DD295869A5 - Rekombinante polypeptide und peptide, diese codierende nucleinsaeuren und verwendung dieser polypeptide und peptide in der diagnose von tuberkulose - Google Patents
Rekombinante polypeptide und peptide, diese codierende nucleinsaeuren und verwendung dieser polypeptide und peptide in der diagnose von tuberkulose Download PDFInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft rekombinante Polypeptide und Peptide und insbesondere Polypeptide, die in ihrer Polypeptidkette eine der in den Patentanspruechen angegebenen Aminosaeuresequenzen enthalten. Ferner betrifft die Erfindung gentechnologische Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptide und Peptide und die dabei zu verwendenden, in den Patentanspruechen gekennzeichneten Nucleinsaeuresequenzen. Die erfindungsgemaeszen Polypeptide und Peptide koennen zur Diagnose von Tuberkulose und als aktives Prinzip bei der Herstellung von Tuberkulose-Impfstoffen verwendet werden.{DNA-Rekombination; rekombinante Proteine; Tuberkulose; Impfstoff; Diagnostikum; Fusionsproteine; Mycobacterium tuberculosis}
Description
Rekombinante Polypeptide und Peptide, diese codierende Nucleinsäuren und Verwendung dieser Polypeptide und Peptide in der Diagnose von Tuberkulose
Die Erfindung betrifft rekombinante Polypeptide und Peptide, die in der Diagnose von Tuberkulose verwendet werden können.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptide und Peptide, die einen solchen Grad biologischer Reinheit haben, daß sie als Teil des aktiven Prinzips in der Herstellung von Impfstoffen gegen Tuberkulose verwendet werden können.
Die Erfindung betrifft ferner Nucleinsäuren, die diese Polypeptide und Peptide codieren.
Weiterhin betrifft die Erfindung diagnostische In-vitro-Verfahren und die Polypeptide und Peptide verwendende Kits und Impfstoffe, die die Polypeptide und Peptide als aktives Prinzip gegen Tuberkulose enthalten.
„Rekombinante Polypeptide oder Peptide" betreffen alle Moleküle, die eine Polypeptid-Kette besitzen, die durch gentechnologische Verfahren, Transkription und Translation, mit einer entsprechenden DNA-Sequenz unter der Kontrolle geeigneter Regulationselemente in einem geeigneten zellulären Wirt hergestellt werden können. Folgerichtig schließt der Begriff „rekombinante Polypeptide" wie er hier verwendet wird, die Möglichkeit nicht aus, daß die Polypeptide andere Gruppen,
z. B. glycosylierte Gruppen, enthalten.
Der Begriff „rekombinant" bedeutet, daß die Polypeptide durch gentechnologische Verfahren hergestellt worden sind, besonders da sie das Ergebnis der Expression der entsprechenden, zuvor in den im Wirt verwendeten Expressionsvektor eingeführten Nucleinsäuresequenzen in einem zellulären Wirt sind.
Es ist jedoch klar, daß diese Expression die Möglichkeit nicht ausschließt, daß das Polypeptid durch ein anderes Verfahren hergestellt werden kann, z. B. durch klassische chemische Synthese gemäß Verfahren, die in der Proteinsynthese verwendet werden, oder durch proteolytische Spaltung größerer Moleküle.
Der Begriff „biologisch rein" oder „biologische Reinheit" bedeutet einerseits einen Reinheitsgrad, so daß das rekombinante Polypeptid zur Herstellung von Zusammensetzungen für Impfstoffe verwendet werden kann, und andererseits das Fehlen von Kontaminanten, insbesondere von natürlichen Kontaminanten.
Tuberkulose ist nach wie vor eine häufig vorkommende Krankheit in Entwicklungsländern. Die Lage ist in einigen Ländern drastisch, insbesondere dort, wo ein hohes Vorkommen von Tuberkulose unter AIDS-Patienten eine neue Verbreitung der
Tuberkulose ist eine chronische Infektionskrankheit, in der Zell-vermittelte Immunmechanismen eine wichtige Rolle sowohl für den Schutz gegen als auch bei der Kontrolle der Krankheit spielen.
Trotz BCG-Impfung und einiger wirksamer Arzneimittel bleibt Tuberkulose ein wichtiges weltweites Problem. Der Hauttest mit Tuberkulin PPD (Protein-gereinigte Derivate, englisch „protein-purified derivative"), der hauptsächlich zum Nachweis der Krankheit verwendet wird, ist wenig spezifisch, was auf die Kreuzreaktivität mit anderen pathogenen oder in der Um weit vorkommenden saprophytischen Mycobakterien zurückzuführen ist.
Darüber hinaus ist es mit in serologischen Tests (ELISA) verwendetem Tuberkulin PPD nicht möglich, zwischen Patienten, die mit BCG geimpft worden sind, oder solchen, die früher infiziert waren und solchen zu unterscheiden, die eine evolutive Tuberkulose entwickeln und für die eine frühe und schnelle Diagnose notwendig wäre.
Ein Protein mit einem Molekulargewicht von 32kDa ist aus einem Mycobacterium bovis Kulturfiltrat ohne Zink (8) gereinigt worden (9). Dieses 32-kDa-Protein von M. bovis BCG ist aus einem Sauton Zink-defizienten Kulturfiltrat vom M. bovis BCG gereinigt worden, wobei nacheinander hydrophobe Chromatographie über Phenyl-Sepharose, Ionenaustausch über DEAE-Sephacel und Molekularsieben über Sephadex G-100 verwendet wurden. Wie durch verschiedene Analysen
festgestellt wurde, ist die letzte Präparation homogen. Dieses P32-Protein ist ein Bestandteil von BCG-Zetlen, die unter normalen Bedingungen gewachsen sind. Es stellt etwa 3% des löslichen Teils eines zellulären Extrakts dar und erscheint als das Haupt-Protein, das in einem normalen Sauton-Kurturfiltrat freigesetzt wird. Man hat durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und molekulares Sieben gefunden, daß das Protein ein Molekulargewicht von 32000 hat.
Die NH2-terminale Aminosäuresequenz des 32-kDa-Proteins von M. bovis BCg (Phe-Ser-Arg-Pro-Gly-Leu) ist identisch mit der für das MPB 59-Protein publizierten, die aus dem M.bovis BCG Unterstamm Tokyo (34) gereinigt worden war. Gereinigtes P32 von M. bovis BCG ist durch verschiedene immunelektrophoretische Techniken untersucht worden, und es ist gezeigt worden, daß es zum Antigen-85-Komplex im Referenzsystem für BCG-Antigene gehört. Genauer ist es als Antigen 85A in dem Klassen-Referenzsystem für BCG-Antigene (7) identifiziert worden.
Erhöhte Werte von ImmunglobulinG-Antikörpern gegen das 32-kDa-Protein von M. bovis BCG konnten in 70% der Tuberkulose-Patienten festgestellt werden (30).
Darüber hinaus induziert das 32-kDa-Protein von M. bovis BCG spezifische Lymphproliferation und lnterferon-γ (IFN-γ) Produktion in peripheren Blutleukozyten aus Patienten mit aktiver Tuberkulose (12) und PPD-positiven gesunden Personen. Neuere Ergebnisse zeigen, daß die Menge an 32-kDa-Protein von M.bovis BCG-induziertem IFN-γ in BCG-sensitivierten Maus-Milzzellen sich wahrscheinlich unter H-2-Kontrolle befindet (13). Schließlich steht die hohe Affinität von Mycobakterien für Fibronectin im Zusammenhang mit Proteinen des BCG 85-Antigen-Komplexes (1).
Matsuo et al. (17) haben vor kurzem das Gen cloniert, das das Antigen α, ein wichtiges, von BCG (Unterstamm Tokyo) sekretiertes Protein, das in seiner NH2-terminalen Aminosäuresequenz stark homolog zum und bezüglich der ersten sechs Aminosäuren „Phe-Ser-Arg-Pro-Gly-Leu" sogar identisch mit dem MPB 59-Antigen ist, codiert.
Dieses Gen wurde unter Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde cloniert, die homolog zu der N-terminalen Aminosäuresequenz vom Antigen α ist, das aus M. tuberculosis, wie von H.Tasaka et al. in „Purification and antigenic specificity of alpha protein (Yoneda and Fukui) from Mycobacterium tuberculosis and mycobacterium intracellulare" Hiroshima J. Med. Sei. 32 (1983), 1-8 beschrieben, gereinigt worden war.
Das Vorhandensein von Antigenen von etwa 30-32kDa, Antigen 85-Komplex genannt, ist mit den Elektrophorese-Mustern von Proteinen gezeigt worden, die aus Kulturmedien von Mycobakterien wie Mycobacterium tuberculosis stammen. Durch Immunoblot-Techniken ist gezeigt worden, daß diese Antigene mit Kaninchenseren kreuzreagieren, die gegen das 32-kDa-Protein von BCG hergestellt worden waren (8).
In einer kürzlich veröffentlichten Arbeit wird über die bevorzugte humorale Immunantwort gegen ein 30-kDa- und ein 31-kDa-Antigen in leprösen Lepra-Patienten und gegen ein 32-kDa-Antigen in tuberkulösen Lepra-Patienten (24) berichtet. Man hat ebenfalls gefunden, daß Fibronectin (FN)-bindende Antigene wichtige Bestandteile in Überständen von Mycobacterium tuberculosis-Kurzzeitkulturen sind. In 3-Tage-alten Überständen wurde ein 30-kDa-Protein als das Haupt-(FN)-bindende Molekül identifiziert. In 21 -Tage-alten Überständen band FN an eine Doppel-Proteinbande von etwa 30-32 kDa sowie an eine Gruppe von Antigenen mit größeren molekularen Massen (57 bis 6OkDa) (1).
In anderen Experimenten wurde Escherichia coli mit rekombinanten Plasmiden, die DNA aus Mycobacterium tuberculosis enthalten, transformiert und drei Kolonien wurden aufgrund ihrer Reaktivität mit polyclonalen Antiseren gegen M.tuberculosis ausgewählt. Jede Rekombinante produzierte 35 und 53-kDa-Proteine (35 K bzw. 53-K-Proteine) („Expression of Proteins of Mycobacterium tuberculosis in Escherichia coli and Potential of Recombinant Genes and Proteins for Development of Diagnostic Reagents", Mitchell L. Cohen et al., Journal of Clinical Microbiology [Juli 1987], 1176-1180).
Unter Bezug auf die verschiedenen, bis jetzt bekannten Ergebnisse sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Antigens P32 von Mycobacterium tuberculosis nicht genau festgelegt und darüber hinaus nicht ausreichend, um es eindeutig zu definieren und seine strukturellen und funktioneilen Bestandteile zu charakterisieren.
Darüber hinaus hat die Pathogenität und die potentiell infektiöse Eigenschaft von M. tuberculosis die Forschung behindert, die die Bestandteile sowie die Sezernierungsprodukte dieser Bakterien identifizieren, reinigen und charakterisieren könnte. Eine erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Bereitstellung rekombinanter Polypeptide, die als gereinigte Antigene für den Nachweis und die Kontrolle von Tuberkulose verwendet werden können. Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Bereitstellung von Nucleinsäuren, die die Peptidketten von biologisch reinen, rekombinanten Polypeptiden codieren und ihre Herstellung in großem Maßstab ermöglichen.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Bereitstellung von Antigenen, die in serologischen Tests als schnelles In-vitro-Diagnoseverfahren von Tuberkulose verwendet werden können.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft schnelle In-vitro-Diagnosemittel für Tuberkulose, wodurch zwischen Patienten, die an evolutiver Tuberkulose leiden, und solchen, die gegen BCG geimpft worden sind oder früher infiziert worden waren, unterschieden werden kann.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Bereitstellung von Nucleinsäuresonden, die als In-vitro-Diagnosereagens für Tuberkulose sowie als In-vitro-Diagnosereagens zur Unterscheidung von M. tuberculosis von anderen Mycobacterien-Stämmen verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptide enthalten in ihrer Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (12) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (31) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (36) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (55) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (77) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (96) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (101) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (120) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (175) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (211) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (230) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (275) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
Aminosäuresequenzen, die sich aus einer der vorstehend angegebenen Aminosäuresequenzen durch Modifizierung von mindestens einer Aminosäure durch Substitution und/oder durch Anheften und/oder durch Deletion von Aminosäuren ergeben, wobei diese Modifizierung keine der nachfolgenden Eigenschaften verändert: die die Aminosäuresequenzen enthaltenden Polypeptide reagieren mit polyclonalem Kaninchen-Antiserum, das gegen das 32-kDa-Protein aus M. bovis BCG-Kulturfiltrat hergestellt wurde; und/oder sie reagieren selektiv mit menschlichem Serum aus Tuberkulose-Patienten und besonders aus Patienten, die eine evolutive Tuberkulose in einem frühen Stadium entwickeln und/oder sie reagieren mit Antikörpern gegen die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
In den Fig.3a und 3b repräsentiert
- X: GoderGG;
- Y: C oder CC;
- Z: C oderG;
- W: CoderGodereinanderesNucleotidalsZ;
- K: CoderCG;
- L: G oder CC;
- a,-b,: ALA-ARGoderGLY-ALA-ALA;
- a2: arg oder gly;
- аз-Ьз-Сзгіз-вз^з-: his-trp-val-pro-arg-prooderala-leu-gly-ala;
- a4: pro oder pro-asn-thr;
- a6: pro oder ala-pro.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptide enthalten in ihrer Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (12) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (31) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (36) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (55) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (77) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (96) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (101) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (120) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (175) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (211) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (230) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (275) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
Aminosäuresequenzen, die sich aus einer der vorstehend angegebenen Aminosäuresequenzen durch Modifizierung von mindestens einer Aminosäure durch Substitution und/oder durch Anheften und/oder durch Deletion von Aminosäurenergeben, wobei diese Modifizierung keine der nachfolgenden Eigenschaften verändert: die die Aminosäuresequenzen enthaltenden Polypeptide reagieren mit polyclonalem Kaninchen-Antiserum, das gegen das 32-kDa-Protein aus M. bovis BCG-Kulturfiltrat hergestellt wurde; und/oder sie reagieren selektiv mit menschlichem Serum aus Tuberkulose-Patienten und besonders aus Patienten, die eine evolutive Tuberkulose in einem frühen Stadium entwickeln; und/oder sie reagieren mit Antikörpern gegen die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Fig.4 a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptide enthalten in ihrer Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-30) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (12) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (31) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (36) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (55) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (77) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (96) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (101 !gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (120) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (175) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (211) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (230) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (275) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt,
Aminosäuresequenzen, die sich aus einer der vorstehend angegebenen Aminosäuresequenzen durch Modifizierung von mindestens einer Aminosäure durch Substitution und/oder durch Anheften und/oder durch Deletion von Aminosäuren ergeben, wobei diese Modifizierung keine der nachfolgenden Eigenschaften verändert: die die Aminosäuresequenzen enthaltenden Polypeptide reagieren mit polyclonalem Kaninchen-Antiserum, das gegen das 32-kDa-Protein aus M. bovis BCG-Kulturfiltrat hergestellt wurde; und/oder sie reagieren selektiv mit menschlichem Serum aus Tuberkulose-Patienten und besonders aus Patienten, die eine evolutive Tuberkulose in einem frühen Stadium entwickeln; und/oder sie reagieren mit Antikörpern gegen die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt.
Vorteilhafte erfindungsgemäße Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet, daß sie mit polyclonalem Kaninchen-Antiserum reagieren, das gegen das 32-kDa-Protein aus dem M. bovis BCG Kulturfiltrat, nachfolgend als „P32-Protein von BCG" bezeichnet, hergestellt worden ist.
Vorteilhafte erfindungsgemäße Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet, daß die selektiv mit menschlichem Serum von Tuberkulose-Patienten und besonders Patienten, die eine evolutive Tuberkulose im frühen Stadium entwickeln, reagieren. Nachstehend wird in einer nicht-limitierenden Weise ein Verfahren zur Herstellung von polyclonalem Kaninchen-Antiserum, das gegen das P32-Protein von BCG hergestellt worden ist, und ein Test zum Nachweis, daß die Reaktion zwischen den erfindungsgemäßen Polypeptiden und dem polyclonalen, gegen das P^-Protein von BCG hergestellten Kaninchen-Antiserum stattfindet, angegeben.
1) Verfahren zur Herstellung von polyclonalem, gegen das P32-Protein von BCG hergestelltem Kaninchen-Antiserum: Gereinigtes BCG-P32-Protein aus Kulturfiltraten wird verwendet, a) Reinigung von BCG-P32-Protein:
P32-Protein kann, wie nachfolgend beschrieben, gereinigt werden:
Die verwendeten bakteriellen Stämme sind M. bovis BCG Unterstamm 1173P2 (Pasteur Institute, Paris) und GL2 (Pasteur Institute, Brüssel).
Die Bakterienkultur wird, wie nachfolgend beschrieben, hergestellt:
Mycobacterium bovis BCG wird als Häutchen auf Sauton-Medium 14 Tage bei 37,5°C gezüchtet. Da das Medium mit destilliertem Wasser hergestellt wird, wird Zinksulfat in einer Endkonzentration von 5μΜ zugegeben (normales Sauton-Medium) (J. De Bruyn, M. Weckx und M.-P. Beumer-Jochmans „Effect of zinc deficiency on Mycobacterium tuberculosis var. bovis [BCG]", J. Gen. Microbiol. 124 [1981] 353-357). Wenn Medium ohne Zink benötigt wird, wird das Zinksulfat weggelassen.
Die Filtrate aus den Zink-defizienten Kulturen wurden, wie nachfolgend beschrieben, erhalten:
Das Kulturmedium wird durch Abgießen geklärt. Die verbleibenden Bakterien werden durch Filtration durch eine Millipak 100 Filtereinheit (Millipore Corp., Bedford, Mass.) entfernt. Wenn das Filtrat für die Aufreinigung verwendet wird, wird es auf 20 mM Phosphat, 450 mM NaCI, 1 mM EDTA eingestellt, und der pH-Wert wird mit 5M HCI vor der Sterilfiltration auf 7,3 eingestellt.
Die Proteinanalyse wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde auf 13 Gew.-% Acrylamid enthaltenden Gelen, wie von U. K. Laemmli beschrieben („Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature 227 [1970], 680-685) durchgeführt. Die Gele werden mit Coomassie Brilliant Blue R-250 gefärbt und für die quantitative Analyse bei 595nm mit einem DU 8 Beckman Spektrophotometer abgetastet. Für die Kontrolle auf Reinheit wird eine Silberfärbung mit dem Gel durchgeführt (Biorad Laboratories, Richmond, Calif.).
Der Reinigungsschritt für P32 wird, wie nachfolgend beschrieben, durchgeführt:
Außer für die hydrophobe Chromatographie über Phenyl-Sepharose enthalten alle Puffer Tween 80 (0,005% Endkonzentration). Vor der Sterilisierung wird der pH-Wert auf 7,3 eingestellt. Alle Reinigungsschritte werden bei +4°C durchgeführt. Die Elutionen werden verfolgt, indem die Absorption bei 280 nm aufgezeichnet wird. Die Proteine enthaltenden Fraktionen werden durch SDS-PAGE analysiert.
(i) Das behandelte Filtrat aus einer 4-Liter-Kultur (ohne Zink), das normalerweise 125 bis 150 mg Protein/Liter enthält, wird auf eine Phenyl-Sepharose CL-4 B-Säule (5,0cm χ 5,0cm) (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden), die zuvor mit 2OmM Phosphatpuffer (PB), enthaltend 0,45M NaCI und 1 mM EDTA bei einer Flußrate von 800ml/Stunde aufgetragen. Das Gel wird anschließend mit einem Säulenvolumen desselben Puffers gewaschen, um nicht gebundenes Material zu entfernen, dann nacheinander mit 300 ml 20 mM und 4mM PB und 10 Vol.-% Ethanol. Das P32 erscheint mit der mit 10% Ethanol eluierten Fraktion.
(ii) Nachdem die Phosphat-Konzentration dieser Fraktion auf 4mM eingestellt worden ist, wird sie auf eine mit4mM PB "äquilibrierte DEAE-Sephacel-Säule (2,6cm x 10cm) (Pharmacia Fine Chemicals)-Säule aufgetragen. Nach Waschen mit dem Äquilibrierungspuffer wird die Probe bei einer Flußrate von 50ml/Stunde mit 25mM Phosphat eluiert. Das Eluat wird in einer gerührten Amicon 202-Zelle, die mit einer PMC-Membran (Amicon Corp., Lexington, Mass.) ausgestattet ist, konzentriert.
(iii) Das konzentrierte Material wird molekular über eine SephadexG-100-Säule (2,6cm χ 45cm) (Pharmacia), die mit 5OmM PB äquilibriert worden war, bei einer Flußrate von 12ml/Stunde gesiebt. Die Fraktionen des Maximums, die eine Bande in SDS-PAGE ergeben, werden zusammengefaßt. Die Reinheit der letzten erhaltenen Präparation wird durch SDS-PAGE und nachfolgend durch Silberfärbung und molekulares Sieben auf einer Superose 12-Säule (12,0cm χ 30cm) (Pharmacia), die mit 5OmM PB, enthaltend 0,005% Tween 80, äquilibriert worden war, bei einer Flußrate von 0,2ml/min im Fast Protein Liquid Chromatography-System (Pharmacia) überprüft. Die Elution wird durch Aufzeichnung der Absorption bei 280ηm und 214nm verfolgt.
b) Herstellung des polyclonalen, gegen das P32-Protein von BCG hergestellten Kaninchen-Antiserums: 400pg von gereinigtem BCG-P32-Protein pro ml physiologischer Kochsalzlösung werden mit einem Volumen inkompletten Freund's Adjuvans gemischt. Das Material wird homogenisiert und intradermal in 50-pl-Dosen an 10 Stellen im Rücken der Kaninchen nach 0,4,7 und 8 Wochen injiziert (Adjuvans wird bei der letzten Injektion durch das Verdünnungsmittel ersetzt). Eine Woche später werden die Kaninchen geblutet und die Seren vor der Aufteilung in Aliquots und der Lagerung bei -800C auf die Antikörpertiter getestet.
2) Test zum Nachweis einer Reaktion zwischen den erfindungsgemäßen Polypeptiden und polyclonalem, gegen das BCG-P32-Protein hergestellten Kaninchen-Antiserum:
Der verwendete Test war ein ELISA; der ELISA zur Bestimmung von Antikörpern hat das Verfahren von Engvall und Perlmann (E. Engvall und P. Perlmann „Enzyme-linked immunsorbent assay [ELISA] Quantitative assay of immunoglobulin G.", Immunochemistry8 [1971], 871-874) zur Grundlage.
Immulon Microelisa-Platten (Dynatech, Kloten, Schweiz) werden durch Zugabe von 1 pg der erfindungsgemäßen Polypeptide in 100μΙ Tris-HCI-Puffer (5OmM, pH 8,2) in jede Vertiefung beschichtet. Nach 2stündiger Inkubation bei 27°C in einer Feuchtekammer werden die Platten über Nacht bei 4°C gelagert. Sie werden 4mal mit 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2), enthaltend 0,05% Tween 20 unter Verwendung eines Titertek „microplate washer" (Flow Laboratories, Brüssel, Belgien) gewaschen. Die Blockierung wird 1 Stunde mit 0,5% Gelatine in 0,06 M Carbonatpuffer (pH 9,6) durchgeführt. Die Vertiefungen werden dann wie zuvor gewaschen, und 100μΙ Serum, verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,05% Tween 20 und 0,5% Gelatine, werden zugegeben. Nach den in Vorversuchen erhaltenen Ergebnissen werden die Arbeitsverdünnungen auf 1:200 für IgG-, 1:20 für IgA- und 1:80 für IgM-Bestimmungen festgesetzt. Jede Verdünnung wird zweifach durchgeführt. Nach 2stündiger Inkubation und nachdem die Vertiefungen gewaschen worden sind, werden sie mit 100μΙ eines mit Peroxidase konjugierten Kaninchen-Immunglobulins gefüllt, das gegen menschliches IgG, IgA oder IgM (Dakopatts, Kopenhagen, Dänemark), verdünnt jeweils 1:400,1:400 oder 1:1200 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,05% Tween 20 und 0,5% Gelatine, gerichtet ist, und 90 Minuten inkubiert.
Nach dem Waschen wird die Menge an die Vertiefungen gebundener Peroxidase unter Verwendung einer frisch zubereiteten Lösung von o-Phenylendiamin (10mg/100ml) und Wasserstoffperoxid (8μΙ einer 30%igen H2O2-Lösung pro 100 ml) in 0,15M Citratpuffer (pH 5,0) als Substrat quantifiziert. Die enzymatische Reaktion wird mit 8 η H2SO4 nach 15minütiger Inkubation gestoppt. Die optische Dichte wird mit einem Titertek Multiscan-Photometer (Flow Laboratories) bei 492 nm gemessen. Vertiefungen ohne Seren werden als Kontrolle für die Konjugate verwendet. Jedes Experiment wird unter Einschluß eines negativen und zwei positiver Referenzseren mit mittleren und niedrigen Antikörpertitern auf jeder Platte durchgeführt, um für Unterschiede von Platte zu Platte und von Tag zu Tag zu korrigieren. Die Antikörperkonzentrationen werden als optische Dichte-Werte ausgedrückt, die nach Korrektur der Ablesedaten gemäß den mittleren Unterschieden der Referenzseren erhalten wurden.
Nachstehend ist ebenfalls in einer nicht limitierenden Weise ein Test angegeben, der beweist, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide selektiv von menschlichen Seren aus Tuberkulose-Patienten erkannt werden.
Dieser Test ist in dem Fall, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide durch rekombinante Techniken erhalten werden, eine Immunblot-Analyse(Western-Blot). Dieser Test kann für die erfindungsgemäßen Polypeptide ebenfalls angewendet werden, wenn sie durch ein unterschiedliches Herstellungsverfahren erhalten wurden. Nach Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden die erfindungsgemäßen Polypeptide auf Nitrocellulose-Membranen (Hybond C. [Amersham]), wie von Towbin et al. (29) beschrieben, geblottet. Die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide, verbunden mit ß-Galactosidase, in E.coll Y1089 wird durch die Bindung eines polyclonalen Kaninchen-anti-32-kDa-BCG-Protein-Serums (1:1000) oder unter Verwendung eines monoclonalen anti-ß-Galactosidase-Antikörpers (Promega) sichtbar gemacht. Der zweite Antikörper (alkalische Phosphatase-anti-Kaninchen-lmmunglobulin G- bzw. alkalische Phosphatase-anti-Maus-Immunglobulin G-Konjugate) wird, wie vom Hersteller (Promega) empfohlen, verdünnt.
Um die selektive Erkennung der erfindungsgemäßen Polypeptide und der erfindungsgemäßen Fusionsproteine durch menschliche tuberkulöse Seren zu zeigen, werden Nitrocellulose-Membranen über Nacht mit diesen Seren (1:50) (nach Blockierung von nicht-spezifischen Protein-bindenden Stellen) inkubiert. Die menschlichen tuberkulösen Seren werden nach ihrer Reaktivität (hoch oder niedrig) gegen das gereinigte BCG-32-kDa-Antigen, getestet in einem Dot-Blot-Versuch, wie in Dokument (31) der nachstehenden Bibliographie beschrieben, ausgewählt. Reaktive Flächen auf den Nitrocellulose-Membranen werden durch 4stündige Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Ziege-antimenschlichen Immunglobulin G-Antikörper (Dakopatts, Kopenhagen, Dänemark) (1:200) aufgezeigt, und nach mehrmaligem Waschen wird die Farbreaktion durch Zugabe von Peroxidasesubstrat (a-Chloronaphthol; Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid entwickelt.
Dem Durchschnittsfachmann ist klar, daß die freien reaktiven Gruppen, die in einigen der Aminosäuren vorkommen und Bestandteil der erfindungsgemäßen Polypeptide sind, insbesondere auf der einen Seite die freien Carboxylgruppen der Glutaminsäurereste oder der C-terminalen Aminosäure und/oder auf der anderen Seite die freien Aminogruppen, die von der N-terminalen Aminosäure oder von Aminosäuren innerhalb der Peptidkette, z. B. von Lysin getragen werden, soweit verändert werden können, daß diese Veränderung die oben erwähnten Eigenschaften des Polypeptide nicht ändert. Die so veränderten Moleküle sind natürlich Teil dieser Erfindung. Die Carboxylgruppen können acyliert oder verestert sein. Andere Veränderungen sind ebenfalls Teil der Erfindung. Insbesondere können die Amin- oder Esterfunktionen von terminalen Aminosäuren, oder beide, selbst in die Bindung mit anderen Aminosäuren eingebunden sein. Zum Beispiel kann die N-terminale Aminosäure mit einer Sequenz verbunden sein, die eine bis mehrere dem C-terminalen Bereich eines anderen Peptids entsprechende Aminosäuren enthält.
Des weiteren sind alle Peptidsequenzen, die sich aus der Veränderung der erfindungsgemäßen Polypeptide durch Substitution und/oder durch Anheften und/oder durch Deletion von einer oder mehrerer Aminosäuren ergeben. Teil der Erfindung, soweit diese Veränderungen die oben erwähnten Eigenschaften der Polypeptide nicht verändern.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können glycosyliert sein oder nicht, insbesondere an einigen ihrer Glycosylierungsstellen des Asn-X-Ser- oder Asn-X-Thr-Typs, wobei X eine beliebige Aminosäure repräsentiert.
Vorteilhafte erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide enthalten in ihrer Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt.
Vorteilhafte erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide enthalten in ihrer Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt.
Vorteilhafte erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide enthalten in ihrer Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—43) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt.
Vorteilhafte erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide enthalten in ihrer Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
Vorteilhafte erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide enthalten in ihrer Polypeptidkette mindestens einen der folgenden Aminosäuresequenzen:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
Vorteilhafte erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide enthalten in ihrer Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—30) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-43) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt.
Weitere erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide bestehen aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen:
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
Weitere vorteilhafte erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide bestehen aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen:
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4 a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4 a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
Weitere vorteilhafte erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide bestehen aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen:
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—30) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-43) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt.
Weitere erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide bestehen aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen:
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt.
Weitere vorteilhafte erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide bestehen aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen:
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4 a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (— 1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt.
Weitere vorteilhafte erfindungsgemäße rekombinante Polypeptide bestehen aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen.·
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-43) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—30) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt.
In eukaryontischen Zellen können diese Polypeptide als Signalpeptide verwendet werden, deren Aufgabe es ist, die Translokation eines Proteins von der Synthesestelle zu initiieren, die jedoch während der Translokation herausgeschnitten werden.
Weitere vorteilhafte erfindungsgemäße Peptide bestehen aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen:
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (12) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (31) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (36) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (55) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (77) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (96) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (101) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (120) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (175) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt, oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (211) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (230) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (275) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
Weitere bevorzugte erfindungsgemäße Peptide bestehen aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen:
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (12) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (31 (gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4 a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (36) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (55) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4 a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (77) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (96) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (101) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (120) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (175) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (211) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (230) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (275) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
Weitere vorteilhafte erfindungsgemäße Peptide bestehen aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen:
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (12) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (31) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (36) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (55) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (77) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (96) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (101) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (120) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (175) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (211) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (230) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (275) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt.
Es muß festgehalten werden, daß die oben erwähnten Polypeptide von den Expressionsprodukten einer DNA abgeleitet sind, die von einer Nucleotidsequenz abgeleitet ist, die ein vom Mycobacterium tuberculosis sezerniertes 32-kDa-Protein codiert, wie nachstehend in den Beispielen erläutert.
Die Erfindung betrifft ferner Aminosäuresequenzen, die aus den oben genannten Polypeptiden und einem Protein oder einer in Hinsicht auf das Polypeptid heterologen Sequenz zusammengesetzt sind, wobei das Protein oder die heterologe Sequenz z.B.
etwa 1 bis etwa 1000 Aminosäuren enthalten. Diese Aminosäuresequenzen werden Fusionsproteine genannt.
In einem vorteilhaften erfindungsgemäßen Fusionsprotein ist das heterologe Protein ß-Galactosidase.
Weitere vorteilhafte erfindungsgemäße Fusionsproteine enthalten ein heterologes Protein, das das Expressionsprodukt eines der folgenden Plasmide ist:
pEX1
pEX2
рЕХЗ
pUEX1 pmTNFMPH
pUEX2
pUEX3
Die Erfindung betrifft ferner alle Nucleotidsequenzen, die die erfindungsgemäßen Polypeptide codieren.
Die Erfindung betrifft ferner Nucleinsäuren, die Nucleotidsequenzen enthalten, die unter den folgenden Hybridisierungsbedingungen mit einer der für eines der oben genannten Polypeptide codierenden Nucleotidsequenz hybridisieren:
- Hybridisierungs-und Waschmedium: 3x SSC, 20% Formamid (1X SSC = 0,15M NaCI, 0,015M Natriumeitrat, pH7,0),
- Hybridisierungstemperatur (HT) und Waschtemperatur (WT) für die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, definiert durch x-y, d.h. durch die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (x) gebildeten Ende bis zum vom Nucleotid in Position (y) gebildeten Ende erstreckende Sequenz.
1-182 HT = WT = 690C
1-194 HT = WT = 69°C
1-212 HT = WT = 69°C
1-218 HT = WT = 69°C
1-272 HT = WT = 69°C
1-359 HT = WT = 710C
1-1241 HT = WT = 73 "C
1-1358 HT = WT = 73 0C
183-359 HT = WT = 70 0C
183-1241 HT = WT = 73°C
183-1358 HT = WT = 73°C
195-359 HT = WT = 7O0C
195-1241 HT = WT = 73°C
195-1358 HT = WT = 730C
213-359 HT = WT = 70°C
213-1241 HT = WT = 73°C
213-1358 HT = WT = 73°C
219-359 HT = WT = 71 0C
219-1241 HT = WT = 73°C
219-1358 HT = WT = 73°C
234-359 HT = WT = 71°C
234-1241 HT = WT = 74 0C
234-1 358 HT = WT = 73 0C
273-359 HT = WT = 71°C
273-1241 HT = WT = 74°C
273-1358 HT = WT = 73°C
360-1241 HT= WT =73 0C
360-1358 HT = WT = 73 0C
1242-1358 HT = WT = 62°C
Die oben genannten Temperaturen sind als Annäherungswerte (±5°C)zu betrachten.
Die Erfindung betrifft ferner Nucleinsäuren, die Nucleotidsequenzen enthalten, die komplementär zu den eines der oben genannten Polypeptide codierenden Nucleotidsequenzen sind.
Es muß festgehalten werden, daß in den oben definierten Nucleinsäuren, sowie in den nachstehend definierten Nucleinsäuren, T durch U ersetzt werden kann.
Eine Gruppe bevorzugter erfindungsgemäßer Nucleinsäuren enthält mindestens eine der folgenden Nucleotidsequenzen:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (1) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (182) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (273) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (360) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (1242) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; wobei N eines der fünf Nucleotide A, T, C, G oder I darstellt; oder
die oben genannten Nucleotidsequenzen, bei denen T durch U ersetzt ist; oder Nucleinsäuren, die mit den oben genannten Nucleotidsequenzen oder deren Komplementär-Sequenzen hybridisieren.
Eine Gruppe bevorzugter erfindungsgemäßer Nucleinsäuren enthält mindestens eine der folgenden Nucleotidsequenzen:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (1) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (182) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (273) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (360) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4 a und 4 b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (1242) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; wobei N eines der fünf Nucleotide A, T, C, G oder I darstellt, oder
die oben genannten Nucleotidsequenzen, bei denen T durch U ersetzt ist; oder Nucleinsäuren, die mit den oben genannten Nucleotidsequenzen oder deren Komplementär-Sequenzen hybridisieren.
Eine Gruppe bevorzugter erfindungsgemäßer Nucleinsäuren enthält mindestens eine der folgenden Nucleotidsequenzen:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (130) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (219) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (220) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (1104) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; wobei N eines der fünf Nucleotide A, T, C, G oder I darstellt, oder
die oben genannten Nucleotidsequenzen, bei denen T durch U ersetzt ist; oder Nucleinsäuren, die mit den oben genannten Nucleotidsequenzen oder deren Komplementär-Sequenzen hybridisieren.
Weitere bevorzugte erfindungsgemäße Aminosäuresequenzen enthalten mindestens eine der folgenden Nucleotidsequenzen:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nucleinsäuren enthalten mindestens eine der nachfolgenden Nucleotidsequenzen:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt.
Eine weitere Gruppe bevorzugter erfindungsgemäßer Nucleinsäuren enthält die nachfolgenden Nucleotidsequenzen:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (360) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt.
Eine weitere Gruppe bevorzugter erfindungsgemäßer Nucleinsäuren enthält die nachfolgenden Nucleotidsequenzen:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (360) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt.
In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren eine der folgenden Sequenzen:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (212) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b darstellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (218) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (272) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (12421 gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren За und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren eine der folgenden Sequenzen:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (212) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (218) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (272) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4 a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nucleinsäuren bestehen aus einer der folgenden Nucleotidsequenzen:
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nucleinsäuren bestehen aus einer der folgenden Nucleotidsequenzen:
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4 a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt.
Diese Nucleotidsequenzen können als Signalnucleotidsequenzen verwendet werden, die das entsprechende Signalpeptid codieren.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nucleinsäuren bestehen aus einer der folgenden Nucleotidsequenzen:
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (360) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (360) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nucleinsäuren bestehen aus einer der folgenden Nucleotidsequenzen:
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (182) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (212) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (218) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (272) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucfeotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure i η Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1242) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nucleinsäuren bestehen aus einer der folgenden Nucleotidsequenzen:
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (360) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4 a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (360) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nucleinsäuren bestehen aus einer der folgenden Nucleotidsequenzen:
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (182) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4 a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (212) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (218) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (272) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4 a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4 a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1242) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nucleinsäuren bestehen aus einer der folgenden Nucleotidsequenzen:
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (129) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (90) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (90) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (90) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (130) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (130) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (220) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nucleinsäu ren bestehen aus einer der folgenden Nucleotidsequenzen:
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (129) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (90) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (90) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (90) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (130) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (130) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (130) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (220) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (220) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt.
Die Erfindung betrifft ferner alle rekombinanten Nucleinsäuren, die mindestens eine erfindungsgemäße Nucleinsäure in eine heterologe Nucleinsäure eingebaut enthält.
Die Erfindung betrifft insbesondere die definierten rekombinanten Nucleinsäuren, in denen der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz ein Promotor (insbesondere ein induzierbarer Promotor) voransteht, unter dessen Kontrolle die Sequenz wahrscheinlich transkribiert wird und möglicherweise eine Transkriptions-Terminations-Signale codierende Sequenz nachfolgt.
Die Erfindung betrifft ferner die rekombinanten Nucleinsäuren, in denen die die erfindungsgemäßen Polypeptide und möglicherweise die Signalpeptide codierenden Nucleinsäuresequenzen mit Kontrollelementen verbunden sind, die heterolog sind in bezug auf diejenigen, mit denen sie normalerweise im bakteriellen Gen verbunden sind, und, insbesondere mit Regulationselementen, die daran angepaßt sind, ihre Expression in dem zellulären Wirt, der für ihre Herstellung gewählt wurde, zu kontrollieren.
Die Erfindung betrifft ferner rekombinante Vektoren, insbesondere zur Clonierung und/oder Expression, die vorzugsweise Plasmide, Cosmide oder Phagen sind und in einer der für die Replikation nicht essentiellen Stellen eine erfindungsgemäße rekombinante Nucleinsäure enthalten.
Geeignete Vektoren zur Expression des rekombinanten Antigens sind die nachfolgenden:
| pEX1 | pmTNF MPH |
| pEX2 | plGRI |
| рЕХЗ | |
| pUEXi | |
| pUEX2 | |
| pUEX3 |
Die pEX1-, pEX2- und рЕХЗ-Vektoren sind im Handel erhältlich und können von Boehringer Mannheim erworben werden.
Die pUEXI-, pUEX2- und pUEX3-Vektoren sind ebenfalls im Handel erhältlich und können von Amersham bezogen werden.
In einer vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält der rekombinante Vektor in einer der für die Replikation nicht-essentiellen Stellen für die Expression von erfindungsgemäßen Polypeptiden in einem zellulären Wirt notwendige Elemente und vorzugsweise einen Promotor, der von der Polymerase des zellulären Wirts erkannt wird, insbesondere einen induzierbaren Promotor und vorzugsweise eine Signalsequenz und/oder eine Ankersequenz.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält der rekombinante Vektor die zur Expression einer in den Vektor eingebauten erfindungsgemäßen Nucleinsäure in E.coli notwendigen Elemente und insbesondere die für die Expression des ß-Galactosidase-Gens oder eines Teils davon notwendigen Elemente.
Die Erfindung betrifft ferner einen zellulären Wirt, der mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor transformiert ist, enthaltend die zur Expression der Nucleotidsequenz, die das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, in diesem Wirt notwendigen Regulationselemente.
Die Erfindung betrifft ferner einen zellulären Wirt, derein Bacterium, z.B. E.coli, transformiert mit einem oben und nachstehend in den Beispielen definierten Vektor ist, oder ein eukaryontischer Organismus, z.B. CHO-Zellen, Insektenzellen, Sf9-Zellen (Spodoptera frugeiperda), infiziert mit dem Virus Ac NPV (Autographa californica nuclear-Polyhedrosis-Virus), enthaltend geeignete Vektoren, z. B. pAc373 pYM 1 oder рѴСЗ, BmN (Bombyx mori), infiziert mit dem Virus BmNPV, enthaltend geeignete Vektoren, z. B. pBE 520 oder ρ 89 B310.
Die Erfindung betrifft ein Expressionsprodukt einer von einem erfindungsgemäßen, transformierten zellulären Wirt exprimierten Nucleinsäure.
Die Erfindung betrifft ferner Oligonucleotid-Sonden, die mit irgendeiner dieser Nucleinsäuren oder mit deren Komplementärsequenzen hybridisieren und insbesondere die Sonden, die die nachfolgend in Tabelle I zusammengestellten und in Fig.9 dargestellten Oligonucleotidsequenzen sind.
Sonden A(O, A(iib A(iii), A(iv) und A(v) A(i) CAGCTTGTTGACAGGGTTCGTGGC
A(ii) GGTTCGTGGCGCCGTCACG
A(iii) CGTCGCGCGCCTAGTGTCGG
A(iv) CGGCGCCGTCGGTGGCACGGCGA
A(v) CGTCGGCGCGGCCCTAGTGTCGG
Sonde B
TCGCCCGCCCTGTACCTG
Sonde C GCGCTGACGCTGGCGATCTATC
Sonde D CCGCTGTTGAACGTCGGGAAG
Sonde E
AAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAAC
Sonden F(i), F(H), F(Hi) und F(Jv) F(i) ACGGCACTGGGTGCCACGCCCAAC
F(ii) ACGCCCAACACCGGGCCCGCCGCA
F(iii) ACGGGCACTGGGTGCCACGCCCAAC
F(iv) ACGCCCCAACACCGGGCCCGCGCCCCA
und ihre komplementären Nucleotidsequenzen.
Die Hybridisierungsbedingungen können die folgenden sein:
Hybridisierungs-und Waschmedium: 3x SSC, 20% Formamid (1х SSC = 0.15М NaCI, 0.015М Natriumeitrat, pH7,0), Hybridisierungstemperatur (HT) und Waschtemperatur (WT):
| (WT)X: | HT und WT ("C) |
| A(i) | 50 |
| A(ii) | 50 |
| A(iii) | 52 |
| A(iv) | 60 |
| A(v) | 52 |
| B | 48 |
| C | 50 |
| D | 45 |
| E | 52 |
| F(i) | 55 |
| F(ii) | 59 |
| F(iii) | 55 |
| F(iv) | 59 |
Diese Sonden könnten es ermöglichen, M.tuberculosis von anderen bakteriellen Stämmen und insbesondere von den nachfolgenden Mycobacterium-Arten zu unterscheiden:
Mycobacterium marinum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium gastri, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium terrae und Mycobacterium triviale und insbesondere von M.bovis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium avium, Mycobacterium phlei und Mycobacterium fortuitum.
Die Erfindung betrifft ferner DNA- oder RNA-Primer, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen durch PCR (Polymerase-Kettenreaktions-Technik) verwendet werden können, die z.B. in US-A 4,683,202 und 4,683,195 und EP-B 200362 beschrieben ist.
Die Erfindung betrifft ferner jeden DNA- oder RNA-Primer, der aus etwa 15 bis etwa 25 Nucleotiden einer Nucleotidsequenz, die das erfindungsgemäße Polypeptid codiert,zusammengesetzt ist.
Die Erfindung betrifft ferner jeden DNA- oder RNA-Primer, der aus etwa 15 bis 25 Nucleotiden zusammengesetzt ist, die wahrscheinlich mit einer ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden Nucleotidsequenz hybridisieren.
Die Erfindung betrifft ferner jeden DNA- oder RNA-Primer, der aus etwa 15 bis 25 Nucleotiden besteht, die komplementär zu einer ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden Nucleotidsequenz sind.
Die Sequenzen, die als Primer verwendet werden können, sind nachstehend in Tabelle Il angegeben (Sequenzen P1 bis P6 oder ihre Komplementärsequenzen) und in Figur 9 dargestellt:
P1 GAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCG
P 2 ATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTAC
P 2 Kompl. GTACCACTCGAACGCCGGGGTGTTGAT
P3 TGCCAGACTTACAAGTGGGA
P 3 Kompl. TCCCACTTGTAAGTCTGGCA
P 4 TCCTGACCAGCGAGCTGCCG
P 4 Kompl. CGGCAGCTCGCTGGTCAGGA
P 5 CCTGATCGGCCTGGCGATGGGTGACGC
P 5 Kompl. GCGTCACCCATCGCCAGGCCGATCAGG
P 6 Kompl. GCGCCCCAGTACTCCCAGCTGTGCGT
Kompl. = Komplementärsequenz
Die Sequenzen können als zwölf verschiedene Primer-Paare (in Tabelle III angegeben) kombiniert werden, mit der jede erfindungsgemäße Nucleotidsequenz durch die Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Technik enzymatisch amplifiziert werden kann, und die sich insbesondere von von dem Nucleotid in Position 1 gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position 1358 gebildeten Ende erstreckt, sowie die Nucleotidsequenz des α-Antigens von BCG (17). Der Nachweis des durch PCR amplifizierten Produktes kann durch eine Hybridisierungs-Reaktion mit einer Oligonucleotid-Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden, die sich zwischen den für die Amplifizierung der DNA verwendeten PCR-Primer befindet, durchgeführt werden.
Die PCR-Produkte der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen können vom a-Antigen-Gen von BCG-Genen oder Teilen davon durch Hybridisierungs-Techniken (Dot-Spot, Southern Blot, etc.) mit den in Tabelle III dargestellten Sonden unterschieden werden. Die Sequenzen dieser Sonden sind in Tabelle I angegeben.
Primer-Paar
1. P1 unddieKomplementarsequenzvonP2
2. P1 und die Komplementärsequenz von P
3. P1 unddieKomplementärsequenzvonP4
4. P1 und die Komplementärsequenz von P
5. P1 unddieKomplementärsequenzvonP6
6. P 2 und die Komplementärsequenz von P
7. P 2 und die Komplementärsequenz von P
8. P 3 und die Komplementärsequenz von P
9. P 3 und die Komplementärsequenz von P
10. P 4 und die Komplementärsequenz von P
11. P4unddie Komplementärsequenz von P
12. P5unddie Komplementärsequenz von P
B oder C
B, C, D oder E C
C, D oder E C
C, D oder E
C, D oder E D oder E
Es muß festgehalten werden, daß die enzymatische Amplifizierung auch mit allen Oligonucleotiden durchgeführt werden kann, die etwa 15 aufeinanderfolgende Basen der in Tabelle Il angegebenen Primer haben. Primer mit einer Verlängerung am 5'-Ende oder mit einem geringen Grad an „Fehlpaarung" sollten das Ergebnis der enzymatischen Amplifizierung nicht stark beeinträchtigen, solange die „Fehlpaarung" die Basenpaarung am З'-Ende der Primer nicht beeinträchtigen. Eine spezifische enzymatische Amplifizierung der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz und nicht des BCG-Gens wird erreicht, wenn die Sonden (dargestellt in Tabelle I) oder ihre Komplementärsequenzen als Amplifizierungs-Primer verwendet werden. Wenn die in Tabelle I angegebenen Sonden als Primer verwendet werden, bestehen die Primer-Paare aus einer der Nucleotidsequenzen (A, B, C, D, E, F) von Tabelle I in Kombination mit der Komplementärsequenz irgendeiner anderen Nucleotidsequenz, die A, B, C, D, E oder F ist, wobei die Sequenz A fur jede der Sequenzen A(i), A(U), A(iii), A(iv), A(v) und Sequenz F für jede der Sequenzen F(i), F(ii), F(iii) und F(iv) steht.
Vorteilhafte Primer-Paare fur die enzymatische Amplifizierung der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz können die nachfolgend in Tabelle IUB angegebenen Primer-Paare sein:
und die Komplementarsequenz von B;
und die Komplementarsequenz von C,
und die Komplementarsequenz von C;
und die Komplementarsequenz von F;
und die Komplementarsequenz von D,
und die Komplementarsequenz von E,
und die Komplementarsequenz von D, und die Komplementarsequenz von E; und die Komplementarsequenz von F; und die Komplementarsequenz von D, und die Komplementarsequenz von E; und die Komplementarsequenz von F; und die Komplementarsequenz von E; und die Komplementarsequenz von F; oder und die Komplementarsequenz von F;
wobei A(i), A(ii), A(iii), A(iv), A(v), B, C, D, E und F die in Tabelle I angegebenen Nucleotidsequenzen haben. Bei der Amplifizierung einer erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz mit einem der in Tabelle 1KB angegebenen Primer-Paare kann der Nachweis der amplifizierten Nucleotidsequenz durch eine Hybridisierungsreaktion mit einer Oligonucleotid-Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden durchgeführt werden, wobei sich diese Sequenz zwischen den beiden PCR-Primern befindet, die zur Amplifizierung der Nucleotidsequenz verwendet worden sind. Eine zwischen den beiden Primern befindliche Oligonucleotid-Sequenz kann aus Figur 9 ermittelt werden, in der die Primer A, B, C, D, E und F durch die eingerahmten Sequenzen dargestellt sind, die als Sonden-Bereich A, Sonden-Bereich B, Sonden-Bereich C, Sonden-Bereich D, Sonden-Bereich E und Sonden-Bereich F bezeichnet sind.
Die Erfindung betrifft ferner einen Kit für die enzymatische Amplifizierung einer Nucleotidsequenz durch die PCR-Technik und den Nachweis der amplifizierten Nucleotid-Sequenz, enthaltend eines der in Tabelle III definierten Primer-Paare und eine der erfindungsgemäßen Nachweis-Sonden, die vorzugsweise eine der in Tabelle I definierten Sonden ist, oder eines der in Tabelle III B definierten PCR-Primer-Paare und eine Nachweis-Sequenz, die z. B. aus einer Oligonucleotid-Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden besteht, wobei diese Sequenz sich zwischen den beiden PCR-Primern, die das für die Amplifizierung der Nucleotidsequenz verwendete Primer-Paar sind, befindet (Fig. 9).
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, das die folgenden Schritte umfaßt:
- die Züchtung eines zellulären Wirtes in einem geeigneten Medium, der zuvor mit einem geeigneten, eine erfindungsgemäße Nucleinsäure enthaltenden Vektor transformiert worden ist;
- die Isolierung des von diesem transformierten zellulären Wirt hergestellten Polypeptids aus dem Kulturmedium; und
- die Reinigung des hergestellten Polypeptids, die im letzten Schritt durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) erfolgt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können durch klassische Techniken auf dem Gebiet der Peptidsynthese hergestellt werden.
Die Synthese kann in einer homogenen Lösung oder auf einer festen Phase durchgeführt werden.
Ein Beispiel für eine Synthese-Technik in einer homogenen Lösung, die hier verwendet werden kann, wird von Houbenweyl in „Methoden der organischen Chemie", herausgegeben von E. Wunsch, Bd. 15-I und II, THIEME, Stuttgart, 1974, beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können ebenfalls nach der von R. D. Merrifield in „Solid phase peptide synthesis",
J. P. Ham. Socks, 45,2149-2154 hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren.
Ein geeignetes Verfahren zur chemischen Herstellung von Einzelstrang-Nucleinsäuren (die höchstens 100 erfindungsgemäße Nucleotide enthalten) umfaßt die folgenden Schritte:
- DNA-Synthese unter Verwendung des automatischen ß-Cyanoethylphosphoramidit-Verfahrens, beschrieben in Bioorganic Chemistry 4 (1986), 274-325.
Bei einzelsträngiger DNA kann das am Ende der DNA-Synthese erhaltene Material so verwendet werden.
Ein geeignetes Verfahren zur chemischen Herstellung von Doppelstrang-Nucleinsäuren (enthaltend höchstens 100 erfindungsgemäße Basenpaare) umfaßt die folgenden Schritte:
- DNA-Synthese eines sense-Oligonucleotids unter Verwendung des automatischen ß-Cyanoethylphosphoamidit-Verfahrens, beschrieben in Bioorganic Chemistry 4 (1986), 274-325 und DNA-Synthese eines anti-sense-Oligonucleotids unter Verwendung des automatischen ß-Cyanoethylphosphoramidit-Verfahrens;
- Aneinanderlagern der sense- und anti-sense-Oligonucleotide durch Hybridisierung, um einen DNA-Doppelstrang zu bilden;
- Clonierung des so erhaltenen DNA-Doppelstranges in einem geeigneten Plasmid-Vektor und Isolierung der DNA nach klassischen Verfahren,z.B. Restriktionsenzym-Spaltung und Agarose-Gelelektrophorese.
Ein Verfahren für die chemische Herstellung von Nucleinsäuren mit mehr als 100 Nucleotiden-oder, bei doppelsträngigen Nucleinsäuren, Basenpaaren - umfaßt die folgenden Schritte:
- Zusammenfügen chemisch synthetisierter Oligonucleotide, die an ihren Enden mit verschiedenen Restriktionsstellen versehen sind, deren Sequenzen mit der Reihenfolge der Aminosäuren im natürlichen Peptid kompatibel sind, nach dem in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80 (1983), 7461-7465 beschriebenen Prinzip;
- Clonierung der so erhaltenen DNA in einem geeigneten Plasmid-Vektor und Isolierung der gewünschten Nucleinsäure nach klassischen Verfahren, z.B. Restriktionsenzym-Spaltung und Agarose-Gelelektrophorese.
Die Erfindung betrifft ferner gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide gebildete Antikörper.
Dem Durchschnittsfachmann ist klar, daß diese Herstellung nicht auf polyclonale Antikörper beschränkt ist.
Sie betrifft ferner alle monoclonalen Antikörper, die von jedem Hybridom hergestellt werden, das nach klassischen Verfahren einerseits aus Milzzellen eines Tieres, insbesondere einer Maus oder Ratte, die mit dem gereinigten erfindungsgemäßen Polypeptid immunisiert worden ist und andererseits aus Zellen einer Myeloma-Zellinie hergestellt werden kann, und das ausgewählt werden kann aufgrund seiner Fähigkeit, monoclonale Antikörper herzustellen, die das ursprünglich für die Immunisierung der Tiere verwendete Polypeptid erkennen.
Die Erfindung betrifft ferner alle erfindungsgemäßen Antikörper, die mit einem enzymatischem fluoreszenten oder radioaktiven Marker markiert sind.
Vorteilhaft verwendete Peptide zur Herstellung von Antikörpern, insbesondere von monoclonalen Antikörpern, sind nachfolgend in Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IVa (siehe Figuren 4a und 4b)
Aminosäure- Aminosäure-
Position Position
(NH2-Terminus) (COOH-Terminus)
12 QVPSPSMGRDIKVQFQSGGA 31
36 LYLLDGLRAQDDFSGWDINT 55
77 SFYSDWYQPACRKAGCQTYK 96
101 LTSELPGWLQANRHVKPTGS 120
175 KASDMWGPKEDPAWQRNDPL 194
211 CGNGKPSDLGGNNLPAKFLE 230
275 KPDLQRHWVPRPTPGPPQGA 294
Tabelle IVb (siehe Fig. 5)
Aminosäure- Aminosäure-
Position Position
(NH2-Terminus) (COOH-Terminus)
77 SFYSDWYQPACGKAGCQTYK 96
276 PDLQRALGATPNTGPAPQGA 295
Die Aminosäure-Sequenzen sind im 1-Buchstaben-Code dargestellt.
Veränderungen der in Tabelle IV aufgeführten Peptide sind, abhängig von ihrer beabsichtigten Verwendung, ebenfalls möglich. Wenn die Peptide z. B. in der Herstellung von Antiseren verwendet werden, können Peptide mit einem zusätzlichen Cystein-Rest hergestellt werden. Dieser zusätzliche Cystein-Rest wird vorzugsweise an den Amino-Terminus angeheftet und erleichtert die Kopplung des Peptide an ein Trägerprotein, das notwendig ist, um dem kleinen Peptid immunogene Eigenschaften zu verleihen. Falls das Peptid zur Verwendung in Radioimmunassays markiert werden soll, kann es vorteilhaft sein, das Protein so herzustellen, daß ein Tyrosin entweder an den Amin- oder den Carboxy-Terminus angeheftet wird, um die Jodierung zu vereinfachen. Diese Peptide besitzen daher die Primärsequenz der in Tabelle IV aufgeführten Peptide, jedoch mit nicht in der Primärsequenz des Proteins vorkommenden zusätzlichen Aminosäuren, deren einzige Funktion es ist, den Peptiden die gewünschten chemischen Eigenschaften zu verleihen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum In- vitro-Nachweis von in Bezug zu Tuberkulose stehenden Antikörpern in einer sie wahrscheinlich enthaltenden menschlichen biologischen Probe, wobei man in diesem Verfahren
- die biologische Probe mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Peptid unter Bedingungen in Kontakt bringt, die eine immunologische In-vitro-Reaktion des Polypeptids mit den möglicherweise in der biologischen Probe vorkommenden Antikörpern ermöglichen; und
- den möglicherweise gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex in vitro nachweist. Vorzugsweise ist das biologische Medium ein menschliches Serum.
Der Nachweis kann nach irgendeinem klassischen Verfahren durchgeführt werden.
Ein Beispiel für ein bevorzugtes Verfahren ist ein immunenzymatisches Verfahren, z.B. ein ELISA-, immunfluoreszentes oder radioimmunologisches (RIA)-Verfahren oder ein dazu gleichwertiges.
Somit betrifft die Erfindung ferner jedes erfindungsgemäße Polypeptid, das mit einem geeigneten enzymatischen, fluoreszenten, radioaktiven oder anderen Marker markiert ist.
Ein solches Verfahren zum In-vitro-Nachweis von im Bezug zu Tuberkulose stehenden Antikörpern umfaßt z. B. die folgenden Schritte:
- Beschichten von Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit bestimmten Mengen einer erfindungsgemäßen Polypeptid-Zusammensetzung;
- Einfüllen zunehmender Verdünnungen des zu diagnostizierenden Serums in die Vertiefungen;
- Inkubation der Mikrotiterplatte;
- wiederholtes Waschen der Mikrotiterplatte;
- Einfüllen von gegen die Immunglobuline im Blut gerichteten markierten Antikörpern in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte;
- wobei diese Antikörper mit einem Enzym markiert werden, das in der Lage ist, ein Substrat zu hydrolysieren, wodurch eine Veränderung der Absorption der Strahlung des letzteren bei mindestens einer Wellenlänge erreicht wird;
- Nachweis durch Vergleich der Menge des hydrolysierten Substrats mit einem Kontrollwert.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung in vitro von M.tuberculosis-Antigenen in menschlichen biologischen Proben, die sie wahrscheinlich enthalten, wobei man in diesem Verfahren:
- die biologische Probe mit einem geeigneten erfindungsgemäßen Antikörper unter Bedingungen, die eine immunologische In-vitro-Reaktion des Antikörpers mit den möglicherweise in der biologischen Probe vorkommenden M. tuberculosis-Antigenen ermöglichen, in Kontakt bringt und den möglicherweise gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex in vitro nachweist.
Vorzugsweise besteht das biologische Medium aus Sputum, Brustausfluß-Flüssigkeit, broncho-alveolarer Waschflüssigkeit, Urin, oder Material aus Biopsin oder Autopsien.
Geeignete Antikörper sind vorteilhafterweise monoclonale Antikörper, die gegen die in Tabelle IV aufgeführten Peptide gerichtet sind.
Die Erfindung betrifft ferner ein zusätzliches Verfahren für die In-vitro-Diagnose von Tuberkulose bei einem Patienten, der zu Infektionen mit Mycobacterium tuberculosis neigt und das die folgenden Schritte umfaßt:
- Amplifikation, soweit möglich, der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen, die wahrscheinlich in einer biologischen Probe eines Patienten enthalten sind, mit einem oben genannten DNA-Primer-Paar;
- In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Sonde, unter Bedingungen, die die Bildung eines Hybridisierungs-Komplexes der Sonde mit der Nucleotid-Sequenz ermöglichen;
- Nachweis des möglicherweise gebildeten Hybridisierungs-Komplexes.
Um das diagnostische In-vitro-Verfahren für Tuberkulose bei einem Patienten durchzuführen, der zu Infektionen mit Mycobacterium tuberculosis neigt, kann der folgende Kit (nachfolgend auch als „Bedarfsartikel" bezeichnet) verwendet werden, welcher enthält:
- eine bestimmte Menge einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Sonde;
- vorteilhafterweise das geeignete Medium, das eine Hybridisierungsreaktion der nachzuweisenden Sequenz mit der Sonde ermöglicht;
- vorteilhafterweise Reagenzien, die den Nachweis des Hybridisierungskomplexes, der sich während der Hybridisierungsreaktion zwischen der Nucleotidsequenz und der Sonde gebildet hat, ermöglichen.
Die Erfindung betrifft ferner ein zusätzliches Verfahren für die In-vitro-Diagnose von Tuberkulose bei einem Patienten, der zu Infektionen mit Mycobacterium tuberculosis neigt, wobei man
- eine biologische Probe eines Patienten mit einem erfmdungsgemäßen Polypeptid oder Peptid unter Bedingungen in Kontakt bringt, die eine immunologische In-vitro-Reaktion des Polypeptide oder Peptide mit den möglicherweise in der biologischen Probe vorkommenden Antikörpern ermöglichen; und
- den möglicherweise gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex in vitro nachweist.
Um das diagnostische In-vitro-Verfahren für Tuberkulose bei einem Patienten, der zu Infektionen mit Mycobacterium tuberculosis neigt, durchzuführen, kann der folgende Bedarfsartikel oder Kit verwendet werden, welcher enthält:
- ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Peptid; und
- Reagenzien, die das Zustandekommen der immunologischen Reaktion in einem Medium ermöglichen, und
- Reagenzien, die den Nachweis des durch die immunologische Reaktion gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes ermöglichen und möglicherweise eine Markierung haben oder von einem markierten Reagenz erkannt werden, insbesondere dann, wenn das Polypeptid selbst nicht markiert ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein zusätzliches Verfahren zur In-vitro-Diagnose von Tuberkulose bei einem Patienten, der zur Infektion mit M.tuberculosis neigt, wobei man
- die biologische Probe mit einem geeigneten erfindungsgemäßen Antikörper unter Bedingungen in Kontakt bringt, die eine immunologische In-vitro-Reaktion zwischen dem Antikörper und den sich möglicherweise in der biologischen Probe befindlichen Antigenen von M.tuberculosis ermöglichen; und
- den möglicherweise gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex in vitro nachweist.
Geeignete Antikörper sind vorteilhafterweise monoclonale Antikörper, die gegen die in Tabelle IV aufgeführten Peptide gerichtet sind.
Um das diagnostische In-vitro-Verfahren für Tuberkulose bei einem zur Infektion durch Mycobacterium tuberculosis neigenden Patienten durchzuführen, kann der folgende Bedarfsartikel oder Kit verwendet werden, enthaltend
- einen erfindungsgemäßen Antikörper;
- Reagenzien, die das Zustandekommen der immunologischen Reaktion in einem Medium ermöglichen; und
- Reagenzien, die den Nachweis des durch die immunologische Reaktion gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes ermöglichen und möglicherweise eine Markierung haben oder von einem markierten Reagenz erkannt werden, insbesondere dann, wenn der Antikörper selbst nicht markiert ist.
Ein vorteilhafter Kit für das diagnostische In-vitro-Verfahren für Tuberkulose enthält:
- mindestens ein geeignetes Festphasensystem, z. B. eine Mikrotiterplatte, die mit der in vitro zu diagnostizierenden biologischen Probe beschichtet werden kann;
- eine Präparation, die einen erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper enthält;
- ein spezifisches Nachweissystem für den monoclonalen Antikörper; und
- geeignete Pufferlösungen für die Durchführung der immunologischen Reaktion zwischen der zu untersuchenden Probe und dem monoclonalen Antikörper auf der einen und den gekoppelten monoclonalen Antikörpern und dem Nachweissystem auf der anderen Seite.
Die Erfindung betrifft ferner einen Kit, wie oben beschrieben, der ferner eine Präparation eines der erfindungsgemäßen Polypeptide oder Peptide enthält, wobei das erfindungsgemäße Antigen entweder ein Standard (für die quantitative Bestimmung des gesuchten M. tuberculosis-Antigens) oder im Bezug auf das gesuchte Antigen ein Kompetitiv für einen in einem kompetitiven Dosierungs-Verfahren verwendeten Kit ist.
Die Erfindung betrifft ferner eine immunogene Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Peptid in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.
Die Erfindung betrifft ferner eine Impfstoff-Zusammensetzung, die außer anderen immunogenen Stoffen erfindungsgemäße Polypeptide oder Peptide oder das erfindungsgemäße Expressionsprodukt enthält, gegebenenfalls gekoppelt an ein natürliches Protein oder ein synthetisches Polypeptid mit einem ausreichenden Molekulargewicht, so daß das Konjugat in vivo die Herstellung von Mycobacterium tuberculosis neutralisierenden Antikörpern oder in vivo eine zelluläre Immunantwort durch Aktivierung von M.tuberculosis-Antigen-spezifischen T-Zellen induzieren kann.
Die vorteilhafterweise verwendeten erfindungsgemäßen Peptide haben eine der nachfolgenden Sequenzen:
Tabelle IVa (siehe Figuren 4a und 4b)
| Aminosäure-Position | QVPSPSMGRDIKVQFQSGGA | Aminosäure-Position |
| (NH2-Terminus) | LYLLDGLRAQDDFSGWDINT | (COOH-Terminus) |
| 12 | SFYSDWYQPACRKAGCQTYK | 31 |
| 36 | LTSELPGWLQANRHVKPTGS | 55 |
| 77 | KASOMWGPKEDPAWQRNDPL | 96 |
| 101 | CGNGKPSDLGGNNLPAKFLE | 120 |
| 175 | KPDLQRHWVPRPTPGPPQGA | 194 |
| 211 | 230 | |
| 275 | 294 | |
Tabelle IVb (siehe Fig.5)
Aminosäure-Position (NH2-Terminus)
Aminosäure-Position (COOH-Terminus)
SFYSDWYQPACGKAGCQTYK PDLQRALGATPNTGPAPQGA
96 299
Die Aminosäure-Sequenzen sind im 1-Buchstaben-Code angegeben.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung sind in den nachfolgenden Beispielen und in den die Erfindung veranschaulichenden Figuren erläutert.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 (A) und 1 (B): Identifizierung von sechs gereinigten rekombinanten Agtl 1-M.tuberculosis-Clonen. Figur 1 (A) zeigt die EcoRI-Restriktionsanalyse der Clone 15,16,17,19 und 24 und in der mit M gekennzeichneten Spur EcoRI-Hindlll gespaltenen lambda-DNA (Boehringer)-Molekulargewichtsmarker (in Kilobasenpaaren).
Figur 1 (B): Immunoblotanalyse von Rohlysaten von E.coli, das Clone 15,16,17,19,23 und 24 als lysogene Phagen trägt. Der («-) zeigt das von den rekombinanten gt 11-M-tuberculosis-Clonen hergestellte Fusionsprotein. Expression und Immunoblot erfolgten wie oben beschrieben. Molekulargewichte (als kDa angegeben) wurden durch Vergleich mit dem Molekulargewichtsmarker (hohes Molekulargewicht-SDS Eichkit, Pharmacia) ermittelt.
Figur 2 Restriktionskarte der DNA-Insertionen in den rekombinanten XgtH-M.tuberculosis-Clonen 17 und 24, die mit dem polyclonalen anti-32-kDa (BCG)-Antiserum, wie oben definiert, identifiziert wurden, und der Clone By1, By2 und By5, die durch Hybridisierung mit einem 120bp EcoRI-Kpn I-Restriktionsfragment aus Clon 17 isoliert wurden.
DNA wurde ausXgt11-Phagen-Stammlösungen unter Verwendung des „Lambda Sorb Phage-Immunoadsorbent", wie vom Hersteller (Promega) beschrieben, isoliert. Die Restriktions-Spaltstellen wurden, wie oben beschrieben, lokalisiert. Einige der Restriktionsspaltstellen (*) wurden aus einer Computer-Analyse der Nucleotidsequenz abgeleitet.
Die kurzen vertikalen Balken ( ) repräsentieren von Linkern stammende EcoRI-Spaltstellen, die sich an den Enden der DNA-Insertionen von rekombinanten Clonen befinden. Der untere Teil zeigt eine Vergrößerung der das 32-kDa-Antigen codierenden 1.YM?egionL die sequenziert worden istKlie :feile zeigen !trategien und ?ichtungender 1ideoxyM!equenzierung_*—»): in Bluescribe M13subcloniertes Fragment; (<-»): in M13 mp10-und mp 11-Vektoren subcloniertes Fragment; (->); unter Verwendung eines synthetischen Oligonucfeotids bestimmte Sequenz.
Figuren 3a und 3b: Allgemeine Formel der Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen Antigene. Figuren 4a und 4b: Nucleotid- und Aminosäuresequenzen eines der erfindungsgemäßen Antigene.
Zwei Gruppen von Sequenzen, die den E.coli Konsens-Promotor-Sequenzen ähneln, sind eingerahmt und die Homologie zur Konsensus-Sequenz ist durch fettgedruckte Kursivbuchstaben angezeigt. Fettgedruckte römische Buchstaben zeigen die putative Shine-Dalgarno-Sequenz.
Die doppelt unterstrichene NH2-terminale Aminosäuresequenz des reifen Proteins ist starkhomolog-29 von 32 Aminosäurenzu der des MPB 59-Antigens (34). Fünf zusätzliche ATG-Codons stromaufwärts von dem ATG in Position 273 sind durch Punkte unterstrichen. Vertikale Pfeile W) zeigen den wahrscheinlichen NH2-Terminus der Clone 17 und 24 an. Die hier willkürlich getroffene Wahl zeigt das 59 Aminosäuren enthaltende Signalpeptid, das sich aus dem ATG in Position 183 als Startcodon ergibt. Figur 5: Nucleotid- und Aminosäuresequenzen des erfindungsgemäßen 32-kDa-Antigens.
Die doppelt unterstrichene NH2-terminale Aminosäuresequenz des reifen Proteins ist stark homolog-29 von 32 Aminosäurenzu der des MPB 59-Antigens (34). Vertikale Pfeile (/) zeigen den vermuteten NH2-Terminus der Clone 17 und 24 an. Figur 6: Hydrophobitäts-Muster des erfindungsgemäßen 32-kDa-Antigens und des α-Antigens von BCG (17). Figur 7: Homologie zwischen dem erfindungsgemäßen 32-kDa-Antigen und dem α-Antigen von BCG (überarbeitete Version). Identische Aminosäuren sind durch (:), in der Evolution konservierter Ersatz einer Aminosäure durch (.) und nicht vorhandene Homologie durch ( ) dargestellt. Die unterstrichene Sequenz (=) stellt das Signalpeptid dar, wobei die hier willkürlich gewählte Möglichkeit das 43 Aminosäure umfassende Signalpeptid darstellt, das sich aus dem ATG in Position 91 als Startcodon ergibt. Bindestriche in der Sequenz zeigen Lücken an, die für ein optimales Aufeinander-Ausrichten notwendig sind. Figur 8: Darstellung der Tatsache, daß das erfindungsgemäße 32-kDa-Protein selektiv von menschlichen tuberkulösen Seren erkannt wird.
Figur 8 zeigt den Immunoblot mit menschlichen tuberkulösen Seren und monoclonalen anti-ß-Galactosidase-Antikörpern. Spuren 1 bis 6:140-kDa-Fusisions-Protein exprimierendes E. coli-Lysat; Spuren 7 bis 12: nichtfusionierte ß-Galactosidase (114 kDa). Die DNA-Insertion von Clon 17 (2,7kb) wurde in pUEX2 subcloniert, und die Expression des Fusionsproteins wurde, wie von Bresson und Stanley (4) beschrieben, induziert. Spuren 1 und 7 wurden mit dem monoclonalen Anti-ß-Galactosidase-Antikörper umgesetzt; Spuren 4,5,6 und 10,11 und 12 wurden mit drei verschiedenen menschlichen tuberkulösen Seren umgesetzt, die sehr stark mit dem gereinigten erfindungsgemäßen 32-kDa-Protein reagierten; Spuren 2; 3,8 und 9 wurden mit
2 verschiedenen Seren niedriger Reaktivität umgesetzt.
Figur 9: Ausrichten der Nucleinsäuresequenz des erfindungsgemäßen 32-kDa-Proteins von M. tuberculosis (obere Reihe), die der Sequenz in Figur 5 entspricht, auf das erfindungsgemäße, in Figuren 4a und 4b dargestellte Gen (mittlere Reihe) und auf das das α-Antigen von BCG codierende Gen (untere Reihe).
Bindestriche in der Sequenz zeigen Lücken an, die für ein optimales Aufeinanderausrichten der Nucleinsäuresequenzen notwendig sind.
Die Primer-Bereiche für die enzymatische Amplifikation sind eingerahmt (P 1 bis P 6).
Die spezifischen Sonden-Bereiche sind eingerahmt und als Sonden-Bereich A, Sonden-Bereich B, Sonden-Bereich C, Sonden-Bereich D, Sonden-Bereich E und Sonden-Bereich F bezeichnet
Es muß festgehalten werden, daß das Numerierungssystem der Nucleotide sich vom Numerierungssystem in den Figuren 3a,
3 b und 5 unterscheidet, da das Nucleotid in Position 1 (in Figur 9) dem Nucleotid 234 in Figur 3a und dem Nucleotid 91 in Figur 5 entspricht.
Figur 10a: Restriktions- und genetische Karte des Plasmids plGRI, das in Beispiel 4 für die Expression des erfindungsgemäßen
Die unterstrichenen Restriktionsspaltstellen kommen nur einmal vor.
Figur 10b: Nucleinsäuresequenz von plGRI.
In dieser Figur ist die Herkunft der für die Konstruktion des Plasmids plGRI verwendeten Nucleotid-Abschnitte dargestellt.
Position
3422-206: Lambda PL, enthaltend das EcoRI-Mboll-Fragment von ρΡί(λ) (Pharmacia), wobei die Enden in glatte Enden umgewandelt worden sind
207-384: synthetische DNA-Sequenz
228-230: Initiationscodon ATG des ersten Cistrons
234-305: DNA, die die Aminosäuren 2 bis 25 des reifen Maus-TNF codiert 306-308: Stopcodon (TAA) des ersten Cistrons
311-312: Initiationscodon (ATG) des zweiten Cistrons
385-890: rrnBTiT2, enthaltend das Hindlll-Sspl-Fragment von pKK223 (Pharmacia)
891-3421: Dral-EcoRI-Fragment von рАТібз(ВіоехсеІІепсе), wobei die Spaltstellen in glatte Enden umgewandelt worden sind, enthaltend das Tetracyclin-Resistenzgen und den Replikationsursprung.
Die nachstehend angegebene Tabelle V zeigt die vollständige Restriktions-Spaltstellen-Analyse von plGRI. Tabelle 5
Gesamtzahl der Basen: 3423
Die Analyse wurde mit der vollständigen Sequenz durchgeführt.
| Acc I | 370 | 2765 | 2 868 | 2982 | 3003 | 2329 | 2732 | 3388 | 3403 | 2617 | 289 |
| Acyl | 735 | 2211 | |||||||||
| AfIIII | 1645 | ||||||||||
| Aha III | 222 | 1345 | 1481 | 1707 | |||||||
| AIuI | 386 | 1088 | 1977 | 2156 | 2 280 | 2 529 | |||||
| AIwNI | 1236 | ||||||||||
| Ара Ll | 1331 | ||||||||||
| Asp 7181 | 208 | 623 | 713 | 1935 | 2529 | 2617 | |||||
| Asu I | 329 | 494 | |||||||||
| 3244 | |||||||||||
| Aval | 1990 | 1935 | 1977 | 2 280 | |||||||
| Avail | 329 | 494 | 1869 | 2813 | 3202 | ||||||
| Ball | 1973 | 2630 | |||||||||
| Bam Bl | 3040 | 2985 | 3006 | ||||||||
| Bbel | 2214 | 2871 | 1735 | 1753 | 1866 | ||||||
| Bbv I | 389 | 1316 | 1226 | 1973 | 1997 | 3 287 | |||||
| Bbvl» | 1017 | 1223 | |||||||||
| Bbv Il | 1822 | 2685 | |||||||||
| BgII | 2 253 | 2487 | 1001 | 1087 | 3048 | ||||||
| Bin I | 15 | 903 | 2313 | 3035 | 1499 | 1620 | 1975 | 2 358 | |||
| Binl» | 902 | 999 | 2 926 | 2159 | 2883 | 3247 | 714 | 77 | |||
| Bsp Hl | 855 | 925 | 3 255 | 1481 | 157 | ||||||
| Bsp Ml | 382 | 2361 | 585 | 753 | 1486 | 2092 | 213 | ||||
| BstNI | 213 | 475 | 716 | 1268 | 1933 | 2478 | 249 | ||||
| Caull | 4 | 683 | 2646 | 3005 | 3014 | 391 | 421 | 607 | 625 | 2 946 | 301 |
| CfMOI | 2132 | 2486 | 2884 | 3016 | 3120 | 1236 | 1315 | 1340 | 1345 | ||
| Cfrl | 1971 | 2476 | 1926 | 1931 | 1973 | 2010 | |||||
| CIaI | 3 393 | 270 | 380 | 386 | 2 370 | 2427 | 2 435 | 2 465 | |||
| C vi Jl | 190 | 263 | 1117 | 1160 | 1171 | 2822 | 2 886 | 2 894 | 2932 | 2 274 | 228 |
| 791 | 1088 | 1634 | 1707 | 1726 | 3403 | ||||||
| 1605 | 1623 | 2 300 | 2310 | 2329 | |||||||
| 2157 | 2162 | 2 732 | 2 748 | 2 804 | 664 | 962 | 1371 | 1835 | |||
| 2544 | 2 588 | 3245 | 3269 | 3388 | 995 | 1006 | 1081 | 1957 | |||
| 3087 | 3122 | ||||||||||
| CviQI | 209 | 3 253 | 343 | 518 | 608 | ||||||
| Ddc I | 133 | 336 | 897 | 909 | 987 | ||||||
| Dpnl | 9 | 236 | 2951 | 3042 | 3069 | ||||||
| 2320 | 2592 | 2892 | |||||||||
| Drall | 1935 | 1977 | |||||||||
| Drall! | 293 | 2887 | |||||||||
| Dsal | 309 | 1968 | |||||||||
| Eco31l | 562 | 2642 | 2923 | 3185 | |||||||
| ECO47I1I | 341 | 1773 | |||||||||
| Eco57l | 214 | 2869 | 2983 | 3004 | 1484 | 1497 | 1618 | 1973 | 2 356 | 3285 | 174 |
| Eco57l* | 1103 | 2 792 | 239 | ||||||||
| Eco78l | 2212 | 473 | 583 | 751 | 1240 | 1305 | 1448 | 1603 | 1721 | 1724 | |
| EcoNI | 196 | 2008 | 2011 | 2130 | 2 209 | 2254 | 2311 | 237 | |||
| EcoRII | 211 | 479 | 1031 | 1237 | 2 836 | 2839 | 3117 | 3120 | 3191 | ||
| EcoRV | 3 232 | 1858 | 1987 | 2 001 | 1881 | 2003 | 2029 | 2174 | 2184 | 2313 | |
| Fnu4HI | 378 | 2644 | 2 695 | 2802 | 2716 | 3072 | |||||
| 1855 | 1021 | 1602 | 1784 | ||||||||
| 2479 | 2445 | 2472 | 2601 | ||||||||
| FnuDII | 489 | 799 | 3317 | ||||||||
| 2440 | 2370 | 2415 | 3269 | 318 | |||||||
| Fokl | 415 | 2035 | 1634 | 1973 | 2370 | 2427 | 2499 | 237 | |||
| Fokl* | 763 | 2214 | 2644 | 2871 | 2925 | 2985 | 3006 | ||||
| Gsul | 339 | 791 | 1171 | 1623 | 1171 | 1605 | 1623 | 1634 | 1973 | 2157 | |
| Gsul* | 2 589 | 541 | 1405 | 1775 | 2822 | 2886 | 2 894 | 3018 | 3122 | 3245 | |
| Had | 775 | 714 | 775 | 791 | 2185 | 2776 | |||||
| Нас Il | 343 | 2478 | 2499 | 2588 | 3015 | ||||||
| Нас III | 625 | 181 | 743 | 2035 | 2832 | 3143 | |||||
| 2427 | 1533 | 2429 | 2461 | 2 867 | 2 981 | 3002 | 3296 | 3339 | 196 | ||
| Hgal | 158 | 1335 | 1954 | 2 245 | 300 | ||||||
| Hgal* | 955 | 2126 | 2210 | 2 649 | 1130 | 1304 | 1404 | 1471 | 1741 | 1774 | |
| HgiAI | 139 | 2 948 | 2603 | 2643 | 2718 | 2870 | 2924 | 2984 | 196 | ||
| HgiCI | 208 | 489 | 540 | 1021 | 300 | ||||||
| HgiJII | 2 934 | 2062 | 2213 | 2472 | 1128 | 1302 | 1402 | 1469 | 1739 | 1772 | |
| Hhal | 342 | 3186 | 3318 | 2601 | 2641 | 2716 | 2868 | 2 922 | 2982 | ||
| 2000 | 487 | 538 | 1019 | ||||||||
| 3158 | 2060 | 2211 | 2470 | ||||||||
| HinPll | 340 | 3184 | 3316 | 239 | |||||||
| 1998 | 371 | 2 766 | 1891 | 2112 | 2410 | 2 564 | 2784 | ||||
| 3156 | 3386 | 1267 | 1293 | 1440 | 1932 | 2133 | 2159 | ||||
| Hindll | 107 | 1275 | 1671 | 1746 | 3006 | 3015 | 3030 | 3247 | 3256 | ||
| Hindill | 384 | 682 | 716 | 1077 | 914 | 1900 | 2121 | 2975 | 3020 | 3302 | |
| Hinfl | 367 | 2647 | 2723 | 2883 | |||||||
| Hpall | 3 | 138 | 181 | 663 | |||||||
| 2487 | 3187 | 329 | |||||||||
| Hphl | 94 | 1871 | 2460 | 2516 | 228 | ||||||
| Hphl* | 6 | 899 | 1152 | 1928 | 1109 | 1225 | 1288 | 2 267 | 2 534 | 3 202 | |
| Kpnl | 212 | 698 | 944 | 1847 | 985 | 993 | 1004 | 1079 | 1955 | 2272 | |
| Mae I | 364 | 255 | 304 | 313 | 3067 | ||||||
| Maell | 274 | 234 | 895 | 907 | 1827 | 2419 | 2 690 | ||||
| Мае III | 169 | 2590 | 2949 | 3040 | |||||||
| Mbol | 7 | 422 | 917 | 1779 | 254 | ||||||
| 2318 | 2 944 | 2630 | |||||||||
| Mboll | 207 | 1436 | 3112 | 3199 | 1467 | 1750 | 2116 | 2143 | 2181 | 2 242 | |
| Mbo II* | 988 | 1542 | 1948 | 2446 | |||||||
| Mmel* | 1252 | 289 | 337 | 711 | 764 | 941 | 3 361 | 3 383 | 3420 | ||
| MnII | 1218 | 3030 | 3234 | 3 294 | |||||||
| MnII* | 208 | 186 | 221 | 433 | |||||||
| 2811 | 2061 | 3157 | |||||||||
| Msol | 179 | 2488 | 2 648 | 3016 | 216 | ||||||
| Mstl | 1963 | 2 868 | 2982 | 3003 | |||||||
| Nael | 2134 | 567 | 859 | 929 | 1649 | 1828 | 1962 | 221 | |||
| Narl | 2211 | 2672 | 2711 | 2857 | 2930 | 3068 | 3415 | ||||
| Ncol | 309 | 230 | 313 | 512 | 1617 | 1936 | 1979 | 2093 | 2128 | 2163 | |
| Nhel | 3186 | 2 241 | 2369 | 2486 | 2 983 | 3004 | 3 042 | 3088 | 3 298 | 3 341 | |
| NIaIII | 166 | 330 | 496 | 1578 | |||||||
| 2 226 | 2651 | 2869 | 2 893 | ||||||||
| NIaIV | 210 | ||||||||||
| 2 530 | 1307 | 2278 | |||||||||
| Nrul | 2445 | 2857 | |||||||||
| NspBII | 1062 | 2052 | 2101 | ||||||||
| NspHI | 1649 | 1754 | |||||||||
| PfIMI | 293 | 2 778 | |||||||||
| PIeI | 375 | 1977 | |||||||||
| PIeI* | 1269 | 1980 | 2895 | ||||||||
| PpuMI | 1935 | ||||||||||
| Pssl | 1938 | 3254 | |||||||||
| Pstl | 379 | ||||||||||
| Rsal | 210 | ||||||||||
| Sail | 369 | 2764 | 475 | 585 | 683 | 716 | 753 | 1268 | 1486 | 1499 |
| Scr Fl | 4 | 213 | 2159 | 2358 | 2883 | 3247 | 3287 | |||
| 1933 | 1975 | 1954 | 2245 | 2 832 | 2934 | 2948 | 3143 | |||
| Sdul | 139 | 1335 | 1485 | 1968 | 2046 | 2 248 | 2 881 | 2887 | 3 286 | 3300 |
| Sec I | 3 | 309 | 2392 | 2767 | 3178 | 3 291 | ||||
| SfaNI | 597 | 765 | 2380 | 3001 | 3013 | 3 202 | ||||
| Sfa NI* | 1548 | 1985 | ||||||||
| Sphl | 2 857 | 473 | 583 | 681 | 714 | 751 | 1266 | 1484 | 1497 | |
| Ssoll | 2 | 211 | 2157 | 2356 | 2 881 | 3 245 | 3 285 | |||
| 1931 | 1973 | |||||||||
| SLyI | 309 | 2046 | 613 | 1547 | 2149 | 2290 | 2 765 | 3078 | 3393 | |
| Taql | 252 | 370 | ||||||||
| Taq HB | 1749 | |||||||||
| TaqHB* | 2751 | |||||||||
| TthHHI | 38 | 1054 | 1061 | |||||||
| Tth 11111* | 633 | 1022 | ||||||||
| Xbal | 363 | 907 | 993 | 1004 | 3040 | |||||
| Xho Il | 7 | 895 | ||||||||
| Xmalll | 2476 | |||||||||
| Xmal | 414 | 3422 | ||||||||
Gesamtzahl der Spaltungen: 705
Liste der Enzyme nach Anzahl der Spaltungen:
| CviJI | 61 | Sdnl | AfIII | Ара I | 8 | Asu Il | Tth 111II* | Avrll | 3 | Bbv II* | Aval | Bell | 1 |
| Fnu4HI | 31 | Caull | Bsp Ml* | Bsp Mil | 8 | BssHII | NspBII | BstEII | 3 | BstXI | Tag HB | Eco311 | 1 |
| Hhal | 25 | Bbvl | Espl | Hpal | 8 | MIuI | Fokl | Mmel | 3 | Ndel | AIwNI | Not I | 1 |
| HinPII | 25 | Mbo Il | PmaCI | Pvul | 7 | Pvull | PfIMI | Rsrll | 3 | Sael | Dralll | Saell | 1 |
| HaelH | 21 | Avail | Seal | Seil | 7 | Sfil | Hindll | Smal | 3 | SnaBI | AfI Hl | Spei | 1 |
| NIaIV | 21 | Mae Il | Sspl | Stu I | 7 | Taq HA | Dsal | Taq IIA* | 3 | CIaI | Vspl | 1 | |
| NIaIII | 21 | Sfa NL | Xho I | Xmal | 6 | Bsp Hl | 3 | Eco57l» | 1 | ||||
| Hpali | 20 | XholL | 6 | Pssl | 3 | Nhel | 1 | ||||||
| Scr Fl | 18 | HgiAI | 6 | Mstl | 3 | Gsul* | 1 | ||||||
| SsoJI | 18 | Sfa Nl* | 6 | HgiJII | 2 | Ball | 1 | ||||||
| Fnu DII | 17 | Bbvl* | 6 | PIeI | 2 | EcoRV | 1 | ||||||
| Mbo I | 16 | Cfc 10I | 6 | Mbo II* | 2 | Sphl | 1 | ||||||
| Dpnl | 16 | Hgal | 6 | CviQI | 2 | Xmalll | 1 | ||||||
| MnII* | 15 | Acyl | 5 | Acc I | 2 | Hphl* | 1 | ||||||
| Asu I | 12 | Bin I | 5 | BgII | 2 | Tag MB* | 1 | ||||||
| Нас IC | 11 | Cf rl | 5 | PIeI* | 2 | Eco57l | 1 | ||||||
| Mae III | 11 | Hgal* | 5 | Gsul | 2 | Knpl | 1 | ||||||
| Hphl | 10 | Mae I | 5 | PpuMI | 2 | Xbal | 1 | ||||||
| BstNI | 10 | Eco47lll | 5 | TthHHI | 2 | Aha III | 1 | ||||||
| EcoRII | 10 | MnII | 5 | Hind III | 2 | Ntu I | 1 | ||||||
| Seel | 10 | Mmel* | 4 | NspHI | 2 | Bam Hl | 1 | ||||||
| Ddel | 9 | Eco78l | 4 | Rsal | 2 | Ара LI | 1 | ||||||
| Hinfl | 9 | Nac78l | 4 | Sail | 2 | Asp718l | 1 | ||||||
| Haol | 9 | Bbel | 4 | Bbv Il | 2 | ЕсоЗІІ | 1 | ||||||
| AIuI | 9 | Bin I* | 4 | Bsp Ml | 2 | Ncol | 1 | ||||||
| HgiCI | 9 | Narl | 4 | Styl | 2 | Pst I | 1 | ||||||
| Mscl | 9 | Fokl* | 4 | EcoNI | 2 | ||||||||
| Tag I | 9 | Drall | 3 | Xmnl | 2 | ||||||||
| Liste ausgewählter, nicht spaltender Enzyme: | |||||||||||||
| Aatll | |||||||||||||
| BgIII | |||||||||||||
| EcoRI | |||||||||||||
| Nsil | |||||||||||||
| Saul | |||||||||||||
| SpII | Tth 1111 | ||||||||||||
| Xcal | |||||||||||||
Gesamtanzahl ausgewählter, nicht spaltender Enzyme: 45
Figur 11a: Restriktions- und genetische Karte des Plasmids pmTNF MPH, das in Beispiel 5 für die Expression des erfindungsgemäßen P32-Antigens in E. coli verwendet worden ist.
Figur 11b: Nucleinsäuresequenz von pmTNF MPH. In dieser Figur ist die Herkunft der für die Konstruktion des Plasmids pmTNF-Hise verwendeten Nucleotid-Bereiche dargestellt.
Position 1-208: Lambda PL, enthaltend das EcoRI-Mboll-Fragment von ρΡΙ(λ) (Pharmacia), wobei die Restriktionsspaltstellen in
glatte Enden umgewendet worden sind 209-436: synthetisches DNA-Fragment 230-232: Initiationscoden (ATG) des mTNF-Fusionsproteins 236-307: Sequenz, die die Aminosäuren 2 bis25von reifem Maus-TNF codiert 308-384: Vielfach-Clonierungsstelle, enthaltend HiS6, das die Sequenz der Positionen 315-332 codiert 385-436: Hindlll-Fragment, enthaltend den E. coli trp-Terminator 437-943: rrnBT,T2, enthaltend das Hindlll-Sspl-Fragment von pKK223 (Pharmacia) 944-3474: Dral-EcoRI-Fragment von ρAT163 (Bioexcellence), wobei die Spaltstellen in glatte Enden umgewandelt worden sind, enthaltend das Tetracyclinresistenzgen und den Replikationsursprung.
Die folgende Tabelle Vl enthält die vollständige Restriktionsspaltstellen-Analyse von pmTNF-MPH.
Gesamtzahl der Basen: 3474 Die Analyse wurde mit der vollständigen Sequenz durchgeführt.
| Acc I | 371 | 2818 | 2921 | 3035 | 3056 | 1760 | 2 382 | 2 785 | 3441 | 3456 | 267 |
| Acyl | 788 | 2 264 | |||||||||
| AfIII | 387 | ||||||||||
| AfI III | 1698 | ||||||||||
| Aba III | 224 | 1141 | 1398 | 1534 | |||||||
| AIuI | 386 | 439 | 1988 | 2030 | 2 209 | 2 333 | 2 582 | ||||
| AIwNI | 1289 | ||||||||||
| Ара I | 345 | ||||||||||
| Ара LI | 1384 | 2670 | |||||||||
| Asp718l | 210 | 547 | 676 | 766 | |||||||
| Asu I | 341 | 342 | |||||||||
| 2945 | 3297 | ||||||||||
| Aval | 338 | 2043 | 2030 | 2333 | 2582 | 2866 | 3255 | ||||
| Avail | 547 | 1988 | 2683 | ||||||||
| Ball | 2026 | ||||||||||
| Bam HI | 334 | 3093 | 3038 | 3059 | |||||||
| Bbef | 2 267 | 2924 | 1806 | 1919 | 1922 | 3101 | |||||
| Bbv I | 1369 | 1788 | 1279 | 2026 | 2050 | ||||||
| Bbvl» | 1070 | 1276 | |||||||||
| Bbvll | 1875 | 2738 | |||||||||
| BgII | 2 306 | 2 540 | 956 | 1054 | 1140 | ||||||
| Bin I | 17 | 342 | 1052 | 2366 | 3088 | 1552 | 1673 | 2 028 | 2411 | 3340 | 47 |
| Bin I* | 329 | 955 | 2 979 | 1321 | 1986 | 2212 | 2 936 | 3300 | 136 | ||
| Bsp HI | 908 | 978 | 3067 | 3308 | 198 | ||||||
| Bsp Ml | 2414 | 248 | |||||||||
| Bsp Mil | 354 | 638 | 806 | 1539 | 293 | ||||||
| Bst NI | 215 | 528 | 340 | 736 | 769 | 361 | 386 | 400 | 439 | 444 | |
| Caull | 6 | 339 | 2 539 | 2699 | 3058 | 1141 | 1170 | 1213 | 1224 | 1289 | |
| CfMOI | 374 | 2185 | 2937 | 3069 | 3173 | 1676 | 1687 | 1760 | 1779 | 1979 | |
| Cfrl | 2 024 | 2529 | 2215 | 2353 | 2363 | 2382 | 2423 | 232 | |||
| CIaI | 3446 | 272 | 343 | 350 | 2641 | 2785 | 2801 | 2 857 | 2875 | ||
| CviJI | 192 | 265 | 767 | 828 | 844 | 3175 | 3 298 | 3322 | 3441 | 3456 | |
| 660 | 678 | 1534 | 1632 | 1658 | |||||||
| 1393 | 1398 | 2145 | 2189 | 2210 | 1424 | 1888 | |||||
| 2026 | 2063 | 2531 | 2552 | 2597 | 1040 | 1048 | 1059 | 1134 | 2010 | ||
| 2488 | 2518 | 2999 | 3071 | 3140 | 3122 | ||||||
| 2 947 | 2985 | ||||||||||
| CviQI | 211 | 3306 | 661 | 717 | 1015 | ||||||
| Ddel | 135 | 571 | 336 | 950 | 962 | ||||||
| Dpnl | 11 | 238 | 2 645 | 3004 | 3095 | ||||||
| 2342 | 2 373 | 2945 | |||||||||
| Drall | 1988 | 2030 | |||||||||
| Dralll | 295 | 331 | 2940 | ||||||||
| Dsal | 345 | 2021 | |||||||||
| Eco31l | 615 | 2976 | 3238 | ||||||||
| Eco47lll | 1826 | 2695 | |||||||||
| Eco57l | 216 | ||||||||||
| Eco57l* | 1156 | 3036 | 3057 | ||||||||
| Eco78l | 2265 | 2922 | |||||||||
| EcoNI | 198 | 2845 | |||||||||
| EcoRI | 309 | ||||||||||
Tabelle 6 (Fortsetzung)
| EcoRII | 213 | 526 | 636 | 804 | 1537 | 1550 | 1671 | 2 026 | 2 409 | 3338 | 177 |
| EcoRV | 3285 | 236 | |||||||||
| Enu4HI | 401 | 417 | 532 | 1084 | 1290 | 1293 | 1358 | 1501 | 1656 | 1774 | |
| 1795 | 1908 | 1911 | 2040 | 2 054 | 2061 | 2064 | 2183 | 2 262 | 2307 | 243 | |
| 2447 | 2532 | 2697 | 2 748 | 2855 | 2889 | 2892 | 3170 | 3173 | 3244 | ||
| EnuDII | 542 | 1074 | 1655 | 1837 | 1934 | 2 056 | 2082 | 2 227 | 2 237 | 2 366 | |
| 2493 | 2498 | 2525 | 2654 | 2769 | 3125 | ||||||
| Fokl | 468 | 852 | 3370 | ||||||||
| Fokl* | 816 | 2423 | 2468 | 3322 | |||||||
| Gsul | 2088 | ||||||||||
| Gsul* | 2642 | ||||||||||
| Hael | 361 | 828 | 844 | 1224 | 1676 | 1687 | 2026 | 2423 | 2480 | 2 552 | 202 |
| Haell | 594 | 1458 | 1828 | 2 267 | 2697 | 2924 | 2978 | 3038 | 3059 | 3240 | 317 |
| Haelll | 343 | 361 | 678 | 767 | 828 | 844 | 1224 | 1658 | 1676 | 1687 | |
| 2210 | 2423 | 2480 | 2531 | 2552 | 2641 | 2875 | 2 939 | 2947 | 3071 | ||
| 3298 | |||||||||||
| Hgal | 160 | 183 | 796 | 2088 | 2238 | 2829 | |||||
| Hgal· | 1008 | 1586 | 2482 | 2514 | 3068 | ||||||
| HgiAI | 141 | 1388 | 2007 | 2298 | 2885 | 3196 | |||||
| HgiCI | 210 | 2179 | 2263 | 2702 | 2920 | 3034 | 3055 | 3349 | 3392 | 205 | |
| HgiJII | 345 | 2 987 | 3001 | 321 | |||||||
| Hhal | 542 | 593 | 1074 | 1183 | 1357 | 1457 | 1524 | 1794 | 1827 | 2017 | |
| 2115 | 2266 | 2525 | 2 656 | 2696 | 2771 | 2923 | 2977 | 3037 | 3058 | 205 | |
| 3239 | 3371 | 320 | |||||||||
| Hin Pll | 540 | 591 | 1072 | 1181 | 1355 | 1455 | 1522 | 1792 | 1825 | 2015 | |
| 2113 | 2264 | 2523 | 2654 | 2694 | 2769 | 2921 | 2975 | 3035 | 3056 | ||
| 3 237 | 3369 | ||||||||||
| Hind Il | 109 | 372 | 2819 | ||||||||
| Hind III | 384 | 437 | 3439 | 198 | |||||||
| Hinfl | 368 | 1328 | 1724 | 1799 | 1944 | 2165 | 2463 | 2617 | 2837 | 330 | |
| Hpall | 5 | 339 | 355 | 375 | 735 | 769 | 1130 | 1320 | 1346 | 1493 | |
| 2186 | 2212 | 2450 | 2 540 | 2700 | 2776 | 2936 | 3059 | 3068 | 3083 | ||
| 3309 | |||||||||||
| Hphl | 96 | 140 | 183 | 716 | 967 | 1953 | 2174 | 3028 | 3073 | 3 355 | |
| Hphl* | 8 | 305 | 311 | 317 | |||||||
| Kpnl | 214 | ||||||||||
| Mae I | 365 | 952 | 1205 | 1981 | 3240 | ||||||
| Maell | 276 | 330 | 751 | 997 | 1900 | 1924 | 2513 | 2 569 | 232 | ||
| Мае III | 171 | 257 | 1162 | 1278 | 1341 | 2320 | 2587 | 3255 | 3343 | ||
| Mbol | 9 | 236 | 334 | 948 | 960 | 1038 | 1046 | 1057 | 1132 | 2008 | |
| 2340 | 2371 | 2643 | 3002 | 3093 | 3120 | ||||||
| Mbo Il | 209 | 475 | 970 | 1832 | 1880 | 2472 | 2 743 | ||||
| Mbo II* | 1041 | 2997 | |||||||||
| Mmol* | 1305 | 1489 | 3165 | 3 252 | 259 | ||||||
| MnII | 372 | 1271 | 1595 | 2001 | 2499 | 2683 | |||||
| MnII* | 210 | 291 | 350 | 764 | 1520 | 1803 | 2169 | 2196 | 2 234 | 2 295 | |
| 2864 | 3083 | 3287 | 3347 | ||||||||
| Msel | 181 | 188 | 223 | 388 | 486 | 817 | 994 | 3414 | 3436 | ||
| Mstl | 2016 | 2114 | 3210 | ||||||||
| Nael | 2187 | 2541 | 2701 | 3069 | |||||||
| Narl | 2264 | 2921 | 3035 | 3056 | |||||||
| Ncol | 345 | 201 | |||||||||
| Nhel | 3 239 | 346 | |||||||||
| NIaIII | 168 | 232 | 349 | 382 | 565 | 620 | 912 | 982 | 1702 | 1881 | 221 |
| 2222 | 2 279 | 2294 | 2422 | 2539 | 2725 | 2764 | 2910 | 2983 | 3121 | 339 | |
| NIaIV | 212 | 336 | 343 | 549 | 1631 | 1670 | 1989 | 2032 | 2146 | 2181 | |
| 2265 | 2583 | 2 704 | 2922 | 2946 | 3036 | 3057 | 3095 | 3141 | 3351 | ||
| Nrul | 2498 | ||||||||||
| NspBII | 412 | 1115 | 1360 | 2331 | |||||||
| NspHI | 382 | 1702 | 2910 | ||||||||
| PfIMI | 295 | 2105 | 2154 | ||||||||
| PIcI | 376 | 1807 | |||||||||
| PIcI* | 1322 | 2831 | |||||||||
| Рта Cl | 331 | ||||||||||
| PpuMI | 1988 | 2030 | |||||||||
| Pssl | 1991 | 2033 | 2948 | ||||||||
| Rsal | 212 | 3307 | |||||||||
| Sail | 370 | 2817 | |||||||||
| 6 | 215 | 339 | 340 | 528 | 638 | 736 | 769 | - | 45- 295 869 | |
| 1552 | 1673 | 1986 | 2028 | 2212 | 2411 | 2 936 | 3 300 | |||
| Tabelle 6 (Fortsetzung) | 141 | 345 | 1388 | 2007 | 2 298 | 2885 | 2987 | 3001 | 806 | 1321 15 |
| SerFI | 5 | 338 | 345 | 1538 | 2 021 | 2099 | 2 301 | 2 934 | 3 340 | |
| 650 | 818 | 2445 | 2 820 | 3 231 | 3344 | 3196 | ||||
| Sdu I | 420 | 1601 | 2 038 | 2433 | 3054 | 3066 | 3 255 | 2 940 | 3 339 33 | |
| Sec I | 340 | |||||||||
| SfaNI | 382 | 2910 | ||||||||
| Sfa Nl* | 4 | 213 | 337 | 338 | 526 | 636 | 734 | 767 | ||
| Smal | 1550 | 1671 | 1984 | 2026 | 2210 | 2409 | 2934 | 3 298 | ||
| Sphl | 361 | 804 | 1319 15 | |||||||
| Ssoll | 345 | 2099 | 3338 | |||||||
| 254 | 371 | 666 | 1600 | 2 202 | 2343 | 2818 | 3131 | |||
| SIuI | 1802 | |||||||||
| Styl | 2804 | 3446 | ||||||||
| Taql | 40 | 1107 | ||||||||
| Taq HB | 686 | 1075 | 1114 | |||||||
| TaqllB* | 364 | |||||||||
| TthHHI | 9 | 334 | 948 | 960 | 1046 | 1057 | 3093 | |||
| TthiHII* | 338 | |||||||||
| Xbal | 2 529 | |||||||||
| Xho Il | 1 | 467 | ||||||||
| Xmal | ||||||||||
| Xmalll | ||||||||||
| Xmnl |
Gesamtzahl der Spaltstellen:
Liste ausgewählter, nicht spaltender Enzyme.
| Antll | Asu Il | Avrll | Bbv II* | Bell | BgIII | Bsp Ml* |
| BssHII | BstEII | BstXI | Eco31l* | Espl | Hpal | MIuI |
| Mmel | Ndel | Not I | Nsil | Pst I | Pvul | Pvull |
| Rsrll | Sac I | Sac Il | Saul | Seal | Seil | Sfil |
| SnaBI | Spei | SpII | Sspl | Taq MA | Taq HA* | Tth111l |
| Vspl | Xcal | Xho I |
Gesamtzahl ausgewählter, nicht spaltender Enzyme:
Figur 12a: Restriktions- und genetische Karte des Plasmids plG 2, das zur Herstellung des Zwischen-Konstrukts plG 2 Mt32 verwendet wurde, wie in Beispiel IV für die Subclonierung des P32-Antigens im Plasmid plGRI beschrieben.
Figur 12b: DNA-Sequenz von plG2 In dieser Figur ist die Herkunft der Nucleotid-Abschnitte, die zur Konstruktion des Plasmids plG 2 verwendet worden sind, dargestellt.
Position 3300-206:
lambda PL, enthaltend das EcoRI-Mboll-Fragment von pPL(A) (Pharmacia), wobei die Restriktionsspaltstellen in glatte Enden umgewandelt worden sind Synthetische Sequenz, enthaltend eine Vielfach-Clonierungsstelle und Ribosomen-Bindungsstelle, wobei sich das ATG-Initiationscodon in Position 232-234 befindet TmBT1T2, enthaltend das Hindlll-Sspl-Fragment von pKK223 (Pharmacia) Tetracyclin-Resistenzgen und Replikationsursprung, enthaltend das EcoRI-Dral-Fragment pAT (Bioexcellence).
Tabelle VII zeigt die vollständige Restriktions-Spaltstellen-Analyse von plG
Gesamtzahl der Basen: 3301 Die Analyse wurde mit der vollständigen Sequenz durchgeführt.
| Acc I | 252 | 2647 | 2750 | 2864 | 2885 | 2211 | 2614 | 3 270 | 3 285 | 2774 | 312 |
| Acyl | 617 | 2093 | |||||||||
| AfI III | 1527 | ||||||||||
| Aha III | 222 | 1227 | 1363 | 1589 | |||||||
| AIuI | 268 | 970 | 2038 | 2162 | 2411 | 2499 | |||||
| AIwNI | 1118 | ||||||||||
| Ара LI | 1213 | 2499 | |||||||||
| Asp 7181 | 208 | 595 | 1817 | 1859 | |||||||
| Asu I | 376 | 505 | |||||||||
| Aval | 1872 | 1859 | 2162 | 2411 | |||||||
| Avail | 376 | 1817 | 1751 | 2695 | 3084 | ||||||
| Ball | 1855 | 2512 | |||||||||
| Bam HI | 239 | 2922 | 2867 | 2888 | |||||||
| Bbel | 2096 | 2753 | 1617 | 1635 | 1748 | ||||||
| Bbvl | 271 | 1198 | 1108 | 1855 | 1879 | 2930 | 3169 | ||||
| Bbvl* | 899 | 1105 | |||||||||
| Bbv Il | 1704 | 2 567 | |||||||||
| BgII | 2135 | 2369 | 785 | 883 | 969 | ||||||
| Bin I | 15 | 247 | 881 | 2195 | 2917 | 1381 | 1502 | 1857 | 2240 | ||
| Bin I* | 234 | 784 | 2808 | 2 041 | 2765 | 3129 | 673 | 97 | |||
| Bsp HI | 737 | 807 | 3137 | 1487 | 150 | ||||||
| Bsp Ml | 264 | 2 243 | 467 | 635 | 1368 | 2039 | 204 | ||||
| BstNI | 213 | 357 | 598 | 1150 | 1815 | 2426 | 247 | ||||
| Caull | 4 | 565 | 2 528 | 2887 | 2896 | 489 | 507 | 596 | 657 | 2969 | 300 |
| CfMOI | 2014 | 2368 | 2766 | 2898 | 3002 | 1222 | 1227 | 1363 | 1461 | ||
| Cfrl | 1853 | 2358 | 1855 | 1892 | 1974 | 2018 | |||||
| CIaI | 3275 | 268 | 273 | 303 | 2317 | 2347 | 2360 | 2381 | |||
| Cv/Jl | 190 | 262 | 1053 | 1118 | 1197 | 2776 | 2814 | 2828 | 2900 | 2156 | 217 |
| 999 | 1042 | 1608 | 1808 | 1813 | |||||||
| 1516 | 1589 | 2211 | 2252 | 2309 | |||||||
| 2182 | 2192 | 2686 | 2704 | 2768 | 1253 | 1717 | |||||
| 2614 | 2630 | 3270 | 3285 | 877 | 888 | 963 | 1839 | ||||
| 3127 | 3151 | ||||||||||
| CviQI | 209 | 3135 | 490 | 546 | 844 | ||||||
| Ddel | 133 | 400 | 779 | 791 | 869 | ||||||
| Dpnl | 9 | 241 | 2833 | 2924 | 2951 | ||||||
| 2202 | 2474 | 2 774 | |||||||||
| Drall | 1817 | 1859 | 2769 | 3167 | |||||||
| Dsal | 230 | 1850 | |||||||||
| ЕсоЗІІ | 444 | 2 805 | 3067 | 1606 | 162 | ||||||
| ECO47III | 1655 | 2 524 | 2193 | 227 | |||||||
| Eco57l | 214 | 1379 | 1500 | 1855 | 2 238 | ||||||
| Eco57l* | 985 | 2 865 | 2886 | 2195 | 226 | ||||||
| Eco78l | 2094 | 2751 | 1187 | 1330 | 1485 | 1603 | |||||
| EcoNI | 196 | 2674 | 465 | 633 | 1366 | 1893 | 2012 | 2091 | 2136 | ||
| EcoRII | 211 | 355 | 2721 | 2999 | 3002 | 3073 | |||||
| EcoRV | 3114 | 913 | 1119 | 1122 | 1885 | 1911 | 2056 | 2066 | |||
| Fnu4HI | 260 | 361 | 1869 | 1883 | 1890 | 2954 | |||||
| 1737 | 1740 | 2577 | 2684 | 2718 | |||||||
| 2 361 | 2 526 | 1484 | 1666 | 1763 | 3069 | ||||||
| FnuDII | 371 | 903 | 2 354 | 2483 | 2 598 | 2039 | 22E | ||||
| 2 322 | 2 327 | 3199 | 3127 | ||||||||
| Fokl | 297 | 681 | 2 297 | 3151 | 1855 | 2252 | 2309 | 2381 | |||
| Fokl* | 645 | 2 252 | 2753 | 2807 | 2867 | 2888 | |||||
| Gsul | 1917 | 1487 | 1505 | 1516 | 1855 | ||||||
| Gsul* | 2471 | 1053 | 1505 | 1516 | 2768 | 2 776 | 2900 | 3004 | |||
| Hael | 657 | 673 | 1 657 | 2096 | 2 526 | 2658 | |||||
| Haell | 423 | 1287 | 657 | 673 | 1053 | ||||||
| Haelll | 507 | 596 | 2381 | 2470 | 2 704 | 3025 | |||||
| 2 309 | 2 360 | 625 | 1917 | 2067 | 2863 | 2884 | 3178 | 3221 | |||
| Hgal | 158 | 181 | 2311 | 2343 | 2897 | ||||||
| Hgal* | 837 | 1415 | 1836 | 2127 | 2714 | ||||||
| HgiAI | 139 | 1217 | 2092 | 2531 | 2749 | ||||||
| HgiCI | 208 | 2008 | |||||||||
| HgiJII | 2816 | 2 830 | |||||||||
Tabelle 7 (Fortsetzung)
| Hhal | 371 | 422 | 903 | 1012 | 1186 | 1286 | 1353 | 1623 | 1656 | 1846 | 188 |
| 1944 | 2095 | 2354 | 2485 | 2525 | 2600 | 2 752 | 2806 | 2866 | 2887 | 304 | |
| 3068 | 3200 | ||||||||||
| HinPII | 369 | 420 | 901 | 1010 | 1184 | 1284 | 1351 | 1621 | 1654 | 1844 | 188 |
| 1942 | 2093 | 2352 | 2483 | 2523 | 2 598 | 2 750 | 2804 | 2864 | 2885 | 303 | |
| 3066 | 3198 | ||||||||||
| Hindll | 107 | 253 | 2648 | ||||||||
| Hind III | 266 | 3 268 | |||||||||
| Hinfl | 249 | 1157 | 1553 | 1628 | 1773 | 1994 | 2292 | 2446 | 2666 | ||
| Hpall | 3 | 564 | 598 | 959 | 1149 | 1175 | 1322 | 1814 | 2015 | 2041 | 227 |
| 2369 | 2529 | 2605 | 2765 | 2888 | 2897 | 2912 | 3129 | 3138 | |||
| Hphl | 94 | 138 | 181 | 545 | 796 | 1782 | 2003 | 2 857 | 2902 | 3184 | |
| Hphl* | 6 | ||||||||||
| Kpnl | 212 | ||||||||||
| Mae I | 246 | 781 | 1034 | 1810 | 3069 | ||||||
| Mae Il | 580 | 826 | 1729 | 1753 | 2342 | 2398 | |||||
| Mae III | 169 | 991 | 1107 | 1170 | 2149 | 2416 | 3084 | 3172 | |||
| Mbol | 7 | 239 | 777 | 789 | 867 | 875 | 886 | 961 | 1837 | 2154 | 216 |
| 2 200 | 2472 | 2831 | 2922 | 2949 | |||||||
| Mbo 11 | 207 | 304 | 799 | 1661 | 1709 | 2301 | 2 572 | ||||
| Mbo II* | 870 | 2826 | |||||||||
| Mmel* | 1 134 | 1318 | 2994 | 3 081 | |||||||
| Mull | 253 | 1100 | 1424 | 1830 | 2328 | 2512 | |||||
| Mull» | 208 | 593 | 1349 | 1632 | 1998 | 2025 | 2063 | 2124 | 2426 | 2693 | 291 |
| 3116 | 3176 | ||||||||||
| Msel | 179 | 186 | 221 | 315 | 646 | 823 | 3 243 | 3 265 | |||
| Mstl | 1845 | 1943 | 3039 | ||||||||
| Nacl | 2016 | 2370 | 2530 | 2 898 | |||||||
| Narl | 2093 | 2750 | 2864 | 2885 | |||||||
| Ncol | 230 | ||||||||||
| Nhc | 3068 | ||||||||||
| NIaIII | 166 | 234 | 394 | 449 | 741 | 811 | 1531 | 1710 | 1844 | 2051 | 210 |
| 2123 | 2 251 | 2 368 | 2 554 | 2 593 | 2 739 | 2812 | 2950 | 3297 | |||
| NIaIV | 210 | 241 | 378 | 1460 | 1499 | 1818 | 1861 | 1975 | 2010 | 2 045 | 209 |
| 2412 | 2533 | 2751 | 2775 | 2865 | 2886 | 2924 | 2 970 | 3180 | 3223 | ||
| Nrul | 2327 | ||||||||||
| NspBII | 944 | 1189 | 2160 | ||||||||
| NspHI | 1531 | 2739 | |||||||||
| PfIMI | 1934 | 1983 | |||||||||
| PIcI | 257 | 1636 | |||||||||
| PIeI* | 1151 | 2 660 | |||||||||
| PpuMI | 1817 | 1859 | |||||||||
| Pssl | 1820 | 1862 | 2777 | ||||||||
| Pst I | 261 | ||||||||||
| Rsal | 210 | 3136 | |||||||||
| Salt | 251 | 2 646 | |||||||||
| Scr Fl | 4 | 213 | 357 | 467 | 565 | 598 | 635 | 1 150 | 1368 | 1381 | 15C |
| 1815 | 1857 | 2041 | 2 240 | 2 765 | 3129 | 3169 | |||||
| Sdul | 139 | 1217 | 1836 | 2127 | 2714 | 2816 | 2 830 | 3 025 | |||
| Sec I | 3 | 230 | 1367 | 1850 | 1928 | 2130 | 2763 | 2 769 | 3168 | 3182 | |
| SfaNI | 479 | 647 | 2274 | 2 649 | 3060 | 3173 | |||||
| Sfa Nl* | 1430 | 1867 | 2 262 | 2883 | 2 895 | 3084 | |||||
| Sphl | 2 739 | ||||||||||
| Ssoll | 2 | 211 | 355 | 465 | 563 | 596 | 633 | 1 148 | 1366 | 1379 | 15C |
| 1813 | 1855 | 2039 | 2 238 | 2 763 | 3127 | 3167 | |||||
| Sspl | 226 | ||||||||||
| Styl | 230 | 1928 | |||||||||
| Taql | 252 | 495 | 1429 | 2031 | 2172 | 2 647 | 2 960 | 3 275 | |||
| Taq HB | 1631 | ||||||||||
| Taq HB* | 2633 | ||||||||||
| TthHill | 38 | 936 | |||||||||
| TthHHI* | 515 | 904 | 943 | ||||||||
| Xbal | 245 | ||||||||||
| Xholl | 7 | 239 | 777 | 789 | 875 | 886 | 2922 | ||||
| Xmalll | 2358 | ||||||||||
| Xmnl | 296 | ||||||||||
| EcoRI | 3300 |
Gesamtzahl der Spaitstellen: 689
| AfIII | Ара I | Asu Il | Avail | -48- | Bbv II* | 295 869 | |
| Bsp Ml* | Bsp Mil | BssHII | BstEII | BstXI | |||
| Espl | Hpal | MIuI | Mmel | Bell | |||
| Liste ausgewählter, nicht spaltender Enzyme | Nsil | PmaCI | Pvul | Pvull | Rsrll | Dralll | |
| AaIiI | Saul | Seal | Seil | Sfil | Smal | Ndel | |
| BgIII | SpII | Stu I | TaqllA | TaqllA· | TthHH | Sac I | |
| Eco31l* | Xhol | Xmal | SnaBI | ||||
| Not I | Vspl | ||||||
| Sac Il | |||||||
| Spei | |||||||
| Xcal |
Gesamtzahl ausgewählter, nicht spaltender Enzyme: 44
Figur 13: Aminosäuresequenz des gesamten Fusionsproteins 01TNF-HiS6-P32. In dieser Figur
- zeigt die durchgehend unterstrichene Sequenz (—) die ersten 25 Aminosäuren der mTNF-Sequenz
- zeigt die gepunktet unterstrichene Sequenz ( ) die Polylinker-Sequenz
- zeigt die doppelt unterstrichene Sequenz die zusätzlichen, an der Clonierungsstelle geschaffenen Aminosäuren
- ist die nicht markierte Aminosäure die mit der Aminosäure in Position 4 von Figur 5 beginnende Antigensequenz.
Figuren 14a und 14b: Expression des mTNF-Hise-P32-Fusionsproteins in K12 H, beschrieben in Beispiel Vl, wobei Figur 14a das mit Coomassie-Brillant-Blau gefärbte SDS-PAGE-GeI und Figur 14b Immunblots des Gels, entwickelt mit anti-32-kDa- und anti-mTNF-Antikörpern zeigt.
In Figur 14a sind die Spuren folgendermaßen zugeordnet:
1. Molekulargewicht-Marker-Proteine
2. pmTNF-MPH-Mt32 28°C, 1 Stunde Induktion
3. pmTNF-MPH-Mt32 42°C, 1 Stunde Induktion
4. pmTNF-MPH-Mt32 42°C, 2 Stunden Induktion
5. pmTNF-MPH-Mt32 42°C, 3 Stunden Induktion
6. pmTNF-MPH-Mt32 28°C, 4 Stunden Induktion
7. pmTNF-MPH-Mt32 42°C, 4 Stunden Induktion
8. pmTNF-MPH-Mt32 28°C, 5 Stunden Induktion
9. pmTNF-MPH-Mt32 420C, 5 Stunden Induktion
In Figur 14b sind die Spuren folgendermaßen zugeordnet: Spur
1. pmTNF-MPH-Mt32 280C, 1 Stunde Induktion
2. pmTNF-MPH-Mt32 420C, 1 Stunde Induktion
3. pmTNF-MPH-Mt32 280C, 4Stunden Induktion
4. pmTNF-MPH-Mt32 420C, 4Stunden Induktion
Figur 15: IMAC-Elutionsprofil des rekombinanten Antigens unter Verwendung von abnehmendem pH-Wert, wie in Beispiel VII beschrieben.
Figur 16: IMAC-Elutionsprofil des rekombinanten Antigens unter Verwendung von abnehmenden Imidazol-Konzentrationen, wie in Beispiel VII beschrieben.
Figur 17: IMAC-Elutionsprofil des rekombinanten Antigens unter Verwendung eines Stufengradienten mit steigenden Imidazol-Konzentrationen, wie in Beispiel VII dargestellt.
Material und Methoden
Absuchen der rekombinanten Agt 11-M. tuberculosis-DNA-Genbank mit anti-32-kDa-Antiserum Eine rekombinante, aus genomischer DNA von M. tuberculosis (Erdman-Stamm) hergestellte Xgt 11 -Genbank wurde von R. Young (35) bezogen. Das Absuchen wurde, wie beschrieben (14,35), mit einigen nachstehend beschriebenen Änderungen durchgeführt. Mit Xgtli infizierter E.coli Y1090 (10s pfu pro 150mm Platte) wurden auf NZYM-Platten (Gibco) (16) ausplattiert und 24 Stunden bei 42°C inkubiert. Um die Expression des ß-Galactosidase-Fusionsproteins zu induzieren, wurden auf die Platten mit Isopropyl-ß-D-Thiogalactosid (IPTG) gesättigte Filter (Hybond C extra, Amersham) gelegt und die Platten 2 Stunden bei 37"C inkubiert. Das Absuchen wurde mit einem polyclonalen Kaninchen-anti-32-kDa-Antiserum durchgeführt. Das polyclonale Kaninchen-anti-32-kDa-Antiserum wurde erhalten, indem ein Antiserum gegen P32 M.bovis BCG (Stamm 1173P2 Institut Pasteur, Paris), wie nachfolgend beschrieben, hergestellt wurde: 400цд gereinigtes P32-Protein von M.bovis BCG pro ml physiologischer Kochsalzlösung wurden mit einem Volumen inkompletten Freund-Adjuvans gemischt. Das Material wurde homogenisiert und intradermal in δΟ-μΙ-Dosen an 10 Stellen in den Rücken der Kaninchen nach 0,4,7 und 8 Wochen injiziert (das Adjuvans wurde bei der letzten Injektion durch das Verdünnungsmittel ersetzt). Eine Woche später wurden die Kaninchen geblutet und die Seren vor der Verteilung in Aliquots und anschließender Lagerung bei -8O0C auf Antikörpertiter getestet. Das polyclonale Kaninchen-anti-32-kDa-Antiserum wurde an E.coli-Lysat präadsorbiert (14) und in einer Endkonzentration von 1:300 verwendet. Ein sekundäres alkalisches Phosphatase-anti-Kaninchen-lgG-Konjugat (Promega), wurde in einer 1 .-5000-Verdünnung verwendet, um die ß-Galactosidase-Fusionsproteine nachzuweisen. Für die Farbentwicklung wurden Nitroblautetrazolium (NBT) und ö-Brom-^-chlor-S-indolylphosphat (BCIP) verwendet. Reaktive Bereiche wurden innerhalb von 30 Minuten dunkelviolett. Üblicherweise wurden drei aufeinanderfolgende Reinigungsschritte durchgeführt, um reine Clone zu erhalten. IPTG, BCIP und NBT wurden von Promega Corp. (Madison, Wl.) erworben.
Absuchen der Plaques durch Hybridisierung, um die nachstehend definierten sekundären Clone By 1, By2 und ByS zu erhalten Das verwendete Verfahren ist in Maniatis et al. (16) beschrieben.
Herstellung von Rohlysaten aus rekombinanten \gt11-Lysogenen
Bakterien vom E.coli Stamm Y1089 wurden mit geeigneten Agt 11-Rekombinanten, wie von Hyunh et al. (14) lysogen gemacht. Einzelne Kolonien lysogen gemachter E.coli Y1089 wurden in Lß-Medium bei 300Czu einer optischen Dichte von 0,5 bei 600nm gezüchtet. Nach einem 20minütigen Hitzeschock bei 45°C wurde die Herstellung des ß-Galactosidase-Fusionsproteins durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 10mM induziert. Die Inkubation wurde 60 Minuten bei 37°C fortgeführt und die Zellen anschließend rasch durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden 50fach in Puffer (1OmM Tris, pH8,0,2mM EDTA) konzentriert und rasch in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden durch Auftauen lysiert und 5 bis 10 Minuten bei 37°C mit 100цд/тІ DNase I in EcoRI-Restriktionspuffer behandelt.
Immunblot (Westernblot)-Analyse
Nach dem Auftrennen durch SDS-PAGE-Elektrophorese wurden rekombinante, lysogene Proteine, wie von Tqwbin et al. (29) beschrieben, auf Nitrocellulosemembranen (Hybond C, Amersham) geblotted. Die Expression mit ß-Galactosidase fusionierter mycobacterieller Antigene in E.coli Y1089 wurde durch Bindungeines polyclonalen Kaninchen-anti-32-kDa-Antiserums (1:1000 verdünnt), das wie im Abschnitt „Absuchen der rekombinanten gt 11-M. tuberculosis-DNA-Genbank mit anti-32-kDa-Antiserum " und unter Verwendung eines monoclonalen anti-ß-Galactosidase-Antikörpers (Promega) sichtbar gemacht. Ein sekundäres, alkalisches Phosphatase-anti-Kaninchen-lgG-Konjugat (Promega) wurde in einer 1:5000-Verdünnung zum Nachweis des Fusionsproteins verwendet.
Die Verwendung dieser verschiedenen Antikörper macht den Nachweis des ß-Galactosidase-Fusionsproteins möglich. Diese Reaktion ist spezifisch für das M. tuberculosis-Protein, da sich auch nichtfusionierte ß-Galactosidase auf demselben Gel befindet und nicht vom Serum von Tuberkulose-Patienten erkannt wird.
Um das selektive Erkennen rekombinanter Fusionsproteine durch menschliche tuberkulöse Seren identifizieren zu können, wurden Nitrocellulose-Membranen über Nacht mit diesen Seren (1:50 verdünnt), nachdem unspezifische Protein-Bindungsstellen blockiert wurden, inkubiert. Die menschlichen tuberkulösen Seren, die in einem „dot-blot-assay", wie zuvor beschrieben (31), getestet worden waren, wurden aufgrund ihrer Reaktivität (hoch oder niedrig) gegenüber dem gereinigten 32-kDa-Antigen von M.bovis BCG ausgewählt. Reaktive Bereiche auf den Nitrocellulose-Membranen wurden durch 4stündige Inkubation mit Peroxidase-gekoppeltem Ziegen-anti-Human-lgG-Antikörper (Dakopatts, Kopenhagen, Dänemark, 1:200 verdünnt) und, nach mehrmaligem Waschen, durch Zugabe von Peroxidase-Substrat (a-Chloronaphthol) (Bio-Rad) in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid über eine Farbreaktion sichtbar gemacht.
Analyse rekombinanter DNA
Die anfängliche Identifizierung von M.tuberculosis-DNA-Insertionen in gereinigten Agt 11-Clonen wurde durch Spaltung mit EcoRI durchgeführt. Nach der Spaltung wurden die ausgeschnittenen Insertionen auf Agarosegelen aufgetrennt und Southern-Blot-Analysen durchgeführt. Die Sonden wurden unter Verwendung von Zufallsprimern (10) mit a32P-dCTP markiert. Andere Restriktionsspaltstellen wurden durch einfache und Doppelspaltungen rekombinanter \gt 11-Phagen-DNA oder der jeweiligen subclonierten EcoRI-Fragmente mit Hind III, Pstl, Kpnl, Accl und Sph I ermittelt.
Sequenzanalyse
Die Sequenzanalyse wurde mit der Primer-Verlängerungs-Dideoxyterminations-Methode von Sanger et al. (25) nach Subclonierung der spezifischen Fragmente in Bluescribe-M 13 (6) oder in M13 mp 10- und mp 11-Vektoren (Joachim Messing, „New M13 vectors for cloning", Methods in Enzymology, 101 (1983], 20-89, Academic Press) durchgeführt. Die Sequenzanalyse wurde durch den hohen GC-Gehalt der M.tuberculosis-DNA (65%) stark behindert. Die Sequenzreaktionen wurden daher mit verschiedenen DNA-Polymerasen: T7 DNA-Polymerase („Sequenase" USB), Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I (Amersham) und, in einigen Fällen mit AMV reverser Transkriptase („Super RT", Anglian Biotechnology Ltd.) und in manchen Fällen mit dlTP anstelle von dGTP durchgeführt. Verschiedene Oligodeoxynucleotide wurden synthetisiert und verwendet, um zweideutige Bereiche in der Sequenz genau zu untersuchen. Die Sequenzstrategie ist in Figur 2 zusammengefaßt. Um in einigen der zweideutigen Bereiche mögliche Rasterschub-Artefakte aufzuspüren und um den wahrscheinlichsten offenen Leserahmen in Sequenzen mit einem hohen GC-Anteil zu ermitteln, wurde ein Spezialprogramm verwendet (3). Die Sequenz mehrerer Regionen, in denen besonders häufig Sequenzier-Artefakte auftraten, wurden durch chemische Sequenzierung (18) bestätigt oder korrigiert. Zu diesem Zweck wurden Fragmente in den Vektor pGV462 für das chemische Sequenzierverfahren (21) subcloniert und wie zuvor beschrieben, analysiert. Ausgewählte Restriktionsfragmente von etwa 250 bis 350bp wurden isoliert, durch Behandlung mit entweder Klenow-Polymerase oder Mungobohnen-Nuclease mit glatten Enden versehen und in die Sma I oder Hincll-Spaltstelle von pGV462 subcloniert. Beide Stränge der eingebauten DNA wurden durch Markierung nur eines Endes an der Tth III oder BstE Il-Spaltstelle (32) und eine veränderte chemische Spalt-Strategie (33) sequenziert. Routineanalysen der von den Nucleinsäuren abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden unter Verwendung eines Computers mit dem LGBC-Programm von Bellon (2) durchgeführt. Die Untersuchungen auf Homologie wurden unter Verwendung des FASTA-Programms von Pearson und LipmaN (23) und des Protein Identification Resource (PIR) der National Biomedical Research Foundation, Washington (NBRF) (NBRF/PIR-Datenbank), Ausgabe 16 (März 1988) durchgeführt.
Ergebnisse
Absuchen der rekombinanten Agt11-M. tuberculosis DNA-Genbank mit polyclonalem anti-32-kDa-Antiserum 10 Filter mit 1,5 x 106 Plaques wurden mit polyclonalem Kaninchen-anti-32kDa-Antiserum abgesucht (8). Nach Reinigung wurden sechs unabhängige positive Clone erhalten.
Analyse der rekombinanten Clone
Restriktionsanalyse dieser 6gereinigten, rekombinanten Xgt 11-DNAs mit EcoRI (Figur 1 a) ergab 4 verschiedene Insertionstypen. Clon 15 hatte eine Insertion mit einer Gesamtlänge von 3,8kb und zwei zusätzlichen internen EcoRI-Spaltstellen, was drei DNA-Fragmente von 1,8 kb, 1,5kb und 0,5 kb ergab. Die DNA-Insertion von Clon 16 war 1,7 kb lang. Die Clone 17 und 19 hatten DNA-Insertionen von nahezu identischer Länge mit 2,7kb bzw. 2,8kb.
Schließlich enthielten Clon 23 (nicht gezeigt) und Clon 24 jeweils eine 4-kb-lnsertion mit einer zusätzlichen EcoRI-Restriktionsspaltstelle, was zwei Fragmente von 2,3 kb und 1,7 kb ergab. Southern-Analyse (Ergebnisse nicht gezeigt) zeigte, daß die DNA-Insertionen der Clone 15,16,19 und das kleine Fragment (1,7 kb) von Clon 24 nur mit sich selbst hybridisierten, wohingegen Clon 17 (2,7 kb) mit sich selbst, jedoch ebensogut mit dem 2,3 kb DNA-Fragment von Clon 24 hybridisierte. Die Clone 15,16 und 19 sind somit einzigartig und stehen in keinem Zusammenhang zur Gruppe mit den Clonen 17, 23 und 24. Diese Auslegung wurde durch die Analyse von Rohlysaten von E.coli Y1089, der mit geeigneten Xgt11-Rekombinanten lysogen gemacht und mit IPTG induziert worden war, weiter bestätigt. Westernblot-Analyse (Figur 1 B) von Zellen, die Clone 15,16 und 19 exprimierten, zeigte weder ein reifes noch ein nichtvollständiges Fusionsprotein, das mit dem polyclonalen anti-32-kDa-Antiserum reagierte. Die Clone 15,16 und 19 wurden daher als falsch-positive angesehen und nicht weiter untersucht. Im Gegensatz dazu stellten Zellen, die die Clone 23 und 24 lysogen trugen, ein immunologisch reaktives Fusionsprotein her, das etwa 1OkDa des 32-kDa-Proteins enthielt. Clon 17 schließlich exprimierte ein Fusionsprotein, dessen fremder Polypeptidteil etwa 25kDa lang war. Die Restriktionskarten der 2,3-kb-lnsertion von Clon 24 und des 2,7-kb-Fragmentes von Clon 17 (Figur 2) erlaubte die Ausrichtung und Orientierung der beiden Insertionen, was die Schlußfolgerung nahelegte, daß letzterer einer etwa
0,5-kb-Verlängerung in 5'-Richtung des ersten entspricht.
Da Clon 17 nicht die vollständige codierende Sequenz enthielt, wurde dieselbe rekombinante Agt 11-M. tuberculosis-DNA-Genbank durch Hybridisierung mit einem 120bp EcoRI-Kpn I-Restriktionsfragment, das dem äußersten 5'-Ende der DNA-Insertion von Clon 17 entsprach und zuvor in einen .Blue Scribe'-Vektor subcloniert worden war (vertrieben von Vector cloning Systems tStratagene Cloning System]) (Figur 2) abgesucht. Drei 5'-verlängerte Clone (By 1, By2 und By5) wurden isoliert, durch Restriktionsspaltungen analysiert und aufeinander ausgerichtet. Die größte Insertion, By 5, enthielt die Information für die gesamte codierende Region (siehe unten) flankiert von 3,1 kb stromaufwärts und 1,1 kb stromabwärts (Figur2).
DNA-Sequenzierung
Die 1358 Basenpaar lange Nucleotidsequenz, die aus den verschiedenen überlappenden KgX 11 -Clonen abgeleitet worden ist, ist in den Figuren 3 a und b dargestellt. Die DNA-Sequenz enthält einen offenen Leseraster von 1059 bp, der bei Position 183 beginnt und mit einem TAG-Codon bei Position 1242 endet. Die NH2-terminale Aminosäuresequenz (phe-ser-arg-pro-gly-leu-pro-val-glutyr-leu-gln-val-pro-ser-pro-ser-met-gly-arg-asp-ile-lys-val-gln-phe-gln-ser-gly-gly-ala-asn), die in diesem offenen Leseraster mit dem TTT-Codon in Position 360 beginnt, ist mit Ausnahme der Aminosäuren in den Positionen 20,21 und 31, die in MPB 59 gly, cys und asn sind, identisch mit der NH2-terminalen Aminosäuresequenz des MPB 59-Antigens (34). Es ist daher zu erwarten, daß die DNA-Region stromaufwärts von dieser Sequenz ein Signalpeptid codiert, das für die Sekretion eines 32-kDa-Proteins erforderlich ist. Das reife Protein besteht daher vermutlich aus 295 Aminosäureresten vom N-terminalen Phe (TTT) bis zum C-terminalen Ala (GCC) (Figur 5).
Es wurden sechs ATG-Codons gefunden, die dem TTT in Position 360 im selben Leseraster voranstehen. Die Verwendung eines dieser ATGs im selben Leseraster würde zur Synthese eines Signalpeptids mit einer Länge von 29,42,47,49,55 und 59 Aminosäuren führen.
Hydrophobitäts-Muster
Die Hydrophobitäts-Muster der codierenden Sequenzen des erfindungsgemäßen 32-kDa-Proteins und des α-Antigens von BCG (17) wurden nach den Verfahren von Kyte und Doolittle (15) ermittelt. Die Nonapeptid-Profile sind in Figur 6 dargestellt. Neben der hydrophoben Signalpeptid-Region konnten verschiedene hydrophile Domänen identifiziert werden. Interessanterweise ist das gesamte Hydrophilitäts-Muster des erfindungsgemäßen 32-kDa-Proteins mit dem des α-Antigens von BCG vergleichbar. Bei beiden Proteinen konnte eine Domäne höchster Hydrophilität zwischen den Aminosäureresten 200 und 250 identifiziert werden.
Homologie
Matsuo et al. (17) veröffentlichten vor kurzem eine 1095 Nucleotide lange clonierte DNA-Sequenz, die dem das α-Antigen von BCG codierenden Gen entspricht. Die 978bp lange codierende Region des α-Antigens von M.bovis in überarbeiteter Form (Infection and Immunity 58 [1990], 550-556) und die 1017bp lange codierende Region des erfindungsgemäßen 32-kDa-Proteins zeigen in einem aufeinander ausgerichteten Bereich von 942 Basenpaaren eine Homologie von 77,5%. Auf der Aminosäureebene zeigen beide Vorläufer-Proteinsequenzen 75,6% identische Aminosäurereste. Zusätzlich entsprechen 17,6% der Aminosäuren evolutionär konserviertem Austauschen, wie im für den Vergleich verwendeten Algorhythmus definiert (PAM250-Matrix, [23]). Figur 7 zeigt Sequenzunterschiede im N-Terminus der Signalpeptide. Die aminoterminale Sequenz von 32 Aminosäuren ist bei beiden reifen Proteinen mit Ausnahme von Position 31 identisch.
Menschliche Seren erkennen das rekombinante 32-kDa-Protein
Figur 8 zeigt, daß Serumproben von Tuberkulose-Patienten, die zur Entwicklung eines Immunoblots mit einem Rohextrakt von Clon 17 exprimierendem E.coli verwendet worden sind, spezifisch mit dem 140-kDa-Fusionsprotein (Spuren 4 bis 6), das das erfindungsgemäße 32-kDa-Protein enthält, nicht jedoch mit nichtfusionierter ß-Galactosidase, die in einem parallel analysierten Extrakt exprimiert ist (Spuren 10 bis 12) reagieren. Serumproben aus zwei negativen Kontrollen, die aufgrund ihrer sehr niedrigen Immunantwort auf das gereinigte, erfindungsgemäße 32-kDa-Protein ausgewählt wurden, erkennen weder das das erfindungsgemäße 32-kDa-Protein enthaltende 140-kDa-Fusionsprotein, noch die nichtfusionierte ß-Galactosidase (Spuren 2,3, 8 und 9). Das 140-kDa-Fusionsprotein und die nichtfusionierte ß-Galactosidase wurden leicht durch ihre Reaktion mit dem monoclonalenanti-ß-Galactosidase-Antikörper (Spuren 1 bis 7) lokalisiert.
Die Erfindung hat die Herstellung einer DNA-Region ermöglicht, die insbesondere ein 32-kDa-Protein (vgl. Figur 5) codiert; diese DNA-Region enthält einen offenen Leseraster von 338 Codons, wobei das Stopcodon nicht eingeschlossen ist. Auf das TTT in Position 220, das die erste Aminosäure des reifen Proteins codiert, folgen 295 Tripletts, die das reife 32-kDa-Protein codieren. Die Größe dieses offenen Leserasters, die Immunreaktivität der abgeleiteten Fusionsproteine, die Anwesenheit eines Signalpeptids und, insbesondere die Identifizierung eines NH2-terminalen Bereichs innerhal b dieses Gens, der stark homolog zu denen im MPB 59-Antigen (31 von 32 Aminosäuren) und im α-Antigen von BCG (31 von 32 Aminosäuren) (vgl. Fig.7) ist, legt die Schlußfolgerung nahe, daß das beschriebene DNA-Fragment das gesamte Cistron enthält, das das vom M.tuberculosis sezernierte 32-kDa-Protein codiert uod das bisher nicht in eindeutiger Weise identifiziert werden konnte. Sechs ATG-Codons stehen diesem TTT in Position 220 im selben Leseraster voran. Die Verwendung eines dieser ATGs im selben
Leseraster würde zur Synthese eines Signalpeptids mit einer Länge von 43,48,50,56 oder 60 Aminosäureresten führen. Bei diesen verschiedenen Möglichkeiten ist wahrscheinlich, daß die Initiation entweder bei ATG91 oder ATG52 stattfindet, da beiden ein möglicher, E.coli-ähnlicher Promotor und eine Shine-Dalgarno-Sequenz voransteht.
Falls die Initiation beim ATG81 stattfindet, würde das entsprechende Signalpeptid mit 43 Aminosäuren relativ lang sein. Diese Länge ist jedoch für von grampositiven Bakterien sezernierte Proteine nicht ungewöhnlich (5). Der Sequenz würde eine typische E.coH-Shine-Dalgarno-Sequenz (4 von 6 Resten identisch mit AGGAGG) in geeigneter Entfernung voranstehen.
Falls die Initiation bei ATG52 stattfindet, wäre das entsprechende Signalpeptid 56 Aminosäuren lang, die DNA-Sequenz enthielte jedoch eine weniger stringente Shine-Dalgarno-Ribosomen-Bindungsstelle.
Der das Translations-Terminations-Triplett enthaltende Bereich war gegenüber die Sekundärstruktur betreffenden Einwirkungen besonders empfindlich, was zu sogenannten Kompressionen auf den Sequenzgelen führte. Vor dem TAGTerminationscodon in Position 1105 sind 22 von 23 Resten G-C-Basenpaare, 9 davon sind Gs.
Stromaufwärts von ATG130 befindet sich eine Sequenz, die einem E.coli-Promotor (11) ähnelt, die ein Hexanucleotid (TTGAGA; in 5 von 6 Positionen homolog zu TTGACA) und eine AAGAAT-Box (in 4 von 6 Positionen homolog zu TATAAT) enthält, die 16 Nucleotide voneinander getrennt sind. Stromaufwärts vom potentiellen Initiationscodon ATG91 wurden mehrere Sequenzen gefunden, die homolog zur E.coli-„35-Hexanucleotid-Box" sind, und denen eine der TATAAT-Box ähnliche Sequenz nachfolgt.
Unter diesen ist die wahrscheinlichste in den Figuren 3a und 3b dargestellt. Sie enthält ein TTGGCC in Position 59 (Figuren 3a und 3 b; 4 von 6 Positionen sind identisch mit TTGACA) und ist 14 Nucleotide von einer GATAAG-Sequenz (in 4 von 6 Positionen identisch mit TATAAT) entfernt. Interessanterweise ist diese putative Promotor-Region in ihrer Sequenz nicht stark homolog zur Promotor-Region des das BCG-a-Protein codierenden Gens (17) oder zur Promotor-Region des das 65-kDa-Protein codierenden Gens (26,28).
Das Absuchen der NBRF-Datenbank (Ausgabe 16,0) erbrachte keine signifikante Homologie zwischen dem erfindungsgemäßen 32-kDa-Protein und irgendeiner anderen vollständig bekannten Proteinsequenz. Insbesondere wurde keine signifikante Homologie zwischen dem 32-kDa-Protein und den α- und ß-Untereinheiten des menschlichen Fibronectin-Rezeptors (1) beobachtet. Die NH2-terminale Sequenz des erfindungsgemäßen 32-kDa-Proteins ist stark homolog - 29 von 32 Aminosäuren mit der zuvor für das BCG MPB59-Antigen (34) publizierten, und zu der des BCG-a-Antigens-31 von 32 Aminosäuren - (Matsuo,
17) und in bezug auf die ersten sechs Aminsäuren identisch mit dem 32-kDa-Protein vom M.bovisBCG (9). Das vermutete Methionin-Initiationscodon steht einer zusätzlichen 29 oder 42 Aminosäure langen hydrophoben Sequenz voran, die sich von der des α-Antigens (vgl. Fig.7) unterscheidet, jedoch alle Eigenschaften zeigt, die Signalsequenzen von sezernierten Polypeptiden in Prokaryonten zugeschrieben werden (22).
Interessanterweise gibt es keine signifikante Homologie zwischen der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz (1-1358; vgl.
Figuren 3a und 3 b) und der von Matsuo et al. publizierten DNA-Sequenz des Antigens α innerhalb ihrer putativen Promotorbereiche.
Konstruktion eines bakteriellen Plasmids, das die gesamte codierende Sequenz des 32-kDa-Proteins von M. tuberculosis enthält.
Im vorangegangenen Beispiel, in Figur 2, wurden die verschiedenen überlappenden \gt 11 -Isolate, die den gesamten Genbereich des 32-kDa-Proteins von M. tuberculosis abdecken, beschrieben. Verschiedene DNA-Fragmente aus diesen Xgt 11-Phagen wurden im „Blue Scribe M 13+"-Plasmid (Stratagene) subcloniert. Da keines dieser Plasmide die gesamte codierende Sequenz des 32-kDa-Protein codierenden Gens enthielt, wurde ein Plasmid konstruiert, das diese Sequenz enthält.
Schritt 1: Präparation der DNA-Fragmente
1) Das durch Subclonierung von Hind HI-Fragmenten von By 5 (vgl. Figur 2) in das „Blue Scribe M13+ "-Plasmid (Stratagene) erhaltene Plasmid BS-By5-800 wurde mit Hindlll gespalten und das so erhaltene 800bp-Fragment durch Elektroelution aus einem 1 % Agarosegel isoliert.
2) Das durch Subclonierung der 2,7-kb-EcoRI-lnsertion ausAgt 11-17 in das „Blue Scribe M 13+"-Plasmid (Stratagene) erhaltene Plasmid BS-4.1 (vgl. Figur 2 der Patentanmeldung) wurde mit Hindlll und Sph I gespalten und das so erhaltene Fragment von 1500bp wurde aus einem 1% Agarosegel durch Elektroelution isoliert.
3) „Blue Scribe MIS+" wurde mit Hindlll und Sphl gespalten und mit Kälberdarm alkalischer Phosphatase (besondere Qualität für die Molekularbiologie, Boehringer Mannheim) wie vom Hersteller empfohlen, behandelt.
Schritt 2: Ligation Die Ligationsreaktion enthielt: 125ng des 800 bp Hindlll-Fragments (1) 125 ng der 1 500bp Sph I-Hind Ill-Insertion (2) 50ng des mit Hind Ill-Sph I gespaltetenen BSM 13+-Vektors (3)
2 μ110 χ Ligationspuffer (Maniatis et al., 1982)
1 μΙ (= 2,5 Einheiten) T4 DNA-Ligase (Amersham)
4μΙ PEG 6000, 25Gew.-%
8μΙΗ2Ο Die Ligation wurde 4 Stunden bei 160C durchgeführt.
Schritt 3: Transformation
100μΙ E.coli DH5a (Gibco BRL) wurden mit 10ml des Ligationsansatzes (Schritt 2) transformiert und auf IPTG, X-Gal-haltigen Ampicillinplatten, wie vom Hersteller empfohlen, ausplattiert. Etwa 70 weiße Kolonien wurden erhalten.
Schritt 4:
Da das 800-bp-Fragment in beiden Orientierungen inseriert gewesen sein konnte, wurde Plasmid-DNA von verschiedenen Clonen durch Spaltung mit Pst I analysiertem einen Clon (von Clon 11 verschieden), der durch die Anwesenheit von zwei kleinen Fragmenten von 229 und 294bp gekennzeichnet war, zu isolieren. Dieses Konstrukt enthält den Hind Ill-Hind Ill-Sph !-Komplex in der richtigen Orientierung. Das dieses neue Konstrukt enthaltende Plasmid wurde „BS.BK.P32.Komplett" genannt.
Die ein Polypeptid codierende DNA-Sequenz oder ein Teil davon kann mit einer Ribosomen-Bindungsstelle, die Teil des Expressionsvektors ist, verbunden werden, oder sie kann an die Information eines anderen Proteins oder Peptide, die sich schon auf dem Expressionsvektor befindet, angeheftet werden.
Im ersten Fall wird die Information als solche exprimiert und ist daher frei von jeglichen fremden Sequenzen (mit der möglichen Ausnahme des aminoterminalen Methionine, das durch E.coli immer entfernt wird). Im zweiten Fall ist das exprimierte Protein ein Hybrid- oder Fusionsprotein.
Das das Polypeptid codierende Gen und der Expressionsvektor werden mit (einem) geeigneten Restriktionsenzym(en) behandelt oder auf andere Weise manipuliert, um Enden zu erzeugen, die eine ügation erlauben. Der resultierende rekombinante Vektor wird zur Transformation eines Wirtes verwendet. Die Transformanten werden auf Gegenwart und richtige Orientierung des eingebauten Gens analysiert. Zusätzlich kann der ClonierungsvektorzurTransformation anderer Stämme des gewählten Wirtes verwendet werden. Verschiedene Verfahren und Materialien zur Herstellung rekombinanter Vektoren, zur Transformation von Wirtszellen mit ihnen und zur Expression von Polypeptiden und Proteinen sind von N. Panayatatos in „Plasmids, a practical approach", Herausgeber K. G. Hardy, IRL-Press, 163-176 und von Old und Primrose „Principals of Gene Manipulation", 2. Ausgabe (1981), beschrieben und dem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
Verschiedene Clonierungsvektoren können für die Expression verwendet werden. Obwohl Plasmide vorzuziehen sind, kann der Vektor auch ein Bacteriophage oder ein Cosmid sein. Der gewählte Vektor sollte mit der gewählten Wirtszelle kompatibel sein. Darüber hinaus sollte das Plasmid eine phänotypische Eigenschaft haben, das der transformierten Wirtszelle ermöglicht, auf einfache Weise identifiziert und von nichttransformierten Zellen abgetrennt zu werden. Eine solche Selektion kann durch ein Gen erfolgen, das eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum, wie Tetracyclin, Carbenicillin, Kanamycin, Chloramphenicol oder Streptomycin aufweist.
Um die codierende Sequenz eines Gens in E.coli exprimieren zu können, sollte der Expressionsvektor ferner die notwendigen Transkriptions- und Translationssignale enthalten.
Er sollte daher einen synthetischen oder aus einer natürlichen Quelle stammenden Promotor enthalten, der in E.coli funktionell ist. Vorzgusweise, jedoch ohne absolute Notwendigkeit, sollte der Promotor vom Experimentator kontrollierbar sein. Beispiele für häufig verwendete kontrollierbare Promotoren zur Expression in E.coli sind der Iac-, dertrp-, dertac-Promotor u nd die lambda-PL- und -PR-Promotoren.
Vorzugsweise sollte der Expressionsvektor fener einen in E. coli funktionellen Transkriptions-Terminator enthalten. Beispiele für verwendete Transkriptions-Terminatoren sind die trp- und rrnB-Terminatoren.
Weiterhin sollte der Expressionsvektor eine synthetische oder aus einer natürlichen Quelle stammende Ribosomen-Bindungsstelle enthalten, die die Translation und damit die Expression einer stromabwärts befindlichen codierenden Sequenz ermöglicht. Wenn darüber hinaus eine Expression ohne fremde Sequenzen erwünscht ist, sollte eine nur einmal vorkommende Restriktionsspaltstelle vorliegen, die so angeordnet ist, daß sie die Ligation der Sequenz direkt an das Initiationscodon oder Ribosomen-Bindungsstelle ermöglicht.
Ein für diese Art der Expression geeignetes Plasmid ist pKK233-2 (Pharmacia). Dieses Plasmid enthält den trc-Promotor, die Iac Z-Ribosomen-Bindungsstelle und den rrnB-Transkriptions-Terminator.
Das Plasmid plGRI (Innogenetics, Gent, Belgien) ist ebenfalls geeignet. Dieses Plasmid enthält das Tetracyclin-Resistenzgen, den Replikationsursprung von pAT1S3 (zu erwerben von Bioexcellence, Biores B. V., Woerden, Niederlande) und den PL-Promotor bis zur Mbo Il-Spaltstelle in der 5' nicht translatierten Region des lambda N-Gens (aus pPL[X]) stammend; Pharmacia). Stromabwärts vom PL-Promotor wurde eine synthetische Sequenz eingefügt, die eine „zwei Cistron"-Translationskassette codiert, wobei das Stopcodon des ersten Cistrons (das den ersten 25 Aminosäuren von mTNF entspricht, mit Ausnahme des Leucins in Position 1, das in Valin umgewandelt wurde) sich zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem Initiationscodon der zweiten Ribosomen-Bindungsstelle befindet. Die Restriktions- und genetische Karte von plGRI ist in Fig. 10a dargestellt. Fig. 10b und Tabelle 5 zeigen die Nucleinsäuresequenz bzw. die vollständige Restriktionsanalyse von plGRI. Wenn jedoch die Expression als Hybridprotein gewünscht ist, sollte der Expressionsvektor zusätzlich die codierende Sequenz eines Peptide oder Polypeptide enthalten, die (vorzugsweise stark) durch diesen Vektor in dem geeigneten Wirt exprimiert wird. In diesem Fall sollte der Expressionsvektor eine nur einmal vorkommende Spaltstelle für eine oder mehrere Restriktionsendonuclease(n) stromabwärts von der codierenden Sequenz enthalten.
Die Plasmide pEX1,2 und 3 (Boehringer Mannheim) und pUEX1,2 und3(Amersham) können für diesen Zweck verwendet werden.
Sie enthalten ein Ampicillin-Reistenzgen, den Replikationsursprung von pBR322 (Bolivar et al., Gene 2, [1977], 95-113), das Iac Z-Gen, das an seinem 5'-Ende an den lambda PR-Promotor, zusammen mit der codierenden Sequenz für die 9 ersten Aminosäuren des natürlicherweise unter seiner Kontrolle stehenden Gens cro angeheftet ist und eine Vielfach-Clonierungsstelle am З'-Ende der Iac Z-codierenden Sequenz, was die Herstellung eines mit ß-Galactosidase fusionierten Polypeptids erlaubt. Die pUEX-Vektoren enthalten ferner das CI857-Allel des Cl-Repressorgens des Bacteriophagen lambda. Ebenfalls verwendbar ist das Plasmid pmTNF-MPH (Innogenetics). Es enthält das Tetracyclin-Resistenzgen, den Replikationsursprung von pAT163 (zu beziehen von Bioexcellence, Biores B. V., Woerden, Niederlande), den lambda PL-Promotor bis zur Mbo Il-Spaltstelle in der 5'-nicht-translatierten Region des N-Gens (aus pPL[X] stammend; Pharmacia), gefolgt von einer synthetischen Ribosomen-Bindungsstelle (vgl. Sequenzdaten) und die die ersten 25 Aminosäuren von mTNF (mit Ausnahme des ersten Leucins, das in Valin umgewandelt worden ist) codierende Information. Dieser Sequenz wiederum folgt eine synthetische Polylinker-Sequenz, die sechs aufeinanderfolgende Histidine codiert, gefolgt von verschiedenen proteolytischen Spaltstellen (eine Ameisensäure-, CNBr", Kallikrein-, und E. coli-Protease Vll-empfindliche Stelle) codierender DNA, wovon jede mit einem unterschiedlichen Restriktionsenzym zugänglich ist, das nur einmal im Plasmid spaltet (Sma I, Nco I, Bsp MII und Stu I; siehe Restriktions- und genetische Karte, Figur 11 a). Stromabwärts vom Polylinker befinden sich mehrere Transkriptions-Terminatoren, einschließlich des E.coli trp- (synthetisch) und des rrnBT,T2-Terminators (aus pKK223-3 stammend; Pharmacia). Die gesamte Nucleinsäuresequenz dieses Plasmids ist in Fig. 11 b dargestellt. Tabelle Vl zeigt die gesamte Restriktionsanalyse von pmTNF MPH.
Das Vorhandensein von 6 aufeinanderfolgenden Histidinen ermöglicht die Reinigung des Fusionsproteins durch immobilisierte Metallionen-Affinitäts-Chromatographie (IMAC).
Nach der Aufreinigung kann der fremde Teil des Hybridproteins durch ein geeignetes Protein-Spaltungsverfahren entfernt werden, und das gespaltene Produkt kann dann von den nichtgespaltenen Molekülen unter Verwendung desselben, auf IMAC basierendem Verfahren abgetrennt werden.
In all den oben aufgeführten Plasmiden, in denen der lambda PL- oder lambda PR-Promotor verwendet wird, ist der Promotor durch die Expression des lambda el ts 857-Allels Temperatur-kontrolliert, das sich entweder auf einem defekten, in das Chromosom des Wirts (Κ12ΔΗ, ATCC Nr.33767) integrierten Prophagen oder auf einem zweiten kompatiblen Plasmid (pACYC-Derivat) befindet. Nur in den pUEX-Vektoren befindet sich dieses cl-Allel auf dem Vektor selbst.
Dem Durchschnittsfachmann ist klar, daß die oben aufgeführten Plasmide beispielhaft sind und andere Plasmide oder Typen von Expressionsvektoren eingesetzt werden können, ohne daß vom Sinn oder Schutzbereich der Erfindung abgewichen wird.
Falls ein Bacteriophage oder Phagemid anstelle eines Plasmids verwendet wird, sollte es die grundlegend gleichen Eigenschaften haben, die zur Auswahl eines oben beschriebenen Plasmids verwendet werden.
Subclonierung des P32-Antigens in das Plasmid plGRI
15mg des Plasmids ,,BS-BK-P32 Komplett" (vgl. Beispiel 2), wurden mit EcIXI und Bst EII (Boehringer, Mannheim) nach den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen gespalten, mit der Ausnahme, daß mindestens drei Einheiten Enzym pro μg DNA eingesetzt wurden. EcIXI spaltet in Position 226 (Figur 5) und BstEII in Position 1136, wodurch an das Start- und Stopcodon des reifen Рзг-Antigens sehr nahe herangekommen wird. Diese DNA wird nachstehend als das „PsrAntigen-Fragment" codierende DNA bezeichnet.
Die das „P32-Antigen-Fragment" codierende DNA wird in plGRI (vgl. Figur 10a) subcloniert, um das von jeglicher fremden Sequenz freie Polypeptid2u exprimieren. Um das ATG-Codon des Expressionsvektors in den P32-Leserasterzu bringen, wird ein Zwischenkonstrukt in plG 2 hergestellt (Restriktions- und genetische Karte: vgl. Figur 12 a; DNA-Sequenzen: vgl. Figur 12b; vollständige Restriktionsanalyse: vgl. Tabelle 7).
5 μg des Plasmids plG 2 wurden im Nco I gespalten. Die 5'-klebrigen Enden wurden vor der Dephosporylierung aufgefüllt.
Die DNA wurde dazu in 40μΙ NB-Puffer (0,05M Tris-HCI, pH 7,4,1OmM MgCI2,0,05% ß-Mercaptoethanol), enthaltend 0,5mM aller vier dXTPs (X = A, T, C, G) und 2 μΙ Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I (5 Einheiten/μΙ, Boehringer Mannheim) mindestens 3 Stunden bei 15°C inkubiert.
Nach der Herstellung glatter Enden wurde die DNA einmal mit einem Volumen mit 20OmM Tris-HCI, pH 8,0 äquilibriertem Phenol und zweimal mit mindestens zwei Volumen Diethylether extrahiert und schließlich unter Verwendung des „Gene clean kit*" (Bio 101) wie vom Hersteller empfohlen, gesammelt. Die DNA wurde anschließend an den 5'-Enden in 30μΙ ClP-Puffer (5OmM Tris HCI, pH 8,1 mM ZnCI2) mit 20 bis 25 Einheiten Kälberdarmphosphatase (hohe Konzentration, Boehringer Mannheim) dephosphoryliert. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert, anschließend wurde EGTA (Ethylenglycol-bis-(ßaminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure),pH 8, in einer Endkonzentration von 1OmM zugegeben. Das Gemisch wurde dann mit Phenol und nachfolgend mit Diethylether, wie oben beschrieben, extrahiert und die DNA wurde durch Zugabe von Vw Volumen 3M KAc (Ac = CH3COO), pH 4,8, und 2 Volumen Ethanol gefällt, und nachfolgend mindestens 1 Stunde bei -2O0C gelagert.
Nach 5minütiger Zentrifugation bei 13000UpM in einer Biofuge A (Hereaus) wurde die pelletierte DNA in einer Konzentration von 0,2 μg/μl in H2O gelöst.
Das „P32-Antigen-Fragment" codierende EclXI-BstEII-Fragment (siehe oben) wurde durch Elektrophorese auf einem 1 % Agarosegel (BRL) vom übrigen Plasmid getrennt und aus dem Gel durch Zentrifugation über einen Millipore-HVLP-Filter (Durchmesser 2cm) (2 Minuten, 13000UpM, Biofuge, Raumtemperatur) isoliert und mit Tris-äquilibriertem Phenol sowie nachfolgend mit Diethylether, wie oben beschrieben, extrahiert. Die DNA wurde nachfolgend unter Verwendung des „Gene clean kit®" (Bio 101), wie vom Hersteller empfohlen, gesammelt. Anschließend wurden die 5'-klebrigen Enden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I, wie oben beschrieben, in glatte Enden umgewandelt, und die DNA wurde wiederum unter Verwendung des „Gene clean kit®", gesammelt und anschließend in 7 μΙ H2O gelöst. Dazu wurden 1 μΙ Vektor-DNA, 1 μΜΟχ Ligasepuffer (0,5M Tris-HCI, pH 7,4,10OmM MgCI2,5mM ATP, 5OmM DTT [Dithiothreit]) und 1 ml T4 DNA-Ligase (1 Einheit/μΙ, Boehringer Mannheim) zugegeben. Die Ligation erfolgte 6 Stunden bei 13°C, und 5μΙ des Gemisches wurde dann verwendet, um Bakterien vom Stamm DH1 (lambda) (Stamm DH1 -ATCC 33849-trägt den Wildtyp-Phagen λ-Lysogen unter Verwendung von Standardtransformations-Techniken, wie z. B. von Maniatis et al., in „Molecular Cloning, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory [1982], beschrieben), zu transformieren.
Einzelne Transformanten wurden gezüchtet und für die Plasmid-DNA-Präparationen unter Verwendung von Standard-Verfahren lysiert („Experiments with gene fusions". Cold Spring Harbor Laboratory [1984], Herausgeber T. J. Silhavy, H.L. Berman und L.W. Engquist) und die DNA-Präparationen wurden durch Restriktionsanalysen auf die richtige Orientierung des Gens innerhalb des Plasmids untersucht.
Die Untersuchung auf die richtige Herstellung glatter Enden wird durch Nachweis der Wiederherstellung der Ncol-Spaltstelle an den 5'- und З'-Enden der das Antigen codierenden Sequenz durchgeführt. Einer der das P32-Antigen-Fragment in der richtigen Orientierung enthaltenden Clone wird für die weitere Arbeit verwendet und plG2-Mt32 genannt. In diesem Zwischenkonstrukt befindet sich die das Antigen codierende DNA nicht im Leseraster mit dem ATG-Codon. Sie kann jedoch jetzt als Ncol-Fragment in einen anderen Expressionsvektor eingebaut werden.
15μg PIG2-Mt32 werden mit Ncol gespalten. Das das P32-Antigen codierende Ncol-Fragment wird Gel-gereinigt und die Enden, wie oben beschrieben, in glatte Enden umgewandelt. Nach der Reinigung unter Verwendung des „Gene clean kit®" wird es in 7 μΙ H2O gelöst.
5μg des Plasmids plGRI werden, wie oben beschrieben, mit Ncol gespalten, die Enden in glatte Enden umgewandelt und dephosporyliert. Nach Phenol- und Diethylether-Extraktionen und Fällung mit Ethanol wird das Pellet in H2O in einer Endkonzentration von 0,2 μg/μl gelöst. Die Ligation von Vektor- und „Anf.igen-Fragment"-DNA wird, wie oben beschrieben, durchgeführt. Bakterien vom Stamm DH1 (lambda) werden mit dem Ligationsgemisch transformiert und einzelne Transformanten werden durch Restriktionsanalyse auf die richtige Orientierung des Gens innerhalb des Plasmids untersucht. Die Untersuchung aufrichtige Herstellung glatter Enden wird durch den Nachweis der Schaffung einer neuen Nsil-Spaltstelle an den 5'- und den З'-Enden der das Antigen codierenden Sequenz geführt. Einer der das „Рзг-Antigen-Fragment" in der richtigen Orientierung erhaltenen Clone wird für die weitere Arbeit verwendet und mit plGRI.Mt32 bezeichnet.
Subclonierung des Pu-Antigens in pmTNF MPH
15pg des Plasmids plG 2 Mt32 (vgl. Beispiel IV) wurden mit dem Restriktionsenzym Nco I (Boehringer Mannheim) nach den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen gespalten, mit der Ausnahme, daß mindestens 3 Einheiten Enzym pro цд DNA verwendet wurden.
Nach der Spaltung wurde das Reaktionsgemisch mit einem Volumen mit 200 mM Tris-HCI, pH 8, äquilibriertem Phenol, zweimal mit 2 Volumen Diethylether extrahiert und durch Zugabe von Vio Volumen 3M KAc (Ac = CH3COO), pH 4,8, und 2 Volumen Enthanol gefällt und anschließend mindestens 1 Stunde bei -200C gelagert.
Nach 5minütiger Zentrifugation bei 13000UpM in einer Biofuge A (Hereaus) wurde die DNA auf einem 1 % Agarosegel (BRL) elektrophoriert.
Die das oben beschriebene „P3J-Antigen-Fragment" codierende DNA wird durch Zentrifugation über einen Millipore HVLP-Filter (02cm), (2 Minuten, 13000UpM, Biofuge, Raumtemperatur) isoliert und einmal mit Tris-HCI äquilibriertem Phenol und zweimal mit Diethylether extrahiert. Die DNA wird anschließend unter Verwendung eines „Gene clean kit9" (Bio 101) gesammelt und in 7 μΙ H2O gelöst.
Die 5'-überhängenden Enden des durch Spaltung mit NcoI erzeugten DNA-Fragmentes wurden durch mindestens 3stündige Inkubation der DNA in 40μΙ NB-Puffer (0,05 M Tris-HCI, pH 7,4,1OmM MgCI2,0,05% ß-Mercaptoethano!) enthaltend 0,5mM aller dXTPs (X = A, T, C, G) und 2μΙ Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I (5 Einheiten/μΙ, Boehringer Mannheim) bei 15°C aufgefüllt. Nach der Herstellung glatter Enden wurde die DNA mit Phenol und anschließend mit Diethylether extrahiert und unter Verwendung von „Gene clean Kit*', wie oben beschrieben, gesammelt.
5 цд des Plasmids pmTNF MPH wurden mit Stu I gespalten, anschließend mit Phenol und dann mit Diethylether extrahiert, und wie oben beschrieben, gefällt. Die Restriktionsspaltung wurde durch Elektrophorese einer 0^g Probe auf einem analytischen 1,2% Agarosegel nachgewiesen.
Die Plasmid-DNA wird anschließend in 30μΙ ClP-Puffer (5OmM Tris-HCI, pH 8,1 mM ZnCI2) mit 20 bis 25 Einheiten Kälberdarmphosphatase (hohe Konzentration, Boehringer Mannheim) dephosphoryliert, um die Selbst-Ligation zu verhindern.
Das Gemisch wird 30 Minuten bei 370C inkubiert, anschließend wird EGTA (Ethylenglycol-bis-(ß-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure), pH 8, in einer Endkonzentration von 1OmM zugegeben. Das Gemisch wird mit Phenol und anschließend mit Diethylether extrahiert und die DNA, wie oben beschrieben, gefällt. Das Präzipitat wird durch lOminütige Zentrifugation bei 13000 UpM und 4CC in einer Biofuge A (Hereaus) pelletiert und das Pellet wird in einer DNA-Endkonzentration von 0,2 μg/μl in H2O gelöst.
1 μΙ dieser Vektor-DNA wird mit den 7μΙ der Lösung, die das DNA-Fragment enthält, das das „P32-Antigen-Fragment" (wie oben definiert) codiert, 1 μΙ 10x Ligasepuffer (0,5MTris HCI, pH7,4,10OmM MgCI2,5mM ATP, 5OmM DTT [Dithiothreit]) und 1 μΙ T4 DNA-Ligase (1 Einheit/μΙ, Boehringer Mannheim) gemischt. Das Gemisch wird 6 Stunden bei 130C inkubiert, und 5μΙ des Gemisches werden dann für die Transformation von Bakterien des Stammes DH1 (lambda) unter Verwendung von Standard-Transformationstechniken, wie z.B. von Maniatis et al. in „Molecular Cloning, a laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschrieben, verwendet.
Einzelne Transformanten werden gezüchtet und anschließend für die Plasmid-DNA-Präparation unter Verwendung von Standard-Verfahren („Experiments with gene fusions". Cold Spring Habor Laboratory [1984], Herausgeber T. J. Silhavy, M. L.
Berman und L.W. Enquist) lysiert und durch Restriktionsanalyse auf die richtige Orientierung des Gens innerhalb des Plasmids untersucht.
Einer der Clone, die die das Antigen-Fragment codierende DNA in der richtigen Orientierung enthalten, wurde für die weitere Arbeit zurückgelegt und pmTNF-Mt 32 genannt. Er codiert die gesamte Informationfür das Рзг-Antigen, beginnend an Position 4 der Aminosäuresequenz (vgl. Figur 5). Die Aminosäuresequenz des gesamten Fusionsproteins ist in Figur 13 dargestellt.
Induktion der Antigen-Expression durch pmTNF MPH Mt32
a. Material und Methoden
Bakterien des E. coli-Stammes Κ12ΔΗ (ATCC 33767) werden mit pmTNF-MPH-Mt32-DNA unter Verwendung von Standard-Transformationsverfahren transformiert, mit der Ausnahme, daß die Züchtungstemperatur für die Kulturen auf 28°C und die Hitzeschocktemperatur auf 340C vermindert wurde.
Eine pmTNF-MPH-Mt32 tragende, über Nacht unter starkem Schütteln und in Gegenwart von 10μg/ml Tetracyclin Nn Luria-Brühe bei 28°C gewachsene K12AH-Kultur wird in frische, 10 μg/ml Tetracyclin enthaltende Luria-Brühe übertragen und zu einer optischen Dichte von 0,2 bis 600 nm unter denselben Bedingungen wie für die Übernacht-Kultur gezüchtet. Nachdem die optische Dichte bei 600 nm 0,2 erreicht hat, wird die Hälfte der Kultur bei einer Temperatur von 420C weiter gezüchtet, um die Expression zu induzieren, während die andere Hälfe als Kontrolle bei 28°C verbleibt. Nach verschiedenen Zeitintervallen werden Aliquots entnommen, die mit 1 Volumen mit M9-Salzen (0,1 % Ammoniumchlorid, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 1,5% Dinatriumhydrogenphosphat, 12 Moleküle Wasser) äquilibriertem Phenol und 1% SDS extrahiert werden. Zur selben Zeit wird die optische Dichte (600 nm) der Kultur überprüft. Proteine werden durch Zugabe von
2 Volumen Aceton aus der Phenolphase gefällt und über Nacht bei -200C gelagert. Das Präzipitat wird pelletiert (Biofuge A,
5 Minuten, 13000UpM, Raumtemperatur), an der Luft getrocknet, in 1 Volumen Laemmli-Probenpuffer (Nature 227 119701,680) (+ ß-Mercaptoethanol) entsprechend der optischen Dichte gelöst und 3 Minuten gekocht.
Die Proben werden dann auf einem SDS-Polyacrylamidgeld (15%) nach dem Verfahren von Laemmli (1970) elektrophoriert. Die temperaturabhängige Induktion von mTNF-His6-P32 wird sowohl durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blau (CBB) als auch durch Immunblots überprüft. CBB-Färbung wird durch Eintauchen des Gels in 1:10 verdünnte CBB-Färbelösung (0,5g CBB-R 250 [Serval in 90ml Methanol:H2O [1:1 Volumen-%] und 10ml Eisessig) und 1 stündiges Belassen auf einer sanft rotierenden Plattform durchgeführt. Nach mehrstündigem Entfärben in Entfärbelösung (30% Methanol, 7% Eisessig) werden die Proteinbanden sichtbar und können mit einem Densitometer (Ultroscan XL Enhanced Laser Densitometer, LKB) abgetastet werden.
Für die Immunblots werden die Proteine auf Hybond C-Membranen (Amersham), wie von Townbin et al. (1979) beschrieben, geblottet. Nach dem Blotten werden die Proteine und damit die Lage der Molekulargewichtsmarker mit Ponceau S (Serva) zeitweilig auf der Membran sichtbar gemacht. Die Farbe wird dann durch Waschen in H2O entfernt. Nicht-spezifische Protein-
Bindungsstellen werden durch Inkubation der Blots in 10% fettarmer, getrockneter Milch (ungefähr 1 Stunde) auf einer sanft rotierenden Plattform blockiert. Nach zweimaligem Waschen mit NT-Puffer (25 mM Tris-HCI, pH 8,0,15OmM NaCI) werden die Blots mit polyclonalem Kaninchen-anti-32-kDa-Antiserum (1:1000 verdünnt), das, wie in Beispiel 1 beschrieben (,Absuchen der rekombinierten Xgt11-M. tuberculosis DNA-Genbank mit anti-32-kDa-Antiserum") gewonnen wurde, in Gegenwart von E. coli-Lysat oder mit monoclonalen anti-hTNF-Antikörpern, die mit mTNF (Innogenetics, Nr.17F5D10) kreuzreagieren, mindestens 2 Stunden auf einer rotierenden Plattform inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit NT-Puffer + 0,02% Triton X-100 wurden die Blots mindestens 1 Stunde mit dem sekundären Antiserum inkubiert: mit alkalischer Phosphatase konjugierten Schwein-anti-Kaninchen-lmmunglobulinen, (1:500 verdünnt; Prosan) im ersten Falle und mit alkalischer Phosphatase konjugierten Kaninchen-anti-Maus-lmmunglobulin (1:500 verdünnt; Sigma) im zweiten Falle. Die Blots werden wieder zweimal mit NT-Puffer + 0,02% Triton X100 gewaschen und die Entwicklung erfolgt mit Nitroblau-Tetrazolium (NBT) und S-Brom^-chlor-S-indolylphosphat (BCIP) (Promega) unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Bedingungen.
b. Ergebnisse
Nach Induktion von pmTNF-MPH-Mt32 enthaltenden Κ12ΔΗ-ΖβΙΙβη erscheint bereits 1 Stunde nach Start der Induktion eine deutlich sichtbare Bande von etwa 35kDa auf CBB gefärbten Gelen (Figur 14 a). Diese etwa 25% des Gesamt-Proteingehalts der Zelle entsprechende Bande reagiert in Immunblots stark mit anti-32-kOa- und anti-mTNF-Antiseren (Figur 14 b). Diese Bande stellt jedoch ein Spaltprodukt des ursprünglichen Fusionsproteins dar, da eine schwächere Bande, etwa 37 kDa, die spezifisch mit beiden Antiseren reagiert, ebenfalls auf dem Immunblot sichtbar ist. Dies läßt vermuten, daß eine ausgiebige Spaltung des rekombinanten mTNF-Hise-P32 etwa 2 bis 3 kDa vom carboxyterminalen Ende stattfindet.
Reinigung des rekombinanten Antigens durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) Das durch pmTNF.MPH.Mt32 enthaltende K12AH-Zellen exprimierte Hybridprotein mTNF-His6-P32 (Aminosäuresequenz: vgl. Figur 13) ist besonders darauf ausgerichtet, die Reinigung durch IMAC zu erleichtern, da die 6 aufeinanderfolgenden Histidine in der Polylinker-Sequenz eine starke Affinität für Metallionen bewirken (Hochuli et al., 1988).
a. Herstellung von rohen Zellextrakten
12 Liter das Plasmid pmTNF-MPH-Mt32 enthaltende K12AH-Zellen wurden in 10 pg/ml Tetracyclin enthaltender Luria-Brühe bei 280C bis zu einer optischen Dichte (600 nm) von 0,2 gezüchtet und anschließend durch Erhöhung der Temperatur auf 42°C induziert. Nach 3stündiger Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet (Beckman, JA 10-Rotor, 10 Minuten, 7500UpM). Die Zellpaste wurde in Lyse-Puffer (1OmM KCI, 1OmM Tris-HCI, pH 6,8,5mM EDTA) in einer Endkonzentration von 50Gew.-% Zellen resuspendiert. e-NH2-Caproylsäure und Dithiothreit (DTT) wurden in einer Endkonzentration von 2OmM bzw. 1 mM zugegeben, um proteolytischen Abbau zu verhindern. Die konzentrierte Zellsuspension wurde über Nacht bei -7O0C gelagert.
Die Zellen wurden durch dreimalige Behandlung in einer French-Presse (SLM-Aminco) bei einem Arbeitsdruck von 800 bis 1000 psi lysiert. Während und nach der Lyse wurden die Zeilen systematisch auf Eis gehalten.
Das ZeII-Lysat wurde durch Zentrifugation geklärt, (Beckman, JA 20,18000UpM, 20 Minuten, 4°C). Der Überstand (SN) wurde vorsichtig abgenommen und das Membranen und Einschlußkörper enthaltende Zellpellet wurde für die weitere Arbeit aufbewahrt, da Vorversuche gezeigt hatten, daß sich das Protein hauptsächlich in der Membranfraktion befand.
7 M Guanidinium-hydrochlorid (GuHCI, erhältlich von ICN) in 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 wurde in einer Endkonzentration von 6M GuHCI zum Pellet gegeben. Das Pellet wurde resuspendiert und in einem Stoß-Gewebe-Homogenisator (10 Cyclen) extrahiert.
Nach der Klärung (Beckman, JA 20,18000UpM, 20 Minuten, 4°C) wurden etwa 100ml Überstand gesammelt (= Extrakt 1) und das übriggebliebene Pellet wurde nochmals, wie oben beschrieben, extrahiert (= Extrakt 2,40ml).
Die verschiedenen Fraktionen (SN, EX1, EX2) wurden durch SDS-PAGE (Laemmli, Nature 227 [1970], 680) zusammen mit Kontrolfproben der induzierten Kultur analysiert. Abtasten des Gels zeigte, daß der Anteil des rekombinanten Proteins etwa 25% des Gesamt-Proteingehaltes der induzierten Zellkultur beträgt. Nach der Fraktionierung wurde der größte Anteil des Proteins in den Extrakten gefunden. Es wurde kein Unterschied zwischen reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen (mit und ohne ß-Mercaptoethano!) festgestellt.
b. Herstellung der Ni++-IDA (Iminodiessigsäure)-Säule
5 ml des chelatisierenden Gels, chelatisierende Sepharose 6 B (Pharmacia) wird ausgiebig mit Wasser gewaschen, um den Ethanol zu entfernen, in dem es aufbewahrt wird, und dann auf eine „Econo-Säule" (1 χ 10cm, Biorad) gepackt. Die Spitze der Säule ist mit der einfließenden Flüssigkeit (Probe, Puffer etc.) verbunden, während das untere Ende über eine peristaltische Pumpe mit einem UV28o-Detektor verbunden ist. Die Fraktionen werden unter Verwendung eines Fraktionssammlers gesammelt, und die pH-Werte der Fraktionen, falls erforderlich, manuell gemessen.
Die Säule wird mit Ni++ (6ml NiCI2- 6H2O, 5цд/тІ) geladen und mit Startpuffer (6M Guanidium-hydrochlorid, 10OmM Phosphatpuffer, pH 7,2) äquilibriert.
Nach dem Auftragen der Probe wird die Säule ausgiebig mit Startpuffer gewaschen, um nicht-gebundenes Material zu entfernen.
Um das gebundene Material zu eluieren sind zwei verschiedene Elutionsverfahren denkbar.
1. Elution durch abnehmenden pH-Wert,
2. Elution durch ansteigende Imidazol-Konzentration
Beide Verfahren werden hier diskutiert.
Um die Säule zu regenerieren, was nach 2 bis 3 Läufen getan werden muß, werden 20 ml (etwa 5 Säulen-Volumen) der folgenden Lösungen nacheinander durch die Säule gepumpt:
- 0,05 M EDTA - 0,5 M NaCL
- 0,1 M NaOH
- H2O
- 6m NiCI2 ·6Η2Ο(5 mg/ml).
Nach Äqulibrierung mit Startpuffer kann die Säule erneut verwendet werden.
с. Chromatographie
Alle in der Chromatographie verwendeten Puffer enthielten 6M Guanidinium-hydrochlorid. Die Säule wurde bei einer Flußrate von 0,5ml/Minute bei umgebender Temperatur entwickelt. 2 ml Fraktionen wurden gesammelt und, falls geeignet, weiter durch SDS-PAGE und Immunblots analysiert. Gele wurden mit Coomassie-Brilliant-BlauR 250 und Silberfarbe, wie von Ansorge (1985) beschrieben, gefärbt. Immunoblots wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Als primäres Antiserum wurde entweder polyclonales anti-32kDa-Antiserum (1:1000 verdünnt), wie in Beispiel 1 beschrieben („Absuchen der rekombinanten Agt11-M.tuberculosis-DNA-Genbank mit anti-32kDa-Antiserum"),anti-E.coli-lmmunglobuline (1:500 verdünnt; PROSAN) oder monoclonale anti-hTNF-Antikörper (Innogenetics, Nr.17F5D10), die mit nrcTNF kreuzreagieren, verwendet. Das sekundäre Antiserum war mit alkalischer Phosphatase konjugierte Schweine-anti-Kaninchen-lmmunoglobuline (1:500 verdünnt, PROSAN) oder mit alkalischer Phosphatase konjugierte Kaninchen-anti-Maus-lmmunoglobuline (1:500 verdünnt, Sigma).
с 1. Elution mit abnehmendem pH-Wert
Verwendete Lösungen:
A: 6 M GuHCMOOmM Phosphat, pH 7,2;
B: 6MGuHCI, 25mM Phosphat, pH 7,2;
C: 6MGuHCI, 5OmM Phosphat,pH4,2.
Nach dem Auftragen von 3 ml Extrakt 1 (OD280 = 32,0) und ausgiebigem Waschen mit Lösung A wurde die Säule mit Lösung B äquilibriert und anschließend mit einem linearen pH-Gradienten von 7,2 bis 4,2 (25ml Lösung B und 25ml Lösung C wurden in einem Gradientenmischer gemischt) entwickelt. Das Elutionsprofil ist in Figur 15 dargestellt.
Aus der SDS-PAGE-Analyse (Coomassie- und Silberfärbung) war klar, daß der größte Anteil des ursprünglich gebundenen, rekombinanten Proteins mit den Fraktionen zwischen pH 5,3 und 4,7 eluiert.
Das Absuchen dieser Fraktionen durch Immunoblots mit anti-32 kDa und den monoclonalen 17F5D10-Antikörpern zeigte, daß, zusammen mit dem intakten rekombinanten Protein auch einige Abbauprodukte und Formen höherer Aggregate des Proteins vorkamen, obwohl in wesentlich geringerer Menge. Die Entwicklung der Blots mit anti-E. coli-Antikörpern zeigte, daß diese Fraktionen (pH 5,3 bis 4,7) noch immunologisch nachweisbare kontaminierende E. coli-Proteine (75,65,43,35, und 31-kDa-Banden) und Lipopolysaccharide enthielten.
c2. Elution mit ansteigenden Imidazol-Konzentrationen:
Verwendete Lösungen:
A: 6MGuHCI, 10OmM Phosphat, pH 7,2;
B: 6MGuHCI, 50mMlmidazol,pH7,2;
C: 6MGuHCI, 10OmM Imidazol, pH 7,2;
D: 6MGuHCI, 15mM Imidazol, pH 7,2;
E: 6MGuHCI, 25mM Imidazol, pH 7,2;
F: 6MGuHCI, 35mM Imidazol, pH 7,2;
Das Auftragen der Proben und das Waschen wurden wie in c1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß nach dem Waschen keine Äquilibrierung mit 6M GuHCI, 25mM Phosphat notwendig war. Die Säule wurde zunächst mit einem linearen Imidazol-Gradienten von 0 bis 5OmM (25ml Lösung A und 25ml Lösung B wurden in einem Gradientenmischer gemischt) und nachfolgend durch schrittweise Elution bis 10OmM Imidazol (Lösung C) entwickelt. Während des linearen Gradienten, eluierten die Proteine allmählich in einem breiten Schmier, während der Schritt auf eine Konzentration von 10OmM ein eindeutiges Maximum (Figur 16) erbrachte.
SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen zeigte, daß in dem ersten Teil des linearen Gradienten (Fraktionen 1 bis 24) die meisten kontaminierenden E. coli-Proteine herausgewaschen wurden, während der zweite Teil des Gradienten (Fraktionen 25-50) und das 10OmM Maximum mehr als 90% des rekombinanten Proteins enthielten.
Wie in с 1 zeigten diese Fraktionen neben einer Hauptbande des intakten rekombinanten Proteins einige schwächere Banden von Abbau- und Aggregationsprodukten. In diesem Falle jedoch war der Bereich unterhalb von 24KDa anscheinend vollständig frei von Proteinbanden, was nahelegt, daß weniger Abbauprodukte mit dem intakten Protein zusammen eluieren. Die gleichen kontaminierenden E. coli-Proteine wurden auch, wie in с 1, durch Immunoblot nachgewiesen, obwohl die 31 kDa-Bande weniger intensiv war und in einigen Fraktionen nicht einmal vorkam.
In einer zweiten Versuchsreihe wurde die Säule mit einem Stufengradienten ansteigender Imidazol-Konzentrationen entwickelt. Nachdem die Probe aufgetragen und die Säule gewaschen war, wurden 2 Säulenvolumen (etwa 8 ml) der folgenden Lösungen aufeinanderfolgend auf die Säule aufgetragen: Lösungen D, E, F und schließlich 4 Säulenvolumen von Lösung C. Der Stufengradient ergab ein konzentrierteres Elutionsprofil (Figur 17), das ihn für Vorhaben in größerem Maßstab geeigneter macht.
Das mTNF-His6-P32-Protein ist letztlich durch IMAC zu mindestens 90% gereinigt worden. Eine weitere Reinigung kann durch eine Kombination der folgenden Reinigungsschritte erreicht werden:
- IMAC auf chelatisierender Superose (Pharmacia);
- Ionenaustauscher-Chromatographie (Anionen oder Kationen);
- Reverse Phasen-Chromatographie;
- Gelfiltrations-Chromatographie;
- Immunaffinitäts-Chromatographie;
- Elution auf Polyacrylamid-Gelen.
Diese chromatographischen Verfahren werden üblicherweise für Proteinreinigungen verwendet.
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Claims (45)
1. Rekombinantes Polypeptid, das in seiner Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen enthält:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (12) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (31) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (36) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (55) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (77) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (96) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (101) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (120) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (175) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (211) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (230) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (275) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
Aminosäuresequenzen, die sich aus einer der vorstehend angegebenen Aminosäuresequenzen durch Modifizierung von mindestens einer Aminosäure durch Substitution und/oder durch Anheften und/oder durch Deletion von Aminosäuren ergeben, wobei die Modifizierung keine der nachfolgenden Eigenschaften verändert:
die die Aminosäuresequenzen enthaltenden Polypeptide reagieren mit polyclonalem Kaninchen-Antiserum, das gegen das 32 kDa-Protein aus M. bovis BCG-Kulturfiltrat hergestellt wurde; und/
sie reagieren selektiv mit menschlichem Serum aus Tuberkulose-Patienten und besonders aus Patienten, die eine evolutive Tuberkulose in einem frühen Stadium entwickeln; und/oder sie reagieren mit Antikörpern gegen die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
2. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 1, das in seiner Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen enthält:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (12) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (31) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (36) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (55) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (77) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (96) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (101) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (120) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (175) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (211) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (230) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (275) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
Aminosäuresequenzen, die sich aus einer der vorstehend angegebenen Aminosäuresequenzen durch Modifizierung von mindestens einer Aminosäure durch Substitution und/oder durch Anheften und/oder durch Deletion von Aminosäuren ergeben, wobei diese Modifizierung keine der nachfolgenden Eigenschaften verändert:
die die Aminosäuresequenzen enthaltenden Polypeptide reagieren mit polyclonalem Kaninchen-Antiserum, das gegen das32kDa-Protein aus M. bovis BCG-KuIturfiItrat hergestellt wurde; und/ oder
sie reagieren selektiv mit menschlichem Serum aus Tuberkulose-Patienten und besonders aus Patienten, die eine evolutive Tuberkulose in einem frühen Stadium entwickeln; und/oder sie reagieren mit Antikörpern gegen die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
3. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 1, das in seiner Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen enthält:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom vonder Aminosäurein Position (-30) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (12) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäureein Position (31) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (36) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (55) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (77) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (96) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (101) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (120) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (175) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (211) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (230) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (275) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt; oder
Aminosäuresequenzen, die sich aus einer der vorstehend angegebenen Aminosäuresequenzen durch Modifizierung von mindestens einer Aminosäure durch Substitution und/oder durch Anheften und/oder durch Deletion von Aminosäuren ergeben, wobei diese Modifizierung keine der nachfolgenden Eigenschaften verändert:
die die Aminosäuresequenzen enthaltenden Polypeptide reagieren mit polyclonalem Kaninchen-Antiserum, das gegen das 32kDa-Protein aus M. bovis BCG-Ku Itu rf iltrat hergestellt wurde; und/
sie reagieren selektiv mit menschlichem Serum aus Tuberkulose-Patienten und besonders aus Patienten, die eine evolutive Tuberkulose in einem frühen Stadium entwickeln; und/oder
sie reagieren mit Antikörpern gegen die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt.
4. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 1, das in seiner Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen enthält:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position \—42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position {—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (— 1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
5. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 2, das in seiner Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen enthält:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt;oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
6. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 3, das in seiner Polypeptidkette mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen enthält:
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-43) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-30) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—43) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (295) gebildeten Ende erstreckt.
7. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 1, das aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen besteht:
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (— 1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (12) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (31) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (36) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (55) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (77) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (96) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (101) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (120) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (175) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3 a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (230) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (275) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
8. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 2, das aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen besteht:
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—59) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—55) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-49) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (—47) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (—1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-42) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-29) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (12) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (31) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (36) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (55) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (77) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (96) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (101) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (120) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (175) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (211) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (230) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (275) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (294) gebildeten Ende erstreckt.
9. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 3, das aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen besteht:
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-43) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (295) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-43) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-30) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (295) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (-30) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (-1) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (295) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (12) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (31) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (36) gtebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (55) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (77) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (96) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (101) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (120) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (175) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (211) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (230) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Aminosäuresequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (275) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure (295) gebildeten Ende erstreckt.
10. Polypeptid, das aus einer Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und einem Protein oder einer in Hinsicht auf das Polypeptid heterologen Sequenz besteht, wobei das Protein oder die heterologe Sequenz von etwa 1 bis etwa 1000 Aminosäuren enthält.
11. Polypeptid nach Anspruch 10, wobei das heterologe Protein ß-Galactosidase ist.
12. Nucleinsäure, enthaltend
- eine Nucleotidsequenz, die eines der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 11 codiert; oder
- Nucleotidsequenzen, die mit den Nucleotidsequenzen, die eines der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 11 codieren, hybridisieren; oder
- Nucleotidsequenzen, die komplementär zu den Nucleotidsequenzen sind, die eines der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 11 codieren; oder
- die oben genannten Nucleotidsequenzen, bei denen T durch U ersetzt ist.
13. Nucleinsäure nach Anspruch 12, die mindestens eine der folgenden Nucleotidsequenzen enthält:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (1) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (182) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (273) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (360) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (1242) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt, wobei N eines der fünf Nucleotide A, T, C, G oder I darstellt; oder
die oben genannten Nucleotidsequenzen, bei denen T durch U ersetzt ist; oder Nucleinsäuren, die mit den oben genannten Nucleotidsequenzen oder deren Komplementär-Sequenzen hybridisieren.
14. Nucleinsäure nach Anspruch 13, die mindestens eine der folgenden Nucleotidsequenzen enthält:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (1) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (182) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (273) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (360) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (1242) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt, wobei N eines der fünf Nucleotide A, T, C, G oder I darstellt; oder
die oben genannten Nucleotidsequenzen, bei denen T durch U ersetzt ist; oder Nucleinsäuren, die mit den oben genannten Nucleotidsequenzen oder deren Komplementär-Sequenzen hybridisieren.
15. Nucleinsäure nach Anspruch 13, die mindestens eine der folgenden Nucleotidsequenzen enthält:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (130) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (219) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (220) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von dem Nucleotid in Position (1104) gebildeten Ende bis zum von dem Nucleotid in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
die oben genannten Nucleotidsequenzen, bei denen T durch U ersetzt ist; oder Nucleinsäuren, die mit den oben genannten Nucleotidsequenzen oder deren Komplementär-Sequenzen hybridisieren.
16. Nucleinsäure nach Anspruch 13, die eine der folgenden Sequenzen enthält:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (212) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (218) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (272) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren За und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (360) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt.
17. Nucleinsäure nach Anspruch 14, die eine derfolgenden Sequenzen enthält:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (212) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (218) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b darstellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (272) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (360) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt.
18. Nucleinsäure nach Anspruch 15, die eine der folgenden Sequenzen enthält:
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (129) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (90) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (90) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (90) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (130) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (130) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- die Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (220) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt.
19. Nucleinsäure nach Anspruch 13, die aus einer der folgenden Nucleotidsequenzen besteht:
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (182) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (212) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (218) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (272) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3 b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (360) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (360) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 3a und 3b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1242) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt.
20. Nucleinsäure nach Anspruch 14, die aus einer der folgenden Nucleotidsequenzen besteht:
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (182) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (194) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (212) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (218) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (272) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (183) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (195) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (213) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (234) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (359) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (273) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (360) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1241) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (360) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in den Figuren 4a und 4b dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1242) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1358) gebildeten Ende erstreckt.
21. Nucleinsäure nach Anspruch 15, die aus einer der folgenden Nucleotidsequenzen besteht:
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (129) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (90) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (90) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (90) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (130) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (219) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (130) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (130) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (220) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (220) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt; oder
- der Nucleotidsequenz, die sich, wie in Figur 5 dargestellt, vom von der Aminosäure in Position (1104) gebildeten Ende bis zum von der Aminosäure in Position (1299) gebildeten Ende erstreckt.
22. Rekombinante Nucleinsäure, die mindestens eine der Nucleotidsequenzen nach einem der Ansprüche 13 bis 21, eingebaut in eine heterologe Nucleinsäure enthält.
23. DNA- oder RNA-Primer, der eine der nachfolgenden Sequenzen hat:
A(i) CAGCTTGTTGACAGGGTTCGTGGC
A(ii) GGTTCGTGGCGCCGTCACG
A(iii) CGTCGCGCGCCTAGTGTCGG
A(iv) CGGCGCCGTCGGTGGCACGGCGA
A(v) CGTCGGCGCGGCCCTAGTGTCGG
B TCGCCCGCCCTGTACCTG
C GCGCTGACGCTGGCGATCTATC
D CCGCTGTTGAACGTCGGGAAG
E AAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAAC
F(O ACGGCACTGGGTGCCACGCCCAAC
F(ii) ACGCCCAACACCGGGCCCGCCGCA
F(iii) ACGGGCACTGGGTGCCACGCCCAAC
F(iv) ACGCCCCAACACCGGGCCCGCGCCCCA
24. DNA- oder RNA-Primer-Paar, bestehend aus einer der Nucleotidsequenzen A(i), A(ii), A(iii), A(iv), A(v), B, C, D, E, F(i), F(ii), F(iii) oder F(iv) in Kombination mit der komplementären Sequenz einer anderen Nucleotidsequenz, die A, B, C, D, E oder F ist, wobei A für eine der Sequenzen A(O, A(ii), A(iii), A(iv) und A(v) und F für eine der Sequenzen F(O, F(ii), F(iii) und F(iv) steht; und A(O, A(ii), A(iii), A(iv), A(v), B, C, D, E, F(i), F(M), F(iii) und F(iv) dieselbe Bedeutung wie in Anspruch 11 haben; und vorzugsweise aus den folgenden Nucleotidsequenzen:
A(i)
oder A(ii) oder A(iii) und der Komplementär-Sequenz von B; oder A(iv) oder A(v) A(I)
oder A(ii) oder A(iii) und der Komplementär-Sequenz von C; oder A(iv) oder A(v)
B und der Komplementär-Sequenz von C;
und der Komplementär-Sequenz von F;
und der Komplementär-Sequenz von D;
und der Komplementär-Sequenz von B;
und der Komplementär-Sequenz von D; und der Komplementär-Sequenz von E; und der Komplementär-Sequenz von F; und der Komplementär-Sequenz von D; und der Komplementär-Sequenz von E; und der Komplementär-Sequenz von F; u nd der Komplementär-Sequenz von E; undderKomplementär-Sequenzvon F; oder und der Komplementär-Sequenz von F.
25. Rekombinanter Vektor, insbesondere zur Clonierung und/oder Expression, der vorzugsweise ein Plasmid, ein Cosmid oder ein Phage ist und in einer derfürdieReplikation nicht essentiellen Stellen eine rekombinante Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 21 enthält.
26. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 25, enthaltend in einer der für die Replikation nicht essentiellen Stellen für die Expression von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in einem zellulären Wirt notwendige Elemente und vorzugsweise einen Promotor, der von der Polymerase des zellulären Wirts erkannt wird, vorzugsweise einen induzierbaren Promotor und vorzugsweise eine Signalsequenz und/oder eine Ankersequenz.
27. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 26, enthaltend die zur Expression einer der in den Vektor eingebauten Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 9 in E. coli erforderlichen Elemente und insbesondere die für die Expression des ß-Galactosidase-Gens oder eines Teils davon erforderlichen Elemente.
28. Zellulärer Wirt, der mit einem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 25 bis transformiert ist, enthaltend die zur Expression der Nucleotidsequenz, die das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 codiert, in diesem Wirt notwendigen Regulationselemente.
29. Zellulärer Wirt nach Anspruch 28, der ein Bakterium, z. B. E. coli, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 25, oder ein Eukaryont, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 25 ist.
30. Expressionsprodukt einer Nucleinsäure, die von einem transformierten zellulären Wirt nach Anspruch 28 oder 29 exprimiert wird.
31. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein rekombinantes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 gerichtet ist.
32. Nucleinsäure-Sonden, die mit einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 21 oder deren Komplementär-Sequenz hybridisieren, insbesondere die Sonden, die eine der folgenden Nucleotidsequenzen haben:
Sonden A(i), A(ii), A(iii) and A(iv)
A(i) CAGCTTGTTGACAGGGTTCGTGGC;
A(i) CAGCTTGTTGACAGGGTTCGTGGC;
A(ii) GGTTCGTGGCGCCGTCACG;
A(iii) CGTCGCGCGCCTAGTGTCGG;
A(iv) CGGCGCCGTCGGTGGCACGGCGA;
A(v) CGTCGGCGCGGCCCTAGTGTCGG;
A(iii) CGTCGCGCGCCTAGTGTCGG;
A(iv) CGGCGCCGTCGGTGGCACGGCGA;
A(v) CGTCGGCGCGGCCCTAGTGTCGG;
Sonde В
TCGCCCGCCCTGTACCTG;
SondeС
GCGCTGACGCTGGCGATCTATC;
SondeD
CCGCTGTTGAACGTCGGGAAG;
Sonde E
AAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAAC;
Sonden F(i) and F(H)
F(i) ACGGCACTGGGTGCCACGCCCAAC;
F(ii) ACGCCCAACACCGGGCCCGCCGCA;
F(iii) ACGGGCACTGGGTGCCACGCCCAAC;
F(iv) ACGCCCCAACACCGGGCCCGCGCCCCA;
oder eine der dazu komplementären Nukleotidsequenzen.
33. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei denen man die folgenden Schritte durchführt:
- Züchtung eines mit einem geeigneten, eine Nucleinsäurenach einem der Ansprüche 12 bis 22 enthaltenden Vektor transformierten zellulären Wirts in einem geeigneten Medium; und
- Isolierung des von dem transformierten zellulären Wirt hergestellten Polypeptids aus dem Kulturmedium.
34. Verfahren zur In-vitro-Diagnose von Tuberkulose bei einem Patienten, der für Infektionen mit Mycobacterium tuberkulosis anfällig ist, das die nachfolgenden Schritte umfaßt:
- Amplifikation, soweit möglich, der Nucleotidsequenzen nach einem der Ansprüche 12 bis 22, die in einer biologischen Probe eines Patienten enthalten sind, mit einem Primer-Paar nach Anspruch 24;
- In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einer Nucleinsäure-Sonde nach Anspruch 32 unter Bedingungen, die die Bildung eines Hybridisierungs-Komplexes der Sonde mit der Nucleotidsequenz ermöglichen; und
- Nachweis des möglicherweise gebildeten Hybridisierungs-Komplexes.
35. Verfahren zur In-vitro-Diagnose von Tuberkulose bei einem Patienten, der für Infektionen mit Mycobacterium tuberkulosis anfällig ist, wobei man
- die biologische Probe des Patienten mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11 unter Bedingungen in Kontakt bringt, die eine immunologische In-vitro-Reaktion des Polypeptids mit dem in der biologischen Probe vorkommenden Antikörpern ermöglichen; und
- den möglicherweise gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex in-vitro nachweist.
36. Verfahren zur In-vitro-Diagnose von Tuberkulose bei einem Patienten, der für Infektionen mit Mycobacterium tuberkulosis anfällig ist, das die folgenden Schritte umfaßt:
- In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einem geeigneten Antikörper nach Anspruch 31 unter Bedingungen, die eine immunologische In-vitro-Reaktion des Antikörpers mit den in der biologischen Probe vorkommenden M-tuberkulosis-Antigenen ermöglichen; und
- In-vitro-Nachweis des möglicherweise gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes.
37. Kit für ein diagnostisches In-vitro-Verfahren nach Anspruch 34 zum Nachweis von Tuberkulose bei einem Patienten, der für Infektionen mit Mycobacterium tuberkulosis anfällig ist, enthaltend
- eine bestimmte Menge einer Nucleinsäure-Sonde nach Anspruch 32;
- vorzugsweise das geeignete Medium, das eine Hybridisierungsreaktion der nachzuweisenden Sequenz mit der Sonde ermöglicht;
- vorzugsweise Reagenzien, die den Nachweis des Hybridisierungskomplexes, der sich während der Hybridisierungsreaktion zwischen der Nucleotidsequenz und der Sonde gebildet hat, ermöglichen.
38. Kit für ein diagnostisches In-vitro-Verfahren nach Anspruch 35 zum Nachweis von Tuberkulose bei einem Patienten, der für Infektionen mit Mycobacterium tuberculosis anfällig ist, enthaltend
- ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
- Reagenzien, die das Zustandekommen der immunologischen Reaktion in einem Medium ermöglichen; und
- Reagenzien, die den Nachweis des durch die immunologische Reaktion gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes ermöglichen und vorzugsweise eine Markierung haben oder von einem markierten Reagens erkannt werden, besonders dann, wenn das Polypeptid selbst nicht markiert ist.
39. Kit für ein diagnostisches In-vitro-Verfahren nach Anspruch 36 zum Nachweis von Tuberkulose bei einem Patienten, der für Infektionen mit Mycobacterium tuberculosis anfällig ist, enthaltend
- einen Antikörper nach Anspruch 31;
- Reagenzien, die das Zustandekommen der immunologischen Reaktion in einem Medium ermöglichen; und
- Reagenzien, die den Nachweis des durch die immunologische Reaktion gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes ermöglichen und vorzugsweise eine Markierung haben oder von einem markierten Reagens erkannt werden, besonders dann, wenn der Antikörper selbst nicht markiert ist.
40. ImmunogeneZusammensetzung, enthaltend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
41. Impfstoff-Zusammensetzung, die außer anderen immunogenen Stoffen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder das Expressionsprodukt nach Anspruch 30 enthält, gegebenenfalls gekoppelt an ein natürliches Protein oder ein synthetisches Polypeptid mit einem ausreichenden Molekulargewicht, so daß das Konjugat in vivo die Herstellung von Mycobacterium tuberculosis neutralisierenden Antikörpern oder in vivo eine zelluläre Immunantwort durch Aktivierung von M. tuberculosis-Antigen-spezifischenT-Zellen induzieren kann.
42. Verfahren zur enzymatischen Amplizierung einer Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 22 und zum Nachweis der amplizierten Nucleotidsequenz, wobei
- die Amplifizierung mit der PCR-Technik unter Verwendung eines Primer-Paares erfolgt und das durch PCR amplifizierte Produkt durch eine Hybridisierungsreaktion mit einer Sonde nachgewiesen wird, die ein mindestens 10 Nucleotide umfassendes Oligonucleotid ist, dessen Sequenz zwischen den beiden PCR-Primern, die zur Amplifikation der Nucleotidsequenz verwendet worden sind, vorkommt;
- das Primer-Paar und die verwendete Sonde vorzugsweise die nachfolgenden Elemente sind; Primer-Paar
P1 GAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCG
P 2 compl. GTACCACTCGAACGCCGGGGTGTTGAT
Sonde B
TCGCCCGCCCTGTACCTG
Primer-Paar
P1 GAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCG
P3compl. TCCCACTTGTAAGTCTGGCA
Sonde B
TCGCCCGCCCTGTACCTG
Primer-Paar
P1 GAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCG
P4compl. CGGCAGCTCGCTGGTCAGGA
Sonde B
TCG CCCG CCCTG TACCTG
Primer-Paar
P1 GAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCG
P5compl. GCGTCACCCATCGCCAGGCCGATCAGG
Sonde B
TCGCCCGCCCTGTACCTG or
Sonde C
GCGCTGACGCTGGCGATCTATC
Primer-Paar
P1 GAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCG
РбсотрІ. GCGCCCCAGTACTCCCAGCTGTGCGT
Sonde B
TCGCCCGCCCTGTACCTG or
Sonde С
GCGCTGACGCTGGCGATCTATC or Sonde D CCGCTGTTGAACGTCGGGAAG or Sonde E AAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAAC
Primer-Paar
P 2 ATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTAC
P5compl. GCGTCACCCATCGCCAGGCCGATCAGG Sonde C GCGCTGACGCTGGCGATCTATC
Primer-Paar
P 2 ATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTAC
P6 compl. GCGCCCCAGTACTCCCAGCTGTGCGT Sonde C GCGCTGACGCTGGCGATCTATC orSonde D CCGCTGTTGAACGTCGGGAAG or Sonde E AAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAAC
Primer-Paar
P3 TGCCAGACTTACAAGTGGGA
P 5 compl. GCGTCACCCATCGCCAGGCCGATCAGG Sonde C GCGCTGACGCTGGCGGATCTATC
Primer-Paar
P3 TGCCAGACTTACAAGTGGGA
P6compl. GCGCCCCAGTACTCCCAGCTGTGCGT Sonde C GCGCTGACGCTGGCGATCTATC or Sonde D CCGCTGTTGAACGTCGGGAAG or Sonde E AAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAAC
Primer-Paar
P4 TCCTGACCAGCGAGCTGCCG
P5compl. GCGTCACCCATCGCCAGGCCGATCAGG Sonde C GCGCTGACGCTGGCGATCTATC
Primer-Paar
P4 TCCTGACCAGCGAGCTGCCG
P6compl. GCGCCCCAGTACTCCCAGCTGTGCGT Sonde C GCGCTGACGCTGGCGATCTATC or Sonde D CCGCTGTTGAACGTCGGGAAG or Sonde E AAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAAC
Primer-Paar
P5 CCTGATCGGCCTGGCGATGGGTGACGC
P6compl. GCGCCCCAGTACTCCCAGCTGTGCGT Sonde D CCGCTGTTGAACGTCGGGAAG or Sonde E AAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAAC
oder das Primer-Paar vorzugsweise ein Primer-Paar nach Anspruch 24 ist und die Sonde aus einemOligonucleotid mit mindestens 10 Nucleotiden besteht, dessen Sequenz zwischen den beiden das Primer-Paar bildenden PCR-Primern, die zur Amplifizierung der Nucleotidsequenz verwendet worden sind, vorkommt.
43. Vektor-Sequenz, die ein Teil eines rekombinanten Vektors nach Anspruch 25 ist und die in Fig. 10 b, Fig. 11 b oder Fig. 12 b dargestellte Nucleinsäure-Sequenz hat.
44. Plasmide, enthaltend die Nucleinsäure-Sequenz aus Fig. 10b, Fig. 11 b oder Fig. 12b.
45. Peptide nach Anspruch 1, vorteilhaft verwendbar zur Herstellung von Antikörpern, insbesondere von monoclonalen Antikörpern, die eine der folgenden Aminosäuresequenzen haben: Aminosäure- Aminosäure-Position Position
(NH2-Terminus) (COOH-Terminus)
12 QVPSPSMGRDIKVQFQSGGA 31
36 LYLLDGLRAQDDFSGWDINT 55
77 SFYSDWYQPACRKAGCQTYK 96
101 LTSELPGWLQANRHVKPTGS 120
175 KASDMWGPKEDPAWQRNDPL 194
211 CGNGKPSDLGGNNLPAKFLE 230
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF04 | In force in the year 2004 |
Expiry date: 20100920 |