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DD249768A5 - METHOD FOR DETERMINING A PARTNER OF AN IMMUNE REACTION - Google Patents

METHOD FOR DETERMINING A PARTNER OF AN IMMUNE REACTION Download PDF

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DD249768A5
DD249768A5 DD86294303A DD29430386A DD249768A5 DD 249768 A5 DD249768 A5 DD 249768A5 DD 86294303 A DD86294303 A DD 86294303A DD 29430386 A DD29430386 A DD 29430386A DD 249768 A5 DD249768 A5 DD 249768A5
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DD
German Democratic Republic
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value
active agent
reagent
block copolymers
carbon atoms
Prior art date
Application number
DD86294303A
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German (de)
Inventor
Urban Schmitt
Gerd Kleinhammer
Rolf Deeg
Original Assignee
��@���������@�������k��
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Publication date
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    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract

A method and a reagent for the determination of a partner in an immunological reaction by the immunoassay principle at a temperature between 15 and 40 DEG C is described, where one of the reactants is present in solid phase, and a surface-active agent with an HLB above 20 is added. <IMAGE>

Description

I 3 / 3 I 3/3

H(OCH0CH9) (OCH-CH0), (CH0-CHO) (CH0CH0O) "~HH (OCH 0 CH 9) (OCH CH-0), (0 CH -CHO) (CH 0 CH 0 O) "~ H

N-CH-CH-NN-CH-CH-N

H(CCH0CH0) (OCH-CH2) (CH0-CHO) (CH0CH0O) HH (CCH 0 CH 0) (OCH-CH 2) (CH 0 -CHO) (CH 0 CH 0 O) H

" l^iLLY '*""YLL Y '*"

ist, worin χ einen Wert zwischen 10 und 50, bevorzugt zwischen 15 und 30 undy einen Wert zwischen 30 und 150, bevorzugt zwischen 40 und 120 hat.in which χ has a value between 10 and 50, preferably between 15 and 30 and y has a value between 30 and 150, preferably between 40 and 120.

19. Reagenz nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung einen Anteil an Poiyoxyethylengruppen von 50 bis 90% hat.19. A reagent according to claim 18, characterized in that the compound has a proportion of Poiyoxyethylengruppen from 50 to 90%.

20. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es noch ein System zum Nachweis einer als Markierung verwendeten Enzymaktivität enthält.20. A reagent according to any one of the preceding claims, characterized in that it also contains a system for detecting an enzyme activity used as a label.

Hierzu 1 Seite TabelleSee 1 page table

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Partners einer Immunreaktion nach dem Immunoassay-Prinzip bei einer Temperatur zwischen 15 und 400C, wobei einer der Reaktionspartner in fester Phase vorliegt.The invention relates to a method for determining a partner of an immune reaction according to the immunoassay principle at a temperature between 15 and 40 0 C, wherein one of the reactants is in the solid phase.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Verfahren zur Immunbestimmung sind weitverbreitet. Dabei gibt es sowohl Verfahren in homogener als auch in heterogener Phase. Bei der Ausführungsform mit der heterogenen Phase wird einer der Reaktionspartner an einen Träger gebunden. Zur Durchführung der Immunbestimmung in heterogener Phase sind nun verschiedene Verfahrensvarianten bekannt, z.B. das Sandwich-Verfahren, das indirekte Verfahren und das Kompetitionsverfahren. Beim Sandwich-Verfahren wird ein Antikörper an den Träger gebunden, die Testlösung wird zugegeben, wobei das in der Testlösung enthaltene spezifische Antigen an den Antikörper gebunden wird. Dann wird ein markierter spezifischer Antikörper für den Antigen-Antikörper-Komplex, oder für Teile des Komplexes, zugegeben, der dann an den Komplex bindet. Über den markierten Antikörper kann man dann die Menge an Antigen berechnen. Beim indirekten Verfahren wird ein Antigen an dem Trägermaterial gebunden. Man gibt Testlösung dazu, wobei der in der Testlösung enthaltene, für das adsorbierte Antigen spezifische Antikörper mit dem Antigen reagiert. Bei Zugabe eines markierten Antiglobulins bindet das Antiglobulin an den Antigen-Antikörper-Komplex, und die Menge des unbekannten Antikörpers im Testserum kann wiederum über das markierte Antiglobulin bestimmt werden. Bei dem Kompetitionsverfahren wird einer der gebundenen Partner der Immunreaktion an das Trägermaterial gebunden. Man gibt dann eine Lösung dazu; die sowohl den in unbekannter Menge vorliegenden anderen Partner der Immunreaktion enthält, als auch eine bekannte Menge an markiertem anderem Partner der Immunreaktion. Beide Partner, der markierte und der unmarkierte, konkurrieren um die •Bindungsstellen des am Träger gebundenen Partners der Immunreaktion. Zu einer zweiten Probe gibt man eine Standardlösung dazu, die nur markierten Partner enthält. Mankannnun durch Bestimmung der markierten Partner in Standard und Probe aus der Differenz die Menge an unbekanntem Reaktionspartner berechnen.Methods for immunological determination are widespread. There are both homogeneous and heterogeneous phase processes. In the heterogeneous phase embodiment, one of the reactants is bound to a support. To carry out the immuno determination in heterogeneous phase, various process variants are now known, e.g. the sandwich method, the indirect method and the competition method. In the sandwich method, an antibody is bound to the carrier, the test solution is added, whereby the specific antigen contained in the test solution is bound to the antibody. Then, a labeled specific antibody for the antigen-antibody complex, or for parts of the complex, is added, which then binds to the complex. The labeled antibody can then be used to calculate the amount of antigen. In the indirect method, an antigen is bound to the carrier material. Test solution is added thereto, the antibody specific for the adsorbed antigen contained in the test solution reacting with the antigen. Upon addition of a labeled antiglobulin, the antiglobulin binds to the antigen-antibody complex and the amount of unknown antibody in the test serum can again be determined via the labeled antiglobulin. In the competition method, one of the bound partners of the immune reaction is bound to the support material. You then give a solution; which contains both the other part of the immune reaction present in an unknown amount, as well as a known amount of labeled other partner of the immune reaction. Both partners, the labeled and the unlabeled, compete for the binding sites of the carrier-bound partner of the immune response. For a second sample add a standard solution containing only marked partners. Mankannnun by determining the labeled partners in standard and sample from the difference calculate the amount of unknown reactant.

Weitere Möglichkeiten zur Bestimmung ergeben sich bei einem mindestens bivalenten Antigen mit Hilfe von drei Rezeptoren, die Antikörper oder Antikörperfragmente sein können. Bei der Durchführung eines Immunoassays mit drei Rezeptoren in heterogener Phase ist eine der drei Rezeptoren immer unlöslich, während die anderen zwei löslich sind, wobei einer der beiden löslichen Rezeptoren markiert ist, während der andere nicht markiert ist. Der unlösliche Rezeptor ist dann gegen den nicht markierten löslichen Rezeptor gerichtet. Zur Durchführung der Bestimmung sind vershiedene Verfahrensvarianten möglich, sowohl einstufige, als auch mehrstufige, in denen die Zugabe der einzelnen Rezeptoren variiert werden kann.Further possibilities for the determination arise in the case of an at least bivalent antigen with the aid of three receptors, which may be antibodies or antibody fragments. When performing an immunoassay with three heterogeneous phase receptors, one of the three receptors is always insoluble, while the other two are soluble, with one of the two soluble receptors labeled while the other is not labeled. The insoluble receptor is then directed against the unlabeled soluble receptor. To carry out the determination, various process variants are possible, both single-stage and multi-stage, in which the addition of the individual receptors can be varied.

Eine weitere Verfahrensvariante besteht darin, das zu bestimmende Antigen in der Probe im ersten Schritt gleichzeitig mit einem löslichen, nicht markierten Rezeptor und einem löslichen markierten Rezeptor in Lösung zusetzen und dann den entstehenden löslichen Sandwich-Komplex in einem zweiten Schritt durch Binden an einen unlöslichen Rezeptor unlöslich zu machen. Zur Markierung der Reaktionspartner sind verschiedene Möglichkeiten bekannt. So kann einer der Reaktionspartner radioaktiv markiert werden, wobei dann die gemessene Radioaktivität eine Berechnung des zu bestimmenden Reaktionspartners erlaubt. Weiterhin kann mit einem Enzym markiert werden. Es wird dann nach Durchführung der üblichen Schritte der Immunbestimmung ein Substrat für das Enzym, das als Markierung verwendet wird, zugegeben und dann über dessen Reaktion die Konzentration des zu bestimmenden Reaktionspartners berechnet. Eine weitere Möglichkeit ist die Markierung mit einer fluoreszierenden Substanz, wobei die Fluoreszenz dann direkt bestimmt werden kann oder mit einem Farbstoff, wobei die Auswertung spektro-oder photometrisch erfolgt.Another variant of the method consists in adding the antigen to be determined in the sample in the first step simultaneously with a soluble, unlabelled receptor and a soluble labeled receptor in solution and then the resulting soluble sandwich complex in a second step by binding to an insoluble receptor insoluble. To mark the reactants, various possibilities are known. Thus, one of the reactants can be radioactively labeled, in which case the measured radioactivity allows a calculation of the reactant to be determined. Furthermore, it can be labeled with an enzyme. It is then after carrying out the usual steps of immunoassay, a substrate for the enzyme, which is used as a label added and then calculated by its reaction, the concentration of the reactant to be determined. Another possibility is the labeling with a fluorescent substance, wherein the fluorescence can then be determined directly or with a dye, the evaluation is carried out spectro-or photometrically.

Immunassays weisen wachsende Bedeutung auf, da sie eine sehr große Empfindlichkeit haben und mit Hilfe dieser Methode Substanzen bis in den Picog ramm bereich erfaßt werden können. Immun bestimmung en in heterogener Phase werden jedoch in unterschiedlichem Ausmaß durch nicht Analyt-spezifische Interferenzen, sogenannte unspezifische Störungen, verfälscht, die schon als „Matrixeffekt", „Background" und „unspezifische Bindung" bezeichnet wurden. Besonders störend macht sich bemerkbar, daß die Wiederfindung der zu bestimmenden Substanz bei Plasmaproben deutlich geringerals bei Serumproben ist. Diese unspezifischen Störungen sind teilweise auf unbekannte Probenbestandteile zurückzuführen. Ebenso kann sich die Empfindlichkeit der Immunbestimmung durch unspezifische Wechselwirkungen der Störfaktoren mit den eingesetzten Immunreagenzien oder mit dem Analyten verschlechtern. Es konnte festgestellt werden, daß unspezifische Störungen bei Immunbestimmungen im Plasma stärker auftreten als bei Immunbestimmungen im Serum. Deshalb ist auch die Wiederfindung bei Bestimmungen im Plasma wesentlich geringer als im Serum, während bei kompetitiven Tests die Wiederfindung im Plasma zu hoch ist. Die Ursache dieser Störung wurde da her auf die Gerinnungsproteine, die im Plasma zu hoch sind. Die Ursache dieser Störung wurde daher auf die Gerinnungsproteine, die im Plasma noch vorhanden sind, im Serum jedoch nicht, zurückgeführt. Die Gerinnungsproteine lagern sich an die Oberfläche des Trägermaterials an und behindern damit die Antigen-Antikörper-Reaktion bzw. die Antigen-Konjugatreaktion.Immunoassays are growing in importance because they have a very high sensitivity and with the help of this method substances can be detected up to the Picog ramm area. Immune determinations in a heterogeneous phase, however, are falsified to varying degrees by non-analyte-specific interferences, so-called non-specific disorders, which have already been referred to as "matrix effect", "background" and "unspecific binding" These unspecific disorders may be due in part to unknown components of the sample, and the susceptibility of the immunoassay may be impaired by non-specific interactions of the interfering factors with the immunoreagents or analyte used. That non-specific interference in immunological determinations in plasma is more pronounced than in immunological determinations in serum Therefore, the recovery in determinations in the plasma is much lower than in the serum, while in competitive tests the Wieder is too high in the plasma. The cause of this disorder was because of the clotting proteins, which are too high in the plasma. The cause of this disorder was therefore attributed to the coagulation proteins, which are still present in the plasma, but not in the serum. The clotting proteins attach themselves to the surface of the carrier material and thus hinder the antigen-antibody reaction or the antigen-conjugate reaction.

Es war bisher bekannt, zur Verringerung unspezifischer Wechselwirkungen bei Immunbestimmungen dem Inkubationsmilieu bestimmte Detergenzien zuzusetzen. Ein Nachteil dieser Methode besteht jedoch darin, daß auch die erwünschte, d.h. die analytspezifische Antigen-Antikörper-Reaktion in ihrem Ausmaß beeinflußt wird, woraus wiederum eine Abnahme der Empfindlichkeit resultiert. Außerdem trat bei der bekannten Anwendung von Detergenzien das Problem auf, daß bei Solidphase-lmmunoassays die oberflächenaktive Substanz das adsorptiv gebundene Molekül von der festen Oberfläche verdrängen konnte. Die Funktion des Immunoassays.wird dadurch entscheidend beeinträchtigt.It has hitherto been known to add certain detergents to the incubation environment to reduce nonspecific interactions in immunological determinations. However, a disadvantage of this method is that also the desired, i. the analyte-specific antigen-antibody reaction is affected in its extent, which in turn results in a decrease in sensitivity. In addition, in the known application of detergents there has been the problem that in solid phase immunoassays, the surfactant could displace the adsorptively bound molecule from the solid surface. The function of Immunoassays.wird thereby impaired.

So war bekannt, daß Detergenzien wie Tween 20 im Inkubationspuffer die Plasmagängigkeit herstellen. Detergenzien dieser Art haben jedoch den Nachteil, daß sie in Konzentrationen, die höher sind als 0,01 %, den an das Trägermaterial gebundenen Reaktionspartner ablösen, was wiederum zu einer negativen Beeinflussung der Immunbestimmung führt.Thus, it has been known that detergents such as Tween 20 produce plasma binding in the incubation buffer. Detergents of this type, however, have the disadvantage that, in concentrations higher than 0.01%, they detach the reactant bound to the support material, which in turn leads to a negative influence on the immunoassay.

Ziel der ErfindungObject of the invention

ZielderErfindungistdie Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Bestimmung eines Partners einer Immunreaktion, bei dem nicht analytspezifische und daher unerwünschte unspezifische Störungen bei Immunbestimmungen in heterogener Phase unterdrückt werden. Ferner ist es ein Ziel, ein derartiges Verfahren zu finden, bei dem weder die Reaktion zwischen Antikörper und Antigen/Hapten beeinträchtigt wird, noch adsorptiv gebundene Reaktionsteilnehmer von dem Träger desorbiert werden, noch, wenn als Markierung enzymmarkierte Immunreagenzien verwendet werden, die enzymatische Aktivität reduziert wird. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist auch eine Beschleunigung der Immunreaktion und damit eine Verkürzung der Analysedauer.The object of the invention is to provide an improved method for the determination of a partner of an immune reaction in which non-analyte-specific and therefore undesirable non-specific disorders are suppressed in heterogeneous phase immunoassays. Further, it is an object to find such a method in which neither the reaction between antibody and antigen / hapten is impaired, nor adsorptively bound reactants are desorbed from the carrier, nor when enzyme-labeled immunoreagents are used as the label that reduces enzymatic activity becomes. Another object of the invention is also an acceleration of the immune response and thus a shortening of the analysis time.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Reaktionsbedingungen zu schaffen, mit denen die Ziele der Erfindung erreicht werden.The invention has for its object to provide reaction conditions with which the objectives of the invention are achieved.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Bestimmung eines Partners einer Immunreaktion nach dem Immunoassay-Prinzip bei einer Temperatur zwischen 15 und 40°C zur Verfugung gestellt, wobei einer der Reaktionspartner in fester Phase vorliegt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man dem Inkubationsmedium der Immunreaktion ein oberflächenaktives Mittel mit einem HLB-Wertvon mehr als 20 zusetzt.According to the invention, a method for determining a partner of an immune reaction according to the immunoassay principle is provided at a temperature between 15 and 40 ° C, wherein one of the reactants is in the solid phase. The method according to the invention is characterized in that a surface-active agent with an HLB value of more than 20 is added to the incubation medium of the immune reaction.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß Detergenzien mit einem HLB-Wert, der größer ist als 20, unerwünschte Reaktionen bei Immunbestimmungen unterdrücken können und gleichzeitig weder die Reaktion zwischen Antikörper und Antigen bzw." Hapten beeinträchtigen, noch eine Desorption der adsorptiv gebundenen Reaktionspartner bewirken. Auch eine Beeinflussung der Enzymaktivität wurde nicht festgestellt. Darüber hinausführt der Zusatz des erfindungsgemäßen Mittels zu einer Beschleunigung der Immunreaktion.It has surprisingly been found that detergents with an HLB value greater than 20 can suppress undesired reactions in immunological determinations and at the same time neither impair the reaction between antibody and antigen or hapten nor cause desorption of the adsorptively bound reactants In addition, the addition of the agent according to the invention leads to an acceleration of the immune reaction.

Bevorzugt werden als oberflächenaktive Mittel mit einem HLB-Wert über 20 nichtionische Blockcopolymere Tenside auf Basis von Alkylenoxiden mit 2 bis 4 C-Atomen, die gegebenenfalls als Zentral molekül ein Alkylendiamin mit 2 bis 4 C-Atomen enthalten können, eingesetzt.Surfactants based on alkylene oxides having 2 to 4 carbon atoms, which may optionally contain as central molecule an alkylene diamine having 2 to 4 carbon atoms, are preferably used as surfactants with an HLB value above 20 nonionic block copolymers.

Bevorzugte Blockcopolymere sind Verbindungen der allgemeinen Formel I ( Preferred block copolymers are compounds of the general formula I (

HO(CH2CH2O)a(CCHCH2O)b(CH2CH2O)aH, OH3 HO (CH 2 CH 2 O) a (CCHCH 2 O) b (CH 2 CH 2 O) a H, OH 3

bei denen a einen Wert zwischen 30 und 150 und besonders bevorzugt zwischen 60 und 100 und b einen Wert zwischen 15 und 60 besonders bevorzugt zwischen 25 und 40 annehmen kann. Diese Verbindungen werden auch als Poloxamere bezeichnet. Eine Handelsbezeichnung ist z.B. PluronicR.in which a can assume a value between 30 and 150 and particularly preferred between 60 and 100 and b a value between 15 and 60 particularly preferentially between 25 and 40. These compounds are also called poloxamers. A trade name is Pluronic R , for example.

Bei der Gruppe der Poloxamere haben sich als besonders geeignet Verbindungen erwiesen, die einen Anteil an hydrophilem Polyoxyethylen im Gesamtmolekül von 60 bis 90% haben.In the group of poloxamers, compounds which have a proportion of hydrophilic polyoxyethylene in the total molecule of 60 to 90% have proven particularly suitable.

Weiterhin bevorzugt sind Blockcopolymere mit der allgemeinen Formel Il ( Preference is furthermore given to block copolymers of the general formula II (

CH3 CH3 CH 3 CH 3

H(OCH0CH0) (OCHCH0) (CH0CHO)(CH CH O) HH (OCH CH 0 0) (0 OC) (CH 0 CHO) (CH CH O) H

ζ ζ γ ζ x-. / ^* ** J ζ ζ γ ζ x-. / ^ * ** J

N-CH0-CH0-NN-CH 0 -CH 0 -N

!H(OCH0CH0) (OCHCH0) ^ (CH0CHO)(CH0CH O) HH (OCH CH 0 0)! (OC 0) ^ (0 CH CHO) (CH CH 0 O) H

2 2 y ι 2 χ X Z\ Z Z γ 2 2 y 2 χ X Z \ ZZ γ

I CH3 CH3 I CH 3 CH 3

die als Poloxamine bezeichnet werden, worin χ die Werte 10 bis 50, besonders bevorzugt 15 bis 30 und y die Werte 30 bis 150, besonders bevorzugt 40 bis 120 annehmen kann, verwendet. Eine Handelsbezeichnung für solche Poloxamine ist z. B. TetronicR.which are referred to as poloxamines, in which χ the values of 10 to 50, more preferably 15 to 30 and y can take the values 30 to 150, particularly preferably 40 to 120 used. A trade name for such poloxamines is z. B. Tetronic R.

Unter den obengenannten oberflächenaktiven Mitteln werden solche am meisten bevorzugt, deren HLB-Wert zwischen 24 und 30 liegt.Among the above-mentioned surfactants, those whose HLB value is between 24 and 30 are most preferred.

Die oberflächenaktive Substanz wird in einer Menge von 0,1 bis 5%, bezogen auf das Gewicht des gesamten Reaktionsansatzes, eingesetzt.The surfactant is used in an amount of 0.1 to 5%, based on the weight of the entire reaction mixture.

Besonders bevorzugt werden bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung Poloxamine mit einem Anteil an hydrophilen Polyoxyethylengruppen von 50 bis 90% verwendet.More preferably, in the process of the present invention, poloxamines having a proportion of hydrophilic polyoxyethylene groups of 50 to 90% are used.

Der Zusatz des oberflächenaktiven Mittels gemäß der Erfindung bringt sowohl Vorteile beim Zusatz zu Plasma als auch beim Zusatz zu Serum. In beiden Fällen tritt eine Beschleunigung der Reaktion auf sowie eine Verhinderung der unspezifischen Störungen, insbesondere bei den hierfür besonders anfälligen Bestimmungen im Plasma.The addition of the surfactant according to the invention brings both advantages in addition to plasma and in addition to serum. In both cases, there is an acceleration of the reaction as well as a prevention of nonspecific disturbances, in particular in the case of the particularly sensitive determinations in the plasma.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf alle Plasmaarten anwendbar. So kann es sowohl für Plasma, das zur Stabilisierung mit EDTA versetzt wurde, als auch für Plasma, das mit Heparin oder Citrat versetzt wurde, verwendet werden.The inventive method is applicable to all types of plasma. Thus, it can be used both for plasma, which has been added for stabilization with EDTA, as well as for plasma, which has been treated with heparin or citrate.

Der Zusatz des oberflächenaktiven Mittels kann bei jeder für die Bestimmung verwendeten Lösung erfolgen. Bei einem zweistufigen Verfahren werden besonders gute Ergebnisse erhalten, wenn beiden Puffern, also für jede der beiden Stufen, das Detergenz zugesetzt wird. Dazu wird die feste Phase, die den einen Reaktionspartner trägt, zuerst mit einer ersten Inkubationslösung behandelt, die Puffer und Zusatzstoffe, wie z. B. IgG enthält. Danach wird gewaschen und anschließend in einer zweiten Stufe die Konjugatlösung zugesetzt und erneut inkubiert. Die Konjugatlösung enthält Konjugat und Puffer sowie gegebenenfalls weitere übliche Zusätze. Das Konjugat selbst besteht aus einem immunologischen Reaktionspartner für die zu bestimmende Substanz oder für den Festphasenpartner, z. B. einem Antikörper gegen das zu bestimmende Antigen in markiertem Zustand. Die Probelösung wird dabei zweckmäßig in den Inkubationspuffer gegeben. Gute Ergebnisse werden aber auch dann erzielt, wenn der Zusatz der oberflächenaktiven Substanz zur Inkubationslösung oder zur Konjugatlösung erfolgt.The addition of the surfactant may be made to any solution used for the determination. In a two-stage process, particularly good results are obtained when the detergent is added to both buffers, ie for each of the two stages. For this purpose, the solid phase carrying the one reactant, first treated with a first incubation solution, the buffer and additives, such as. B. IgG contains. It is then washed and then added in a second stage, the conjugate solution and incubated again. The conjugate solution contains conjugate and buffer as well as optionally other customary additives. The conjugate itself consists of an immunological reaction partner for the substance to be determined or for the solid phase partner, eg. Example, an antibody against the antigen to be determined in the labeled state. The sample solution is expediently added to the incubation buffer. However, good results are also achieved if the addition of the surface-active substance to the incubation solution or to the conjugate solution takes place.

Der Zusatz des oberflächenaktiven Mittels zur Probelösung selbst ist weniger günstig. In der fertigen Inkubationslösung muß ja eine ausreichend hohe Konzentration desselben vorliegen. Wenn nun das Mittel über die Probelösung zugegeben wird, die in nur sehr geringer Menge verwendet wird, muß die Konzentration an oberflächenaktivem Mittel darin sehr hoch sein. Bei sehr hohen Konzentrationen könnten jedoch unerwünschte Wirkungen auftreten.The addition of the surfactant to the sample solution itself is less favorable. In the finished incubation solution must indeed be present a sufficiently high concentration. Now, if the agent is added via the sample solution, which is used in only a very small amount, the concentration of surfactant therein must be very high. At very high concentrations, however, undesirable effects could occur.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ei η Reagenz verwendet, das mobilisierte und immobilisierte Partner der Immunreaktion enthält und dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein oberflächenaktives Mittel mit einem HLB-Wert von mehr als 20 enthält. Dieses Reagenz kann außerdem noch an sich übliche Inhaltsstoffe enthalten. Zweckmäßig enthält es noch Puffersubstanzen, beispielsweise Phosphatpuffer, Citratpuffer, Boratpuffer und dergleichen oder/und Rinderserumalbumin oder/und Konservierungsmittel. Wird als Markierung bei der Immunreaktion ein Enzym verwendet, so enthält das Reagenz noch ein System zum Nachweis der Enzymaktivität.To carry out the method according to the invention, a reagent is used which contains mobilized and immobilized partners of the immune reaction and which is characterized in that it contains a surface-active agent with an HLB value of more than 20. This reagent may also contain conventional ingredients. Suitably it also contains buffer substances, for example phosphate buffer, citrate buffer, borate buffer and the like and / or bovine serum albumin and / or preservatives. If an enzyme is used as a label in the immune reaction, the reagent also contains a system for detecting the enzyme activity.

Vorzugsweise enthält das Reagenz als oberflächenaktives Mittel ein nichtionisches Blockcopolymeres auf Basis von Alkylenoxiden mit 2 bis 4 C-Atomen, die gegebenenfalls ein Alkyiendiamin mit 2 bis 4 C-Atomen als Zentralmolekül enthalten.Preferably, the surfactant reagent comprises a nonionic block copolymer based on alkylene oxides having 2 to 4 carbon atoms, optionally containing an alkylene diamine having 2 to 4 carbon atoms as the central molecule.

Besonders bevorzugt enthält es als oberflächenaktives Mittel eine Verbindung der allgemeinen Formel I oder Il mit den für die Indices, a, b, χ und y angegebenen Bereichen. Besonders bevorzugt werden oberflächenaktive Mittel mit einem HLB-Wert zwischen 26 und 30 verwendet. Das oberflächenaktive Mittel ist in dem Reagenz in einer Konzentration von 0,1 bis 5% enthalten.With particular preference it contains as surface-active agent a compound of general formula I or II having the ranges indicated for the indices a, b, χ and y. Particularly preferably, surfactants having an HLB value between 26 and 30 are used. The surfactant is contained in the reagent in a concentration of 0.1 to 5%.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenz gelingt es die Wiederfindung bei Immunbestimmungen in heterogener Phase zu verbessern. Durch den Zusatz des erfindungsgemäß verwendeten Mittels wird ferner die Immunreaktion beschleunigt.With the method and reagent according to the invention it is possible to improve the recovery in immunoassays in a heterogeneous phase. The addition of the agent used according to the invention further accelerates the immune reaction.

Darüber hinaus werden unerwünschte Nebenreaktionen unterdrückt wie insbesondere die unspezifische Anlagerung von Konjugat an die feste Phase, ohne daß es zu einer verstärkten Ablösung der gebundenen Reaktionspartner kommt.In addition, undesirable side reactions are suppressed, in particular the non-specific addition of conjugate to the solid phase, without there being any increased detachment of the bound reactants.

Ausführungsbeispielembodiment

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.The invention is explained in more detail below with reference to some examples.

Beispiel 1example 1

Es wurden Kunststoff röhrchen mit Antikörper gegen TSH, die mittels der Chloramin-T-Methode mit 125 J markiert waren, in Phosphatpuffer mit 40mmol/l bei einem pH7,4 beladen. Die Konzentration war 2/itg/ml. Nachbeladen wurde mit einer Lösung aus 0,9% Natriumchlorid und 0,3% Rinderserumalbumin, Typ II. Das Beladevolumen lag bei 1,5 ml. die Inkubationszeit für die Beladung betrug 22 Stunden. Danach wurde mit 1,8m! einer Nachbeladelösung V2 Stunde lang nachbeladen. Die Röhrchen wurden 24 Stunden getrocknet mit der Röhrchenöffnung nach oben. Die Rörchen wurden dan mit Detergenz behandelt. Bei diesen Röhrchen wurde dann die Desorption des Antigens bzw. des Antigen-Antikörper-Komplexes gemessen. Die Ergebnisse sind derfolgenden Tabelle I zu entnehmen.Plastic tubes with antibody to TSH labeled with 125 I by the chloramine T method were loaded into phosphate buffer at 40 mmole / L at pH 7.4. The concentration was 2 / itg / ml. The loading was with a solution of 0.9% sodium chloride and 0.3% bovine serum albumin, type II. The loading volume was 1.5 ml. The incubation time for the loading was 22 hours. After that, with 1.8m! reloading a post-load solution for V2 hours. The tubes were dried for 24 hours with the tube up. The slides were then treated with detergent. In these tubes, the desorption of the antigen or the antigen-antibody complex was then measured. The results are shown in the following Table I.

Tabelle 1Table 1

Detergenzdetergent Konzentrationconcentration Desorptiondesorption Antigenantigen Wand-AKWall AK 1,2 %1.2% Pufferlösungbuffer solution - 3,2%3.2% 74%74% Tween 20 (V)Tween 20 (V) 1%1% 58%58% 65%65% Tween20(V)Tween 20 (V) 0,1 %0.1% 50%50% 45%45% Tween 20 (V)Tween 20 (V) 0,01 %0.01% 30 %30% 85%85% Triton X100 (V)Triton X100 (V) 1%1% 61 %61% 89%89% Triton X100 (V)Triton X100 (V) 0,1 %0.1% 62%62% 78%78% Triton X100 (V)Triton X100 (V) 0,01 %0.01% 53%53% 85%85% PluronicL64(V)PluronicL64 (V) 1%1% 64%64% 39 %39% PluronicL64(V)PluronicL64 (V) 0,1 %0.1% 21%21% 10%10% PluronicL64(V>PluronicL64 (V> 0,01 %0.01% 6%6% 7%7% PluronicF68(E)PluronicF68 (E) 1%1% 9%9% 6%6% PluronicF68(E)PluronicF68 (E) 0,1 %0.1% 5%5% 5%5% PluronicF68(E)PluronicF68 (E) 0,01 %0.01% 5%5% - Tetronic707 (E)Tetronic707 (E) 1%1% 5%5% - Tetronic707 (E)Tetronic707 (E) 0,1 %0.1% 4%4% - Tetronic707 (E)Tetronic707 (E) 0,01 %0.01% 4%4%

V = Vergleich, oberflächenaktives Mittel mit HLB < 20V = comparison, surfactant with HLB <20

E = erfindungsgemäßes oberflächenaktives Mittel mit HLB >E = surface-active agent according to the invention with HLB>

Beispiel 2Example 2

Es wurde die Wiederfindung im TSH-Test bei Verwendung verschiedener Detergenzien überprüft. Dazu wurde mit EDTA, mit Heparin bzw. mit Citrat stabilisiertes Plasma verwendet. Gleichzeitig wurde der TSH-Test mit Serum durchgeführt. Bei diesem Test war die Wiederfindung 100%. Die für verschiedene Detergenzien erhaltenen Werte sind der folgenden Tabelle zu entnehmen:The recovery in the TSH test using different detergents was checked. Plasma was used with EDTA, with heparin or with citrate. At the same time, the TSH test was carried out with serum. In this test the recovery was 100%. The values obtained for various detergents are shown in the following table:

Tabelle 2Table 2

Detergenzdetergent

Detergenzkonzentration Inkubationspuffer KonjugatpufferDetergent concentration Incubation buffer Conjugate buffer

Wiederfindungrecovery

EDTAEDTA

Plasmaplasma

Heparin PlasmaHeparin plasma

Citrat PlasmaCitrate plasma

ohne-without- - TritoxinX405TritoxinX405 0,1 %0.1% Tween 20Tween 20 0,005%0.005% PluronicF68PluronicF68 1%1% PluronicF68PluronicF68 1%1% PluronicF87PluronicF87 1%1% PluronicF87PluronicF87 1%1% PluronicF88PluronicF88 1%1% PluronicF88PluronicF88 1%1% PluronicF88PluronicF88 1%1% PluronicF98PluronicF98 1 %1 % PluronicF98PluronicF98 - PluronicF127PluronicF127 1%1% PluronicF127PluronicF127 1%1% PluronicF38PluronicF38 1%1% PluronicF108PluronicF108 1%1% Tetronic 707Tetronic 707 1%1% Tetronic 707Tetronic 707 1%1% Tetronic 707Tetronic 707 - Tetronic 908Tetronic 908 1%1% Tetronic 908Tetronic 908 1%1% Tetronic 909Tetronic 909 1%1% Tetronic 909Tetronic 909 1%1% Tetronic 1107Tetronic 1107 1%1% Tetronic 1107Tetronic 1107 1%1% Tetronic 1307Tetronic 1307 1%1% Tetronic 1307Tetronic 1307 1%1%

1% 1% 1%1% 1% 1%

1% 2%1% 2%

1% 1%1% 1%

1% 2%1% 2%

1% 1% 1% 1%1% 1% 1% 1%

40-7040-70 40-7040-70 - 66%66% 81%81% - 88 %88% 89%89% 89%89% 98%98% 97%97% 93%93% 105%105% 98%98% 99%99% 99%99% 105%105% 100%100% 106%106% 100%100% 112%112% 106%106% 93%93% - 103%103% 92%92% - 105%105% 104%104% 105%105% 99%99% 98%98% 102%102% 98%98% 98%98% 99%99% 103%103% 98%98% - 101%101% 95%95% - 102%102% 86%86% 94%94% 105%105% 92%92% 101%101% 100%100% 97%97% 105%105% 98%98% 94%94% 102%102% 96%96% 83%83% 96%96% 98%98% 84%84% 100%100% 97%97% 94%94% 99%99% 90%90% 84%84% 95%95% 98%98% 96%96% 101%101% 110%110% 103%103% - 105%105% 99%99% - 105 %105% 96%96% - 107%107% 103%103% . ,

Serumwert = 100%Serum value = 100%

Analoge Versuche wurden auch im CEA-Test durchgeführt. Die Ergebnisse entsprachen denen im TSH-Test. Es konnte festgestellt werden, daß bei steigenden Konzentrationen an oberflächenaktivem Mittel nicht nur die Wiederfindung im Plasma steigt, sondern auch die Extinktion des Nullstandards erniedrigt wird. Das bedeutet, daß die unspezifische Konjugatbindung durch den Zusatz des oberflächenaktiven Mittels verringert wird.Analogous experiments were also carried out in the CEA test. The results were the same as in the TSH test. It has been found that as the surfactant level increases, not only does recovery in the plasma increase, but also the absorbance of the zero standard is lowered. This means that the non-specific conjugate binding is reduced by the addition of the surfactant.

Beispiel 3Example 3

Um den Einfluß von verschiedenen Detergenzien auf die unspezifische Bindung von Konjugat zu zeigen, wurden verschiedene oberflächenaktive Mittel getestet. Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle 3 zu entnehmen.To demonstrate the effect of various detergents on the non-specific binding of conjugate, various surfactants were tested. The results are shown in Table 3 below.

Tabelle 3Table 3

Detergenzdetergent Konzentrationconcentration Ext. O-StandardExt. O standard ohnewithout - 68 mE68 mE Tetronic 707Tetronic 707 1%1% 43 mE43 mE Tetronic 707Tetronic 707 2%2% 26mE26mE Tetronic 908Tetronic 908 1%1% 1OmE1OmE PluronicF68PluronicF68 2%2% 22 mE22 mE PluronicF88PluronicF88 ,2%, 2% 18mE18mE

Beispiel 4Example 4

Es wurde geprüft, inwieweit das erfindungsgemäß verwendete oberflächenaktive Mittel den TSH-Test beschleunigen kann, ohne daß die Extinktion des Nullstandards sich erhöht. Dazu wurden verschiedene oberflächenaktive Mittel getestet. Die Ergebnisse sind der beigefügten Abbildung zu entnehmen.It was tested to what extent the surface active agent used according to the invention can accelerate the TSH test without the extinction of the zero standard increasing. For this purpose various surfactants were tested. The results are shown in the attached figure.

Beispiel 5Example 5

Es wurden mehrere TSH-Tests durchgeführt. Dabei wurde die Beschleunigung, bezogen auf einen Standard, bestimmt, die mit den erfindungsgemäß verwendeten Mitteln erreicht werden kann. Die in der folgenden Tabelle 4 aufgeführten Werte wurden dabei mit den verschiedenen oberflächenaktiven Mitteln erhalten.Several TSH tests were performed. The acceleration, based on a standard, was determined which can be achieved with the agents used according to the invention. The values listed in Table 4 below were obtained with the various surfactants.

Tabelle 4Table 4

oberflächenaktives Mittelsurfactant Konz.Conc. Standarddefault %% %% ΔΕΔΕ 100,5100.5 PluronicF68PluronicF68 1%1% 0,8470.847 110110 PhjronicF68PhjronicF68 2%2% 0,9260.926 147147 PluronicF68PluronicF68 5%5% 1,2381,238 114114 PluronicF88PluronicF88 1%1% 0,7750.775 112112 PluronicF88PluronicF88 2%2% 0,7620,762 147147 PluronicF88PluronicF88 5%5% 1,0021,002 118118 PluronicF98PluronicF98 1%1% 0,8310.831 112112 PluronicF98PluronicF98 2%2% 0,7890.789 172172 PluronicF98PluronicF98 5%5% 1,2131,213 102102 PiuronicF38PiuronicF38 1%1% 0,6970.697 102102 PluronicF38PluronicF38 2%2% 0,6950,695 9292 PluronicF38PluronicF38 5%5% 0,6270.627

Claims (18)

1. Verfahren zur Bestimmung eines Partners einer Immunreaktion nach dem Immunoassay-Prinzip bei einer Temperatur zwischen 15 und 400C, wobei einer der Reaktionspartner in fester Phase vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß man ein oberflächenaktives Mittel mit einem HLB-Wert von mehr als 20 zusetzt.1. A method for the determination of a partner of an immune reaction according to the immunoassay principle at a temperature between 15 and 40 0 C, wherein one of the reactants in the solid phase, characterized in that one comprises a surface-active agent having an HLB value of more than 20 added. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in einer Plasmaprobe durchgeführt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the determination is carried out in a plasma sample. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Mittel nichtionische Blockcopolymere auf Basis von Alkylenoxiden mit 2 bis 4 C-Atomen, die gegebenenfalls ein Alkylendiamin mit 2 bis 4 C-Atomen als Zentralmolekül enthalten, einsetzt.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that nonionic block copolymers based on alkylene oxides having 2 to 4 carbon atoms, which optionally contain an alkylenediamine having 2 to 4 carbon atoms as the central molecule, are used as surfactants. 4.· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis3, dadurch gekennzeichnet, daß man oberflächenaktive Mittel mit einem HLB-Wert zwischen 24 und 30 verwendet.4. Process according to one of Claims 1 to 3, characterized in that surfactants with an HLB value between 24 and 30 are used. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Mittel Verbindungen der Formel I,5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that as surface-active compounds of the formula I, CH3
(CH2CH2O)8(CH-CH2O)5(Ch2CH2O)8
CH 3
(CH 2 CH 2 O) 8 (CH-CH 2 O) 5 (Ch 2 CH 2 O) 8
worin a einen Wert zwischen 30 bis .150 und b einen Wert zwischen 15 und 60 annehmen kann, einsetzt.where a can assume a value between 30 to 150 and b a value between 15 and 60.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Blockcopolymere einsetzt, bei denen a ein Wert zwischen und 100 und b einen Wert zwischen 25 und 40 hat.6. The method according to claim 5, characterized in that one uses block copolymers in which a has a value between and 100 and b has a value between 25 and 40. 7. Verfahren nach einem derAnsprüche4bis6, dadurch gekennzeichnet, daß man Blockcopolymere einsetzt, die einen Anteil an hydrophilen Polyoxyethylengruppen von 60 bis 90% aufweisen.A process according to any one of claims 4 to 6, characterized in that block copolymers having a proportion of hydrophilic polyoxyethylene groups of 60 to 90% are used. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Mittel Verbindungen mit der folgenden Formel Il einsetzt:8. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that one uses as surfactants compounds having the following formula II: ν 3 ,3ν 3, 3 H(OCH2CH2) (OCH-CH2)xV^ χ(CH2-CHO) ,.(CH2CIf2O) HH (OCH 2 CH 2 ) (OCH-CH 2 ) x V ^ χ (CH 2 -CHO),. (CH 2 Clf 2 O) H N-CH„-CH„-N ^
^ 2 2 \
N-CH "-CH" -N ^
^ 2 2 \
H(CCH0CH0) (CCH-CH0) "^ (CH0-CHO) (CH0CH0O) HH (CCH 0 CH 0) (CCH-CH 0) "^ (0 CH -CHO) (CH 0 CH 0 O) H z t. y \ Zx x2) y Z 2. z t. y \ Zx x2) y Z 2. CH- CH-CH- CH- worin χ einen Wert zwischen 10 und 50 und y einen Wert zwischen 30 und 150 annehmen kann.where χ can have a value between 10 and 50 and y a value between 30 and 150.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Blockcopolymere einsetzt, bei denen χ einen Wert zwischen 15 und 30 und y einen Wert zwischen 40 und 120 hat.9. The method according to claim 8, characterized in that one uses block copolymers in which χ has a value between 15 and 30 and y has a value between 40 and 120. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an Polyoxyethylengruppen 50 bis 90% beträgt.10. The method according to any one of claims 8 or 9, characterized in that the proportion of polyoxyethylene groups is 50 to 90%. 11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel zusammen mit der Inkubationslösung eingebracht wird.11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the surface-active agent is introduced together with the incubation solution. 12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von 0,1 bis 5%, bezogen auf die gesamte Lösung, zugegeben wird.12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the surface-active agent in a concentration of 0.1 to 5%, based on the total solution, is added. 13. Reagenz zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12, enthaltend mobilisierte und immobilisierte Partner einer Immun reaktion, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oberflächenaktives Mittel mit einem HLB-Wert von mehr als 20 enthält.13. A reagent for carrying out a method according to any one of claims 1 to 12, comprising mobilized and immobilized partners of an immune reaction, characterized in that it contains a surfactant having an HLB value of more than 20. 14. Reagenz nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktives Mittel nichtionische Blockcopolymere auf Basis von Alkylenoxiden mit 2 bis 4 C-Atomen, die gegebenenfalls ein Alkylendiamin mit 2 bis 4 C-Atomen als Zentralmolekül enthalten, enthält.14. A reagent according to claim 13, characterized in that it contains as surface-active agent nonionic block copolymers based on alkylene oxides having 2 to 4 carbon atoms, optionally containing an alkylenediamine having 2 to 4 carbon atoms as the central molecule contains. 15. Reagenz nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel einen HLB-Wert zwischen 20 und 30 hat.15. A reagent according to claim 13 or 14, characterized in that the surface-active agent has an HLB value between 20 and 30. 16. Reagenz nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel eine Verbindung mit der Formel I16. A reagent according to any one of claims 13 to 15, characterized in that the surface-active agent is a compound of the formula I. CH3 CH 3 (CH2CH2O)a(CH-CH2O)b(CH2CH2O)a "(CH 2 CH 2 O) a (CH-CH 2 O) b (CH 2 CH 2 O) a " ist, worin a einen Wert zwischen 30 und 150, bevorzugt zwischen 60 und 100 und b einen Wert zwischen 15 und 60, bevorzugt zwischen 25 und 40 hat.in which a has a value between 30 and 150, preferably between 60 and 100 and b has a value between 15 and 60, preferably between 25 and 40. 17. Reagenz nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung einen Anteil an Poiyoxyethylengruppen von 60 bis 90% hat.17. A reagent according to claim 16, characterized in that the compound has a proportion of Poiyoxyethylengruppen of 60 to 90%. 18. Reagenz nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel eine Verbindung mit der allgemeinen Formel Il18. A reagent according to any one of claims 13 to 15, characterized in that the surface-active agent is a compound having the general formula II
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