchenförmigen Optik bestehend aus Grinlinsen (17), die minimal invasiv in das Gewebe bzw. die Flüssigkeit bzw. das Lebensmittel eingeführt wird, transmittiert und in das Objekt (9) fokussiert. Die emittierte Strahlung wird über den Strahlteiler (15) einem schnellen Detektor mit wellenlängen-selektiven Element (18) zugeführt.

Claims (3)

  1. Verfahren zur Detektion von pathogenen Mikroorganismen und/oder chemischen Gefahrenstoffen in Flüssigkeiten und/oder Lebensmitteln, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende Flüssigkeit bzw. das zu untersuchende Lebensmittel einer Bestrahlung durch einen Laserpuls im nahen Infrarotbereich (Wellenlängen zwischen 700 nm und 1200 nm) mit einem Fokusvolumen des Laserpulses von weniger als 3 μm3 ausgesetzt wird, wobei nachfolgend die von der zu untersuchenden Flüssigkeit bzw. dem zu untersuchenden Lebensmittel emittierte Strahlung erfasst wird, deren Emission durch den Laserpuls angeregt wird, wobei die erfasste Strahlung hinsichtlich der Intensität, der spektralen Zusammensetzung und/oder der Emissionsabklingkinetik ausgewertet wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende Flüssigkeit bzw. das zu untersuchende Lebensmittel und die Laseranordnung derart gegeneinander verschoben werden, dass aus den untersuchten Teilvolumina ein untersuchtes Gesamtvolumen zusammen gesetzt wird.
  3. Nachweisvorrichtung für pathogene Mikroorganismen und/oder chemische Gefahrenstoffe in biologischen Geweben, Flüssigkeiten und/oder Lebensmitteln, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweisvorrichtung eine Laseranordnung aufweist, mittels der ein Laserpuls im nahen Infrarotbereich (Wellenlängen zwischen 700 nm und 1200 nm) mit einem Fokusvolumen des Laserpulses von weniger als 3 μm3 emittierbar ist, wobei weiterhin eine Erfassungseinrichtung für die von dem zu untersuchenden biologischen Gewebe, der unterzusuchenden Flüssigkeit und/oder dem zu untersuchenden Lebensmittel emittierte Strahlung vorhanden ist, deren Emission durch den Laserpuls angeregt wurde, wobei weiterhin eine Auswertungseinheit vorhanden ist, mittels der die erfasste Strahlung hinsichtlich der Intensität, der spektralen Zusammensetzung und/oder der Emissionsabklingkinetik auswertbar ist.
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