DE10153852A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration von Dioxinen - Google Patents

Abstract

Ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der in einer Probe vorhandenen Dioxine, umfasst die Schritte des chemischen Verbindens eines Haptens, das eine Struktur aufweist, die einen Teil der Strukturen von Dioxinen nachahmt, mit einem Rutheniumkomplex, um so ein Antigen zu bilden; Inkubieren des erhaltenen Antigens zusammen mit einem Antikörper, der an einer Elektrode fixiert oder auf ihre immobilisiert ist, um so eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu bewirken; Oxidation oder Reduktion des Rutheniumkomplexes durch Anlegen einer elektrischen Spannung an das Reaktionsprodukt durch die Elektrode, um so eine elektrolytische Lichtemission zu bewirken; und Beobachten der elektrolytisch emittierten Lichtstrahlen, um die Menge des Antigens quantitativ zu bestimmen und so die Konzentration der in der Probe vorhandenen Dioxine zu beurteilen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Eliminierung der Verwendung irgendeines Reagens, wie Wasserstoffperoxid, das für die chemische Lumineszenz erforderlich ist, die in hohem Maße empfindliche Analyse von Dioxinen und die Miniaturisierung der in der Analyse von Dioxinen zu verwendenden Vorrichtung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration von Dioxinen, die in einer Probe vorhanden sind. Insbe­ sondere betrifft die Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung, die eine in hohem Maße empfindliche und in hohem Maße selektive Bestimmung der Konzentration von polychlorierten Dibenzo-p-dioxinen (PCDD), einschließlich äußerst giftigem 2,3,7,8- Tetrachlordibenzo-p-dioxin (T₄CDD), und ähnlich äußerst giftigen polychlorierten Di­ benzofuranen (PCDF) ermöglichen, die während der Verbrennung von allgemeinem Ab­ fall und Industrieabfall erzeugt werden.

Dioxine werden in hoher Konzentration erzeugt, wenn Abfall verbrannt wird, und das wurde in letzter Zeit als ernstes Problem angesehen. Demgemäß muß die Konzentration von Dioxinen, die im Abgas enthalten sind, das während der Verbrennung des vorstehenden Abfalls erzeugt wird, auf nicht höhere Werte als 0,1 ng/Nm³ begrenzt werden, ausgedrückt in Bezug auf die Gesamtmenge der Dioxine und Homologe und Isomere davon, sowie den Homologen und Isomeren von polychloriertem Dibenzofuran, da die Dioxine äußerst giftig sind. Jedoch ist erforderlich, vorhandene Dioxine wegen ihrer äußersten Giftigkeit in so geringer Konzentration nachzuweisen, die jenseits der Nachweisgrenze von üblichen Analyseverfahren liegt. Darüber hinaus enthält das zu analysierende Abgas eine breite Vielfalt an Verunreinigungen und kontaminierenden Stoffen, wie Staub und Nebel in großer Menge. Aus diesem Grund erfordert die direkte und genaue Bestimmung und/oder quantitative Bestimmung von Dioxinen eine komplizierte Vorbehandlung des Abgases und die Verwendung einer speziell entworfenen Analysevorrichtung.

Ein typisches quantitatives Analyseverfahren umfasst die Schritte des Extrahie­ rens eines Abgases mit einem Lösungsmittel, wie Toluol oder Ethylenglycol für 72 Stunden unter Verwendung eines Soxhlet-Extraktors, Reinigung des Extrakts, Konzent­ rieren des Extrakts und dann Analysieren unter Verwendung eines Gaschromatographie- Massenspektrometers. Das Verfahren schließt die Verwendung komplizierter Schritte ein, die für die Analyse erforderlich sind, wie einen Schritt des Konzentrierens. Daher erfordert es zwei oder drei Wochen, bis die Analyse beendet ist oder gewünschte Ergeb­ nisse erhalten werden, und die Analyse ist ziemlich teuer.

JP-A-11-326222 schlägt ein indirektes Verfahren zur quantitativen Analyse von Dioxinen vor, bei dem kein Verfahren zum Konzentrieren einer Dioxine enthaltenden Probe erforderlich ist und das eine relativ preiswerte Vorrichtung verwendet. Das Verfahren umfasst die Schritte des Mischens eines Halogenatome enthaltenden organischen Lösungsmittels mit Metallkomplexen von 8-Oxychinolin und einer Probe, deren Konzentration an Dioxinen zu bestimmen ist; Bestrahlen des erhaltenen Gemisches mit angeregten Lichtstrahlen, um die Intensität der emittierten fluoreszierenden Lichtstrahlen zu bestimmen und dadurch Halogenphenole, deren Konzentration mit der der in der Probe vorhandenen Dioxine gut korreliert, quantitativ zu analysieren; und Ab­ schätzen der Konzentration der Dioxine auf der Basis der so bestimmten Konzentration der Halogenphenole.

In diesem Verfahren kann jedoch (1) die zu analysierende Flüssigkeit mit den fluoreszierenden Komplexen in Wechselwirkung treten und daher sollte jeder Einfluß von in der Flüssigkeit vorhandenen Bestandteilen, die mit den Halogenphenolen konkurrieren, vorher untersucht werden, und es sollte (2) die Beziehung zwischen den Konzentrationen der Halogenphenole und Dioxine vorher untersucht werden. Die durch das Verfahren erhaltenen Ergebnisse können in großem Maße durch Faktoren beeinflußt werden, die die Arten der Dioxine betreffen. Demgemäß kann das Verfahren eine Maßnahme sein, die deutlich schlechter in der Genauigkeit ist, da die Konzentration der in der Flüssigkeit vorhandenen Dioxine indirekt bestimmt wird. Zusätzlich ist das Fluoreszenzverfahren in hohem Maße empfindlich, aber das Verfahren ist ziemlich anfällig für gleichzeitig vorhandene Substanzen und die angeregten Lichtstrahlen beeinflussen unvermeidbar das System für die Untersuchung (oder ein Nachweissystem), und daher stellt das Verfahren nicht immer die gewünschte hohe Empfindlichkeit sicher.

Außerdem offenbart JP-A-11-79719 ein Verfahren zum reversiblen Absorbieren und Desorbieren eines Gases, ohne dass ein herkömmlich verwendetes Absorptionsmittel, wie Aktivkohle und Kieselgel, verwendet wird. Das Verfahren um­ fasst Inkontaktbringen eines Paars von Elektroden mit einer einen Rutheniumkomplex, der zum Absorbieren und Freisetzen von molekularem Stickstoff fähig ist, enthaltenden Lösung, und gleichzeitiges Regeln der zwischen den Elektroden angelegten elektrischen Spannung, um so Stickstoffgas zu absorbieren und desorbieren. Das Verfahren er­ möglicht (1) die Regelung der Absorption und Desorption des Gases bei Umgebungs­ temperatur und -druck ohne Anwenden von Wärme; (2) die Regelung der Gasabsorp­ tion und -desorption einfach durch Einstellen der an die Elektroden anzulegenden elekt­ rischen Spannung und (3) die reversible und wiederholte Absorption und Desorption des Gases. In diesem Verfahren, das eine Lösung eines Rutheniumkomplexes verwendet, der zur Absorption und Freisetzung von molekularem Stickstoff fähig ist, bleiben jedoch einige Probleme ungelöst, zum Beispiel, das Problem, ob das Verfahren die Absorption und Desorption von Substanzen mit ebenen Strukturen, wie Dioxine und Homologe und Isomere davon, sowie Homologe und Isomere von polychloriertem Dibenzofuran, er­ möglicht.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration von in einer Probe vorhandenen Dioxinen bereitzustellen, wobei die vorstehenden Probleme, die mit herkömmlichen Verfahren verbunden sind, überwunden werden.

Diese Aufgabe konnte auf der Basis des Befundes gelöst werden, dass die Verwendung eines Rutheniumkomplexes eine in hohem Maße selektive Bestimmung yon Dioxinen ermöglicht. Dabei wird ein neues Meßsystem unter Verwendung elektrolyti­ scher Lichtemission verwendet, um so eine in hohem Maße empfindliche Analyse von Dioxinen sicherzustellen, die die Verwendung eines Reagens, wie Wasserstoffperoxid, die für die chemische Lumineszenz erforderlich ist, nicht erfordert, was die Miniaturi­ sierung der Vorrichtung ermöglicht und die Empfindlichkeit der Analyse erhöhen kann. Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfah­ ren zur Bestimmung der Konzentration von in einer Probe vorhandenen Dioxinen bereit­ gestellt, umfassend die Schritte des chemischen Verbindens eines Haptens, das eine Struktur aufweist, die einen Teil der Struktur von Dioxinen nachahmt, mit einem Rutheniumkomplex, um so ein Antigen zu bilden; Inkubieren des erhaltenen Antigens zusammen mit einem Antikörper, der an einer Elektrode fixiert oder auf ihr immobilisiert ist, um so eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu bewirken; Oxidieren oder Reduzieren des Rutheniumkomplexes unter Anlegen einer elektrischen Spannung an das Reaktionsprodukt durch die Elektrode, um so eine elektrolytische Lichtemission zu bewirken; und Untersuchen der elektrolytisch emittierten Lichtstrahlen, um quantitativ die Menge des Antigens zu bestimmen und so die Konzentration der in der Probe vorhandenen Dioxine zu ermitteln.

Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines in einer Probe vorhandenen Dioxins bereitgestellt, umfassend die Schritte des Bereitstellens einer ersten Elektrode, an der ein Antikörper zu dem Dioxin immobilisiert ist; Eintauchen der ersten Elektrode in eine erste Flüssigkeit, die die Probe und ein Antigen enthält, wobei das Antigen durch chemi­ sches Verbinden eines Haptens, das eine Struktur aufweist, die einen Teil der Struktur des Dioxins nachahmt, mit einem Rutheniumkomplex gebildet wird; Inkubieren der Flüssigkeit zusammen mit der ersten Elektrode, um so eine konkurrierende Antigen- Antikörper-Reaktion zwischen dem Antikörper und Antigen (Dioxin) und dem Hapten zu bewirken; Herausnehmen und Waschen der ersten Elektrode, um das Antigen und das Hapten, die nicht mit dem Antikörper umgesetzt sind, zu entfernen; Eintauchen der ersten Elektrode und einer zweiten Elektrode in eine zweite Flüssigkeit, die ein Reduktionsmittel und einen Elektrolyten enthält; Anlegen einer elektrischen Spannung an die zweite Flüssigkeit durch die erste und zweite Elektrode, um den Rutheniumkomplex zu oxidieren; Reduzieren des oxidierten Rutheniumkomplexes durch das Reduktionsmittel, um so eine elektrolytische Lichtemission zu bewirken; Nachweisen der elektrolytisch emittierten Lichtstrahlen; und Erhalten der Menge des in der Probe vorhandenen Dioxins unter Verwendung einer Eichkurve.

Gemäß einem dritten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird eine im vorstehenden Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von in einer Probe vorhan­ denen Dioxinen verwendbare Messvorrichtung bereitgestellt, die eine durch Lösen eines Rutheniumkomplexes und Trimethylamin in einer phosphatgepufferten wässrigen Lösung hergestellte Messflüssigkeit; eine Goldelektrode, durch die eine elektrische Spannung an die Flüssigkeit angelegt wird; einen Antikörper, fixiert an oder immobilisiert auf der Goldelektrode; einen Detektor für emittiertes Licht zum Bestimmen der Intensität der elektrolytisch emittierten Lichtstrahlen; und eine arithmetische Einheit zur quantitativen Bestimmung der Konzentration der in der Probe vorhandenen Dioxine, basierend auf der Intensität des emittierten Lichts, das durch den Detektor für emittiertes Licht nachgewiesen wird, umfasst.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im Einzelnen in Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen:

Fig. 1 ein schematisches Diagramm ist, das die Situation veranschaulicht, in der Dioxin und die Dioxinhaptenstelle eines elektrolytisch lichtemittierenden Reagens kon­ kurrierend mit einem Dioxinantikörper verbunden sind.

Fig. 2 ein schematisches Diagramm ist, das zeigt, wie Licht an der Haptenstelle elektrolytisch emittiert wird.

Fig. 3 ein schematisches Diagramm ist, das eine Nachweisvorrichtung zur Untersuchung der elektrolytisch emittierten Lichtstrahlen zeigt.

Fig. 4 ein Diagramm (Eichkurve) ist, das die Beziehung zwischen der Kon­ zentration von Dioxinen und der Intensität des emittierten Lichts zeigt.

In Bezug auf die Funktionen der Dioxine ist bekannt, dass, wenn eine chemische Substanz (wie Dioxin, Dibenzofuran und coplanare PCB) mit einer ebenen Struktur in Zellen eingemischt wird, die Substanz hohe Affinität für ein Ah-Rezeptor genanntes Protein zeigt und damit bindet. Daher verwendet die vorliegende Erfindung solche Ei­ genschaften des Dioxins in bestem Maße. Insbesondere bildet die vorliegende Erfindung zuerst eine fremde niedermolekulare Substanz, deren Struktur nur einen Teil der Struk­ tur des Dioxins nachahmt und die charakteristischen Eigenschaften des niederen Mole­ küls als Hapten voll verwendet, das ein spezielles Antigen bilden kann, wenn das Mole­ kül an ein Polymer gebunden wird. Dann wird das Hapten, das nur einen Teil der Struk­ tur des Dioxins nachahmt, chemisch mit einem Rutheniumkomplex verbunden, um so ein Antigen zu bilden. Das Antigen kann einfach durch Oxidation-Reduktion eine elektrolytisch lichtemittierende Reaktion bewirken. Das erhaltene Antigen wird zusammen mit einem an einer Elektrode immobilisierten Antikörper inkubiert, um so eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu bewirken. Eine elektrische Spannung wird durch die Elektroden an das Reaktionsprodukt angelegt, um eine elektrolytische Lichtemission zu bewirken. Dann kann das Antigen quantitativ durch Untersuchen der Intensität der emittierten Lichtstrahlen analysiert werden, um so die Konzentration der Dioxine zu bestimmen. So ermöglicht die vorliegende Erfindung die Analyse von in einer Probe vorhandenen Dioxinen ohne Verwendung irgendeines Reagens, das für die chemische Lumineszenz erforderlich ist, wie Wasserstoffperoxid, ermöglicht die Miniaturisierung einer in dieser Analyse zu verwendenden Messvorrichtung und ermöglicht auch die Verbesserung der Empfindlichkeit der Analyse.

Nachstehend wird die Bildung eines Antigens 1 (siehe Fig. 1) erklärt, das durch die chemische Bindung einer Dioxin-Hapten-Stelle 2 (siehe Fig. 1) mit einem Rutheniumkomplex 3 (siehe Fig. 1) als elektrolytisch lichtemittierendes Reagens dient. Zuerst kann das Dioxin-Hapten zum Beispiel gemäß folgendem Reaktionsschema (1) hergestellt werden:

Reaktionsschema 1

Die Verbindung (A) auf der linken Seite des chemischen Schemas ist zum Bei­ spiel ein Phthalsäureester: 4,5-Dichlorphthalsäureanhydrid mit einem Teil der Struktur von 2,3-Dibenzodioxin. Diese Verbindung (A) wird mit einer Verbindung (B): 4-(p- Aminophenyl)butansäure, umgesetzt, die als Spacer dient, wenn das Hapten mit einem Antikörper gebunden wird, wobei so eine Verbindung (C): N-(4',5'-Dichlorphthaloyl)- 4-(p-aminophenyl)buttersäure, gebildet wird. Diesbezüglich ist der Teil (C) die Hap­ tenstelle und diese wird mit einem Rutheniumkomplex durch die am Teil (D) vorhandene Carboxylgruppe verbunden.

Andererseits ist auch erforderlich, ein Reagens zu dem Rutheniumkomplex 3 zu geben, das als Spacer dienen kann, wenn das erhaltene Antigen mit dem Antikörper ge­ bunden wird. Die Herstellung eines solchen Rutheniumkomplexes 3 wird nachstehend in Bezug auf die folgenden Reaktionsschemata (2) bis (6) detailliert dargestellt:

Reaktionsschema 2

Gemäß dem Reaktionsschema (2) wird Kaliumphthalimid (A) mit 1,3-Dibrompro­ pan (B) umgesetzt, wobei 1-(N-Phthaloylamino)-3-brompropan (C) erhalten wird, das als Spacer dient, wenn das erhaltene Antigen mit einem Antikörper gebunden wird.

Reaktionsschema 3

Dann wird gemäß Reaktionsschema 3 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridin (A) mit 1- (N-Phthaloylamino)-3-brompropan (B), das gemäß Reaktionsschema 2 hergestellt wurde, umgesetzt, wobei 4-(4-(N-Phthaloylamino)butyl)-4'-methyl-2,2'-bipyridin (C) erhalten wird.

Reaktionsschema 4

Außerdem wird 4-(4-(N-Phthaloylamino)butyl)-4'-methyl-2,2'-bipyridin (A) mit Hydrazin H₂NNH₂ reduziert, wobei 4-(4-Aminobutyl)-4'-methyl-2,2'-bipyridin (B) ge­ mäß dem Reaktionsschema 4 erhalten wird.

Reaktionsschema 5

Dann wird 2,2'-Bipyridin (A) mit Rutheniumtrichlorid umgesetzt, wobei Dichlorbis(2,2'-bipyridin)ruthenium (C) gemäß Reaktionsschema 5 erhalten wird.

Reaktionsschema 6

Gemäß dem Reaktionsschema 6 wird Dichlorbis(2,2'-bipyridin)ruthenium (A), hergestellt im Reaktionsschema 5, mit 4-(4-Aminobutyl)-4'-methyl-2,2'-bipyridin (B), hergestellt im Reaktionsschema 4, umgesetzt, wobei so endgültig der Bis(2,2'- bipyridyl)-[4-(4-aminobutyl)-4'-methyl-2,2'-bipyridin]ruthenium-Komplex (C) gebildet wird, der einen Spacer trägt und verwendet wird, wenn das Hapten mit einem Antikörper gebunden wird.

Anschließend wird das N-(4',5'-Dichlorphthaloyl)-4-(p-aminophenyl)butansäure des Reaktionsschemas 1 mit einem Spacer mit dem Bis(2,2'-bipyridyl)-[4-(4- aminobutyl)-4'-methyl-2,2'-bipyridin]rutheniumkomplex des Reaktionsschemas 6 umgesetzt, der ebenfalls einen Spacer aufweist, wobei das Antigen 1 erhalten wird, das als elektrolytisch lichtemittierendes Reagens dient, das ein Hapten von Dioxinen chemisch verbunden mit einem Rutheniumkomplex umfasst.

Reaktionsschema 7

In diesem Stadium können, wenn die Menge des [4-(4-Aminobutyl)-4'-methyl- 2,2'-bipyridin]ruthenium-Komplexes quantitativ bestimmt werden kann, die Haptenstel­ len von Dioxinen ähnlich quantitativ bestimmt werden.

Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, das die Situation veranschaulicht, in der Dioxin 20 und die Dioxin-Hapten-Stelle 2 eines Antigens 1, das einen Rutheniumkom­ plex 3 daran gebunden umfasst, konkurrierend mit einem Dioxinantikörper 4 gebunden werden. Die in die quantitative Analyse der vorliegenden Erfindung einbezogene Anti­ gen-Antikörper-Reaktion wird nachstehend im Einzelnen in Bezug auf Fig. 1 beschrie­ ben. Das Dioxinhapten 2, dessen Struktur einen Teil der Strukturen der Dioxine 20 nachahmt, wird chemisch mit einem Rutheniumkomplex 3 gebunden, wobei ein Antigen 1 gebildet wird (siehe die vorstehenden Reaktionsschemata 1 bis 7), und das erhaltene Antigen 1 dient so als elektrolytisch lichtemittierendes Reagens. Das Antigen 1 und die Dioxine 20 werden zusammen mit einem Antikörper 4, der auf der Oberfläche einer Elektrode S immobilisiert ist, inkubiert, um so eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu bewirken. Diesbezüglich wird jedoch keine chemische Bindung in diese Antigen-Anti­ körper-Reaktion einbezogen, sondern findet die Reaktion durch schwache Wechselwir­ kung, einschließlich zum Beispiel Wasserstoffbrückenbindungen, statt. Es gibt auf dem Antikörper 4 eine große Zahl von Stellen, die in eine solche Wechselwirkung einbezogen sind, und daher weist der Antikörper 4 hohe Fähigkeit der Erkennung der Dioxin- Hapten-Stelle 2 und der Dioxine 20 auf, und daher ist er stark mit der Hapten-Stelle 2 und den Dioxinen 20 verbunden. Das ist so vorzustellen, dass der Antikörper 4 eine Lücke 4' mit ähnlicher Form zu der der Dioxin-Hapten-Stelle 2 und den Dioxinen 20 einschließt und letztere vollständig in der Lücke beherbergt sind, wie aus Fig. 1 zu se­ hen ist.

Nachstehend wird der Mechanismus der Antigen-Antikörper-Reaktion detailliert beschrieben. Zuerst wird der Antikörper 4 auf der Oberfläche einer Goldelektrode 5 durch eine chemische Bindung immobilisiert. Insbesondere wird die Goldelektrode 5 mit einer Säure, wie Schwefelsäure, behandelt, um so die Oberfläche davon zu säubern, und die Elektrode 5 dann für 30 Minuten in eine Lösung von 3,3'-Dithiodipropansäure (HOOCCH₂CH₂S-SCH₂CH₂COOH) (10 mmol/l) getaucht, um so die 3,3'-Dithio­ dipropansäuremoleküle auf der Oberfläche der Goldelektrode 5 chemisch zu absorbieren (chemische Bindung, gebildet durch die Wechselwirkung zwischen dem Schwefelatom (5) der 3,3'-Dithiodipropansäure und dem die Elektrode 5 bildenden Goldatom (Au)). Dann wird die Goldelektrode 5 aus der Lösung genommen und mit einem Alkohol, wie Methanol, gewaschen. Außerdem wird die Goldelektrode 5 zusätzlich 15 Minuten in 20 ml einer 90%igen wässrigen Dioxanlösung, versetzt mit 30 mg Hydroxysuccinimid und 50 mg wasserlöslichem Carbodiimid (1-Ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimid- Hydrochlorid), getaucht, um die Carboxylgruppe der 3,3'-Dithiodipropansäure zu aktivieren, die auf der Oberfläche der Goldelektrode 5 immobilisiert ist. Danach wird die Goldelektrode 5, die die aktivierten 3,3'-Dithiodipropansäuremoleküle trägt, bei Raumtemperatur für 1 bis 10 Minuten in eine Lösung getaucht, die den Antikörper 4 enthält, um so durch die Reaktion zwischen Aminogruppen (NH₂-) des Antikörpers 4 und den Carboxylgruppen der 3,3'-Dithiodipropansäuremoleküle Amidobindungen (-CONH-) zu bilden. So wird der Antikörper 4 fest auf der Goldelektrode 5 immobilisiert. Anschließend wird die Goldelektrode 5 mit einem Phosphatpuffer gewaschen, um die Antikörpermoleküle 4 zu entfernen, die durch die Spacer mit der Elektrode 5 nicht chemisch gebunden sind.

Andererseits wird eine festgelegte Menge des Antigens 1, das durch chemische Bindung der Dioxin-Hapten-Stelle 2 und des Rutheniumkomplexes 3 erhalten wird, zu einer Messflüssigkeit gegeben, die aus einem Phosphatpuffer, versetzt mit 3% DMSO (Dimethylsulfoxid) hergestellt wird. DMSO wird verwendet, um die Dioxine in der Flüssigkeit vollständig zu lösen. Wenn eine Flüssigkeit, hergestellt aus 0,2 mol/l phos­ phatgepufferter Lösung (pH = 7,0), die 3% DMSO enthält, als zu analysierende Probe verwendet wird, oder nur eine kleine Menge DMSO zu einer Probe gegeben wird, können Dioxine in der Probenlösung bis zu einem Grad in der Größenordnung von ppb gelöst werden. Dann wird die Goldelektrode 5, auf die der Antikörper 4 immobilisiert ist, in diese Messflüssigkeit getaucht, gefolgt von 10 Minuten Inkubieren, um eine Anti­ gen-Antikörper-Reaktion zu bewirken. Danach wird die Goldelektrode 5 aus der Mess­ flüssigkeit entfernt und dann leicht mit einem Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen.

Fig. 2 ist ein schematisches Diagramm, das den Mechanismus der elektrolyti­ schen Lichtemission durch das Antigen 1 zeigt, das aus der chemisch gebundenen Di­ oxin-Hapten-Stelle 2 und dem Rutheniumkomplex 3 gebildet wird. Wie aus Fig. 2 zu sehen ist, werden die Elektrode 5 (Anode), eine Kathode, wie eine Edelstahlelektrode (nicht gezeigt) und eine Referenzelektrode, wie Silber/Silberchlorid-Elektrode (nicht gezeigt), in einen Phosphatpuffer getaucht, der ein Reduktionsmittel, wie ein tertiäres Niederalkylamin, wie Trimethylamin (TMA), Triethylamin, Tripropylamin, Tributylamin, eine Aminosäure, wie Prolin, oder eine organische Säure, wie Oxalsäure, enthält. Eine elektrische Spannung (0,9 bis 1,3 V) wird an die Elektrode 5 bei einer Temperatur von 15 bis 30°C für 20 Sekunden bis 2 Minuten angelegt, um eine elektrolytische Lichtemission zu bewirken, und die Intensität der elektrolytisch emittierten Lichtstrahlen dann bestimmt.

Die vorstehenden Verfahren werden in Bezug auf mehrere Proben durchgeführt, die ein Dioxin in mehreren Konzentrationen und das Antigen 1 in einer festgelegten Konzentration von zum Beispiel 20 µg/l enthalten. Die Daten werden aufgetragen, um eine Eichkurve, wie in Fig. 4 gezeigt, zu erstellen.

Die für die vorstehende elektrolytische Lichtemission erforderlichen Substanzen sind ein Rutheniumkomplex 3 und ein Phosphatpuffer, der ein Reduktionsmittel, wie Trimethylamin (TMA) 6, enthält. Die Goldelektrode 5 oxidiert den Rutheniumkomplex 3 oder die Wertigkeit des Komplexes 3 (oder Ruthenium) wird von 2 auf 3 geändert, und so wird der Komplex in ein aktiviertes Reagens umgewandelt. Der aktivierte Komplex 3 wird dann mit Trimethylamin (TMA) 6 umgesetzt, das oxidiert wird, wobei TMAox 7 (ein Oxidationsprodukt von TMA) erhalten wird, oder TMA reduziert den aktivierten Komplex (die Wertigkeit davon wird von 3 auf 2 reduziert), wobei so Lichtstrahlen emittiert werden. Der Phosphatpuffer ist zum Optimieren der Bedingungen für die Lichtemission wichtig. Insbesondere dient der Puffer als Elektrolyt oder kann die für Elektrolyse erforderliche Leitfähigkeit sicherstellen und den pH-Wert (pH 7,0) der Umgebung für die Elektrolyse einstellen. Der Rutheniumkomplex 3 ist an den Antikör­ per 4, der an der Oberfläche der Goldelektrode 5 immobilisiert ist, in umgekehrtem An­ teil zur Dioxinkonzentration der wässrigen Lösung gebunden, aber die Menge des an den Antikörper gebundenen Rutheniumkomplexes wird verringert, wenn die Dioxinkon­ zentration der wässrigen Lösung hoch ist. Danach wird die Goldelektrode 5, die den Ru­ theniumkomplex 3 daran gebunden trägt, leicht gewaschen, um den Einfluß von irgend­ welcher in der Dioxinlösung vorhandener Inhibitorsubstanz auf ein so geringes Ausmaß wie möglich zu eliminieren, und in eine getrennt hergestellte wässrige phosphatgepuffer­ te Lösung eingebracht, die Trimethylamin (TMA) 6 enthält. Dann wird das elektroly­ tisch emittierte Licht beobachtet oder quantitativ bestimmt.

Das elektrolytisch emittierte Licht wird vorzugsweise unter Verwendung einer Nachweisvorrichtung, wie in Fig. 3 gezeigt, nachgewiesen, die eine Kondensorlinse 8, einen Spiegel 9, ein optisches Filter 10 und einen Nachweissensor 11 umfasst. Die Menge des in einer Probe vorhandenen Rutheniumkomplexes kann quantitativ durch Aufzeichnen der Intensität des emittierten Lichts und der Dauer der Lichtemission, nach­ gewiesen durch den Nachweissensor 11, bestimmt werden. Außerdem wurde die Bezie­ hung zwischen den Mengen des Rutheniumkomplexes und der Dioxin-Hapten-Stelle vorher bestimmt, und daher kann die Menge an in der Probe vorhandenem Dioxin quan­ titativ bestimmt werden. Diesbezüglich ist erwünscht, eine arithmetische Einheit (nicht gezeigt), wie einen Personal-Computer, zu verwenden, so dass eine Kalibrierungskurve, wie die in Fig. 4 gezeigte, in den Speicher vorher eingegeben werden kann, um so die quantitative Bestimmung der Menge an in der Probe vorhandenem Dioxin, basierend auf der Intensität des emittierten Lichts, zu ermöglichen.

Wie aus der vorstehenden Erklärung zu sehen ist, wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Dioxine enthaltende Probe zu einer ersten Flüssigkeit gegeben, die eine festgelegte Menge des Antigens 1 enthält. In die Flüssigkeit wird die Elektrode (Anode) 5, auf der der Antikörper 4 immobilisiert ist, getaucht, wobei eine Antigen-Antikörper- Reaktion zwischen dem auf der Elektrode 5 immobilisierten Antikörper 4 und dem Anti­ gen 1 und Dioxinen 20 bewirkt wird. Das heißt, die Dioxine in der Probe und das Anti­ gen 1 reagieren konkurrierend mit dem Antikörper 4. Wenn die Konzentration der Di­ oxine in der Probe hoch ist, ist das Reaktionsverhältnis der Dioxine zu dem Antikörper 4 hoch, während das Reaktionsverhältnis des Antigens 1 zu dem Antikörper 4 gering ist. Als Ergebnis ist die Intensität des emittierten Lichts gering. Andererseits ist, wenn die Konzentration der Dioxine in der Probe niedrig ist, das Reaktionsverhältnis der Dioxine zu dem Antikörper gering, während das Reaktionsverhältnis des Antigens 1 zu dem An­ tikörper 4 hoch ist.

Dann wird die Elektrode (Anode) 5, auf der der Antikörper 4 immobilisiert ist, wobei der Antikörper 4 mit dem Antigen 1 oder den Dioxinen in der Probe verbunden ist, in eine zweite Flüssigkeit getaucht, die ein Reduktionsmittel und einen Elektrolyten, wie einen Phosphatpuffer, enthält. Eine Kathode, wie eine Edelstahlkathode, und eine Referenzelektrode, wie Ag/AgCl, werden ebenfalls in die zweite Flüssigkeit getaucht. Eine elektrische Spannung wird dann an die zweite Flüssigkeit durch die Elektroden an­ gelegt, um den Rutheniumkomplex 3 zu oxidieren. Der oxidierte Rutheniumkomplex 3 wird dann mit dem Reduktionsmittel reduziert, um Licht zu emittieren. Das emittierte Licht wird mit einem Detektor nachgewiesen. Die Intensität des emittierten Lichts hängt von der Menge des Rutheniumkomplexes 3 ab. So kann, wenn die Intensität des emittierten Lichts nachgewiesen wird, die Konzentration der Dioxine in der Probe aus der vorher hergestellten Eichkurve erhalten werden.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im Einzelnen in Bezug auf die fol­ genden Arbeitsbeispiele beschrieben, aber die vorliegende Erfindung ist in keiner Weise auf die speziellen Beispiele beschränkt.

Beispiel

Als Beispiel der vorliegenden Erfindung wurde eine Korrelation zwischen der Dioxinkonzentration und der Intensität des emittierten Lichts (Kalibrierungskurve) be­ stimmt.

Eine Flüssigkeit, die 2,3,7,8-Tetrachlor-p-dibenzodioxin in der Konzentration von 0,02, 0,06, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 oder 3,0 µg/l in einem 0,2 mol/l 3% DMSO (Di­ methylsulfoxid) enthaltenden Phosphatpuffer enthielt, wurde hergestellt. Zur Flüssigkeit wurden das gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren hergestellte Antigen 1 und Trimethylamin in der Konzentration von 20 µg/l bzw. 1 mmol/l gegeben.

Die Goldelektrode 5 (Anode), auf der der Antikörper (EWVATITGGGTYTYYPDSVRGC) immobilisiert worden war und die gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren hergestellt worden war, eine Edelstahlelektrode (Ka­ thode) und eine Referenzelektrode (Silber/Silberchlorid) wurden in die das Antigen ent­ haltende Flüssigkeit eingetaucht und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die elektrische Spannung von 1,1 V wurde 1 Minute bei Raumtemperatur an die Elektroden angelegt und das emittierte Licht durch die in Fig. 3 gezeigte Nachweisvorrichtung nachgewiesen.

Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 4 als Diagramm aufgetragen. Die Daten von Fig. 4 zeigen deutlich, dass die Intensität von elektrolytisch emittierten Lichtstrahlen durch das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung festgestellt werden kann, auch wenn die Dioxinkonzentration ziemlich gering ist (zum Beispiel 0,01 bis 0,1 ppb), und dass die Empfindlichkeit der Bestimmung der Dioxinkonzentration leicht und beträchtlich verbessert werden kann.

Wie vorstehend im Einzelnen beschrieben, bestimmt die vorliegende Erfindung die Konzentration von in einer Probe vorhandenen Dioxinen durch chemisches Verbinden eines Haptens, das eine Struktur aufweist, die einen Teil der Strukturen von Dioxinen nachahmt, mit einem Rutheniumkomplex, wobei so ein Antigen gebildet wird; Inkubieren des erhaltenen Antigens zusammen mit einem Antikörper, der an eine Elektrode fixiert oder auf ihr immobilisiert ist, um so eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu bewirken; Oxidieren oder Reduzieren des Rutheniumkomplexes durch Anlegen einer elektrischen Spannung an das Reaktionsprodukt durch die Elektrode, um so eine elektrolytische Lichtemission zu bewirken; und Beobachten der elektrolytisch emittierten Lichtstrahlen, um die Menge des Antigens quantitativ zu bestimmen und so die Konzentration der in der Probe vorhandenen Dioxine zu beurteilen. Demgemäß erfordert die vorliegende Erfindung nicht die Verwendung irgendeines Reagens, wie Wasserstoffperoxid, das für die chemische Lumineszenz erforderlich ist, kann die vorliegende Erfindung eine in hohem Maße empfindliche Analyse von Dioxinen sicherstellen und ermöglicht die vorliegende Erfindung die Miniaturisierung der in der Analyse von Dioxinen zu verwendenden Vorrichtung.

Claims (7)

1. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von in einer Probe vorhandenen Dioxinen, umfassend die Schritte des chemischen Verbindens eines Haptens, das eine Struktur aufweist, die einen Teil der Strukturen der Dioxine nachahmt, mit einem Rutheniumkomplex, um so ein Antigen zu bilden; Inkubieren des erhalte­ nen Antigens zusammen mit einem Antikörper, der an eine Elektrode fixiert oder auf ihr immobilisiert ist, um so eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu bewirken; Oxidieren oder Reduzieren des Rutheniumkomplexes durch Anlegen einer elek­ trischen Spannung an das Reaktionsprodukt durch die Elektrode, um so eine elek­ trolytische Lichtemission zu bewirken; und Beobachten der elektrolytisch emit­ tierten Lichtstrahlen, um die Menge des Antigens quantitativ zu bestimmen und so die Konzentration der in der Probe vorhandenen Dioxine zu ermitteln.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die elektrolytische Lichtemission des Rutheniumkomplexes eine Oxidationsreaktion, in der der Komplex oder das Ruthenium eine elektrische Ladung erhält oder dessen Wenigkeit von 2 auf 3 geändert wird, und eine Reduktionsreaktion mit einer Trimethylamin enthaltenden phosphatgepufferten Lösung, in der die Wertigkeit von 3 auf 2 reduziert wird, verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Antigen zusammen mit dem auf der Elektrode immobilisierten Antikörper unter Verwendung einer Messflüssig­ keit inkubiert wird, die aus einem 3% Dimethylsulfoxid enthaltenden Phosphat­ puffer hergestellt wird, um so eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu bewirken.

4. Verfahren zum Bestimmen der Konzentration eines in einer Probe vorhandenen Dioxins, umfassend die Schritte des Bereitstellens einer ersten Elektrode, auf der ein Antikörper zum Dioxin immobilisiert wird; Eintauchen der ersten Elektrode in eine die Probe und ein Antigen enthaltende erste Flüssigkeit, wobei das Anti­ gen durch chemisches Verbinden eines Haptens, das eine Struktur aufweist, die einen Teil der Struktur des Dioxins nachahmt, mit einem Rutheniumkomplex gebildet wird; Inkubieren der Flüssigkeit zusammen mit der ersten Elektrode, um so eine konkurrierende Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem Antikörper und dem Antigen und dem Hapten zu bewirken; Herausnehmen und Waschen der ersten Elektrode, um das Antigen und das Hapten zu entfernen, die mit dem Antikörper nicht umgesetzt sind; Eintauchen der ersten Elektrode und einer zweiten Elektrode in eine zweite Flüssigkeit, die ein Reduktionsmittel und einen Elektrolyten enthält; Anlegen einer elektrischen Spannung an die zweite Flüssigkeit durch die erste und zweite Elektrode, um den Rutheniumkomplex zu oxidieren; Reduzieren des oxidierten Rutheniumkomplexes durch das Reduktionsmittel, um so eine elektrolytische Lichtemission zu bewirken; Nachweisen der elektrolytisch emittierten Lichtstrahlen; und Erhalten der Menge an in der Probe vorhandenem Dioxin unter Verwendung einer Eichkurve.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die erste Elektrode eine Goldelektrode ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Reduktionsmittel aus Trimethylamin, Triethylamin, Tripropylamin, Tributylamin, Prolin und Oxalsäure ausgewählt ist.

7. Vorrichtung, verwendbar in einem Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Dioxinen, umfassend eine Messflüssigkeit, hergestellt durch Lösen eines Rutheniumkomplexes und Trimethylamin in einer phosphatgepufferten wässrigen Lösung; eine Goldelektrode, durch die eine elektrische Spannung an die Flüssig­ keit angelegt wird; einen auf der Goldelektrode immobilisierter Antikörper; einen Detektor für emittiertes Licht zum Bestimmen der Intensität der elektrolytisch emittierten Lichtstrahlen; und eine arithmetische Einheit zur quantitativen Be­ stimmung der Konzentration der in der Probe vorhandenen Dioxine, basierend auf der Intensität des durch den Detektor für emittiertes Licht nachgewiesenen emittierten Lichts.