DE10120834A1

DE10120834A1 - New pain relievers that are inhibitors of TRP channels

Info

Publication number: DE10120834A1
Application number: DE10120834A
Authority: DE
Inventors: Rainer Haberberger; Michaela Kress
Original assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 2001-04-27
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2002-11-07
Also published as: WO2002087608A1

Abstract

The invention relates to novel targets for pain relievers and a method for discovering novel pain relievers and the use thereof. The invention particularly relates to the use of inhibitors of channel proteins of the TRP-family, preferably the STRPC sub-family, for treating painful conditions, particularly inflammatory pain.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Targets für Schmerzmittel sowie Verfahren zum Auffinden von neuen Schmerzmitteln und deren Verwendung.The present invention relates to new targets for painkillers and methods for Finding new painkillers and their use.

Nozizeptoren sind feine unmyelinisierte oder dünn myelinisierte Nervenfasern mit freien Nervenendigungen, die in fast allen Geweben zu finden sind, und deren Aufgabe die De tektion von potentiell gewebeschädigenden, noxische Einflüssen aus der Umwelt oder dem Körperinneren ist. Noxische Reize (z. B. mechanische Abscherung oder Hitze) an den re zeptiven Feldern rufen Aktionspotentiale in Nozizeptoren hervor. Ebenso wirken viele Entzündungsmediatoren auf Nozizeptoren exzitatorisch (Kress & Reeh, 1996). Im entzün deten Gewebe reagieren Nozizeptoren häufig mit einer Zunahme der Empfindlichkeit für Hitzereize (Sensibilisierung), die charakterisiert ist durch eine gesteigerte Entladungsakti vität sowie durch eine Verschiebung der Reizschwelle in den nicht-noxischen Temperatur bereich (Kress & Reeh, 1996). Eine Schlüsselrolle bei der Nozizeptorsensibilisierung spielt die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration (Guenther et al. 1999; Kress & Guenther, 1999). Solche Veränderungen an nozizeptiven Neuronen werden durch endoge ne Entzündungsmediatoren wie Bradykinin oder Trypsin hervorgerufen, die an G-Protein gekoppelte Rezeptoren in der Nozizeptormembran binden (Koltzenburg et al. 1992). So wohl für Bradykinin als auch für Trypsin sind Anstiege der intrazellulären Kalziumkon zentration beschrieben worden, die durch die bisher bekannten Signalwege nicht erklärt werden können (Steinhoff et al. 2000; Jiang et al. 1998; Reiser & Hamprecht, 1985). Auch die funktionelle Grundlage für die exzitatorische Wirkung von Bradykinin ist bisher unbe kannt. Wegen der geringen Größe der nozizeptiven Nervenendigungen (< 1 µm) sind Un tersuchungen zur Aufklärung dieser Signalwege an den Nozizeptoren in vivo oder im iso lierten Gewebe in vitro nicht möglich. Als zelluläres Model des Nozizeptors werden daher Primärkulturen von dissoziierten Neuronen aus dem Spinalganglion verwendet, die moder nen zellphysiologischen Untersuchungsmethoden gut zugänglich sind und die in vielen Aspekten funktionell den Nozizeptoren in situ ähneln. Mit diesem Model ist es möglich, die Funktion von Membranrezeptoren und Jonenkanälen im Detail zu untersuchen, die für die Entstehung von Schmerzen wichtig sind. Ohne genauere Kenntnisse dieser Prozesse ist das gerichtete Auffinden von Wirkstoffen, die in diese Prozesse eingreifen und als Schmerzmittel verwendet werden könnten, nicht möglich. Nociceptors are fine unmyelinated or thin myelinated nerve fibers with free Nerve endings, which can be found in almost all tissues, and whose task the De detection of potentially tissue-damaging, noxious influences from the environment or the Is inside the body. Noxious stimuli (e.g. mechanical shear or heat) to the right zeptive fields evoke action potentials in nociceptors. Many work in the same way Inflammatory mediators on nociceptors excitatory (Kress & Reeh, 1996). I'm kindling neciceptors often react with an increase in sensitivity to tissue Heat stimuli (sensitization), which is characterized by an increased discharge action vity as well as by shifting the stimulus threshold to the non-noxious temperature area (Kress & Reeh, 1996). It plays a key role in nociceptor sensitization the increase in the intracellular calcium concentration (Guenther et al. 1999; Kress & Guenther, 1999). Such changes in nociceptive neurons are caused by endoge Inflammatory mediators such as bradykinin or trypsin are caused by G protein bind coupled receptors in the nociceptor membrane (Koltzenburg et al. 1992). so Both bradykinin and trypsin have increased intracellular calcium levels concentration has been described, which is not explained by the previously known signal paths (Steinhoff et al. 2000; Jiang et al. 1998; Reiser & Hamprecht, 1985). Also the functional basis for the excitatory effect of bradykinin has so far not been determined known. Because of the small size of the nociceptive nerve endings (<1 µm), Un Studies to elucidate these signaling pathways at the nociceptors in vivo or in iso tissue in vitro not possible. Therefore, as a cellular model of the nociceptor Primary cultures of dissociated neurons from the spinal ganglion are used, the moder Cell physiological examination methods are easily accessible and in many Aspects functionally similar to the nociceptors in situ. With this model it is possible to study in detail the function of membrane receptors and Jon channels, which are necessary for the emergence of pain is important. Without more precise knowledge of these processes the targeted detection of active substances that intervene in these processes and as Pain relievers could not be used.

In der Drosophilafliege sind Ionenanäle bekannt, die an der Entstehung des Sensorpotenti als (transientes Rezeptorpotential) in der Retina beteiligt sind, und die deshalb als TRP- Kanäle bezeichnet werden (Hofmann et al. 2000; Harteneck et al. 2000). In nicht erregbaren Zellen werden TRP-Kanäle durch ein unbekanntes Link bei Entleerung der intrzellulären Kalziumspeicher geöffnet, um die Speicher wieder zu füllen (zur Übersicht s. Harteneck et al. 2000). Außerdem führt die Aktivierung der Proteinkinase C durch Phor bolmyristatacetat oder Oleylacylglyerol zur Öffnung von einigen TRP-Kanälen (Hofmann et al. 1999). TRP-Kanäle können in Neuronen heteromerisieren und entwickeln dann neue Eigenschaften. Z. B. wird die Aktivierung dieses neuen Ionenkanals unabhängig von intra zellulären Kalziumspeicher (Strübing et al. 2001). Ein in der Retina nicht exprimierter Vertreter der TRP-Subfamilie OTRPC, der Vanilloidrezeptor VR-1, ist als multimodaler Kationenkanal bei der Transduktion von Hitzereizen und der Entstehung von protonenakti vierten Membranströmen für die Nozizeption von Bedeutung (Caterina et al. 1997; Tomi naga et al. 1998; WO 00/32766). In der WO 00/04929 ist die Verwendung von antisense- Oligonukleotiden oder Inhibitoren vorgeschlagen worden, um die Expression von TRP- Protein bzw. deren Funktionalität zu reduzieren und so bestimmte entzündliche Prozesse, insbesondere Asthma, günstig zu beeinflussen.Ion channels are known in the Drosophila fly, which contribute to the creation of the sensor potenti as (transient receptor potential) in the retina, and therefore as TRP- Channels are referred to (Hofmann et al. 2000; Harteneck et al. 2000). In not Excitable cells become TRP channels through an unknown link when the channel is emptied intracellular calcium stores opened to refill the stores (for an overview see Harteneck et al. 2000). In addition, the activation of protein kinase C by Phor bolmyristatacetat or Oleylacylglyerol to open some TRP channels (Hofmann et al. 1999). TRP channels can heteromerize in neurons and then develop new ones Characteristics. For example, the activation of this new ion channel is independent of intra cellular calcium storage (Strübing et al. 2001). One not expressed in the retina Representative of the TRP subfamily OTRPC, the vanilloid receptor VR-1, is multimodal Cation channel in the transduction of heat stimuli and the development of proton acti fourth membrane currents are important for nociception (Caterina et al. 1997; Tomi naga et al. 1998; WO 00/32766). WO 00/04929 describes the use of antisense Oligonucleotides or inhibitors have been proposed to express TRP- To reduce protein or its functionality and thus certain inflammatory processes, especially asthma.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass TRP-Kanäle das funktionelle Korrelat für die durch Entzündungsmediatoren hervorgerufenen Kalziumantworten in sensorischen Neuronen sind. Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis der funktionellen Bedeutung von TRP-Kanälen in der Entstehung von Schmerz, insbesondere Entzündungsschmerz und/oder -hyperalgesie. Die Aktivierung von TRP-Kanälen stellt ein "common link" dar, über das möglicherweise alle G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die den Phospholipase C/Proteinkinase C Signalweg aktivieren, einen Kalziumeinstrom in Nozizeptoren induzieren können. Derartige Kalziumanstiege führen zur Sensibilisierung von Nozizeptoren für Temperaturanstiege und damit zur Hitzehyperalgesie (Guenther et al. 1999, Kress & Guenther 1999). Diesen Signalweg können damit solche Entzündungsme diatoren nutzen, um eine Nozizeptorerregung oder -sensibilisierung hervorzurufen. Somit stellen TRP-Kanäle ein neues Target für potentiell analgetisch wirksame Substanzen dar. Solche Substanzen verhindern vor allem die Entstehung von Entzündungsschmerz und - hyperalgesie. Da auch im Randbezirk von Tumoren häufig Entzündungsmediatoren in hohen Konzentration gefunden werden, stellen sie ein neues therapeutisches Prinzip bei Konzentration gefunden werden, stellen sie ein neues therapeutisches Prinzip bei Tumor schmerzen und -hyperalgesie dar.Surprisingly, it has now been found that TRP channels are the functional correlate for the calcium responses caused by inflammation mediators in sensory Are neurons. The present invention is based on the surprising knowledge of functional importance of TRP channels in the development of pain, in particular Inflammatory pain and / or hyperalgesia. The activation of TRP channels stops "common link" that may have all of the G protein-coupled receptors that activate the phospholipase C / protein kinase C signaling pathway, a calcium influx in Can induce nociceptors. Such increases in calcium lead to sensitization of nociceptors for temperature increases and thus for heat hyperalgesia (Guenther et al. 1999, Kress & Guenther 1999). Such signaling pathways can thus be used to measure inflammation Use diators to induce nociceptor excitation or sensitization. Consequently TRP channels represent a new target for potentially analgesic substances. Such substances primarily prevent the development of inflammatory pain and hyperalgesia. Because inflammatory mediators are often found in the peripheral area of tumors high concentration, they provide a new therapeutic principle Concentration can be found, they represent a new therapeutic principle in tumor pain and hyperalgesia.

Die vorliegende Erfindung stellt somit eine neue Klasse von Schmerzmitteln bereit. Insbe sondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Inhibitoren für Ionenka näle der TRP-Familie zur Behandlung von Schmerzzuständen, insbesondere von Schmerzzuständen, die durch entzündliche Prozesse hervorgerufen werden. Insbesondere können solche Inhibitoren bei Schmerzzuständen angewendet werden, die durch Nozizep toren vermittelt werde. Der Schmerzzustand kann dabei durch einen noxischen Reiz oder einen Entzündungsmediator induziert werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfin dung ist die Verhinderung oder Verringerung des Entstehens der Hyperalgesie, insbeson dere der Hitzehyperalgesie, durch TRP-Inhibitoren.The present invention thus provides a new class of pain reliever. in particular In particular, the present invention relates to the use of inhibitors for Ionenka channels of the TRP family for the treatment of pain conditions, in particular of Painful conditions caused by inflammatory processes. In particular such inhibitors can be used for pain conditions caused by Nozizep are conveyed to gates. The state of pain can be caused by a noxious stimulus or an inflammatory mediator can be induced. Another aspect of the present invention is preventing or reducing the onset of hyperalgesia, in particular heat hyperalgesia, due to TRP inhibitors.

Bevorzugt inhibiert der Inhibitor die Aktivität von TRP-Kanalproteinen der Subfamilie STRPC ("Short" TRP, Einteilung siehe Harteneck et al., 2000). Insbesondere gehören zu dieser Familie die folgenden humanen Kanalproteine: TRP-1 (NCBI GenBank Accession No. NM 003304; Wes et al., 1995; Zhu et al., 1995; Zitt et al., 1996), TRP-1A (GenBank Accession No. Z 73903; Zitt et al., 1996); TRP-2, TRP-3 (GenBank Accession No. U 47050, Zhu et al., 1996); TRP-4 (GenBank Accession No. NM 016179; Zhu et al., 1996; Philipp et al., 2000; McCay et al., 2000), TRP-5 (GenBank Accession No. AF 054568; Sossey-Alaoui et al., 1999), TRP-6 (GenBank Accession No. NM 004621; D'Esposito et al., 1996), oder TRP-7 (WO 00/29571). Inhibitoren für diese Ionenkanäle hemmen den Kalziumeinstrom aus dem Extrazellulärraum in sensorische Neuronen, der durch verschie dene G-Protein-gekoppelte Rezeptorsysteme und auch durch direkte Aktivierung des Pro teinkinase C Signalwegs durch Phorbolmyristatacetat oder Oleylacylglycerol aktiviert wird. Besonders bevorzugt sind dabei TRP-1, TRP-3, TRP-4, und TRP-6.The inhibitor preferably inhibits the activity of TRP channel proteins of the subfamily STRPC ("Short" TRP, classification see Harteneck et al., 2000). In particular belong to this family the following human channel proteins: TRP-1 (NCBI GenBank Accession No. NM 003304; Wes et al., 1995; Zhu et al., 1995; Zitt et al., 1996), TRP-1A (GenBank Accession No. Z 73903; Zitt et al., 1996); TRP-2, TRP-3 (GenBank Accession No. U 47050, Zhu et al., 1996); TRP-4 (GenBank Accession No. NM 016179; Zhu et al., 1996; Philipp et al., 2000; McCay et al., 2000), TRP-5 (GenBank Accession No. AF 054568; Sossey-Alaoui et al., 1999), TRP-6 (GenBank Accession No. NM 004621; D'Esposito et al., 1996), or TRP-7 (WO 00/29571). Inhibitors for these ion channels inhibit the Calcium influx from the extracellular space into sensory neurons, which through various G protein-coupled receptor systems and also by direct activation of the Pro Tinkinase C signaling pathway activated by phorbol myristate acetate or Oleylacylglycerol becomes. TRP-1, TRP-3, TRP-4 and TRP-6 are particularly preferred.

Dem Fachmann ist bekannt, wie er solche Inhibitoren auffinden kann. Entsprechende Me thoden sind beispielsweise in der WO 98/08979 und der WO 00/04929 beschrieben. So können geeignete Wirtszellen, beispielsweise COS-Zellen, mit Expressionsvektoren trans fiziert werden, die für einen der genannten TRP-Kanäle kodieren, beispielsweise gleich zeitig mit einem Expressionsvektor, der für den muscarinen Rezeptor M5 kodiert. Die Funktion der Rezeptoren in den transfizierten Zellen kann dann über die Messung der in trazellulären Kalziumkonzentration nach der FURA2-Methode oder des Membranpotentials mit patch-clamp-Techniken in An- bzw. Abwesenheit von Testsubstanzen, die potenti elle Inhibitoren sein könnten, bestimmt werden. Dabei kann, wenn die Zelle einen musca rinen Rezeptor exprimiert, beispielsweise Muscarin als Stimulus für den Kalziumeinstrom in die Zelle benutzt werden. Solche Untersuchungen können im Hochdurchsatz- Musterungs-Format (High Throughput Screening, HTS) an großen Substanzbibliotheken ausgeführt werden.The person skilled in the art knows how to find such inhibitors. Corresponding me Methods are described for example in WO 98/08979 and WO 00/04929. So suitable host cells, for example COS cells, can be trans with expression vectors be coded, which code for one of the TRP channels mentioned, for example the same early with an expression vector that codes for the muscarinic receptor M5. The Function of the receptors in the transfected cells can then be measured by measuring in tracellular calcium concentration according to the FURA2 method or the membrane potential with patch-clamp techniques in the presence or absence of test substances, the potenti all inhibitors could be determined. If the cell has a musca pure receptor, for example muscarin as a stimulus for calcium influx be used in the cell. Such investigations can be carried out in high-throughput Pattern format (high throughput screening, HTS) in large substance libraries be carried out.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung deshalb ein Verfahren zum Auffinden eines Wirkstoffes gegen Schmerz, dadurch gekennzeichnet, dass
In a further aspect, the present invention therefore relates to a method for finding an active ingredient for pain, characterized in that

a) a cell or cell line is provided which is an ion channel protein of the TRP family expressed;
b) a test substance is brought into contact with the cell or cell line;
c) the stimulus-induced calcium influx into the cell or cell line in An the presence of the test substance is measured; and
d) the measured value is compared with a reference value without test substance and there by determining whether the substance is an inhibitor of the ion channel protein.

Vorzugsweise wird in einem solchen Verfahren der Kalziumeinstrom durch die zeitabhän gige Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration bestimmt.In such a process, the calcium influx is preferably dependent on the time current measurement of the intracellular calcium concentration determined.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Inhi bitors eines Ionenkanalproteins der TRP-Familie zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Schmerzzuständen, insbesondere Entzündungs schmerzen.In a further aspect, the present invention relates to the use of an Inhi bitors of an ion channel protein of the TRP family for the production of a pharmaceutical Composition for the treatment of pain conditions, in particular inflammation pain.

Formulierung, Dosierung und Anwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zu sammensetzung richten sich dabei nach der chemischen Natur des Inhibitors, der Art der Erkrankung sowie dem Zustand des Patienten.Formulation, dosage and use of the pharmaceutical additives according to the invention The composition depends on the chemical nature of the inhibitor, the type of Disease as well as the patient's condition.

Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, wie er erfindungsgemässe Wirkstoffe für be stimmte Anwendungsweisen formulieren kann (Gennaro, Alfonso R. Remington's Phar maceutical Sciences. Easton Mack 1990. XVI). Dem Fachmann sind ebenfalls Verfahren bekannt, wie er die optimale Dosierung eines Wirkstoffs für eine bestimmte Erkrankung bestimmen kann. Methods are known to the person skilled in the art as he uses active substances according to the invention for can formulate certain applications (Gennaro, Alfonso R. Remington's Phar pharmaceutical sciences. Easton Mack 1990. XVI). Methods are also known to the person skilled in the art Known how to find the optimal dosage of an active ingredient for a particular condition can determine.

Die Verbindungen können oral, parenteral oder topisch verabreicht werden. Die ge wünschte therapeutische Dosis ist von der Indikation und Darreichungsform abhängig und kann experimentell bestimmt werden. Geeignete Anwendungsformen sind beispielsweise Tabletten, Kapseln, Zäpfchen, Lösungen, Säfte, Emulsionen, Aerosole oder dispersible Pulver. Entsprechende Tabletten können beispielsweise durch Mischen des oder der Wirk stoffe mit bekannten Hilfsstoffen, beispielsweise inerten Verdünnungsmitteln, wie Kalzi umcarbonat, Kalziumphosphat oder Milchzucker, Sprengmitteln, wie Maisstärke oder Al ginsäure, Bindemitteln, wie Stärke oder Gelatine, Schmiermitteln, wie Magnesiumstearat oder Talk, und/oder Mitteln zur Erzielung des Depoteffektes, wie Carboxypolymethylen, Carboxymethylcellulose, Celluloseacetatphthalat, oder Polyvinylacetat erhalten werden. Die Tabletten können auch aus mehreren Schichten bestehen.The compounds can be administered orally, parenterally or topically. The ge The desired therapeutic dose depends on the indication and the dosage form can be determined experimentally. Suitable forms of use are, for example Tablets, capsules, suppositories, solutions, juices, emulsions, aerosols or dispersible Powder. Corresponding tablets can be made, for example, by mixing the agent or agents substances with known auxiliaries, for example inert diluents, such as Kalzi umcarbonate, calcium phosphate or milk sugar, disintegrants such as corn starch or Al Ginsäure, binders such as starch or gelatin, lubricants such as magnesium stearate or talc, and / or agents for achieving the depot effect, such as carboxypolymethylene, Carboxymethyl cellulose, cellulose acetate phthalate, or polyvinyl acetate can be obtained. The tablets can also consist of several layers.

Entsprechend können Dragees durch Überziehen von analog den Tabletten hergestellten Kernen mit üblicherweise in Drageehüllen verwendeten Mitteln, beispielsweise Kollidon oder Schellack, Gummi arabicum, Talk, Titandioxid oder Zucker, hergestellt werden. Zur Erzielung eines Depoteffektes oder zur Vermeidung von Inkompatibilitäten kann der Kern auch aus mehreren Schichten bestehen. Desgleichen kann auch die Drageehülle zur Erzie lung eines Depoteffektes aus mehreren Schichten bestehen, wobei die oben bei den Ta bletten erwähnten Hilfsstoffe verwendet werden können.Correspondingly, coated tablets can be produced by coating analogously to the tablets Cores with agents commonly used in coated tablets, for example Kollidon or shellac, gum arabic, talc, titanium dioxide or sugar. to The core can achieve a depot effect or to avoid incompatibilities also consist of several layers. Likewise, the coated tablet can also be used for education a depot effect consist of several layers, whereby the above in Ta Bletten mentioned excipients can be used.

Säfte der erfindungsgemässen Wirkstoffe bzw. Wirkstoffkombinationen können zusätzlich noch ein Süssungsmittel, wie Saccharin, Cyclamat, Glycerin oder Zucker sowie ein ge schmacksverbesserndes Mittel, z. B. Aromastoffe, wie Vanillin oder Orangenextrakt, ent halten. Sie können ausserdem Suspendierhilfsstoffe oder Dickungsmittel, wie Natriumcar boxymethylcellulose, Netzmittel, beispielweise Kondensationsprodukte von Fettalkoholen mit Ethylenoxid, oder Schutzstoffe, wie p-Hydroxybenzoate, enthalten.Juices of the active substances or combinations of active substances according to the invention can additionally another sweetener such as saccharin, cyclamate, glycerin or sugar and a ge taste-improving agent, e.g. B. flavors such as vanillin or orange extract ent hold. You can also use suspending aids or thickeners, such as sodium car boxymethyl cellulose, wetting agents, for example condensation products of fatty alcohols with ethylene oxide, or protective substances such as p-hydroxybenzoates.

Injektionslösungen werden in üblicher Weise, z. B. unter Zusatz von Konservierungsmit teln, wie p-Hydroxybenzoaten, oder Stabilisatoren, wie Alkalisalzen der Ethylendiaminte traessigsäure, hergestellt und in Injektionsflaschen oder Ampullen abgefüllt. Injection solutions are made in the usual way, e.g. B. with the addition of preservation agents, such as p-hydroxybenzoates, or stabilizers, such as alkali metal salts of ethylenediamines traacetic acid, produced and filled into injection bottles or ampoules.

Die eine oder mehrere Wirkstoffe bzw. Wirkstoffkombinationen enthaltenden Kapseln können beispielsweise hergestellt werden, indem man die Wirkstoffe mit inerten Trägern, wie Milchzucker oder Sorbit, mischt und in Gelatinekapseln einkapselt.The capsules containing one or more active ingredients or combinations of active ingredients can be produced, for example, by mixing the active ingredients with inert carriers, like milk sugar or sorbitol, mixes and encapsulates in gelatin capsules.

Geeignete Zäpfchen lassen sich beispielsweise durch Vermischen mit dafür vorgesehenen Trägermitteln, wie Neutralfetten oder Polyethylenglykol bzw. dessen Derivaten herstellen.Suitable suppositories can be mixed, for example, with those provided for them Manufacture carriers such as neutral fats or polyethylene glycol or its derivatives.

Die Verbindungen können sowohl enteral als auch parenteral verabreicht werden. Als Do sis für die orale Anwendung werden 0,1 bis 500 mg Wirkstoff pro Dosis, für die i. v.- Anwendung von 0,05 bis 150 mg pro Dosis vorgeschlagen. Der gewünschte therapeutische Dosis ist von der Indikation und Darreichungsform abhängig und kann experimentell be stimmt werden.The compounds can be administered both enterally and parenterally. As a Thursday for oral use, 0.1 to 500 mg of active ingredient per dose, for i. v.- Application of 0.05 to 150 mg per dose is suggested. The desired therapeutic Dose depends on the indication and dosage form and can be determined experimentally be true.

Die Arzneimittel sind für orale oder parenterale, gegebenenfalls auch topische Verabrei chung geeignet. Als Arzneimittelformen dien en vorwiegend Tabletten, Dragees, Ampullen und Saftzubereitungen. Die Einzeldosis zu diesen Arzneimittelformen beträgt zwischen 1,0 und 200 mg, vorzugsweise 20 und 50 mg pro 75 kg Körpergewicht. Je nach der Schwere des Falles sind täglich im allgemeinen 1 bis 3 Einzeldosen zu verabreichen.The medicinal products are for oral or parenteral, possibly also topical, administration suitable. Mainly tablets, dragees, ampoules serve as pharmaceutical forms and juice preparations. The single dose for these drug forms is between 1.0 and 200 mg, preferably 20 and 50 mg per 75 kg body weight. Depending on the severity of the case, 1 to 3 single doses should generally be administered daily.

Ein erfindungsgemäßer TRP-Inhibitor ist beispielsweise die Substanz (R,S)-(3,4-dihydro- 6,7-dimethoxyisochinolin-1-yl)-2-cyclohexyl-N-(3,3-diphenylpropyl)-acetamid- hydroch loride (BIIA 388 CL; Krishtal et al., 2001), die gemäß EP 0 957 092 hergestellt und for muliert werden kann. Diese Substanz wurde ursprünglich als Blocker bestimmter soge nannter "store operated" Kationenkanäle in bestimmten elektrisch nicht erregbaren Zellen (RBL-Zellen) beschrieben, die nicht im Zentralnervensystem vorkommen.A TRP inhibitor according to the invention is, for example, the substance (R, S) - (3,4-dihydro- 6,7-dimethoxyisoquinolin-1-yl) -2-cyclohexyl-N- (3,3-diphenylpropyl) acetamide hydroch loride (BIIA 388 CL; Krishtal et al., 2001), which are produced according to EP 0 957 092 and for can be mulated. This substance was originally used as a blocker of certain so-called called "store operated" cation channels in certain electrically non-excitable cells (RBL cells) that do not occur in the central nervous system.

Von der Entwicklung eines solchen Präparats würden alle Patienten profitieren, deren Er krankung zur plastischen Veränderung von Nozizeptoren im peripheren Nervensystem führt und erst sekundär Lernprozesse des ZNS anschaltet, die die Chronifizerung der Schmerzen weiterführen. Vor allem bei Rheumatischen Erkrankungen, z. B. Chronischer Rheumatoider Polyarthritis, bedeutet die Entwicklung von potenten peripher wirksamen Analgetika einen großen Fortschritt. Aber auch Schmerzen als Folge anderer Erkrankun gen mit entzündlicher Beteiligung können dadurch wesentlich gebessert werden, z. B. Mi gräne, entzündliche Arthritiden und Tumorschmerzen. All patients whose Er disease for plastic change of nociceptors in the peripheral nervous system leads and only switches on secondary learning processes of the CNS, which chronicle the Continue pain. Especially with rheumatic diseases, e.g. B. Chronic Rheumatoid polyarthritis means the development of potent peripherally effective Analgesics made great progress. But also pain as a result of other diseases genes with inflammatory involvement can be significantly improved. B. Wed. green, inflammatory arthritis and tumor pain.

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Examples methods Neurons primary culture

Die lumbalen Spinalganglien der Ratte wurden nach Entfernung der lumbalen Wirbelsäule und sagittaler Eröffnung des Wirbelkanals entfernt, gereinigt und mit Collagenase (0.28 U/ml in D-MEM, 75 min, Boehringer Mannheim) und Trypsin behandelt (25.000 U/ml in Phosphatpuffer, 12 min, Sigma, Diesenhofen). Nach dem Waschen der Ganglien in Dulbec co's modified eagle medium (D-MEM, Gibco, Karlsruhe) erfolgte die mechanische Triturie rung mittels einer partiell zugeschmolzenen Pasteurpipette. Die vereinzelten Spinalgangli enneurone wurden mit Kulturmedium (s. u.) gewaschen, zentrifugiert und auf sterile Kul turschälchen mit Glasboden und Poly-L-lysin-Beschichtung ausplattiert. Dem syntheti schen Kulturmedium TNB 100 (mit Supplement, Biochrom, Berlin) wurden 100 ng/ml Nervenwachstumsfaktor (NGF 7S, Alomone, Israel), Penicillin/Streptomycin (je 20.000 I.U./100 ml) und 2 mM L-Glutamin (beides von Gibco Life Technologies) zugesetzt. Die gewonnenen Primärkulturen waren nach 2 Stunden adhärent und wurden für maximal 36 Stunden unter sterilen Bedingungen bei 37°C und wasserdampfgesättigter, 5%-iger CO₂- Atmosphäre inkubiert.The lumbar spinal ganglia of the rat were removed after removal of the lumbar spine and sagittal opening of the spinal canal, cleaned and treated with collagenase (0.28 U / ml in D-MEM, 75 min, Boehringer Mannheim) and trypsin (25,000 U / ml in phosphate buffer, 12 min, Sigma, Denhofen). After washing the ganglia in Dulbec co's modified eagle medium (D-MEM, Gibco, Karlsruhe), the mechanical trituration was carried out using a partially melted Pasteur pipette. The isolated spinal gangli neurons were washed with culture medium (see below), centrifuged and plated on sterile culture dishes with a glass bottom and poly-L-lysine coating. The synthetic culture medium TNB 100 (with supplement, biochrom, Berlin) was given 100 ng / ml nerve growth factor (NGF 7S, Alomone, Israel), penicillin / streptomycin (20,000 IU / 100 ml each) and 2 mM L-glutamine (both from Gibco Life Technologies) added. The primary cultures obtained were adherent after 2 hours and were incubated for a maximum of 36 hours under sterile conditions at 37 ° C. and water vapor-saturated, 5% CO ₂ atmosphere.

Kalziummikrofluorimetrie

Zur funktionellen Untersuchung wurden die Neurone nicht-disruptiv mit dem membran gängigen Kalziumindikatorfarbstoff FURA-2/AM (3 µM, Molecular Probes, Leiden, Nie derlande) beladen, und der Farbstoff für 30 min mit externer Lösung (ECS) ausgewaschen. Die ECS bestand aus (in mM) 145 NaCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES und 10 Glucose, pH 7,4 mit NaOH eingestellt. Die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration erfolgte ratiometrisch. Dazu wurden Hintergrund-korrigierte Fluoreszenzbilder mittels eines Slow Scan CCD-Kamera-Systems mit einem - in ein Axiovert Mikroskop mit 40-fach Fluotar- Ölimmersions-Objektiv (Zeiss, Jena, Germany) eingekoppelten - schnellen Monochroma tor (PTI, New Jersey) wurde aufgenommen. Die Fluoreszenz wurde bei λ < 420 nm mit einer Frequenz von 1 Hz bei gleicher Anregungsdauer je Wellenlänge (340 und 380 nm je 200 ms) aufgenommen. Die intrazelluläre Kalziumkonzentration [Ca²⁺]_i wurde berechnet (Grynkie wicz et al. 1985) und als Kalibrationskonstanten in vitro wurden bestimmt: R_min = 0.44, R_max = 8.0 und K_eff = 1.2 µM.For the functional examination, the neurons were loaded non-disruptively with the membrane-common calcium indicator dye FURA-2 / AM (3 µM, Molecular Probes, Leiden, Netherland), and the dye was washed out with external solution (ECS) for 30 min. The ECS consisted of (in mM) 145 NaCl, 2 CaCl ₂ , 1 MgCl ₂ , 10 HEPES and 10 glucose, pH 7.4 adjusted with NaOH. The intracellular calcium concentration was measured ratiometrically. For this purpose, background-corrected fluorescence images were taken using a slow scan CCD camera system with a fast monochromator (PTI, New Jersey), which was coupled into an Axiovert microscope with a 40x Fluotar oil immersion objective (Zeiss, Jena, Germany) added. The fluorescence was recorded at λ <420 nm with a frequency of 1 Hz with the same excitation duration per wavelength (340 and 380 nm per 200 ms). The intracellular calcium concentration [Ca ²⁺ ] _i was calculated (Grynkie wicz et al. 1985) and the following were determined as calibration constants in vitro: R _min = 0.44, R _max = 8.0 and K _eff = 1.2 µM.

Zur Stimulation der Neurone wurde ein 7-Kanal-Applikationssystem mit Magnetventilen verwendet, das einen schnellen Lösungswechsel an der Zelle (τ = 100 ms) erlaubte (Dittert et al. 1998). Alle Substanzen zur Stimulation der Neurone wurden in ECS gelöst und mit tels Schwerkraft appliziert. Zur Stimulation wurden benutzt: 10 µM Bradykinin, 1 µM Muscarin, 1 µM Phorbol-Myristat-Acetat, bzw. 1 µM Trypsin. Eine Reihe von Ableitun gen wurden in Kalzium-freier ECS durchgeführt, in der CaCl₂ durch 10 mM EGTA ersetzt wurde. Alle Salze und Chemikalien außer den gesondert genannten wurden von Sigma, Deisenhofen bezogen. Die Substanzen BIIA388CL und BIIA908MS wurden uns von der Firma Boehringer Ingelheim überlassen.A 7-channel application system with magnetic valves was used to stimulate the neurons, which allowed a quick change of solution on the cell (τ = 100 ms) (Dittert et al. 1998). All substances for stimulating the neurons were dissolved in ECS and applied by means of gravity. The following were used for stimulation: 10 μM bradykinin, 1 μM muscarin, 1 μM phorbol myristate acetate, or 1 μM trypsin. A number of derivations were carried out in calcium-free ECS, in which CaCl _{2 was} replaced by 10 mM EGTA. All salts and chemicals apart from those mentioned separately were obtained from Sigma, Deisenhofen. The substances BIIA388CL and BIIA908MS were provided to us by Boehringer Ingelheim.

Fixation methods and immunocytochemistry

Der immunhistochemische Nachweis der Kanalproteine erfolgte durch indirekte Immunhi stochemie an Kryostatschnitten oder kultivierten Neuronen mittels Fluoreszenzmarkierung. Zur Gewinnung von Ganglienschnitten wurden fünf junge erwachsene Wistar Ratten durch eine Überdosis Chloroform getötet und die Ganglien entnommen. Anschließend wurde die Ganglien in flüssigem Stickstoff schockgefroren und an einem Kryostaten (Jung Frigocut 1900 E, Leica, Bensheim) Schnitte einer Dicke von 10 µm angefertigt. Die Schnitte und die auf Glasobjektträgern kultivierten Neurone wurden je nach verwendetem Material ent weder 15 min mit Zambonifixativ (Stefanini et al. 1967) oder 10 min mit Aceton (-20°C) fixiert.The immunohistochemical detection of the channel proteins was carried out by indirect immunhi stochemistry on cryostat sections or cultured neurons using fluorescent labeling. Five young adult Wistar rats were used to obtain ganglia slices an overdose of chloroform was killed and the ganglia removed. Then the Ganglions in liquid nitrogen snap-frozen and on a cryostat (Jung Frigocut 1900 E, Leica, Bensheim) Cuts with a thickness of 10 µm were made. The cuts and the neurons cultivated on glass slides were removed depending on the material used neither 15 min with zamboni fixative (Stefanini et al. 1967) or 10 min with acetone (-20 ° C) fixed.

Nach dem Auswaschen des Fixativs mit 0.1 M Phosphatpuffer folgte die Blockung unspe zifischer Bindungsstellen (PBS-Puffer, 10% normales Schweineserum, 0.1% bovines Serumalbumin und 0.5% Tween 20). Die Schnitte/Zellen wurden über Nacht bei Raum temperatur mit Antiseren gegen TRP-Kanäle (TRP-1, TRP-3, TRP-6, Alomone Lab., Tel A viv, Israel; TRP-4 Prof. Flockerzi, Universität des Saarlandes) und biotinyliertem Isolectin B4 (IB4, Sigma) bzw. Antiseren gegen den Vanilloirezeptor 1 (VR1, Neuromics) inkubiert (TRP/IB4, TRP/VR1). Nach Waschen in PBS erfolgte die Inkubation mit den sekundären Reagentien. Die TRP-Antiseren wurden mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugiertem anti-Kaninchen IgG aus der Ziege, das biotinylierte Isolectin B4 mit Cy-3 konjugiertem Streptavidin, und das VR1-Antiserum mit Cy-3 konjugiertem anti-Meerschweinchen IgG inkubiert. Nach weiterem Waschen in PBS erfolgte die Einbettung von Schnitten und Zel len in gepuffertem Glycerol pH 8,6. Die indirekte Immunfluoreszenz wurde an einem Epi fluoreszenzmikroskop (Olympus BX 60F, Hamburg) unter Verwendung geeigneter Filter (Cy3, Anregungsfilter 525-560 nm, Sperrfilter 570-650 nm und FITC Anregungsfilter 460- 490 nm, Sperrfilter 515-550 nm) ausgewertet. Vier Schnitte pro Tier mit einem Mindestab stand von 50 µm bzw. 3 Glasträger mit Zellkulturen wurden für jeden TRP-Kanal von zwei unabhängigen Untersuchern beurteilt.After washing out the fixative with 0.1 M phosphate buffer, the blocking followed specific binding sites (PBS buffer, 10% normal pig serum, 0.1% bovine Serum albumin and 0.5% Tween 20). The sections / cells were left overnight at room temperature with antisera against TRP channels (TRP-1, TRP-3, TRP-6, Alomone Lab., Tel A viv, Israel; TRP-4 Prof. Flockerzi, Saarland University) and biotinylated isolectin B4 (IB4, Sigma) or antisera against vanilloireceptor 1 (VR1, Neuromics) incubated (TRP / IB4, TRP / VR1). After washing in PBS, the secondary incubation was carried out Reagents. The TRP antisera were conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC) goat anti-rabbit IgG, the biotinylated isolectin B4 conjugated with Cy-3 Streptavidin, and the VR1 antiserum with Cy-3 conjugated anti-guinea pig IgG incubated. After further washing in PBS, sections and cells were embedded len in buffered glycerol pH 8.6. Indirect immunofluorescence was measured on an Epi fluorescence microscope (Olympus BX 60F, Hamburg) using suitable filters (Cy3, excitation filter 525-560 nm, blocking filter 570-650 nm and FITC excitation filter 460- 490 nm, blocking filter 515-550 nm) were evaluated. Four cuts per animal with a minimum of of 50 µm or 3 glass slides with cell cultures were used for each TRP channel by two judged by independent investigators.

Kontrollschnitte, die mit einem präabsorbierten Antiserum (20-100 µg Antigen/ml ver dünntes Antiserum) inkubiert wurden zeigten keine Immunreaktion. Zur computergestütz ten Bildanalyse wurden für jeden TRP-Subtyp mindestens zwei Schnitte aus einem Gan glion (Mindestabstand 50 µm) verwendet (ScionImage, Scion, Las Vegas, NV). Es wurden nur Zellen mit deutlich sichtbarem Zellkern aufgenommen und zur Messung verwendet.Control sections with a pre-absorbed antiserum (20-100 µg antigen / ml ver thin antiserum) showed no immune response. For computerized For each TRP subtype, at least two sections were cut from one gan glion (minimum distance 50 µm) is used (ScionImage, Scion, Las Vegas, NV). There were only cells with a clearly visible nucleus recorded and used for measurement.

Detection of mRNA expression with RT-PCR

Der Nachweis von TRPs auf mRNA-Ebene erfolgte mittels der RT-PCR. Dafür wurden die lumbalen Spinalganglien und das Gehirn (Positivkontrolle) aus 5 Ratten isoliert, in RNa zol (WAK-Chemie, Bad-Homburg, Germany) schnellgefroren und mit dem Ultraturrax homogenisiert. Die Gesamt-RNA wurde mit der RNazol-Reagenz Technik nach dem Pro tokoll des Herstellers präpariert.TRPs were detected at the mRNA level using RT-PCR. That’s why lumbar spinal ganglia and the brain (positive control) isolated from 5 rats, in RNa zol (WAK-Chemie, Bad-Homburg, Germany) quickly frozen and with the Ultraturrax homogenized. The total RNA was determined using the RNazole reagent technique according to the Pro prepared tokoll of the manufacturer.

Mögliche Kontamination durch DNA wurde mit DNase (1 U/µg total RNA, Gibco-BRL, Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Germany) in 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 2 mM MgCl₂, 50 mM KCl für 15 min at 25°C entfernt. Gleiche Mengen von RNA wurden revers transkribiert. Ansatz: 3 mM MgCl₂, 75 mM KCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 10 mM Dithiothreitol, 0.5 mM dNTPs (Gibco-BRL) und 25 µg oligo(dT) (MWG Biotech, Ebers berg, Germany) mit 200 U Superscript RNase H^- Reverse-Transcriptase (Gibco-BRL) für 50 min bei 42°C. Für die PCR Reaktion wurden 4 µl Puffer II, 4 µl MgCl₂, 1 µl dNTP (je 10 mM), 0.4 µl (2 U) AmpliTaq Gold Polymerase (alle von Perkin Elmer) und 1 µl von jedem Primer (20 µM) gemischt.Possible contamination by DNA was with DNase (1 U / µg total RNA, Gibco-BRL, Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Germany) in 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 2 mM MgCl ₂ , 50 mM KCl for 15 min at 25 ° C away. Equal amounts of RNA were reverse transcribed. Batch: 3 mM MgCl ₂ , 75 mM KCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 10 mM dithiothreitol, 0.5 mM dNTPs (Gibco-BRL) and 25 µg oligo (dT) (MWG Biotech, Ebers berg, Germany) with 200 U Superscript RNase H ^- reverse transcriptase (Gibco-BRL) for 50 min at 42 ° C. For the PCR reaction, 4 µl buffer II, 4 µl MgCl ₂ , 1 µl dNTP (10 mM each), 0.4 µl (2 U) AmpliTaq Gold Polymerase (all from Perkin Elmer) and 1 µl of each primer (20 µM) were mixed ,

Tabelle 1 Table 1

Verwendete Primer Primers used

Für die PCR wurde 10 min bei 95°C, 30 Zyklen von 45 s bei 94°C, 60 s bei 58°C und 45 s bei 73°C und im Anschluß für 7 min bei 73°C inkubiert. Als Kontrollen wurden Ansät ze ohne vorausgehende RT-Reaktion verwendet und das jeweilige Template durch Wasser ersetzt. Unter diesen Bedingungen wurde keine Amplifizierung nachgewiesen.For the PCR, 10 min at 95 ° C, 30 cycles of 45 s at 94 ° C, 60 s at 58 ° C and 45 s incubated at 73 ° C and then for 7 min at 73 ° C. Seeds were used as controls ze used without previous RT reaction and the respective template by water replaced. No amplification was detected under these conditions.

Results

Die Stimulation mit Bradykinin, Prostaglandin E₂, Muscarin oder Trypsin verursachten in kultivierten DRG-Neuronen einen Kalziumanstieg von etwa 100 bis 300 nM. Die 4 Sub stanzen zeigten eine unterschiedliche Tachyphylaxie: der durch Bradykinin verursachte Kalziumanstieg zeigte in Kontrolllösungen eine deutliche Tachyphylaxie, während die Neurone auf wiederholte Gabe alle anderen Mediatoren mit etwa gleich großen Kalzium anstiegen antworteten. Als Ursache der Tachyphylaxie wird eine Inaktivierung durch In ternalisierung von Bradykininrezeptoren vermutet. Da für jede der Substanzen Membranrezeptoren bekannt sind, die durch Aktivierung von Phospholipase C (PLC) und die Ent stehung von Inositoltriphosphat (IP₃) und Diacylglycerol (DAG) Kalzium aus intrazellulä ren Speichern freisetzen, wurde in einigen Experimenten kalziumfreie ECS verwendet. Unter diesen Bedingungen rief keine der Substanzen einen signifikanten Kalziumanstieg hervor, die Anstiege scheinen daher durch einen Kalziumeinstrom von außen in die Zelle verursacht zu werden. Der Kalziumeinstrom kann einerseits durch die Aktivierung span nungsabhängiger Kalziumkanäle, andererseits durch Liganden-gesteuerte Kationenkanäle erfolgen. Daher wurden in einigen Muskarin-Experimenten die spannungsabhängigen Kal ziumkanäle durch Zugabe von 200 µM Cd²⁺/Co²⁺ blockiert. Unter dieser Bedingung waren die durch Muskarin verursachten Antworten nur wenig vermindert, was auf eine Aktivie rung von Liganden-gesteuerten Kationenkanälen schliessen lässt.Stimulation with bradykinin, prostaglandin E ₂ , muscarin or trypsin caused a calcium increase of approximately 100 to 300 nM in cultured DRG neurons. The 4 substances showed a different tachyphylaxis: the calcium increase caused by bradykinin showed a clear tachyphylaxis in control solutions, while the neurons responded to repeated administration of all other mediators with approximately equal calcium increases. Inactivation by internalization of bradykinin receptors is suspected to be the cause of tachyphylaxis. Since membrane receptors are known for each of the substances, which release calcium from intracellular stores by activating phospholipase C (PLC) and the formation of inositol triphosphate (IP ₃ ) and diacylglycerol (DAG), calcium-free ECS was used in some experiments. Under these conditions, none of the substances caused a significant increase in calcium, so the increases appear to be caused by an influx of calcium into the cell from outside. The calcium influx can take place on the one hand by activating voltage-dependent calcium channels, and on the other hand by ligand-controlled cation channels. Therefore, in some muscarinic experiments, the voltage-dependent calcium channels were blocked by adding 200 µM Cd ²⁺ / Co ²⁺ . Under this condition, the responses caused by muscarin were only slightly diminished, suggesting that ligand-gated cation channels were activated.

Da für IP₃ außer der Kalzium-Freisetzung aus intrazellulären Speichern keine weitere Wir kung bekannt ist, haben wir den zweiten Second messenger in diesem System genauer un tersucht. DAG aktiviert das Enzym Proteinkinase C (PKC) und scheint direkt Kationenka näle zu öffnen (Hofmann et al. 1999). Deshalb wurden die Zellen durch extrazelluläre Zu gabe von Phorbol-Myristat-Acetat (PMA), einem membrangängigen Aktivators der PKC, stimuliert. PMA sowie Oleyl-Acylglycerol (OAG), ein membrangängiges DAG-Analogon riefen einen Kalziumeinstrom an DRG-Neuronen hervor, der in Kalziumfreier ECS aus blieb. Dies läßt auf die Aktivierung eines - durch DAG und/oder PKC aktivierten - Katio nenkanals schließen.Since no other effect is known for IP ₃ apart from calcium release from intracellular stores, we examined the second second messenger in this system in more detail. DAG activates the enzyme protein kinase C (PKC) and appears to open cation channels directly (Hofmann et al. 1999). The cells were therefore stimulated by extracellular addition of phorbol myristate acetate (PMA), a membrane-activator of PKC. PMA and oleyl acylglycerol (OAG), a membrane-compatible DAG analogue, caused a calcium influx into DRG neurons, which did not occur in calcium-free ECS. This suggests the activation of a cation channel - activated by DAG and / or PKC.

Die Entleerung der intrazellulären Kalziumspeicher durch Vorbehandlung mit Thapsigar gin (1 µM) beeinflusste die durch PMA hervorgerufene Antwort nicht. Demnach ist die Aktivierung des durch PMA aktivierten Kalziumeinstroms nicht von der Entleerung intra zellulärer Speicher abhängig. Der am Kalziumeinstrom beteiligte Kationenkanal wird möglicherweise direkt über die PKC abhängige Phosphorylierung eines Kanalproteins ak tiviert. Von Schultz und Mitarbeitern wurde ein solcher Aktivierungsmechanismus für ei nige Mitglieder der TRP-Kanalfamilie beschrieben (Hofmann et al. 1999). Für die meisten der bekannten TRP-Kanäle sind die molekularen Aktivierungsmechanismen bisher nicht aufgeklärt. Auch OAG/DAG können die PKC aktivieren, so daß die Phosphorylierung des Kanalproteins durch das Enzym als Aktivierungsmechanismus nicht ausgeschlossen ist. Deshalb wurden einige Neurone mit PMA in Anwesenheit des PKC-Inhibitors Staurosporin (0.25 µM) stimuliert. Unter diesen Bedingungen blieb die Antwort auf PMA- Stimulation aus. Dies läßt auf die Beteiligung der PKC an der Kanalaktivierung schließen.The emptying of the intracellular calcium stores by pretreatment with Thapsigar gin (1 µM) did not affect the response caused by PMA. So it is Activation of the calcium influx activated by PMA not from the intra-emptying cellular memory dependent. The cation channel involved in the calcium inflow becomes possibly directly via the PKC-dependent phosphorylation of a channel protein ak tivated. Such an activation mechanism for ei few members of the TRP channel family are described (Hofmann et al. 1999). For the most of the known TRP channels are not yet the molecular activation mechanisms elucidated. OAG / DAG can also activate the PKC so that the phosphorylation of the Channel protein is not excluded by the enzyme as an activation mechanism. Therefore, some neurons with PMA were staurosporine in the presence of the PKC inhibitor (0.25 µM) stimulated. Under these conditions, the answer to PMA- Stimulation off. This suggests PKC's involvement in channel activation.

Im Gegensatz zu diesen Befunden war die Antwort auf Muskarin nach Vorbehandlung mit Thapsigargin deutlich reduziert. Möglicherweise ist dieser Unterschied auf die Expression und differentielle Aktivierung mehrerer TRP-Kanal-Subtypen in sensorischen Neuronen zurückzuführen.Contrary to these findings, the answer to Muskarin after pretreatment was with Thapsigargin significantly reduced. This difference may be due to expression and differential activation of multiple TRP channel subtypes in sensory neurons due.

Um die Beteiligung von TRP-Kanälen an dem o. g. Kalziumeinstrom weiter untersuchen zu können, wurde die Substanz BIIA388CL verwendet, die als Inhibitor von TRP-Kanälen wirkt. BIIA388CL (1 µM) verursachte in einigen Fällen bei der ersten Applikation selbst einen Kalziumanstieg. Gleichzeitig verhinderte die Substanz aber die PMA- bzw. die OAG-Antwort vollständig. Ebenso wirksam war der kommerziell erhältliche TRP- Inhibitor SKF 96365 (1-(beta-[3-(4-Methoxyphenyl)propoxy]-4-methoxyphenethyl)-1H- imidazol-Hydrochlorid, CAS 130495-35-1, Merritt, J. E., et al., Biochem. J., 271, 515 (1990); 1 µM, Sigma, Deisenhofen). Auch die Antworten auf Trypsin wurden durch SKF 96365 oder durch BIIA388CL inhibiert.In order for the participation of TRP channels in the above-mentioned Calcium influx further investigate , the substance BIIA388CL was used as an inhibitor of TRP channels acts. BIIA388CL (1 µM) in some cases caused the first application itself a calcium surge. At the same time, the substance prevented the PMA or the OAG response complete. The commercially available TRP- Inhibitor SKF 96365 (1- (beta- [3- (4-methoxyphenyl) propoxy] -4-methoxyphenethyl) -1H- imidazole hydrochloride, CAS 130495-35-1, Merritt, J.E., et al., Biochem. J., 271, 515 (1990); 1 µM, Sigma, Deisenhofen). The answers to trypsin were also provided by SKF 96365 or inhibited by BIIA388CL.

Diese Befunde, die bereits stark für eine Beteiligung von TRP-Kanälen and der exzitatori schen und sensibilisierenden Wirkung einiger schmerzrelevanter Mediatoren sprechen, wurden auf mRNA-Ebene weiter erhärtet. Nach Isolierung und Amplifizierung der mRNA/cDNA aus Spinalganglien, wurde die Identität mehrerer TRP-Kanäle durch Se quenzierung der amplifizierten Produkte bestätigt. In Spinalganglien (DRG) wurde mRNA für TRP-1 (7/7 DRGs), TRP-3 (7/7 DRGs), TRP-4 (7/7 DRGs) und TRP-6 (6/7 DRGs) nachgewiesen. mRNA für TRP-2, TRP-5 und TRP-7 wurden nur in Einzelfällen gefunden (s. Tabelle 2). These findings are already strong for participation of TRP channels in the excitatori speak and sensitizing effects of some pain-relevant mediators, were further hardened at the mRNA level. After isolation and amplification of the mRNA / cDNA from spinal ganglia, the identity of several TRP channels was determined by Se confirmation of the amplified products confirmed. In spinal ganglia (DRG), mRNA for TRP-1 (7/7 DRGs), TRP-3 (7/7 DRGs), TRP-4 (7/7 DRGs) and TRP-6 (6/7 DRGs) demonstrated. mRNA for TRP-2, TRP-5 and TRP-7 were only found in isolated cases (see Table 2).

Tabelle 2 Table 2

Auf Proteinebene wurden diese Ergebnisse weiter untermauert. Mittels Immunhistochemie konnte TRP-1-Immunreaktivität (IR) in den Perikaryen großer Neuronen (Aß- Faserneurone), TRP-3-IR in VR1- und IB₄-positiven (C, Ad-Faser-)Neuronen sowohl in vitro unter Kulturbedingungen als auch in situ in Schnitten von Spinalganglien nachgewie sen werden. Die Lokalisation des TRP-4 und TRP-6 Kanalproteins in Spinalganglien ist Gegenstand derzeitiger Untersuchungen.These results were further supported at the protein level. By means of immunohistochemistry, TRP-1 immunoreactivity (IR) in the perikaryas of large neurons (Aß fiber neurons), TRP-3-IR in VR1 and IB ₄ positive (C, Ad fiber) neurons both in vitro under culture conditions and can also be detected in situ in sections of spinal ganglia. The localization of the TRP-4 and TRP-6 channel protein in spinal ganglia is the subject of current investigations.

Pharmaceutical application examples a) Dragees

1 Drageekern enthält:
Wirkstoff gemäß Erfindung 30,0 mg
Milchzucker 100,0 mg
Maisstärke 75,0 mg
Gelatine 3,0 mg
Magnesiumstearat 2,0 mg
210,0 mg1 coated tablet contains:
Active ingredient according to the invention 30.0 mg
Milk sugar 100.0 mg
Corn starch 75.0 mg
Gelatin 3.0 mg
Magnesium stearate 2.0 mg
210.0 mg

manufacturing

Die Mischung der Wirksubstanz mit Milchzucker und Maisstärke wird mit einer 10%-igen wässerigen Gelatinelösung durch ein Sieb mit 1 mm Maschenweite granuliert, bei 40 DEG C getrocknet und nochmals durch ein Sieb gerieben. Das so erhaltene Granulat wird mit Magnesiumstearat gemischt und verpresst. Die so erhaltenen Kerne werden in üblicher Weise mit einer Hülle überzogen, die mit Hilfe einer wässerigen Suspension von Zucker, Titandioxyd, Talkum und Gummi arabicum aufgebracht wird. Die fertigen Dragees werden mit Bienenwachs poliert.The mixture of the active substance with milk sugar and corn starch is made with a 10% aqueous gelatin solution granulated through a sieve with a mesh size of 1 mm, at 40 ° C dried and rubbed through a sieve again. The granules obtained in this way are mixed with Magnesium stearate mixed and pressed. The cores obtained in this way become more common Way covered with an envelope using an aqueous suspension of sugar, Titanium dioxide, talc and gum arabic is applied. The finished coated tablets will be polished with beeswax.

b) tablets

Wirkstoff gemäß Erfindung 30,0 mg
Milchzucker 100,0 mg
Maisstärke 70,0 mg
lösliche Stärke 7,0 mg
Magnesiumstearat 3,0 mg
210,0 mgActive ingredient according to the invention 30.0 mg
Milk sugar 100.0 mg
Corn starch 70.0 mg
soluble starch 7.0 mg
Magnesium stearate 3.0 mg
210.0 mg

manufacturing

Wirkstoff und Magnesiumstearat werden mit einer wässerigen Lösung der löslichen Stärke granuliert, das Granulat getrocknet und innig mit Milchzucker und Maisstärke vermischt. Das Gemisch wird sodann zu Tabletten von 210 mg Gewicht verpresst.Active ingredient and magnesium stearate are mixed with an aqueous solution of the soluble starch granulated, the granules dried and intimately mixed with milk sugar and corn starch. The mixture is then compressed into tablets weighing 210 mg.

c) capsules

Wirkstoff gemäß Erfindung 20,0 mg
Milchzucker 230,0 mg
Maisstärke 40,0 mg
Talk 10,0 mg
300,0 mgActive ingredient according to the invention 20.0 mg
Milk sugar 230.0 mg
Corn starch 40.0 mg
Talc 10.0 mg
300.0 mg

manufacturing

Wirkstoff, Milchzucker und Maisstärke werden zunächst in einem Mischer und dann in einer Zerkleinerungsmaschine vermengt. Das Gemisch wird nochmals in den Mischer ge geben, gründlich mit dem Talk vermengt und maschinell in Hartgelatinekapseln abgefüllt.Active ingredient, milk sugar and corn starch are first mixed in a mixer and then in a shredder blended. The mixture is again placed in the mixer give, mixed thoroughly with the talc and machine filled into hard gelatin capsules.

d) tablets

Wirkstoff gemäß Erfindung 40,0 mg
Milchzucker 100,0 mg
Maisstärke 50,0 mg
kolloidale Kieselsäure 2,0 mg
Magnesiumstearat 3,0 mg
insgesamt 200,0 mgActive ingredient according to the invention 40.0 mg
Milk sugar 100.0 mg
Corn starch 50.0 mg
colloidal silica 2.0 mg
Magnesium stearate 3.0 mg
a total of 200.0 mg

manufacturing

Der Wirkstoff wird mit einem Teil der Hilfsstoffe gemischt und mit einer Lösung der lösli chen Stärke in Wasser granuliert. Nach dem Trocknen des Granulats wird der Rest der Hilfsstoffe zugemischt und die Mischung zu Tabletten verpresst.The active ingredient is mixed with some of the excipients and with a solution of the soluble Chen starch granulated in water. After drying the granulate, the rest of the Auxiliaries added and the mixture compressed into tablets.

e) coated tablets

Wirkstoff gemäß Erfindung 20,0 mg
Milchzucker 100,0 mg
Maisstärke 65,0 mg
kolloidale Kieselsäure 2,0 mg
lösliche Stärke 5,0 mg
Magnesiumstearat 3.0 mg
insgesamt 195,0 mgActive ingredient according to the invention 20.0 mg
Milk sugar 100.0 mg
Corn starch 65.0 mg
colloidal silica 2.0 mg
soluble starch 5.0 mg
Magnesium stearate 3.0 mg
a total of 195.0 mg

manufacturing

[0093] Der Wirkstoff und die Hilfsstoffe werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, zu Ta blettenkernen verpresst, die mit Zucker, Talcum und Gummi arabicum in üblicher Weise dragiert werden.The active ingredient and excipients are, as described in Example 1, to Ta pressed cores with sugar, talcum and gum arabic in the usual way be coated.

f) suppositories

Wirkstoff gemäss Erfindung 50,0 mg
Milchzucker 250,0 mg
Suppositorienmasse q. s. ad 1,7 gActive ingredient according to the invention 50.0 mg
Milk sugar 250.0 mg
Suppository mass qs ad 1.7 g

manufacturing

Der Wirkstoff und der Milchzucker werden miteinander vermischt und die Mischung in der geschmolzenen Suppositorienmasse gleichmässig suspendiert. Die Suspensionen werden in gekühlte Formen zu Suppositorien von 1,7 g Gewicht ausgegossen.The active ingredient and the milk sugar are mixed together and the mixture in the molten suppository mass evenly suspended. The suspensions are poured into chilled molds into suppositories weighing 1.7 g.

g) ampoules

Wirkstoff gemäss Erfindung 20,0 mg
Natriumchlorid 5,0 mg
Bi-destilliertes Wasser q. s. ad 2,0 mlActive ingredient according to the invention 20.0 mg
Sodium chloride 5.0 mg
Bi-distilled water qs ad 2.0 ml

manufacturing

Der Wirkstoff und das Natriumchlorid werden in bi-destilliertem Wasser gelöst und die Lösung in Ampullen steril abgefüllt.The active ingredient and sodium chloride are dissolved in bi-distilled water and the Solution sterile filled in ampoules.

h) ampoules

Wirkstoff gemäß Erfindung 10,0 mg
Natriumchlorid 7,0 mg
Bi-destilliertes Wasser q. s. ad 1,0 mgActive ingredient according to the invention 10.0 mg
Sodium chloride 7.0 mg
Bi-distilled water qs ad 1.0 mg

i) drops

Wirkstoff gemäß Erfindung 0,70 g
p-Hydroxybenzoesäuremethylester 0,07 g
p-Hydroxybenzoesäurepropylester 0,03 g
Entmineralisiertes Wasser q. s. ad 100,00 mlActive ingredient according to the invention 0.70 g
p-Hydroxybenzoic acid methyl ester 0.07 g
Propyl p-hydroxybenzoate 0.03 g
Demineralized water qs ad 100.00 ml

manufacturing

Der Wirkstoff und die Konservierungsmittel werden in entmineralsiertem Wasser gelöst, die Lösung filtriert und in Flaschen zu je 100 ml abgefüllt.The active ingredient and the preservatives are dissolved in demineralized water, the solution is filtered and filled into bottles of 100 ml each.

Claims

1. Use of an inhibitor of an ion channel protein of the TRP family for treatment development of a painful condition.

2. Use of a TRP family ion channel protein inhibitor for manufacture treatment of a pharmaceutical composition for the treatment of a pain condition of.

3. Use according to claim 1 or 2, characterized in that the pain got caused by an inflammatory process.

4. Use according to claim 1 to 3, characterized in that the painful condition is induced by a noxious stimulus or an inflammatory mediator.

5. Use according to one of claims 1 to 4, characterized in that the Pain is mediated by nociceptors.

6. Use according to one of claims 1 to 5, characterized in that the Pain as a result of a rheumatic disease, e.g. B. chronic rheumatoid Polyarthritis, or the result of migraines, inflammatory arthritis, or a tumor is.

7. Use according to one of claims 1 to 6 for reducing hyperalgesia.

8. Use according to one of claims 1 to 7, characterized in that the Io channel protein belongs to the STRPC subfamily of TRP receptors.

9. Use according to claim 8, characterized in that the ion channel protein TRP-1, TRP1A, TRP-2, TRP-3, TRP-4, TRP-5, TRP-6, or TRP-7.

10. Use according to one of claims 1 to 9, characterized in that the In hibitor inhibits the influx of calcium into sensory neurons.

11. A method for finding an active ingredient for pain, characterized in that

a) a cell or cell line is provided which expresses an ion channel protein of the TRP family;
b) a test substance is brought into contact with the cell or cell line;
c) the calcium flow through the cell membrane is measured in the presence of the test substance; and
d) the measured value is compared with a reference value and this determines whether the substance is an inhibitor of the ion channel protein.