DE10101793A1

DE10101793A1 - Verwendung von SLPI zur Behandlung chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen

Info

Publication number: DE10101793A1
Application number: DE10101793A
Authority: DE
Inventors: Manfred Nilius
Original assignee: Individual
Current assignee: Vivotec Biomedical Technologies 39114 Magdeb GmbH
Priority date: 2001-01-17
Filing date: 2001-01-17
Publication date: 2002-08-01
Also published as: EP1353680A2; WO2002056900A2; US20040106564A1; JP2004520362A; WO2002056900A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verwendung von sekretorischem Leukocyten-Protease-Inhibitor (SLPI) oder eines zur SLPI-Bildung befähigten nicht-pathogenen Mikroorganismus, der eine SLPI codierende Nucleinsäure enthält, zur Behandlung chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen von Mensch und Tier, pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen oder rektalen Verabreichung, die den Wirkstoff SLPI oder SLPI-exprimierende Mikroorganismen enthalten, sowie Verfahren zur Herstellung dieser pharmazeutischen Zusammensetzungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von sekretorischem Leukocyten-Protease-Inhibitor (SLPI) oder eines zur SLPI-Bildung befähigten nicht-pathogenen Mikroorganismus, der eine SLPI co dierende Nucleinsäure enthält, zur Behandlung chro nisch entzündlicher Darmerkrankungen von Mensch und Tier, pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen oder rektalen Verabreichung, die den Wirkstoff SLPI oder SLPI-exprimierende Mikroorganismen enthalten, sowie Verfahren zur Herstellung dieser pharmazeuti schen Zusammensetzungen.

Die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED), zu denen im erweiterten Sinne Enteritis necroti cans, Enteritis regionalis Crohn (Morbus Crohn), Colitis cystica, Colitis granulomatosa, Colitis gravis, Colitis haemorrhagia, Colitis ischaemica, Colitis mucosa und Colitis ulcerosa gehören, sind durch schubartig verlaufende destruierende Entzün dungsreaktionen der Darmschleimhaut gekennzeichnet. Die schwersten Formen Enteritis regionalis Crohn (Morbus Crohn) und Colitis ulcerosa unterscheiden sich in ihrem Verteilungsmuster, ihrem makroskopi schen und histologischen Bild.

Morbus Crohn ist eine unspezifische granulumatöse Entzündung, die alle Abschnitte des Verdauungstrak tes vom Ösophagus bis zum After befallen kann, jedoch vor allem im Bereich des unteren Ileums und des Kolons vorkommt. In etwa 40% aller Fälle ist ausschließlich das terminale Ileum betroffen, sel tener Ösophagus und Magen. Bei Colitis ulcerosa handelt es sich um eine diffuse kontinuierliche Entzündung der Dickdarmschleimhaut, die durch Ulce rationen und zwischen diesen stehengebliebenen Schleimhautinseln gekennzeichnet ist, wobei die Er krankung nur in seltenen Fällen auf den Dünndarm übergreift. Die definitive Diagnose einer CED kann häufig nur durch den chronischen Verlauf erfolgen. Bei der Colitis ulcerosa ist lediglich die Schleim haut betroffen, während der Morbus Crohn Granulome aufweist, wobei sämtliche Wandschichten betroffen sind und sich oftmals Fisteln bilden. Häufig ist jedoch eine Trennung zwischen Morbus Crohn und Co litis ulcerosa nicht möglich.

Die Ursachen der Entstehung einer CED sind noch weitestgehend unklar. So wird Morbus Crohn auf im munologische Faktoren, genetische Faktoren, wie po lygene Vererbung, Ernährungsfaktoren, wie bei spielsweise den häufigen Verzehr von Süßigkeiten, sowie infektiöse Faktoren, beispielsweise Rotavi ren, kapsellose Mykobakterien und Pseudonomaden, zurückgeführt. Ebenso wird dem psychosozialen Um feld und der prämorbiden Persönlichkeitsstruktur Bedeutung beigemessen. Colitis ulcerosa wird mit einer familiären Disposition, Gynäkotropie, psycho somatischen Faktoren und Autoimmunmechanismen in Verbindung gebracht. Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, dass für die Pathogenese der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen wahrscheinlich eine pathologisch gesteigerte Aktivierung des mukosalen Immunsystems von entscheidender Bedeutung ist.

Da eine kausale Therapie noch nicht möglich ist, zielt die Behandlung von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa hauptsächlich auf die Linderung der Sym ptome ab. Die derzeit etablierten Therapien für chronisch entzündliche Darmerkrankungen basieren im Wesentlichen auf unspezifischen, entzündungshemmen den Substanzen wie Glukokortikoiden und Aminosali zylaten.

Glukokortikoide hemmen über eine Reduktion des nuc leären Faktors Kappa B die Synthese fast sämtlicher proentzündlicher Cytokine, die Expression von Adhä sionsmolekülen und die Produktion von Prostaglandi nen und Leukotrienen. Eine Langzeitprophylaxe mit Glukokortikoiden ist jedoch nicht sinnvoll, da ge zeigt wurde, dass mit der langfristigen Gabe gra vierende unerwünschte Wirkungen einhergehen. Abso lute Kontraindikationen der Glukokortikoidtherapie sind Abszesse, relative Kontraindikationen sind Konglomerattumoren beziehungsweise intraabdominelle Resistenzen und enteroenterale Fisteln. Bei neu entwickelten Glukokortikoiden, beispielsweise Bude sonid, zeigt sich, dass die Nebenwirkungen der Ste roidtherapie zumindest kurzfristig verringert wer den können. In der akuten Phase muss Budesonid al lerdings so hoch dosiert werden, dass über die to pische Wirkung hinaus eine, wenn auch vergleichs weise geringe, systemische Wirkung zu beobachten ist.

Aminosalizylate reduzieren ebenfalls den nucleären Faktor Kappa B und damit die Bildung von proent zündlichen Cytokinen beziehungsweise ihrer Rezepto ren. Dieser Effekt ist jedoch weit schwächer ausge prägt als bei der Steroidbehandlung. Aminosalizyla te sind bei der Behandlung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen insgesamt weniger wirksam als Glu kokortikoide. Die derzeit verwendeten galenischen Formulierungen wurden mit dem Ziel einer unter schiedlichen Freisetzungscharakteristik, das heißt einer Freisetzung vom proximalen Dünndarm bis zum proximalen Kolon, konzipiert. Bislang ist jedoch nicht gesichert, dass die unterschiedlichen anato mischen Freisetzungsorte im Sinne einer lokal ge zielteren Therapie tatsächlich einen therapeuti schen Vorteil aufweisen.

In bestimmten klinischen Situationen wird die Ver abreichung von Glukokortikoiden beziehungsweise A minosalizylaten von einer Umstellung der Ernährung begleitet. Bei schweren Morbus Crohn- und Colitis ulcerosa-Schüben ist eine komplette parenterale Er nährung unumgänglich. Vor allem bei Kindern mit Wachstumsstörungen oder bei schweren Steroidneben wirkungen wird eine bilanzierte enterale Diät ver schrieben. Es hat sich jedoch gezeigt, dass es kei ne in ihrer Wirksamkeit gesicherte Morbus Crohn- und Colitis-Diät gibt, da Untersuchungen zur Aus schlussdiät, kohlenhydratreduzierten Diät oder zu Fischölpräparaten zum Teil widersprüchliche Befunde ergaben (Stange und Schreiber, Deutsches Ärzte blatt, 22 (1997), 1493-1498).

Bei chronisch aktiven Patienten wird eine immun suppressive Therapie im engeren Sinne, das heißt mit Medikamenten wie Azathioprin, seinem Metaboli ten 6-Mercaptopurin, Methotrexat und Cyclosporin angewandt.

Ein positiver Effekt von Azathioprin und seines Me taboliten 6-Mercaptopurin auf die Heilung und Ab sonderung von Fisteln wurde klinisch immer wieder beschrieben, wurde jedoch nie in großen Untersu chungen prospektiv und kontrolliert abgesichert (Present et al., N. Engl. J. Med., 302 (1980), 981- 987; Present et al., Annals Internal Medicine, 111 (1989), 641-649). Als nachteilig erweist sich auch, dass die mittlere Latenz bis zum Therapieeffekt et wa drei Monate beträgt, wobei immerhin noch etwa 20 % der Patienten vier bis sieben Monate brauchen, um auf die Therapie anzusprechen. Bei Colitis ulcerosa sind nur wenige kontrollierte Studien zum Einsatz von Azathioprin durchgeführt worden. Sie zeigten jedoch, dass das Medikament bei akuter Colitis ul cerosa nicht indiziert ist. Azathioprin verursacht eine Reihe von Nebenwirkungen, zu denen dosisunab hängige allergische Reaktionen, wie Übelkeit, Durchfall, Gelenkschmerzen und Erhöhung von Leber enzymen, und dosisabhängige Nebenwirkungen, wie Cy topenie, Infektionen und toxische Hepatitis, gehö ren.

Methotrexat ist eine immunsupressive Substanz, die das Enzym Dihydrofolatreduktase inhibiert und auf diese Weise in den Purinstoffwechsel eingreift. Me thotrexat hat zahlreiche Effekte auf das humane Im munsystem. Es supprimiert die Antikörperproduktion von B-Zellen, die Monocytenaktivierung, die Neovas cularisierung und die Aktivierung von Granulocyten. Der Einsatz von Methotrexat erfolgt zur Zeit nur bei Azathioprin-resistenten Verlaufsformen von Mor bus Crohn, nicht jedoch bei Colitis ulcerosa.

Cyclosporin A wirkt bevorzugt auf Lymphocyten und hemmt deren clonale Expansion und Proliferation. In drei von vier Studien erwies sich der klinische Einsatz von Cyclosporin A bei der Behandlung von chronisch aktivem Morbus Crohn als wirkungslos (Neurath und Stange, Deutsches Ärzteblatt, 28-29 (2000), 1672-1678). Darüber hinaus verursacht Cyc losporin A häufig Nebenwirkungen wie Hypertonie, diabetische Stoffwechsellage, Niereninsuffizienz und gelegentlich opportunistische Infektionen.

Seit 1980 werden auch Ansätze zur selektiven Immun modulation entwickelt, um chronisch-rezidivierende, unspezifische Darmentzündungen zu therapieren. Die se beruhen auf einer Beeinflussung des Gleichge wichtes zwischen entzündungsfördernden und entzün dungshemmenden Cytokinen im Darm. Dies soll er reicht werden, indem die Sekretion proinflammatori scher Cytokine unterdrückt wird oder indem kontrainflammatorische Cytokine, wie Interleukin 10 (IL-10) oder Interleukin 4, in ihrer Bildung stimu liert oder substituiert werden.

In tierexperimentellen Untersuchungen führte eine Inaktivierung des IL-10-Gens zum Auftreten einer chronischen Darmerkrankung. Ferner übte rekombinan tes IL-10 einen präventiven Effekt auf die Entwick lung einer experimentellen Colitis aus, wobei die zur Therapie erforderliche Steroidmenge reduziert wurde. In mehreren Studien wurde der potenzielle therapeutische Effekt von IL-10 bei Patienten mit Morbus Crohn evaluiert. Nach klinischen und endo skopischen Kriterien wurde bei etwa 30% der Patien ten eine Remission beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei Verwendung von IL-11 erhalten (Neurath und Stange, Deutsches Ärzteblatt, 97 (2000), 1672-1678). Steidler et al. (Science, 289 (2000), 1352-1355) beschreiben die Verwendung eines IL-10 sezernierenden rekombinanten Lactococcus lac tis-Stammes zur Behandlung von chronisch entzündli chen Darmerkrankungen in einem Maus-Modell. Dabei wurden lebende rekombinante L. lactis-Keime über einen Zeitraum von 14 Tagen täglich an erkrankte Tiere verabreicht. Es zeigte sich, dass mit Hilfe dieses Verfahrens die gleiche Wirkung wie bei der systemischen Verabreichung von IL-10 oder Dexa methason erzielt wurde. L. lactis ist ein gramposi tives nicht-pathogenes Bakterium, das nicht zur na türlichen Darmflora gehört.

Bei der Verwendung kontraentzündlicher Cytokine, zum Beispiel Interleukin 4, zeigt sich jedoch eben falls ein erhebliches Nebenwirkungspotential. In einer Studie von van Dullemen et al. (Gastroenterology, 109 (1995), 129-135) zeigte sich zwar, dass bei einmaliger Anwendung eines humani sierten Anti-TNF-α-Antikörpers bei Patienten mit Morbus Crohn bei 8 bis 10 Patienten eine zumindest über einige Wochen andauernde Abheilung erreicht wurde, wobei jedoch auch starke Nebenwirkungen beo bachtet wurden. Beispielsweise erfolgte eine Anti körperbildung gegen diesen hybriden Maus/Mensch- Antikörper, die teilweise mit Serumkrankheit und gelegentlich mit der Entwicklung von Lymphomen ein herging. Ebenfalls zeigte sich, dass die durch den Antikörper bewirkte irreversible Verminderung von Zellpopulationen ein erhebliches immunologisches Risiko darstellt, insbesondere bei Mehrfachgabe.

Es gibt auch zahlreiche Hinweise, dass Infektionen zur Entstehung des CED-Formenkreises beitragen. So üben beispielsweise Lymphocyten, die mit einem E. coli-Lipopolysaccharid-Extrakt behandelt wurden, gegenüber Epithelzellkolonien cytotoxische Aktivi tät aus (Shorter et al., Gastroenterology, 58 (1970), 692-698). Patienten mit Colitis ulcerosa weisen darüber hinaus häufiger hämolytische, ente rotoxische oder nekrotoxische E. coli-Stämme auf als gesunde Probanden. Eine Strategie zur Behand lung von beispielsweise Colitis ulcerosa besteht daher in der Verabreichung von Breitbandantibioti ka. Bei Vancomycin wurde jedoch keine therapeuti sche Wirkung festgestellt. Tobramycin, dessen Akti vität hauptsächlich gegen gramnegative Bakterien wie E. coli gerichtet ist, scheint allenfalls kurz zeitige Effekte bei Colitis ulcerosa zu haben.

Es wurden auch Versuche unternommen, die Darmflora von CED-Patienten langfristig zu verändern. Bei spielsweise wurden Colitis ulcerosa-Patienten mit Gentamicin vorbehandelt und anschließend mit dem nicht-pathogenen E. coli-Stamm (Nissle 1917) (Mutaflor) behandelt (Rembacken et al., The Lancet, 354 (1999), 635-639). Es zeigte sich, dass der E. coli-Stamm eine ähnliche Wirkung wie Mesazalin (5- Aminosalizylsäure) ausübte, wobei Remission und Dauer der Remission vergleichbar waren.

Natürliche oder rekombinante Bakterienstämme werden auch zur Behandlung anderer Krankheiten von Mensch und Tier verwendet. So beschreibt die WO 99/26642 die Verwendung des nicht-pathogenen E. coli-Stammes DSM 6601 zur Behandlung von Diarrhoe auf dem Vete rinärsektor. Vandenplas (Clin. Mikrobiol. and In fect., 5 (1999), 299-307) beschreibt die Verwendung von biotherapeutischen Mitteln, insbesondere leben den Bakterien und Hefezellen, zur Behandlung akuter und chronischer infektiöser Gastroenteritis. Paton et al. (Nature Medicine, 6 (2000), 265-270) be schreiben die Verwendung rekombinanter Bakterien, beispielsweise rekombinanter Escherichia coli- Stämme, die auf ihrer Zelloberfläche einen Shiga- Toxin-Rezeptor bilden, zur Behandlung von Magen- Darm-Erkrankungen, die durch Shiga-Toxin produzierende Bakterien verursacht werden. Beninati et al. (Nature Biotechnology, 18 (2000), 1060-1064) beschreiben die Verwendung von zwei rekombinanten Streptococcus gordonii-Stämmen, die einen mikrobi ziden Einzelketten-Antikörper sezernieren und die Ratten-Vagina stabil kolonisieren können, zur Be handlung einer experimentell erzeugten, Candida al bicans-verursachten Vaginitis.

Von einigen endogenen proteolytischen Enzymen ist bekannt, dass sie direkt oder indirekt an der Pa thogenese verschiedener Krankheiten des menschli chen oder tierischen Körpers beteiligt sind. Endo gene proteolytische Enzyme dienen vorrangig zum Ab bau von eindringenden Mikroorganismen, Antigen- Antikörper-Komplexen und bestimmten Gewebeprotei nen, die der Organismus nicht mehr benötigt. Bei einem normalen gesunden Organismus werden proteoly tische Enzyme in einer begrenzten Menge produziert und durch die Synthese einer Reihe von Protease- Inhibitoren reguliert. Gewebe, die insbesondere proteolytischen Attacken und Infektionen ausgesetzt sind, beispielsweise Gewebe der Atemwegsorgane, enthalten normalerweise sehr viele Protease- Inhibitoren. In bestimmten Fällen, beispielsweise schweren pathologischen Prozessen wie Sepsis oder akuter Leukämie, erhöht sich die Menge freier pro teolytischer Enzyme. Eine Störung des Gleichgewich tes zwischen Proteasen und Protease-Inhibitoren kann zu einer schwerwiegenden Schädigung des be troffenen Organismus führen, indem es beispielswei se zu Protease-vermittelten Gewebezerstörungen kommt, wozu Emphysem, Arthritis, Glomerulonephri tis, Periodontitis, Muskeldystrophie, Tumorinvasion und andere pathologische Zustände gehören.

Zu den bislang identifizierten Protease-Inhibitoren gehört der sekretorische Leukocyten-Protease- Inhibitor (SLPI), der Enzyme mit Serin-Protease- Aktivität hemmt. Das 12 Kilodalton-Protein ist vor allem an solchen Stellen im Körper nachgewiesen worden, wo dieser im direkten Kontakt mit seiner Umwelt steht, beispielsweise in der Ohrspeicheldrü se und in den Epithelien der Nasennebenhöhle, der Trachea und Bronchien. SLPI hemmt unter anderem menschliche Leukocyten-Elastase, Cathepsin G und menschliches Trypsin. Leukocyten-Elastase ist eine Serin-Protease von besonderem Interesse, da das En zym bei extrazellulärer Freisetzung Bindegewebe und damit assoziierte Proteine abbaut. Leukocyten- Elastase ist mit verschiedenen pathologischen Zu ständen, beispielsweise Emphysem und Rheumatoi darthritis, in Verbindung gebracht worden. Trypsin ist ebenfalls eine Protease von besonderem Interes se, da bekannt ist, dass Trypsin den Abbau bestimm ter Weichorgangewebe, beispielsweise von Pankreas gewebe während einer Pankreatitis, initiieren kann. Von Cathepsin G ist bekannt, dass diese Protease in vitro eine Reihe von Proteinen abbauen kann, bei spielsweise Proteine des Komplement- Stoffwechselweges. SLPI besitzt darüber hinaus an tivirale, antimykotische und antibakterielle Wir kungen.

SLPI scheint auch bei der Entstehung der chroni schen Gastritis eine Rolle zu spielen. So zeigen Nilius et al. (in: Cellular Peptidases in Immune Functions and Diseases 2 (Herausgeber: Langner und Ansorge), (2000), 445-454, Kluwer Academic/Plenum Publishers), dass bei einer Helicobacter pylori- Infektion der Magenschleimhaut das von Epithelzel len der Magenschleimhaut gebildete und sezernierte SLPI signifikant vermindert wird.

Die Verwendung von SLPI zur Therapie verschiedener Erkrankungen ist bekannt.

So offenbart die US 5,633,227 ein Verfahren zur Be handlung von Mastzell-vermittelten Krankheitszu ständen in Säugetieren durch Verabreichung eines pharmakologisch wirksamen SLPI-Fragmentes oder ei nes Muteins davon. Ebenfalls wird ein Verfahren zur Behandlung von Asthma oder allergischer Rhinopathie unter Verwendung von SLPI beschrieben. Das Dokument offenbart auch ein Verfahren zur Hemmung von Tryp tase beziehungsweise Tryptase-vermittelten Krank heitszuständen durch Verabreichung von SLPI- Peptiden oder Proteinteilen.

Die US 5,851,983 offenbart ein Polypeptid, das den C-terminalen SLPI-Teil umfasst und somit Elastase inhibieren kann. Ebenso werden eine dieses Polypep tid umfassende pharmazeutische Zusammensetzung und ein Verfahren zur Behandlung von Krankheiten be schrieben, die entweder durch eine übermäßige Akti vierierung von Neutrophilen hervorgerufen werden oder die mit der neutrophilen Protease im Zusammen hang stehen. Dabei kann es sich beispielsweise um Entzündungskrankheiten, Thrombocytenaggregations- Thrombose und Reperfusionsschäden nach Ischämie handeln, aber auch um Krankheiten wie chronische Bronchitis, ARDS, Nierenentzündung, Lungenentzün dung etc..

Die WO 94/06454 beschreibt ein Verfahren zur Hem mung von Retrovirus-Infektionen, insbesondere In fektionen mit HIV, wobei SLPI-Proteine oder Analoge oder Derivate davon verabreicht werden. Das Doku ment offenbart außerdem spezifische SLPI-codierende Nucleotidsequenzen sowie die von diesen Sequenzen codierten Proteine.

Die WO 99/17800 offenbart eine das SLPI-Protein um fassende pharmazeutische Zusammensetzung. Dieses Arzneimittel ist besonders zur Behandlung von Atem wegserkrankungen, beispielsweise Lungenkrankheiten, zur Behandlung von Krankheiten, die durch erhöhte Mengen von Proteasen charakterisiert sind, sowie zur Behandlung von Leukocyten- oder Mastzell vermittelten Krankheiten konzipiert.

Die US 6,132,990 offenbart Verfahren zur Herstel lung rekombinanter Serin-Protease-Inhibitoren und DNA-Sequenzen, die dafür verwendet werden können. Das offenbarte Protein kann Chymotrypsin und E lastase hemmen, nicht jedoch Trypsin.

Die JP 07103977 A beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von SLPI und SLPI-Elastase-Komplexen unter Verwendung von gegen SLPI gerichteten Antikörpern. Das System wird insbesondere zum Nachweis von Atem wegserkrankungen verwendet.

Bezüglich des Vorkommens und der Funktion von SLPI im Darm gibt es jedoch kaum Untersuchungen, wobei die Ergebnisse teilweise sehr widersprüchlich sind. So beschreiben Bergenfeldt et al., J. Gastroente rol., 31 (1996), 18-23, eine Immunfärbung für SLPI in Epithelzellen der menschlichen Darmmucosa. Si- Taher et al., Gastroenterology, 118 (2000), 1061- 1071, beschreiben eine konstitutive und regulierte Sekretion von SLPI in menschlichen Darmepithelzel len, wobei sie auch eine antibakterielle Aktivität von SLPI gegen das Pathogen Salmonella typhimurium zeigen. Franken et al., J. Histochem. Cytochem., 37 (1989), 493-498, berichten jedoch, dass SLPI im Verdauungstrakt nicht oder kaum vorhanden ist. In einer Untersuchung von Nystrom et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest., 57 (2) (1997), 119-125) wurde die Frage untersucht, inwieweit aus dem Speichel stammendes, verschlucktes SLPI zu der im Darm vorgefundenen SLPI-Menge beitragen kann. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass verschlucktes SLPI im Magen und Duodenum schnell abgebaut wird und demzu folge für inflammatorische Erkrankungen im Darm trakt keine Rolle spielt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit das techni sche Problem zugrunde, Mittel, die zur Behandlung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen verwendet werden können, und Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Mittel bereitzustellen, wobei die Mittel in höherem Maße als die bisher verwende ten Mittel eine Behandlung der Ursachen der CED er möglichen und im Gegensatz zu den bisher verwende ten Mitteln eine topische Therapie ermöglichen, oh ne dass die im Stand der Technik beschriebenen sys temischen Nebenwirkungen auftreten.

Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem insbesondere durch die Verwendung eines Wirkstoffes, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus sekretorischem Leukocyten-Protease-Inhibitor (SLPI), einem Fragment davon, einem Komplex davon, einem Derivat davon, einem Analog davon, einer den Wirkstoff SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon codierenden, exprimierbaren Nucleinsäure und eines die Nucleinsäure enthaltenden, zur SLPI-Bildung be fähigten nicht-pathogenen Mikroorganismus zur Be handlung einer Krankheit eines menschlichen oder tierischen Körpers, ausgewählt aus der Gruppe chro nischer entzündlicher Darmerkrankungen (CED) beste hend aus Enteritis necroticans, Enteritis regiona lis Crohn (Morbus Crohn), Colitis cystica, Colitis granulomatosa, Colitis gravis, Colitis haemorrhagia, Colitis ischaemica, Colitis mucosa und Colitis ulcerosa.

Die insbesondere bei Morbus Crohn auftretenden Ge schwüre mit tiefen Fissuren sprechen dafür, dass bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ein proteolytischer Abbau des Darmgewebes stattfin det. Der Darm ist im Allgemeinen dadurch gekenn zeichnet, dass ein schneller Stoff-Turnover an den Oberflächen stattfindet. Der Abbau und die Wieder herstellung der extrazellulären Matrix muss daher bei gesundem Gewebe einer engmaschigen Kontrolle unterliegen, um eine Erosion und Geschwürbildung und somit eine Beeinträchtigung der Darmfunktion zu verhindern. Erfindungsgemäß wurde nun mit Hilfe von Immunofärbeverfahren überraschenderweise festge stellt, dass die Menge von sekretorischem Leukocy ten-Protease-Inhibitor in der Darmmucosa von Morbus Crohn-Patienten gegenüber der Darmmucosa gesunder Patienten erheblich dezimiert ist. Dieser überra schende Befund zeigt, dass in den Darmepithelzellen von CED-Patienten das Gleichgewicht zwischen prote olytisch wirkenden Serin-Proteasen und dem Protea se-Inhibitor SLPI gestört ist. SLPI kann daher nicht seine, beispielsweise in Geweben der Atem wegsorgane nachgewiesene, Schutzfunktion des Epi thelgewebes ausüben, so dass proteolytische Enzyme die Darmepithelschichten abbauen können. Durch die gezielte Zuführung von SLPI in die betroffenen Or gane ist es somit möglich, das Gleichgewicht zwi schen dem Protease-Inhibitor und inflammatorischen Proteasen in Darmepithelzellen von Morbus Crohn- und Colitis ulcerosa-Patienten wiederherzustellen. Bei solchen inflammtorischen Proteasen kann es sich beispielsweise um neutrophile Elastase, Cathepsin G und Chymasen handeln, die insbesondere aus den in der Darmmucosa von CED-Patienten verstärkt auftre tenden neutrophilen und eosinophilen Granulocyten und Makrophagen stammen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist also vorgesehen, dass der Wirkstoff, also SLPI, ein Fragment davon, ein Komplex davon, ein Derivat davon oder ein Analog davon, zur Be handlung von CED-Erkrankungen verwendet wird, indem der Wirkstoff selbst, vorzugsweise in isolierter und gereinigter Form, den betroffenen Organen zuge führt wird. Die gezielte Zuführung des Wirkstoffes, zum Beispiel SLPI selbst, in die betroffenen anato mischen Bereiche bei CED-Patienten bewirkt einen Schutz der Darmoberfläche vor einem Abbau durch die proteolytische Aktivität von Proteasen. Da SLPI au ßerdem nachgewiesenermaßen antiretrovirale, antimy kotische und antibakterielle Wirkungen aufweist, führt die gezielte Zuführung von SLPI in den Darm darüber hinaus zu einer Bekämpfung sekundärer In fektionen, die häufig CED-Erkrankungen begleiten. Dazu gehören beispielsweise Infektionen durch Sal monellen und enterotoxigene Kolibakterien.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfüh rungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass nicht der isolierte und gereinigte Wirkstoff selbst, son dern eine den Wirkstoff SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon codierende exprimierbare Nucleinsäu re, die in einem lebenden, zur SLPI-Bildung befä higten, nicht-pathogenen Mikroorganismus enthalten ist, zur Behandlung von Erkrankungen des CED- Formenkreises verwendet wird. Dabei wird der nicht- pathogene Mikroorganismus, der die den Wirkstoff, zum Beispiel SLPI, codierende Nucleinsäure enthält und den Wirkstoff exprimiert, in den Darm einge schleust, wo er vorzugsweise den Darm besiedelt und dann innerhalb des Darmlumens über einen bestimm ten, vorzugsweise längeren, Zeitraum hinweg den Wirkstoff SLPI exprimiert und direkt an die Zellen der erkrankten Darmepithelien abgibt. Auf diese Weise werden die gleichen vorteilhaften Wirkungen auf erkrankte Darmbereiche erzielt, wie bei der Be handlung mit dem isolierten und gereinigten Wirk stoff selbst. Somit ist eine gezielte topische The rapie von CED-Erkrankungen möglich. Gegenüber der Behandlung mit dem isolierten und gereinigten Wirk stoff ist die Behandlung mit einem lebenden, SLPI produzierenden Mikroorganismus wesentlich kosten günstiger. Darüberhinaus wird auch die zur Behand lung erforderliche Dosis erheblich vermindert, so dass das Nebenwirkungspotential ebenfalls verrin gert wird.

Diese Ausführungsform bietet darüber hinaus zusätz lich mehrere Vorteile. Handelt es sich bei dem ver wendeten nicht-pathogenen Mikroorganismus um einen Escherichia coli-Stamm, beispielsweise den E. coli- Stamm (Nissle 1917), so kann die vorteilhafte Wir kung von SLPI mit der im Stand der Technik be schriebenen günstigen Wirkung von E. coli (Nissle 1917) auf die Remission von CED-Erkrankungen kombi niert werden. Da durch die Mikroorganismen, bei spielsweise Bakterien, kontinuierlich und über ei nen längeren Zeitraum hinweg eine bestimmte Menge des Wirkstoffs SLPI direkt an die betroffenen Gewebe abgegeben wird, ist die Bioverfügbarkeit des Wirkstoffes SLPI außerordentlich hoch, da pharma zeutische Faktoren, wie Herstellungsverfahren, Lös lichkeit, etc., die bei herkömmlichen Arzneimitteln die Bioverfügbarkeit eines Wirkstoffes beeinflus sen, keine Rolle spielen. Auch die präsystemische Elimination (first pass effect), das heißt der Me tabolismus des Wirkstoffes SLPI, die ansonsten die Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen erheblich ein schränkt, spielt nur eine untergeordnete Rolle. Ein nicht zu unterschätzender Vorteil besteht ferner darin, dass die kostenintensive Isolierung und Auf reinigung des Wirkstoffes SLPI aus Bakterien oder tierischen oder menschlichen Geweben entfällt.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer den unter dem Begriff "chronische entzündliche Darmerkrankungen (CED)" chronisch-rezidivierende, spezifische Entzündungen des Darmes, insbesondere Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, verstanden. Der Begriff umfasst ebenfalls alle Erkrankungen, die unter den Begriff "indeterminate Colitis" bekannt sind und bei denen keine eindeutige Zuordnung zu einem bestimmten Krankheitsbild möglich ist. Der Begriff umfasst ebenfalls alle extraintestinalen CED-Begleiterkrankungen, beispielsweise chronische Hepatitis, Zirrhose, Granulumatose, Urolithiasis, Amyloidose, Erythema nodosum, Pyoderma gangraeno sum, Stomatitis aphthosa, Arthritis, Trommelschle gelfinger, Uveitis/Iritis, autoimmune hämolytische Anämie, Vaskulitis, fibrosierende Alveolitis, Peri karditis, Hyperthyreose und dergleichen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer den unter einem "Wirkstoff" SLPI selbst, Fragmente davon, Komplexe davon, Derivate davon oder Analoga davon verstanden, solange diese die für die erfin dungsgemäße Verwendung notwendige biologische Akti vität aufweisen. Im Folgenden wird der Begriff SLPI im Allgemeinen bedeutungsgleich zu dem vorstehend genannten Begriff Wirkstoff verwendet. In Zusammen hang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff "Wirkstoff" also Therapeutika verstan den, die entweder prophylaktisch oder krankheitsbe gleitend eingesetzt werden können, um Krankheitszu stände zu vermeiden, zu lindern oder zu beseitigen.

Unter "sekretorischen Leukocyten-Protease-Inhibitor (SLPI)" wird erfindungsgemäß ein eukaryontisches Protein verstanden, das eine Inhibitionswirkung auf Serin-Proteasen, insbesondere Leukocyten-Elastase, Trypsin und Cathepsin G, ausübt und darüber hinaus antiretrovirale, antimykotische und antibakterielle Aktivität besitzt. Der erfindungsgemäß eingesetzte Wirkstoff SLPI kann natürlichen Ursprungs sein, beispielsweise ein aus einem eukaryontischen Gewe be, vorzugsweise aus einem Säugergewebe, bevorzug ter aus einem menschlichen Gewebe isoliertes Prote in. Der Wirkstoff SLPI kann auch ein mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechniken hergestelltes Protein oder synthetischen Ursprungs sein, beispielsweise ein unter Verwendung des Festphasensynthese- Verfahrens von Merrifield (Angew. Chem., 97 (1985), 801) hergestelltes Protein.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer den unter "Fragmenten" Teile des SLPI-Proteins verstanden, die eine ausreichende Länge besitzen, um die vorstehend beschriebenen Aktivitäten ausüben zu können. Erfindungsgemäß wird unter einem Fragment von SLPI somit ein Proteinteil verstanden, der we niger Aminosäuren als natives SLPI aufweist, das heißt weniger als 132 Aminosäuren, bei dem jedoch die beiden Hauptdomänen, nämlich der Carboxy terminale Bereich, der die Antiproteinase-Aktivität aufweist, und der Amino-terminale Bereich, der die antimikrobielle Wirkung gegen beispielsweise Staphylococcus aureus ausübt, erhalten sind. Vor zugsweise ist ein solches Fragment durch das Vor handensein von vier Disulfidbrücken gekennzeichnet, so dass die Tertiärstruktur des Proteins im wesent lichen erhalten bleibt.

Erfindungsgemäß wird unter einem "Komplex" eine Verbindung verstanden, die neben SLPI mehrere ande re Bestandteile umfasst, beispielsweise ein Multi enzymkomplex oder ein heteromeres Protein, das aus einer geordneten Assoziation funktionell und struk turell verschiedener Enzyme einschließlich SLPI be steht, zum Beispiel ein SLPI-Elastase-1-Komplex. Erfindungsgemäß kann ein SLPI-Komplex ein natürli cher SLPI-Komplex sein. Es kann sich jedoch auch um einen in vitro hergestellten SLPI-Komplex handeln, der andere Protease-Inhibitoren, beispielsweise α₂- Makroglobulin, α₁-Protease-Inhibitor (α₁-PI), α₁- Antichymotrypsin, α₁-Antikollagenase und α₁- Trypsin-Inhibitor umfasst.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer den unter "Derivaten" funktionelle Äquivalente oder Abkömmlinge von SLPI verstanden, die unter Beibehaltung der SLPI-Grundstruktur durch Substitution von Atomen oder Molekülgruppen beziehungsweise - resten erhalten werden und/oder deren Aminosäurese quenzen sich von der des natürlicherweise vorkom menden menschlichen oder tierischen SLPI-Proteins an mindestens einer Position unterscheiden, die a ber im wesentlichen einen hohen Grad an Homologie auf der Aminosäureebene und vergleichbare biologi sche Aktivität aufweisen. Erfindungsgemäß umfasst der Begriff "Derivat" auch Fusionsproteine, bei de nen am N-terminalen Teil beziehungsweise am C- terminalen Teil funktionelle Domänen eines anderen Proteins, beispielsweise eines anderen Protease- Inhibitors, vorhanden sind. "Homologie" bedeutet insbesondere eine Sequenzidentität von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85% und besonders bevorzugt mindestens mehr als 90%, 95%, 97% und 99%. Der dem Fachmann bekannte Ausdruck der "Homologie" bezeichnet somit den Grad der Verwandt schaft zwischen zwei oder mehreren Polypeptid- Molekülen, der durch die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen bestimmt wird. Dabei kann eine Über einstimmung sowohl eine identische Übereinstimmung als auch ein konservativer Aminosäureaustausch be deuten.

Die Unterschiede zwischen einem Derivat und nativem SLPI können beispielsweise durch Mutationen, wie zum Beispiel Deletionen, Substitutionen, Insertio nen, Anlagerungen, Basenaustausche und/oder Rekom binationen der die Aminosäuresequenzen codierenden Nucleotidsequenzen entstanden sein. Selbstverständ lich kann es sich dabei auch um natürlicherweise auftretende Sequenzvariationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus einem anderen Organismus o der um Sequenzen, die auf natürliche Weise mutiert wurden, oder Mutationen, die mit Hilfe üblicher, auf dem Fachgebiet bekannter Mittel, beispielsweise chemische Agenzien und/oder physikalische Agenzien, gezielt in die entsprechenden Sequenzen eingeführt wurden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon codierenden, exprimierbaren Nucleinsäure" ei ne Nucleinsäure verstanden, die ein SLPI-Protein, Fragment oder Derivat davon codiert, das die funk tionellen Domänen, insbesondere die Antiprotease- Aktivität, die antiretrovirale Aktivität, die anti mikrobielle Aktivität und die antimykotische Akti vität von nativem SLPI aufweist. Bei der erfin dungsgemäß verwendeten Nucleinsäuresequenz kann es sich um eine DNA- oder RNA-Sequenz in linearer oder circulärer Form handeln. Die Nucleinsäure kann eine aus natürlichen Quellen, beispielsweise aus eukary ontischen Geweben, vorzugsweise aus Säugergeweben, bevorzugter aus menschlichen Geweben, isolierte Nucleinsäure sein oder synthetisch hergestellt wor den sein.

Da die SLPI-Sequenzen aus einem eukaryontischen Or ganismus, vorzugsweise aus einem Säuger, bevorzug ter aus dem Menschen, stammen, muss die erfindungs gemäß verwendete, SLPI codierende Sequenz im Fall ihrer Verwendung in einem nicht-pathogenen Bakteri um eine Form aufweisen, die ihre Expression in dem Bakterium, also einem prokaryontischen Mikroorga nismus, gewährleistet. Falls die erfindungsgemäß verwendete Sequenz also in einem prokaryontischen Mikroorganismus exprimierbar sein muß, wird eine aus natürlichen Quellen isolierte Nucleinsäure vor zugsweise so verändert, dass beispielsweise ihre Intronsequenzen entfernt werden, da die meisten Bakterien über keine geeigneten zellulären Mecha nismen zur korrekten Entfernung der Intronsequenzen verfügen. In diesem Fall werden vorzugsweise auch die nativen, ein Signalpeptid codierenden Sequenzen der Nucleinsäure entfernt, da die Proteine von Bak terien, wenn überhaupt, andere Signalsequenzen als die Proteine von Eukaryonten aufweisen. Gegebenen falls wird auch die Codon-Zusammensetzung der aus einem eukaryontischen Gewebe stammenden Nucleinsäu re in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus verändert, um eine effizientere Expression des eukaryontischen Gens im prokaryontischen Wirtsorganismus zu errei chen. Es ist bekannt, dass Prokaryonten eine andere tRNA-Population besitzen als Eukaryonten und des halb häufig andere Codons benutzen. Dieses unter schiedliche "codon usage" kann eine effiziente Ex pression eukaryontischer Gene in Bakterien limitie ren.

Falls die erfindungsgemäß verwendete, SLPI codie rende Sequenz in nicht-pathogenen pilzlichen Mikro organismen, beispielsweise ascosporenbildenden He fen wie Saccharomyces boulardii, verwendet werden soll, müssen ihre natürlicherweise vorhandenen Intronsequenzen gegebenenfalls entfernt werden. He fezellen verfügen zwar über zelluläre Mechanismen zur Entfernung von Intronsequenzen, es gibt jedoch Unterschiede zu höheren Eukaryonten. Gegebenenfalls müssen auch die nativen Signalpeptid-codierenden Sequenzen der erfindungsgemäß verwendeten Sequenz entfernt werden, da sich gezeigt hat, dass einige, jedoch nicht alle Signalsequenzen von Säugerprotei nen von der Hefezelle erkannt und korrekt prozes siert werden. Eine Veränderung der Codon- Zusammensetzung bei der erfindungsgemäß verwendeten Sequenz ist jedoch nicht erforderlich, da bei Hefe zellen hohe Expressionsraten von Fremdgenen, insbe sondere eukaryontischen Genen, beobachtet wurden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung be deutet der Ausdruck "ein zur SLPI-Bildung befähig ter nicht-pathogener Mikroorganismus", dass ein er findungsgemäß verwendeter Mikroorganismus gegenüber den Makroorganismen, also Menschen oder Tieren, in die er eingeschleust werden soll, nicht krankheits erregend wirkt und dass er die aus einem eukaryon tischen Organismus stammende, gegebenenfalls in ei ne exprimierbare Form gebrachte Nucleinsäure kor rekt transkribieren und translatieren kann, wobei im Cytoplasma des Mikroorganismus ein Protein mit der Aktivität von SLPI erzeugt und aus dem Cy toplasma durch die Außenmembranen hindurch zumin dest in den periplasmatischen Raum transportiert und vorzugsweise an die Umgebung des Mikroorganis mus abgegeben wird. Erfindungsgemäß ist also vorge sehen, dass ein in betroffene Darmabschnitten von CED-Patienten eingeschleuster Mikroorganismus in der Lage ist, über einen bestimmten Zeitraum hinweg ein Protein mit SLPI-Aktivität zu exprimieren und direkt an die Darmepithelgewebe abzugeben. Vorzugs weise ist der nicht-pathogene Mikroorganismus also in der Lage, über einen bestimmten Zeitraum hinweg im Darm eines Menschen oder eines Tieres zu leben und diesen gegebenenfalls zu kolonisieren. Auf die se Weise können der beobachtete SLPI-Mangel in der Darmmukosa von CED-Patienten kompensiert und die damit verbundenen klinischen Manifestationen besei tigt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegen den Erfindung erfolgt die Verwendung des Wirkstof fes SLPI zur Behandlung von CED-Erkrankungen, indem der, vorzugsweise isolierte und gereinigte, Wirk stoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht wird. Im Zusammenhang mit der vorlie genden Erfindung wird unter einer "pharmazeutischen Zusammensetzung" ein zu diagnostischen, therapeuti schen und/oder prophylaktischen Zwecken verwende tes, natürliche oder synthetisch hergestellte Wirk stoffe umfassendes Gemisch verstanden, wobei die Wirkstoffe in einer beim Patienten gut applizierba ren Form enthalten sind. Die pharmazeutische Zusam mensetzung kann ein festes oder flüssiges Gemisch sein. Beispielsweise kann eine SLPI umfassende pharmazeutische Zusammensetzung einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Exipienten enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weitere Zusatzstoffe, wie Stabilisatoren, Verdickungsmit tel, Trennmittel, Gleitmittel, Farbstoffe, Geruchs stoffe, Geschmacksstoffe, Emulgatoren oder ähnliche auf dem Fachgebiet verwendete Stoffe umfassen.

Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass der in einer pharmazeutischen Zusammensetzung ent haltene, isolierte und aufgereinigte Wirkstoff an einen CED-Patienten in einer Dosis verabreicht wird, die ausreicht, den Zustand der chronisch entzündlichen Darmerkrankung zu heilen oder ihm vorzu beugen, die Progression der chronisch entzündlichen Darmerkrankung zu stoppen und/oder die Symptome der chronisch entzündlichen Darmerkrankung zu lindern. Die Dosierung des Wirkstoffes erfolgt daher so, dass ein optimaler arzneitherapeutischer Effekt oh ne wesentliche toxischen Nebenwirkungen erreicht wird, wobei der Behandlungserfolg langfristig an dauert.

Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass der in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthal tene isolierte und aufgereinigte Wirkstoff täglich ein- bis dreimal in einer Dosis von 1 bis 5000 mg Wirkstoff verabreicht wird. Die Menge des an einen Patienten zu verabreichenden Wirkstoffes hängt un ter anderem von der Darreichungsform, dem Alter, dem Geschlecht und dem Körpergewicht des zu behan delnden Patienten und der Schwere der Erkrankung ab. Die genaue Dosis, mit der ein Patient zu behan deln ist, muss daher von dem behandelnden Arzt in dividuell festgelegt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene, isolierte und aufgerei nigte Wirkstoff oral verabreicht wird. Eine orale Verabreichung des Wirkstoffes ist insbesondere bei solchen CED-Erkrankungen bevorzugt, die den oberen Darmtrakt, wie Duodenum oder Dünndarm, betreffen. Vorzugsweise wird der Wirkstoff in Form einer Sus pension, Tablette, Pille, Kapsel, eines Lutschbon bons, Granulates, Pulvers oder einer ähnlich geeig neten Darreichungsform verabreicht. Obwohl sich gezeigt hat, dass SLPI gegenüber Säure relativ stabil ist (Nystrom et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest., 57 (1997), 119-125), sind Arzneimittelformen bevor zugt, die eine magensaftresistente Beschichtung aufweisen, so dass der Wirkstoff den Magen ungehin dert passieren kann und vorzugsweise erst in den oberen Darmabschnitten in Lösung geht. Die Zusam mensetzung von magensaftresistenten Beschichtungen und Verfahren für ihre Herstellung sind auf dem Fachgebiet bekannt. Insbesondere sind oral zu ver abreichende Arzneimittelformen bevorzugt, die einen verzögerten Wirkstoff-Freisetzungsmechanismus auf weisen, um die intestinale Schleimhaut von CED- Patienten vom Lumen her längerfristig topisch zu therapieren. Aufbau und Zusammensetzung solcher Arzneimittelformen mit verzögerter Wirkstoff freisetzung sind ebenfalls auf dem Fachgebiet be kannt.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, eine den isolierten und aufgereinigten Wirkstoff enthaltende pharmazeutischen Zusammenset zung rektal zu verabreichen. Eine rektale Verabrei chung des Wirkstoffes ist bei der Behandlung von CED-Erkrankungen bevorzugt, die insbesondere den unteren Darmbereich betreffen, beispielsweise bei Colitis ulcerosa, die stets im Rektum beginnt und sich bei vielen Betroffenen in proximaler Richtung ausbreitet. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung des Wirkstoffes in Form eines Suppositoriums, Clys mas, Schaums oder einer ähnlich geeigneten Darrei chungsform.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der, vorzugsweise isolierte und aufgereinigte, Wirkstoff parenteral, das heißt un ter Umgehung des Magen-Darm-Traktes verabreicht wird. Eine parenterale Verabreichung des Wirkstof fes kann insbesondere dann indiziert sein, wenn die Therapie der chronisch entzündlichen Darmerkrankun gen von einer parenteralen Ernährung begleitet wird. Diese Therapieform kann außerdem bei Kindern mit Wachstumsstörungen von Vorteil sein. Erfin dungsgemäß ist vorgesehen, dass die parenterale Verabreichung des Wirkstoffes insbesondere mittels Injektionen oder Infusionen erfolgt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Behandlung eines CED- Patienten nicht mit dem isolierten und aufgereinig ten Wirkstoff SLPI selbst, sondern mit einem zur SLPI-Bildung befähigten nicht-pathogenen Mikroorga nismus, der eine den Wirkstoff SLPI oder ein Frag ment oder Derivat davon codierende, exprimierbare Nucleinsäure enthält. Erfindungsgemäß ist insbeson dere vorgesehen, dass der nicht-pathogene Mikroor ganismus in der Lage ist, den Wirkstoff vor, wäh rend oder nach der Verabreichung an einen Menschen oder ein Tier zu produzieren und den produzierten Wirkstoff nach der Verabreichung an die erkrankten Organe des Verdauungstraktes abzugeben.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass es sich bei den ver wendeten nicht-pathogenen Mikroorganismen um bakte rielle oder pilzliche Mikroorganismen handelt, die zu den Kommensalen von Mensch oder Tier gehören. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter "Kommensalen" nicht-pathogene Mikroorganismen verstanden, die von der Nahrung ihres Wirtes, bei spielsweise eines Menschen oder Tieres, beziehungs weise dessen Absonderungen, beispielsweise Speichel oder Schleim, leben. Solche Kommensalen leben unter anderem auf den Schleimhäuten des Mundes, der At mungs-, Harn- und Geschlechtsorgane oder im Darm. Bei erfindungsgemäß verwendeten Kommensalen handelt es sich vorzugsweise um saprophytische Mikroorga nismen, nicht jedoch um parasitär lebende Kommen sal-Mikroorganismen, die häufig pathogen sind.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass ein pilzlicher nicht-pathogener Kommensal-Mikroorganismus als Wirtszelle für die den Wirkstoff SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon codierende Nucleinsäure verwendet wird. Als Wirtsorganismen zur Expression eukaryontischer Fremdgene besitzen die zu den Euka ryonten gehörenden pilzlichen Mikroorganismen, bei spielsweise Hefen, gegenüber den zu den Prokaryon ten gehörenden Bakterien einige entscheidende Vor teile. Beispielsweise können Hefezellen die Genpro dukte eukaryontischer Gene sezernieren, das heißt die Genprodukte aus der Zelle heraus transportieren und an die Umgebung abgeben. Die Proteine können während der Sekretion glykosyliert werden. In Hefe zellen lassen sich auch sehr große DNA-Fragmente clonieren. Hefezellen sind daher in besonderem Maße zur Clonierung und Expression von SLPI und dessen Abgabe an die Darmepithelien geeignet.

Vorzugsweise gehört der pilzliche Mikroorganismus zu der Gattung Saccharomyces, das heißt zu Ascospo ren bildenden Hefen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungs gemäß verwendeten pilzlichen nicht-pathogenen Kom mensal-Mikroorganismus um Saccharomyces boulardii.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die nicht-pathogenen Mikroorganismen zur natürlichen Darmflora von Mensch oder Tier gehören. Dies ist insofern beson ders vorteilhaft, als die Darmflora der Patienten nicht mit Keimen infiltriert wird, deren Einfluß auf die Zusammensetzung der natürlichen Darmflora beziehungsweise das mit CED-Erkrankungen im Zusam menhang stehende pathologische Geschehen unbekannt beziehungsweise schwer einzuschätzen ist. Ein be sonderer Vorteil besteht außerdem darin, dass die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen physio logisch sehr gut an die speziellen Bedingungen in nerhalb des Säugerdarms angepaßt sind, so dass die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen er folgreich mit den natürlicherweise im Darm des Pa tienten vorkommenden Keimen um Nährstoffe konkur rieren können. Somit ist ein längerfristiges Über leben der erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorga nismen und eine damit einhergehende längerfristige Expression des Wirkstoffs SLPI gewährleistet. Darü berhinaus vermitteln Mikroorganismen der normalen Darmflora eine Schutzinfektion gegen pathogene oder opportunistische Mikroorganismen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass es sich bei dem verwendeten nicht-pathogenen Mikroorganismus um ein aerobes o der anaerobes gramnegatives Bakterium der natürli chen Darmflora von Mensch oder Tier handelt. Vor zugsweise gehört das erfindungsgemäß verwendete gramnegative Wirtsbakterium zu der Gattung Escheri chia, Pseudonomas, Bacterioides oder Proteus.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den eingesetzten gramnegativen Wirtsbakterien um den Stamm Escheri chia coli (Nissle, 1917), der Escherichia coli DSM 6601 entspricht. Dieser Stamm ist für den Menschen nicht-pathogen. Von E. coli Nissle, 1917 (Serotyp 06:K5:H) ist bekannt, dass dieser Stamm antagonis tische Aktivitäten gegen verschiedene pathogene und nicht-pathogene Enterobakterien zeigt. Die antago nistische Aktivität von E. coli (Nissle 1917) ist wahrscheinlich auf die Produktion von Bakteriozinen oder Mikrozinen zurückzuführen (Blum, Marre und Ha cker, Infection, 23 (1995), 234-236), kann aber auch mit der Blockierung von Rezeptoren der Darmmu cosa im Zusammenhang stehen (Rembacken et al., The Lancet, 354 (1999), 635-639). Von E. coli (Nissle 1917) ist darüber hinaus bekannt, dass mit diesem Stamm behandelte Colitis ulcerosa-Patienten Remis sionen zeigten, die mit denen des Arzneimittels Me salazin vergleichbar waren, ohne dass jedoch die von Mesalazin bekannten Nebenwirkungen auftraten (Rembacken et al., The Lancet, 354 (1999), 635- 639). Der Stamm E. coli (Nissle 1917) bietet also den besonderen Vorteil, dass die günstige Wirkung des Wildtyp-Stammes auf den Krankheitsverlauf von CED-Erkrankungen mit der erfindungsgemäßen vorteil haften Wirkung einer SLPI-Zuführung auf den Heilungsprozeß von CED-Krankheitsverlauf kombiniert werden kann. E. coli (Nissle 1917) ist im Handel unter der Bezeichnung "Mutaflor" von Ardeypharm GmbH, Herdecke, Deutschland erhältlich. Escherichia coli bietet darüber hinaus den großen Vorteil, das es der am besten erforschte Mikroorganismus ist, der am häufigsten für gentechnische Experimente verwendet wird. Für dieses Bakterium wurden sehr viele gentechnische Verfahren und Clonierungsvekto ren entwickelt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass es sich bei dem ver wendeten nicht-pathogenen Mikroorganismus um ein aerobes oder anaerobes grampositives Bakterium der natürlichen Darmflora handelt. Es ist bekannt, dass die normale Darmflora von vielen grampositiven Bak terien besiedelt wird, zu denen beispielsweise Bi fidobacterium-, Streptococcus-, Staphylococcus- und Corynebacterium-Arten zählen. Beispielsweise gilt Bifidobacterium bifidum als häufigster Darmbewohner von Brustkindern, stellt aber auch einen wesentli chen Anteil der normalen Darmflora von Flaschenkin dern und Erwachsenen sowie möglicherweise aller Warmblüter dar. Als Wirtsorganismen zur Expression eukaryontischer Gene besitzen grampositive Bakteri en gegenüber gramnegativen Bakterien den entschei denden Vorteil, dass sie die Genprodukte eukaryon tischer Gene sezernieren können, das heißt die Gen produkte aus der Zelle heraus transportieren und an die Umgebung abgeben können. Grampositive Wirtsbak terien sind daher in besonderem Maße auch zur Ex pression von SLPI und Abgabe an die Darmepithelien geeignet.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst daher die Verwendung von grampo sitiven Bakterien der Gattungen Bifidobacterium, Streptococcus, Staphylococcus und Corynebacterium als Wirtsbakterium für die den Wirkstoff SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon codierende Nuclein säure. In einer besonders bevorzugten Ausführungs form handelt es sich bei dem verwendeten gramposi tiven Wirtsbakterium um Streptococcus gordonii, das ein nicht-pathogenes und natürlicherweise transfor mierbares Kommensalbakterium ist (vergleiche Beni nati et al., Nature Biotechnology, 18 (2000), 1060- 1064).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass zur Expression der den Wirkstoff SLPI codierenden Nucleinsäure nicht- pathogene Mikroorganismen verwendet werden, die nicht zur natürlichen Darmflora gehören oder keine Kommensalen von Mensch oder Tier sind, sofern sie zur Bildung von SLPI befähigt sind und gegenüber dem Wirt, in den sie eingeführt werden sollen, nicht-pathogen sind. Vorzugsweise handelt es sich bei solchen Mikroorganismen um Bakterien, die zu mindest über einen bestimmten Zeitraum im Darm von Mensch oder Tier leben können. Solche Bakterien dürfen darüber hinaus keine nachteilige Wirkung auf den Verlauf einer chronisch entzündlichen Darmer krankung oder auf die therapeutische Wirkung von SLPI ausüben. Bevorzugte Beispiele für Bakterien, die nicht zur natürlichen Darmflora gehören oder keine Kommensalen sind, die erfindungsgemäß jedoch als Wirtszellen für eine den Wirkstoff SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon codierende, exprimierbare Nucleinsäure verwendet werden können, um fassen Bakterien, die zur fermentativen Herstellung von Lebensmitteln eingesetzt werden. Besonders be vorzugte Beispiele sind Milchsäurebakterien, wie Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii subspec. bulgaricus, Lactobacillus caucasicus, Lac tobacillus casei, Lactobacillus kefir, Streptococ cus thermophilus, einige Leuconostoc-Arten und ähn liche.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden zur Expression der den Wirkstoff SLPI codierenden Nucleinsäure Mutanten der erfin dungsgemäß verwendeten nicht-pathogenen Mikroorga nismen eingesetzt, bei denen die äußere Zellhülle verändert ist, so dass bestimmte exprimierte Prote ine die Zelle verlassen und in die Umgebung der Zelle gelangen können. Solche Mutanten werden auch als "leaky-Mutanten" bezeichnet. Leaky-Mutanten mit veränderter Zellhülle können mit Hilfe bekannter Verfahren erhalten werden, wie beispielsweise Muta genese-Verfahren unter Verwendung von Nitrosoguani din. Beispiele für unterschiedliche Typen von Lea ky-Mutanten sind von Anderson, Wilson und Oxender in J. Bacteriol., 140 (1979), 351-358, und Fung, MacAlister und Rotrifield in J. Bacteriol., 133 (1978), 1467-1471 beschrieben. Die Verwendung von Leaky-Mutanten als Wirtszellen für die den Wirk stoff SLPI codierende Nucleinsäure bietet also ins besondere den Vorteil, dass eine Abgabe des expri mierten SLPI-Proteins an die Umgebung, das heißt die Darmepithelien des CED-Patienten, gewährleistet ist.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können Spheroblasten, L-Formen oder Protoblasten von gramnegativen beziehungsweise grampositiven Wirtsbakterien oder von pilzlichen Wirtszellen ver wendet werden. Bakterielle Spheroblasten sind Zel len, die durch Behandlung von gramnegativen Bakte rien mit Lysozym erhalten werden. Bakterielle Pro toblasten sind Zellen, die durch Behandlung grampo sitiver Bakterien mit Lysozym erhalten werden. Spheroblasten können auch mit Hilfe einer Behand lung mit Penicillin oder Lysozym-EDTA gewonnen wer den. L-Formen gramnegativer oder grampositiver Bak terien sind dadurch gekennzeichnet, dass sie die Fähigkeit zur Bildung einer funktionellen Zellwand verloren haben. Verfahren zum Erhalt von bakteriel len L-Formen sind beispielsweise von Makemson und Darwish, Infect. Immun., 6 (1972), 880, beschrie ben. Auch von Hefezellen können Spheroblasten mit tels wohlbekannter Verfahren erhalten werden.

Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die in dem nicht-pathogenen Mikroorganismus enthal tene, SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon co dierende Nucleinsäure in einem Vektor insertiert ist. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Vektor" eine extrachromosoma le DNA, bei der es sich vorzugsweise um ein Plas mid, ein Cosmid, einen Bakteriophagen, ein Virus, einen Shuttle-Vektor und einen anderen üblicherwei se in der Gentechnik verwendeten Vektor handelt. Die erfindungsgemäßen Vektoren können weitere Funk tionseinheiten besitzen, die eine Stabilisierung, Selektion und/oder Replikation des Vektors in einem Wirtsorganismus bewirken oder zumindest dazu bei tragen.

Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass im Gegensatz zu den üblicherweise zur Clonierung von Gensequenzen verwendeten Vektoren der erfin dungsgemäß zur Insertion von SLPI-Sequenzen verwen dete Vektor keinen Selektionsmarker enthält, der auf einer Antibiotikaresistenz beruht. Da die Wirtszelle, in die der Vektor zur Expression des Wirkstoffs eingeführt wird, über einen bestimmten Zeitraum hinweg stabil den Darm eines CED-Patienten besiedeln soll, bestünde ansonsten die Gefahr, dass eine auf dem Vektor enthaltene Antibiotikaresistenz an die anderen Keime der Darmflora weitergegeben wird und sich somit innerhalb der Darmflora aus breiten kann.

Erfindungsgemäß ist daher vorgesehen, dass der auf dem Vektor in bevorzugter Ausführung enthaltene Se lektionsmarker ein Gen ist, dessen Genprodukt für den menschlichen oder tierischen Organismus nicht schädlich ist und das sich leicht nachweisen läßt. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem auf dem Vektor enthaltenen Selektions marker um eine das "green fluorescent protein" (GFP) codierende Sequenz, wobei der Nachweis des GFP-Produktes beispielsweise mittels FACS oder Durchflusscytometrie erfolgt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die den Wirkstoff SLPI oder ein Frag ment oder Derivat davon codierende Nucleinsäure so in einen Vektor insertiert, dass sie unter der funktionellen Kontrolle von mindestens einem regu latorischen Element steht, das die Transkription der Nucleinsäure in eine translatierbare RNA und/oder die Translation der RNA in ein Protein vor, während oder nach der Verabreichung gewähr leistet.

Regulatorische Elemente können beispielsweise Pro motoren, Ribosomenbindungsstellen, Signalsequenzen und/oder Transkriptionsterminationssignale sein. Regulatorische Elemente, die mit einer SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon codierende Nuclein säure funktionell verbunden sind, können Nucleotid sequenzen sein, die aus anderen Organismen oder an deren Genen stammen als die SLPI codierende Nucleo tidsequenz selbst.

Erfindungsgemäß kann es sich bei dem verwendeten Promotor um einen konstitutiven oder induzierbaren Promotor handeln. Ein Promotor ist der Bereich ei ner DNA, an den das Enzym RNA-Polymerase bindet und den Prozess der Gentranskription initiiert. Ein "konstitutiver Promotor" ist ein nicht- regulierbarer Promotor, der ohne Stimulus von außen kontinuierlich die Transkription einer codierenden DNA-Sequenz bewirkt. Ein "induzierbarer Promotor" ist ein regulierbarer Promotor, der direkt durch die Gegenwart oder die Abwesenheit eines chemischen Mittels oder indirekt durch einen Stimulus aus der Umgebung wie eine Temperaturveränderung aktiviert wird. Ein konstitutiver Promotor weist gegenüber einem induzierbaren Promotor insofern einen Nach teil auf, als eine nicht-kontrollierte Expression eines Fremdproteins, beispielsweise in einer bakteriellen Wirtszelle, zum Absterben dieser Wirtszel len führen kann.

Erfindungsgemäß ist daher insbesondere die Verwen dung eines induzierbaren Promotors zur Expression der SLPI codierenden Nucleinsäure vorgesehen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein induzierbarer Promotor verwendet, der durch Nährstoffmangel induzierbar ist. Ein durch Nährstoffmangel induzierbarer Promotor wird dann aktiviert, wenn die Konzentration eines chemischen Mittels, das für den Erhalt von Zellfunktionen not wendig ist, stark reduziert ist oder vollkommen fehlt. Ein solcher Promotor ist insbesondere für die spezifischen Wachstumsbedingungen geeignet, mit denen Keime im Darm konfrontiert werden. Im Darm unterliegt die Nährstoffversorgung der Keime äu ßerst starken Schwankungen. Die Wachstumsbedingun gen im Darm werden daher häufig als "feast or fami ne" beschrieben. Wenn also Nährstoffmangel im Darm herrscht, das heißt wenn der Darm wenig oder keinen Speisebrei enthält, wird durch den erfindungsgemäß verwendeten induzierbaren Promotor die Transkripti on der SLPI codierenden Nucleinsäure induziert. Das anschließend gebildete SLPI-Protein kann nach Ausschleußung aus der erfindungsgemäß verwendeten Wirtszelle relativ ungehindert zu den Darmepithe lien diffundieren, da der Darm wenig oder keinen Speisebrei enthält.

Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass zur Expression der SLPI codierenden Nucleinsäure in einem gramnegativen Wirtsbakterium, beispielsweise E. coli (Nissle 1917), ein induzierbarer Promotor verwendet wird, der durch Phosphatmangel induziert wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungs form handelt es sich bei dem verwendeten Promotor um den phoA-Promotor von Escherichia coli. Falls der Vektor den phoA-Promotor enthält, umfaßt er vorzugsweise auch die Regulationsgene phoB und phoR, um den Promotor effizient ein- und ausschal ten zu können. In einer weiteren besonders bevor zugten Ausführungsform handelt es sich bei den zur Wirkstoff-Expression in einem gramnegativen Wirts bakterium verwendeten Promotoren um die trp-, lac- oder tac-Promotoren von Escherichia coli. Die Pro motoren von E. coli lassen sich prinzipiell auch in grampositiven Bakterien verwenden.

Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass zur Expression der SLPI codierenden Nucleinsäure in einer Hefezelle, beispielsweise Saccharomyces bou lardii, ein induzierbarer Promotor verwendet wird, der durch Phosphatmangel induziert wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem verwendeten Promotor um den Promotor des Hefe-Gens PHO 5. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, zur Expression der SLPI codierenden Nucleinsäure in einer Hefezelle den Promotor des ADH 1-Gens der Hefe zu verwenden, der durch Glucose-Mangel induziert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die SLPI codierende Nuclein säure zur Expression in einer bakteriellen Wirts zelle unter die funktionelle Kontrolle einer Ribo somen-Bindungsstelle gestellt wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "Ribosomen-Bindungsstelle" eine Sequenz ver standen, die zum 3'-Ende der bakteriellen 16S-rRNA komplementär ist und zur Bindung von Ribosomen dient. Ribosomen-Bindungsstellen sind normalerweise 3 bis 12 Basen vor einem Initiationscodon lokali siert, wobei sie üblicherweise 3 bis 9 Basen umfas sen. Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass es sich bei der verwendeten Ribosomen- Bindungsstelle um eine Shine-Dalgarno-Sequenz mit der Konsensussequenz 5'-AAGGAGGU-3' handelt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die SLPI codierende Nucleinsäure zur Expression in einer erfindungsge mäßen Wirtszelle mit einer für den jeweiligen Wirt geeigneten Signalsequenz, das heißt mit einer bak teriellen oder pilzlichen Signalsequenz, verbunden wird. Eine "Signalsequenz" ist eine Sequenz, die ein Signalpeptid codiert, das die Sekretion eines Proteins aus dem Cytoplasma eines Mikroorganismus in den periplasmatischen Raum oder in die Umgebung des Mikroorganismus bewirkt. Das Signalpeptid ist ein kurzes Segment von etwa 15 bis 30 Aminosäuren, das am N-Terminus von sezernierten und exportierten Proteinen lokalisiert ist. Die zelluläre Maschine rie der Wirtszelle zur Prozessierung von Proteinen erkennt diese Signalsequenz, so dass das exprimier te Protein durch die Zellmembran oder durch die Membran einer Organelle sezerniert wird, wobei das Signalpeptid während des Sekretionsprozesses durch eine spezifische Protease entfernt wird. Da SLPI ein normalerweise von einem eukaryontischen Orga nismus sezerniertes Protein ist, wird das natürli che Signalpeptid des nativen SLPI-Proteins erfindungsgemäß durch ein für die jeweilige Wirtszelle geeignetes Signalpeptid ersetzt, so dass der Trans port aus der Wirtszelle heraus in den periplasmati schen Raum oder die Umgebung der Wirtszelle gewähr leistet ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist insbesondere vorgesehen, dass zur Expression der SLPI codierenden Nucleinsäure in einem gramne gativen Wirtsbakterium, beispielsweise E. coli (Nissle 1917), die Signalsequenz des β-Lactamase- Gens von E. coli oder die Signalsequenz des ompA- Gens von E. coli verwendet wird, um eine Sekretion des exprimierten SLPI-Proteins in den periplasmati schen Raum und/oder die Umgebung zu erreichen. Er findungsgemäß ist es auch möglich, Hybrid- Signalsequenzen zu verwenden, beispielsweise die von Konrad, Annuals New York Academy of Sciences, 413 (1983), 12-22) beschriebene Sequenz, die aus einer Fusion der ersten zwölf Aminosäuren der β- Lactamase-Signalsequenz mit den letzten 13 Amino säuren der Insulin-Signalsequenz des Menschen be steht.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass zur Expression der SLPI codierenden Nucleinsäure in einem grampositi ven Wirtsbakterium, beispielsweise Streptococcus gordonii, die Signalsequenz des α-Amylase-Gens von Bacillus amyloliquefaciens oder die Signalsequenz des Streptococcus-Gens M6 verwendet wird, um eine Sekretion des exprimierten SLPI-Proteins durch die Zellhülle hindurch in die Umgebung zu erreichen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass zur Expression der SLPI codierenden Nucleinsäure in einer pilzlichen Wirtszelle, beispielsweise Saccharomyces boulardii, die Signalsequenz des α-Faktors von Hefen oder die Signalsequenz des Killertoxins von Hefen verwendet werden, um eine Sekretion des exprimierten SLPI- Proteins durch die Zellhülle hindurch in die Umge bung zu erreichen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die zur SLPI-Expression befähigte lebende mikrobielle Wirtszelle, die die in einen Vektor insertierte, SLPI codierende Nucleinsäure enthält, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen CED- Patienten verabreicht wird. Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die pharmazeutische Zusammensetzung ausreichend koloniebildende Einhei ten (CFU) der zur SLPI-Bildung befähigten Wirtszel le enthält, so dass bei mehrmaliger Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammenset zung an einen CED-Patienten der Zustand der chro nisch entzündlichen Darmerkrankung geheilt, die Progression der chronisch entzündlichen Darmerkran kung gestoppt und/oder die Symptome der chronisch entzündlichen Darmerkrankung gelindert werden kön nen. Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung 1 × 10⁸- 1 × 10¹¹, vorzugsweise 1 × 10⁹-1 × 10¹⁰CFU der er findungsgemäßen Wirtszellen enthält.

Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die pharmazeutische Zusammensetzung, die den zur SLPI-Bildung befähigten Mikroorganismus enthält, über einen Zeitraum von zwei bis vier Wochen täg lich ein- bis dreimal verabreicht wird. Die genaue Dosierung hängt unter anderem von der Darreichungs form, dem Alter, dem Geschlecht und dem Körperge wicht des zu behandelnden Patienten und der Schwere der Erkrankung ab und muss vom behandelnden Arzt individuell festgelegt werden.

Vorzugsweise handelt es sich bei der pharmazeuti schen Zusammensetzung, die die erfindungsgemäße le bende mikrobielle Wirtszelle enthält, um eine orale Darreichungsform. Die oral zu verabreichende phar mazeutische Zusammensetzung kann eine flüssige oder feste Form aufweisen. Die pharmazeutische Zusammen setzung kann beispielsweise in Form einer Suspensi on, Tablette, Pille, Kapsel, eines Granulates oder Pulvers oral verabreicht werden.

In einer flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung liegt der erfindungsgemäße lebende Mikroorganismus vorzugsweise frei und nicht-immobilisiert in Sus pension vor. Die Suspension weist eine Zusammenset zung auf, die physiologische Bedingungen für den Mikroorganismus gewährleistet, so dass insbesondere der osmotische Druck innerhalb der Zelle nicht zu einer Lyse der Zelle führt. Eine flüssige pharma zeutische Zusammensetzung ist vor allem für Mikro organismen, insbesondere Bakterien, mit intakter Zellhülle geeignet.

In einer festen pharmazeutischen Zusammensetzung können die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorga nismen in freier, vorzugsweise lyophilisierter, Form oder in immobilisierter Form vorliegen. Bei spielsweise können die erfindungsgemäßen Mikroorga nismen in einer Gelmatrix eingeschlossen sein, die den Zellen physikalischen Schutz verleiht. Ein Ein schluss in eine Gelmatrix ist insbesondere für Mik roorganismen geeignet, bei denen die äußere Membran vollständig oder teilweise entfernt ist, also für leaky-Mutanten, Spheroblasten, Protoblasten oder L- Formen. Solche mikrobiellen Formen sind sehr zer brechlich und der Einschluss in die Gelmatrix sorgt für den Schutz der Zellen vor mechanischen Scher kräften.

Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen, beispiels weise Bakterien, können in eine Gelmatrix einge schlossen werden, indem eine konzentrierte Zelllö sung mit einem gelösten Geliermittel gemischt wird und dann das Gemisch durch Nadeln mit kleinem Durchmesser hindurchläuft. Dabei werden Tropfen ge bildet, die anschließend in eine Lösung fallen, die eine Gelierung des Geliermittels und somit die Bil dung polymerisierter Partikel bewirkt. Beispiele und Modifikationen dieses Verfahrens sind in Brode lius und Mosbach, Adv. Appl. Microbiol., 28 (1982), 1-25, und Klein, Stock und Vorlop, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 18 (1983) 86-91, beschrie ben. Stoffe, die als Matrix zum Einschluß von Mik roorganismen verwendet werden können, umfassen A gar, Alginate, Carrageen, Agarose oder andere für den Menschen oder Tiere physiologisch geeignete Po lymere, die unter physiologischen Bedingungen ge lieren können.

Andere Formen der Zellimmobilisierung umfassen die Adsorption der erfindungsgemäßen mikrobiellen Wirtszellen an festen Trägern oder die Immobilisie rung der erfindungsgemäßen Wirtszellen über kova lente Bindungen. Diese Verfahren sind in Navarro und Durand, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 4 (1977), 243, beschrieben. Eine Immobilisation von erfindungsgemäßen Bakterien kann auch erreicht wer den, indem die Zellen zwischen Membranen einge schlossen werden, deren Poren kleiner als die Bak terien selbst sind, jedoch groß genug, um einen Transport der exprimierten SLPI-Proteine durch die Membran hindurch zu ermöglichen. Solche Vorrichtun gen sind wohl bekannt und im Handel erhältlich (beispielsweise Amicon, Millipore und Dorr- Olivier).

Eine zur oralen Verabreichung bestimmte feste phar mazeutische Zusammensetzung, die die erfindungsge mäßen Wirtszellen in immobilisierter oder nicht- immobilisierter Form enthält, ist vorzugsweise mit einer magensaftresistenten Beschichtung versehen. Dadurch wird gewährleistet, dass die in der pharma zeutischen Zusammensetzung enthaltenden lebenden Mikroorganismen ungehindert und unbeschadet den Ma gen passieren können und die Freisetzung der Mikro organismen erst in den oberen Darmbereichen er folgt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die pharmazeutische Zu sammensetzung, die die lebenden erfindungsgemäßen Wirtszellen enthält, rektal verabreicht. Eine rek tale Verabreichung erfolgt vorzugsweise in Form eines Suppositoriums, Klysmas oder Schaums. Die rek tale Verabreichung ist insbesondere für CED- Erkrankungen geeignet, die die unteren Darmab schnitte, beispielsweise den Dickdarm, betreffen.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindes tens eine lebende Zelle eines zur SLPI-Bildung be fähigten nicht-pathogenen Mikroorganismus, der eine exprimierbare, den Wirkstoff SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon codierende Nucleinsäure enthält, wobei der nicht-pathogene Mikroorganismus vorzugs weise ein Kommensale oder ein Bestandteil der na türlichen menschlichen oder tierischen Darmflora ist und/oder zur fermentativen Herstellung von Le bensmitteln verwendet werden kann.

In einer bevozugten Ausführungsform der Erfindung enthält die pharmazeutische Zusammensetzung ein an aerobes oder aerobes, gramnegatives oder gramposi tives Bakterium der natürlicher menschlichen oder tierischen Darmflora. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen Mikro organismus um eine Kommensalhefe von Mensch oder Tier. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der pharmazeutischen Zu sammensetzung enthaltenen Mikroorganismus um ein Bakterium, das zur fermentativen Herstellung von Lebensmitteln verwendet werden kann. In einer wei teren bevorzugten Ausführungsform enthält die phar mazeutische Zusammensetzung eine "leaky"-Mutante eines nicht-pathogenen Mikroorganismus.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die pharmazeutische Zusammenset zung Zellen des nicht-pathogenen Escherichia coli- Stamms Nissle 1917. In einer weiteren besonders be vorzugten Ausführungsform enthält die pharmazeuti sche Zusammensetzung Zellen des Kommensalbakteriums Streptococcus gordonii. In noch einer weiteren be sonders bevorzugten Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung Zellen der Kommen salhefe Saccharomyces boulardii.

Eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, in der der Mikroorganismus eine den Wirkstoff SLPI oder ein Fragment oder ein Derivat davon codierende Nuclein säure enthält, wobei die Nucleinsäure in einem Ex pressionsvektor insertiert ist und wobei die Ex pression der Nucleinsäure unter der Kontrolle von mindestens einem regulatorischen Element steht, so dass der Wirkstoff vor, während oder nach der Ver abreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung an einem Menschen oder ein Tier exprimiert und nach der Verabreichung der pharmazeutischen Zusammenset zung an die Organe des Verdauungstraktes abgegeben wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch Ver fahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zu sammensetzung, umfassend:

a) Isolierung oder Synthese einer den Wirkstoff SLPI codierenden Nucleinsäuresequenz;
b) Clonierung der SLPI codierenden Nucleinsäurese quenz in einen bakteriellen Expressionsvektor o der pilzlichen Expressionsvektor;
c) Transformation des bei b) erhaltenen rekombinan ten Expressionsvektors in eine mikrobielle Wirtszelle, wobei die Wirtszelle ein Kommensale von Mensch oder Tier oder ein natürlicher Be standteil der menschlichen oder tierischen Darm flora ist und/oder zur fermentativen Herstellung von Lebensmitteln verwendet werden kann;
d) Vermehrung der transformierten Wirtszelle;
e) Herstellung eines Immobilisats, Lyophilisats o der Flüssigpräparats transformierter Wirtszel len;
f) Mischen des/der bei e) erhaltenen Immobilisats, Lyophilisats oder Suspension transformierter Wirtszellen mit physiologisch verträglichen Ex cipienten, Stabilisatoren, Verdickungsmitteln, Trennmitteln, Gleitmitteln, Emulgatoren oder ähnlichen Stoffen zum Erhalt einer pharmazeuti schen Zusammensetzung.

Die Isolierung einer den Wirkstoff SLPI codierenden Nucleinsäure kann mit Hilfe üblicherweise in der Gentechnik verwendeter Verfahren erfolgen (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Labo ratory Press, NY, USA). Da die DNA-Sequenz des menschlichen SLPI-Gens bekannt ist (vgl. US 5,851,983 und US 6,132,990), können SLPI codierende Sequenzen beispielsweise aus einem eukaryontischen Gewebe, vorzugsweise einem Säugergewebe, bevorzug ter einem menschlichen Gewebe, mit geeigneten Pri mern unter Verwendung des Verfahrens der Polymera se-Kettenereaktion (PCR) amplifiziert und isoliert werden. Besonders bevorzugt ist eine Amplifikation unter Verwendung einer cDNA-Bank eines menschlichen Gewebes. Darüber hinaus sind die Primer vorzugswei se so konzipiert, dass die codierende SLPI-Sequenz am 5'- und 3'-Ende mit geeigneten Restriktions- Schnittstellen versehen wird. Das Amplifikati onsprodukt wird mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten und wird nach Aufreinigung, beispielswei se unter Verwendung einer Gelelektrophorese, in ei nen geeigneten Vektor cloniert.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die SLPI codierende Sequenz synthetisch hergestellt werden. Die chemische Synthese der Nucleinsäure bietet den Vorteil, dass die Nucleinsäuresequenz beispielsweise bezüglich der Codonverwendung modi fiziert werden kann, ohne die Aminosäuresequenz des codierten Proteins zu verändern. Die Synthese von DNA-Sequenzen kann beispielsweise unter Verwendung des Phosphotriester-Verfahrens oder des Phosphit verfahrens, beispielsweise an Festphasensystemen, erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Synthese unter Verwendung von DNA-Synthese-Vorrichtungen, bei spielsweise DNA-Syntheseautomaten von Applied Bio systems. Nach Aufreinigung der synthetisierten Se quenz wird diese unter Verwendung geeigneter Ver fahren in einen Vektor insertiert.

Die Insertion der entweder mittels Amplifikation oder mittels Synthese gewonnenen, SLPI codierenden Nucleinsäuresequenz in einen geeigneten Vektor er folgt unter Verwendung von üblicherweise auf dem Fachgebiet verwendeten Verfahren, beispielsweise Restriktionsspaltung und Ligierung. Ein geeigneter Vektor muss generell über folgende Eigenschaften verfügen:

a) er muss die zu insertierende Nucleinsäure in einer definierten Position und Orientierung integrieren können;
b) er muss mit der integrierten Nucleinsäure in einen Wirtsorganismus eindringen, das heißt Zellwand und Zellmembran unversehrt passieren können;
c) er muss sich in der Wirtszelle als Replikon verhalten, das heißt als selbständiges geneti sches Element; und
d) der Vektor muss sich bei einer Zellteilung verdoppeln können, damit alle Nachkommen min destens eine Kopie des Vektors erhalten.

Geeignete Vektoren für gramnegative oder gramposi tive Wirtszellen beziehungsweise Hefe-Wirtszellen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Wie vorstehend er wähnt, enthält der Vektor, der erfindungsgemäß zur Clonierung der SLPI codierenden Nucleinsäure ver wendet wird, keinen Selektionsmarker, der auf einer Antibiotika-Resistenz beruht, sondern vorzugsweise einen Marker wie eine das GFP-Protein codierende Gensequenz, deren Genprodukt mittels FACS oder Durchflußcytometrie leicht nachweisbar ist. Vor zugsweise enthält der Vektor auch bereits eine Expressionskassette mit einem geeigneten Promotor, einer geeigneten Ribosomenbindungsstelle, einer ge eigneten Signalsequenz und geeigneten Transkripti onsterminationssequenzen.

Nach der Insertion der SLPI codierenden Nucleinsäu re in einen geeigneten Vektor wird das Konstrukt in einen bakteriellen Wirtsorganismus oder einen Hefe- Wirtsorganismus eingeführt. Handelt es sich bei dem Vektor um einen Bakteriophagen, kann dieser mittels Transduktion in den Wirt eingeführt werden (vgl. Sambrook et al., 1989). Handelt es sich bei dem verwendeten Vektor um ein Plasmid, kann dieses bei spielsweise mittels eines Transformationsverfahrens in den Wirt eingeschleust werden. Für Escherichia coli-Stämme wird vorzugsweise das übliche Calcium- Transformationsverfahren verwendet (vgl. Sambrook et al., 1989). Transformationsverfahren für Strep tococcus-Zellen sind beispielsweise in Clewell, Microbiol. Rev., 45 81984), 409, beschrieben. Transformationsverfahren für pilzliche Wirtszellen, beispielsweise Hefe-Wirtszellen, sind auf dem Fach gebiet ebenfalls wohlbekannt.

Nach der Transformation werden transformierte Wirtszellen in einem geeigneten Medium unter geeig neten Bedingungen gezüchtet und vermehrt, bis eine geeignete Zelldichte erreicht ist.

Zur Herstellung einer oral zu verabreichenden Sus pension werden die Wirtszellen danach in einer ste rilen physiologischen Lösung in einer geeigneten Zelldichte suspendiert. Die kultivierten Wirtszel len können aber auch unter Verwendung bekannter Verfahren lyophilisiert oder immobilisiert werden. Nach Lyophilisierung oder Immobilisierung werden die Zellen in einer geeigneten CFU (koloniebildende Einheit)-Menge mit Stoffen wie pharmazeutisch ver träglichen Exipienten, Stabilisatoren, Verdickungs mitteln, Trennmitteln, Gleitmitteln, Farbstoffen, Geruchsstoffen, Geschmacksstoffen, Emulgatoren oder ähnliche pharmazeutisch verwendeten Stoffen ver setzt, um eine gewünschte pharmazeutische Zusammen setzung herzustellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft nicht nur die vorgenannten Verwendungen des Wirkstoffes oder ei nes zur Wirkstoffbildung befähigten Mikroorganismus zur Behandlung einer vorstehend definierten Krank heit, sondern auch die Verwendung eines vorstehend definierten Wirkstoffes oder eines zur Bildung die ses Wirkstoffes befähigten Mikroorganismus zur Her stellung eines pharmazeutischen Präparates zur Be handlung einer Krankheit eines menschlichen oder tierischen Körpers ausgewählt aus der Gruppe chro nisch entzündlicher Darmerkrankungen, die vorste hend näher definiert wurden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren und das Beispiel näher erläutert.

Fig. 1 zeigt die Immunfärbung eines histologischen Darmschnitts eines gesunden Patienten unter Verwen dung eines spezifisch gegen menschlichen SLPI ge richteten Kaninchen-Antikörpers.

Fig. 2 zeigt die Immunfärbung eines histologischen Darmschnitts eines CED-Patienten unter Verwendung eines spezifisch gegen menschlichen SLPI gerichte ten Kaninchen-Antikörpers.

Beispiel Nachweis von SLPI in Daragewebeproben gesunder und erkrankter Patienten

Darmgewebeproben gesunder und erkrankter Patienten wurden endoskopisch gewonnen und sofort in Einbett medium für Gefrierschnitte (OCT, Miles Scientific) überführt und danach in flüssigem Stickstoff einge froren. Aus den so eingebetteten Proben wurden Ge frierschnitte hergestellt und immunhistologisch ge färbt.

Zur Färbung wurden die so hergestellten Gefrier schnitte über Nacht luftgetrocknet und dann 10 min mit Aceton-Methanol-Formaldehyd (AMF) bei Raumtem peratur fixiert. Anschließend wurden die fixierten Gefrierschnitte dreimal mit Tris-HCl-Puffer, pH- Wert 7,4-7,6, über jeweils 5 min gewaschen. An schließend wurden die Schnitte einer 30-minütigen Serumblockierung unterworfen. Danach wurden die Schnitte mit einem ersten Antikörper (polyclonaler Kaninchen-Antikörper, der gegen menschliches SLPI gerichtet war) in einer Verdünnung von 1 : 1000 bis 1 : 2000 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach einem dreimaligen Waschen mit Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,4-7,6, über jeweils 5 min wurden die Schnitte mit einem zweiten Antikörper (biotinylierter anti rabbit-Ziegen-Antikörper; Vector ABC-Kit) 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Schnitte erneut dreimal gewaschen, wie vorstehend beschrieben. Anschließend erfolgte eine 30-minütige Inkubation mit Vector-ABC-Reagens. Danach wurden die Schnitte erneut dreimal gewaschen. Dann wurde alkalische Phosphatase mit Substrat entwickelt (Vector Red-Alkalische Phosphatase-Substrat-Kit I). Dabei wurden SLPI-positive Zellen rot gefärbt. Die Farbentwicklung wurde nach 20 bis 30 min mit Lei tungswasser gestoppt, wobei eine 10-minütige Spü lung mit Leitungswasser durchgeführt wurde. An schließend erfolgte eine 10-minütige Gegenfärbung mit 0,1% Hämatoxillin. Überschüssige Farbe wurde durch 10-minütiges Spülen mit Leitungswasser ent fernt. Dann wurden die Schnitte luftgetrocknet, eingedeckelt und ausgewertet.

Wie beispielsweise auch in Fig. 1 (insbesondere untere beiden Zellen) zu sehen ist, sind die Zellen der Darmmucosa gesunder Probanden intensiv (im Ori ginalfoto: rot) gefärbt. Diese intensive Rotfärbung zeigt, dass SLPI in der Darmmucosa gesunder Proban den in sehr großer Menge vorhanden ist. Im Gegen satz dazu sind die Zellen der Darmmucosa von CED- Patienten kaum gefärbt (vergleiche Fig. 2). Diese geringe Färbung zeigt, dass die SLPI-Menge in der Darmmucosa von CED-Patienten im Vergleich zur Darm mucosa gesunder Probanden stark vermindert ist. Diese beobachtete starke Verminderung der SLPI- Menge in der Darmmucosa von CED-Patienten ist ein Hinweis auf die Eignung von SLPI zur Therapie chro nisch entzündlicher Darmerkrankungen.

Claims

1. Verwendung eines Wirkstoffes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus sekretorischem Leukocyten- Protease-Inhibitor (SLPI), einem Fragment davon, einem Komplex davon, einem Derivat davon, einem A nalog davon, einer den Wirkstoff SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon codierenden, exprimier baren Nucleinsäure und eines die Nucleinsäure ent haltenden, zur SLPI-Bildung befähigten nicht- pathogenen Mikroorganismus zur Behandlung einer Krankheit eines menschlichen oder tierischen Kör pers ausgewählt aus der Gruppe chronischer entzünd licher Darmerkrankungen (CED) bestehend aus Enteri tis necroticans, Enteritis regionalis Crohn (Morbus Crohn), Colitis cystica, Colitis granulomatosa, Co litis gravis, Colitis haemorrhagia, Colitis ischae mica, Colitis mucosa und Colitis ulcerosa.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Behandlung durch Verabreichung des isolierten und gereinigten Wirkstoffs in einer pharmazeutischen Zusammenset zung erfolgt.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Wirkstoff in einer Dosis verabreicht wird, die ausreicht, den CED-Zustand zu heilen oder ihm vorzubeugen, die CED-Progression zu stoppen und/oder die CED- Symptome zu lindern.

4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Wirkstoff täglich ein- bis dreimal in einer Dosis von 1 bis 5000 mg Wirkstoff verabreicht wird.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wo bei der Wirkstoff oral verabreicht wird.

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Wirkstoff in Form einer Suspension, Tablette, Pille, Kapsel, eines Lutschbonbons, Granulats oder Pulvers verab reicht wird.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wo bei der Wirkstoff rektal verabreicht wird.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Wirkstoff in Form eines Suppositoriums, Klysmas oder Schaums verabreicht wird.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wo bei der Wirkstoff parenteral verabreicht wird.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Wirkstoff in Form einer Injektion oder Infusion verabreicht wird.

11. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der nicht- pathogene Mikroorganismus in der Lage ist, den Wirkstoff vor, während oder nach der Verabreichung an einen Menschen oder ein Tier zu produzieren und den produzierten Wirkstoff nach der Verabreichung an die Organe des Verdauungstraktes abzugeben.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei der nicht- pathogene Mikroorganismus ein bakterieller oder pilzlicher Mikroorganismus ist, der zu den Kommen salen von Mensch oder Tier gehört.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei der pilzli che Mikroorganismus zu der Gattung Saccharomyces gehört.

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei der pilzli che Mikroorganismus Saccharomyces boulardii ist.

15. Verwendung nach Anspruch 12, wobei der nicht- pathogene Mikroorganismus zur natürlichen Darmflora von Mensch oder Tier gehört.

16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei der nicht- pathogene Mikroorganismus ein aerobes oder anaero bes gramnegatives Bakterium der Darmflora ist.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei das gramne gative Bakterium zu der Gattung Escherichia, Pseu domonas, Bacteroides oder Proteus gehört.

18. Verwendung nach einem der Ansprüche 17, wobei das gramnegative Bakterium Escherichia coli (Nissle 1917) ist.

19. Verwendung nach Anspruch 15, wobei der nicht- pathogene Mikroorganismus ein aerobes oder anaero bes grampositives Bakterium der Darmflora ist.

20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei das grampo sitive Bakterium zu der Gattung Bifidobacterium, Streptococcus, Staphylococcus, Corynebacterium ge hört.

21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das grampo sitive Bakterium Streptococcus gordonii ist.

22. Verwendung nach Anspruch 11, wobei der nicht- pathogene Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der nicht zu den Kommensalen von Mensch oder Tier gehört.

23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei der nicht- pathogene Mikroorganismus ein Bakterium ist, das zur fermentativen Herstellung von Lebensmitteln verwendet wird.

24. Verwendung nach Anspruch 22 oder 23, wobei es sich bei dem Bakterium um Milchsäurebakterien wie Lactococcus lactis, Lactococcus delbrueckii subspec. bulgaricus, Lactobacillus caucasicus, Lac tobacillus casei, Lactobacillus kefir, Streptococ cus thermophilus oder Leuconostoc handelt.

25. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 24, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um eine "leaky"-Mutante handelt.

26. Verwendung nach Anspruch 11 bis 25, wobei die in dem Mikroorganismus enthaltene, SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon codierende Nucleinsäure in einem Vektor insertiert ist.

27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei der Vektor ein Plasmid, Cosmid, Bakteriophage oder Virus ist.

28. Verwendung nach Anspruch 26 oder 27, wobei die in einem Vektor insertierte Nucleinsäure unter der funktionellen Kontrolle von mindestens einem regulatorischen Element steht, das die Transkription der Nucleinsäure in eine translatierbare RNA und/oder die Translation der RNA in ein Protein vor, während oder nach der Verabreichung gewähr leistet.

29. Verwendung nach Anspruch 28, wobei das mindes tens ein regulatorische Element ein Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Signalsequenz oder ein 3'-Transkriptionsterminator ist.

30. Verwendung nach Anspruch 29, wobei der Promotor ein induzierbarer Promotor ist.

31. Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Promotor ein Promotor ist, der durch Nährstoffmangel indu zierbar ist.

32. Verwendung nach Anspruch 30 oder 31, wobei der Promotor ein trp-, lac- oder tac-Promotor von E scherichia coli ist.

33. Verwendung nach Anspruch 30 oder 31, wobei der Promotor der phoA-Promotor von Escherichia coli ist.

34. Verwendung nach Anspruch 30 oder 31, wobei der Promotor der Promotor des PHO 5-Gens von Hefe ist.

35. Verwendung nach Anspruch 30 oder 31, wobei der Promotor der Promotor des ADH 1-Gens von Hefe ist.

36. Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 35, wobei die Ribosomenbindungsstelle eine Shine- Dalgarno-Sequenz ist.

37. Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 36, wobei die Signalsequenz eine bakterielle oder pilz liche Signalsequenz ist, die die Sekretion des Pro teins aus dem Cytoplasma des Mikroorganismus in den periplasmatischen Raum oder in die Umgebung des Mikroorganismus bewirkt.

38. Verwendung nach Anspruch 37, wobei es sich bei der bakteriellen Signalsequenz um die Signalsequenz des β-Lactamase-Gens von Escherichia coli oder die Signalsequenz des ompA-Gens von Escherichia coli handelt.

39. Verwendung nach Anspruch 37, wobei es sich bei der pilzlichen Signalsequenz um die Signalsequenz des α-Faktors von Hefe oder die Signalsequenz des Killertoxins von Hefe handelt.

40. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 39, wobei der zur SLPI-Bildung befähigte nicht- pathogene Mikroorganismus in einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten ist.

41. Verwendung nach Anspruch 40, wobei die den Mik roorganismus enthaltende pharmazeutische Zusammen setzung oral verabreicht wird.

42. Verwendung nach Anspruch 41, wobei die den Mik roorganismus enthaltende pharmazeutische Zusammen setzung in Form einer Suspension, Tablette, Pille, Kapsel, eines Granulats oder Pulvers verabreicht wird.

43. Verwendung nach Anspruch 40, wobei die den Mik roorganismus enthaltende pharmazeutische Zusammen setzung rektal verabreicht wird.

44. Verwendung nach Anspruch 43, wobei die den Mik roorganismus enthaltende pharmazeutische Zusammen setzung in Form eines Suppositoriums, Klysmas oder Schaums verabreicht wird.

45. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend min destens eine Zelle eines zur SLPI-Bildung befähig ten nicht-pathogenen Mikroorganismus, der eine exprimierbare, SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon codierende Nucleinsäure enthält.

46. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 45, wobei der Mikroorganismus ein anaerobes oder aerobes, gramnegatives oder grampositives Bakterium der Darmflora ist.

47. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 45, wobei der Mikroorganismus eine Kommensalhefe von Mensch oder Tier ist.

48. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 45, wobei der Mikroorganismus ein Bakterium ist, das zur fermentativen Herstellung von Lebensmitteln verwendet werden kann.

49. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 45, wobei der Mikroorganismus eine "Leaky"-Mutante ist.

50. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 45 bis 49, wobei die SLPI oder ein Fragment oder Derivat davon codierende Nucleinsäure in einem Expressionsvektor insertiert ist und wobei die Expression der Nucleinsäure unter der Kontrolle von mindestens einem regulatorischen Element steht, so dass der Wirkstoff vor, während oder nach der Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Menschen oder ein Tier exprimiert und nach der Verabreichung der pharmazeutischen Zusammenset zung an die Organe des Verdauungstraktes abgegeben wird.

51. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeuti schen Zusammensetzung, umfassend:

a) Isolierung oder Synthese einer den Wirkstoff SLPI codierenden Nucleinsäuresequenz;
b) Clonierung der SPLI codierenden Nucleinsäurese quenz in einen bakteriellen oder pilzlichen Expres sionsvektor;
c) Transformation des bei b) erhaltenen rekombinan ten Expressionsvektor in eine mikrobielle Wirtszel le, die ein Kommensale von Mensch oder Tier oder ein natürlicher Bestandteil der Darmflora von Mensch oder Tier ist und/oder zur fermentativen Herstellung von Lebensmitteln verwendet werden kann;
d) Vermehrung der transformierten Wirtszelle;
e) Herstellung eines Immobilisats, Lyophilisats o der Suspension transformierter Wirtszellen; und
f) Mischen des/der bei e) erhaltenen Immobilisats, Lyophilisats oder Suspension transformierter Wirts zellen mit physiologisch verträglichen Excipienten, Stabilisatoren, Verdickungsmitteln, Trennmitteln, Gleitmitteln, Emulgatoren oder ähnlichen Stoffen zum Erhalt der pharmazeutischen Zusammensetzung.