DE10061200A1

DE10061200A1 - Diagnosis kit for the detection of prion-protein, for the diagnosis of infection Spongiform Encephalopathies, has a micro-particle with an antibody and a second antibody specific to a native prion-protein with a flow cytometer

Info

Publication number: DE10061200A1
Application number: DE2000161200
Authority: DE
Inventors: Niels Wedemeyer; Juergen Weidner; Heiko Wiebusch
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2002-06-27

Abstract

The diagnosis system to detect the presence of prions uses a micro-particle (1) with an antibody (2) specific to prion-protein (3), and a flow cytometer. The diagnosis system, to detect prions, has a second antibody (4) specific to a prion-protein for detection. The antibody has at least one fluorescent marker (5). The micro-particle is paramagnetic, with a diameter of 0.1-8.0 mu m. The system has at least one further antibody against a native prion-protein. Two types of micro-particles are used, in terms of size and color. The system can use a polyclonal or monoclonal antibody specific to prion-protein. An Independent claim is included for a diagnosis kit, with an antibody against a native prion-protein as an internal control.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Kit zum Nachweis übertragbarer spongiformer Encephalopathien.The invention relates to a method and a kit for the detection of transferable spongiform encephalopathies.

Alls Übertragbare spongiforme Encephalopathien (transmissible spongiforme encephalopathy (TSE)) oder auch Prionen-Erkrankungen wird eine Gruppe neurodegenerativer Erkrankungen bezeichnet, die im Gegensatz zu gene tisch bedingten ähnlichen Erkrankungen durch die Infektion mit pathogenen Proteinen (Prionen oder Prionproteinen) ausgelöst werden (Prusiner, 1982). Dazu gehören die Creutzfeld-Jakob Erkrankung beim Menschen (CJD), Kuru, Scrapie beim Schaf und die Bovine Spongiforme Encephalopathie (BSE) beim Rind.All transmissible spongiform encephalopathies (transmissible spongiform encephalopathy (TSE)) or prion diseases becomes a group called neurodegenerative diseases, which in contrast to genes similar diseases caused by table infection by pathogenic Proteins (prions or prion proteins) are triggered (Prusiner, 1982). These include Creutzfeld-Jakob disease in humans (CJD), Kuru, scrapie in sheep and Bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle.

Prionen (nachfolgend auch Prionproteine) sind infektiöse Isoformen nativer ubiquitär vorkommender Proteine (PrP), deren physiologische Bedeutung noch unbekannt ist. Von dem nativen Protein unterscheidet sie sich durch eine Abweichung in der Aminosäuresequenz, die sie unlöslich, hitzeresistent und zudem unzugänglich für einen vollständigen proteolytischen Abbau macht (Forloni et al., 1993).Prions (hereinafter also prion proteins) are native infectious isoforms ubiquitous proteins (PrP), their physiological importance is still unknown. It differs from the native protein by a deviation in the amino acid sequence that makes them insoluble, heat resistant and also inaccessible for complete proteolytic degradation does (Forloni et al., 1993).

Pathogene Prionproteine besitzen einen kleinen N-terminalen Abschnitt (PrP106-126), der - im Gegensatz zu dem nativen Protein mit einer α-Helix- Struktur - eine stabile β-Faltblattstruktur aufweist. Sie neigen zur Aggregation mit weiteren gleichartigen Peptiden zu so genannten Fibrillen (Tagliavini et al., 1991). Diese Fibrillen sind nach Infektion einer Zelle in der Lage, native Proteine in ihrer Struktur zu konvertieren, die damit ihrerseits ebenfalls pathogen werden (Horwich und Weissman, 1997). Es kommt auf diese Weise zur Verklumpungen einer Vielzahl pathogener Proteine. Diese Ver klumpungen sind auch als amyloide Plaques im Hirn erkrankter Individuen bekannt und stellen - ähnlich wie bei vergleichbaren neurodegenerativen Erkrankungen wie z. B. Altzheimer oder Veitstanz (Chorea Huntington) - die primäre Ursache für das Absterben essentieller Hirnregionen dar (Tagliavini et al., 1991).Pathogenic prion proteins have a small N-terminal section (PrP106-126), which - in contrast to the native protein with an α-helix - Structure - has a stable β-sheet structure. They tend to aggregate with other similar peptides to fibrils (Tagliavini et al., 1991). These fibrils are native to a cell after infection To convert proteins in their structure, which in turn also become pathogenic (Horwich and Weissman, 1997). It comes down to this Way to clump a variety of pathogenic proteins. This ver Lumps are also known as amyloid plaques in the brain of diseased individuals known and put - similar to comparable neurodegenerative Diseases such as B. Altzheimer or Veitstanz (Huntington's chorea) - the primary cause of the death of essential brain regions (Tagliavini et al., 1991).

Bei allen Säugern verläuft die Pathologie der Prionen-Erkrankungen ver gleichbar. Aufgrund der hochkonservierten Struktur der Prionen können Prione aus Plaques erkrankter Individuen nicht nur Individuen der eigenen, sondern auch einer fremden Spezies infizieren. Dies wurde durch Versuche mit Rindern und Primaten (Makake) gezeigt (Collinge et al., 1996). Die Übertragung der Prionen-Erkrankung (Scrapie) vom Schaf auf das Rind sowie von Rind (BSE) auf den Menschen gilt daher als sehr wahrscheinlich.In all mammals, the pathology of prion diseases proceeds parable. Due to the highly conserved structure of the prions Prions from plaques of sick individuals not only individuals of their own, but also infect a foreign species. This has been through experimentation with cattle and primates (macaque) (Collinge et al., 1996). The Transmission of prion disease (scrapie) from sheep to cattle and from cattle (BSE) to humans is therefore very likely.

Beim Menschen wird dieser Übertragungsweg mit der neuen Variante der Creutzfeld-Jacob-Erkrankung in Verbindung gebracht, die im Gegensatz zur klassischen Erkrankung bereits bei jungen Erwachsenen auftritt. Dabei sind vor allem Personen anfällig, dessen PrP-Protein an der Position 129 ein Methionin aufweist. Diese Gruppe stellt einen Anteil von ca. 11% der Gesamtbevölkerung dar.In humans, this transmission path is associated with the new variant of Creutzfeld-Jacob disease, which, in contrast to the classic disease, already occurs in young adults. People are particularly susceptible to this if their PrP protein has a methionine at position 129 . This group represents approximately 11% of the total population.

Nach dem vermehrten Auftreten von BSE-Fällen in Großbritannien Mitte der 80er Jahre existieren strenge Kontrollen über Herkunft und Verwendung von Schlachtvieh in Europa. Eine vollständige epidemiologische Kontrolle spon giformer Encephalopathien ist jedoch nur durch die lückenlose Untersuchung kompletter Tierbestände und des gesamten Schlachtviehs möglich. Daher wird ein Schnelltest gefordert, mit dem routinemäßig alle Schlachttiere auf spongiforme Encephalopathien untersucht werden, bevor das Fleisch in den Handel gelangt.After the increased incidence of BSE cases in the UK in the middle of the There are strict controls on the origin and use of Slaughter cattle in Europe. A complete epidemiological control spon giform encephalopathies, however, is only due to the complete examination complete livestock and the entire slaughter cattle possible. Therefore a rapid test is required, which routinely shows all animals for slaughter Spongiform encephalopathies are examined before the meat enters the Trade.

Zum Nachweis spongiformer Encephalopathien sind post mortem-Verfahren bekannt, während zuverlässige in vivo-Tests noch nicht zur Verfügung ste hen. Die post mortem-Verfahren basieren im wesentlichen auf einem immu nologischen Nachweis der Prionproteine, der mittels prionprotein-spezifi scher monoklonaler Antikörper erbracht wird. Als Referenz dazu dienen mikroskopische Untersuchung von Hirnschnitten, wobei insbesondere die Elektronenmikroskopie (Scott et al., 1992; Stack et al., 1991) und die Immunohistochemie an formalinfixierten Proben (Schulz-Schaeffer et al., 2000; Van Eversbroeck et al., 1999) erfolgreich eingesetzt werden. Die bei den letztgenannten Methoden bringen hoch präzise und zuverlässige Ergeb nisse. Aufgrund der erforderlichen Arbeitsintensität und der notwendigen Qualifikation des Personals sind sie als Standardmethode im Rahmen einer routinemäßigen Massenabfertigung jedoch ungeeignet.Post mortem procedures are used to detect spongiform encephalopathies known, while reliable in vivo tests are not yet available hen. The post mortem procedures are essentially based on an immu biological detection of the prion proteins, which is determined by means of prion protein-specific monoclonal antibody. Serve as a reference microscopic examination of brain sections, in particular the Electron microscopy (Scott et al., 1992; Stack et al., 1991) and the Immunohistochemistry on formalin-fixed samples (Schulz-Schaeffer et al., 2000; Van Eversbroeck et al., 1999) can be used successfully. The at The latter methods bring highly precise and reliable results nisse. Because of the required work intensity and the necessary Personnel qualifications are the standard method in the context of a routine bulk handling, however, unsuitable.

Daneben gibt es Bestrebungen, BSE-Detektionssysteme auf der Basis fluo reszenzspektroskopischer Methoden zu etablieren. Dazu wird beispielsweise die als fluorescence correlation spectroscopy (FCS) bekannte Methode her angezogen, die üblicherweise der Untersuchung dynamischer Prozesse monomerer Proteine dient (Bieschke et al., 2000). Erste Ergebnisse deuten auf eine hohe Sensitivität dieses Verfahren auch bei der Diagnose von Prio nen-Erkrankungen hin. Auch dieses Verfahren bedarf jedoch eines geschul ten Personals und steht derzeit für den routinemäßigen Einsatz in der Praxis nicht zur Verfügung stehen.There are also efforts to develop BSE detection systems based on fluo to establish resence spectroscopic methods. For example the method known as fluorescence correlation spectroscopy (FCS) that's usually attracted to the study of dynamic processes serves monomeric proteins (Bieschke et al., 2000). First results indicate for a high sensitivity of this procedure also in the diagnosis of priority diseases. However, this procedure also requires training personnel and currently stands for routine use in practice are not available.

Alternativ werden auch ELISA-Verfahren zur Diagnose von Prionen- Erkrankungen, insbesondere BSE eingesetzt (Grathwohl et al., 1997; Meyer et al., 1999). Dazu werden die Antigene, also Prionproteine, Fibrillen oder Abschnitte davon aus der aufbereiteten Gehirn- oder Spinalflüssigkeitsprobe der Rinder zunächst auf Oberflächen z. B. von Mikrotiterplatten immobilisiert werden. Anschließend erfolgt der immunologische Nachweis über einen ersten spezifischen und einen zweiten Enzym-gekoppelten Antikörper, oder andere Farbreaktionen. Hierbei handelt es sich um einen indirekten Test, da die Prionenproteine selbst nicht detektiert werden.Alternatively, ELISA methods for the diagnosis of prion Diseases, especially BSE used (Grathwohl et al., 1997; Meyer et al., 1999). For this purpose, the antigens, i.e. prion proteins, fibrils or Sections thereof from the prepared brain or spinal fluid sample the cattle first on surfaces such. B. immobilized by microtiter plates become. The immunological detection is then carried out using a first specific and a second enzyme-coupled antibody, or other color reactions. This is an indirect test because the prion proteins themselves are not detected.

Derzeit wird der Nachweis von BSE bei Rindern zu Zwecken der veterinär medizinischen Kontrolle zumeist über Western Blot-Verfahren geführt (Rubenstein et al., 1987; Doi et al., 1988; Lee et al., 2000). Das Nachweisprinzip macht sich dabei die Tatsache zunutze, daß das native Prion protein PrP^c durch Proteasen abbaubar ist, während nach einer Protease- Behandlung das pathogene Prionprotein PrP^sc als verdauungsresistentes Fragment übrigbleibt. Anschließend wird das Fragment über einen Immuno blot detektiert, d. h. nach einer elektrophoretischen Auftrennung der Probe in einem Polyacrylamidgel wird das verbliebene PrP^sc-Fragment auf eine Membran übertragen und mit einem Prionprotein-spezifischen Antikörpers gebunden. Der endgültige Nachweis des zweiten Antikörpers ist üblicherweise mit einem Enzym gekoppelt, das eine Farbreaktion vermittelt oder ist radioaktiv markiert.Currently, the detection of BSE in cattle for the purposes of veterinary medical control is mostly carried out using Western blot methods (Rubenstein et al., 1987; Doi et al., 1988; Lee et al., 2000). The detection principle takes advantage of the fact that the native prion protein PrP ^c is degradable by proteases, while after a protease treatment the pathogenic prion protein PrP ^sc remains as a digestion-resistant fragment. The fragment is then detected via an immunoblot, ie after electrophoretic separation of the sample in a polyacrylamide gel, the remaining PrP ^sc fragment is transferred to a membrane and bound with a prion protein-specific antibody. The final detection of the second antibody is usually coupled with an enzyme that mediates a color reaction or is radioactively labeled.

Das bekannte Immunoblot-Verfahren setzt eine ausreichend hohe Konzen tration pathogener Prionproteine in der Untersuchungsprobe voraus, die - nach derzeitigen Erkenntnissen - etwa 6 Monate vor dem Auftreten erster klinischer Symptome, frühestens aber 30 Monate nach der Infektion des Tie res in Gehirnproben oder in der Spinalflüssigkeit erreicht ist. Aufgrund der für den Immunoblot erforderlichen nachweisbaren Anreicherung kann demnach BSE erst zu einem Zeitpunkt sicher nachgewiesen werden, wenn das erkrankte Tier bereits schon lange infektiös ist und daher eine Gefahr für den Konsumenten darstellt. Für die betroffenen Verbraucher und vor allem für die Landwirte ist dies ein erheblicher Nachteil.The well-known immunoblot method uses a sufficiently high concentration tration of pathogenic prion proteins in the test sample, which - according to current knowledge - about 6 months before the first appearance clinical symptoms, but no earlier than 30 months after infection of the tie res in brain samples or in the spinal fluid. Because of for the detectable enrichment required for the immunoblot can accordingly BSE can only be reliably detected at a time when that sick animal has long been infectious and therefore a danger to the Represents consumers. For the consumers concerned and especially for the This is a significant disadvantage for farmers.

Darüber hinaus beträgt die Bearbeitungszeit für einen dieser - derzeit als Schnelltest bekannten - Immunoblots etwa 6 bis 7 Stunden und setzt zudem geschultes Personal voraus. Dieser zeitliche Faktor stellt vor allem aufgrund der neuen gesetzlichen Verpflichtung zur Überprüfung tatsächlich jeden Schlachttieres ein erhebliches Hindernis für eine schnelle, zuverlässige und vollständige veterinärmedizinische Routinekontrolle dar. Darüber hinaus ist dieses Verfahren nicht für parallele Untersuchungen einer Vielzahl von Pro ben und für die Automatisierung geeignet. Letztes ist besonders bei hoch infektiösem Material aus Gründen der Arbeitssicherheit wünschenswert. In addition, the processing time for one of these - currently as Known rapid test - immunoblots about 6 to 7 hours and also sets trained personnel ahead. This time factor is mainly due to the new legal obligation to review everyone Slaughter animals are a significant obstacle to fast, reliable and complete routine veterinary control. In addition, this procedure is not for parallel examinations of a variety of pros ben and suitable for automation. The latter is especially high infectious material desirable for occupational safety reasons.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die bekannten immunologi schen Nachweisverfahren von Prionen-Erkrankungen, insbesondere von BSE, zu verbessern und damit ein Verfahren und ein Untersuchungspaket (nachfolgend auch Kit) bereitzustellen, das möglichst sensitiv, einfach zu handhaben und schnell durchzuführen ist. Das Verfahren sollte dabei mög lichst auch ohne langwierige Schulung des Personals durchführbar und daher einer Automatisierung weitgehend zugänglich sein.The invention is therefore based on the object, the known immunological methods of detection of prion diseases, especially of BSE, and thus improve a procedure and an investigation package (also called kit below), the most sensitive, easy to do handle and perform quickly. The procedure should be possible feasible without lengthy training of the staff and therefore be largely accessible to automation.

Die Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren gemäß dem Hauptanspruch. Vorteilhafte Weiterentwicklungen sind Gegenstand der Unteransprüche.The object is achieved with a method according to the main claim. Advantageous further developments are the subject of the subclaims.

Der Erfindung liegt dabei der Gedanke zugrunde, die prionprotein-spezifi schen Antikörper an Mikropartikel zu binden und eine Antikör per/Prionprotein-Bindung mit einem zweiten prionprotein-spezifischen Anti körper nachzuweisen.The invention is based on the idea that the prion protein-specific binding antibodies to microparticles and an antibody per / prion protein binding with a second prion protein-specific anti body.

Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt dabei darin, die Prionproteine auf der Oberfläche der Mikropartikel anreichern zu können. Mit dieser Anreicherung wird die Nachweisgrenze der pathogenen Prionpro teine in den Untersuchungsproben erniedrigt und somit die Sensitivität des Test deutlich erhöht. Durch die Verwendung von Mikropartikeln können zudem auch kleinste Probenvolumina analysiert werden, was wiederum der Arbeitssicherheit dient.The particular advantage of the method according to the invention is that to be able to accumulate the prion proteins on the surface of the microparticles. With this enrichment, the detection limit of the pathogenic prionpro teine in the test samples and thus the sensitivity of the Test significantly increased. By using microparticles you can also the smallest sample volumes are analyzed, which in turn is the Occupational safety serves.

Bei Mikropartikeln (auch microbeads oder microspheres) handelt es sich um bereits seit fast zwei Jahrzehnten bekannte Instrumente der Biochemie, die erfolgreich zum Nachweis extrazellulärer Proteine eingesetzt werden (Lisi et al., 1982; Kempfer et al., 1999; lannelli et al., 1997). Sie stellen feste oder halbfeste Partikel mit einem Durchmesser von bis maximal 100 µm, vor zugsweise bis zu 10 µm dar. Besonders geeignet sind Mikropartikel eine Größe bis zu 8 µm. Sie bestehen üblicherweise aus Polystyrol oder Latex; auch Mikropartikel auf der Basis von Silikaten sind möglich. An ihren Oberflächen können Proteine - so auch Antikörper - beispielsweise über Car boxylgruppen kovalent gebunden sein. Zur Bindung spezifischer Antikörper an Mikropartikel steht die bekannte sog. Carbodiimid-Methode zur Verfügung (Molday et al., 1975). Daneben ist erfindungsgemäß jedoch auch der Einsatz von unmodifizierten Mikropartikeln oder von Mikropartikeln mit spezifischen Liganden möglich.Microparticles (also microbeads or microspheres) are Instruments of biochemistry known for almost two decades, the successfully used for the detection of extracellular proteins (Lisi et al., 1982; Kempfer et al., 1999; lannelli et al., 1997). They represent fixed or semi-solid particles with a diameter of up to a maximum of 100 µm preferably up to 10 µm. Microparticles are particularly suitable Size up to 8 µm. They are usually made of polystyrene or latex; Microparticles based on silicates are also possible. On their surfaces proteins - including antibodies - can be boxyl groups be covalently bound. For binding specific antibodies the known so-called carbodiimide method is available on microparticles (Molday et al., 1975). In addition, however, the use is also according to the invention of unmodified microparticles or of microparticles with specific ones Ligands possible.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform werden erfindungsgemäß paramagnetische Mikropartikel eingesetzt, die beispielsweise Eisenionen in Form von Fe₂O₃ oder Fe₃O₄ enthalten. Sie ermöglichen eine einfache und leichte Handhabung, die mit Hilfe entsprechender Magneten automatisiert werden kann. Die Automatisierung von Arbeitsschritten ist insbesondere bei hochinfektiösem Material bedeutsam. So wird durch das erfindungsgemäße Verfahren der Einsatz eines Robotors möglich, mit dem zum Beispiel über elektromagnetische Stifte, die in Probelösungen eintauchen, die paramagnetischen Mikropartikel in eine jeweils nächste Probenlösung transferiert werden können. Mit fortschreitender Automatisierung sinkt dabei der Bedarf an qualifiziertem Personal.In a particularly advantageous embodiment, paramagnetic microparticles are used according to the invention which contain, for example, iron ions in the form of Fe ₂ O ₃ or Fe ₃ O ₄ . They enable simple and easy handling, which can be automated with the help of appropriate magnets. The automation of work steps is particularly important with highly infectious material. The method according to the invention thus makes it possible to use a robot with which the paramagnetic microparticles can be transferred to a next sample solution, for example by means of electromagnetic pins which are immersed in sample solutions. With increasing automation, the need for qualified personnel decreases.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren können sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper mit einer Spezifität gegen Epitope der nativen oder pathogenen Prionproteine oder der Fibrillen eingesetzt werden. Sofern ein zweiter Antikörper zum Nachweis des ersten Antikörpers oder der Bindung des Prionproteins an den ersten Antikörper erforderlich ist, kann dieser ent weder mit einem durch eine Enzymreaktion detektierbaren Chromogen, oder einer direkt detektierbaren Chromophore oder fluoreszente Proteine, wie Phycoerythrin oder Allophycocyanin gekoppelt sein. Auch eine radioaktive Markierung oder andere Markierungen sind möglich.Both monoclonal and polyclonal antibodies with a specificity against epitopes of the native or pathogenic prion proteins or fibrils are used. If a second antibody for the detection of the first antibody or the binding of the prion protein to the first antibody is required, this can ent neither with a chromogen detectable by an enzyme reaction, or a directly detectable chromophore or fluorescent protein, such as Phycoerythrin or Allophycocyanin coupled. Also a radioactive one Marking or other markings are possible.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in Anlehnung an das bekannte ELISA-Verfahren durchgeführt werden. Dabei ist allerdings eine Immobilisie rung der Antigene auf einer Membran oder Oberfläche der Reaktionsgefäße (üblicherweise also der Mikrotiterplatten) nicht mehr erforderlich. Vielmehr können die mit Antikörpern gekoppelten Mikropartikel in die wells der Mikro titerplatten aufgenommen und dort mit dem aufbereiteten Probenmaterial inkubiert werden. Nach ggf. der Behandlung mit einem zweiten Antikörper und der anschließenden Farbreaktion kann die Detektion mit Hilfe eines übli chen Auswertegeräts erfolgen.The method according to the invention can also be based on the known method ELISA procedures are carried out. However, there is an immobilization the antigens on a membrane or surface of the reaction vessels (usually the microtiter plates) are no longer required. Much more can the microparticles coupled with antibodies into the wells of the micro titre plates recorded and there with the prepared sample material be incubated. After treatment with a second antibody, if necessary and the subsequent color reaction, the detection with the help of a übli Chen evaluation device.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind prionprotein-spezifi sche Antikörper an paramagnetische Mikropartikel gebunden (Fig. 1) Die Antikörper sind dabei vorzugsweise gegen die fibrillären Prionproteine gerichtet. Mit einem zweiten Fluoreszenz-markierten Antikörper, der gegen ein anderes Epitop der Fibrillen gerichtet ist, erfolgt der qualitative Nachweis der Prionproteine. Hiermit ist gewährleistet, daß unspezifisch an den Mikro partikeln gebundene Proteine nicht erfaßt werden. Die quantitative Erfas sung der gebundenen Prionen erfolgt durch die Auswertung der Fluo reszenzsignale in einem Fluoreszenzdetektionsgerät, z. B. einem Durchfluß zytometer.In a particularly preferred embodiment, prion protein-specific antibodies are bound to paramagnetic microparticles ( FIG. 1). The antibodies are preferably directed against the fibrillar prion proteins. The qualitative detection of the prion proteins is carried out with a second fluorescence-labeled antibody which is directed against another epitope of the fibrils. This ensures that proteins which are not specifically bound to the microparticles are not detected. The quantitative detection of the bound prions is carried out by evaluating the fluorescence signals in a fluorescence detection device, e.g. B. a flow cytometer.

Die Verwendung eines Durchflußzytometers stellt eine besonders bevor zugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Die Vorteile der Durchflußzytometrie liegen insbesondere darin, daß schon mit einfachen Geräten 100 Fluoreszenzmoleküle pro Partikel erfaßt werden, was etwa der hohen Empfindlichkeit eines radioaktiven Assays entspricht. Zum anderen können bis zu 1000 Partikel pro Sekunde gemessen werden. So kann die Messung einer hohen Anzahl von Proben innerhalb kürzester Zeit gewährlei stet werden.The use of a flow cytometer is a particularly preferred embodiment of the method according to the invention. The advantages of flow cytometry are, in particular, that 100 fluorescent molecules per particle can be detected with simple devices, which corresponds approximately to the high sensitivity of a radioactive assay. On the other hand, up to 1000 particles per second can be measured. In this way, the measurement of a large number of samples can be guaranteed within a very short time.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann eine interne Kontrolle mitgeführt werden. Diese kann darin bestehen, daß zusätzlich zu den Mikro partikeln zum Nachweis der pathogenen Prionproteine Mikropartikel mit Anti körpern gegen das native Prionprotein verwendet werden. Diese dienen der Kontrolle einer vollständigen Proteolyse des nativen Prionproteins. Sofern nämlich nach einer Inkubation mit einem zweiten, ebenfalls gegen das native Protein gerichteten, fluoreszenz-markierten Antikörpers im eine Fluoreszenz zu detektieren ist, ist der Nachweis einer unvollständigen Proteolyse erbracht. Dies ist bedeutsam für die Beurteilung möglicher falsch positiver Ergebnisse, die auf eine unvollständige Verdauung zurückgehen. Die Zuverlässigkeit des Tests kann durch diese internen Kontrollen somit deut lich erhöht werden.In a further advantageous embodiment, an internal control be carried along. This can be that in addition to the micro particles for the detection of pathogenic prion proteins microparticles with anti bodies against the native prion protein can be used. These serve the Control of complete proteolysis of the native prion protein. Provided namely after an incubation with a second, also against the native Protein-directed, fluorescence-labeled antibody in one fluorescence is to be detected is evidence of incomplete proteolysis provided. This is important for the assessment of possible false positives Results due to incomplete digestion. The The reliability of the test can therefore be shown by these internal controls Lich increased.

Zum Zwecke der internen Kontrolle können für die Auswertung in der Durch flußzytometrie auch verschiedene Mikropartikel verwendet werden, die sich ggf. in ihrer Größe oder Färbung unterscheiden. Der Vorteil der Durchfluß zytometrie liegt dabei darin, daß diese Mikropartikel in einem Verfahren gleichzeitig aber getrennt voneinander analysiert werden können.For the purpose of internal control can be used for evaluation in the through Flow cytometry also uses various microparticles that can if necessary, differentiate in size or color. The advantage of the flow Cytometry is that these microparticles in one process but can be analyzed separately from each other at the same time.

Das erfindungsgemäße Verfahren in der Ausführungsform mit paramagneti schen Mikropartikel und der Durchflußzytometrie als Detektionsverfahren fluoreszenz-markierter prionprotein-spezifischer Antikörper bietet zudem den Vorteil der einfachen und leichten vollständigen Automatisierung.The method according to the invention in the embodiment with paramagneti microparticles and flow cytometry as a detection method fluorescence-labeled prion protein-specific antibody also offers the Advantage of simple and easy full automation.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines in den Zeichnungen darge stellten Ausführungsbeispieles des nähren erläutert. Darin zeigen:In the following, the invention is illustrated with reference to one in the drawings presented embodiment of the nourish explained. In it show:

Fig. 1 schematische Darstellung des Nachweises von Prionproteinen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens und Fig. 1 shows a schematic representation of the detection of prion proteins using the method according to the invention and

Fig. 2 Histogramm einer Fluoreszenzdetektion nach der erfindungsge mäßen Verfahrens mittels einer Durchflußzytometrie Fig. 2 histogram of a fluorescence detection according to the inventive method by means of a flow cytometry

Fig. 1. zeigt ein Schema eines bevorzugten Ausführungsbeispiels des erfin dungsgemäßen Verfahrens. Danach werden prionprotein-spezifische Anti körper an einen paramagnetischen Mikropartikel gebunden, die ihrerseits an das Prionprotein binden. Mittels eines zweiten fluoreszenz-markierten spezifischen Antikörpers erfolgt der Nachweis der Bindung des Prionproteins an den ersten Antikörper. Anschließend erfolgt die quantitative Auswertung in einem Durchflußzytometer. Fig. 1. shows a schematic of a preferred embodiment of the inventive method. Thereafter, prion protein-specific antibodies are bound to a paramagnetic microparticle, which in turn bind to the prion protein. The binding of the prion protein to the first antibody is detected by means of a second fluorescence-labeled specific antibody. The quantitative evaluation is then carried out in a flow cytometer.

Fig. 2. zeigt das Beispiel einer durchflußzytometrischen Auswertung. Dazu wurden paramagnetische Mikropartikel mit gekoppelten Anti-Prion-Antikörper nach der Zugabe von BSA (A) und nach der Zugabe von prionischen Fibril len (B) im Durchflußzytometer gemessen. Die Fluoreszenzfärbung erfolgte durch die Zugabe eines weiteren Anti-Prion-Antikörpers, der mit Phy coerythrin gekoppelt war. FIG. 2 shows an example of a flow cytometric analysis. For this purpose, paramagnetic microparticles with coupled anti-prion antibodies were measured in the flow cytometer after the addition of BSA (A) and after the addition of prionic fibrils (B). The fluorescence staining was carried out by adding another anti-prion antibody which was coupled with phy coerythrin.

Die pro Mikropartikel gemessene Orange-Fluoreszenz ist als Histogramm dargestellt. Ist sie gering, so erscheint ein Histogramm am linken Rand. Ist sie hingegen hoch, wandert sie nach rechts.The orange fluorescence measured per microparticle is as a histogram shown. If it is low, a histogram appears on the left edge. is however, if it goes up, it moves to the right.

example 1. Preparation of the sample material

100 mg einer Hirnprobe eines geschlachteten Rindes werden in 900 µl Lysispuffer (100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.5% Natrium desoxycholat, 10 mM Tris pH 7.4) und 100 µl Proteinase K (1 mg/ml) übertragen. Die Probe wird anschließend 5 sec. im Ultrathorax (Sigma, St. Louis, IL, USA) homogenisiert. Der proteolytische Verdau erfolgt bei 37°C für 30 min. Zum Stoppen der enzymatischen Reaktion wird 10 µl 0.5 M PMSF (pH 6.8) hinzugegeben und der Probenansatz für 10 min gekocht.100 mg of a brain sample from a slaughtered cattle are in 900 µl Lysis buffer (100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 10 mM Tris pH 7.4) and 100 µl Proteinase K (1 mg / ml) transfer. The sample is then held in the ultrathorax (Sigma, St. Louis, IL, USA). The proteolytic digestion takes place with 37 ° C for 30 min. To stop the enzymatic reaction, 10 µl 0.5 M PMSF (pH 6.8) is added and the sample mix for 10 min cooked.

2. Coupling the antibodies to the microparticles 2.1. Monoclonal antibodies

Magnetische Mikropartikel. Monoklonale Antikörper 3F4 (M 7216, Dako, Hamburg) werden mit Hilfe eines Kopplungs-Kits (Cat. No. 19539) der Firma Polysciences (Warringden, PA, USA) in einem Verhältnis 2 : 1 kovalent an die magnetischen Mikropartikel (CM-30-10) der Fa. Spherotech Inc. Libertyvill, IL, USA gebunden. Die Mikropartikel weisen einen Durchmesser von 3,5 µm auf.Magnetic microparticles. Monoclonal antibodies 3 F4 (M 7216, Dako, Hamburg) are covalently attached to the magnetic microparticles (CM-) in a ratio of 2: 1 using a coupling kit (Cat. No. 19539) from Polysciences (Warringden, PA, USA). 30-10) from Spherotech Inc. Libertyvill, IL, USA. The microparticles have a diameter of 3.5 µm.

2.2. Polyclonal antibodies

Für einen qualitativen Nachweis der Fibrillen wird ein polyklonaler (Kaninchen-)Antikörper (PA 1-750, Dianova, Hamburg) verwendet. Dazu werden die Mikropartikel (siehe Ziffer 2.1.) mit 10 µl 1 : 50 verdünntem Antikörper versetzt und 30 min bei 4°C inkubiertA polyclonal (rabbit) antibody (PA 1-750 , Dianova, Hamburg) is used for a qualitative detection of the fibrils. For this purpose, 10 µl of 1:50 diluted antibody is added to the microparticles (see section 2.1 .) And incubated at 4 ° C for 30 min

3. Incubation of the microparticles with sample preparation

100 µl des Probenansatzes werden mit 10 µl der nach Ziffer 2.1. oder nach Ziffer 2.1. behandelten Mikropartikel inkubiert. Die Inkubationszeit beträgt 1 h bei 4°C. Anschließend werden die Mikropartikel zweimal mit 1 ml PBS plus 0.1% BSA zur Sättigung der freien Bindungsstellen gewaschen. Der Austausch der Inkubationslösungen erfolgt jeweils durch Verwendung eines Magnetständers (Fa. Promega).100 µl of the sample batch are mixed with 10 µl of the sample according to 2.1 or according to section 2.1 . treated microparticles incubated. The incubation time is 1 h at 4 ° C. The microparticles are then washed twice with 1 ml PBS plus 0.1% BSA to saturate the free binding sites. The incubation solutions are exchanged using a magnetic stand (Promega).

4. Fluorescent labeling

Die Fluoreszenzmarkierung erfolgt nach wiederholtem Waschen mit PBS/BSA durch Zugabe von 5 µl Phycoerythrin-(PE)-konjugiertem Anti- Rabbit-Antikörper (RD I-711116152; Research Diagnostics, Flandern, NL) und einer 30 minütigen Inkubation bei 4°C. Nach einmaligem Waschen mit 1 ml PBS und Aufnahme in 1.5 ml PBS können die Proben im Durchflußzytometer gemessen werden. The fluorescent labeling is carried out after repeated washing with PBS / BSA by adding 5 µl of phycoerythrin (PE) conjugated anti Rabbit antibody (RD I-711116152; Research Diagnostics, Flanders, NL) and a 30 minute incubation at 4 ° C. After one time Washing with 1 ml PBS and taking up in 1.5 ml PBS can help Samples are measured in the flow cytometer.

5. Fluorescence detection

Hierzu wird ein PAS III Durchflußzytometer der Firma Partec (Münster) mit FlowMax-Software verwendet. Das Gerät enthält einen 25 mW- Argon-Laser, der eine Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Die Orange- Emission wird mit einem 575-605 nm Bandpass-Filter gemessen. Die Daten werden als Fluoreszenzhistogramm dargestellt, wobei die durch schnittliche Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl der Partikel aufge tragen ist. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität ist dabei propor tional zur gebundenen Prionenmenge (Abb. 2). For this purpose, a PAS III flow cytometer from Partec (Münster) with FlowMax software is used. The device contains a 25 mW argon laser that generates a wavelength of 488 nm. The orange emission is measured with a 575-605 nm bandpass filter. The data are presented as a fluorescence histogram, with the average fluorescence intensity plotted against the number of particles. The average fluorescence intensity is proportional to the amount of prions bound ( Fig. 2).

credentials

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Display text Fig. 1

Schema des Verfahrens zum Nachweis von Prionen mit Hilfe von Mikroparti keln.Scheme of the procedure for the detection of prions using microparties angles.

Fig. 2

Durchflußzytometrischer Nachweis von Prionen. Paramagnetische Mikropar tikel mit gekoppelten Anti-Prion-Antikörper wurden nach Zugabe von BSA (A) und nach Zugabe prionischer Fibrillen (B) im Durchflußzytometer gemessen. Die Fluoreszenzfärbung erfolgte durch die Zugabe eine weiteren Anti-Prion- Antikörpers, der mit Phycoerythrin konjungiert war.Flow cytometric detection of prions. Paramagnetic micropar articles with coupled anti-prion antibodies were added after the addition of BSA (A) and measured after adding prionic fibrils (B) in the flow cytometer. The fluorescence staining was carried out by adding another anti-prion Antibody conjugated to phycoerythrin.

Claims

1. Immunological method for binding prion proteins or Portions of this involve the coupling of a first prion protein specific antibody to a microparticle.

2. The method according to claim 1, characterized by the incubation of the Microparticles with a prion protein or prion protein sections ent holding sample to form an antibody / prion protein complex xes.

3. The method according to claim 2, characterized by a proof the antibody / prion protein complex by a second detection prion protein-specific antibodies.

4. The method according to claim 3, characterized in that the second Antibody has a fluorescent marker.

5. The method according to claim 4, characterized by a quantification tion of the fluorescence marker by a fluorescence reader.

6. The method according to claim 5, characterized by a flow cytometry.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized by paramagnetic microparticles.

8. The method according to claim 7, characterized by having microparticles a diameter of 0.1 to 8 µm.

9. The method according to any one of the preceding claims, characterized through an internal control.

10. The method according to claim 9, characterized by another Antibodies against a native prion protein.

11. The method according to any one of the preceding claims, characterized by at least two types in different size or color of micro particle.

12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized by polyclonal prion protein specific antibodies.

13. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized by monoclonal prion protein specific antibodies.

14. Microparticles with a prion protein-specific antibody.

15. Microparticles according to claim 14, characterized by a PrP ^sc- specific antibody.

16. Use of a microparticle according to claim 14 or 15 for after white of prions.

17. Use of a microparticle according to claim 14 or 15 for after white spongiform encephalopathies.

18. Method for the detection of prion proteins according to one of the preceding claims, characterized by the use of blood, muscle, spinal fluid, urine or brain samples.

19. Diagnostic kit according to claim 17, characterized by a second prion protein specific antibodies.

20. Diagnostic kit according to claim 19, characterized in that the second antibody has a fluorescent marker.