DE10111877A1 - Neue Imidazolidinderivate, ihre Herstellung, ihre Verwendung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Imidazolidinderivate der Formel I DOLLAR F1 in der A, E, Z, R·1·, R·2·, R·3·, R·4· und R·5· die in den Ansprüchen angegebenen Bedeutungen haben. Die Verbindungen der Formel I sind wertvolle Arzneimittelwirkstoffe, die sich zum Beispiel für die Behandlung von Entzündungserkrankungen, beispielsweise der rheumatoiden Arthritis, oder von allergischen Erkrankungen eignen. Die Verbindung der Formel I sind Inhibitoren der Adhäsion und Migration von Leukozyten und/oder Antagonisten des zur Gruppe der Integrine gehörenden Adhäsionsrezeptoren VLA-4. Sie eignen sich generell zur Behandlung von Krankheiten, die durch ein unerwünschtes Ausmaß an Leukozytenadhäsion und/oder Leukozytenmigration verursacht werden oder damit verbunden sind oder bei denen Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Interaktionen eine Rolle spielen, die auf Wechselwirkungen von VLA-4-Rezeptoren mit ihren Liganden beruhen. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, ihre Verwendung und pharmazeutische Präparate, die Verbindungen der Formel I enthalten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Imidazolidinderivate der Formel I,

in der A, E, Z, R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ die unten angegebenen Bedeutungen haben. Die Verbindungen der Formel I sind wertvolle Arzneimittelwirkstoffe, die sich zum Beispiel für die Behandlung von Entzündungserkrankungen, beispielsweise der rheumatoiden Arthritis, oder von allergischen Erkrankungen eignen. Die Verbindungen der Formel I sind Inhibitoren der Adhäsion und Migration von Leukozyten und/oder Antagonisten des zur Gruppe der Integrine gehörenden Adhäsionsrezeptors VLA-4. Sie eignen sich generell zur Behandlung von Krankheiten, die durch ein unerwünschtes Ausmaß an Leukozytenadhäsion und/oder Leukozytenmigration verursacht werden oder damit verbunden sind oder bei denen Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Interaktionen eine Rolle spielen, die auf Wechselwirkungen von VLA-4-Rezeptoren mit ihren Liganden beruhen. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, ihre Verwendung und pharmazeutische Präparate, die Verbindungen der Formel I enthalten.

Die Integrine sind eine Gruppe von Adhäsionsrezeptoren, die bei Zell-Zell-bindenden und Zell-Extrazelluläre Matrix-bindenden Prozessen eine wesentliche Rolle spielen. Sie weisen eine αβ-heterodimere Struktur auf und zeigen eine weite zelluläre Verbreitung und ein hohes Maß an evolutiver Konservierung. Zu den Integrinen gehört zum Beispiel der Fibrinogen-Rezeptor auf Thrombozyten, der vor allem mit der RGD-Sequenz des Fibrinogens interagiert, oder der Vitronectin-Rezeptor auf Osteoclasten, der vor allem mit der RGD-Sequenz des Vitronectins oder des Osteopontins interagiert. Man teilt die Integrine in drei Großgruppen ein, die β2- Unterfamilie mit den Vertretern LFA-1, Mac-1 und p150/95, die insbesondere für Zell- Zell-Interaktionen des Immunsystems verantwortlich sind, und die Unterfamilien β1 und β3, deren Vertreter hauptsächlich die Zellanheftung an Komponenten der extrazellulären Matrix vermitteln (Ruoslahti, Annu. Rev. Biochem. 1988, 57, 375). Die Integrine der β1-Unterfamilie, auch VLA-Proteine (very late (activation) antigen) genannt, umfassen mindestens sechs Rezeptoren, die spezifisch mit Fibronektin, Kollagen und/oder Laminin als Liganden interagieren. Innerhalb der VLA-Familie ist das Integrin VLA-4 (α4β1) insofern untypisch, als es hauptsächlich auf lymphoide und myeloide Zellen begrenzt ist und bei diesen verantwortlich ist für Zell-Zell- Interaktionen mit einer Vielzahl von anderen Zellen. VLA-4 vermittelt zum Beispiel die Interaktion von T- und B-Lymphozyten mit dem Heparin II-Bindungsfragment von humanem Plasmafibronektin (FN). Die Bindung von VLA-4 mit dem Heparin II- Bindungsfragment des Plasmafibronektins beruht vor allem auf einer Interaktion mit einer LDVP-Sequenz. Im Unterschied zum Fibrinogen- oder Vitronectin-Rezeptor ist VLA-4 kein typisches RGD-bindendes Integrin (Kilger und Holzmann, J. Mol. Meth. 1995, 73, 347).

Die im Blut zirkulierenden Leukozyten zeigen normalerweise nur eine geringe Affinität zu den vaskulären endothelialen Zellen, die die Blutgefäße auskleiden. Zytokine, die von entzündetem Gewebe abgegeben werden, bewirken die Aktivierung von Endothelzellen und damit die Expression einer Vielzahl von Zelloberflächenantigenen. Diese umfassen zum Beispiel die Adhäsionsmoleküle ELAM-1 (endothelial cell adhesion molecule-1; auch als E-Selektin bezeichnet), das unter anderem Neutrophile bindet, ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1), das mit LFA-1 (leucocyte function-associated antigen 1) auf Leukozyten interagiert, und VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1), das verschiedene Leukozyten, unter anderem Lymphozyten, bindet (Osborn et al., Cell 1989, 59, 1203). VCAM-1 ist, wie ICAM-1, ein Mitglied der Immunglobulin-Gen-Überfamilie. Identifiziert wurde VCAM-1 (zuerst bekannt als INCAM-110) als ein Adhäsionsmolekül, daß auf endothelialen Zellen durch Entzündungs-Zytokine wie TNF und IL-1 und Lipopolysaccharide (LPS) induziert wird. Elices et al. (Cell 1990, 60, 577) zeigten, daß VLA-4 und VCAM-1 ein Rezeptor-Ligand-Paar bilden, das die Anheftung von Lymphozyten an aktiviertes Endothel vermittelt. Die Bindung von VCAM-1 an VLA-4 erfolgt dabei nicht durch eine Interaktion des VLA-4 mit einer RGD-Sequenz, eine solche ist im VCAM-1 nicht enthalten (Bergelson et al., Current Biology 1995, 5, 615). VLA-4 tritt aber auch auf anderen Leukozyten auf, und über den VCAM-1/VLA-4-Adhäsionsmechanismus wird auch die Anheftung von anderen Leukozyten als Lymphozyten vermittelt. VLA-4 repräsentiert somit ein einzelnes Beispiel eines β1-Integrin-Rezeptors, der über die Liganden VCAM-1 bzw. Fibronektin sowohl bei Zell-Zell-Interaktionen als auch bei Zell-Extrazellulärer Matrix-Interaktionen eine wesentliche Rolle spielt.

Die Zytokin-induzierten Adhäsionsmoleküle spielen eine wichtige Rolle bei der Rekrutierung von Leukozyten in extravaskuläre Gewebebereiche. Leukozyten werden in entzündliche Gewebebereiche durch Zelladhäsionsmoleküle rekrutiert, die auf der Oberfläche von endothelialen Zellen exprimiert werden und als Liganden für Leukozyten-Zelloberflächen-Proteine oder -Proteinkomplexe (Rezeptoren) dienen (die Begriffe Ligand und Rezeptor können auch vice versa verwendet werden). Leukozyten aus dem Blut müssen zunächst an endotheliale Zellen anheften, bevor sie in das Synovium auswandern können. Da VCAM-1 an Zellen bindet, die das Integrin VLA-4 (α4β1) tragen, wie Eosinophile, T- und B-Lymphozyten, Monozyten oder Neutrophile, kommt ihm und dem VCAM-1/VLA-4-Mechanismus die Funktion zu, derartige Zellen aus dem Blutstrom in Infektionsgebiete und Entzündungsherde zu rekrutieren (Elices et al., Cell 1990, 60, 577; Osborn, Cell 1990, 62, 3; Issekutz et al., J. Exp. Med. 1996, 183, 2175).

Der VCAM-1/VLA-4-Adhäsionsmechanismus wurde mit einer Reihe von physiologischen und pathologischen Prozessen in Verbindung gebracht. VCAM-1 wird außer von Zytokin-induziertem Endothel unter anderem noch von den folgenden Zellen exprimiert: Myoblasten, lymphoiden dendritischen Zellen und Gewebsmakrophagen, rheumatöidem Synovium, Zytokin-stimulierten Neuralzellen, parietalen Epithelzellen der Bowmans Kapsel, dem renalen Tubularepithel, entzündetem Gewebe bei Herz- und Nieren-Transplantat-Abstoßung und von fntestinalgewebe bei Graft versus host-Krankheit. VCAM-1 findet man auch exprimiert auf solchen Gewebearealen des arteriellen Endotheliums, die frühen atherosklerotischen Plaques eines Kaninchenmodells entsprechen. Zusätzlich wird VCAM-1 auf follikulären dendritischen Zellen von humanen Lymphknoten exprimiert und findet sich auf Stromzellen des Knochenmarks, zum Beispiel in der Maus. Letzterer Befund weist auf eine Funktion von VCAM-1 in der B-Zell-Entwicklung hin. VLA-4 wird, außer auf Zellen haematopoetischen Ursprunges, auch zum Beispiel auf Melanoma-Zellinien gefunden, und der VCAM-1/VLA-4-Adhäsionsmechanismus wird mit der Metastasierung von solchen Tumoren in Verbindung gebracht (Rice et al., Science 1989, 246, 1303).

Die hauptsächliche Form, in der VCAM-1 in vivo auf endothelialen Zellen vorkommt und die die dominante Form in vivo ist, wird als VCAM-7D bezeichnet und trägt sieben Immunglobulin-Domänen. Die Domänen 4, 5 und 6 ähneln in ihren Aminosäuresequenzen den Domänen 1, 2 und 3. Die vierte Domäne ist bei einer weiteren, aus sechs Domänen bestehenden Form, hier als VCAM-6D bezeichnet, durch alternatives Splicing entfernt. Auch VCAM-6D kann VLA-4-exprimierende Zellen binden.

Weitere Angaben zu VLA-4, VCAM-1, Integrinen und Adhäsionsproteinen finden sich zum Beispiel in den Artikeln von Kilger und Holzmann, J. Mol. Meth. 1995, 73, 347; Elices, Cell Adhesion in Human Disease, Wiley, Chichester 1995, S. 79; Kuijpers, Springer Semin. Immunopathol. 1995, 16, 379.

Aufgrund der Rolle des VCAM-1/VLA-4-Mechanismus bei Zelladhäsionsprozessen, die von Bedeutung zum Beispiel bei Infektionen, Entzündungen oder Atherosklerose sind, wurde versucht, durch Eingriffe in diese Adhäsionsprozesse Krankheiten zu bekämpfen, insbesondere zum Beispiel Entzündungen (Osborn et al., Cell 1989, 59, 1203). Eine Methode hierzu ist die Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die gegen VLA-4 gerichtet sind. Derartige monoklonale Antikörper (mAK), die als VLA-4- Antagonisten die Interaktion zwischen VCAM-1 und VLA-4 blockieren, sind bekannt. So inhibieren zum Beispiel die anti-VLA-4 mAK HP2/1 und HP1/3 die Anheftung von VLA-4 exprimierenden Ramos-Zellen (B-Zell-ähnlichen Zellen) an humane Nabelschnurendothelzellen und an VCAM-1-transfizierte COS-Zellen. Ebenso inhibiert der anti-VCAM-1 mAK 4B9 die Adhäsion von Ramos-Zellen, Jurkat-Zellen (T-Zell-ähnlichen Zellen) und HL60-Zellen (Granulozyten-ähnlichen Zellen) an COS- Zellen transfiziert mit genetischen Konstrukten, die veranlassen, daß VCAM-6D und VCAM-7D exprimiert werden. In vitro-Daten mit Antikörpern, die gegen die α4- Untereinheit von VLA-4 gerichtet sind, zeigen, daß die Anheftung von Lymphozyten an synoviale Endothelzellen blockiert wird, eine Adhäsion, die bei der rheumatoiden Arthritis eine Rolle spielt (von Dinther-Janssen et al., J. Immunol. 1991, 147, 4207).

In vivo-Versuche haben gezeigt, daß eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis durch anti-α4 mAK gehemmt werden kann. Die Wanderung von Leukozyten in einen Entzündungsherd wird ebenfalls durch einen monoklonalen Antikörper gegen die α4-Kette von VLA-4 blockiert. Die Beeinflussung des VLA-4- abhängigen Adhäsionsmechanismus mit Antikörpern wurde auch in einem Asthma- Modell untersucht, um die Rolle von VLA-4 bei der Rekrutierung von Leukozyten in entzündetes Lungengewebe zu untersuchen (WO-A-93/13798). Die Gabe von anti- VLA-4-Antikörpern inhibierte die Spätphasenreaktion und die Atemwegsüberreaktion in allergischen Schafen. Die Bedeutung von VLA-4 als Target zur Behandlung von Asthma ist ausführlich in Metzger, Springer Semin. Immunopathol. 1995, 16, 467 diskutiert.

Der VLA-4 abhängige Zelladhäsionsmechanismus wurde ebenfalls in einem Primatenmodell der inflammatory bowel disease (IBD) untersucht. In diesem Modell, das der ulcerativen Colitis im Menschen entspricht, ergab die Gabe von anti-α4- Antikörpern eine signifikante Reduktion der akuten Entzündung.

Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß die VLA-4-abhängige Zelladhäsion bei den folgenden klinischen Konditionen einschließlich der folgenden chronischen entzündlichen Prozesse eine Rolle spielt: Rheumatoide Arthritis (Cronstein und Weismann, Arthritis Rheum. 1993, 36, 147; Elices et al., J. Clin. Invest. 1994, 93, 405), Diabetes mellitus (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 10494), systemischer Lupus erythematosus (Takeuchi et al., J. Clin. Invest. 1993, 92, 3008), Allergien vom verzögerten Typ (Typ IV-Allergie) (Elices et al., Clin. Exp. Rheumatol. 1993, 11, S77), multiple Sklerose (Yednock et al., Nature 1992, 356, 63), Malaria (Ockenhouse et al., J. Exp. Med. 1992, 176, 1183), Atherosklerose (OBrien et al., J. Clin. lnvest. 1993, 92, 945; Shih et al., Circ. Res. 1999, 84, 345), Transplantation (Isobe et al., Transplantation Proceedings 1994, 26, 867), verschiedene Malignitäten, zum Beispiel Melanom (Renkonen et al., Am. J. Pathol. 1992, 140, 763), Lymphom (Freedman et al., Blood 1992, 79, 206) und andere (Albelda et al., J. Cell Biol. 1991, 114, 1059).

Die VLA-4-Wechselwirkung mit VCAM-1 und Fibronektin wird mit einigen patho­ physiologischen Prozessen in Herzkreislauferkrankungen in Verbindung gebracht. In einem in vitro-Zellsystem hemmen eingewanderte Neutrophile die Zellverkürzung (negative Inotropie) von Kardiomyozyten um 35%. Diese negative inotrope Wirkung von Neutrophilen konnte durch einen anti-α4 Antikörper gehemmt werden, nicht jedoch durch einen anti-CD18 Antikörper (Poon et al., Circ. Res. 1999, 84, 1245). Die Bedeutung von VLA-4 in der Pathogenese der Atherosklerose wurde in einem Mausmodell der Atherosklerose gezeigt. So hemmt das CS-1-Peptid, das gegen die Bindungsstelle von VLA-4 auf Fibronectin gerichtet ist, die Rekrutierung von Leukozyten und die Ansammlung von Fett in der Aorta und somit die Ausbildung von atherosklerotischen Plaques in atherogen gefütterten LDL-Rezeptor-knockout- Mäusen (Shih et al., Circ. Res. 1999, 84, 345). Unter Verwendung des gleichen CS- 1-Peptids konnte weiterhin in einem heterotopen Herztransplantationsmodell im Kaninchen gezeigt werden, daß durch die Blockade der Interaktion von VLA-4 und Fibronektin die Ausbildung einer Transplantatvaskulopathie signifikant vermindert werden kann (Molossi et al., J. Clin. Invest. 1995, 95, 2601).

Eine VLA-4-Blockierung durch geeignete Antagonisten bietet danach effektive therapeutische Möglichkeiten, insbesondere zum Beispiel verschiedene entzündliche Konditionen einschließlich Asthma und IBD zu behandeln. Die besondere Relevanz von VLA-4-Antagonisten für die Behandlung der rheumatoiden Arthritis ergibt sich dabei, wie bereits gesagt, aus der Tatsache, daß Leukozyten aus dem Blut zunächst an endotheliale Zellen anheften müssen, ehe sie in das Synovium auswandern können, und daß bei dieser Anheftung der VLA-4-Rezeptor eine Rolle spielt. Darauf, daß durch Entzündungsagenzien auf endothelialen Zellen VCAM-1 induziert wird (Osborn, Cell 1990, 62, 3; Stoolman, Cell 1989, 56, 907), und auf die Rekrutierung verschiedener Leukozyten in Infektionsgebiete und Entzündungsherde wurde bereits oben eingegangen. T-Zellen adherieren dabei an aktiviertes Endothel hauptsächlich über die LFA-1/ICAM-1- und VLA-4/VCAM-1-Adhäsionsmechanismen (Springer, Cell 1994, 76, 301). Auf den meisten synovialen T-Zellen ist die Bindungskapazität von VLA-4 für VCAM-1 bei der rheumatoiden Arthritis erhöht (Postigo et al., J. Clin. Invest. 1992, 89, 1445). Zusätzlich wurde eine verstärkte Anheftung von synovialen T-Zellen an Fibronektin beobachtet (Laffon et al., J. Clin. Invest. 1991, 88, 546; Morales-Ducret et al., J. Immunol. 1992, 149, 1424). VLA-4 ist also hochreguliert sowohl im Rahmen seiner Expression als auch hinsichtlich seiner Funktion auf T- Lymphozyten der rheumatoiden Synovialmembran. Die Blockierung der Bindung von VLA-4 an seine physiologischen Liganden VCAM-1 und Fibronektin ermöglicht eine effektive Verhinderung oder Linderung von artikulären Entzündungsprozessen. Dies wird auch durch Experimente mit dem Antikörper HP2/1 an Lewis-Ratten mit Adjuvanz-Arthritis bestätigt, bei denen eine effektive Krankheitsprävention beobachtet wurde (Barbadillo et al., Springer Semin. Immunopathol. 1995, 16, 427). CS-1-Peptidomimetika, die eine Asparaginsäureeinheit oder ein Derivat davon im Molekül enthalten und die die Bindung von VLA-4 an die CS-1-Sequenz des Matrixproteins Fibronektin hemmen, werden in der WO-A-00/02903 beschrieben. VLA-4 stellt also ein wichtiges therapeutisches Zielmolekül dar.

Die oben erwähnten VLA-4-Antikörper und der Einsatz von Antikörpern als VLA-4- Antagonisten sind in den Patentanmeldungen WO-A-93/13798, WO-A-93/15764, WO-A-94/16094, WO-A-94/17828 und WO-A-95/19790 beschrieben. In den Patentanmeldungen WO-A-94/15958, WO-A-95/15973, WO-A-96/00581, WO-A- 96/06108 und WO-A-96/20216 werden peptidische Verbindungen als VLA-4- Antagonisten beschrieben. Der Einsatz von Antikörpern und peptidischen Verbindungen als Arzneimitteln ist aber mit Nachteilen behaftet, zum Beispiel mangelnder oraler Verfügbarkeit, leichter Abbaubarkeit oder immunoger Wirkung bei längerfristiger Anwendung, und es besteht somit Bedarf nach VLA-4-Antagonisten mit einem günstigen Eigenschaftsprofil für einen Einsatz in der Therapie und Prophylaxe verschiedener Kranheitszustände.

In der WO-A-95/14008, WO-A-93/18057, US-A-5 658 935, US-A-5 686 421, US-A- 5 389 614, US-A-5 397 796, US-A-5 424 293 und US-A-5 554 594 sind substituierte 5-Ring-Heterocyclen beschrieben, die am N-terminalen Ende des Moleküls eine Amino-, Amidino- oder Guanidinofunktion aufweisen und die thrombozytenaggregationshemmende Wirkungen zeigen. In der EP-A-796 855 sind weitere Heterocyclen beschrieben, die Inhibitoren der Knochenresorption sind. In der EP-A-842 943, EP-A-842 945 und EP-A-842 944 wird beschrieben, daß Verbindungen aus diesen Reihen und weitere Verbindungen überraschenderweise auch die Leukozytenadhäsion hemmen und VLA-4-Antagonisten sind.

In der EP-A-903 353, EP-A-905 139 und EP-A-918 059, WO-99/23063, WO-A- 99/24398, WO-A-99/54321 und WO-A-99/60015 werden weitere Verbindungen beschrieben, die die Leukozytenadhäsion hemmen und VLA-4-Antagonisten sind. Die Eigenschaften dieser Verbindungen sind aber in verschiedener Hinsicht noch nicht befriedigend und es besteht Bedarf an Verbindungen mit einem weiter verbesserten Eigenschaftsprofil. In der EP-A-918 059 werden unter anderem Imidazolidinderivate erwähnt, in denen der Imidazolidinring über seine 1-Position an das Kohlenstoffatom in der 2-Position einer 2-(Cycloalkyl-alkyl)-acetylamino-Einheit oder einer 2-Isobutyl-acetylamino-Einheit gebunden ist. Nicht spezifisch offenbart werden aber die Imidazolidinderivate der Formel I der vorliegenden Erfindung, die sich durch ihr vorteilhaftes Eigenschaftsprofil und insbesondere durch ihre deutlich gesteigerte Wirkstärke auszeichnen.

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel I,

worin
A für Cyclopropylmethyl- oder Isobutyl steht;
E für -CO-R⁶, -CO-H oder -CH₂-O-R⁷ steht;
Z für Sauerstoff oder Schwefel steht;
R¹ für Wasserstoff oder Methyl steht;
R² für Phenyl, Pyridyl oder (C₁-C₄)-Alkyl steht, wobei der Alkylrest durch ein oder mehrere Fluoratome substituiert sein kann und der Phenylrest durch einen oder mehrere gleiche oder verschiedene Substituenten aus der Reihe (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁- C₄)-Alkoxy, Methylendioxy, Ethylendioxy, Halogen, Trifluormethyl und Trifluormethoxy substituiert sein kann;
R³ und R⁴ für Methyl oder Trifluormethyl stehen;
R⁵ für Wasserstoff oder (C₁-C₄)-Alkyl steht, wobei der Alkylrest durch ein oder mehrere Fluoratome substituiert sein kann;
R⁶ für Hydroxy, (C₁-C₁₀)-Alkoxy, Phenyl-(C₁-C₈)-alkoxy-, Phenyloxy-, (C₁-C₈)- Alkylcarbonyloxy-(C₁-C₆)-alkoxy-, Phenylcarbonyloxy-(C₁-C₆)-alkoxy-, Phenyl-(C₁- C₆)-alkylcarbonyloxy-(C₁-C₆)-alkoxy-, (C₁-C₈)-Alkoxycarbonyloxy-(C₁-C₆)-alkoxy-, Phenyloxycarbonyloxy-(C₁-C₆)-alkoxy-, Phenyl-(C₁-C₆)-alkoxycarbonyloxy-(C₁-C₆)- alkoxy-, Amino, Mono-((C₁-C₁₀)-alkyl)-amino- oder Di-((C₁-C₁₀)-alkyl)-amino- steht;
R⁷ für Wasserstoff oder (C₁-C₄)-Alkyl steht;
in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

Alkylreste können geradkettig oder verzweigt sein. Dies gilt auch, wenn sie Substituenten tragen oder als Substituenten anderer Reste auftreten, beispielsweise in Fluoralkylresten, Alkoxyresten oder Alkoxycarbonylresten. Beispiele für Alkylreste sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl (= 1-Methylethyl = iC₃H₇), n-Butyl, Isobutyl (= 2-Methylpropyl, sec-Butyl (= 1-Methylpropyl), tert-Butyl (= 1,1-Dimethylethyl), n- Pentyl, Isopentyl, tert-Pentyl, Neopentyl, n-Hexyl, 3-Methylpentyl, Isohexyl, Neohexyl, n-Heptyl, 2,3,5-Trimethylhexyl, n-Octyl, n-Nonyl, n-Decyl. Bevorzugte Alkylreste sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl. In Alkylresten können ein oder mehrere, zum Beispiel 1, 2, 3, 4 oder 5, Wasserstoffatome durch Fluoratome substituiert sein. Beispiele für solche Fluoralkylreste sind Trifluormethyl, 2,2,2-Trifluorethyl, Pentafluorethyl, Heptafluorisopropyl. Substituierte Alkylreste, zum Beispiel Phenylalkylreste oder Fluoralkylreste, können in beliebigen Positionen substituiert sein.

Phenylreste können unsubstituiert sein oder einfach oder mehrfach, zum Beispiel einfach, zweifach, dreifach, vierfach oder fünffach, durch gleiche oder verschiedene Reste substituiert sein. Wenn ein Phenylrest substituiert ist, trägt er bevorzugt einen oder zwei gleiche oder verschiedene Substituenten. Dies gilt ebenso für substituierte Phenylreste in Gruppen wie Phenylalkyl, Phenylcarbonyl, etc. Phenylalkylreste sind zum Beispiel Benzyl, 1-Phenylethyl oder 2-Phenylethyl, insbesondere Benzyl, die alle auch substituiert sein können.

In monosubstituierten Phenylresten kann sich der Substituent in der 2-Position, der 3-Position oder der 4-Position befinden. Zweifach substituiertes Phenyl kann in 2,3- Position, 2,4-Position, 2,5-Position, 2,6-Position, 3,4-Position oder 3,5-Position substituiert sein. In dreifach substituierten Phenylresten können sich die Substituenten in 2,3,4-Position, 2,3,5-Position, 2,4,5-Position, 2,4,6-Position, 2,3,6- Position oder 3,4,5-Position befinden. Trägt ein Phenylrest Substituenten aus der Reihe Methylendioxy (-O-CH₂-O-) und Ethylendioxy (-O-CH₂-CH₂-O-), so trägt er bevorzugt nur einen Substituenten aus dieser Reihe (gewünschtenfalls neben anderen Substituenten).

Beispiele für substituierte Phenylreste, die für R² stehen können, sind 2- Methylphenyl, 3-Methylphenyl, 4-Methylphenyl, 2,3-Dimethylphenyl, 2,4- Dimethylphenyl, 2,5-Dimethylphenyl, 2,6-Dimethylphenyl, 3,4-Dimethylphenyl, 3,5- Dimethylphenyl, 2,4,5-Trimethylphenyl, 2,4,6-Trimethylphenyl, 3,4,5-Trimethylphenyl, 2-(n-Butyl)phenyl, 3-(n-Butyl)phenyl, 4-(n-Butyl)phenyl, 2-Isobutylphenyl, 3- Isobutylphenyl, 4-Isobutylphenyl, 3-tert-Butylphenyl, 4-tert-Butylphenyl, 2- Methoxyphenyl, 3-Methoxyphenyl, 4-Methoxyphenyl, 2,3-Dimethoxyphenyl, 2,4- Dimethoxyphenyl, 2,5-Dimethoxyphenyl, 2,6-Dimethoxyphenyl, 3,4- Dimethoxyphenyl, 3,5-Dimethoxyphenyl, 2,4,5-Trimethoxyphenyl, 2,4,6- Trimethoxyphenyl, 3,4,5-Trimethoxyphenyl, 2-(n-Butoxy)phenyl, 3-(n-Butoxy)phenyl, 4-(n-Butoxy)phenyl, 2-Isobutoxyphenyl, 3-Isobutoxyphenyl, 4-Isobutoxyphenyl, 2-tert- Butoxyphenyl, 3-tert-Butoxyphenyl, 4-tert-Butoxyphenyl, 2,3-Methylendioxyphenyl, 3,4-Methylendioxyphenyl, 2,3-Ethyfendioxyphenyl, 3,4-Ethylendioxyphenyl, 2- Fluorphenyl, 3-Fluorphenyl, 4-Fluorphenyl, 2,3-Difluorphenyl, 2,4-Difluorphenyl, 2,5- Difluorphenyl, 2,6-Difluorphenyl, 3,4-Difluorphenyl, 3,5-Difluorphenyl, 2,4,5- Trifluorphenyl, 2,4,6-Trifluorphenyl, 3,4,5-Trifluorphenyl, 2,3,5,6-Tetrafluorphenyl, 2,3,4,5,6-Pentafluorphenyl, 2-Chlorphenyl, 3-Chlorphenyl, 4-Chlorphenyl, 2,3- Dichlorphenyl, 2,4-Dichlorphenyl, 2,5-Dichlorphenyl, 2,6-Dichlorphenyl, 3,4- Dichlorphenyl, 3,5-Dichlorphenyl, 2-Bromphenyl, 3-Bromphenyl, 4-Bromphenyl, 3- fodphenyl, 4-Iodphenyl, 2-Trifluormethylphenyl, 3-Trifluormethylphenyl, 4- Trifluormethylphenyl, 3,4-Bis(trifluormethyl)phenyl, 3,5-Bis(trifluormethyl)phenyl, 2- Trifluormethoxyphenyl, 3-Trifluormethoxyphenyl, 4-Trifluormethoxyphenyl, etc. In substituierten Phenylresten können aber auch verschiedene Substituenten in beliebiger Kombination enthalten sein, wie zum Beispiel in den Resten 3-Methoxy-4- methylphenyl, 4-Fluor-3-methoxyphenyl, 3-Fluor-4-methoxyphenyl, 3,5-Difluor-4- methoxyphenyl, 3-Fluor-4,5-methylendioxyphenyl, 3-Fluor-4,5-ethylendioxyphenyl, 2- Chlor-3-methylphenyl, 3-Chlor-4-methylphenyl, 3-Chlor-4-fluorphenyl, etc.

Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom oder Iod, bevorzugt für Fluor oder Chlor
Pyridyl steht für 2-Pyridyl, 3-Pyridyl oder 4-Pyridyl. In Pyridylresten kann das Stickstoffatom auch oxidiert sein und die entsprechende Verbindung der Formel I kann als Pyridin-N-oxid vorliegen, das ebenso von der vorliegenden Erfindung umfaßt wird.

Physiologisch verträgliche Salze der Verbindungen der Formel I sind insbesondere nicht-toxische oder pharmazeutisch verwendbare Salze. Verbindungen der Formel I, die saure Gruppen enthalten, zum Beispiel eine für die Gruppe E stehende Carbonsäuregruppe, können beispielsweise vorliegen als Alkalimetallsalze oder Erdalkalimetallsalze wie zum Beispiel Natriumsalze, Kaliumsalze, Magnesiumsalze und Calciumsalze, oder als Ammoniumsalze wie zum Beispiel Salze mit physiologisch verträglichen quartären Ammoniumionen und Säureadditionssalze mit Ammoniak und physiologisch verträglichen organischen Aminen, wie zum Beispiel Methylamin, Ethylamin, Triethylamin, 2-Hydroxyethylamin, Tris-(2-hydroxyethyl)-amin, α,α,α-Tris-(hydroxymethyl)-methylamin (Tromethamin) oder Aminosäuren, insbesondere basischen Aminosäuren. Salze aus einer sauren Verbindung der Formel I und einem organischen Amin können die beiden Komponenten im Verhältnis 1 : 1 oder ca. 1 : 1 enthalten oder auch in einem anderen Verhältnis, beispielsweise in einem Verhältnis von ca. 1 : 0.5 bis ca. 1 : 4 (1 Molekül der Formel I auf 0.5 bis 4 Moleküle des Amins), insbesondere in einem Verhältnis von ca. 1 : 0.5 bis ca. 1 : 2 (1 Molekül der Formel I auf 0.5 bis 2 Moleküle des Amins).

Verbindungen der Formel I, die basische Gruppen enthalten, zum Beispiel eine Pyridylgruppe, können zum Beispiel vorliegen als Salze mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, und mit organischen Carbonsäuren oder Sulfonsäuren, wie zum Beispiel Essigsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Methansulfonsäure oder p-Toluolsulfonsäure. Verbindungen, die sowohl saure Gruppen als auch basische Gruppen enthalten, können auch in Form von inneren Salzen, Zwitterionen oder Betainen vorliegen, die ebenso von der vorliegenden Erfindung umfaßt werden.

Salze können aus den Verbindungen der Formel I nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden, beispielsweise durch Vereinigung mit einer organischen oder anorganischen Säure oder Base in einem Lösungsmittel oder Verdünnungsmittel, oder auch durch Anionenaustausch oder Kationenaustausch aus anderen Salzen.

Die Verbindungen der Formel I können in stereoisomeren Formen vorliegen. An allen Asymmetriezentren in den Verbindungen der Formel I können unabhängig voneinander die S-Konfiguration oder die R-Konfiguration vorliegen oder R/S- Gemische vorliegen. Es kann also das asymmetrische Kohlenstoffatom, an das der Rest R² gebunden ist, R-Konfiguration oder S-Konfiguration aufweisen oder die Verbindung der Formel I kann hinsichtlich dieses Kohlenstoffatoms als R/S-Gemisch vorliegen. Ebenso kann das asymmetrische Kohlenstoffatom, an das die Gruppe A und der Imidazolidinring gebunden sind, die R-Konfiguration oder S-Konfiguration aufweisen oder die Verbindung der Formel I kann hinsichtlich dieses Kohlenstoffatoms als R/S-Gemisch vorliegen. Auch alle anderen asymmetrischen Kohlenstoffatome können die R-Konfiguration oder die S-Konfiguration aufweisen oder die Verbindung der Formei I hinsichtlich kann jedes dieser Kohlenstoffatome als R/S-Gemisch vorliegen.

Zur Erfindung gehören alle möglichen Stereoisomeren der Verbindungen der Formel I, zum Beispiel reine oder weitgehend reine Enantiomere und reine oder weitgehend reine Diastereomere und Mischungen von zwei oder mehr stereoisomeren Formen, zum Beispiel Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren, in allen Verhältnissen. Enantiomere sind also in enantiomerenreiner Form, sowohl als linksdrehende als auch als rechtsdrehende Antipoden, in Form von Racematen und in Form von Mischungen der beiden Enantiomeren in allen Verhältnissen Gegenstand der Erfindung. Ebenso sind Diastereomere in diastereomerenreiner Form und in Form von Mischungen in allen Verhältnissen Gegenstand der Erfindung. Beispiele für einzelne Stereoisomere, die Gegenstand der Erfindung sind, sind die Verbindungen der Formeln 1a, 1b, 1c und 1d.

Die Herstellung von einzelnen Stereoisomeren kann gewünschtenfalls durch Verwendung von stereochemisch einheitlichen Ausgangssubstanzen bei der Synthese, durch stereoselektive Synthese oder durch Auftrennung eines Gemisches nach üblichen Methoden, zum Beispiel durch Chromatographie oder Kristallisation, erfolgen, im Fall von Enantiomeren zum Beispiel durch Chromatographie an chiralen Phasen. Gegebenenfalls kann vor einer Trennung von Stereoisomeren eine Derivatisierung erfolgen. Die Trennung eines Stereoisomerengemisches kann auf der Stufe der Verbindungen der Formel I erfolgen oder auf der Stufe einer Ausgangssubstanz oder eines Zwischenprodukts im Verlaufe der Synthese.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I können bewegliche Wasserstoffatome enthalten, also in verschiedenen tautomeren Formen vorliegen.

Auch alle Tautomeren der Verbindungen der Formel I sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Solvate und Additionsverbindungen oder Addukte von Verbindungen der Formel I, zum Beispiel Addukte mit Wasser, das heißt Hydrate, oder Addukte mit Alkoholen oder Aminen. Die Erfindung umfaßt weiterhin Derivate von Verbindungen der Formel I, zum Beispiel Ester, Amide, Prodrugs und andere physiologisch verträgliche Derivate, sowie aktive Metabolite von Verbindungen der Formel I. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere auch Prodrugs der Verbindungen der Formel I, die in vitro nicht notwendigerweise pharmakologisch aktiv sind, aber die in vivo unter physiologischen Bedingungen in aktive Verbindungen der Formel I umgewandelt werden. Geeignete Prodrugs für die Verbindungen der Formel I, also chemisch modifizierte Derivate der Verbindungen der Formel I mit in gewünschter Weise verbesserten Eigenschaften, sind dem Fachmann bekannt. Nähere Angaben zu Prodrugs finden sich zum Beispiel in Fleisher et al., Advanced Drug Delivery Reviews 19 (1996) 115; Design of Prodrugs, H. Bundgaard, Ed., Elsevier, 1985; H. Bundgaard, Drugs of the Future 16 (1991) 443. Als Prodrugs für die Verbindungen der Formel I kommen speziell Ester- Prodrugs, Amid-Prodrugs, Aldehyd-Prodrugs und Alkohol-Prodrugs von Carbonsäuregruppen in Betracht, zum Beispiel von einer für die Gruppe E stehenden Carbonsäuregruppe. So stellen auch die Verbindungen der Formel I, in denen die Gruppe E für Hydroxymethyl, Alkoxymethyl oder Formyl steht und die in vivo einen VLA-4-Antagonismus zeigen, Prodrugs der Verbindungen der Formel I dar, in denen die Gruppe E für Hydroxycarbonyl steht. Als Beispiele für Ester-Prodrugs und Amid- Prodrugs seien genannt (C₁-C₄)-Alkylester wie Methylester, Ethylester, Isopropylester, Isobutylester, substituierte Alkylester wie Hydroxyalkylester, Acyloxyalkylester, Aminoalkylester, Acylaminoalkylester, Dialkylaminoalkylester, unsubstituierte Amide oder N-(C₁-C₄)-Alkylamide wie Methylamide oder Ethylamide.

Als Beispiele für erfindungsgemäße Verbindungen der Formel I seien die folgenden Verbindungen der Formeln Ie und If genannt, die an dem Kohlenstoffatom, das die Gruppe A trägt, S-Konfiguration aufweisen und an dem Kohlenstoffatom, das die Gruppe R² trägt, im Fall, daß R² für Phenyl steht, S-Konfiguration aufweisen und an dem Kohlenstoffatom, das die Gruppe R² trägt, im Fall, daß R² für Methyl steht, R-Konfiguration aufweisen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls die physiologisch verträglichen Salze der Verbindungen der Formeln Ie und If, zum Beispiel Metallsalze oder Salze mit organischen Ammoniumkationen von Verbindungen der Formeln Ie und If, die eine Carbonsäuregruppe enthalten, oder Säureadditionssalze von Verbindungen der Formeln Ie und If, die Pyridylreste enthalten, zum Beispiel die Hydrochloride.

Verbindungen der Formeln Ie und If:

Die einzelnen Strukturelemente in den erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I haben bevorzugt die folgenden Bedeutungen, die sie unabhängig voneinander haben können.

R² steht bevorzugt für (C₁-C₄)-Alkyl, das durch ein oder mehrere Fluoratome substituiert sein kann, oder für Pyridyl, oder für unsubstituiertes Phenyl, oder für Phenyl, das durch einen Methylendioxyrest oder einen Ethylendioxyrest substituiert ist, oder für Phenyl, das durch eine oder zwei (C₁-C₄)-Alkoxygruppen substituiert ist. Die für R² stehende Alkylgruppe, die gewünschtenfalls durch Fluor substituiert sein kann, ist insbesondere eine der Gruppen Methyl, Ethyl, Isopropyl, Trifluormethyl und 2,2,2-Trifluorethyl. Die Alkoxysubstituenten in einer für R² stehenden Phenylgruppe sind insbesondere Methoxygruppen. Besonders bevorzugt steht R² für Methyl, Pyridyl, unsubstituiertes Phenyl, Phenyl, das durch einen Methylendioxyrest oder einen Ethylendioxyrest substituiert ist oder Phenyl, das durch eine oder zwei Methoxygruppen substituiert ist. Ganz besonders bevorzugt steht R² für Methyl, unsubstituiertes Phenyl oder Pyridyl.

R³ und R⁴ können gleich oder verschieden sein. Bevorzugt sind die beiden Gruppen R³ und R⁴ gleich. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stehen R³ und R⁴ beide für Methyl. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stehen R³ und R⁴ beide für Trifluormethyl.

Eine für R⁵ stehende Alkylgruppe, die durch ein oder mehrere Fluoratome substituiert sein kann, ist bevorzugt eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe oder eine Trifluormethylgruppe. Bevorzugt steht R⁵ für (C₁-C₄)-Alkyl, das durch ein oder mehrere Fluoratome substituiert sein kann. Besonders bevorzugt steht R⁵ für Methyl oder Trifluormethyl, ganz besonders bevorzugt für Methyl.

R⁶ steht bevorzugt für Hydroxy, (C₁-C₆)-Alkoxy-, Phenyl-(C₁-C₄)-alkoxy-, Phenyloxy- oder Amino (-NH₂), besonders bevorzugt für Hydroxy, (C₁-C₆)-Alkoxy- oder Amino, ganz besonders bevorzugt für Hydroxy oder (C₁-C₆)-Alkoxy-, speziell bevorzugt für Hydroxy oder (C₁-C₄)-Alkoxy-, insbesondere für Hydroxy.

R⁷ steht bevorzugt für Wasserstoff oder (C₁-C₃)-Alkyl, besonders bevorzugt für Wasserstoff oder Methyl, ganz besonders bevorzugt für Wasserstoff.

E steht bevorzugt für -CO-R⁶, -CO-H, -CH₂-OH oder -CH₂-OCH₃, besonders bevorzugt für -CO-R⁵, -CH₂-OH oder -CH₂-OCH₃, ganz besonders bevorzugt für -CO-R⁶ oder -CH₂-OH, darüber hinaus bevorzugt für -COOH, -COOC₂H₅, -COOiC₃H₇ oder -CH₂-OH, insbesondere für -COOH.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfndung steht Z für Schwefel, in einer anderen Ausführungsform steht Z für Sauerstoff.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung steht A für den Isobutylrest (2- Methylpropylrest; (CH₃)₂CH-CH₂-), in einer anderen Ausführungsform steht A für den Cyclopropylmethylrest (Cyclopropyl-CH₂-). Weiterhin steht in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung R¹ für Wasserstoff und in einer anderen Ausführungsform R¹ für Methyl.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, die an einem oder an mehreren Chiralitätszentren, zum Beispiel an dem Kohlenstoffatom, das den Rest R² trägt, und/oder an dem Kohlenstoffatom, das den Rest A und den Imidazolidinrest trägt, eine einheitliche Konfiguration aufweisen. Das heißt, Verbindungen sind bevorzugt, die an einem oder mehreren Chiralitätszentren in einheitlicher oder im wesentlichen einheitlicher Konfiguration vorliegen, entweder in der R-Konfiguration oder in der S- Konfiguration, aber nicht als R/S-Gemisch. Wie erläutert können die einzelnen Chiralitätszentren in diesen Verbindungen der Formel I aber unabhängig voneinander die R-Konfiguration oder die S-Konfiguration aufweisen und gleiche oder verschiedene Konfigurationen haben. Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, in denen das Kohlenstoffatom, das den Rest A und den Imidazolidinrest trägt, in der S-Konfiguration vorliegt, also in der Konfiguration hinsichtlich dieses Stereozentrums, die in den Formeln Ia und Ib wiedergegeben ist. Besonders bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel I, in denen das Kohlenstoffatom, das die Gruppe R² trägt, in der in den Formeln Ia und Ic wiedergegebenen Konfiguration vorliegt. Steht R² beispielsweise für Phenyl, substituiertes Phenyl oder Pyridyl, so hat in diesen besonders bevorzugten Verbindungen das Kohlenstoffatom, das die Gruppe R² trägt, S-Konfiguration, steht R² für Methyl, Ethyl oder Isobutyl, so hat es R-Konfiguration. Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, in denen die beiden vorstehend genannten Stereozentren in den in der Formel Ia wiedergegebenen Konfigurationen vorliegen.

Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind solche Verbindungen, in denen einer oder mehrere der Reste bevorzugte Bedeutungen haben oder eine spezifische Bedeutung aus den umfaßten Bedeutungen haben, wobei alle Kombinationen von bevorzugten Bedeutungen und/oder spezifischen Bedeutungen von Resten Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind. Beispiele für bevorzugte Verbindungen sind zum Beispiel Verbindungen, in denen gleichzeitig R¹, R³, R⁴ und R⁵ für Methyl stehen und A für Isobutyl steht, oder Verbindungen, in denen gleichzeitig R¹, R³, R⁴ und R⁵ für Methyl stehen und A für Cyclopropylmethyl- steht, oder Verbindungen, in denen gleichzeitig R¹ für Methyl steht, R³ und R⁴ für Trifluormethyl stehen, R⁵ für Methyl steht und A für Isobutyl steht, oder Verbindungen, in denen gleichzeitig R¹ für Methyl steht, R³ und R⁴ für Trifluormethyl stehen, R⁵ für Methyl steht und A für Cyclopropylmethyl- steht, oder Verbindungen, in denen gleichzeitig R¹ für Wasserstoff steht, R³ und R⁴ für Methyl stehen, R⁵ für Methyl steht und A für Isobutyl steht, oder Verbindungen, in denen gleichzeitig R¹ für Wasserstoff steht, R³ und R⁴ für Methyl stehen, R⁵ für Methyl steht und A für Cyclopropylmethyl- steht, oder Verbindungen, in denen gleichzeitig R¹ für Wasserstoff steht, R³ und R⁴ für Trifluormethyl stehen, R⁵ für Methyl steht und A für Isobutyl steht, oder Verbindungen, in denen gleichzeitig R¹ für Wasserstoff steht, R³ und R⁴ für Trifluormethyl stehen, R⁵ für Methyl steht und A für Cyclopropylmethyl- steht, und die anderen Gruppen die oben angegebenen allgemeinen Bedeutungen in den Verbindungen der Formel I haben oder bevorzugte Bedeutungen haben oder spezifische Bedeutungen aus ihren jeweiligen Definitionen haben.

Besonders bevorzugte Verbindungen sind zum Beispiel Verbindungen der Formel I, worin
A für Cyclopropylmethyl- oder Isobutyl steht;
E für -CO-R⁶ oder -CH₂-OH steht;
Z für Sauerstoff steht;
R¹ für Wasserstoff oder Methyl steht;
R² für Pyridyl, für unsubstituiertes Phenyl, für Phenyl, das durch einen Methylendioxyrest oder einen Ethylendioxyrest substituiert ist, für Phenyl, das durch eine oder zwei (C₁-C₄)-Alkoxygruppen substituiert ist, oder für (C₁-C₄)-Alkyl, das durch ein oder mehrere Fluoratome substituiert sein kann, steht;
R³ und R⁴ für Methyl stehen;
R⁵ für Methyl steht;
R⁶ für Hydroxy, (C₁-C₆)-Alkoxy-, Phenyl-(C₁-C₄)-alkoxy-, Phenyloxy- oder Amino steht;
in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

Ganz besonders bevorzugte Verbindungen sind zum Beispiel Verbindungen der Formel I, worin
A für Cyclopropylmethyl- oder Isobutyl steht;
E für -COOH, -COOC₂H₅, -COOiC₃H₇ oder -CH₂-OH steht;
Z für Sauerstoff steht;
R¹ für Methyl steht;
R² für Pyridyl, für unsubstituiertes Phenyl, für Phenyl, das durch einen Methylendioxyrest oder einen Ethylendioxyrest substituiert ist, für Phenyl, das durch eine oder zwei Methoxygruppen substituiert ist, oder für (C₁-C₄)-Alkyl, das durch ein oder mehrere Fluoratome substituiert sein kann, steht;
R³ und R⁴ für Methyl stehen;
R⁵ für Methyl steht;
in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

Speziell bevorzugte Verbindungen sind zum Beispiel Verbindungen der Formel I, worin
A für Cyclopropylmethyl- oder Isobutyl steht;
E für -COOH, -COOC₂H₅, -COOiC₃H₇ oder -CH₂-OH steht;
Z für Sauerstoff steht;
R¹ für Methyl steht;
R² für unsubstituiertes Phenyl, Pyridyl, Methyl oder 2,2,2-Trifluorethyl steht;
R³ und R⁴ für Methyl stehen;
R⁵ für Methyl steht;
in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

Besonders speziell bevorzugte Verbindungen sind zum Beispiel Verbindungen der Formel I, worin
A für Cyclopropylmethyl- oder Isobutyl steht;
E für -COOH, -COOC₂H₅, -COOiC₃H₇ oder -CH₂-OH steht;
Z für Sauerstoff steht;
R¹ für Methyl steht;
R² für unsubstituiertes Phenyl, Pyridyl oder Methyl steht;
R³ und R⁴ für Methyl stehen;
R⁵ für Methyl steht;
in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

Die vorstehenden Definitionen von Untergruppen der Verbindungen der Formel I gelten analog für Verbindungen der Formel I, in der R³ und R⁴ beide für Trifluormethyl anstatt für Methyl stehen. So sind zum Beispiel besonders speziell bevorzugte Verbindungen auch Verbindungen der Formel I, worin
A für Cyclopropylmethyl- oder Isobutyl steht;
E für -COOH, -COOC₂H₅, -COOiC₃H₇ oder -CH₂-OH steht;
Z für Sauerstoff steht;
R¹ für Methyl steht;
R² für unsubstituiertes Phenyl, Pyridyl oder Methyl steht;
R³ und R⁴ für Trifluormethyl stehen;
R⁵ für Methyl steht;
in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

Die Verbindungen der Formel I können beispielsweise hergestellt werden durch Kondensation einer Verbindung der Formel II

mit einer Verbindung der Formel III,

wobei in den Formeln II und III die Gruppen A, E, Z, R¹ R², R³, R⁴ und R⁵ wie oben angegeben definiert sind oder auch in diesen Gruppen funktionelle Gruppen in geschützter Form oder in Form von Vorstufen enthalten sein können, und wobei G für Hydroxycarbonyl, (C₁-C₅)-Alkoxycarbonyl oder aktivierte Carbonsäurederivate wie Säurechloride oder Aktivester steht.

Bei der Kondensation der Verbindungen der Formeln II und III ist es in der Regel nötig, daß eine vorhandene, nicht an der Kondensationsreaktion beteiligte Carbonsäuregruppe durch eine reversible Schutzgruppe geschützt wird und zum Beispiel in Form eines geeigneten (C₁-C₆)-Alkylesters wie des tert-Butylesters oder als Benzylester vorliegt. Wenn Verbindungen der Formel I hergestellt werden sollen, in denen die Gruppe E zum Beispiel für Hydroxycarbonyl steht oder für eine Gruppe steht, die aus einer Hydroxycarbonylgruppe hergestellt werden soll, kann in den Verbindungen der Formel III beispielsweise der Rest E zunächst für eine in geschützter Form vorliegende Hydroxycarbonylgruppe stehen und dann nach der Kondensation der Verbindungen der Formeln II und III in einem oder mehreren weiteren Schritten die Hydroxycarbonylgruppe freigesetzt werden oder die gewünschte endgültige Gruppe E aufgebaut werden.

Vorstufen von funktionellen Gruppen sind Gruppen, die nach den üblichen, dem Fachmann bekannten Syntheseverfahren in die gewünschte funktionelle Gruppe umgewandelt werden können. Beispielsweise kann eine Cyangruppe, die durch Hydrolyse in eine Carbonsäuregruppe umgewandelt werden kann, als Vorstufe für diese Gruppe bezeichnet werden. Eine Alkoholgruppe, die zu einer Aldehydgruppe oxidiert werden kann, kann als Vorstufe für diese Gruppe bezeichnet werden. Beispiele für Schutzgruppen, die vor Durchführung einer Reaktion oder einer Reaktionsfolge in das Molekül eingefügt werden und später wieder abgespalten werden, wurden bereits erwähnt.

Zur Kondensation der Verbindungen der Formeln II und III verwendet man vorteilhafterweise die dem Fachmann an sich wohlbekannten Kupplungsmethoden der Peptidchemie (siehe zum Beispiel Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Band 15/1 und 15/2, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, 1974). Als Kondensationsmittel oder Kupplungsreagenzien kommen zum Beispiel Carbonyldiimidazol, Carbodiimide wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder Diisopropylcarbodümid, das O-((Cyan(ethoxycarbonyl)methylen)amino)-N,N,N',N'- tetramethyluroniumtetrafluoroborat (TOTU) oder Propylphosphonsäureanhydrid (PPA) in Frage. Die Kondensationen können unter den dem Fachmann wohlbekannten Standardbedingungen durchgeführt werden. Im allgemeinen werden sie in einem inerten Lösungsmittel oder Verdünnungsmittel durchgeführt, zum Beispiel in einem aprotischen Lösungsmittel wie N,N-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP), Tetrahydrofuran (THF) oder Dimethoxyethan (DME). Je nach der im Einzelfall durchgeführten Kondensation kann es vorteilhaft sein, eine Base wie ein tertiäres Amin oder Hilfsreagenzien, zum Beispiel eine N-Hydroxyverbindung wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) zuzusetzen. Die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches und eine Reinigung des Produktes können nach üblichen Standardverfahren durchgeführt werden. Nach der Kondensation werden die vorhandenen Schutzgruppen in geeigneter Weise abgespalten. Beispielsweise können Benzylgruppen in Benzylestern abhydriert oder Schutzgruppen vom tert-Butyltyp sauer abgespalten werden. Die Herstellung der Verbindungen der Formel 1 kann beispielsweise auch erfolgen, indem man die Verbindungen nach üblichen Methoden schrittweise an einer Festphase aufbaut, wobei die einzelnen Strukturelemente des Moleküls in unterschiedlicher Reihenfolge eingeführt werden können.

Die Aminoverbindungen der Formel III sind käuflich erhältlich oder können nach oder analog zu wohlbekannten Standardverfahren aus Ausgangsverbindungen aufgebaut werden, die käuflich sind oder wiederum nach oder analog zu Literaturvorschriften erhältlich sind. Zum Beispiel können optisch aktive 3-substituierte 3- Aminopropionsäuren der Formel III oder deren Ester, insbesondere 3-Phenyl-3- aminopropionsäureester, aus den entsprechenden 3-substituierten Acrylsäuren hergestellt werden, die wiederum aus den entsprechenden Aldehyden erhältlich sind. Die 3-substituierten Acrylsäuren werden mit Oxalylchlorid in die Säurechloride überführt und diese mit einem Alkohol in die Ester, zum Beispiel mit tert-Butanol in die tert-Butylester. Zur Einführung der Aminogruppe wird dann mit dem Lithiumsalz eines optisch aktiven Amins umgesetzt, zum Beispiel dem Lithiumsalz des (R)-(+)-N- Benzyl-N-(1-phenyl-ethyl)-amins, und anschließend in dem erhaltenen 3- substituierten 3-(N-Benzyl-N-(1-phenyl-ethyl)-amino)-propionsäure-tert-butylester die Benzylgruppe und die Phenylethylgruppe durch katalytische Hydrierung abgespalten. Für die Herstellung von Verbindungen der Formel III, in der E für die Hydroxymethylgruppe CH₂OH oder eine veretherte Hydroxymethylgruppe steht, können in die Kondensationsreaktion 3-substituierte 3-Aminopropanole oder deren Ether eingesetzt werden, die aus den 3-substituierten 3-Aminopropionsäuren oder deren Estern durch Reduktion der Säuregruppe (oder der Estergruppe) erhältlich sind, beispielsweise aus dem Ethylester oder tert-Butylester mit Lithiumaluminiumhydrid oder Lithiumaluminiumhydrid/Aluminiumtrichlorid.

Verbindungen der Formel II können beispielsweise hergestellt werden, indem man zunächst Verbindungen der Formel IV

in einer Bucherer-Reaktion, zum Beispiel mit Ammoniumcarbonat und Kaliumcyanid, zu Verbindungen der Formel V

umsetzt, die dann mit einem alkylierenden Reagenz der Formel LG-CHA-G, das den Rest der Formel -CHA-G in das Molekül einführt, zu Verbindungen der Formel VI umgesetzt werden,

wobei A, R³, R⁴ und G wie oben angegeben definiert sind. Die Umsetzung von Verbindungen der Formel VI mit einem zweiten Reagenz der Formel VII,

in der Z, R¹ und R⁵ wie oben angegeben definiert sind, führt dann zu den entsprechenden Verbindungen der Formel II. Die Gruppe LG steht für eine nucleophil substituierbare Abgangsgruppe, zum Beispiel Halogen, insbesondere Chlor oder Brom, oder Sulfonyloxy wie Tosyloxy, Methylsulfonyloxy oder Trifluormethylsulfonyloxy.

Verbindungen der Formel II können beispielsweise auch hergestellt werden, indem man eine Verbindung der Formel VI zunächst mit einem Reagenz der Formel 4-(PG-NH)-C₆H₃(OR⁵)-CH₂-LG, in der LG wiederum für eine nucleophil substituierbare Abgangsgruppe steht, zu einer Verbindung der Formel VIII umsetzt,

wobei für A, G, R³, R⁴ und R⁵ die oben angegebenen Bedeutungen gelten und PG für eine Amino-Schutzgruppe steht, beispielsweise tert-Butoxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl. Nach Entfernen der Schutzgruppe PG erhält man durch Umsetzung der entstandenen Aminogruppe H₂N mit Phenylisocyanat, Phenylisothiocyanat, 2-Methylphenylisocyanat oder 2-Methylphenylisothiocyanat die Verbindungen der Formel II. Ebenso wie Verbindungen der Formel VIII können auch Verbindungen hergestellt und eingesetzt werden, in denen in der Formel VIII die Gruppe PG-NH- durch eine Gruppe ersetzt ist, die eine Vorstufe für eine Aminogruppe darstellt und die dann in einem weiteren Reaktionsschritt in eine Aminogruppe überführt wird. Beispielsweise kann eine Verbindung der Formel VI zunächst mit einer Nitroverbindung der Formel 4-O₂N-C₆H₃(OR⁵)-CH₂-LG zu einer der Verbindung der Formel VIII entsprechenden Verbindung umgesetzt werden, dann die Nitrogruppe beispielsweise durch katalytische Hydrierung in die Aminogruppe überführt werden und dann die Aminogruppe mit Phenylisocyanat, Phenylisothiocyanat, 2-Methylphenylisocyanat oder 2-Methylphenylisothiocyanat in die gewünschte Verbindung der Formel II umgewandelt werden.

Ganz generell können die einzelnen Schritte bei der Herstellung der Verbindungen der Formel I nach oder analog zu bekannten, dem Fachmann geläufigen Methoden durchgeführt werden. Je nach dem Einzelfall kann es hierbei, wie bereits erläutert, bei allen Schritten in der Synthese der Verbindungen der Formel I angebracht sein, funktionelle Gruppen, die zu Nebenreaktionen oder unerwünschten Reaktionen führen könnten, durch eine dem Syntheseproblem angepaßte Schutzgruppenstrategie temporär zu blockieren, was dem Fachmann bekannt ist.

Verbindungen der Formel I können auch wie folgt erhalten werden. Durch Reaktion von nach Standardverfahren erhältlichen N-substituierten Aminosäuren oder bevorzugt von deren Estern, zum Beispiel der Methylester, Ethylester, tert-Butylester oder Benzylester, beispielsweise von Verbindungen der Formel IX,

worin Z, R¹, R³, R⁴ und R⁵ wie oben angegeben definiert sind, mit einem Isocyanat der Formel X,

für das die obigen Definitionen von A und R² gelten und das aus der entsprechenden Verbindung, die an Stelle der Isocyanatgruppe eine H₂N-Gruppe enthält, nach Standardverfahren erhältlich ist, erhält man Harnstoffderivate beispielsweise der Formel XI,

für die die oben angegebenen Definitionen gelten. Die Verbindungen der Formel XI können dann durch Erhitzen mit Säure zu den Verbindungen der Formel I cyclisiert werden. Die Cyclisierung der Verbindungen der Formel XI zu den Verbindungen der Formel I kann auch durch Behandlung mit Basen in inerten Lösungsmittel durchgeführt werden, zum Beispiel durch Behandlung mit Natriumhydrid in einem aprotischen Lösungsmittel wie Dimethylformamid. Während der Reaktionen können wiederum funktionelle Gruppen in geschützter Form vorliegen.

Verbindungen der Formel I können auch erhalten werden, indem man eine Verbindung der Formel IX mit einem Isocyanat der Formel XII

umsetzt, in der A die oben angegebenen Bedeutungen hat und Q zum Beispiel für eine Alkoxygruppe, zum Beispiel eine (C₁-C₄)-Alkoxygruppe wie Methoxy, Ethoxy oder tert-Butoxy, oder eine (C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₄)-alkoxygruppe, zum Beispiel Benzyloxy, steht. Dabei wird eine Verbindung der Formel XIII erhalten,

in der A, Q, Z, R¹, R³, R⁴ und R⁵ wie oben angegeben definiert sind, die dann unter dem Einfluß einer Säure oder einer Base, wie oben für die Cyclisierung der Verbindungen der Formel XI beschrieben, zu einer Verbindung der Formel XIV,

in der A, Q, Z, R¹, R³, R⁴ und R⁵ wie oben angegeben definiert sind, cyclisiert wird. In der Verbindung der Formel XIV kann dann, beispielsweise durch Hydrolyse, die Gruppe CO-Q in die Carbonsäuregruppe COOH überführt werden. Wenn die Cyclisierung der Verbindung der Formel XIII zur Verbindung der Formel XIV mit einer Säure erfolgt, kann die Überführung der Gruppe CO-Q in die Gruppe COOH auch gleichzeitig mit der Cyclisierung erfolgen. Durch nachfolgende Kupplung mit einer Verbindung der Formel III, wie oben für die Kupplung der Verbindungen der Formeln II und III beschrieben, wird dann eine Verbindung der Formel I erhalten. Auch bei diesem Syntheseverfahren können wiederum funktionelle Gruppen in geschützter Form oder in Form von Vorstufen vorliegen.

Eine weitere Methode zur Herstellung von Verbindungen der Formel I ist beispielsweise die Umsetzung von Verbindungen der Formel XV,

für die die oben angegebenen Definitionen gelten, mit Phosgen oder entsprechenden Äquivalenten (analog S. Goldschmidt und M. Wick, Liebigs Ann. Chem. 575 (1952), 217 und C. Tropp, Chem. Ber. 61 (1928), 1431).

Verbindungen der Formel I können auch hergestellt werden, indem zunächst eine Verbindung der Formel XVI,

in der R³ und R⁴ die oben angegebenen Bedeutungen hat und PG für eine Amlnoschutzgruppe wie zum Beispiel eine Benzyloxycarbonylgruppe steht, mit einer Verbindung der Formel XVII,

in der A die oben angegebenen Bedeutungen hat und Q' für eine geschützte Carbonsäurehydroxygruppe, zum Beispiel für eine Alkoxygruppe wie tert-Butoxy, steht, zu einer Verbindung der Formel XVIII

gekuppelt wird, in der A, R³, R⁴, PG und Q' die oben angegebenen Bedeutungen haben. In der Verbindung der Formel XVIII kann dann selektiv die Schutzgruppe PG von der Aminogruppe abgespalten werden, zum Beispiel durch Hydrierung im Fall einer Benzyloxycarbonylgruppe, und durch Einführung einer CO-Gruppe ein Ringschluß zu einer Verbindung der Formel XIX,

in der A, R³, R⁴ und Q' die angegebenen Bedeutungen haben, durchgeführt werden. Zur Einführung der Carbonylgruppe kann beispielsweise Phosgen oder ein Phosgenäquivalent Verwendung finden (analog der oben erläuterten Umsetzung der Verbindungen der Formel XV). Als Zwischenstufe kann bei der Überführung der Verbindung der Formel XVIII in die Verbindung der Formel XIX beispielsweise ein Isocyanat auftreten oder gezielt hergestellt werden. Die Überführung der Verbindung der Formel XVIII in die der Formel XIX kann in einem oder mehreren Schritten erfolgen. Beispielsweise kann zunächst die Carbonylgruppe eingeführt werden und dann in einem separaten Schritt die Cyclisierung wie die oben beschriebenen Cyclisierungen in Gegenwart einer Base wie Natriumhydrid durchgeführt werden. Verbindungen der Formel XVIII, in der PG für die Benzyloxycarbonylgruppe steht, können auch direkt in Verbindungen der Formel XIX überführt werden, ohne daß zur Einführung der Carbonylgruppe ein Synthesebaustein wie Phosgen eingesetzt wird. Werden Verbindungen der Formel XVIII, in der PG für Benzyloxycarbonyl steht, mit einer Base wie Natriumhydrid behandelt, so können direkt die Verbindungen der Formel XIX erhalten werden.

Die Verbindungen der Formel XIX können dann, wie oben für die Verbindungen der Formel VI erläutert, an der NH-Gruppe mit einem Reagenz der Formel VII alkyliert werden, und nach Umwandlung der geschützten Carbonsäuregruppe CO-Q' in die Carbonsäuregruppe COOH können wie oben für die Verbindungen der Formeln VI und II beschrieben die gewünschten Verbindungen der Formel I aufgebaut werden. Auch bei diesem Syntheseverfahren können wiederum funktionelle Gruppen in geschützter Form oder in Form von Vorstufen vorliegen.

Verbindungen der Formel I können weiterhin hergestellt werden, indem zunächst eine Verbindung der Formel XX

in der R³, R⁴ und Q' die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit einem Isocyanat der Formel XII zu einer Verbindung der Formel XXI,

in der A, R³, R⁴, Q und Q' die oben angegebenen Bedeutungen haben, umgesetzt wird. Die Verbindung der Formel XXI wird dann durch Behandeln mit einer starken Säure, zum Beispiel halbkonzentrierter Salzsäure, zu einer Verbindung der Formel XXII cyclisiert.

Verbindungen der Formel XXII können auch hergestellt werden, indem man zunächst eine Verbindung der Formel XVIII herstellt, in der A, R³, R⁴ und Q' die angegebenen Bedeutungen haben und PG eine Alkoxycarbonylgruppe wie (C₁-C₄)-Alkoxycarbonyl, eine Arylalkoxycarbonylgruppe wie Phenyl-(C₁-C₄)-alkoxycarbonyl, oder eine Aryloxycarbonylgruppe wie Phenyloxycarbonyl bedeutet, diese Verbindung durch Freisetzen der geschützten Carbonsäuregruppe CO-Q' in eine Verbindung der Formel XVIII überführt, in der CO-Q' für die freie Carbonsäuregruppe CO-OH steht, PG für Alkoxycarbonyl, Arylalkoxycarbonyl oder Aryloxycarbonyl steht und A, R³ und R⁴ die angegebenen Bedeutungen haben, und diese Verbindung mit einer Base wie zum Beispiel Natriumcarbonat zur Verbindung der Formel XXII cyclisiert.

Verbindungen der Formel IIa,

in der A, Z, R¹ R³, R⁴ und X die oben angegebenen Bedeutungen haben, können dann erhalten werden, indem man die Verbindungen der Formel XXII in Gegenwart von überschüssiger Base, zum Beispiel in Gegenwart eines Überschusses n- Butyllithium, mit einem Alkylierungsreagenz der Formel VII umsetzt und anschließend ansäuert. Die 4-(3-Arylureido)-benzylgruppe oder 4-(3-Arylthioureido)- benzylgruppe kann auch schrittweise, analog der Herstellung der Verbindungen der Formel VIII und den daraus erhaltenen Verbindungen der Formel II, in die Verbindungen der Formel XXII eingeführt werden.

Verbindungen der Formel I, in denen die Reste R³ und R⁴ für Trifluormethyl stehen, können vorteilhaft hergestellt werden, indem ein Isonitril der Formel XXIII mit dem 2- tert-Butoxy-4,4-bis(trifluormethyl)-1,3-oxazabuta-1,3-dien der Formel XXIV zu einer Verbindung der Formel XXV umgesetzt wird,

wobei A und Q die oben angegebenen Bedeutungen haben, also die Gruppe C( = O)-Q zum Beispiel für eine Estergruppe steht und Q zum Beispiel für Alkoxy wie (C₁-C₄)-Alkoxy einschließlich Methoxy, Ethoxy und tert-Butoxy oder für (C₅-C₁₄)-Aryl- (C₁-C₄)-alkoxy einschließlich Benzyloxy steht. Die Umsetzung der Verbindungen der Formeln XXIII und XXIV zu den Verbindungen der Formel XXV wird vorteilhaft in einem Kohlenwasserstoff oder Ether als Lösungsmittel, zum Beispiel in Benzol oder Toluol, unter Erwärmen durchgeführt.

Die Isocyanide (Isonitrile) der Formel XXIII können nach dem Fachmann bekannten Standardmethoden aus den entsprechenden Aminosäureestern der Formel H₂ N-CHA-C(=O)-Q erhalten werden, in der A und Q die oben angegebenen Bedeutungen haben. Vorteilhaft wird der Aminosäureester der Formel H₂ N-CHA-C(=O)-Q zunächst durch Umsetzung mit einem reaktiven Ameisensäureester, zum Beispiel Ameisensäure-cyanmethylester, in den N-Formyl- Aminosäureester der Formel HC(=O)-NH-CHA-C(=O)-Q überführt, der dann beispielsweise durch Umsetzung mit Phosgen oder einem Phosgenäquivalent wie Diphosgen oder Triphosgen in Gegenwart eines tertiären Amins wie Triethylamin in das Isocyanid der Formel XXIII überführt wird. Das 2-tert-Butoxy-4,4- bis(trifluormethyl)-1,3-oxazabuta-1,3-dien der Formel XXIV ist nach dem von Steglich et al., Chemische Berichte 107 (1974), 1488, beschriebenen Verfahren aus Carbamidsäure-tert-butylester (tert-Butoxycarbonylamid) und wasserfreiem Hexafluoraceton und nachfolgende Behandlung des zunächst erhaltenen 2-tert- Butoxycarbonylamino-2-hydroxy-1,1,1,3,3,3-hexafluorpropans mit Trifluoressigsäureanhydrid in Gegenwart einer Base wie Chinolin erhältlich.

Die Verbindungen der Formel XXV können dann zum Beispiel mit Verbindungen der Formel VII an der NH-Gruppe zu Verbindungen der Formel XIV alkyliert werden, die - gewünschtenfalls nach Umwandlung der Estergruppe CO-Q in die Carbonsäuregruppe CO-OH - wie oben beschrieben mit Verbindungen der Formel III Verbindungen der Formel I liefern. In den Verbindungen der Formel XXV kann auch erst die Estergruppe CO-Q nach Standardverfahren in die Carbonsäuregruppe CO-OH umgewandelt werden und die erhaltene Verbindung der Formel XXII wie oben beschrieben mit einem Alkylierungsreagenz der Formel VII in Gegenwart überschüssiger Base in eine Verbindung der Formel IIa überführt werden, die dann mit einer Verbindung der Formel III eine Verbindung der Formel I liefert. Analog der oben beschriebenen Herstellung der Verbindungen der Formel VIII und der daraus erhaltenen Verbindungen der Formel IIa kann die 4-(3-Arylureido)-benzylgruppe oder 4-(3-Aryithioureido)-benzylgruppe auch schrittweise in die Verbindungen der Formel XXV eingeführt werden. Auch bei diesen Umsetzungen können wiederum funktionelle Gruppen in geschützter Form oder in Form von Vorstufen vorliegen.

Die Verbindungen der Formel I, in der E zum Beispiel für Hydroxycarbonyl oder Hydroxymethyl steht, können nach Standardverfahren in Verbindungen der Formel I überführt werden, in der E andere Bedeutungen hat, oder in sonstige Prodrugs oder Derivate der Verbindungen der Formel I. So können zur Herstellung von Estern die Verbindungen der Formel I, in der E für Hydroxycarbonyl steht, mit den entsprechenden Alkoholen verestert werden, zum Beispiel in Gegenwart eines Kondensationsreagenzes wie DCC, oder es können die Verbindungen der Formel I, in der E für Hydroxycarbonyl steht, mit Alkylhalogeniden wie Alkylchloriden oder Alkylbromiden alkyliert werden, zum Beispiel mit Acyloxyalkylhalogeniden zu Verbindungen der Formel I, in der E für Acyloxyalkoxy-CO- steht. Verbindungen der Formel I, in der E für Hydroxycarbonyl steht, können mit Ammoniak oder organischen Aminen in Gegenwart eines Kondensationsreagenzes in Amide überführt werden. Verbindungen der Formel I, in der E für CO-NH₂ steht, können vorteilhaft auch an der Festphase erhalten werden, indem die Verbindung, in der E für COOH steht, in Gegenwart eines Kondensationsmittels wie TOTU an Rink-Amidharz gekuppelt wird und dann mit Trifluoressigäure wieder vom Harz abgespalten wird. Verbindungen der Formel I, in der E für die Hydroxymethylgruppe CH₂OH steht, können nach Standardverfahren an der Hydroxymethylgruppe verethert werden. Nach Standardverfahren für die selektive Oxidation von Alkoholen zu Aldehyden, zum Beispiel mit Natriumhypochlorit in Gegenwart von 4-Acetamido-2,2,6,6- tetramethylpiperidin-1-oxyl (4-Acetamido-TEMPO), können Verbindungen der Formel I, in der E für CH₂OH steht, in Verbindungen der Formel I überführt werden, in der E für die Aldehydgruppe -CO-H steht.

Verbindungen der Formel I, in denen R⁵ für Wasserstoff steht, können auch hergestellt werden, indem mit Verbindungen der Formel I, in denen R⁵ für Methyl steht, eine Etherspaltung durchführt. Beispielsweise kann eine für R⁵O stehende Methoxygruppe durch Behandlung mit Bortribromid in eine Hydroxygruppe überführt werden.

Die Verbindungen der Formel I sind wertvolle Arzneimittelwirkstoffe, die sich beispielsweise für die Behandlung von Entzündungserkrankungen, allergischen Erkrankungen oder Asthma eignen. Die Verbindungen der Formel I und ihre physiologisch verträglichen Salze und Derivate können erfindungsgemäß am Tier, bevorzugt am Säugetier, und insbesondere am Menschen als Arzneimittel zur Behandlung von Krankheitszuständen verabreicht werden, wobei unter Behandlung generell sowohl die Therapie akuter oder chronischer Krankheitserscheinungen als auch die Prophylaxe oder Vorbeugung von Krankheitserscheinungen zu verstehen ist, also zum Beispiel die Vorbeugung gegen das Auftreten allergischer oder asthmatischer Krankheiterscheinungen oder die Vorbeugung des Myokardinfarkts oder des Myocardreinfarkts in entsprechenden Patienten. Die Verbindungen der Formel I und ihre Salze und Derivate können für sich allein, in Mischungen untereinander oder in Form von pharmazeutischen Präparaten verabreicht werden, die eine enterale oder parenterale Anwendung gestatten und die als aktiven Bestandteil eine wirksame Dosis mindestens einer Verbindung der Formel I und/oder ihrer physiologisch verträglichen Salze und/oder Derivate und einen pharmazeutisch einwandfreien Träger enthalten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch die Verbindungen der Formel I und/oder ihre physiologisch verträglichen Salze und Derivate zur Verwendung als Arzneimittel, die Verwendung der Verbindungen der Formel I und/oder ihrer physiologisch verträglichen Salze und Derivate zur Herstellung von Arzneimitteln für die Behandlung der oben und im folgenden erläuterten Krankheiten, zum Beispiel für die Behandlung von Entzündungserkrankungen, sowie die Verwendung der Verbindungen der Formel I und/oder ihrer physiologisch verträglichen Salze und Derivate in der Behandlung dieser Krankheiten. Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung pharmazeutische Präparate (oder pharmazeutische Zusammensetzungen), die eine wirksame Dosis mindestens einer Verbindung der Formel I und/oder ihrer physiologisch verträglichen Salze und/oder Derivate und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, das heißt einen oder mehrere pharmazeutisch einwandfreie Trägerstoffe und/oder Zusatzstoffe, enthalten.

Die Arzneimittel können systemisch oder lokal verabreicht werden. Sie können zum Beispiel oral in Form von Pillen, Tabletten, Filmtabletten, Dragees, Granulaten, Hart- und Weichgelatinekapseln, Pulvern, Lösungen, Sirupen, Emulsionen, Suspensionen oder in anderen Arzneiformen verabreicht werden. Die Verabreichung kann aber auch vaginal oder rektal, zum Beispiel in Form von Suppositorien, oder parenteral oder implantiv, zum Beispiel in Form von Injektionslösungen oder lnfusionslösungen, Mikrokapseln oder Rods, oder topisch oder perkutan, zum Beispiel in Form von Cremes, Salben, Pudern, Lösungen, Emulsionen oder Tinkturen, oder auf anderem Wege, zum Beispiel in Form von Nasalsprays oder Aerosolmischungen, erfolgen. Lösungen können parenteral zum Beispiel intravenös, intramuskulär, subkutan, intraartikulär, intrasynovial oder auf andere Weise verabreicht werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate erfolgt in an sich bekannter Weise, wobei die Verbindung oder die Verbindungen der Formel I und/oder ihre physiologisch verträglichen Salze und/oder Derivate mit pharmazeutisch inerten anorganischen und/oder organischen Trägerstoffen und/oder Zusatzstoffen vermischt werden und in eine geeignete Dosierungsform und Verabreichungsform gebracht werden. Für die Herstellung von Pillen, Tabletten, Dragees und Hartgelatinekapseln kann man zum Beispiel Lactose, Maisstärke oder Derivate davon, Talk, Stearinsäure oder deren Salze, Polyethylenglykole, etc. verwenden, für Weichgelatinekapseln und Suppositorien zum Beispiel Fette, Wachse, halbfeste und flüssige Polyole, Polyethylenglykole, natürliche oder gehärtete Öle etc. Als Trägerstoffe für die Herstellung von Lösungen, zum Beispiel lnjektionslösungen, oder von Emulsionen oder Sirupen eignen sich zum Beispiel Wasser, Alkohole, Glycerin, Diole, Polyole, Saccharose, lnvertzucker, Glukose, pflanzliche Öle etc. Als Trägerstoffe für Mikrokapseln, Implantate oder Rods eignen sich zum Beispiel Mischpolymerisate aus Glykolsäure und Milchsäure. Die pharmazeutischen Präparate enthalten normalerweise etwa 0.5 bis 90 Gew.-% der Verbindungen der Formel I und/oder ihrer physiologisch verträglichen Salze und Derivate. Die Menge an Wirkstoff der Formel I und/oder seinen physiologisch verträglichen Salzen und Derivaten in den pharmazeutischen Präparaten beträgt normalerweise ungefähr 0.2 bis ungefähr 1000 mg, vorzugsweise ungefähr 1 bis ungefähr 500 mg, je nach der Art des pharmazeutischen Präparats kann die Menge des Wirkstoffs aber auch größer sein.

Die pharmazeutischen Präparate können neben den Wirkstoffen und Trägerstoffen noch Hilfsstoffe oder Zusatzstoffe enthalten, zum Beispiel Füllstoffe, Spreng-, Binde-, Gleit-, Netz-, Stabilisierungs-, Emulgier-, Konservierungs-, Süß-, Färbe-, Geschmacks-, Aromatisierungs-, Dickungs-, Verdünnungsmittel, Puffersubstanzen, Lösungsmittel, Lösungsvermittler, Mittel zur Erzielung eines Depoteffekts, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks, Überzugsmittel oder Antioxidantien. Sie können auch zwei oder mehrere Verbindungen der Formel I und/oder deren physiologisch verträgliche Salze und/oder Derivate enthalten. Ferner können sie neben mindestens einer Verbindung der Formel I und/oder ihren physiologisch verträglichen Salzen und Derivaten noch einen oder mehrere weitere Arzneimittelwirkstoffe enthalten, zum Beispiel Stoffe mit entzündungshemmender Wirkung.

Wenn die Verbindungen der Formel I bzw. sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen als Aerosole verabreicht werden, zum Beispiel als Nasalaerosole oder durch Inhalation, so kann dies beispielsweise unter Verwendung eines Sprays, eines Zerstäubers, eines Pumpzerstäubers, eines Inhalationsgerätes, eines Dosierinhalators oder eines Trockenpulverinhalators erfolgen. Arzneiformen für eine Verabreichung der Verbindungen der Formel I als Aerosol können nach dem Fachmann wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. In Betracht kommen für deren Herstellung beispielsweise Lösungen oder Dispersionen der Verbindungen der Formel I in Wasser, Wasser-Alkohol-Gemischen oder geeigneten Kochsalzlösungen unter Verwendung von üblichen Zusatzstoffen, zum Beispiel Benzylalkohol oder anderen geeigneten Konservierungsmitteln, Absorptionsverbesserern zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit, Lösungsvermittlern, Dispergiermitteln und anderen, und gegebenenfalls üblichen Treibmitteln, zum Beispiel Fluorchlorkohlenwasserstoffen und/oder Fluorkohlenwasserstoffen.

Als weitere Arzneimittelwirkstoffe, die in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparaten neben Verbindungen der Formel I enthalten sein können, mit denen aber die Verbindungen der Formel I auch in anderer Weise im Rahmen einer Kombinationsbehandlung kombiniert werden können, kommen insbesondere solche Wirkstoffe in Betracht, die sich für die Behandlung, also die Therapie oder Prophylaxe, der oben oder im folgenden erwähnten Krankheiten eignen, für deren Behandlung sich auch die Verbindungen der Formel I eignen. Als Beispiele für derartige Wirkstoffklassen seien genannt Steroide, nichtsteroidale entzündungshemmende Stoffe, nichtsteroidale entzündungshemmende Essigsäurederivate, nichtsteroidale entzündungshemmende Propionsäurederivate, nichtsteroidale Antiasthmatika, Salicylsäurederivate, Pyrazolone, Oxicame, Leukotrienantagonisten, Inhibitoren der Leukotrienbiosynthese, Cyclooxygenase- Inhibitoren, Cyclooxygenase-2-Inhibitoren (COX-2-lnhibitoren), Antihistaminika, H1- Histaminantagonisten, nichtsedierende Antihistaminika, Goldverbindungen, ß2-Agonisten, Anticholinergika, Muskarin-Antagonisten, Lipidsenker, Cholesterinsenker, HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren, Statine, Nikotinsäurederivate, lmmunsuppressiva, Cyclosporine, β-Interferone, Tumortherapeutika, Cytostatika, Metastasenhemmer, Antimetabolite, 5-Aminosalicylsäurederivate, Antidiabetika, Insuline, Sulfonylharnstoffe, Biguanide, Glitazone, α-Glukosidase-Inhibitoren, und andere. Als Beispiel für in Betracht kommende Wirkstoffe seien genannt Acetylsalicylsäure, Benorilat, Sulfasalazin, Phenylbutazon, Oxyphenbutazon, Metamizol, Mofebutazon, Feprazon, Celecoxib, Rofecoxib, Diclofenac, Fentiazac, Sulindac, Zomepirac, Tolmetin, Indometacin, Acemetacin, Ibuprofen, Naproxen, Carprofen, Fenbufen, Indoprofen, Ketoprofen, Pirprofen, Tiaprofensäure, Diflunisal, Flufenaminsäure, Meclofenamsäure, Mefenaminsäure, Nifluminsäure, Tolfenaminsäure, Piroxicam, Isoxicam, Tenoxicam, Nikotinsäure, Prednison, Dexamethason, Hydrocortison, Methylprednisolon, Betamethason, Beclomethason, Budesonid, Montekulast, Prankulast, Zafirkulast, Zileuton, Ciclosporin, Cyclosporin A, Rapamycin, Tacrolimus, Methotrexat, 6-Mercaptopurin, Azathioprin, Interferon-beta­ la, lnterferon-beta-1b, 5-Aminosalicylsäure, Leflunomid, D-Penicillamin, Chloroquin, Glibenclamid, Glimepirid, Troglitazone, Metformin, Acarbose, Atorvastatin, Fluvastatin, Lovastatin, Simvastatin, Pravastatin, Colestipol, Colestyramin, Probucol, Clofibrat, Fenofibrat, Bezafibrat, Gemfibrozil, lpatropiumbromid, Clenbuterol, Fenoterol, Metaproterenol, Pirbuterol, Tulobuterol, Salbutamol, Salmeterol, Terbutalin, Isoetarin, Ketotifen, Ephedrin, Oxitropiumbromid, Atropin, Cromoglicinsäure, Theophyllin, Fexofenadin, Terfenadin, Cetirizin, Dimetinden, Diphenhydramin, Diphenylpyralin, Pheniramin, Brompheniramin, Chlorpheniramin, Dexchlorpheniramin, Alimezain, Antazolin, Astemizol, Azatadin, Clemastin, Cyproheptadin, Hydroxyzin, Loratidin, Mepyramin, Promethazin, Tripelennamin, Triprolidin und andere.

Wenn Verbindungen der Formel I und/oder ihre physiologisch verträglichen Salze und/oder Prodrugs zusammen mit einem oder mehreren anderen Wirkstoffen in einer Kombinationsbehandlung eingesetzt werden sollen, kann dies wie erwähnt erfolgen, indem alle Wirkstoffe zusammen in einem einzigen pharmazeutischen Präparat verabreicht werden, zum Beispiel einer Tablette oder Kapsel. Derartige pharmazeutische Präparate, für die alle obigen Erläuterungen entsprechend gelten, sind ausdrücklich ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Menge an den Wirkstoffen in diesen pharmazeutischen Präparaten ist im allgemeinen so bemessen, daß eine wirksame Menge jedes Wirkstoffes enthalten ist. Eine Kombinationsbehandlung kann aber auch erfolgen, indem die Wirkstoffe in zwei oder mehr getrennten pharmazeutischen Präparaten enthalten sind, die sich in einer einzelnen Packung oder in zwei oder mehr getrennten Packungen befinden können. Die Verabreichung der Verbindungen der Formel I und/oder deren physiologisch verträglicher Salze oder Prodrugs und der anderen Wirkstoffen kann zusammen oder getrennt erfolgen und gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Die Verabreichung kann auch auf unterschiedlichen Wegen erfolgen, zum Beispiel kann ein Wirkstoff oral verabreicht werden und der andere durch Injektion, Inhalation oder topische Applikation.

Die Verbindungen der Formel I haben beispielsweise die Fähigkeit, Zell-Zell- Interaktionsprozesse und Zell-Matrix-lnteraktionsprozesse zu inhibieren, bei denen Wechselwirkungen zwischen VLA-4 mit seinen Liganden eine Rolle spielen. Die Wirksamkeit der Verbindungen der Formel I kann zum Beispiel in einem Assay nachgewiesen werden, in dem die Bindung von Zellen, die den VLA-4-Rezeptor aufweisen, zum Beispiel von Leukozyten, an Liganden dieses Rezeptors gemessen wird, zum Beispiel an VCAM-1, das dafür vorteilhafterweise auch gentechnisch hergestellt werden kann. Einzelheiten eines solchen Assay sind weiter unten beschrieben. Insbesondere vermögen die Verbindungen der Formel I die Adhäsion und die Migration von Leukozyten zu inhibieren, etwa die Anheftung von Leukozyten an endotheliale Zellen, die - wie oben erläutert - über den VCAM-1/VLA-4- Adhäsionsmechanismus gesteuert wird. Außer als Entzündungshemmstoffe eignen sich die Verbindungen der Formel I und ihre physiologisch verträglichen Salze und Derivate daher generell zur Behandlung, also zur Therapie und Prophylaxe, von Krankheiten, die auf der Wechselwirkung zwischen dem VLA-4-Rezeptor und seinen Liganden beruhen oder durch eine Hemmung dieser Wechselwirkung beeinflußt werden können, und insbesondere eignen sie sich zur Behandlung von Krankheiten, die zumindest teilweise durch ein unerwünschtes Ausmaß an Leukozytenadhäsion und/oder Leukozytenmigration verursacht werden oder damit verbunden sind, und zu deren Vorbeugung, Linderung oder Heilung die Adhäsion und/oder Migration von Leukozyten verringert werden soll.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch die Verbindungen der Formel I und deren physiologisch verträgliche Salze und Derivate zur Hemmung der Adhäsion und/oder Migration von Leukozyten oder zur Hemmung des VLA-4- Rezeptors und die Verwendung der Verbindungen der Formel I zur Herstellung von Arzneimitteln dafür, also von Arzneimitteln zur Behandlung von Krankheiten, bei denen die Leukozytenadhäsion und/oder Leukozytenmigration ein unerwünschtes Ausmaß aufweist, oder zur Behandlung von Krankheiten, bei denen VLA-4- abhängige Adhäsionsvorgänge eine Rolle spielen, sowie die Verwendung der Verbindungen der Formel I und/oder ihrer physiologisch verträglichen Salze und Derivate in der Behandlung derartiger Krankheiten.

Die Verbindungen der Formel I können bei entzündlichen Erscheinungen unterschiedlichster Ursache als Entzündungshemmer eingesetzt werden, um die unerwünschten oder schädigenden Folgen der Entzündung zu verhindern, zu verringern oder zu unterdrücken. Anwendung finden sie beispielsweise zur Behandlung, also Therapie oder Prophylaxe, der Arthritis, der rheumatoiden Arthritis, der Polyarthritis, der inflammatorischen bowel disease (ulcerative Colitis, Morbus Crohn), des systemischen Lupus erythematosus, von inflammatorischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie zum Beispiel der multiplen Sklerose, oder von Asthma oder Allergien wie zum Beispiel Allergien vom verzögerten Typ (Typ IV-Allergie). Weiterhin eignen sie sich zur Cardioprotektion und zur Behandlung, also Therapie und Prophylaxe, von cardiovaskulären Erkrankungen, der Atherosklerose, des Myocardinfarkts, des Myocardreinfarkts, des akuten Coronarsyndroms, von Restenosen, von Diabetes, der Schädigung von Organtransplantaten, von Immunerkrankungen, von Autoimmunerkrankungen, von Tumorwachstum oder Tumormetastasierung bei verschiedenen Malignitäten, der Malaria sowie von weiteren Krankheiten, bei denen eine Blockierung des Integrins VLA-4 und/oder eine Beeinflussung der Leukozytenaktivität zur Vorbeugung, Linderung oder Heilung angebracht erscheint. Eine bevorzugte Verwendung ist die Prävention des Myocardinfarkts oder des Myocardreinfarkts.

Die Dosis bei der Anwendung der Verbindungen der Formel I kann innerhalb weiter Grenzen variieren und ist wie üblich in jedem einzelnen Fall den individuellen Gegebenheiten anzupassen, was dem Arzt bekannt ist. Sie hängt beispielsweise von der Art und Schwere der zu behandelnden Krankheit ab, vom Zustand des Patienten, von der eingesetzten Verbindung oder davon, ob ein akuter oder chronischer Krankheitszustand behandelt wird oder Prophylaxe betrieben wird, oder davon, ob neben den Verbindungen der Formel I weitere Wirkstoffe verabreicht werden. Im allgemeinen ist bei der oralen Verabreichung eine Tagesdosis von ungefähr 0.01 bis ungefähr 100 mg/kg, vorzugsweise ungefähr 0.1 bis ungefähr 10 mg/kg (jeweils mg pro kg Körpergewicht) bei Verabreichung an einen ca. 75 kg schweren Erwachsenen zur Erzielung wirksamer Ergebnisse angemessen. Bei intravenöser Applikation beträgt die Tagesdosis im allgemeinen etwa 0.01 bis 50 mg/kg, vorzugsweise 0.01 bis 10 mg/kg Körpergewicht. Die Tagesdosis kann, insbesondere bei der Applikation größerer Mengen, in mehrere, zum Beispiel 2, 3, oder 4, Teilverabreichungen aufgeteilt werden. Gegebenenfalls kann es je nach individuellem Verhalten erforderlich werden, von der angegebenen Tagesdosis nach oben oder nach unten abzuweichen.

Außer als Arzneimittelwirkstoffe in der Humanmedizin und der Veterinärmedizin können die Verbindungen der Formel I und ihre Salze und für die betreffende Verwendung geeigneten Derivate weiterhin für diagnostische Zwecke, zum Beispiel bei in vitro-Diagnosen von Zellproben oder Gewebsproben, und als Hilfsmittel oder als wissenschaftliches Tool in biochemischen Untersuchungen eingesetzt werden, bei denen eine VLA-4-Blockierung oder eine Beeinflussung von Zell-Zell- oder Zell- Matrix-Interaktionen angestrebt wird. Weiterhin können die Verbindungen der Formel I und ihre Salze als Zwischenprodukte für die Herstellung anderer Verbindungen dienen, insbesondere anderer Arzneimittelwirkstoffe, die aus Verbindungen der Formel I beispielsweise durch Abwandlung oder Einführung von Resten oder funktionellen Gruppen erhältlich sind, zum Beispiel durch Veresterung, Reduktion, Oxidation oder andere Umwandlungen von funktionellen Gruppen.

Beispiele

Beispiel 1

(R)-3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-methyl-propionsäure

1a) 4-(3-(2-Methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzylalkohol

15 g (81.8 mmol) 3-Methoxy-4-nitro-benzylalkohol wurden in 500 ml Methyl-tert­ butylether über 1.3 g Palladium/Kohle (10%1g; 50% Wasser) unter Eiskühlung hydriert. Nachdem die Wasserstoffaufnahme beendet war, wurde der Katalysator abfiltriert und zum Filtrat unter Rühren 10.14 ml (81.8 mmol) 2- Methylphenylisocyanat innerhalb von 30 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht stehen gelassen, der ausgefallene Feststoff abgesaugt und mit Methyl-tert-butylether gewaschen. Ausbeute: 20.5 g (88%).

1b) 4-(3-(2-Methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzylchlorid

Zu einer Suspension von 15 g (52.4 mmol) der Verbindung des Beispiels 1a in 300 ml Dichlormethan wurden unter Eiskühlung 7.65 ml (104.8 mmol) Thionylchlorid zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt, über Nacht stehen gelassen und auf 1000 ml Heptan gegossen. Das Heptan wurde vom abgeschiedenen Öl abdekantiert, der Rückstand erneut mit Heptan aufgeschlämmt und das Heptan abdekantiert. Dieser Vorgang wurde noch zweimal wiederholt. Der Rückstand wurde dann in Dichlormethan gelöst und in 800 ml eiskalten Dilsopropylether gegossen. Es wurde 2 Stunden unter Eiskühlung nachgerührt, das Produkt abgesaugt, mit Diisopropylether gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute: 12 g (75%).

1c) (S)-2-Amino-3-cyclopropyl-propionsäure-benzylester

Zu einer Suspension von 10 g (77.5 mmol) (S)-2-Amino-3-cyclopropyl-propionsäure in 160 ml Dioxan wurde bei 0°C 1 N Natronlauge gegeben, bis pH 8-9 erreicht war. Anschließend wurden 16.9 g (77.5 mmol) Di-tert-butyldicarbonat zugegeben, das Eisbad entfernt und der pH-Wert durch weitere Zugabe von 1N Natronlauge auf 8-9 gehalten. Nach Stehenlassen über Nacht wurde das Dioxan im Vakuum entfernt, zur Wasserphase wurde Ethylacetat gegeben und die Phasen wurden getrennt. Die Wasserphase wurde mit 1 N Salzsäure auf pH 4.5 gestellt und mit Ethylacetat extrahiert. Die erhaltene Ethylacetatphase wurde über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 1000 ml Dichlormethan gelöst und mit 53.4 ml Benzylalkohol, 8.37 g 4-Dimethylaminopyridin und 18.8 g DCC versetzt. Nach 6 Stunden Rühren und Stehenlassen über Nacht wurde filtriert, das Filtrat eingeengt und der Rückstand mit 300 ml 90%iger Trifluoressigsäure versetzt. Nach 10 Minuten Rühren bei Raumtemperatur wurde die Trifluoressigsäure im Vakuum entfernt und der Rückstand zweimal an Kieselgel chromatographiert (Dichlormethan/Methanol, 95/5). Ausbeute: 11.48 g (68%).

1d) (S)-2-(4,4-Dimethyl-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-essigsäure

Zu einer Lösung von 3.82 g (23.7 mmol) 2-Methoxycarbonylamino-2-methyl­ propionsäure (hergestellt aus 2-Amino-2-methyl-propionsäure und Chlorameisensäuremethylester) und 5.2 g (23.7 mmol) der Verbindung des Beispiels 1c in 100 ml THF wurden 321 mg HOBT und 4.75 g (23.7 mmol) DCC gegeben und das Gemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Stehenlassen über Nacht und Filtration wurde das THF im Vakuum entfernt, der Rückstand in Methyl­ tert-butylether aufgenommen und die Lösung jeweils zweimal mit gesättigter NaHCO₃-Lösung und wäßriger KHSO₄/K₂SO₄-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und in Gegenwart von Palladium/Kohle (10%ig; 50% Wasser) hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und zur organischen Phase wurden 500 ml Wasser und 10.1 g Natriumcarbonat gegeben. Nach Ausschütteln und Phasentrennung wurde die Wasserphase 24 Stunden bei 100°C gerührt. Nach Stehenlassen über Nacht wurden 500 ml 6N Salzsäure zugegeben und die Wasserphase dreimal mit Methyl-tert-butylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Diisopropylether kristallisiert und das Produkt abfiltriert. Ausbeute: 2.88 g (51%).

1e) (S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-essigsäure

Zu einer Lösung von 2.85 g (11.8 mmol) der Verbindung des Beispiels 1d in 60 ml absolutem THF wurden unter Argon bei -40°C 9.44 ml einer n-Butyllithiumlösung (2.5M in Hexan) gegeben. Nach 30 Minuten Rühren bei -40°C ließ man das Reaktionsgemisch sich auf 0°C erwärmen und gab eine Lösung von 3.6 g (11.8 mmol) der Verbindung des Beispiels 1b in 20 ml N-Methyl-2-pyrrolidon zu. Man ließ das Reaktionsgemisch sich auf 0°C erwärmen und rührte dann 2 Stunden bei 0°C. Es wurden 15 ml 1N Salzsäure zugegeben und das THF im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde auf 300 ml Methyl-tert-butylether gegossen. Die Phasen wurden getrennt, die organische Phase mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt. Der Rückstand w 60387 00070 552 001000280000000200012000285916027600040 0002010111877 00004 60268urde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Einengen der Produktfraktionen und Gefriertrocknung wurden 1.33 g (22%) der Titelverbindung erhalten.

1f) (R)-3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-methyl-propionsäure-tert­ butylester

Zu einer Lösung von 974 mg (1.91 mmol) der Verbindung des Beispiels 1e und 305 mg (1.91 mmol) (R)-3-Amino-butansäure-tert-butylester in 10 ml absolutem DMF wurden nacheinander unter Eiskühlung 626 mg (1.91 mmol) TOTU und 308 µl (1.81 mmol) N,N-Diisopropyl-ethylamin gegeben. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, der Rückstand in Ethylacetat gelöst und die Ethylacetatlösung nacheinander jeweils zweimal mit einer wäßrigen KHSO₄/K₂SO₄-Lösung, einer gesättigten NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase über Natriumsulfat und Filtration wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand mit EthylacetatlHeptan (1/1) an Kieselgel chromatographiert. Nach Einengen der Produktfraktionen wurden 880 mg (71%) der Titelverbindung erhalten.

1g) (R)-3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)- 2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-methyl-propionsäure

880 mg (1.35 mmol) der Verbindung des Beispiels 1f wurden mit 10 ml 90%iger Trifluoressigsäure versetzt. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und im Vakuum eingeengt. Dieser Vorgang wurde noch ein zweites Mal wiederholt. Der erhaltene Rückstand wurde dann in Dichlormethan aufgenommen, die Dichlormethanphase dreimal mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration und Einengen im Vakuum wurde der Rückstand in Acetonitril/Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Ausbeute: 730 mg (91%).
Es(+)-MS: 594.2 (M + H)⁺

Beispiel 2

(R)-3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazoüdin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-methyl-propionsäure- Natrium-Salz

Zu einer Suspension von 100 mg (0.168 mmol) der Verbindung des Beispiels 1 in 10 ml Wasser wurden unter Rühren portionsweise 1.64 ml 0.1 N Natronlauge gegeben und das Gemisich 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Filtration und Gefriertrocknen des Fütrates wurden 104 mg (100%) der Titelverbindung erhalten. Es(+)-MS: 594.3 ((R)-3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3- methyl-propionsäure +H)⁺, 616.2 (M⁺).

Beispiel 3

(R)-3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-methyl-propanol

535 mg (1.05 mmol) der Verbindung des Beispiels 1e in 15 ml absolutem DMF wurden unter Eiskühlung mit 140 mg (1.05 mmol) HOBT und 260 mg (1.26 mmol) DCC versetzt. Das Gemisch wurde 45 Minuten unter Eiskühlung gerührt, dann wurden 112 mg (1.26 mmol) (R)-3-Amino-3-methyl-propanol zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Stehenlassen über Nacht wurde das Gemisch filtriert, das Filtrat eingeengt, der Rückstand in Ethylacetat gelöst und die Ethylacetatphase zweimal mit wäßriger KHSO₄/K₂SO₄-Lösung gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat, Filtration und Einengen wurde der Rückstand mit Ethylacetat an Kieselgel chromatographiert. Nach Einengen der Produktfraktionen wurden 423 mg (70%) der Titelverbindung erhalten.
Es(+)-MS: 580.3 (M + H)⁺

Herstellung von (R)-3-Amino-3-methyl-propanol

Unter Argon wurden zu einer Lösung von 19.9 g (149 mmol) Aluminiumtrichlorid in 250 ml absolutem Diethylether portionsweise 5.68 g (149 mmol) Lithiumaluminiumhydrid gegeben und das Gemisch 30 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Es wurden 6 g (37.7 mmol) (R)-3-Amino-butansäure-tert-butylester in 50 ml absolutem Diethylether langsam zugetropft und das Reaktionsgemisch 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wurden unter Eiskühlung vorsichtig 10.8 ml Wasser und 25.3 g Kaliumhydroxid, gelöst in 43 ml Wasser, zugetropft. Man ließ das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur stehen, dekantierte die Etherphase ab und kochte den Rückstand dreimal mit Dichlormethan aus. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration und Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurden 2.5 g (75%) der Titelverbindung erhalten.

Beispiel 4

(R)-3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-methyl-propionsäureamid

Zu einer Lösung von 330 mg (0.555 mmol) der Verbindung des Beispiels 1 und 125 mg (0.926 mmol) HOBT in 5 ml absolutem DMF wurden 131 mg (0.636 mmol) DCC gegeben, das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann 47 µl (0.555 mmol) einer 25%igen wäßrigen Ammoniaklösung zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen, weitere 16 µl einer 25%igen wäßrigen Ammoniaklösung wurden zugegeben und 4 Stunden gerührt. Nach Filtration wurde das Filtrat im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Ethylacetat gelöst und die Ethylacetatphase jeweils zweimal mit einer wäßrigen KHSO₄/K₂SO₄-Lösung, einer gesättigten NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase über Natriumsulfat und Filtration wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Ethylacetat an Kieselgel chromatographiert. Nach Einengen der Produktfraktionen und Gefriertrocknen wurden 272 mg (82%) der Titelverbindung erhalten.
Es(+)-MS: 593.3

Beispiel 5

(R)-3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-hydroxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-methyl-propionsäure

Unter Argon wurden zu einer Lösung von 100 mg (0.169 mmmol) der Verbindung des Beispiels 1 in 20 ml absolutem Dichlormethan bei -78°C 211 µl Bortribromid zugegeben und das Reaktionsgemisch sich unter Eiskühlung auf 0°C erwärmen lassen. Nach 30 Minuten bei 0°C wurde vorsichtig Wasser zugegeben. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration, Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum, chromatographischer Reinigung durch präparative HPLC und Gefriertrocknen der Produktfraktionen wurden 35 mg (36%) der Titelverbindung erhalten.
Es(+)-MS: 580.2 (M + H)⁺

Beispiel 6

(R)-3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-hydroxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-methyl-propanol

Unter Argon wurden zu einer Lösung von 220 mg (0.39 mmmol) der Verbindung des Beispiels 3 in 40 ml absolutem Dichlormethan bei -78°C 488 µl Bortribromid gegeben und das Reaktionsgemisch unter Eiskühlung sich auf 0°C erwärmen lassen. Nach 30 Minuten bei 0°C wurde vorsichtig Wasser zugegeben. Die Phasen wurden getrennt, die organische Phase viermal mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration, Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum, chromatographischer Reinigung durch präparative HPLC und Gefriertrocknen der Produktfraktionen wurden 81 mg (37%) der Titelverbindung erhalten.
Es(+)-MS: 566.3 (M+H)⁺

Beispiel 7

(R)-3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-phenylureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-methyl-propionsäure

7a) 4-(3-Phenylureido)-3-methoxybenzylchlorid

Zu einer Suspension von 14.07 g (51.7 mmol) 4-(3-Phenylureido)-3- methoxybenzylalkohol (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei Phenylisocyanat anstelle von 2-Methylphenylisocyanat eingesetzt wurde) in 200 ml Dichlormethan wurden 7.55 ml (103.4 mmol) Thionylchlorid zugetropft. Das Gemisch wurde dann 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, über Nacht stehen gelassen und auf 800 ml Heptan gegossen. Das Heptan wurde vom abgeschiedenen Öl abdekantiert, der Rückstand mehrmals mit Heptan aufgeschlämmt und jeweils das n- Heptan abdekantiert. Der Rückstand wurde in 100 ml Dichlormethan gelöst und in 800 ml Diisopropylether getropft. Das Gemisch wurde 1 Stunde unter Eiskühlung gerührt, das Produkt abgesaugt, mit Diisopropylether gewaschen und im Vakuum getrocknet.

7b) (S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-phenylureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-essigsäure

Zu einer Lösung von 2.8 g (11.6 mmol) der Verbindung des Beispiels 1d in 60 ml absolutem THF wurden unter Argon bei -40°C 9.32 ml einer n-Butyllithiumlösung (2.5M in Hexan) gegeben. Nach 30 Minuten Rühren bei -40°C ließ man das Reaktionsgemisch sich auf 0°C erwärmen und gab eine Lösung von 5.07 g (17.4 mmol) der Verbindung des Beispiels 7a in 20 ml N-Methyl-2-pyrrolidon zu. Man ließ das Reaktionsgemisch sich auf 0°C erwärmen und rührte dann 2 Stunden bei 0°C. Es wurden 15 ml 1N Salzsäure zugegeben, das THF im Vakuum entfernt und der Rückstand auf 300 ml Methyl-tert-butylether gegossen. Die Phasen wurden getrennt, die organische Phase mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Einengen der Produktfraktionen und anschließender Gefriertrocknung wurden 484 mg (8%) der Titelverbindung erhalten.

7c) (R)-3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-phenylureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-methyl-propionsäure

Die Verbindung wurde analog Beispiel 1 aus 120 mg (0.242 mmol) der Verbindung des Beispiels 7b und 38 mg (0.242 mmol) (R)-3-Amino-butansäure-tert-butylester durch Kopplung, chromatographische Reinigung, Spaltung des tert-Butylesters und Gefriertrocknung erhalten. Ausbeute: 113 mg (81%).
Es(+)-MS: 580.2 (M + H)⁺

Beispiel 8

(R)-3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-phenylureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-methyl-propanol

Die Verbindung wurde analog Beispiel 3 aus 172 mg (0.348 mmol) der Verbindung des Beispiels 7b und 31 mg (0.417 mmol) (R)-3-Amino-3-methyl-propanol (siehe Beispiel 3 durch Kopplung, chromatographische Reinigung (Ethylacetat/Heptan, 9/1), Einengen der Produktfraktionen und Gefriertrocknung erhalten. Ausbeute: 117 mg (59%).
Es(+)-MS: 566.3 (M + H)⁺

Beispiel 9

3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-(3-pyridyl)-propionsäure­ ethylester

Zu einer Lösung von 200 mg (0.393 mmol) der Verbindung des Beispiels 1d und 76.4 mg (0.393 mmol) 3-Amino-3-(3-pyridyl)-propionsäureethylester (Herstellung siehe J. G. Rico et al., J. Org. Chem. 58 (1993) 7948) in 5 ml absolutem DMF wurden unter Eiskühlung 129 mg (0.393 mmol) TOTU und 64 µl (0.374 mmol) N,N-Diisopropyl­ ethylamin gegeben. Nach 30 Minuten Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen.

Die Ethylacetatlösung wurde nacheinander jeweils zweimal mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase über Natriumsulfat und Filtration wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Ethylacetat an Kieselgel chromatographiert. Nach Einengen der Produktfraktionen wurden 195 mg (72%) der Titelverbindung erhalten.
Es(+)-MS: 685.4 (M + H)⁺

Beispiel 10

3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-(3-pyridyl)-propionsäure­ hydrochlorid

Zu einer Lösung von 141 mg (0.206 mmol) der Verbindung des Beispiels 9 in 7.25 ml Methanol wurden 0.82 ml (0.82 mmol) einer 1M wäßrigen Lithiumhydroxid-Lösung gegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde das Methanol im Vakuum entfernt, der Rückstand mit 1N Salzsäure auf pH 2 gestellt und das Gemisch im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan/Methanol/Eisessig/Wasser (95/510.5/0.5) an Kieselgel chromatographiert. Nach Einengen der Produktfraktionen wurde der Rückstand mit 1.1 Äquivalenten 1N Salzsäure versetzt und gefriergetrocknet. Ausbeute:120 mg (89%).
Es(+)-MS: 657.4 (M + H)⁺

Beispiel 11

3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-(3-pyridyl)-propionsäure­ isopropylester

Zu einer Suspension von 80 mg (0.122 mmol) der Verbindung des Beispiels 11 in 3 ml Dichlormethan wurden 56 µl (0.731 mmol) Isopropanol und 23.6 mg (0.193 mmol) 4-Dimethylaminopyridin gegeben. Zu der dann klaren Lösung wurden 38 mg (0.183 mmol) DCC, gelöst in 1 ml Dichlormethan, gegeben. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Filtration wurde das Filtrat im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Heptan/Ethylacetat (3/1) und Ethylacetat/Heptan (20/1) an Kieselgel chromatographiert. Nach Einengen der Produktfraktionen wurden 70 mg (82%) der Titelverbindung erhalten.
Es(+)-MS: 699.4 (M + H)⁺

Beispiel 12

3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-(4-pyridyl)-propionsäure­ ethylester

Die Verbindung wurde analog Beispiel 9 aus 200 mg (0.393 mmol) der Verbindung des Beispiels 1d und 76.4 mg (0.393 mmol) 3-Amino-3-(4-pyridyl)- propionsäureethylester (Herstellung siehe J. G. Rico et al., J. Org. Chem. 58 (1993) 7948) hergestellt. Ausbeute: 199 mg (74%).
Es(+)-MS: 685.4 (M + H)⁺

Beispiel 13

3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-(4-pyridyl)-propionsäure­ hydrochlorid

Die Verbindung wurde analog Beispiel 10 aus 143 mg (0.209 mmol) der Verbindung des Beispiels 12 hergestellt. Ausbeute: 126 mg (87%).
Es(+)-MS: 657.2 (M + H)⁺

Beispiel 14

3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-(4-pyridyl)-propionsäure­ isopropylester

Die Verbindung wurde analog Beispiel 11 aus 83 mg (0.126 mmol) der Verbindung des Beispiels 13 hergestellt. Ausbeute: 34.6 mg (39%).
Es(+)-MS: 699.4 (M + H)⁺

Beispiel 15

3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-(2-pyridyl)-propionsäure­ ethylester

Die Verbindung wurde analog Beispiel 9 aus 200 mg (0.393 mmol) der Verbindung des Beispiels 1d und 76.4 mg (0.393 mmol) 3-Amino-3-(2-pyridyl)- propionsäureethylester (Herstellung siehe J. G. Rico et al., J. Org. Chem. 58 (1993) 7948) hergestellt. Ausbeute: 226 mg (84%).
Es(+)-MS: 685.4 (M + H)⁺

Beispiel 16

3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-(2-pyridyl)-propionsäure

Die Verbindung wurde analog Beispiel 10 aus 170 mg (0.248 mmol) der Verbindung des Beispiels 15 hergestellt, aber nicht durch Zusatz von Salzsäure in das Hydrochlorid überführt. Ausbeute: 160 mg (98%).
Es(+)-MS: 657.4 (M + H)⁺

Beispiel 17

3-((S)-2-(4,4-Dimethyl-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3-(2-pyridyl)-propionsäure­ isopropylester

Die Verbindung wurde analog Beispiel 11 aus 90 mg (0.137 mmol) der Verbindung des Beispiels 16 hergestellt. Ausbeute: 39 mg (41%).
Es(+)-MS: 699.4 (M + H)⁺

Beispiel 18

(R)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3- methyl-propionsäure

18a) 2-tert-Butoxy-4,4-bis(trifluormethyl)-1,3-oxazabuta-1,3-dien

Die Verbindung wurde analog W. Steglich et al., Chem. Ber. 1974, 107, 1488-1498 hergestellt. Zur Herstellung von wasserfreiem Hexafluoraceton (HFA) wurde HFA- Trihydrat in konz. Schwefelsäure getropft, die auf 80°C erwärmt war. Das entstehende Gas wurde nochmals mit konz. Schwefelsäure gewaschen und anschließend in den Gas-Raum des Reaktionskolbens eingeleitet. Am Gasaustritt des Kolbens befand sich ein mit Aceton/Trockeneis gefüllter Rückflußkühler.

Wie vorstehend beschrieben wurde eine Lösung von 20 g (170 mmol) Carbamidsäure-tert-butylester in 150 ml Dichlormethan mit wasserfreiem HFA umgesetzt, bis die Reaktionslösung gesättigt war. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das erhaltene rohe 2-tert-Butoxycarbonylamino-2-hydroxy- 1,1,1,3,3,3-hexafluorpropan (Ausbeute: 48.3 g, 100%) weiter umgesetzt.

Zu einer Lösung von 50.05 g (176 mmol) 2-tert-Butoxycarbonylamino-2-hydroxy- 1,1,1,3,3,3-hexafluorpropan in 300 ml Diethylether wurden bei 0°C 13.6 g Trifluoressigsäureanhydrid und anschließend 5 Tropfen Chinolin getropft. Nach 10 Minuten Rühren bei 0°C wurden weitere 27.2 g Trifluoressigsäureanhydrid zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 0°C (Außentemperatur) gerührt, wobei die Innentemperatur des Gemisches auf 8-10°C anstieg. Nach Kühlen auf 0°C wurden 50.01 g (388 mmol) Chinolin zugegeben, wobei das Trifluoressigsäuresalz des Chinolins auszukristallisieren begann. Nach 2 Stunden Rühren bei 0°C wurde filtriert und das Filtrat zur Abtrennung des Salzes unter Vakuum in einen mit Aceton/Trockeneis gekühlten Vorlagekolben destilliert. Das Destillat wurde dann über eine Vigreuxkolonne destilliert. Man erhielt 36.2 g (77%) der Titelverbindung. (Übergangstemperatur 126-130°C).

18b) (S)-β-Cyclopropylalanin-tert-butylester

Bei Raumtemperatur wurden zu einer Mischung aus 50 ml Dioxan und 5 ml konzentrierter Schwefelsäure (hergestellt durch vorsichtiges Zutropfen der Säure zu Dioxan bei 5°C) 3.5 g (27.1 mmol) (S)-β-Cyclopropylalanin gegeben. Die Lösung wurde in ein Bombenrohr überführt, in das bei -78°C 40 ml Isobutylen einkondensiert wurden. Das abgeschmolzene Bombenrohr wurde anschließend bei Raumtemperatur 24 Stunden auf einer Schüttelmaschiene geschüttelt. Nach Öffnung des Bombenrohres (unter Kühlung) wurde die Reaktionsmischung vorsichtig in eine gerührte, auf 0°C gekühlte Mischung aus 30 ml Triethylamin und 50 ml Wasser eingetragen. Nach Entfernen von überschüssigem Isobutylen wurde das Produkt mit Ether (2 × 50 ml) extrahiert. Nach Trocknen der Etherphase über Magnesiumsulfat, Filtration und Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde das erhaltene Rohprodukt (leicht gelbes Öl) ohne weitere Reinigung in der folgenden Reaktion eingesetzt. Ausbeute 4.2 g (84%).

18c) (S)-N-Formyl-β-Cyclopropylalanin-tert-butylester

Eine Mischung aus 10 g (54 mmol) (S)-β-Cyclopropylalanin-tert-butylester und 4.7 g (55.2 mmol) Cyanmethyl-formiat in 100 ml Dichlormethan wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde der erhaltene Rückstand im Vakuum destilliert. Ausbeute: 8.8 g (76%). Siedepunkt 120°C/0.3 Torr.

18d) (S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropyl­ essigsäure-tert-butylester

Zu einer Lösung von 2.5 g (11.7 mmol) (S)-N-Formyl-β-cyclopropylalanin-tert­ butylester und 2.5 g (24.7 mmol) Triethylamin in 100 ml trockenem Dichlormethan wurden bei -30°C 2.4 g (12.1 mmol) Diphosgen gegeben. Man ließ die Reaktionslösung sich innerhalb 1 Stunde bis auf -15°C erwärmen und bei dieser Temperatur weiterrühren, bis die Reaktion beendet war. Die Reaktionslösung wurde anschließend bei Raumtemperatur zweimal mit 7%iger Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration wurden das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand in 70 ml Benzol aufgenommen. Zu dieser Lösung wurden 3.05 g (11.5 mmol) 4,4- Bis(trifluormethyl)-2-tert-butoxy-1,3-oxazabuta-1,3-dien in 10 ml Benzol bei Raumtemperatur zugetropft. Die Reaktionslösung wurde über Nacht bei 60°C erhitzt und anschließend Benzol im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Petrolether/Ethylacetat = 8/l). Ausbeute: 3.7 g (78%). Schmelzpunkt: 76-77°C. [α]²⁰ = -28° (c = 1, CHCl₃).

18e) (S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl­ essigsäure

Zu einer Mischung von 30 ml Trifluoressigsäure und 50 ml Dichlormethan wurde bei 10°C eine Lösung von 7 g (17.3 mmol) der Verbindung des Beispiels 18d in 20 ml Dichlormethan gegeben und das Gemisch 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen von Trifluoressigsäure und Dichlormethan im Vakuum wurden 5.9 g (98%) der Titelverbindung erhalten.
Schmelzpunkt: 123-125°C, [α]²² = -26° (c = 2, Methanol).

18f) (S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)- 2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-essigsäure

Zu einer Lösung von 1.39 g (4 mmol) der Verbindung des Beispiels 18e in 40 ml absolutem THF wurden unter Argon bei -40°C 3.2 ml einer n-Butyllithiumlösung (2.5 M in Hexan) gegeben. Man ließ das Reaktionsgemisch unter Rühren sich auf 0°C erwärmen, gab eine Lösung von 2.43 g (8 mmol) 4-(3-(2-Methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzylchlorid in 20 ml absolutem THF zu und ließ das Reaktionsgemisch 3 Stunden bei Raumtemperatur rühren. Es wurden 20 ml 1N Salzsäure zugegeben und THF im Vakuum entfernt. Die wäßrige Phase wurde zweimal mit Methyl-tert­ butylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Einengen der Produktfraktionen und Gefriertrocknung wurden 1.41 g (57%) der Titelverbindung erhalten.

18g) (R)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3- methyl-propionsäure

Die Titelverbindung kann wie in Beispiel 1f und 1 g beschrieben aus der Verbindung des Beispiels 18f und (R)-3-Amino-butansäure-tert-butylester durch Kopplung und anschließende Spaltung des tert-Butylesters erhalten werden.

Beispiel 19

(S)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3- phenyl-propionsäure

19a) (S)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3- phenyl-propionsäure-ethylester

Zu einer Lösung von 1.41 g (2.28 mmol) der Verbindung des Beispiels 18f und 442 mg (2.28 mmol) (S)-3-Amino-3-phenylpropionsäure-ethylester in 20 ml absolutem Dimethylformamid (DMF) wurden bei 0°C 748 mg (2.28 mmol) TOTU (O-((Cyan(ethoxycarbonyl)methylen)amino)-N,N,N',N'-tetramethyluronium­ tetrafluoroborat) und 368 µl N,N-Diisopropyl-ethylamin gegeben. Nach 1 Stunde Rühren bei Raumtemperatur wurde das DMF im Vakuum entfernt, der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen und die Ethylacetatlösung nacheinander mit einer wäßrigen KHSO₄/K₂SO₄-Lösung, einer gesättigten NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase über Natriumsulfat und Filtration wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Heptan/Ethylacetat (3/2) an Kieselgel chromatographiert. Durch Einengen der Produktfraktionen wurden 1.48 g (82%) der Titelverbindung erhalten.

19b) (S)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3- phenyl-propionsäure

Eine Lösung von 1.46 g (1.84 mmol) der Verbindung des Beispiels 19a in 40 ml N- Methyl-2-pyrrolidon und 20 ml 6 N Salzsäure wurde 6 Stunden auf 60°C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf 300 ml Wasser gegossen, der Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet. Das Rohprodukt wurde zweimal an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol/Essigsäure/Wasser = 95/5/0.5/0.5) chromatographiert. Nach Einengen der Produktfraktionen wurde der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und die organische Phase mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration, Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum und Gefriertrocknen wurden 1.19 g (85%) der Titelverbindung erhalten.
Es(+)-MS: 764.2 (M + H)⁺

Beispiel 20

(R)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2-methylpropyl)-acetylamino)-3- methyl-propionsäure

20a) N-Formyl-L-leucin-tert-butylester

Die Herstellung erfolgte analog W. Duczek et al., Synthesis 1996, 37-38. Zu einer Lösung von 8.94 g (40 mmol) L-Leucin-tert-butylester-hydrochlorid und 3.4 g (40 mmol) Cyanmethyl-formiat in 60 ml Dichlormethan wurde bei 0°C eine Lösung von 4.04 g (40 mmol) Triethylamin in 10 ml Dichlormethan gegeben. Die Reaktionslösung wurde sich auf Raumtemperatur erwärmen lassen, über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und anschließend zweimal mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration und Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde der erhaltene Rückstand im Vakuum destilliert. Ausbeute: 7.5 g (87%). Siedepunkt: 118°C/0.02 Torr.

20b) (S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2-methylpropyl)- essigsäure-tert-butylester

Zu einer Lösung von 2.5 g (11.6 mmol) N-Formyl-L-leucin-tert-butylester und 2.5 g (24.7 mmol) Triethylamin in 100 ml trockenem Dichlormethan wurden bei -30°C 2.4 g (12.1 mmol) Diphosgen gegeben. Man ließ die Reaktionslösung sich innerhalb 1 Stunde auf -10°C erwärmen und bei dieser Temperatur weiterrühren, bis die Reaktion beendet war. Die Reaktionslösung wurde anschließend bei Raumtemperatur zweimal mit 7%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration wurden das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand in 70 ml Benzol aufgenommen. Zu dieser Lösung wurden 3 g (11.3 mmol) 2-tert-Butoxy-4,4-bis(trifluormethyl)-1,3-oxazabuta-1,3-dien in 10 ml Benzol bei Raumtemperatur zugetropft. Die Reaktionslösung wurde über Nacht auf 60°C erhitzt und anschließend Benzol im Vakuum entfernt. Nach Chromatographie des Rückstandes an Kieselgel (Laufmittel: Petrolether/Ethylacetat = 10/l) wurden 3.7 g (80%) der Titelverbindung erhalten. Schmelzpunkt: 105-106°C. [α]²⁰ = -24° (c = 1, CHCl₃).

20c) (S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2-methylpropyl)- essigsäure

Zu einer Mischung von 30 ml Trifluoressigsäure und 50 ml Dichlormethan wurde bei 10°C eineLösung von 7 g (17.2 mmol) der Verbindung des Beispiels 20b in 20 ml Dichlormethan gegeben und das Reaktionsgemisch 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen von Trifluoressigsäure und Dichlormethan im Vakuum wurden 6.0 g (99%) der Titelverbindung erhalten. Schmelzpunkt: 154-156°C. [α]²² = -23° (c = 2, Methanol).

20d) (R)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2-methylpropyl)-acetylamino)-3- methyl-propionsäure

Die Titelverbindung wurde wie in Beispiel 1f und 1g beschrieben aus 500 mg (0.809 mmol) (S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2-methylpropyl)-essigsäure der Formel

die aus (S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2-methylpropyl)- essigsäure und 4-(3-(2-Methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzylchlorid wie im Beispiel 18f beschrieben hergestellt worden war, und 128 mg (0.809 mmol) (R)-3- Amino-butansäure-tert-butylester hergestellt. Nach Kopplung, chromatographischer Reinigung an Kieselgel (Laufmittel: Heptan/Ethylacetat = 3/2) und Spaltung des tert- Butylesters wurden 299 mg (53%) der Titelverbindung erhalten.
Es(+)-MS: 704.5 (M + H)⁺

Beispiel 21

(S)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2-methylpropyl)-acetylamino)-3- phenyl-propionsäure

21a) (S)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2-methylpropyl)-acetylamino)-3- phenyl-propionsäure-ethylester

Zu einer Lösung von 3.57 g (5.77 mmol) (S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2- methylphenyl)-ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2- methylpropyl)-essigsäure (hergestellt aus (S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-2,5- dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2-methylpropyl)-essigsäure und 4-(3-(2-Methylphenyl)- ureido)-3-methoxybenzylchlorid wie im Beispiel 18f beschrieben) und 1.11 g (5.77 mmol) (S)-3-Amino-3-phenyl-propionsäure-ethylester in 30 ml absolutem DMF wurden bei 0°C 1.89 g (5.77 mmol) TOTU und 932 µl N,N-Diisopropyl-ethylamin gegeben. Nach 1 Stunde Rühren bei Raumtemperatur wurde DMF im Vakuum entfernt, der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen und die Ethylacetatlösung nacheinander mit einer wäßrigen KHSO₄/K₂SO₄-Lösung, einer gesättigten NaHCOs- Lösung und Wasser gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase über Natriumsulfat und Filtration wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Ethylacetat/Heptan (2/3) an Kieselgel chromatographiert. Nach Einengen der Produktfraktionen wurden 3.26 g (71%) der Titelverbindung erhalten.

21b) (S)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2-methylpropyl)-acetylamino)-3- phenyl-propionsäure

Zu einer Lösung von 3.25 g (4.09 mmol) der Verbindung des Beispiels 21a in 90 ml N-Methyl-2-pyrrolidon wurden 45 ml 6 N Salzsäure gegeben und das Gemisch 6 Stunden auf 60°C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch auf 600 ml Wasser gegossen. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet. Nach zweimaliger chromatographischer Reinigung des Rohprodukts an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol/Essigsäure/Wasser = 95/5/0.5/0.5) und Einengen der Produktfraktionen wurde der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen. Die organische Phase wurde zweimal mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration, Einengen und Gefriertrocknen wurden 2.7 g (86%) der Titelverbindung erhalten.
ES(+)-MS: 766.2 (M + H)⁺

Beispiel 22

(S)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2-methylpropyl)-acetylamino)-3- phenyl-propionsäure-Natriumsalz

Zu einer Suspension von 1 g (1.3 mmol) der Verbindung des Beispiels 21 in 100 ml Acetonitril und 200 ml Wasser wurden unter Rühren 1.24 ml 1 N Natronlauge (verdünnt mit 20 ml Wasser) gegeben. Nach Gefriertrocknen der Lösung wurden 1.01 g (79%) der Titelverbindung erhalten.
ES(+)-MS: 766.2 (3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-(2-methylpropyl)-acetylamino)-3- phenyl-propionsäure + H)⁺

Beispiel 23

(S)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)-ureido)-3- methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl-acetylamino)-3- phenyl-propionsäure-Natriumsalz

Aus 720 mg der Verbindung des Beispiels 19b wurde nach dem in Beispiel 22 beschriebenen Verfahren 720 mg (99%) der Titelverbindung erhalten.
ES(+)-MS: 764.3 ((S)-3-((S)-2-(4,4-Bis(trifluormethyl)-3-(4-(3-(2-methylphenyl)­ ureido)-3-methoxybenzyl)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-cyclopropylmethyl­ acetylamino)-3-phenyl-propionsäure + H)⁺

Untersuchung der biologischen Aktivität A) U937/VCAM-1 Zelladhäsionstest

Als Testmethode für die Wirksamkeit der Verbindungen der Formel I auf die Interaktion zwischen VCAM-1 und VLA-4 wird der im folgenden beschriebene Assay verwendet, der für diese Interaktion spezifisch ist. Die zellulären Bindungspartner, d. h. die VLA-4-Integrine, werden in ihrer natürlichen Form als Oberflächenmoleküle auf humanen U937-Zellen (ATCC CRL 1593), die zur Gruppe der Leukozyten gehören, angeboten. Als spezifische Bindungspartner werden gentechnisch hergestellte rekombinante lösliche Fusionsproteine, bestehend aus der extrazytoplasmatischen Domäne von humanen VCAM-1 und der konstanten Region eines humanen Immunglobulins der Subklasse IgG1, vervendet.

Assay zur Messung der Adhäsion von U937-Zellen (ATCC CRL 1593) an hVCAM-1(1-3)-IgG 1. Herstellung von humanem VCAM-1(1-3)-IgG und humanem CD4-IgG

Eingesetzt wurde ein genetisches Konstrukt zur Expression der extrazellulären Domäne des humanen VCAM-1, verbunden mit der genetischen Sequenz der schweren Kette des humanen Immunglobulins IgG1 (Hinge, CH2 und CH3 Regionen) (von Dr. Brian Seed, Massachusetts General Hospital, Boston, USA; vgl. Damle und Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 6403). Das lösliche Fusionsprotein hVCAM-1(1-3)-IgG enthielt die drei aminoterminalen extrazellulären Immunglobulin-ähnlichen Domänen des humanen VCAM-1 (Damle und Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 6403). CD4-IgG (Zettlmeissl et al., DNA and Cell Biology 1990, 9, 347) diente als Fusionsprotein für negative Kontrollen. Die rekombinanten Proteine wurden als lösliche Proteine nach DEAE/Dextran­ vermittelter DNA-Transfektion in COS-Zellen (ATCC CRL1651) gemäß Standardprozeduren exprimiert (Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994).

2. Assay zur Messung der Adhäsion von U937-Zellen an hVCAM-1(1-3)-IgG

• 1. 96 well-Mikrotitertestplatten (Nung Maxisorb) wurden mit 100 µl/well einer Ziege-anti-human-IgG-Antikörperlösung (10 µg/ml in 50 mM Tris, pH 9.5) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Antikörperlösung wurde einmal mit PBS gewaschen.
• 2. 150 µl/well eines Blockierungspuffers (1% BSA in PBS) wurden 0.5 Stunden bei Raumtemperatur auf den Platten inkubiert. Nach Entfernen des Blockierungspuffers wurde einmal mit PBS gewaschen.
• 3. 100 µl pro well eines Zellkulturüberstandes von transfektierten COS-Zellen wurden für 1.5 Stunden bei Raumtemperatur auf den Platten inkubiert. Die COS- Zellen waren mit einem Plasmid transfiziert, welches für die drei N-terminalen Immunglobulin-ähnlichen Domänen des VCAM-1, gekoppelt an den Fc-Teil von humanem IgG₁ (hVCAM-1(1-3)-IgG), codiert. Der Gehalt an hVCAM-1(1-3)-IgG betrug ca. 0.5-1 µg/ml. Nach Entfernen des Kulturüberstandes wurde einmal mit PBS gewaschen.
• 4. Die Platten wurden mit 100 µl/well Fc-Rezeptor-Blockpuffer (1 mg/ml γ- Globulin, 100 mM NaCl, 100 µM MgCl₂, 100 µM MnCl₂, 100 µM CaCl₂, 1 mg/ml BSA in 50 mM HEPES, pH 7.5) für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen des Fc-Rezeptor-Blockpuffers wurde einmal mit PBS gewaschen.
• 5. 20 µl Bindungspuffer (100 mM NaCl, 100 µM MgCl₂, 100 µM MnCl₂, 100 µM CaCl₂, 1 mg/ml BSA in 50 mM HEPES, pH 7.5) wurden vorgelegt, die zu testenden Substanzen in 10 µl Bindungspuffer zugegeben und für 20 Minuten inkubiert. Als Kontrollen dienten Antikörper gegen VCAM-1 (BBT, Nr. BBA6) und gegen VLA-4 (Immunotech, Nr. 0764).
• 6. U937-Zellen wurden 20 Minuten in Fc-Rezeptor-Blockpuffer inkubiert und anschließend in einer Konzentration von 1 × 10⁶/ml und in einer Menge von 100 µl pro well zupipettiert (Endvolumen 125 µl/well).
• 7. Die Platten wurden in einem 45°-Winkel in Stop-Puffer (100 mM NaCl, 100 µM MgCl₂, 100 µM MnCl₂, 100 µM CaCl₂ in 25 mM Tris, pH 7.5) langsam eingetaucht und ausgeschlagen. Der Vorgang wurde wiederholt.
• 8. Anschließend wurden 50 µl/well einer Färbelösung (16.7 µg/ml Hoechst Farbstoff 33258, 4% Formaldehyd, 0.5% Triton-X-100 in PBS) 15 Minuten auf den Platten inkubiert.
• 9. Die Platten wurden ausgeschlagen und in einem 45°-Winkel in Stop-Puffer (100 mM NaCl, 100 µM MgCl₂, 100 µM MnCl₂, 100 µM CaCl₂ in 25 mM Tris, pH 7.5) langsam eingetaucht. Der Vorgang wurde wiederholt. Anschließend wurden die Platten mit der enthaltenen Flüssigkeit (Stop-Puffer) in einem Cytofluorimeter (Mlllipore) gemessen (Sensitivität: 5, Filter: Anregungswellenlänge: 360 nm, Emissionswellenlänge: 460 nm).

Die Intensität des von den angefärbten U937-Zellen emittierten Lichts ist ein Maß für die Zahl der an der Platte verbliebenen, an das hVCAM-1(1-3)-IgG adhärierten U937-Zellen und somit ein Maß für die Fähigkeit der zugesetzten Testsubstanz, diese Adhäsion zu hemmen. Aus der Hemmung der Adhäsion bei verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanz wurde die Konzentration IC₅₀ berechnet, die zu einer Hemmung der Adhäsion um 50% führt.

3. Ergebnisse

Im U937VCAM-1 Zelladhäsionstest wurden folgende Ergebnisse erhalten (IC₅₀- Werte in nM (Nanomol/Liter)).

Verbindung des Beispiels Nr.
IC50 (nM)
1	0.3
2	0.5
5	25.9
7	2.1
10	0.6
13	1.8
16	0.9
19	4.4

Die pharmakologischen Eigenschaften der Verbindungen der Formel I können auch in den folgenden Modellen untersucht werden.

B) Leukozytenadhäsion an der Ratte

In dem Modell der Leukozytenadhäsion an der Ratte wird die Beeinflussung der Adhäsion von Leukozyten durch die Verbindungen der Formel I in Venolen der Ratte untersucht. Die Leukozytenadhäsion an das Endothel von postkapillaren Venolen wird als wichtiger Schritt bei Entzündungsreaktionen angesehen (J. M. Harlan, Blood 1985, 65, 513). Bei der Rekrutierung von Leukozyten aus dem Blut in entzündete Bereiche läuft eine wohlkoordinierte dynamische Sequenz von Ereignissen ab, in der chemotaktische Cytokine und zelluläre Adhäsionsmoleküle eine aktive Rolle spielen. Es wurde gefunden, daß VCAM-1/VLA-4-Wechselwirkungen eine entscheidende Rolle spielen bei der Adhäsion und Emigration von Leukozyten und der gesteigerten Permeabilität von Gefäßen für Makromoleküle, die durch verschiedene Mediatorsubstanzen und Cytokine induziert werden (D. Seiffge, Int. J. Microcirc. 1995, 15, 301). In dem vorliegenden Modell wird durch lokale oder systemische Injektion von Endotoxinen, zum Beispiel Zymosan, Bakterientoxinen wie Lipopolysacchariden (LPS) oder Freunds Adjuvanz, eine generalisierte Entzündung bzw. rheumatoide Arthritis hervorgerufen, die zu einer Adhäsion der Leukozyten und ihrer Emigration in erkrankte Organbereiche führt. Bestimmt wird die durch das Endotoxin hervorgerufene gesteigerte Adhäsion an das Endothel der Venolen.

Zur Bestimmung der Leukozytenadhäsion wird ein Kamera-Umkehrmikroskop (Fa. Zeiss) verwendet, das mit einem Videosystem ausgerüstet ist. Männlichen Sprague- Dawley Ratten (Körpergewicht ca. 250 g) wird unter einer leichten Halothan- Prämedikation Zymosan oder Bakterienendotoxin injiziert. Die Kontrolltiere erhalten ein gleiches Volumen 0.9%ige Kochsalzlösung. Anschließend wird den Tieren die Testsubstanz subkutan oder oral als Einmaldosis oder als Mehrfachdosis verabreicht. Für die Durchführung der Messung werden die Ratten durch eine intramuskuläre Injektion von 1.25 g/kg Urethan betäubt. Man läßt sie durch einen Trachealtubus spontan atmen. Die Körpertemperatur wird mittels einer regulierbaren Heizdecke bei 37°C gehalten. Auf einem thermostatisierten (37°C) Fenster des Mikroskoptisches wird durch eine Bauchöffnung das Dünndarmgekröse vorsichtig freigelegt und bei 37°C mit flüssigem Paraffin bedeckt. Mit drei stumpfen Nadeln und Knetmasse wird der Ileocekalbereich des Gekröses in Position gehalten. Nach einer 30minütigen Äquilibrierungszeit, während der sich das Gewebe stabilisieren kann, wird in postkapillaren Venolen von 20-30 µm Durchmesser und ca. 100 µm Länge die Leukozytenadhäsion bestimmt durch Zählung in 2-3 Segmenten der Venolen in Abständen von 10 Minuten über 1 Stunde. Ein Leukozyt wird als an das Endothel adhärent angesehen, wenn er für mehr als 30 Sekunden stationär ist. Nach dem Experiment wird die systemische Leukozytenzahl und der Fibrinogengehalt des Blutes bestimmt. Die Hemmung der Leukozytenadhäsion durch die Testsubstanz wird angegeben durch die Verringerung (in %) der Zahl der adhärenten Leukozyten in den behandelten Tieren im Vergleich zu der Zahl in den Kontrolltieren.

C) Hypersensitivität vom verzögerten Typ an der Maus

In dem Modell der Hypersensitivität vom verzögerten Typ (DTH; delayed-type hypersensitivity) wird die antiallergische bzw. entzündungshemmende Wirkung der Verbindungen der Formel 1 untersucht. DTH ist eine entzündliche Reaktion der Haut, die durch eine Sensibilisierung mit antigenen Substanzen ausgelöst wird. Um die entsprechende Entzündungsreaktion und die Leukozyten-Rekrutierung in den entzündeten Bereichen in vivo zu ermitteln, werden die Substanzen in dem folgenden DTH-Modell an der Maus getestet (siehe auch T. B. Issekutz, J. Immunol. 1991, 147, 4178).

Gruppen von weiblichen BALB/c-Mäusen (Körpergewicht ca. 20 g) werden an einem rasierten Teil der Haut epikutan mit 150 µl einer 3%igen Lösung von Oxazolon sensibilisiert, das eine starke entzündliche DTH-Reaktion induziert. 6 Tage später wird die Reaktion durch Gabe von 20 µl einer 1%igen Oxazolonlösung am rechten Ohr der Tiere ausgelöst. Die Testsubstanzen werden jeweils 44 Stunden vor der Auslösung der Reaktion, 20 Stunden vor der Auslösung und 4 Stunden nach der Auslösung subkutan oder oral verabreicht. Direkt vor der Auslösung der Reaktion und 24 Stunden nach der Auslösung wird mit einem Mitutoyo Engineering- Mikrometer die durch die entzündliche Schwellung des Ohres veränderte Ohrdicke am rechten Ohr gemessen. Die Differenz zwischen diesen beiden Messungen wird für jedes Tier der Gruppe ermittelt. Die Mittelwerte der Differenzen einer mit der Testsubstanz behandelten Tiergruppe einerseits und einer unbehandelten Kontrollgruppe andererseits werden verglichen. Als Maß für den Effekt der Substanz wird die prozentuale Inhibition der Ohrschwellung angegeben.

D) Anti-asthmatische Wirkung am Meerschweinchen

Die Beeinflussung der Lungenfunktion und die anti-asthmatische Wirkung der Verbindungen der Formel I kann in einem Modell am Meerschweinchen bestimmt werden, das sich an die von G. Moacevic, Arch. Toxicol. 1975, 34, 1, beschriebene Methode anlehnt. Dazu werden die technischen Vorbereitungen für die Untersuchung entsprechend den von Moacevic beschriebenen Einzelheiten durchgeführt. Eingesetzt werden männliche Albino-Meerschweinchen mit einem Körpergewicht von 300-500 g. Die Tiere werden in einen Plethysmograph (Fa. FMI) gesetzt und drei Ausgangswerte der Parameter Atemfrequenz und Atemamplitude werden aufgenommen. In diesem Modell ist eine asthmatische Atmung charakterisiert durch die Abnahme der Atemamplitude (= Verringerung des Atemvolumens aufgrund der Bronchokonstriktion) und die Zunahme der Atemfrequenz (= Reflexreaktion). Dieser Zustand ist in Asthmapatienten als Dyspnoe bekannt.

Die Albino-Meerschweinchen werden 22 Tage vor dem Beginn der Studie sensibilisiert mit 1 ml pro Tier einer 0.1%igen Ovalbuminlösung an zwei aufeinander folgenden Tagen. Der experimentelle Asthma-Anfall wird durch Inhalation einer 0.3%igen Ovalbuminlösung für 1 Minute ausgelöst. Nach einer Erholungsphase von 40-60 Minuten inhalieren die Tiere die Testsubstanz als wäßrige Lösung. Sofort danach wird für 1 Minute 0.3%ige Ovalbuminlösung verabreicht. In der folgenden Erholungsphase von 30 Minuten atmen die Tiere normale Luft. Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt. Wenn die Asthma-Anfälle lebensbedrohlich werden, wird den Tieren Sauerstoff verabreicht.

Die anti-asthmatische Wirkung am Schafkann zum Beispiel wie von Abraham et al., J. Clin. Invest. 1994, 93, 776, beschrieben bestimmt werden.

E) Die anti-atherosklerotische Wirkung kann in den folgenden Tiermodellen untersucht werden Cuff-Modell der Neointimabildung

Die Wildtyp-Mäuse des Stammes C57BU6 J werden von dem Zuchtbetrieb Charles River Wiga GmbH (Sulzfeld) und die homozygoten KO-Mäuse des Stammes C57BU6J-ApoE tm1 Unc (ApoE KO) werden von The Jackson Laboratory (Maine, USA) geliefert. Alle Mäuse sind bei Versuchsbeginn zwischen 10 und 12 Wochen alt und werden in vollklimatisierten Räumen bei einer Temperatur von 22°C gehalten. Die Tag/Nachtphase des kontrollierten Lichtprogramms ist auf einen Zeitraum von 12 Stunden eingestellt. Die Mäuse werden zunächst mit 60 mg/kg Körpergewicht Pentobarbital-Natrium i.p. narkotisiert. Anschließend erhielt jedes Tier zusätzlich 0.01 mg/10 g Körpergewicht Xylazin i.m.

Die Mäuse werden in Rückenlage fixiert, die Innenflächen beider Hinterbeine rasiert und desinfiziert. Nun wird die Haut an der Innenseite des linken Oberschenkels mit einem etwa 1 cm langen Längsschnitt eröffnet und die Arteria femoralis vom umliegenden Gewebe und von der Vena femoralis sowie dem Nervus ischiadicus isoliert. Dann wird ein etwa 2 mm langes Stück eines Polyethylen-Schlauchs (Innendurchmesser 0.58 mm, Außendurchmesser 0.965 mm, Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) der Länge nach aufgeschnitten und um die Arteria femoralis gelegt und mit Prolene-Fäden (7/0, 0.5 metric von Ethicon, Norderstedt) fixiert. Anschließend wird die Haut mit einer fortlaufenden Naht wieder geschlossen. Das rechte Hinterbein wird in analoger Weise operiert, jedoch ohne daß ein "Cuff" um die Arteria femoralis plaziert wird. Anschließend wird das Tier wieder in seinen Käfig gebracht. Ab der Operation werden die Tiere täglich mit der Testsubstanz behandelt.

Am Versuchsende werden die Mäuse erneut mit 60 mg/kg Körpergewicht Pentobarbital-Natrium i.p. und 0.01 mg/10 g Körpergewicht Xylazin i.m. narkotisiert. Zur Fixation der Gefäße in situ erhält jede Maus dann eine Injektion von 4%iger Formalinlösung in die Bauchaorta. Dann werden die rechte und die linke Arteria femoralis entnommen. Es wird auf der linken Seite das Teilstück der Arterie entnommen, das den Bereich etwa 1 mm proximal des "Cuff", das vom "Cuff" umschlossene Teilstück selbst und den Gefäßabschnitt 1 mm distal einschließt. Auf der rechten Seite entspricht dieses Teilstück dem Bereich, der während der Operation nur isoliert, aber nicht mit einem "Cuff" umschlossen wird.

Die in 4%iger Formalinlösung fixierten Teilstücke der linken und der rechten Arteria femoralis werden in Paraffin eingebettet. Aus dem vom "Cuff" umhüllten Bereich der linken Arterie bzw. von dem entsprechendem Bereich der rechten Kontrollarterie werden mehrere Querschnitte hergestellt, die anschließend mit Hämatoxilin und Eosin zur softwaregestützten (LeicaQWin von Leica Imaging Systems, Cambridge, GB) morphometrischen Analyse gefärbt werden.

Pro Maus werden drei Gewebeschnitte aus dem vom "Cuff" umhüllten Bereich der linken Arteria femoralis sowie drei Schnitte aus dem entsprechenden Bereich der rechten Kontrollarterie ausgewertet. Nach Markierung der Lamina elastica externa, der Lamina elastica interna und der Grenze zwischen Lumen und Endothel werden vom Analysenprogramm folgende Flächen berechnet: Lumen, Neointima und Media. Die Größe dieser Flächen wird in der Einheit µm² angegeben. Die Wirkung einer Verbindung äußert sich in der Reduktion des Verhältnisses von Neointima/Media im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Herztransplantation

Im Modell der allogenen Herztransplantation werden Transplantationen zwischen zwei genetisch inkompatiblen Rattenstämmen durchgeführt. Hierzu werden Wistar- Furth-Ratten als Spendertiere und Lewis-Ratten als Empfängertiere benutzt. Die Tiere werden von dem Zuchtbetrieb Charles River Wiga GmbH (Sulzfeld, BRD) bezogen. Männliche, 270-330 g schwere Lewis-Ratten im Alter von 2.5 bis 3 Monaten, und männliche, 200-250 g schwere Wistar-Furth-Ratten im After von 1.5 bis 2 Monaten werden unter konstanten, kontrollierten Bedingungen gehalten (Temperatur 19-22°C; relative Luftfeuchtigkeit 50-55%; die Tag/Nachtphase des kontrollierten Lichtprogramms ist auf einen Zeitraum von 12 Stunden eingestellt).

Für die Operation erhalten die Ratten eine Kombination aus 3.3 mg/kg Körpergewicht Xylazin und 115 mg/kg Körpergewicht Ketamin. Nach Eintritt der Narkosewirkung wird das Abdomen des Empfängers median eröffnet. Die Aorta abdominalis und Vena cava caudalis wird zwischen renaler Arterie und Vene und den Iliolumbal- Gefäßen voneinander getrennt. Die Aorta wird anschließend kranial mit einem Gefäßclip verschlossen. Kaudal wird ein Seidenfaden um beide Gefäße gelegt und angezogen. Ein zweiter Seidenfaden liegt locker um das kraniale Ende der Vena cava caudalis. Das Spendertier wird nach Eröffnung der Bauchhöhle mittels Durchtrennen der großen Bauchgefäße getötet. Dieser Zeitpunkt signalisierte den Beginn der Ischämiezeit des Spenderorgans. Anschließend wird das Diaphragma eröffnet und das Herz freigelegt. Die Vena cava cranialis und caudalis werden ligiert und herzfern der Ligatur durchtrennt. Es folgte eine Massenligatur der Pulmonalvenen mit einem Seidenfaden. Die Aorta und Arteria pulmonalis werden anschließend mit einer Pinzette angehoben und durchtrennt. Das Transplantat wird nun von Blutresten im Gefäßsystem befreit. Anschließend wird das Herz angehoben, mitsamt der Massenligatur von der Lunge abgesetzt und in kalter physiologischer NaCl-Lösung für ein bis zwei Minuten aufbewahrt. Anschließend erfolgt eine End-zu- Seit Anastomose der Aorta bzw. der Arteria pulmonalis des Spenderorgans mit der Arteria abdominalis bzw. Vena caudalis des Empfängertiers. Nach Beendigung der Gefäßanastomosen wird nacheinander der venöse Kreislauf gefolgt vom arteriellen Kreislauf freigeben. Abschließend wird die Bauchhöhle mit einer Peritonaeum/Muskelnaht und einer Hautnaht wieder verschlossen. Nach Freigabe der Blutzirkulation und einer kurzen Erholungsphase schlägt das transplantierte Herz mit einer Sinusfrequenz von ca. 100 bis 120 Schlägen/Minute. Cyclosporin A (CSA) zur Immunsuppresion wird entweder subcutan (s.c.) oder oral über das Trinkwasser verabreicht. Nach Überwindung der akuten Abstoßungsperiode kann die Dosis von 25 mg/kg Körpergewicht ab dem 15. Tag p.op. auf 5 mg/kg Körpergewicht reduziert werden. Die Injektionen werden einmal täglich morgens im Nackenbereich der Tiere vorgenommen.

Die Umstellung von s.c. CSA-Gabe zu oraler CSA-Gabe erfolgt am Tag 22 p.op., um die akute Abstoßungsperiode sicher überwunden zu haben. Die zu untersuchende Substanz wird ab der Operation über 100 Tage appliziert. Nach Ablauf des Beobachtungszeitraumes (100 Tage) werden die Tiere in Narkose gelegt und die Bauchhöhle eröffnet. Anschließend wird das Herz unter Schonung der Gefäßstümpfe von den Bauchgefäßen abgesetzt, in Scheiben geschnitten und in 4% Formalinlösung aufbewahrt. Nach erfolgter Fixierung der Herzscheiben werden diese in Paraffin eingebettet und nach standardisierter histologischer Technik nach Elastica von Gieson gefärbt. Die Klassifikation der neointimalen Proliferation und der damit verbundenen Verengung des Gefäßlumens wird nach Adams et al. (Transplantation 1993, 56,794) vorgenommen. Klassifiziert werden Zubildungen zwischen Lamina elastica interna und Endothel. Die elastische Fasern selektiv hervorhebende Spezialfärbung nach von Gieson erleichtert die Beurteilung. Die Wirkung einer Verbindung äußert sich in der Reduktion der neointimalen Proliferation und damit der Transplantatatherosklerose im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Atherosclerose-Modell in ApoE knockout(KO)-Mäusen

Die homozygoten KO-Mäuse des Stammes C57BU6 J-ApoE tml Unc (ApoE KO) werden von The Jackson Laboratory (Maine, USA) geliefert. Alle Mäuse sind bei Versuchsbeginn zwischen 10 und 12 Wochen alt und werden auf Standardeinstreu für Labortiere (Altromin, Lage) in vollklimatisierten Räumen bei einer Temperatur von 22°C gehalten. Die Tag-/Nacht-Phase des kontrollierten Lichtprogramms ist auf einen Zeitraum von 12 Stunden eingestellt. Die Tiere werden für 4 Monate mit der Testsubstanz behandelt.

Am Versuchsende werden die Mäuse mit 60 mg/kg Körpergewicht Pentobarbital- Natrium i.p. und 0.01 mg/10 g Körpergewicht Xylazin i.m. narkotisiert. Anschließend werden Herz und Aortenbogen sowie die deszendierende thorakale Aorta entnommen und in 4%iger Formalinlösung fixiert. Die deszendierende Aorta wird mit Ölrot O zur Anfärbung von Fettläsionen behandelt. Die morphometrische Analyse der Fettläsionen erfolgt mit einem Mikroskop (Typ Leitz DM RBE von Leica, Bensheim), einer daran angeschlossenen Kamera mit Steuerungseinheit (Typ CF 15 MCC, Kappa Meßtechnik, Gleichen) sowie einem Computer (Leica, Bensheim). Die Messungen erfolgen mit Hilfe eines Computerprogramms zur Bildanalyse (LeicaQWin von Leica Imaging Systems, Cambridge, GB). Das Herz und der Aortenbogen werden longitudinal geschnitten und mit Hämatoxilin und Eosin zur morphometrischen Analyse gefärbt. Es werden jeweils 15-20 Schnitte ausgewertet. Weitere Schnitte werden immunhistochemisch auf Makrophagen und T-Lymphozyten untersucht. Die Wirkung einer Verbindung äußert sich in der Reduktion der Plaquebildung in der Aorta im Vergleich zur Kontrollgruppe.

F) Die cardioprotektive Wirkung kann zum Beispiel im folgendem Tiermodell untersucht werden Herzinfarktgröße in der Ratte

Männliche Wistar-Ratten werden von dem Zuchtbetrieb Charles River Wiga GmbH (Sulzfeld, BRD) im Alter von 2.5 bis 3 Monaten und mit einem Körpergewicht von 270-330 g bezogen. Die Tiere werden unter konstanten, kontrollierten Bedingungen gehalten (Temperatur 19-22°C; relative Luftfeuchtigkeit 50-55%; die Tag/Nachtphase des kontrollierten Lichtprogramms ist auf einen Zeitraum von 12 Stunden eingestellt). Für die Operation erhalten die Ratten eine Kombination aus 3.3 mg/kg Körpergewicht Xylazin und 115 mg/kg Körpergewicht Ketamin. Anschließend werden die Tiere intubiert und mit 30% Sauerstoff beatmet. Der Brustkorb wird rasiert, desinfiziert und durch eine linkslaterale Thorakotomie eröffnet. Die linke Koronararterie wird 2-3 mm unterhalb des linken Herzohrs permanent für 48 Stunden oder 4 Wochen ligiert, oder sie wird für 30 Minuten ligiert und für 47.5 Stunden oder 4 Wochen reperfundiert.

Nach der Operation wird der Brustkorb wieder verschlossen und die Tiere nach Einsetzen der Spontanatmung extubiert. Die Testsubstanz wird 30 Minuten nach der Ligatur oder unmittelbar vor der Reperfusion appliziert. Anschließend werden die Tiere täglich mit der Testsubstanz behandelt. Am Versuchsende werden die Tiere erneut mit einer Kombination aus 3.3 mg/kg Körpergewicht Xylazin und 115 mg/kg Körpergewicht Ketamin narkotisiert. Zur Wandbewegungsanalyse werden die Tiere, bei denen die Herzen reperfundiert wurden, mittels "Nuklear Magnet Resonanz Imaging" untersucht. Bei Tieren mit nicht-reperfundierten Herzen wird über die rechte Arteria Karotis ein Tip-Katheter zur Messung des Ventrikeldrucks und der Kontraktilität in die linke Herzkammer eingebracht. Anschließend wird bei allen Tieren das Harz entnommen und in einer Langendorff-Apparatur retrograd über die Aorta mit 37°C warmer 1%iger Evans Blue-Lösung zur Bestimmung des anatomischen Risikoareals und des nicht-ischämischen Areals perfundiert. Anschließend werden die Herzen in 5-6 dünne Scheiben geschnitten und in 2,3,5- Triphenyltetrazoliumchlorid-Lösung für 15 Minuten zur Bestimmung des vitalen und des abgestorbenen Herzgewebes inkubiert. Die planimetrische Analyse des Risikoareals und der Infarktregion erfolgt mit einer Kamera (Leica, Bensheim) und einer angeschlossenen Computereinheit mit Analysesoftware (Leitz, Bensheim). Das Risikoareal ausgedrückt in Prozent bezogen auf den linken Ventrikel plus Septum und die lnfarktregion in Prozent bezogen auf das Risikoareal. Die Wirkung einer Verbindung äußert sich in der Reduktion der Infarktregion bezogen auf das Risikoareal im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Claims (16)

1. Verbindungen der Formei I,
worin
A für Cyclopropylmethyl- oder Isobutyl steht,
E für -CO-R⁶, -CO-H oder -CH₂-O-R⁷ steht;
Z für Sauerstoff oder Schwefel steht;
R¹ für Wasserstoff oder Methyl steht;
R² für Phenyl, Pyridyl oder (C₁-C₄)-Alkyl steht, wobei der Alkylrest durch ein oder mehrere Fluoratome substituiert sein kann und der Phenylrest durch einen oder mehrere gleiche oder verschiedene Substituenten aus der Reihe (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁- C₄)-Alkoxy, Methylendioxy, Ethylendioxy, Halogen, Trifluormethyl und Trifluormethoxy substituiert sein kann;
R³ und R⁴ für Methyl oder Trifluormethyl stehen;
R⁵ für Wasserstoff oder (C₁-C₄)-Alkyl steht, wobei der Alkylrest durch ein oder mehrere Fluoratome substituiert sein kann;
R⁵ für Hydroxy, (C₁-C₁₀)-Alkoxy, Phenyl-(C₁-C₈)-alkoxy-, Phenyloxy-, (C₁-C₈)- Alkylcarbonyloxy-(C₁-C₆)-alkoxy-, Phenylcarbonyloxy-(C₁-C₆)-alkoxy-, Phenyl-(C₁- C₆)-alkylcarbonyloxy-(C₁-C₆)-alkoxy-, (C₁-C₈)-Alkoxycarbonyloxy-(C₁-C₆)-alkoxy-, Phenyloxycarbonyloxy-(C₁-C₆)-alkoxy-, Phenyl-(C₁-C₆)-alkoxycarbonyloxy-(C₁-C₆)- alkoxy-, Amino, Mono-((C₁-C₁₀)-alkyl)-amino- oder Di-((C₁-C₁₀)-alkyl)-amino- steht;
R⁷ für Wasserstoff oder (C₁-C₄)-Alkyl steht;
in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

2. Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch 1, worin R³ und R⁴ beide für Methyl stehen oder beide für Trifluormethyl stehen, in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

3. Verbindungen der Formel I gemäß den Ansprüchen 1 und/oder 2, worin Z für Sauerstoff steht, in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

4. Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, worin R¹ für Methyl steht und R⁵ für Methyl steht, in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

5. Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, worin R² für Pyridyl, für unsubstituiertes Phenyl, für Phenyl, das durch einen Methylendioxyrest oder einen Ethylendioxyrest substituiert ist, für Phenyl, das durch eine oder zwei (C₁-C₄)-Alkoxygruppen substituiert ist, oder für (C₁-C₄)-Alkyl, das durch ein oder mehrere Fluoratome substituiert sein kann, steht, in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

6. Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, worin E für -CO-R⁶ oder -CH₂-OH steht und R⁵ für Hydroxy, (C₁-C₆)-Alkoxy- oder Amino steht, in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

7. Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 worin
A für Cyclopropylmethyl- oder Isobutyl steht;
E für -COOH, -COOC₂H₅, -COOiC₃H₇ oder -CH₂-OH steht;
Z für Sauerstoff steht;
R¹ für Methyl steht;
R² für unsubstituiertes Phenyl, Pyridyl oder Methyl steht;
R³ und R⁴ für Methyl stehen;
R⁵ für Methyl steht;
in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

8. Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, worin
A für Cyclopropylmethyl- oder Isobutyl steht;
E für -COOH, -COOC₂H₅, -COOiC₃H₇ oder -CH₂-OH steht;
Z für Sauerstoff steht;
R¹ für Methyl steht;
R² für unsubstituiertes Phenyl, Pyridyl oder Methyl steht;
R³ und R⁴ für Trifluormethyl stehen;
R⁵ für Methyl steht;
in allen ihren stereoisomeren Formen und Mischungen davon in allen Verhältnissen, und ihre physiologisch verträglichen Salze.

9. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel 1 gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der Formel II mit einer Verbindung der Formel III
umgesetzt wird, wobei A, E, Z, R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ wie in den Ansprüchen 1 bis 8 definiert sind oder funktionelle Gruppen in geschützter Form oder in Form von Vorstufen enthalten sind, und wobei G für Hydroxycarbonyl, (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl oder aktivierte Carbonsäurederivate steht.

10. Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 und/oder ihre physiologisch verträglichen Salze und/oder Prodrugs zur Verwendung als Arzneimittel.

11. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es eine oder mehrere Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 und/oder ihre physiologisch verträglichen Salze und/oder Prodrugs und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.

12. Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 und/oder ihre physiologisch verträglichen Salze und/oder Prodrugs zur Verwendung als Entzündungshemmstoffe.

13. Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 und/oder ihre physiologisch verträglichen Salze und/oder Prodrugs zur Verwendung in der Behandlung der Arthritis, der rheumatoiden Arthritis, der Polyarthritis, der inflammatorischen bowel disease, des systemischen Lupus erythematosus, der multiplen Sklerose oder von inflammatorischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems.

14. Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 und/oder ihre physiologisch verträglichen Salze und/oder Prodrugs zur Verwendung in der Behandlung von Asthma oder Allergien.

15. Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 und/oder ihre physiologisch verträglichen Salze und/oder Prodrugs zur Verwendung in der Behandlung von cardiovaskulären Erkrankungen, der Atherosklerose, des Myocardinfarkts, des akuten Coronarsyndroms, von Restenosen, von Diabetes, der Schädigung von Organtransplantaten, von Immunerkrankungen, von Autoimmunerkrankungen, von Tumorwachstum oder Tumormetastasierung, oder Malaria, oder zur Cardioprotektion.

16. Verbindungen der Formel I gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 und/oder ihre physiologisch verträglichen Salze und/oder Prodrugs zur Verwendung als Hemmstoffe der Adhäsion und/oder Migration von Leukozyten oder zur Hemmung des VLA-4-Rezeptors.