DE10112748A1

DE10112748A1 - Invention relating to HCV diseases

Info

Publication number: DE10112748A1
Application number: DE10112748A
Authority: DE
Inventors: Norbert Tautz; H-J Thiel; Christoph Birghan
Original assignee: Transmit Gesellschaft fuer Technologietransfer mbH
Current assignee: JUSTUS-LIEBIG-UNIVERSITAET GIESSEN, 35390 GIESSEN,
Priority date: 2001-03-14
Filing date: 2001-03-14
Publication date: 2002-09-19
Also published as: WO2002072126A2; WO2002072126A3; AU2002257525A1

Abstract

The invention relates to the binding partners for the NS2 protein of human Hepatitis C Virus (HCV), to binding partners for a cellular J domain protein (Jiv; J-domain protein interacting with viral protein), and to methods for identifying the binding partners which effect a competitive or allosteric inhibition of the bond between the HCV-NS2 protein and Jiv. The invention also relates to agents for treating HCV diseases that contain said binding partners, and to the use of the binding partners in the prevention, diagnosis and treatment of HCV diseases.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Bindungspartner für das NS2-Protein des humanen Hepatitis C Virus (HCV), Bindungs partner für ein zelluläres J-Domänen-Protein (Jiv; J-domain protein interacting with viral protein), Verfahren zur Iden tifikation der Bindungspartner welche eine kompetitive oder allosterische Hemmung der Bindung zwischen dem HCV-NS2- Protein und Jiv bewirken, Mittel zur Behandlung von HCV- Erkrankungen, die diese Bindungspartner enthalten, sowie die Verwendung dieser Bindungspartner zur Prävention, Diagnose und Behandlung von HCV-Erkrankungen. The present invention relates to binding partner for the NS2 protein of the human hepatitis C virus (HCV), binding partner for a cellular J-domain protein (Jiv; J -domain protein i nteracting with v Iral protein), methods for Iden tification of the binding partners which cause a competitive or allosteric inhibition of the binding between the HCV NS2 protein and Jiv, agents for the treatment of HCV diseases which contain these binding partners, and the use of these binding partners for the prevention, diagnosis and treatment of HCV diseases.

description

Hepatitis C ist eine Viruserkrankung, welche die Leber an greift, zu Erkrankungen und Versagen dieses Organs und letzt lich bis zum Tode führen kann. 3% der Weltbevölkerung sind bereits mit dem Hepatitis C-Virus (HCV) infiziert, 20 Millio nen Menschen allein in der westlichen Welt. HCV ist häufiger und ansteckender, als HIV, die Rate an Neuinfizierten steigt jährlich an. Eine Vakzine ist zur Zeit nicht verfügbar und deren Entwicklung stößt u. a. aufgrund der hohen Mutationsrate des viralen Genoms auf große Schwierigkeiten. Das derzeitige Vorgehen gegen HCV umfasst gegenwärtig eine weitgehend unspe zifische medizinische Therapie mit Interferon alpha alleine oder in Kombination mit Ribavirin (Wang and Heinz, 2000). Al lerdings ist die Behandlung in vielen Fällen erfolglos weil ein Grossteil der HCV Isolate eine Resistenz gegen die Inter feron-Behandlung zeigt (Taylor, 2000). Die verwendete Behand lungsstrategie führt gerade bei der hohen benötigten Dosie rung von Interferon alpha zu signifikanten und unerwünschten Nebenreaktionen, deren Langzeitwirkungen noch gänzlich unbe kannt sind.Hepatitis C is a viral disease affecting the liver attacks, diseases and failure of this organ and last Lich can lead to death. 3% of the world population are already infected with the hepatitis C virus (HCV), 20 million in the western world alone. HCV is more common and more contagious than HIV, the rate of newly infected people is increasing annually. A vaccine is currently not available and their development bumps u. a. due to the high mutation rate of the viral genome at great difficulty. The current one Action against HCV currently includes a largely unspecified Specific medical therapy with interferon alpha alone or in combination with ribavirin (Wang and Heinz, 2000). al However, in many cases the treatment is unsuccessful because a large part of the HCV isolates are resistant to the inter feron treatment shows (Taylor, 2000). The treatment used Development strategy leads especially in the high dose required tion of interferon alpha to significant and undesirable Side reactions, the long-term effects of which are are known.

Das Genus Hepacivirus (einziger Vertreter ist das humane He patitis C Virus, HCV) gruppiert sich mit den Genera Flavivi rus und Pestivirus zur Familie der Flaviviridae (Heinz et al., 2000). Dieser Familie werden auch die bislang nicht weiter klassifizierten GBV-A, GBV-B und GBV-C zugeordnet. Das Genus Pestivirus umfasst u. a. das Virus der bovinen viralen Diarrhöe (BVDV).The hepacivirus genus (the only representative is the human He patitis C virus, HCV) is grouped with the Genera Flavivi rus and pestivirus to the Flaviviridae family (Heinz et al., 2000). So far they have not been able to continue with this family classified GBV-A, GBV-B and GBV-C. The Genus Pestivirus includes a. the bovine viral virus Diarrhea (BVDV).

Auf molekularer Ebene weisen die Vertreter der Genera Pesti virus und Hepacivirus (HCV) innerhalb der Familie der Flavi viridae ein hohes Maß an Übereinstimmungen auf (s. u.) (Rice, 1996). Daher werden Pestiviren und zwar v. a. BVDV als Modell system für HCV verwendet. Der Bedarf an einem Modellsystem resultiert aus der Tatsache, dass derzeit im Gegensatz zum Pestivirussystem für HCV kein, für ein Wirkstoff-Screening verwendbares, infektiöses Zellkultursystem existiert. So kön nen bislang Infektionsversuche nur im Primatensystem zuver lässig durchgeführt werden (Kolykhalov et al., 2000). Dadurch ist z. B. die Ermittlung der Titer infektiöser Viren ausge sprochen schwierig, was die Entwicklung antiviraler Substan zen entscheidend hemmt. Die kürzlich entwickelten HCV- Replikons können zwar in Zellkulturen ihre RNA replizieren, bisher gelang es aber nicht mit diesem Ansatz, neue infektiö se Viren zu erzeugen (Lohmann et al., 1999). Eine gezielte Suche nach Substanzen, welche die Bildung infektiöser HCV- Virionen reduzieren, verläuft somit bislang nur äußerst unbe friedigend.At the molecular level, the representatives of Genera Pesti virus and hepacivirus (HCV) within the Flavi family viridae a high degree of correspondence on (see below) (Rice, 1996). Therefore, pestiviruses, v. a. BVDV as a model system used for HCV. The need for a model system results from the fact that, in contrast to the Pestivirus system for HCV no, for drug screening usable, infectious cell culture system exists. So can Until now, infection attempts have only been possible in the primate system be carried out casually (Kolykhalov et al., 2000). Thereby is z. B. the determination of the titer of infectious viruses talked difficult about the development of antiviral substances zen decisively inhibits. The recently developed HCV While replicons can replicate their RNA in cell cultures, So far, however, this approach has not succeeded in creating new infectious diseases generate viruses (Lohmann et al., 1999). A targeted Search for substances that prevent the formation of infectious HCV So far, reducing virions has been extremely easy satisfactorily.

Die Replikation der Mitglieder der Flaviviridae umfasst wie bei allen positiv strängigen RNA Viren die Synthese minde stens eines Polyproteins das von zellulären und viralen Proteasen ko- und posttranslational in die reifen Virusproteine gespalten wird (Rice, 1996). Bei Viren, deren Replikations strategie die Synthese eines Polyproteins umfasst, kommt dem korrekten Ablauf und der exakten Kinetik der Polyproteinpro zessierung eine entscheidende Bedeutung hinsichtlich der Vi rusvermehrung in der Zelle zu. Antivirale Strategien, z. B. gegen das humane Immundefizienz Virus (HIV), zielen daher häufig darauf ab, die Polyproteinprozessierung zu stören. Den Erfolg dieser Methode belegt u. a. die derzeit praktizierte HIV-Therapie mit Proteaseinhibitoren (Flexner, 2000).The replication of the members of Flaviviridae includes how the synthesis of all positive stranded RNA viruses at least one polyprotein that of cellular and viral proteases co- and post-translational into the mature virus proteins is split (Rice, 1996). For viruses, their replication strategy involves the synthesis of a polyprotein comes to that correct sequence and the exact kinetics of the polyprotein pro cessation is of crucial importance with regard to the Vi soot increase in the cell. Antiviral strategies, e.g. B. against the human immunodeficiency virus (HIV), therefore aim often seek to interfere with polyprotein processing. The Success of this method shows u. a. the currently practiced HIV therapy with protease inhibitors (Flexner, 2000).

Bei Pestiviren und HCV verläuft die Prozessierung im C- terminal gelegenen Nichtstrukturprotein (NS)-Bereich des Po lyproteins (NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B) in sehr ähnlicher Weise. Als Hauptprotease fungiert in beiden Polyproteinen ei ne Serinprotease im NS3 Protein, welche für ihre volle Funk tionsfähigkeit das NS4A Protein als Kofaktor benötigt (Rice, 1996). Die Inaktivierung der NS3 Protease führt in beiden Vi russystemen zum Erliegen der Replikation (Behrens et al., 1998; Kolykhalov et al., 2000). Eine weitere viruskodierte Protease wurde für NS2-3 von HCV beschrieben, welche die Spaltung von NS2-3 katalysiert (Grakoui et al., 1993; Hijika ta et al., 1993; Pieroni et al., 1997). Aufgrund von in vitro Studien wurde postuliert, dass für eine effiziente NS2-3 Spaltung bei HCV bis dato unbekannte Wirtsfaktoren eine wich tige Rolle spielen (Pieroni et al., 1997). Molekularbiologische Untersuchungen am HCV haben gezeigt, dass eine Inakti vierung der NS2-3 Protease die RNA Replikation des Virus un terbindet (Kolykhalov et al., 2000). Somit kommt der NS2-3 Spaltung und damit der Aktivität der NS2-3 Protease im Fall des HCV eine essentielle Bedeutung zu. Aus virologischer Sicht ist davon auszugehen, dass eine Störung der NS2-3 Spal tung die virale Replikation beeinträchtigt.For pestiviruses and HCV, the processing takes place in the C- terminally located non-structural protein (NS) region of the Po lyproteins (NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B) in very similar Wise. The main protease in both polyproteins is egg ne serine protease in the NS3 protein, which is responsible for its full function Ability to use the NS4A protein as a cofactor (Rice, 1996). Inactivation of the NS3 protease results in both Vi soot systems to stop replication (Behrens et al., 1998; Kolykhalov et al., 2000). Another virus-encoded Protease has been described for NS2-3 from HCV, which the Cleavage of NS2-3 catalyzed (Grakoui et al., 1993; Hijika ta et al., 1993; Pieroni et al., 1997). Due to in vitro Studies have been postulated to be efficient for NS2-3 Cleavage at HCV previously unknown host factors an important play an important role (Pieroni et al., 1997). molecular biology Studies at the HCV have shown that an inactivity the NS2-3 protease and RNA replication of the virus terbet (Kolykhalov et al., 2000). So the NS2-3 comes Cleavage and thus the activity of the NS2-3 protease in the case of the HCV is of essential importance. From virological View it can be assumed that a malfunction of the NS2-3 Spal viral replication.

Im Hinblick auf Pestiviren wurde die Existenz einer der HCV NS2-3 Protease entsprechenden Enzymaktivität bereits mehrfach gefordert (Kümmerer and Meyers, 2000; Mendez et al., 1998; Tautz, et al.; 1996).With regard to pestiviruses, the existence of one of the HCV Enzyme activity corresponding to NS2-3 protease has been repeated several times required (Kümmerer and Meyers, 2000; Mendez et al., 1998; Tautz, et al .; 1996).

Die erfindungsgemäßen Untersuchungen im BVDV-System zeigen, dass das BVDV-NS2 Protein eine stabile Interaktion mit einem bislang unbekannten zellulären J-Domänen-Protein Jiv (J- domain protein interacting with viral protein; Fig. 2A) ein geht. In BVDV infizierten Zellen korreliert die intrazellulä re Menge des Jiv-Proteins direkt mit dem Ausmaß der NS2-3 Spaltung. Interessanterweise hat auch ein erfindungsgemäß als Jiv90 bezeichnetes Jiv-Fragment, welches die Aminosäuren 533- 622 des bovinen Jiv-Proteins umfasst (Fig. 2B), die Eigen schaft an NS2 von BVDV zu binden und die NS2-3 Spaltung zu stimulieren. Jiv90 kann entweder carboxy- oder aminoterminal um 5 Aminosäuren verkürzt werden, ohne die oben genannten Ei genschaften zu verlieren; funktionell sind somit Jiv oder Fragmente von Jiv die mindestens die Aminosäure 538-622, oder 533-617 umfassen.The investigations of the invention in BVDV system show that the BVDV NS2 protein a stable interaction with an unidentified cellular J-domain protein Jiv (J - domain protein i nteracting with v Iral protein; Fig. 2A) is one. In BVDV infected cells, the intracellular amount of the Jiv protein correlates directly with the extent of the NS2-3 cleavage. Interestingly, a Jiv fragment, which is designated according to the invention as Jiv90 and which comprises amino acids 533-622 of the bovine Jiv protein ( FIG. 2B), has the property of binding to NS2 of BVDV and stimulating NS2-3 cleavage. Jiv90 can be shortened by either 5 amino acids, either carboxy or amino, without losing the properties mentioned above; functional are thus Jiv or fragments of Jiv which comprise at least the amino acid 538-622 or 533-617.

Erstaunlicherweise kann für das NS2 Protein von HCV (HCV-NS2) ebenfalls eine Interaktion mit der im bovinen System identi fizierten Jiv90-Domäne des Jiv Proteins nachgewiesen werden. Im relevanten Bereich des Jiv Proteins, Aminosäuren 533-621 (Zahlenangaben beziehen sich auf die bovine Sequenz), sind bovines und humanes Jiv identisch (siehe Fig. 3).Surprisingly, an interaction with the Jiv90 domain of the Jiv protein identified in the bovine system can also be demonstrated for the HCV NS2 protein (HCV-NS2). In the relevant region of the Jiv protein, amino acids 533-621 (numbers refer to the bovine sequence), bovine and human Jiv are identical (see FIG. 3).

In Anbetracht der im BVDV-System erhaltenen Befunde ist davon auszugehen, dass das humane Ortholog des bovinen Jiv Proteins für HCV einen der postulierten Wirtsfaktoren darstellt, der die Aktivität der NS2-3 Protease stimuliert (Pieroni et al., 1997). Aus virologischer Sicht ist davon auszugehen, dass ei ne Hemmung dieser Interaktion zu einer Verminderung der Re plikation des HCV führt.In view of the findings obtained in the BVDV system is of that assume that the human ortholog of the bovine Jiv protein is one of the postulated host factors for HCV that stimulates the activity of the NS2-3 protease (Pieroni et al., 1997). From a virological point of view it can be assumed that ei inhibition of this interaction to reduce the Re of the HCV.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Identifika tion von Bindungspartnern welche die Bindung zwischen HCV-NS2 und Jiv kompetitiv oder allosterisch hemmen, weiterhin Test systeme die zum Auffinden dieser Bindungspartner führen, Ver wendung dieser Bindungspartner zur Prävention und Diagnose von HCV-Erkrankungen, sowie Mittel zur Behandlung von HCV- Erkrankungen, die wenigstens einen dieser Bindungspartner enthalten.The object of the present invention is therefore the identifica tion of binding partners which bind the HCV-NS2 and inhibit Jiv competitively or allosterically, continue testing systems that lead to the finding of these binding partners, Ver application of these binding partners for prevention and diagnosis of HCV diseases and agents for the treatment of HCV Diseases that have at least one of these binding partners contain.

Die Interaktion zwischen Jiv und NS2 von Pestiviren, insbe sondere von BVDV, kann dabei als Modellsystem dienen. Mit Hilfe dieses Modellsystems lässt sich eine Korrelation zwi schen der Hemmung der NS2/Jiv Interaktion und der dadurch verursachten Reduktion des Virustiters ermitteln. In diesem System erfolgreich getestete Substanzen/Proteine/Liganden können an das HCV-System angepasst werden.The interaction between Jiv and NS2 from pestiviruses, esp especially from BVDV, can serve as a model system. With With the help of this model system, a correlation between inhibition of the NS2 / Jiv interaction and thereby determine the reduction in virus titer caused. In this System successfully tested substances / proteins / ligands can be adapted to the HCV system.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Bindungs partner für das NS2-Protein von HCV (HCV-NS2), die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie die Bindung von HCV-NS2 an das Jiv-Protein kompetitiv oder allosterisch hemmen.The present invention therefore relates to binding partner for the NS2 protein from HCV (HCV-NS2), which thereby are marked to bind HCV-NS2 to the Inhibit jiv protein competitively or allosterically.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Bindungspart ner für Jiv, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie die Bindung des HCV-NS2 an Jiv kompetitiv oder allosterisch hem men.The present invention also relates to the binding part ner for Jiv, who are characterized by the fact that they are the Binding of HCV-NS2 to Jiv competitive or allosteric hem men.

Unter Bindung versteht man jede molekulare Wechselwirkung zwischen Jiv und HCV-NS2, insbesondere unter physiologischen Bedingungen. Dies sind in der Regel klassische Protein- Protein-Wechselwirkungen, zu denen elektrostatische Anzie hung, Wasserstoffbrücken-Bindung, hydrophobe Bindung, van der-Waals-Kräfte und metallkomplexartige koordinative Bindung gehören. Zusätzlich zu den vorstehend genannten reversiblen molekularen Wechselwirkungen kommen für die Bindung erfin dungsgemäßer Bindungspartner an Jiv oder HCV-NS2 auch irre versible Wechselwirkungen, wie kovalente Bindungen, in Be tracht. Binding is understood to mean any molecular interaction between Jiv and HCV-NS2, especially under physiological Conditions. These are usually classic protein Protein interactions, including electrostatic attraction hung, hydrogen bond, hydrophobic bond, van der Waals forces and metal complex-like coordinative bond belong. In addition to the aforementioned reversible molecular interactions are invented for binding binding partner according to the invention on Jiv or HCV-NS2 also crazy versible interactions, such as covalent bonds, in Be costume.

Unter kompetitiver Hemmung versteht man, dass erfindungsgemä ße Bindungspartner mit Jiv oder HCV-NS2 um die Bindung an HCV-NS2 bzw. Jiv konkurrieren, d. h. die Bindung des einen behindert die Bindung des anderen.Competitive inhibition means that according to the invention Connect with Jiv or HCV-NS2 to bind HCV-NS2 and Jiv compete, respectively. H. the bond of one hinders the other's bond.

Unter allosterischer Hemmung versteht man, dass erfindungsge mäße Bindungspartner an Jiv oder HCV-NS2 binden und dabei Jiv oder HCV-NS2 so verändern, dass die Bindung zwischen Jiv und HCV-NS2 behindert wird.Allosteric inhibition means that inventive bind binding partner to Jiv or HCV-NS2 and thereby Jiv or HCV-NS2 so that the bond between Jiv and HCV-NS2 is hindered.

Vorzugsweise wird die HCV-NS2-seitige Bindungsstelle, über die der Bindungspartner an HCV-NS2 bindet, von wenigstens ei nem Teil der HCV-NS2-seitigen Bindungsstelle, über die HCV- NS2 an Jiv bindet, gebildet. Entsprechendes gilt für die Jiv- seitige Bindungsstelle im Hinblick auf die Bindung zwischen Jiv und HCV-NS2 bzw. Jiv und Bindungspartner.Preferably, the HCV-NS2 side binding site is over which the binding partner binds to HCV-NS2, of at least ei part of the HCV-NS2-side binding site, via the HCV NS2 binds to Jiv, formed. The same applies to the Jiv side binding site in terms of binding between Jiv and HCV-NS2 or Jiv and binding partner.

Bevorzugt werden Bindungspartner für das HCV-NS2 Protein.Binding partners for the HCV-NS2 protein are preferred.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Er findung binden Bindungspartner von HCV-NS2 an einen Teil der in Fig. 1A gezeigten Aminosäuresequenz des HCV BK (Subtyp1b) 1 bis 217 (Takamizawa et al., 1991), an NS2 anderer HCV Sub typen oder homologe Sequenzen davon.According to a preferred embodiment of the present invention, binding partners of HCV-NS2 bind to a part of the amino acid sequence of HCV BK (subtype 1b) 1 to 217 (Takamizawa et al., 1991) shown in FIG. 1A, to NS2 of other HCV subtypes or homologous Sequences of it.

Unter homologen Sequenzen versteht man Aminosäuresequenzen, die sich von der in Fig. 1A gezeigten Aminosäuresequenz durch ein- oder mehrfache Aminosäuredeletion, -substitution, -insertion und/oder -inversion ableiten. Homologe Sequenzen sind somit Teil mutierter HCV-NS2 Proteine, sofern man die in Fig. 1A gezeigte Aminosäuresequenz als Wildtyp-Sequenz defi niert. Definitionsgemäß sind homologe Sequenzen der in Fig. 1A gezeigten Aminosäuresequenz zu dieser im wesentlichen funktionell gleichwirkend. Insbesondere vermögen homologe HCV-NS2-Sequenzen an Jiv zu binden, wobei sich die Bin dungsaffinität einer homologen HCV-NS2-Sequenz zu Jiv von der Bindungsaffinität der in Fig. 1A gezeigten Sequenz zu Jiv un terscheiden kann.Homologous sequences are understood to mean amino acid sequences which are derived from the amino acid sequence shown in FIG. 1A by single or multiple amino acid deletion, substitution, insertion and / or inversion. Homologous sequences are thus part of mutated HCV-NS2 proteins, provided that the amino acid sequence shown in FIG. 1A is defined as a wild-type sequence. By definition, homologous sequences of the amino acid sequence shown in FIG. 1A are essentially functionally equivalent to this. In particular, homologous HCV-NS2 sequences can bind to Jiv, whereby the binding affinity of a homologous HCV-NS2 sequence to Jiv can differ from the binding affinity of the sequence shown in FIG. 1A to Jiv.

Erfindungsgemäß steht der Begriff "HCV-NS2" für die in Fig. 1A gezeigte Aminosäuresequenz genauso wie für NS2 anderer HCV Subtypen und homologe Sequenzen davon; eingeschlossen sind dabei auch die NS2 Sequenzen von GBV-A, GBV-B und GBV-C.According to the invention, the term “HCV-NS2” stands for the amino acid sequence shown in FIG. 1A as well as for NS2 of other HCV subtypes and homologous sequences thereof; The NS2 sequences of GBV-A, GBV-B and GBV-C are also included.

Erfindungsgemäß steht der Begriff "Jiv" für die in Fig. 2A gezeigte Aminosäuresequenz des bovinen Jiv Proteins genauso wie für Jiv anderer Euksryoten, insbesondere die der Mammalia und homologe Sequenzen davon.According to the invention, the term “Jiv” stands for the amino acid sequence of the bovine Jiv protein shown in FIG. 2A as well as for Jiv of other Euksryotes, in particular that of mammals and homologous sequences thereof.

Vorzugsweise binden erfindungsgemäße Bindungspartner an Jiv oder HCV-NS2 mit höherer Affinität als Jiv an HCV-NS2 bzw. HCV-NS2 an Jiv. Eine höhere Bindungsaffinität hat den Vor teil, dass geringere Konzentrationen an Bindungspartner er forderlich sind, um eine kompetitive oder allosterische Hem mung zu bewirken. Andererseits kann eine geeignete Hemmung auch mit Bindungspartnern geringerer Bindungsaffinität er reicht werden, indem man eine höhere Konzentration an Bin dungspartner anwendet. Binding partners according to the invention preferably bind to Jiv or HCV-NS2 with higher affinity than Jiv on HCV-NS2 or HCV-NS2 to Jiv. A higher binding affinity has the intention share that lower concentrations of binding partner he are required to have a competitive or allosteric hem effect. On the other hand, a suitable inhibition also with binding partners of lower binding affinity be enough by having a higher concentration of bin application partner applies.

Bei den erfindungsgemäßen Bindungspartnern kann es sich um Peptide, Peptoide, organische oder anorganische Substanzen handeln. Bevorzugt sind Peptide und Peptoide.The binding partners according to the invention can be Peptides, peptoids, organic or inorganic substances act. Peptides and peptoids are preferred.

Unter Peptiden versteht man Sequenzen natürlich vorkommender, proteogener Aminosäuren, die über Peptidbindung miteinander verknüpft sind. Sequenzen von Peptoiden, d. h. Peptid- ähnlichen Verbindungen, können neben natürlich vorkommenden, proteogenen Aminosäuren auch weitere Aminosäuren und Ami nosäure-Derivate enthalten, beispielsweise bestimmte Stereo- und Diastereoisomere, wie D-Aminosäuren, natürlich vorkommen de, nichtproteogene Aminosäuren oder chemisch synthetisierte Verbindungen mit Eigenschaften, die dem Fachmann als Ami nosäure-ähnlich bekannt sind, wie beta-Alanin, gamma-Carboxy glutamin-säure, Hydroxyprolin, Norleucin, Norvalin, Ornithin, Phenylglycin, Pyroglutaminsäure, Sarcosin, Statin, oder t- Leucin. Unter Peptiden versteht man auch solche Sequenzen, deren N- und/oder C-Terminus modifiziert sein kann, bei spielsweise mit acetyliertem N-Terminus und/oder amidiertem C-Terminus. Das gleiche gilt auch für chemisch modifizierbare Aminosäuren-Seitengruppen, die insbesondere die in der orga nischen Chemie geläufigen und vor allem in der Peptidchemie zur Anwendung kommenden Schutzgruppen tragen können.Peptides are understood to be sequences of naturally occurring proteogenic amino acids linked to each other via peptide are linked. Sequences of peptoids, i. H. Peptide- similar compounds, in addition to naturally occurring, proteogenic amino acids also other amino acids and ami contain noic acid derivatives, for example certain stereo and diastereoisomers such as D-amino acids occur naturally de, non-proteogenic amino acids or chemically synthesized Compounds with properties that the skilled worker as Ami are known similar to no acid, such as beta-alanine, gamma-carboxy glutamic acid, hydroxyproline, norleucine, norvaline, ornithine, Phenylglycine, pyroglutamic acid, sarcosine, statin, or t- Leucine. Peptides are also understood to mean sequences whose N- and / or C-terminus can be modified at for example with acetylated N-terminus and / or amidated C-terminus. The same applies to chemically modifiable ones Amino acid side groups, in particular those in the orga African chemistry and especially in peptide chemistry protective groups to be used.

Geeignete Bindungspartner sind auch Antikörper, insbesondere monoklonale und rekombinante Antikörper, die an wenigstens einen Teil der Bindungsstelle zwischen HCV-NS2 und Jiv binden. Ganz besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang an tigenbindende Fragmente der hypervariablen Domänen derartiger Antikörper, beispielsweise Fab-, Fv-, scFv- Fragmente oder auf einer oder mehrere CDRs aufbauende Fragmente.Suitable binding partners are also antibodies, in particular monoclonal and recombinant antibodies to at least bind part of the binding site between HCV-NS2 and Jiv. Are particularly preferred in this context gene binding fragments of the hypervariable domains of such Antibodies, for example Fab, Fv, scFv fragments or fragments based on one or more CDRs.

Im Hinblick auf die erfindungsgemäße Verwendung der Bindungs partner in pharmazeutischen Mitteln ist der Einbau von Ami nosäuren, die in der Natur nicht vorkommen, insofern vorteil haft, als dadurch die Stabilität gegenüber natürlichen Abbau prozessen erhöht wird. Soll einem Säuger als erfindungsgemä ßer Bindungspartner ein bestimmtes Peptid verabreicht werden, so lässt sich dessen Halbwertszeit in vivo beispielsweise da durch verlängern, dass man zumindest einen Teil der natürli chen L-Aminosäuren durch D-Isomere ersetzt und so zu einem entsprechenden Peptoid gelangt.With regard to the use of the binding according to the invention The partner in pharmaceutical products is the incorporation of Ami Non-acids that do not occur in nature are therefore advantageous clinging, as a result the stability against natural degradation processes is increased. Should a mammal as according to the invention a specific peptide is administered to the binding partner, for example, its half-life can be there in vivo by extending that you can at least part of the natural Chen L-amino acids replaced by D-isomers and thus to one corresponding peptoid.

Dem Fachmann sind Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Peptide und Peptoide bekannt. Bevorzugt werden Festphasen- Synthesen unter Verwendung funktionalisierter Harze, an wel che die zu synthetisierenden Peptide geknüpft werden können. Wang-Harze für die FMOC-Festphasen-Peptidsynthese oder Merri field-Harze zur BOC-Festphasen-Peptid-aynthese sind geläufige Beispiele. Nach erfolgtem Aufbau eines gewünschten Peptids wird dieses dann vom Träger abgelöst, wobei gleichzeitig oder auch im Anschluss daran möglicherweise vorhandene Schutzgrup pen abgespalten werden können. Eine gegebenenfalls erforder liche, sich anschließende Aufreinigung, beispielsweise über HPLC, liefert das Peptid in gewünschter Reinheit, die bei spielsweise mittels Massenspektroskopie oder NMR festgestellt werden kann. Die genaue Ausgestaltung des Verfahrens richtet sich nach dem zu synthetisierenden Peptid oder Peptoid und beruht auf fachmännischem Wissen.Methods for producing according to the invention are more familiar to the person skilled in the art Peptides and peptoids are known. Solid phase are preferred Syntheses using functionalized resins, on wel the peptides to be synthesized can be linked. Wang resins for FMOC solid phase peptide synthesis or Merri field resins for BOC solid-phase peptide synthesis are common Examples. After a desired peptide has been built up it is then detached from the carrier, with or simultaneously afterwards there may also be a protective group can be split off. A possibly required Liche, subsequent purification, for example via HPLC delivers the peptide in the desired purity for example by means of mass spectroscopy or NMR can be. The exact design of the procedure is aimed the peptide or peptoid to be synthesized and is based on professional knowledge.

Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptoide können ebenso mit tels molekularbiologischer Verfahren hergestellt werden. Dazu kann beispielsweise die primäre Aminosäuresequenz des zu syn thetisierenden Peptids in die entsprechende cDNA- oder mRNA- Sequenz umgesetzt werden. Die auf bekannte Art synthetisier ten Nukleinsäuren können dann in eine geeignete Wirtszelle eingeschleust, exprimiert und anschließend gegebenenfalls zu den gewünschten Peptoiden modifiziert werden. Zusätzliche Ausgestaltungen dieses Verfahrens beruhen ebenfalls auf fach männischem Wissen.The peptides and peptoids according to the invention can also be used be produced using molecular biological methods. To can, for example, the primary amino acid sequence of syn thetizing peptide into the corresponding cDNA or mRNA Sequence are implemented. The synthesized in a known way The nucleic acids can then be transferred to a suitable host cell introduced, expressed and then, if necessary, to the desired peptoids can be modified. additional Refinements of this method are also based on subject male knowledge.

Desweiteren können Bibliotheken randomisierter Peptidgene an gelegt werden, aus denen dann die Isolierung von Peptiden mit der gewünschten Bindungsspezifität möglich ist. Beispielswei se kann man randomisierte Oligonukleotide in ein geeignetes Expressionssystem einbringen, welches die Auswahl von erfin dungsgemäßen Oligopeptiden mit unterschiedlicher Aminosäure sequenz erlaubt.Furthermore, libraries can randomized peptide genes are then used to isolate peptides the desired binding specificity is possible. Beispielswei one can randomize oligonucleotides into a suitable one Bring expression system, which the selection of invent oligopeptides according to the invention with different amino acids sequence allowed.

Dem Fachmann sind Verfahren zur Herstellung spezifischer, monoklonaler und rekombinanter Antikörper und insbesondere Antikörperfragmente bekannt. Methods for producing specific, monoclonal and recombinant antibodies and in particular Antibody fragments known.

Beispielsweise können monoklonale Antikörper, die spezifisch gegen die HCV-NS2- bzw. Jiv-seitige, an der Bindung zwischen HCV-NS2 und Jiv beteiligte Bindungsstelle gerichtet sind, mittels herkömmlicher Hybridomtechnik gewonnen werden, indem man Peptidfragmente aus der HCV-NS2- bzw. Jiv-seitigen Bin dungsstelle zur Immunisierung verwendet. Antikörperfragmente dieser monoklonalen Antikörper können auf übliche Weise, bei spielsweise durch proteolytische Verdauung, erhalten werden.For example, monoclonal antibodies that are specific against the HCV-NS2 or Jiv side, at the bond between HCV-NS2 and Jiv involved binding site are directed can be obtained by means of conventional hybridoma technology by peptide fragments from the HCV-NS2 or Jiv-side bin used for immunization. Antibody fragments these monoclonal antibodies can in the usual way for example by proteolytic digestion.

Die Grundlage zur Herstellung rekombinanter Antikörper und Antikörperfragmente bilden bevorzugt Antikörper-Gen bibliotheken, die mittels PCR aus antikörperbezogenen geneti schen Informationen angelegt werden können. Als genetische Information können beispielsweise cBNA aus definierten Zell linien, wie Hybridomen oder Myelomen, cDNA aus seropositiven Spendern oder nicht immunisierten Spendern, genomische DNA als Gesamtheit der variablen Regionen oder randomisierte Oli gonukleotide für hypervariable Regionen verwendet werden, was in der Reihenfolge der vorstehend genannten Beispiele zu Bi bliotheken mit zunehmender Komplexität führt.The basis for the production of recombinant antibodies and Antibody fragments preferentially form antibody genes libraries using PCR from antibody-related geneti information can be created. As a genetic Information can be, for example, cBNA from defined cells lines, such as hybridomas or myelomas, cDNA from seropositive Donors or non-immunized donors, genomic DNA as a whole of the variable regions or randomized oli gonucleotides can be used for hypervariable regions in the order of the above examples for Bi libraries with increasing complexity.

Aus diesen können dann einzelne Antikörper oder Antikörper fragmente mit der gewünschten Spezifität, d. h. erfindungsge mäße Bindungspartner, hergestellt werden, indem man das be treffende Gen in einen Produktionsvektor kloniert und in pro karyontischen Systemen, wie E. coli, Bacillus subtilis, Strep tomyces lividans, oder eukaryontischen Systemen, wie Plasmacytoma- oder Myeloma-Zellen, COS-Zellen, CHO-Zellen, be stimmten Insekten-, Pflanzen- oder Pilzzellen, beispielsweise einzelligen Hefezellen, exprimiert. Auch zellfreie Systeme, insbesondere bei Anfügung eines zytotoxischen Fusionsanteils an den erfindungsgemäßen Bindungspartner, können zur Anwen dung kommen. Beispiele hierfür bieten Retikulozyten-Extrakte. Erfindungsgemäße Bindungspartner binden an HCV-NS2 oder Jiv, wobei sie die Bindung zwischen HCV-NS2 und Jiv kompetitiv oder allosterisch hemmen. Dem Fachmann sind zahlreiche Ver fahren zum Nachweis einer derartigen Bindung.Individual antibodies or antibodies can then be made from these fragments with the desired specificity, d. H. erfindungsge moderate binding partner, be prepared by the be apt gene cloned into a production vector and into pro caryotic systems such as E. coli, Bacillus subtilis, Strep tomyces lividans, or eukaryotic systems, such as plasmacytoma or myeloma cells, COS cells, CHO cells, be agreed insect, plant or fungal cells, for example unicellular yeast cells, expressed. Even cell-free systems, especially when adding a cytotoxic fusion component to the binding partner according to the invention can be used come. Examples of this are reticulocyte extracts. Binding partners according to the invention bind to HCV-NS2 or Jiv, being competitive between HCV-NS2 and Jiv or inhibit allosterically. Numerous ver drive to the detection of such a bond.

In der Regel wird wenigstens eine an der Bindung beteiligte Komponente, d. h. Bindungspartner, HCV-NS2 und/oder Jiv, mit Markierungen und/oder Immobilisierungsmitteln versehen. Eine Markierung kann so gewählt sein, dass der Nachweis direkt oder indirekt unter Verwendung spezifischer Bindungspaare ge führt werden kann. Diese spezifischen Bindungspaare können immunologischer oder nicht-immunologischer Art sein. Immuno logische, spezifische Bindungspaare basieren in der Regel auf Hapten/anti-Hapten- Systemen unter Verwendung spezifischer anti-Hapten-Antikörper.As a rule, at least one participates in the binding Component, d. H. Binding partner, HCV-NS2 and / or Jiv, with Provide markings and / or immobilizing agents. A Marking can be chosen so that the proof is direct or indirectly using specific binding pairs can be led. These specific bond pairs can be of an immunological or non-immunological type. Immuno logical, specific binding pairs are usually based on Hapten / anti-hapten systems using specific anti-hapten antibody.

Hierzu gehören beispielsweise Fluoreszein/anti-Fluoreszein-, Dinitrophenyl/anti-Dinitrophenyl-, Biotin/anti-Biotin-, Di goxigenin/anti-Digoxigenin-Systeme und dergleichen. In nich timmunologischen Bindungspaaren besitzen beide Komponenten eine natürliche Affinität zueinander, wie Biotin/- Streptavidin.These include, for example, fluorescein / anti-fluorescein, Dinitrophenyl / anti-dinitrophenyl, biotin / anti-biotin, di goxigenin / anti-digoxigenin systems and the like. In nich Immunological binding pairs have both components a natural affinity for each other, like biotin / - Streptavidin.

Markierungen oder Teile von Markierungen, beispielsweise eine Komponente eines spezifischen Bindungspaares, können kovalent an das nachzuweisende Molekül gebunden werden. Dazu sind dem Fachmann verschiedene Verfahren geläufig und entsprechend ge eignete Reagenzien im Handel erhältlich.Markings or parts of markings, for example a Component of a specific binding pair, can be covalent be bound to the molecule to be detected. That’s why Specialist familiar with various methods and corresponding ge suitable reagents commercially available.

Beispielsweise kann Biotin an Amin-, Aldehyd-, Carboxyl- und Sulfhydrylgruppen unter Verwendung von Biotin-N- Hydroxysuccinimidester, Biotinhydrazid, Biotinmaleimid bzw. Jodacetylbiotin gebunden werden. Analoge Reagenzien sind auch für Fluorescein oder Digoxigenin erhältlich. Der Nachweis wird dann über eine an das Hapten bindende Komponente ge führt, die beispielsweise an ein radioaktives Isotop, wie [¹²⁵I] oder [³H], ein Enzym, sowie fluorogene, chemilumines zierende oder elektrochemische Mittel gekoppelt sein kann. Messmethoden zum Nachweise von Radioaktivität, Fluoreszenz, z. B. der EVOTEK-Ansatz zum Nachweis von Fluoreszenzkorrela tion, Fluoreszenzenergietransfer, vgl. z. B. WO 97/28261, oder konventionellem Fluoreszenz-Quenching, Chemilumineszenz oder elektrochemischen Vorgängen sind dem Fachmann bekannt. Geeignete Enzyme sind beispielsweise Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, beta -Galactosidase, Glukoseoxidase, Luciferase, beta -Lactamase, Urease oder Lysozym. Die daran gebundenen Nachweisreaktionen, wie die Umsetzung von o- Phenylendiamin, 4-Chlornaphthol oder Tetramethylbenzidin durch Meerrettich-Perioxidasen, sind dem Fachmann ebenfalls hinlänglich bekannt.For example, biotin can be bound to amine, aldehyde, carboxyl and sulfhydryl groups using biotin-N-hydroxysuccinimide ester, biotin hydrazide, biotin maleimide or iodoacetylbiotin. Analog reagents are also available for fluorescein or digoxigenin. The detection is then carried out via a component which binds to the hapten and can be coupled, for example, to a radioactive isotope, such as [ ¹²⁵ I] or [ ³ H], an enzyme, and fluorogenic, chemiluminescent or electrochemical agents. Measurement methods for the detection of radioactivity, fluorescence, e.g. B. the EVOTEK approach to the detection of fluorescence correlation, fluorescence energy transfer, cf. z. B. WO 97/28261, or conventional fluorescence quenching, chemiluminescence or electrochemical processes are known to the person skilled in the art. Suitable enzymes are, for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, glucose oxidase, luciferase, beta-lactamase, urease or lysozyme. The associated detection reactions, such as the reaction of o-phenylenediamine, 4-chloronaphthol or tetramethylbenzidine by horseradish peroxidases, are likewise well known to the person skilled in the art.

Der Nachweis und gegebenenfalls die Quantifizierung einer kompetitiven oder allosterischen Hemmung kann mittels Ver drängungstitration erfolgen. Beispielsweise wird fluoreszenz markiertes HCV-NS2 einerseits und Bindungspartner anderer seits in einer Stopped Flow-Vorrichtung zusammengeführt und die resultierende Fluoreszenzzunahme gemessen. In einer zwei ten Messung wird ein Gemisch aus fluoreszenzmarkiertem HCV- NS2 und Bindungspartner einerseits und Jiv andererseits in einer Stopped Flow-Vorrichtung zusammengeführt. Die Fluores zenz bleibt unverändert, wenn der Komplex aus HCV-NS2 und Bindungspartner stabiler ist als der Komplex aus HCV-NS2 und Jiv.The detection and, if necessary, the quantification of a competitive or allosteric inhibition can be achieved using Ver urgent titration. For example, fluorescence labeled HCV-NS2 on the one hand and binding partner of others merged in a stopped flow device and the resulting increase in fluorescence was measured. In a two measurement is a mixture of fluorescence-labeled HCV NS2 and attachment partners on the one hand and Jiv on the other in a stopped flow device. The fluores zenz remains unchanged if the complex of HCV-NS2 and Binding partner is more stable than the complex of HCV-NS2 and Jiv.

Die Nachweisverfahren können auch eine Immobilisierung wenig stens einer Bindungskomponente an einen festen Träger bein halten. Geeignet sind beispielsweise Träger aus synthetischen Polymeren, wie Polypropylen, Polystyrol, substituiertem Po lystyrol, beispielsweise aminiertem oder carboxyliertem Po lystyrol, Polyacrylamiden, Polyamiden, Polyvinylchloriden und dergleichen. Es kann sich um Gefässe, wie Mikrotiterkammern, Tauchstäbe, Fasern oder Partikel, beispielsweise magnetische Kügelchen, handeln. Bei der Immobilisierung finden weitgehend die zuvor als Markierungsmittel beschriebenen spezifischen Bindungspaare Anwendung. In der Regel wird HCV-NS2 oder Jiv immobilisiert, während der Bindungspartner frei an diese im mobilisierten Proteine binden kann.The detection methods can also do little immobilization at least one binding component on a solid support leg hold. For example, synthetic supports are suitable Polymers such as polypropylene, polystyrene, substituted Po lystyrene, for example aminated or carboxylated Po lystyrene, polyacrylamides, polyamides, polyvinyl chlorides and like. Vessels such as microtiter chambers, Dip sticks, fibers or particles, for example magnetic Beads, act. When immobilizing largely take place the specific ones previously described as markers Binding pairs application. As a rule, HCV-NS2 or Jiv immobilized while the binding partner is free to this in the can bind mobilized proteins.

Der Nachweis der kompetitiven oder allosterischen Bindung er findungsgemäßer Bindungspartner an Jiv oder HCV-NS2 lässt sich auch über strukturabbildende Verfahren, wie Kernspinre sonanz oder Röntgen-Kristallbeugung, führen. Hierzu werden Komplexe aus Bindungspartnern mit HCV-NS2 oder Jiv oder Frag menten davon spektroskopisch untersucht. Auf diese Weise kann der Bindungsbereich zwischen einem erfindungsgemäßen Bin dungspartner und HCV-NS2 oder Jiv abgebildet werden. Erfin dungsgemäß überlappt dieser Bindungsbereich zumindest teil weise mit dem Bindungsbereich zwischen HCV-NS2 und Jiv. Massenspektroskopische Verfahren sind insbesondere zum ra schen Nachweis von Bindungen mit kleinen Substanzmengen von Vorteil.Evidence of competitive or allosteric binding binding partner according to the invention to Jiv or HCV-NS2 also about structure-mapping processes, such as nuclear spin sonance or X-ray crystal diffraction. To do this Complexes from binding partners with HCV-NS2 or Jiv or Frag elements of which were examined spectroscopically. That way the binding area between a bin according to the invention partner and HCV-NS2 or Jiv. OF INVENTION According to the invention, this bond area at least partially overlaps wise with the bond area between HCV-NS2 and Jiv. Mass spectroscopic methods are especially for ra detection of bonds with small amounts of substance Advantage.

Computergestützte, qualitative und quantitative Methoden un ter Zuhilfenahme zweckmäßiger Suchalgorithmen oder Substanz- Datenbänke, wie das Programm DOCK der Universität von San Franzisko oder QSAR-Methoden, und struktureller Vorgaben für HCV-NS2 und/oder Jiv, wie Kristall- und NMR-Strukturdaten, bieten eine weitere Möglichkeit zum Bindungsnachweis.Computer-aided, qualitative and quantitative methods and ter using appropriate search algorithms or substance Databases, such as the DOCK program of the University of San Franzisko or QSAR methods, and structural requirements for HCV-NS2 and / or Jiv, such as crystal and NMR structural data, offer another way of proving your commitment.

Auch eignen sich bekannte Systeme zum Nachweis von Prote in/Protein-Interaktionen, wie der sogenannte GST-pulldown- Assay und insbesondere yeast-two-hybrid-Ansätze. Letztere basieren auf dem modularen Aufbau eukaryotischer Transkripti onsfaktoren, wobei erfindungsgemäß die Interaktion von Bin dungspartner mit HCV-NS2 bzw. mit Jiv zur funktionellen Re konstitution eines Transkriptionsfaktors führt, dessen DNA- Binde- und Transaktivierungsdomäne zuvor getrennt worden ist. Der Nachweis der Interaktion, d. h. der Bindung ist bei spielsweise über auxotrophe Marker oder Reportergene möglich, wie dem LacZ-Gen aus E. coli und den daran gekoppelten enzyma tischen Nachweisreaktionen.Known systems for the detection of protein are also suitable in / protein interactions, such as the so-called GST pulldown Assay and especially yeast two hybrid approaches. The latter are based on the modular structure of eukaryotic transcripts ons factors, the interaction of bin partner with HCV-NS2 or with Jiv for functional re constitution of a transcription factor whose DNA Binding and transactivation domain has previously been separated. Evidence of the interaction, i.e. H. the bond is at possible, for example, via auxotrophic markers or reporter genes, such as the LacZ gene from E. coli and the enzyma coupled to it table detection reactions.

Erfindungsgemäße Bindungspartner, die in Gen-Bibliotheken niedergelegt sind, können auf ihre Bindung an HCV-NS2 bzw. Jiv untersucht werden, indem man sie oberflächengebunden, d. h. in der Regel membrangebunden auf der Oberfläche eines Or ganismus exprimiert. Hierzu eignen sich beispielsweise Bakte riophagen, insbesondere filamentöse Bakteriophagen, Bakteri en, wie E. coli, in deren Zellwand der Bindungspartner veran kert werden kann, oder auch eukaryontische Viren, wie Baculo viren. Phagen-Display und Bakterien-Display werden zur Suche erfindungsgemäßer Bindungspartner bevorzugt. Eukaryontische Viren, die erfindungsgemäße Bindungspartner tragen, besitzen den Vorteil, dass sie direkt zur Einschleusung des Bindungs partners in Zielzellen, insbesondere HCV-infizierten bzw. mit HCV-Replikons transfizierte Zellen, benutzt werden können. Die Bindung der oberflächenexprimierten Bindungspartner an HCV-NS2 bzw. Jiv kann dann über die oben beschriebenen Methoden nachgewiesen werden, die auf der Bindungspartneraffinität zu HCV-NS2 bzw. Jiv basieren. Darüber hinaus kann diese Bin dung zur Abtrennung erfindungsgemäßer Bindungspartner von an deren in der Bibliothek niedergelegten Peptiden benutzt wer den. Der Einsatz von Fluoreszenz und Biotinylierung zur Mar kierungen und Abtrennung mittels FACS, Affinitätschromatogra phie oder Adsorption an feste, beispielsweise immobilisiertes Streptavidin aufweisende Träger, wie Polystyrolgefässen, ist von Vorteil.Binding partners according to the invention, which are in gene libraries are deposited, can bind to HCV-NS2 or Jiv can be examined by making them surface bound, i.e. H. usually membrane-bound on the surface of an or ganism expressed. Bacts, for example, are suitable for this riophages, especially filamentous bacteriophages, bacteri s, such as E. coli, in the cell wall of which the binding partner induces can be core, or eukaryotic viruses, such as Baculo virus. Phage display and bacteria display are used for the search binding partner according to the invention preferred. eukaryotic Viruses that carry binding partners according to the invention have the advantage that they are used directly to inject the binding partners in target cells, especially HCV-infected or with HCV replicons transfected cells can be used. The binding of the surface-expressed binding partner HCV-NS2 or Jiv can then use the methods described above be demonstrated based on the binding partner affinity based on HCV-NS2 or Jiv. In addition, this bin tion to separate binding partners according to the invention from whose peptides stored in the library are used the. The use of fluorescence and biotinylation for the Mar markings and separation using FACS, affinity chromatography phy or adsorption on solid, for example immobilized Carriers containing streptavidin, such as polystyrene vessels advantageous.

Es können auch Kombinationen der vorstehend beschriebenen Verfahren zum Nachweis der Bindung erfindungsgemäßer Bin dungspartner an HCV-NS2 bzw. Jiv durchgeführt werden. Beson ders effiziente Bindungspartner führen in mehreren dieser Verfahren zu einem positiven Nachweis. Auch können die Eigen schaften eines Bindungspartners optimiert, d. h. vorteilhaft ausgestaltet werden, indem man durch leichte Veränderungen des Bindungspartners einen Pool möglicher weiterer Bindungs partner mit abweichenden Eigenschaften bereitstellt, aus de nen Bindungspartner mit verbesserten Eigenschaften durch die nochmalige Durchführung eines oder mehrerer der oben genann ten Verfahren abgeleitet werden können. Ein derartiges itera tives Vorgehen führt zu besonders bevorzugten Ausführungsfor men der vorliegenden Erfindung.Combinations of those described above can also be used Method for detecting the binding of bin according to the invention partner to HCV-NS2 or Jiv. Beson Efficient attachment partners lead in several of these Procedure for a positive proof. Even the own optimized of a binding partner, d. H. advantageous be shaped by going through slight changes of the binding partner a pool of possible further binding provides partners with different properties from de a binding partner with improved properties through the repeat one or more of the above ten methods can be derived. Such an itera tive approach leads to particularly preferred execution men of the present invention.

Gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung lei ten sich Bindungspartner für HCV-NS2 von den in Fig. 2A gezeigten Jiv-Aminosäuresequenzen 1 bis 699 ab, bevorzugt von dem als Jiv90 bezeichneten Bereich, der die Aminosäuren 533 bis 622 von Jiv umfasst. Vorteilhafterweise unterscheidet sich die Aminosäuresequenz eines Bindungspartners von der entsprechenden in Fig. 2A gezeigten Aminosäuresequenz da durch, dass wenigstens eine Aminosäure derart ausgetauscht, entfernt, hinzugefügt oder modifiziert ist, dass der Bin dungspartner eine höhere Affinität für die Bindung an HCV-NS2 aufweist als Jiv selbst.According to one embodiment of the present invention, binding partners for HCV-NS2 are derived from the Jiv amino acid sequences 1 to 699 shown in FIG. 2A, preferably from the region designated as Jiv90, which comprises the amino acids 533 to 622 from Jiv. The amino acid sequence of a binding partner advantageously differs from the corresponding amino acid sequence shown in FIG. 2A in that at least one amino acid is exchanged, removed, added or modified in such a way that the binding partner has a higher affinity for binding to HCV-NS2 than Jiv self.

Erfindungsgemäß steht der Begriff "Jiv" für die in der Fig. 2A gezeigte Aminosäuresequenz genauso wie für homologe Se quenzen davon.According to the invention, the term "Jiv" stands for the amino acid sequence shown in FIG. 2A as well as for homologous sequences thereof.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfin dung leiten sich Bindungspartner für Jiv von der in Fig. 1A gezeigten HCV-NS2 Aminosäuresequenz 1 bis 217 ab. Vorteilhaf terweise unterscheidet sich die Aminosäuresequenz eines Bin dungspartners von der entsprechenden in Fig. 1 gezeigten HCV- NS2 Aminosäuresequenz dadurch, dass wenigstens eine Aminosäu re derart ausgetauscht, entfernt, hinzugefügt oder modifi ziert ist, dass der Bindungspartner eine höhere Affinität für die Bindung an Jiv aufweist als HCV-NS2 selbst.According to a further embodiment of the present invention, binding partners for Jiv are derived from the HCV-NS2 amino acid sequence 1 to 217 shown in FIG. 1A. The amino acid sequence of a binding partner advantageously differs from the corresponding HCV-NS2 amino acid sequence shown in FIG. 1 in that at least one amino acid is exchanged, removed, added or modified in such a way that the binding partner has a higher affinity for binding to Jiv exhibits as HCV-NS2 itself.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfin dung leiten sich Bindungspartner für Jiv von der in Fig. 1B gezeigten BVDV-NS2 Aminosäuresequenz 1 bis 444 ab. Vorteil hafterweise unterscheidet sich die Aminosäuresequenz eines Bindungspartners von der entsprechenden in Fig. 3 gezeigten BVDV-NS2 Aminosäuresequenz dadurch, dass wenigstens eine Ami nosäure derart ausgetauscht, entfernt, hinzugefügt oder modi fiziert ist, dass der Bindungspartner eine höhere Affinität für die Bindung an Jiv aufweist als BVDV-NS2 selbst.According to a further embodiment of the present invention, binding partners for Jiv are derived from the BVDV-NS2 amino acid sequence 1 to 444 shown in FIG. 1B. The amino acid sequence of a binding partner advantageously differs from the corresponding BVDV-NS2 amino acid sequence shown in FIG. 3 in that at least one amino acid is exchanged, removed, added or modified in such a way that the binding partner has a higher affinity for binding to Jiv as BVDV-NS2 itself.

Erfindungsgemäß steht der Begriff "BVDV-NS2" für die in der Fig. 1B gezeigte Aminosäuresequenz des BVDV CP7ins- genauso wie für homologe Sequenzen davon; diese schließen die NS2 Se quenzen anderer Pestiviren ein.According to the invention, the term "BVDV-NS2" stands for the amino acid sequence of the BVDV CP7ins shown in FIG. 1B - just as for homologous sequences thereof; these include the NS2 sequences of other pestiviruses.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur intra- und/oder extrazellulären kompetitiven oder allo sterischen Hemmung der Bindung zwischen HCV-NS2 und Jiv, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man wenigstens einen
The present invention also relates to a method for intra- and / or extracellular competitive or allosteric inhibition of the binding between HCV-NS2 and Jiv, which is characterized in that at least one

a) Binding partner for HCV-NS2, which binds to Jiv HCV-NS2 competitively or allosterically inhibits and / or
b) Binding partner for Jiv who binds HCV-NS2 Jiv competitively or allosterically inhibits with HCV-infected or cells transfected with HCV replicon RNA, preferably HuH7 cells, and / or with HCV-NS2 from body fluid, ins special blood that brings into contact.

Dieses Verfahren kann sowohl in vitro als auch in vivo durch geführt werden. In vitro kann der Bindungspartner direkt in eine HCV-infizierte bzw. mit HCV Replikons transfizierte Zel len und/oder HCV-NS2 enthaltende Lösung, beispielsweise ein Gewebekulturmedium, gegeben werden oder zunächst selbst in einer geeigneten Flüssigkeit, beispielsweise einem Puffer, gelöst oder dispergiert und anschließend zu dem zell- und/oder HCV-NS2-haltigen Medium gegeben werden.This method can be carried out both in vitro and in vivo be performed. The binding partner can be directly in vitro in a cell infected with HCV or transfected with HCV replicons len and / or HCV-NS2 containing solution, for example a Tissue culture medium, to be given or initially in a suitable liquid, for example a buffer, dissolved or dispersed and then added to the cell and / or medium containing HCV-NS2.

Die in vitro Anwendung ist auch für die Diagnose von HCV- Erkrankungen von Bedeutung. So können die erfindungsgemäßen Bindungspartner zum spezifischen Nachweis von intra- und/oder extrazellulärem HCV-NS2 benutzt werden. Dadurch kann nicht nur eine HCV-Infektion allgemein festgestellt sondern auch eine HCV-NS2-abhängige Diagnose gestellt werden, die weitere qualitative und auch quantitative Rückschlüsse über die In fektion, beispielsweise deren Stadium, ermöglicht. Bindungs partner zur diagnostischen Anwendung werden in der Regel auf die oben beschriebene Art und Weise markiert und/oder immobi lisiert, so dass sie in üblichen Tests, die auf den oben be schriebenen Nachweisverfahren basieren, eingesetzt werden können. Handliche Kits zur raschen und zuverlässigen Durch führung des diagnostischen Verfahrens stellen ausreichend Bindungspartner und wenigstens einen Teil der weiteren, zur Erkennung der Bindung an HCV-NS2 erforderlichen Reagenzien in einer zweckmässigen Anordnung zur Verfügung, beispielsweise beschichtete Gefässe zur Immobilisierung von bindungspartner gebundenem HCV-NS2 und/oder Antikörper zur spezifischen Er kennung des Bindungspartner/HCV-NS2-Protein-Komplexes. Kits zum serologischen Nachweis von HCV-NS2 sind bevorzugt. Diese können die zur Blutaufbereitung üblichen Mittel beinhalten, wie gängige Lyse-Puffer und Mittel zur Anreicherung bestimm ter Zellfraktionen.The in vitro application is also for the diagnosis of HCV Diseases of importance. So can the invention Binding partner for the specific detection of intra- and / or extracellular HCV-NS2 can be used. This cannot just found an HCV infection in general but also an HCV-NS2 dependent diagnosis can be made, the further qualitative and quantitative conclusions about the In fection, for example their stage. Bonds Diagnostic partners are usually based on the way described above marked and / or immobi lised so that they can be tested in usual tests based on the above written verification methods are used can. Handy kits for quick and reliable through management of the diagnostic procedure is sufficient Binding partner and at least part of the others, for Detection of binding to HCV-NS2 required reagents in an appropriate arrangement available, for example coated vessels for immobilization of binding partners bound HCV-NS2 and / or antibody for specific Er Identification of the binding partner / HCV-NS2-protein complex. Kits for serological detection of HCV-NS2 are preferred. This can contain the usual means for blood preparation, how to determine common lysis buffers and enrichment agents ter cell fractions.

Für eine Anwendung in vivo sind pharmazeutische Formulierun gen geeignet, die einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Bindungspartner zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder üblichen Hilfsstoffen enthalten.Pharmaceutical formulations are for in vivo use gene suitable, the one or more of the invention Binding partner together with a pharmaceutically acceptable Contain carriers and / or customary auxiliaries.

Um eine kompetitive oder allosterische Hemmung der HCV-NS2- Jiv-Bindung zu erzielen, werden vorzugsweise Dosierungen an Bindungspartner gewählt, die extrazelluläre Bindungspartner- Konzentrationen von weniger als 100 ng/ml, vorzugsweise von weniger als 10 ng/ml und insbesondere von weniger als 1 ng/ml Körperflüssigkeit ergeben.To have a competitive or allosteric inhibition of HCV NS2 To achieve jiv binding, dosages are preferred Binding partner chosen, the extracellular binding partner Concentrations of less than 100 ng / ml, preferably of less than 10 ng / ml and especially less than 1 ng / ml Result in body fluid.

Beispiele geeigneter pharmazeutischer Formulierungen sind fe ste Arzneiformen, wie Pulver, Puder, Granulate, Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien oder vaginale Arzneiformen, halbfeste Arzneiformen, wie Salben, Cremes, Hydrogele, Pasten oder Pflaster, sowie flüssige Arzneiformen, wie Lösungen, Emulsionen, insbesondere Öl-in-Wasser-Emulsionen, Suspensio nen, beispielsweise Lotionen, Injektions- und Infusionszube reitungen, Augen- und Ohrentropfen, zu nennen. Die Verabrei chung erfindungsgemäßer Bindungspartner durch implantierte Abgabevorrichtungen ist möglich, ferner können auch Liposo men, Mikrosphären oder Polymermatrizes angewandt werden.Examples of suitable pharmaceutical formulations are fe medicinal forms, such as powders, powders, granules, tablets, Coated tablets, capsules, suppositories or vaginal dosage forms, semi-solid dosage forms, such as ointments, creams, hydrogels, pastes or plasters, as well as liquid pharmaceutical forms, such as solutions, Emulsions, especially oil-in-water emulsions, suspensions NEN, for example lotions, injection and infusion accessories horse riding, eye and ear drops. The disposition binding partner according to the invention by implanted Dispensing devices are possible, and Liposo can also be used men, microspheres or polymer matrices are used.

Zu pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder üblichen Hilfs stoffen zählen beispielsweise Antioxidantien, Antireizstoffe, Chelatbildner, Desinfektionsmittel, Dispergiermittel, Dra gierhilfsmittel, Emulgatoren, Emulsionsstabilisatoren, gege benenfalls ethoxylierte und/oder propoxylierte Fettalkohole, Fettamine, Fettaminoxide, Fettsäurealkylolamide, Fettsäuree ster, Fettsäuren, Feuchthaltemittel, Filmbildner, Gelbildner, Geruchsmaskierungsmittel, Geschmackskorrigentien, Harze, Hy drokolloide, Konservierungsmittel, Lösemittel, Lösungsver mittler, Netzmittel, Neutralisierungsmittel, Permeationsbe schleuniger, Pigmente, Protein-Derivate und/oder -Hydrolysate, quaternäre Ammoniumverbindungen, Rückfettungs- und Überfettungsmittel, Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe, Salbengrundlagen, Silikon-Derivate, Spreithilfsmittel, Stabi lisatoren, Sterilanzien, Suppositoriengrundlagen, Suspendier mittel, Tabletten-Hilfsstoffe, wie Bindemittel, Füllstoffe, Gleitmittel, Sprengmittel oder Überzüge, Tone, Treibstoffe, Trocknungsmittel, Trübungsmittel, Verdickungsmittel, Wachse, Weichmacher, Weissöle. Ausgestaltungen dieser Art beruhen auf fachmännischem Wissen und sind beispielsweise in Fiedler, H. P., Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und an grenzende Gebiete, 4. Auflage, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor- Verlag, 1996, dargestellt.To pharmaceutically acceptable carriers or usual auxiliaries substances include, for example, antioxidants, anti-irritants, Chelating agents, disinfectants, dispersants, Dra yawing aids, emulsifiers, emulsion stabilizers, opp optionally ethoxylated and / or propoxylated fatty alcohols, Fatty amines, fatty amine oxides, fatty acid alkylolamides, fatty acids ster, fatty acids, humectants, film formers, gel formers, Odor masking agents, taste correctives, resins, hy drocolloids, preservatives, solvents, solvent ver medium, wetting agent, neutralizing agent, permeation agent accelerators, pigments, protein derivatives and / or -Hydrolysates, quaternary ammonium compounds, refatting and superfatting agents, ointment, cream or oil base materials, Ointment bases, silicone derivatives, spreading aids, stabilizers lisators, sterilizers, suppository bases, suspenders medium, tablet excipients, such as binders, fillers, Lubricants, disintegrants or coatings, clays, fuels, Desiccants, opacifiers, thickeners, waxes, Plasticizers, white oils. Refinements of this type are based on professional knowledge and are for example in Fiedler, H. P., Lexicon of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and an bordering areas, 4th edition, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor- Verlag, 1996.

Sofern es sich bei dem Bindungspartner um ein Peptid handelt, kann das erfindungsgemäße Verfahren auch darin bestehen, dass ein zur Expression dieses Peptids befähigtes System, in der Regel ein geeignetes Vektor-System, mit HCV-infizierten bzw. mit HCV-Replikon-RNA transfizierten Zellen in Kontakt ge bracht wird. Vorzugsweise werden geeignete Nukleinsäurekon strukte in die HCV-infizierten bzw. mit HCV-Replikon-RNA transfizierten Zellen eingeschleust, in denen dann das Peptid exprimiert wird. Dafür können verschiedene physikalische Me thoden verwendet werden, z. B. liposomen, virosomen- oder li gandenvermittelte Gentransfers, oder Viren, wie Retro-, Fla vi-, Adeno-, Adenoassoziierte oder Herpesviren. Dem Fachmann sind Massnahmen zur gewebsspezifischen Infektion und/oder Ex pression bekannt.If the binding partner is a peptide, The method according to the invention can also consist in that a system capable of expressing this peptide, in which Usually a suitable vector system with HCV-infected or cells transfected with HCV replicon RNA is brought. Suitable nucleic acids are preferably used structures in the HCV-infected or with HCV replicon RNA transfected cells, in which then the peptide is expressed. Various physical me methods are used, e.g. B. liposomes, virosomes or li gene-mediated gene transfers, or viruses such as retro, fla vi, adeno, adeno associated or herpes viruses. The specialist are measures for tissue-specific infection and / or ex known pression.

Ein peptidischer Bindungspartner kann auch direkt oder an Träger, beispielsweise Liposomen, gekoppelt, in die Virusin fizierten Zellen eingeschleust werden.A peptide binding partner can also be direct or attached Carriers, for example liposomes, coupled into the virus infected cells.

Aufgrund der kompetitiven oder allosterischen Hemmung der Bindung zwischen HCV-NS2 und Jiv sind die erfindungsgemäßen Bindungspartner und pharmazeutischen Mittel, die wenigstens einen erfindungsgemäßen Bindungspartner enthalten, und das erfindungsgemäße Verfahren zur intra- und/oder extrazellulä ren kompetitiven oder allosterischen Hemmung der Bindung zwi schen HCV-NS2 und Jiv zur Prävention, Diagnose und/oder Be handlung von HCV-Erkrankungen geeignet. Because of the competitive or allosteric inhibition of the Binding between HCV-NS2 and Jiv are those of the invention Binding partners and pharmaceutical agents that at least contain a binding partner according to the invention, and that Process according to the invention for intra- and / or extracellular ren competitive or allosteric inhibition of binding between HCV-NS2 and Jiv for prevention, diagnosis and / or treatment suitable for treatment of HCV diseases.

legends

Fig. 1A Proteinsequenz des NS2 Proteins des HCV Stamms BK (Aminosäuren 1-217) weitgehend identisch zu der veröffent lichten Sequenz des HCV Subtyps 1B (Takamizewa et al., 1991) Fig. 1A protein sequence of the NS2 protein of the HCV BK strain (residues 1-217) is substantially identical to the published sequence of the clear HCV subtype 1B (Takamizewa et al., 1991)

Fig. 1B Aminosäuresequenz des NS2 Proteins des BVDV CP7ins- (Aminosäuren 1-444) (Tautz et al., 1996) Fig. 1B amino acid sequence of the NS2 protein of BVDV CP7ins- (amino acids 1-444) (Tautz et al., 1996)

Fig. 2A Aminosäuresequenz des bovinen Jiv Proteins aus Mardin Darby bovine Kidney (MDBK) Zellen Fig. 2A amino acid sequence of the bovine Jiv protein from Mardin Darby bovine Kidney (MDBK) cells

Fig. 2B Aminosäuresequenz des erfindungsgemäß als Jiv90 bezeichneten Bereichs des bovinen Jiv (Jiv-Aminosäuren 533-622) FIG. 2B amino acid sequence of the region according to the invention as designated Jiv90 of bovine Jiv (Jiv amino acids 533-622)

Fig. 3 Vergleich der humanen und der bovinen Jiv90 Aminosäuresequenz (Aminosäuren 533-622) Fig. 3 Comparison of human and bovine Jiv90 amino acid sequence (amino acids 533-622)

Fig. 4 Regulation der NS2-3 Spaltung des BVDV in MBDK_Tet-On/Jiv Zellen Fig. 4 Regulation of NS2-3 cleavage of BVDV in MBDK _Tet-On / Jiv cells

Fig. 5 Nachweis der Interaktion zwischen BVDV-NS2 und Jiv durch Kopräzipitation beider Proteine im GST-pull down Assay Fig. 6 Nachweis der Interaktion zwischen HCV-NS2 und Jiv durch Kopräzipitation beider Proteine im GST-pull down Assay Fig. 5 Detection of the interaction between BVDV NS2 and Jiv by co-precipitation of both proteins in the GST-pull down assay Fig. 6 Detection of the interaction between HCV NS2 and Jiv by co-precipitation of both proteins in the GST-pull down assay

Examples

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläu tern, ohne sie zu beschränken.The following examples are intended to explain the invention in more detail without restricting them.

example 1

Die Regulierung der NS2-3 Spaltung des BVDV in MBDK_Tet-On/Jiv Zellen wurde mittels Westernblot untersucht (Fig. 4).The regulation of the NS2-3 cleavage of the BVDV in MBDK _Tet-On / Jiv cells was examined by means of Western blot ( FIG. 4).

Die MBDK_Tet-on/Jiv Zellinie wurden mit Hilfe des Tet-On-Systems hergestellt. Hierfür wurde die für den offenen Leserahmen des Jiv kodierende cDNA-Sequenz in das Tet-On Expressionsplasmid pTRE ligiert. Das resultierende Plasmid pTRE/Jiv wurde zusam men mit einem Expressionsplasmid welches eine Puromycin- Resistenz vermittelt in die Zelllinie MBDK_Tet-On transfiziert, welche konstitutiv das rtTA Aktivatorprotein exprimiert (Gos sen et al., 1995). Die Transfektion erfolgte mittels Elektro poration (Tautz et al., 1999). Die Selektion der Zellinien erfolgte unter 1 g/l G418 (Calbiochem, Frankfurt, Germany). In der MBDK_Tet-On/Jiv Zelllinie kommt es durch Zugabe des In duktors Doxycyclin (Dox) zu einer regulierten Überexpression des vollständigen bovinen Jiv Proteins.The MBDK _Tet-on / Jiv cell line was manufactured using the Tet-On system. For this, the cDNA sequence coding for the open reading frame of the Jiv was ligated into the Tet-On expression plasmid pTRE. The resulting plasmid pTRE / Jiv was transfected together with an expression plasmid which mediates puromycin resistance into the cell line MBDK _Tet-On , which constitutively expresses the rtTA activator protein (Gos sen et al., 1995). The transfection was carried out by means of electro poration (Tautz et al., 1999). The cell lines were selected under 1 g / l G418 (Calbiochem, Frankfurt, Germany). In the MBDK _Tet-On / Jiv cell line, the addition of the inductor doxycycline (Dox) leads to a regulated overexpression of the complete bovine Jiv protein.

Nach der Lyse der Zellen erfolgte die elektrophoretische Auf trennung der Proteine in 8% Polyacrylamid Tricin SDS-Gelen (Schägger und Jagow, 1997). Nach der Auftrennung im Polyacry lamid Tricin SDS-Gel wurden die Proteine mit einer "Semi- Dry"-Elektroblot Apparatur (BIORAD, München) auf Nitrozellulose-Membran (Optitran BA-S83 reinforced NC: Schleicher & Schuell, Düren, Germany) transferiert. Um unspezifische Bin dungstellen zu blockieren, wurde die Membran für 1 h mit 3% (w/v) Magermilchpulver in TPBS (0,05% Tween-20 in PBS [8 g/l NaCl; 0,2 g/l KCl; 1,44 g/l Na₂HPO₄; 0,24 g/l KH₂PO₄; pH 7,4]) behandelt. Der Nachweis von Jiv erfolgte mit einem Jiv- spezifischen Kaninchenserum (1 : 10000 in TPBS), einem sekundä ren, Peroxidase-gekoppelten anti-Kaninchen Antikörper (1 : 10000 in TPBS; Dianova, Hamburg) und dem Renaissance We stern Blot Chemiluminescence Reagent Plus (NEN, Life Scien ces, Boston, MA).After the cells had been lysed, the proteins were electrophoretically separated in 8% polyacrylamide tricin SDS gels (Schägger and Jagow, 1997). After separation in the polyacrylamide Tricin SDS gel, the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane (Optitran BA-S83 reinforced NC: Schleicher & Schuell, Düren, Germany) using a "semi-dry" electroblot apparatus (BIORAD, Munich). To block nonspecific binding sites, the membrane was washed for 1 h with 3% (w / v) skim milk powder in TPBS (0.05% Tween-20 in PBS [8 g / l NaCl; 0.2 g / l KCl; 1 , 44 g / l Na ₂ HPO ₄ ; 0.24 g / l KH ₂ PO ₄ ; pH 7.4]). Jiv was detected with a Jiv-specific rabbit serum (1: 10000 in TPBS), a secondary, peroxidase-coupled anti-rabbit antibody (1: 10000 in TPBS; Dianova, Hamburg) and the Renaissance We stern Blot Chemiluminescence Reagent Plus (NEN, Life Sciences, Boston, MA).

Aufgrund der Infektion der Zellen mit dem BVDV Stamm NCP7 kommt es zur Expression des NS2-3 Proteins welches im We sternblot (s. o.) durch einen NS3-spezifischen monoklonalen Antikörper (mAb 8.12.7; 1 : 200 in TPBS; [Corapi et al., 1990]) einem sekundären, Peroxidase-gekoppelten anti-Maus Antikörper (1 : 10000 in TPBS; Dianova, Hamburg) und dem Renaissance We stern Blot Chemiluminescence Reagent Plus (NEN, Life Scien ces) nachgewiesen wurdeDue to the infection of the cells with the BVDV strain NCP7 there is expression of the NS2-3 protein which is in We sternblot (see above) by an NS3-specific monoclonal Antibodies (mAb 8.12.7; 1: 200 in TPBS; [Corapi et al., 1990]) a secondary, peroxidase-coupled anti-mouse antibody (1: 10000 in TPBS; Dianova, Hamburg) and the Renaissance We stern Blot Chemiluminescence Reagent Plus (NEN, Life Science ces) has been demonstrated

Results

In der MBDK_Tet-On/Jiv Zelllinie kommt es durch Zugabe des In duktors Doxycyclin (Dox) zu einer regulierten Überexpression des vollständigen bovinen Jiv Proteins. Die Dox-abhängige Zunahme der Jiv-Expression ist in der oberen Hälfte des gezeig ten Westernblots zu sehen. (Fig. 4, oberer Teil)In the MBDK _Tet-On / Jiv cell line, the addition of the inductor doxycycline (Dox) leads to a regulated overexpression of the complete bovine Jiv protein. The Dox-dependent increase in Jiv expression can be seen in the upper half of the Western blot shown. ( Fig. 4, upper part)

Aufgrund der Infektion der Zellen mit dem BVDV Stamm NCP7 kommt es zur Expression des NS2-3 Proteins. Mit steigender Dox-Konzentration kommt es in diesen Zellen zu einer gestei gerten Jiv-Expression (s. o.) und einer Zunahme der NS2-3- Spaltung; letztere zeigt sich in der Zunahme der NS3-Menge und einer Abnahme der NS2-3-Menge (Fig. 4, unterer Teil).The infection of the cells with the BVDV strain NCP7 leads to the expression of the NS2-3 protein. With increasing Dox concentration, there is an increased Jiv expression (see above) and an increase in NS2-3 cleavage in these cells; the latter is shown in the increase in the amount of NS3 and a decrease in the amount of NS2-3 ( FIG. 4, lower part).

Example 2

Nachweis der Interaktion zwischen BVDV-NS2 und Jiv durch Ko präzipitation beider Proteine im GST-pull down Assay (Fig. 5)Evidence of the interaction between BVDV-NS2 and Jiv by co-precipitation of both proteins in the GST pull-down assay ( FIG. 5)

Die Expression der Proteine erfolgte in baby hamster kidney (BHK) Zellen welche mit dem Vaccinia Virus MVA-T7Pol (Sutter et al., 1995) infiziert wurden; das Vaccinia Virus MVA-T7Pol exprimiert die T7 RNA Polymerase in diesen Zellen. Für die Expression wurden folgende Expressionskonstrukte genutzt (Die offenen Leseraster werden durch Kästen symbolisiert; TM: pu tative Transmembranregion; J: J-Domäne; Jiv90: Jiv90 Domäne entspricht den Aminosäuren 533-622 des Jiv Proteins; GST: Gluthation-S-Transferase):
pFlag-NS2: in den Vektor pCITE-2A wurde das NS2 Gen des BVDV CP7ins- (Aminosäuren 1137-1580) (Tautz et al., 1996) (s. Fig. 1B) unter der Kontrolle des T7 RNA Polymerase Promotors (T7 Promotor) kloniert. Um einen spezifischen Nachweis von NS2 zu erlauben und die Immunpräzipitation zu erleichtern wurde vor das Leseraster des NS2 eine Sequenz kloniert welche für ein sogenanntes Flag-Epitop kodiert.
pGST-Jiv: im Vektor pCITE-2A ist das Gen für die Gluthation- S-Transferase (GST) gefolgt vom offenen Leseraster des bo vinen Jiv Proteins unter die Kontrolle des T7 Promoters klo niert.
pGST-Jiv90: im Vektor pCITE-2A ist das Gen für die Gluthati on-S-Transferase (GST) gefolgt von den Kodons 533-622 des of fenen Leseraster des bovinen Jiv Proteins unter die Kontrolle des T7 Promotors kloniert.The proteins were expressed in baby hamster kidney (BHK) cells which were infected with the vaccinia virus MVA-T7Pol (Sutter et al., 1995); the vaccinia virus MVA-T7Pol expresses the T7 RNA polymerase in these cells. The following expression constructs were used for expression (the open reading frames are symbolized by boxes; TM: pu tative transmembrane region; J: J domain; Jiv90: Jiv90 domain corresponds to amino acids 533-622 of the Jiv protein; GST: gluthation-S-transferase) :
pFlag-NS2: In the vector pCITE-2A, the NS2 gene of BVDV CP7ins- (amino acids 1137-1580) (Tautz et al., 1996) (see FIG. 1B) was controlled by the T7 RNA polymerase promoter (T7 promoter ) cloned. In order to allow a specific detection of NS2 and to facilitate immunoprecipitation, a sequence was cloned in front of the reading frame of the NS2 which codes for a so-called flag epitope.
pGST-Jiv: in the vector pCITE-2A the gene for the gluthation-S-transferase (GST) followed by the open reading frame of the bovine Jiv protein is cloned under the control of the T7 promoter.
pGST-Jiv90: in the vector pCITE-2A the gene for glutathon-S-transferase (GST) followed by codons 533-622 of the open reading frame of the bovine Jiv protein is cloned under the control of the T7 promoter.

Protein expression and immunoprecipitation

Nach Transfektion der Zellen mit den beschriebenen cDNA Kon strukten kommt es zur Expression der kodierten Proteine Flag- NS2, GST-Jiv oder GST-Jiv90. Durch Zugabe von 70 µCi [35S] markiertem Methionin und Cystein (NEN, Life Sciences) je ml Medium, kommt es zur Synthese radioaktiver Proteine welche sich durch Immunpräzipitation (IP) nachweisen lassen. Für die IP wurden mit Hilfe des RIPA Puffers [50 mN Tris-HCl (pN 8.0), 150 mN NaCl, 1% (V/V) NP-40, 1% (W/V) Deoxycholat, 0.1% (W/V) SDS, 0.5 mN PefablocSC (Merck, Darmstadt, Ger many)] Zelllysate unter nicht denaturierenden Bedingungen hergestellt. Zur Präzipitation der GST-Fusionsprotein GST-Jiv und GST-Jiv90 wurde ein GST-spezifischer monoklonaler Antikörper (mAk) eingesetzt (Sigma) während zum Nachweis des Flag-NS2 ein Flag-Epitop spezifischer mAk (Sigma) eingesetzt wurde. Die Inkubation erfolgte bei 4°C für 1 h. Nach Präzipi tation der Antikörper/Protein-Komplexe durch Protein-A- Sepharose (Sigma) und dreimaligen Waschen mit RIPA-Puffer wurden die Aggregate durch kochen gelöst, in 10% Polyacryla mid Tricin SDS-Gelen aufgetrennt und für die Fluorographie mit Enlightning solution (NEN Life Science, Zavantem, Belgi um) vorbereitet.After transfection of the cells with the cDNA Kon structs there are expression of the coded proteins Flag- NS2, GST-Jiv or GST-Jiv90. By adding 70 µCi [35S] labeled methionine and cysteine (NEN, Life Sciences) per ml Medium, radioactive proteins are synthesized which can be demonstrated by immunoprecipitation (IP). For the IP were determined using the RIPA buffer [50 mN Tris-HCl (pN 8.0), 150 mN NaCl, 1% (v / v) NP-40, 1% (w / v) deoxycholate, 0.1% (W / V) SDS, 0.5 mN PefablocSC (Merck, Darmstadt, Ger many)] cell lysates under non-denaturing conditions manufactured. For the precipitation of the GST fusion protein GST-Jiv and GST-Jiv90 became a GST-specific monoclonal antibody (mAk) used (Sigma) while to detect the Flag-NS2 uses a flag-epitope-specific mAb (Sigma) has been. Incubation was at 4 ° C for 1 h. According to Precise tation of the antibody / protein complexes by protein A Sepharose (Sigma) and wash three times with RIPA buffer the aggregates were dissolved by boiling in 10% polyacryla separated with Tricin SDS gels and for fluorography with Enlightning solution (NEN Life Science, Zavantem, Belgi um) prepared.

Results

Der mAk gegen GST präzipitiert aus Zellen in denen GST-Jiv und Flag-NS2 exprimiert wurden sowohl GST-Jiv als auch Flag- NS2 (Fig. 5, unterer Teil Spur 6); ebenso präzipitiert der gegen das Flag-Epitop gerichtete mAk Flag-NS2 und GST-Jiv (Fig. 5, unterer Teil Spur 5). Analoge Ergebnisse wurden für Zellen erhalten in denen Flag-NS2 und GST-Jiv90 exprimiert wurden (Fig. 5, unterer Teil Spuren 9, 10). Hingegen konnte aus Zellen in welchen nur Flag-NS2 exprimiert wurde mit dem GST spezifischen mAk kein Flag-NS2 präzipitiert werden (Fig. 5, unterer Teil Spur 3). Aus Zellen in denen nur GST-Jiv bzw. GST-Jiv90 exprimiert wurde erfolgte mit dem Flag-Epitop spezifischen mAk keine Präzipitation von GST-Jiv oder GST- Jiv90 (Fig. 5, unterer Teil Spuren 8, 12). The mAb against GST precipitated from cells in which GST-Jiv and Flag-NS2 were expressed, both GST-Jiv and Flag-NS2 ( FIG. 5, lower part lane 6); likewise the mAb directed against the flag epitope precipitates Flag-NS2 and GST-Jiv ( FIG. 5, lower part lane 5). Analogous results were obtained for cells in which Flag-NS2 and GST-Jiv90 were expressed ( FIG. 5, lower part lanes 9, 10). On the other hand, no flag NS2 could be precipitated from cells in which only flag NS2 was expressed with the GST-specific mAb ( FIG. 5, lower part lane 3). From cells in which only GST-Jiv or GST-Jiv90 was expressed, there was no precipitation of GST-Jiv or GST-Jiv90 with the flag-epitope-specific mAb ( FIG. 5, lower part lanes 8, 12).

Diese Daten beweisen eine spezifische Interaktion zwischen Jiv bzw. Jiv90 und dem NS2 Protein von BVDV (Flag-NS2).These data demonstrate a specific interaction between Jiv or Jiv90 and the NS2 protein from BVDV (Flag-NS2).

Example 3 Detection of the interaction between HCV-NS2 and Jiv by co-precipitation of both proteins in the GST pull-down assay ( FIG. 6)

Proteinexpression und Immunpräzipitation erfolgte analog zu Beispiel 2. Zur Expression des NS2 Proteins bzw. Teilen des NS3 Proteins von HCV BK wurden folgende Expressionskonstrukte eingesetzt (Die offenen Leseraster werden durch Kästen symbo lisiert; siehe Beispiel 2):
pFlag-HCV-NS2-3-His: in pCITE-2A wurde das vollständige NS2 Gen des HCV Stamms BK (217 Kodons) einkloniert; auf das NS2 Gen folgen 213 Kodons der NS3 kodierende Sequenz.; vor das Leseraster des HCV-NS2 wurde eine Sequenz kloniert welche für ein sogenanntes Flag-Epitop kodiert. Auf das NS3 Fragment folgen 3 vektorkodierte Aminosäuren, ein Hexa-His-Tag und ein Stop Kodon.Protein expression and immunoprecipitation were carried out analogously to Example 2. The following expression constructs were used to express the NS2 protein or parts of the NS3 protein from HCV BK (the open reading frames are symbolized by boxes; see Example 2):
pFlag-HCV-NS2-3-His: the complete NS2 gene of HCV strain BK (217 codons) was cloned into pCITE-2A; the NS2 gene is followed by 213 codons of the NS3 coding sequence .; in front of the reading frame of the HCV-NS2, a sequence was cloned which codes for a so-called flag epitope. The NS3 fragment is followed by 3 vector-encoded amino acids, a hexa-His tag and a stop codon.

Protein expression and immunoprecipitation (see also example 2)

Zur Präzipitation des GST-Fusionsproteins GST-Jiv90 wurde ein GST-spezifischer mAk eingesetzt während zum Nachweis von Flag-HCV-NS2 und Flag-HCV-NS2-3-His ein Flag-Epitop spezifi scher mAk eingesetzt wurde. A was used to precipitate the GST fusion protein GST-Jiv90 GST-specific mAb used during the detection of Flag-HCV-NS2 and Flag-HCV-NS2-3-His specified a flag epitope shear mAb was used.

Results

Der mAk gegen GST präzipitiert aus Zellen in denen GST-Jiv90 und Flag-HCV-NS2-3-His exprimiert würden sowohl GST-Jiv90 als auch Flag-HCV-NS2 und Flag-HCV-NS2-3-His (Fig. 6, unterer Teil Spur 3); ebenso präzipitiert der gegen das Flag-Epitop gerichtete mAk Flag-HCV-NS2 und Flag-HCV-NS2-3-His und GST- Jiv90 (Fig. 6, unterer Teil Spur 4). Hingegen konnte aus Zellen in welchen nur Flag-HCV-NS2-3-His exprimiert wurde mit dem GST spezifischen mAk weder Flag-HCV-NS2 noch Flag-HCV- NS2-3-His präzipitiert werden (Fig. 6, unterer Teil Spur 6). Aus Zellen in denen nur GST-Jiv90 exprimiert wurde erfolgte mit dem Flag-Epitop spezifischen mAk keine Präzipitation von GST-Jiv90 (Fig. 6, unterer Teil Spur 1).The mAb against GST precipitated from cells in which GST-Jiv90 and Flag-HCV-NS2-3-His were expressed, both GST-Jiv90 and Flag-HCV-NS2 and Flag-HCV-NS2-3-His ( FIG. 6, lower part lane 3); likewise the mAb directed against the flag epitope precipitates Flag-HCV-NS2 and Flag-HCV-NS2-3-His and GST-Jiv90 ( FIG. 6, lower part lane 4). In contrast, from cells in which only Flag-HCV-NS2-3-His was expressed, neither Flag-HCV-NS2 nor Flag-HCV-NS2-3-His could be precipitated with the GST-specific mAb ( FIG. 6, lower part lane 6 ). From cells in which only GST-Jiv90 was expressed, there was no precipitation of GST-Jiv90 with the flag epitope-specific mAb ( FIG. 6, lower part lane 1).

Diese Daten beweisen eine spezifische Interaktion zwischen Jiv90 und dem HCV-NS2 Protein. These data demonstrate a specific interaction between Jiv90 and the HCV-NS2 protein.

literature

Behrens, S.-E., Grassmann, C. W., Thiel, H.-J., Meyers, G. and Tautz, N. (1998) Characterization of an autonomous subgenomic pestivirus RNA replicon. J Virol, 72, 2364-2372.
Corapi, W. V., Donis, R. O. and Dubovi, E. J. (1990) Characteri zation of a panel of monoclonal antibodies and their use in the study of the antigenic diversity of bovine viral diarrhea virus. Am J Vet Res, 51, 1388-1394.
Flexner, C. (2000) Dual protease inhibitor therapy in HIV- infected patients: pharmacologic rationale and clinical bene fits. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 40, 649-74.
Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W. and Bujard, H. (1995) Transcriptional activation by tetra cyclines in mammalian cells. Science, 268, 1766-9.
Grakoui, A., McCourt, D. W., Wychowski, C., Feinstone, S. M. and Rice, C. (1993) A second hepatitis C virus-encoded pro teinase. Proc Natl Acad Sci USA, 90, 10583-10587.
Heinz, F. X., Collett, M. S., Purcell, R. H., Gould, E. A., How ard, C. R., Houghton, M., Moormann, J. M., Rice, C. M. and Thiel, H.-J. (2000) Family Flaviviridae. In M. H. V., R.v., Fauquet, C. M., Bishop, D. H. L., Carstens, E. B., Estes, M. K., Lemon, S. M., Maniloff, J., Mayo, M. A., McGeoch, D. J., Prin gle, C. R. and Wickner, R. B. (eds.), Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, USA, pp. 859-878.
Hijikata, M., Mizushima, H., Akagi, T., Mori, S., Kakiuchi, N., Kato, N., Tanaka, T., Kimura, K. and Shimotohno, K. (1993) Two distinct proteinase activities required for the processing of a putative nonstructural precursor protein of hepatitis C virus. J Virol, 67, 4665-4675.
Kolykhalov, A. A., Mihalik, K., Feinstone, S. M. and Rice, C. M. (2000) Hepatitis C Virus-Encoded Enzymatic Activities and Conserved RNA Elements in the 3' Nontranslated Region Are Es sential for Virus Replication In Vivo. J Virol, 74, 2046- 2051.
Kümmerer, B. M. and Meyers, G. (2000) Correlation between point mutations in NS2 and the viability and cytopathogenic ity of bovine viral diarrhea virus strain Oregon analyzed with an infectious cDNA clone. J Virol, 74, 390-400.
Lohmann, V., Körner, F., Koch, J.-O., Herian, U., Theilmann, L. and Bartenschlager, R. (1999) Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science, 285, 110-113.
Mendez, E., Ruggli, N., Collett, M. S. and Rice, C. M. (1998) Infectious bovine viral diarrhea virus (strain NADL) RNA from stable cDNA clones: a cellular insert determines NS3 produc tion and viral cytopathogenicity. J Virol, 72, 4737-45.
Pieroni, L., Santolini, E., Fipaldini, C., Pacini, L., Migliaccio, G. and La Monica, N. (1997) In vitro study of the NS2-3 protease of hepatitis C virus. J Virol, 71, 6373-80.
Rice, C. M. (1996) Flaviviridae: The viruses and their repli cation. In Fields, B. N., Knipe, D. M. and Howley, P. M. (eds.), Fields Virology. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, New York, Vol. 1, pp. 931-959.
Sutter, G., Ohlmann, M. and Erfle, V. (1995) Non-replicating vaccinia vector efficiently expresses bacteriophage T7 RNA polymerase. FEBS Letters, 371, 9-12.
Takamizawa, A., Mori, C., Fuke, I., Manabe, S., Murakami, S., Fujita, J., Onishi, E., Andoh, T., Yoshida, I. and Okayama, H. (1991) Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers. J Virol, 65, 1105-13.
Tautz, N., Meyers, G., Stark, R., Dubovi, E. J. and Thiel, H.- J. (1996) Cytopathogenicity of a pestivirus correlated with a 27 nucleotide insertion. J Virol, 70, 7851-7858.
Tautz, N., Harada, T., Kaiser, A., Rinck, G., Behrens, S. E. and Thiel, H.-J. (1999) Establishment and characterization of cytopathogenic and noncytopathogenic pestivirus replicons. J Virol, 73, 9422-9432.
Taylor, D. R. (2000) Hepatitis C virus: evasion of the inter feron-induced antiviral response. J Mol Med, 78, 182-90.
Wang, Q. M. and Heinz, B. A. (2000) Recent advances in preven tion and treatment of hepatitis C virus infections. Prog Drug Res, 55, 1-32.Behrens, S.-E., Grassmann, CW, Thiel, H.-J., Meyers, G. and Tautz, N. (1998) Characterization of an autonomous subgenomic pestivirus RNA replicon. J Virol, 72, 2364-2372.
Corapi, WV, Donis, RO and Dubovi, EJ (1990) Characterization of a panel of monoclonal antibodies and their use in the study of the antigenic diversity of bovine viral diarrhea virus. Am J Vet Res, 51, 1388-1394.
Flexner, C. (2000) Dual protease inhibitor therapy in HIV-infected patients: pharmacologic rationale and clinical bene fits. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 40, 649-74.
Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W. and Bujard, H. (1995) Transcriptional activation by tetra cyclines in mammalian cells. Science, 268, 1766-9.
Grakoui, A., McCourt, DW, Wychowski, C., Feinstone, SM and Rice, C. (1993) A second hepatitis C virus-encoded pro teinase. Proc Natl Acad Sci USA, 90, 10583-10587.
Heinz, FX, Collett, MS, Purcell, RH, Gould, EA, How ard, CR, Houghton, M., Moormann, JM, Rice, CM and Thiel, H.-J. (2000) Family Flaviviridae. In MHV, Rv, Fauquet, CM, Bishop, DHL, Carstens, EB, Estes, MK, Lemon, SM, Maniloff, J., Mayo, MA, McGeoch, DJ, Prin gle, CR and Wickner, RB (eds.) , Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, USA, pp. 859-878.
Hijikata, M., Mizushima, H., Akagi, T., Mori, S., Kakiuchi, N., Kato, N., Tanaka, T., Kimura, K. and Shimotohno, K. (1993) Two distinct proteinase activities required for the processing of a putative nonstructural precursor protein of hepatitis C virus. J Virol, 67, 4665-4675.
Kolykhalov, AA, Mihalik, K., Feinstone, SM and Rice, CM (2000) Hepatitis C Virus-Encoded Enzymatic Activities and Conserved RNA Elements in the 3 'Nontranslated Region Are Es sential for Virus Replication In Vivo. J Virol, 74, 2046-2051.
Kümmerer, BM and Meyers, G. (2000) Correlation between point mutations in NS2 and the viability and cytopathogenic ity of bovine viral diarrhea virus strain Oregon analyzed with an infectious cDNA clone. J Virol, 74, 390-400.
Lohmann, V., Körner, F., Koch, J.-O., Herian, U., Theilmann, L. and Bartenschlager, R. (1999) Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science, 285, 110-113.
Mendez, E., Ruggli, N., Collett, MS and Rice, CM (1998) Infectious bovine viral diarrhea virus (strain NADL) RNA from stable cDNA clones: a cellular insert determines NS3 production and viral cytopathogenicity. J Virol, 72, 4737-45.
Pieroni, L., Santolini, E., Fipaldini, C., Pacini, L., Migliaccio, G. and La Monica, N. (1997) In vitro study of the NS2-3 protease of hepatitis C virus. J Virol, 71, 6373-80.
Rice, CM (1996) Flaviviridae: The viruses and their repli cation. In Fields, BN, Knipe, DM and Howley, PM (eds.), Fields Virology. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, New York, Vol. 1, pp. 931-959.
Sutter, G., Ohlmann, M. and Erfle, V. (1995) Non-replicating vaccinia vector efficiently expresses bacteriophage T7 RNA polymerase. FEBS Letters, 371, 9-12.
Takamizawa, A., Mori, C., Fuke, I., Manabe, S., Murakami, S., Fujita, J., Onishi, E., Andoh, T., Yoshida, I. and Okayama, H. ( 1991) Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers. J Virol, 65, 1105-13.
Tautz, N., Meyers, G., Stark, R., Dubovi, EJ and Thiel, H.- J. (1996) Cytopathogenicity of a pestivirus correlated with a 27 nucleotide insertion. J Virol, 70, 7851-7858.
Tautz, N., Harada, T., Kaiser, A., Rinck, G., Behrens, SE and Thiel, H.-J. (1999) Establishment and characterization of cytopathogenic and noncytopathogenic pestivirus replicons. J Virol, 73, 9422-9432.
Taylor, DR (2000) Hepatitis C virus: evasion of the inter feron-induced antiviral response. J Mol Med, 78, 182-90.
Wang, QM and Heinz, BA (2000) Recent advances in preven tion and treatment of hepatitis C virus infections. Prog Drug Res, 55, 1-32.

Claims

1. binding partner for HCV-NS2, characterized in that it inhibits the binding of Jiv to HCV-NS2 competitively or allosterically.

2. attachment partner for Jiv, characterized in that he the binding of HCV-NS2 to Jiv competitive or allosteric inhibits.

3. Binding partner according to claim 1, characterized in that it binds to a part of the amino acid sequence shown in Fig. 1 1 to 217 or homologous sequences thereof.

4. binding partner according to any one of claims 1 to 3, characterized characterized that it is a peptide, a peptoid, a organic or inorganic substance.

5. A method for intra- and / or extracellular competitive or allosteric inhibition of the binding between HCV-NS2 and Jiv, characterized in that at least one

a) binding partner for HCV-NS2, which competitively or allosterically inhibits the binding of Jiv to HCV-NS2 and / or
b) Binding partner for Jiv, which competitively or allosterically inhibits the binding of HCV-NS2 to Jiv, in contact with HCV-infected / HCV replicon-RNA-transfected cells and / or HCV-NS2 from body fluid.

6. The method according to claim 5, characterized in that it the binding partner is a peptide whose cDNA or mRNA in the HCV infected / HCV replicon RNA transfected cells is introduced and expressed.

7. The method according to claim 5, characterized in that it the binding partner is a peptide or peptoid delt, which is coupled to a carrier in the HCV-infected / HCV replicon RNA transfected cells are introduced.

8. Use of at least one binding partner of the claims 1 to 4 for the prevention, diagnosis and / or treatment of HCV Diseases.

9. Pharmaceutical composition containing at least one bin end partner of claims 1 to 4 in a pharmaceutical acceptable carrier and / or excipient.

10. Method for overexpression of Jiv protein, characterized by the following steps

a) Construction of a Jiv coding cDNA sequence and insertion into an expression vector
b) transfection of the vector into a host cell
c) Cultivation of the transfected host cell and start of overexpression by adding an inductor
d) extraction and purification of the recombinant protein produced.

11. Use of a protein according to claim 10 for Prevention, diagnosis and therapy of HCV diseases.