DD222632A5

DD222632A5 - Verfahren zur immobilisierung von carboxypeptidase-b-enzym

Info

Publication number: DD222632A5
Application number: DD84270845A
Authority: DD
Inventors: Laszlo Boross; Jozsefne Dala; Aranka Kissne; Bela Szajani
Original assignee: Reanal Finomvegyszergyar
Priority date: 1983-07-11
Filing date: 1984-04-06
Publication date: 1985-05-22
Also published as: DD220334A5; HU190129B; DE3412669A1; CS252472B2; RO88619A; CU21674A3; RU1769763C; US4650762A; CS236184A2; SU1487817A3; HUT34234A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von insbesondere aus der Bauchspeicheldruese von Saeugetieren gewonnenem Carboxypeptidase-B-Enzym. Carboxypeptidase-B-Enzym wird erfindungsgemaess aus einer Pufferloesung mit einem p H-Wert von 4,5-8,5 auf einen aus Acrylsaeure und/oder Methacrylsaeure bzw. Acrylamid bzw. Methacrylamid hergestellten, mindestens 0,1 m-Aequiv./g funktionelle Carboxygruppen enthaltenden aktivierten Traeger aufgebracht. Das so immobilisierte Enzym wird gewaschen, in waessriger Suspension bei 0-4 C gelagert und gegebenenfalls getrocknet.

Description

16 167 55

Verfahren zur Immobilisierung von Carboxypeptidase-

-B-Ehzym

Anwendungsgebiet der "Erfindung :

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung* von Carboxypeptidase-B-Enzytn.

Charakteristik der, bekannten technischen Lösungen:

Das als Handelsprodukt zugängliche Carboxypeptidase B Enzym wird aus der Schweinebauchspeicheldrüse isoliert. Nach der Fachliteratur kann dieses Enzym auch aus dem Pankreas von anderen Säugetieren (z.B. Rind, Ziege) isoliert werden.

Nach dem in D. Biol. Chem. 235, 2272 (1960) veröffentlichten Artikel wird das Schweinepankreas aufgeschnitten und bei Raumtemperatur autolysiert. Der Fettgehalt des Organs wird mit Aceton, einem Aceton-Äther Gemisch und schließlich Äther entfernt, das entfettete Organ wird getrocknet und pulverisiert. Das acetonische Pulver wird mit Wasser extrahiert und das Extrakt mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Das Produkt wird nacheinander einerEntsalzung, einem Ionenaustausch (auf DEAE-Cellulos.e, durch Säulenchromatographie) und einer Ausfällung mit Ammoniumsulfat unterworfen. Der

Niederschlag wird durch Dialys.e oder Gelfiltrieren entsalzen. Das Enzym' wird in gefrorenem Zustand gelagert, weil die Liophylisierung die Aktivität um 25-45 % herab--. setzt. ' ;

/ -,' . . ·

/. Die spezifische Aktivität des Produktes beträgt 184,2 Einheiten/mg (bei 25⁰C mit einem Hippuryl-L-arginin Subst rat gemessen), was im Vergleich zum aus dem autolysier-, ten Gewebe erhaltenen Extrak't einer 16-17-fachen Reinigung entspricht« "

In der Praxis wird die obige Methode in den.meisten Fällen angewendet. . ,

Gemäß Biochemistry 1, 1069 (1962) kann das Carboxypeptidas-B-Enzym aus Rinderpankreas in kristalliner Form durch Aktivierung des gereinigten Zimogens - d.h. des Procarboxypeptidase-B-Enzyms - hergestellt werden. Nach diesem VerfahreH wird als Ausgangsstoff ebenfalls das wäßrige Extrakt des acetonischen Pankreaspulvers verwendet. Das -, wäßrige Extrakt enthält des Procarboxypeptidase-B-Enzym, welches einer chromatographischen Reinigung zuerst an DEAE-Cellülpse und darauffolgend an DEAE-Sephadex unterworfenwird. Das Procarboxypeptidase-B-Enzym wird mit Tripsin in das aktive Carboxypeptidase-B-Enzym überführt, welches schließlich kristallisiert wird.

In dem in 3iochem. 163 ,· 253 (1977) publizierten Artikel wird die Isolierung des Carboxypeptidase-B-Enzyms aus humanem Pankreas beschrieben. Die Herstellung des ace.tonischen Pulvers, die Ausfällung mit Ammoniumsulfat und die DEAE-Cellulose-Chrotnatographie werden im wesentlichen wie in 3. Biol. Chet?. 235, 2272 (1960) offenbart, durchgeführt* Das für die Aufarbeitung von humanem Pankreas be-

schriebene Verfahren unterscheidet Methods nur in d3n bei der DEAE-Calluloss-Chromatographia verwendeten Pufferkonzentrationen und Eiuentengradientsn , Das so erhaltene. Carbcxypeptidase-B-Enzym wird durch an Whatam CM-Cellulose Ionenaustauscher durchgeführte Chromatographie auf zwei Fraktionen - und zwar 3^ und B^'-aufgatrannt. Die spezifische Aktivität der B₁- pnd B₉-Fraktionen beträgt 1192 Einheiten/mg Όζ'."., 352 Einheiten/mg (bei 37"C und an einem iHippuryl-L-Arginin Substrat gemessen), was zum wäßrigen Extrakt verglichen einer 103-fachsn bzw. 78-fächen Reinigung entspricht. Carboxypeptidase-B-Enzym kann auch aus Zigenpankreas isoliert werden. (Indian 0. Siochem. Biophys. _12, 24 (1975.) bzw. 13, 106 /1976/).

Die wesentlichen Merkmale dieses Verfahrens sind folgende:

Das Ziegenpankreas' wird bei -20 C gefroren, in gefrorenem Zustand aufgeschnitten und die bei +4⁰C ausfließende Zellflüssigkeit gesammelt. Die gesammelte Flüssigkeit wird einer Autolyse unterworfen..Der pH-Wert der Lösung wird auf 4,6 eingestellt, die Lösung mit destilliertem Wasser auf das zehnfache Volumen verdünnt und die entstandene Suspension bei +4⁰C 2-3 Stunden lang stehengelassen. Der überwiegende Teil des aktiven Carboxypeptidase-Enzyms fällt aus. Der Niederschlag wird mit Bariumhydroxyd bei einem pH-Wert zwischen 10,0 und 10,4 extrahiert. Aus dem Extrakt wird das Enzym bei einem pH-Wert von 6,5 kristallisiert und viermal umkristallisiert. Die weitere Reinigung des so erhaltenen Präparates wird in Indian 3. Biochem. Biophys. _13, 106 (1976) beschrieben. Nach dieser Methode wird, das bei einem pH-Wert von 6,5 ausgefällte Produkt in einer 0,2 molaren Bariumhydroxydlösung gelöst, der pH-Wert mit Essigsäure auf 7,0 eingestellt und die Substanz durch mit Ammoniumsulfat durchgeführte Fraktionierung und wieder-

holten Ionenaustausch (auf DEAE-Cellulose).weitergerainigt. Die entsalzte Enzymlösung wird bei -2CTC gelagert.

Die speizifische Aktivität des Produktes beträgt 102,55 Einheiten/mg (an einem Hippuryl-L-arginin-Sübstrat-gemessen)', was einer 44-fachen Reinigung entspricht. ·

Nach dem in 3. Mol. Catal. H), 253 (1931) publizierten Artikel wird das wäßrige Extrakt des acetonischeri Pulvers von Ziegenpankreas mit Ammoniumsulfat fraktioniert und die bei einer 0,3-0,7-fachen Sättigung erhaltene Fraktion einer Chromatographie auf CM-Sephadex C-50 und DEAE-Cellulose unterworfen. Die spezifische Aktivität des so hergestellten Produktes beträgt 82,9 Einheiten/ijg (an einem Hippuryl._ L-Arginin Substrat gemessen), was einer 18,2-fachen Reinigung entspricht. - "

Der gemeinsame Nachteil der obigen Methoden besteht darin, daß als Ausgangsstoff die Zellflüssigkeit von Pankreas oder das acetonische Pulver des Organs eingesetzt wird. Die Sammlung der Zellflüssigkeit ist schwierig und bei Schweinepankreas wegen des hohen Fett- und Schleimgehaltes des Organs praktisch undurchführbar. Die Herstellung des acetonischen Pulvers erfordert die Anwendung von kostspieligen feuer- und explosionsgefährlichen Lösungsmitteln (Äther, Acöton). Die örtlichen Erwärmungen können das Enzym schädigen, sowie die Ausbeute und die spezifische Aktivität herabsetzen. Ein weiterer Nachteil liegt darin, daß ein Produkt mit zufriedenstellender Reinheit nur mit Hilfe eines komplizierten, aus-zahlreichen Verfahrensschritten bestehenden Arbeitsvorganges herstellbar ist.

Zwecks Beseitigung der beschriebenen Nachteile wurde vorgeschlagen (

, ein homogenisiertes und autolysiertes Pankreas

mit einem Puffer, dessen pH-Wert 5,0-8,5, zweckmäßig 6,0 beträgt, in einem Verhältnis von 1:1 zu verdünnen und danach bei 50-75⁰C 5-30 Minuten lang, zweckmäßig bei 6O⁰C- . 20 Hinuten lang, einer Wärmebehandlung zu unterwerfen. Bei dieser Wärmebehandlung wird der überwiegende Teil der. das zu isolierende Enzym begleitenden Proteine danaturiert, Das denaturierte Protein fällt aus der wäßrigen Lösung in Form eines Niederschlages' mit großer Oberfläche aus und zieht infolge seiner klärenden Wirkung den großen Teil der in der Lösung zurückgebliebenen Verunreinigungen mit. Dadurch wird die schwierige und kostspielige Herstellung des acetonischen Pankreaspulvers beseitigt.

immobilisierten Carboxypeptidase-B-Enzym-Rräparate können zur Bestimmung der COOH-terminalen Aminosäuren von Proteinen und Peptiden oder zur Trennung von DL-Arginin oder DL-Lysin verwendet werden.

Ziel der Erfindung: .

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Immobilisierung von immobilisierten Carboxypeptidase-B-Enzym-Präparaten.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sollen immobilisierte Carboxypeptidase-B-Enzympräparate hergestellt werden können, die das Enzym an einem chemisch inerten, derWirkung von Mikroorganismen unbegrenzt widerstehenden, gute mechanische Eigenschaften aufweisenden, eine große Ourchlfußgeschwindigkeit ermöglichenden Träger gebunden enthalten. Eine weitere Forderung besteht darin, daß das Enzym mit dem Träger unter milden Reaktionsbedingungen verknüpft werden soll. ,

- ο -

' Darlegung des Wesens der Erfindung: ' · .

. Es wurde gefunden, daß aus Acrylsäure und/oder Methacrylsäure bzw. Acrylamid und/oder Methacrylamid Monomeren.' mit Hilfe eines Vernetzungsmittels des Acryl- oder Allylt'yps (z.B. N/N"-Methylen-bisacrylamid, Äthylendiacrylat -oder N,N-Oiällylweinsäureamid) gebildete, mindestens 0,1 m-A'quv./ g - zweckmäßig 2-8 m-Äquiv-./g - funktionelle Carboxygrup- '!

" '.- -..- . pen aufweisende polymere. Gele den an "die Träger gestellten' Forderungen weitestgehend entsprechen. Die obigen Eznymträger können nach an sich bekannten Methoden hergestellt

ν./· ' werden. . " _# .. .., ·

Qie funlitionellen Carbpxygruppen der verwendeten Enzyraträger können nach bekannten Methoden durch Behandlung mit Carbodiimiden aktiviert werden. Die so behandelten Enzym träger sind zur Bindung des Carboxypeptidase-B-Enzyms geeignet. Die Umsetzung kann auch unter milden Bedingungen (0-4⁰C, pH 7,0) durchgeführt werden.

Erfindungsgemäß werden die immobilisierten Carboxypeptidase-B-Enzym-Präparate hergestellt, indem man ein aus Acrylsäure und/oder Methacrylsäure bzw. Acrylamid und/oder Methacryl- _. amid hergestelltes, mindestens 0,1 m-Äquiv«/g funktionelle ^' Carboxygruppen enthaltendes polymeres Gel mit einer wasserlöslichen oder in organischen Lösungsmitteln bei einer Temperatur unter O⁰C lösbaren Carbodiimid-Verbindung behandelt, auf den so aktivierten Träger das Carboxypeptidase-B-Enzym aus einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 4,5 und 8,5 aufbringti das erhaltene immobilisierte Enzym wäscht und gewünschtenfalls trocknet.

Als Polymer können vorzugsweise Acrylex C Polymere eingesetzt - werden. Als Enzym kann Carboxypeptidase-3-Enzym beliebigen Ursprungs ;

verwendet werden.

Zur; Aktivierung des Enzymt-ragerkopolysisrs können z.E. N-Cyclohexyl-N¹-^~2-(4-morpholinyl)-äthyl/-carbodiimidmethyl-p-toluolsulfonat oder N-Äthyl-N"-(3-dim8thylaminoprcpyl)-carbodiiniid-hydrochlorid Verwendung findan. Es werden vorzugsweise wasserlösliche Carbodiimidverbindungen eingesetzt. Sollte man nur in organischen Lösungsmiί- ^;te lh lösbare Carbodiimidverbindungen verwenden, kommen.

solche Derivate in 3etracht, die im angegebenen organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur unter 0 C ausreichend · \,.' löslich sind.

Das Carboxypeptidase-3-Enzym wird auf den aktivierten Träger, wie bereits erwähnt, aus einer Lösung mit einem pH-Wert von 4,5-8,5 aufgebracht. Zeckmäßig liegt der pH-Wert jedoch zwischen 6,0 und 7,0. Als Reaktionsmediurn können mit Vorteil 0,05-0,1 molare Kaliumphosphatpufferlösungen mit einem pH-Wert von 7,0 eingesetzt werden.

Das nach der Verkupplungsreaktion hergestellte immobilisierte Eznympräparat wird in an sich bekannter Weise gewaschen, und gewünschtenfalls getrocknet. Das Enzympräparat kann je-.-- ' doch auch in wäßriger Suspension bei einer Temperatur zwi^v sehen 0 und 4 C gelagert werden.

/ - .

. Die spezifische Aktivität der nach dem erfindungsgemäßenVerfahren hergestellten Enzympräparate beträgt 600-900 ,uMol hydrolysierte Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Xerogel, und dieser Wert ist für die praktische Anwendbarkeit sehr . günstig.

. · ^! Ausführunqsbe!spiel·: ·

Weitere Einzelheiten des erfindungsgemäßen Verfahrens " - sind, den nachstehenden,Beispielen zu entnehmen, ohne den Schutzumfang auf diese Beispiele einzuschränken,

> ' Beispiel 1

0,25 kg Schweinepankreas werden in einer Fleischmühle ge-" mahlne, woraufhin 250 ml einer 0,05 molaren Tris-HCl-Püffers (pH 7,0) zugegeben werden und das Gemisch über ,

\.J . .Nacht bei 4⁰C stehengelassen wird,. Am nächsteh Tag wird die Suspension auf 37 C erwärmt und eine Stunde lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Die Organsuspension wird zentrifugiert, die supernatierende Flüssigkeit auf 5O°C erwärmt und bei dieser Temperatur weitere 30 Minuten lang inkubiert. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskaltes Puffer wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 42,2 g Ammoniumsulfat zugegeben. Das Gemisch wird eine Nacht lang stehengelassen, die Sus- ^: pension zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der pH-Wert der supernatierenden Flüssigkeit wird auf 7,0-7,2 eingestellt. Nach Zugabe von 36,1 g Ammoniumsulfat wird

/-, die-Suspension eine Nacht lang stehengelassen und zentri- ^ fugiert. Der Niederschlag wird in ein leicht kaltem (+4⁰C) Tris^HSl-Puffer (pH 7,0) gelöst und mit destilliertem ,Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren

Ausbeute: 343 mg Carboxypeptidase B.

Spezifische Aktivität: 17,5/UMol hydrolysiertes Hippuryl-. Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 2

0,25 kg Schweinebauchspeichedrüse werden in einer Fleischmühle gemahlen, woraufhin 250 ml einer 0,05 molaren Tris-

HCl-Puffers (pH 7,0) zugegeben werden. Das Gemisch wird

' eine Nacht lang bei +4⁰C stehengelassen. Am nächsten Mor-

* ο

gen Wird die Suspension auf +37 C erwärmt und eine Stunde lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Die Organsuspension wird zentrifugiert, die supernatierende Flüssigkeit auf 6O⁰C erwärmt und bei dieser Temperatur weitere 10 Minuten lang inkubiert. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eines eiskalten Puffers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 92 g Ammoniumsul- ^:fat zugegeben. Weil nach dem Stehenlassen über eine Nacht kein Niederschlag ausschied, werden der Lösung nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 weitere.78 ,7 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in ein wenig kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach^: der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute: 295 mg Carboxypeptidase

Spezifische Aktivität: 53,1 ,uMol hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel -3 ' . '

s~ 0,25 Schwein'ebauchspeicheldrüse werden in einer Fleisch-' mühle gemahlen, woraufhin 250 ml eines 0,05 molaren Tris-HCl-Puf fers (pH 7,0) zugegeben werden und das Gemisch eine Nacht lang bei +4⁰C stehengelassen wird. Am nächsten Morgen wird die Suspension auf +37⁰C erwärmt und eine Stunde lang bei dieser Temperatur stehengelassen Die Organsuspension wird zentrifugiert, die supernatierende Flüssigkeit auf 60 C erwärmt und bei dieser Temperatur weitere 20 Minuten lang inkubiert. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eines eiskalten Puffers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 98,2 g Ammoniumsulfat zugegeben. Weil nach dem Stehenlassen über Nacht kein Niederschlag ausschied, werden der Lösung nach Einstellung des

- 10 -

"⁵O -

pH-Wertes auf 7,0-7,2 weitere 85,9 .g.Ammoniumsulfat zu-^έ gegeben, Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kal-. tem (+4⁰C.) Tris-HCl-Puffer, (pH 7,0) gelost und gegen destil- ·' .·. , . lier.tes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird

. ' die Lösung filtriert und gefroren

ν'-. Ausbeute 266 mg Carboxypeptidase.

Spezifische Aktivität: 63,2 ,uMol hydrolysiertes Kippuryl-L-arginin/Minute/mg Protein.

; -.' ' Beispiel 4 ... '· . '

0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden in einer Fleisch-,muFvle gemahlen » worauf hin .250 ml eines 0,05 molaren 'TrIs-Hel-Puffers (pH 7,0) zugegeben werden und das Gemisch eine ,-.. ' Nacht lang bei +4⁰C stehengelassen wird. Am nächsten Morgen wird die Suspension auf +37⁰C erwärmt und eine Stunde lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Die Organsuspension wird zentrifugiert, die supernatierende Flüssigkeit auf 75°C erwärmt und bei dieser Temperatur weitere 5 Minuten lang inkubiert. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eines eiskalten Puf- fers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 66,9 g Ammoniumsulfat zugegeben. Weil nach Stehenlassen über eine-Nacht kein Niederschlag aus-W schied, werden der Lösung nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 weitere 55,8 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach ,der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren

Ausbeute: 34 mg Carboxypeptidase.

Spezifische Aktivität: 21,6 -uMol hydrolysiertes Hippuryl-L-arginin/MinujCe/mg Protein.

- 11 -

O . ' O

.: _ Tabelle 1

Einfluß der Temperatur und der Zeitdauer der Wärmebehandlung eines Schweinepankreashomogenisats auf die Aktivität von Carboxypeptidase B

Temperatur Zeit Gesamtaktivität Geaamtprotein Spezifische Aktivität

(°C) (Min.) (Einheit/kg (mg/kg Pankreas) (Einheit/mg)

Pankreas)

1372 17,5

1180 53,1

1064 63,2

136 21,6 -

50	30	23968
60	10	62660
	20	67260
75	5	2932

=» 1 Einheit entspricht einer Enzymmmnge, die die Hydrolyse von l,0,uMol Hippuryl-L-Arginin per Minute katalysiert (bei 25°C und pH 2,65 gemessen)

ro ι

-IC⁵-

Seispiel b- . ' · . .

, G,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden in einer' Fleisch-'" mühle gemahlen und .über Nacht bei Raum iam'peratür stehengelassen, Arn nächsten. Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Acetätpuffers (pH 5,0) zugegeben. Die Suspension 'A'ird: auf 6O⁰C .erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Te<Ti-': pe ra tür 'stehengelassen. Nach Zugabe von 2'VoI. Teilen eiskalten Wassers -wird das Gemisch zentrifugiert:. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 274,8 g Ammoniumsulfat züge- .

geben'. Die Suspension wird über Nacht stehenaelassen und

fs- · .· ". '. : .' ' · '. ' "

ν/ dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Der

supernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-VX.artes.äuf 7,Ρχ7,2 232,,9/g Ammoniumsulf^t zugegeben; Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen und zentri-'... ,' ,fugiert. Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4⁰C) Tris- : HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser

salzfrei diälysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: .360 mg Carboxypeptidase B. ·

• ^Spezifische Aktivität: 14,8 ,uMol hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

/Τ~·- Seispiel 6 . . '

0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden an einer Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Acetatpuffers (pH 5,5.) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von" 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 261,2 g Ammoniumsulfat zugegeben.Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag'wird verworfen. Der

- 13 -

supernatierenden-Flüssigkeit vieräen nach Einstellung des pH-Wertes 'auf 7,0-7,2 22S g Amuipniumsulf a t zugegeben, Die Suspensio.n wird über eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert.'Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4⁰C) Tfis-HCl-Puffer {pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren» .

Ausbeute: 317 mg Carbcxypeptidase 3. ;

Spezifische Aktivität: 20,3,UMoI hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 7

0,3 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden in einer Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 300 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60⁰C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supbernatierenden Flüssigkeit werden 301 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Der supbernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 252,6 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Puffer (pH

7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialy-

Nach siert. Üer Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 517'mg C_arboxypeptidase B. Spezifische Aktivität: 57,uMol hydrolysiertes Hippuryl- L-Arginin/Minute/mg Protein.

-. 14 -

1 A

Beispiel 8 '·

P,e kg Schweinebauchspeicheldrüse werden in einer Fleischern ühIe. gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur ste'nen-.: '. ; gelassen. Am nächsten Morgen werden 300 ml eines 0,05. mo~ . . - - iaren Phosphatpuffers (pH 6,5) zugegeben. Die Suspension

wird auf 60⁰C erwärmt und 20 Minuten lang auf dieser Tem-,: ., peratur. gehalten. Nach. Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten Wasser wird das Gemisch zentrifugiert. Der superhatieren-. den Flüssigkeit werden 326 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentriv / fugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Der supernatie-, renden Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes • auf 7,Q-7,2 275,5 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspen--. sioh wird über Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird'in etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Puffer ' (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. - '

Ausbeute: 361 mg Carboxypeptidase B.

Spezifische Aktivität: 43,8/UMol hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 9

0,3 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden in einer Fleisch-. mühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 300 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 7,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten τ Wassers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden· Flüssigkeit werden 326 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Der supernä-

- 15 -

tierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 272 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird -über eine Nacht stehengelassen und. zen-·, trifugispt. Der Rückstand wird in' etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei d'ialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 433 mg Carboxypeptidase 3,- . _r

, Spezifische Aktivität: 39,9,uMol hydrolysiertes Hippuryi-L--Arginin/Minute/mg Protein.

C~ '

's... Beispiel 10 '

0,25 kg Schvveinebauchspeicheldrüse werden in einen Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Xris-HCl-Puffers (pH 7,5) zugegeben. Die Suspension wird auf 6O⁰C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 247 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über eine Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Der supernatierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung des p8-Wertes auf 7,0-7,2 202 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser slazfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert, und gefroren .

Ausbeute: 695 mg Carboxype'ptidase 3.

Spezifische Aktivität: l7,4,uMol hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

- 16 -

- χα -

Beispie X .11 . '. · '

0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden in. einer Fleisch- mühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH 8.0) zugegeben, Die Suspension wird · auf 50⁰C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Mach Zugabe- von 2 VoI, Teilen eiskalten Wassers wird das Gemisch., zentrifugiert. Der superna tierenden Flüssigkeit werden 255 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über ;eine Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Der super-' natierenden Flüssigkeit werden nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0-7,2 198 g- Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und zentrifugiert . Der Rückstand wird.in etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl- • Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 552 mg Carboxypeptidase 3. '

Spezifische Aktivität: 14,3,UMoI hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

' Beispiel 12 . . ' .' .

0,25 kg Schweinebauchspeicheldrüse werden in einer Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH 8^5) zugegeben. Die Suspension wird auf 60°C erwärmt und 20 Minuten lang bei,dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten -. Wassers wird das Gemisch zentrifugiert. Der supernatierenden Flüssigkeit werden 247 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und zentrifugiert, Der Niederschlag wird*verworfen. Der supernatierenden Flüs-

sigkeit werden nach einstellung des pH-Wertes auf 7,0 bis 7,2 197 g.Ammoniumsulf at zugegeben. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Der Rückstand wird in etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Pgffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gef roren. ... . .

Ausbeute: 1209 mg Carboxypept'idase 3. -

Spezifische Aktivität:' 6 ,4 ,Mol hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/m§ Protein.

- 18 -

Tabelle 2

Wirkung des pH-Wertes des bei der Wärmebehandlurig (6O⁰C, 20 Minuten) von homogenisiertem Schweinepankreas verwendeten Puffers auf die Aktivität von

Garboxypeptidase B

-Wert	Gesamtaktivität (Einheit/kg Pankreas)
5,0	21348
5,5	25808
6,0	98333
6,5	52767
7.0	64882
7,5	48400
8,0	31632
8.5	30753

Gesamtprotein ' (mg/kg Pankreas)

Spezifische Aktivität (Einheit/mg)

1440 1268 1724 1204 1625 2780 2210 4836

14,8 20,3 57,0 43,8 39,9 17,4 14,3 6 ,4

Η-¹

Beispiel 13 . '

0,25 kg Schweinepankreas werden in einer Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 6O⁰C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugaben von 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 340 g/l gesättigt (408 g). Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen und die¹ supernatierende Flüssigkeit mit. Ammoniumsulf at bis zu einer Konzentration von 370 g/l gesättigt (41,1 g). Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Puffer (pH 7/0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. Ausbeute: 95 mg Carboxypeptidase B-. Spezifische Aktivität: 56,2 ,uMol hydrolysiertes Hiipuryl-L-Arginin/Minute/rag Protein.

Beispiel 14

0,2 kg Schweinepankreas werden in einer Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 200 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 6O⁰C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen, Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird die Suspension zentrifugiert. Die supbernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 330 g/l gesättigt (330 g). Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentri-

- 20 -

fugiert. Der Niederschlag wird verworfen und die superna-. tierende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 370 g/l gesättigt (44.8g). Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Puf- fer (pH 7,0) gelöst und. gegen destilliertes Wasser slazfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren, . . -

Ausbeute: 62 mg Carboxypeptidase B.

Spezifische Aktivität: 89,0,UMoI hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minüte/mg Protein. .

Beispiel 15

0,25 kg Schweinepankreas werden in einer Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Phos-

; phatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf

60 C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen, Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten ; Wassers wird die Suspension zentrifugiert. Die. supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt (386 g). Die Suspen-

yV. sion wird eine Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen und die supernatierende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konezntration von 370 g/l gesättigt (65 g). Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 106,5 mg Carboxypeptidase 3.

Spezifische Aktivität: 95,5,uMol hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

,.; . : , - ; ' . ',.· ": - 21. -

iel 16

0,2 kg Schweinepankreas werden in einer. Fleischmjhle gemahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 200 ml eines 0,05 molaren P'nosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf. 60°C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser'Temperatur . stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten* Wassers wird'die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird, mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 310 g/l gesättigt (310 g). Die Suspenv.J sion wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen, und die.super-' datierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 370 g/l gesättigt (67,2 g). Dia Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4⁰C) . Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser slzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

Ausbeute: 135 mg Carboxypeptidas B. \•Spezifische Aktivität: 44,3,uMol hydrolysiert^ Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

Beispiel 17

0,25 kg Schweinepankreas werden in einer Fleischmühle 'ge-• mahlen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60 C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulaft bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt (386,4 g). Die Sus-

- 22 ,-

-. 22 -

pension .wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen,, und die super·*-' natierende Flüssigkeit Wird mit Ammoniumsulfat bis zu ·' einer Konzentration von 350 g/l'gesättigt (52 g). Die ' . Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann

zentrifugiert. Der. Niederschlag wird in etwas kaltem (+4⁰C)' Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes :',..'' '. Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren

Ausbeute: 76 mg Carboxypeptidase B.

V-S- Spezifische Aktivität: 123,8 ,uMol hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

" .' - Beispiel 18 '' ' ' .. '

0,25 kg Schweinepankreas werden in einer Fleischmühle gemahlen und über Nacht bei Reumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird",auf 6O⁰C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt (386,4 g). Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 350 g/l gesättigt (39 g). Die Suspension wird dann wieder eine Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag, wird in etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren. . -

-23 -

Ausbeute: ,45'mg Carboxypeptidase B.

Spezifische Aktivität:' 286 ,7,uMol hydrolysier tes Hippuryl-L-Arginin/Minute/rag Protein,

Beispiel 19 ,

0,25 kg Schweinepankreas werden in einer Fleischmühle gemahlen und über eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen werden 250 ml eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wird auf 60⁰C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieserTemperatur stehen-

V^ gelassen. Nach Zugabe von 2 Vol. Teilen eiskalten Wassers

wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammonium^ulfat bis zu einer Konzentration : von 320 g/l gesättigt (385,4 g). Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen und die supernatierende Flüssigkeit mit Aramoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 340 g/l gesättigt (26 g). Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen and dann zentrifugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert und gefroren.

/<-?·. , Ausbeute: 25,5 mg Carboxypeptidase B.

Spezifische Aktivität: -195,8,UMoI hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/Minute/mg Protein.

- 24 -

Tabelle 3

Wirkung der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat auf die Aktivität von Carboxypeptidase B

Ammoniumsulfatkonzentration (g/i)	Sättigung	Gesamtaktivität (Einheit/kg Pankreas)	Gesamtprotein (mg/kg Pankreas)	Spezifische Aktivität (Einheit/mg)
1, Sättigung 2.	370
340	370	21373	380	56.2
330	370	27670	310	89,0
320	370	40697	426	95,5
310	360	29914	675	44,3
320	' 350	27629	304	123,8
32Ö>	340	51610'	*180	286,7
320	19977	102	195,8

Bei'spiel 20 ·. · . '

1 kg.Rinderpankreas wird ineiner Fleischmühle gemahlen, und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen wird 1 Liter eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH 6,0) zugegeben, woraufhin die Suspension auf 6O⁰C erwärmt und 20 Minuten lang bei dieser Temperatur stehengelassen wird, Mach Zugabe von 2 Vol. Teilen (3,8 1) eiskalten Wassers wird die Suspension zentrifugiert. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 320 g/l gesättigt (1,6 kg). Die

v_^: Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und da,nn zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Die supernatierende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 350 g/l (165 g) gesättigt. Die Suspension wird eine Nacht lang stehengelassen und dann zentri- \ fugiert. Der Niederschlag wird in etwas kaltem (+4⁰C) Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und mit destilliertem Wasser salzfrei dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung filtriert. Es werden 406 mg Natriumchlorid zugegeben, woraufhin die Lösung gefroren wird. Ausbeute: 233,7 mg Carboxypeptidase B.

^ Spezifische Aktivität: l5,4,uMol hydrolysiertes Hippuryl-L-Arg in in/M in ute/mg Protein, ' ' .

Beispiel 21 /

1 g Akrilex C-IOO Xerogel (Carboxygehalt: 6,2- 0,3 m-Äquiv./ g) wird in 50 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert, wonach derSuspension auf einem eiskalten Wasserbad unter ständigem Rühren eine Lösung von

2 g N-Cyclohexyl-N^f-/*2-(4-morpholinyl)-äthyl7-carbodiimidmethyl-p-toluolsulfonat in 20 ml einer kalten (M-⁰C) Pufferlösung zugegeben wird. Nach 10-minutigem Rühren werden der Lösung 31 ml einer wäßrigen Carboxypeptidase B Lösung zugefügt (Konzentration: 16,45 mg/ml; spezifische Aktivität

- 26 -

; ../ des Enzyms: .1T₇UMoI hydrolysier tes Hippuryl-L-Arginin/

Minute/ing Protein) . Oie Reaktionszeit betragt 48 Stunden, . ; ' während der das Gemisch zweimal -jeweils 5 Stunden lang g-3-

;. rührt wird. Das Gel wird entfernt, dreimal mit jeweils ' ^; \. . 100 ml einer 0,1 niolaren 'xäliümphosphatpuf f erlösu-ng [pn '' '.· '..' 7,0)/. dreimal mit jeweils 100 ml einer 0,1 molaren/ 1 Mol

.Natriumchlorid enthaltenden Kaliuraphosphatpufferlösung :. . Λ . '- (pH 7,0) und dreimal'mit jeweils. ICO ail einer 0,1 molaren

".-.....' Kaliumphosphatpüffer (pH 7,0) gewaschen. Das Gel wird ^: - "schließlich fünfmal mit je 200 ml destilliertem Wasser ,-/ gewaschen und liöphylisiert.

--' Ausbeute: 1,43- g. ' / ^:

Aktivität: 690-üMol hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/ ;: Minute/g. Trockensubstanz. · .

Beispiel 23 · ,

1 g Akrilex C-IOO Xerogel (Carboxygehalt: 6,2-0,3 m-Äquiv./ . g) wird in 50 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpüfferlösung (pH 7,0) suspendiert, wonach der Suspension auf einem

_: / eiskalten Wasserbad unter ständigem Rühren eine Lösung.von

2 g N-CyCiOhexyl-N *-/. 2-(4-morpholinyl)-ät.hyl/-carbodiimid- - . methyl-p-toluolsulfonat in 20 ml einer kalten (+4°c) Puffer-lösung zugegeben wird. Nach 10-minutigem Rüh'ren· werden der Lösung 15,5 ml einer wäßrigen CJarboxypeptidase-S-Lösung zugefügt (Konzentration: 16,45 mg/ml; spezifische Aktivitat des Enzyms: 17,uMol hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/ Minute/mg Protein). Die Reaktionszeit beträgt 48 Stunden, während deren das Gemisch zweimal jeweils 6 Stunden lang gerührt wird. Das Gel wird entfernt, dreimal mit jeweils 100 ml einer 0,1 molaren Kaliumphophatpufferlösung (pH 7,0), dreimal mit. jeweils 100 ml einer 0,1 molaren, 1 Mol Na-. ; triumchlorid enthaltenden Kaliuraphosphatpuf ferlösung (pH 7,0) und dreimal, mit je 100 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen. Das Gel wird schließlich

27 -

fünfmal mit jeweils 200 ml destilliertem Wasser gewaschen und liophylisiert. ··

Ausbeute :1,6g·¹ '

Aktivität: 880,UMoI hydrolysiartss Hippuryl-L-Arginin/ . Minute/g Trockensubstanz. .

Beispiel 24 ·

1 g Akrilex C-IOO Xerogel (Carboxygehalt: 6/2-0,3 m-Äquiv./9) wird in 50 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert, wonach derSuspension auf einem eiskalten Wasserbad unter ständigem Rühren eine Lösung von 2 g N-Cyclohexyl-N' -_</~2-(4-morpholinyl) -äthyl/-carbodiimidmethyl-p-toluolsulfonat in 20 ml einer kalten (+4⁰C) Pufferlösung zugegeben wird. Nach 10-minutigem Rühren werden der Lösung 62 ml einer wäßrigen Carboxypeptidase B Lösung zugefügt (Konzentration: 16,45 mg/ml; spezifische Aktivität des Enzyms: l7,uMol hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/M-inuate/mg Protein). Die Reaktionszeit beträgt 48 Stunden, während der das Gemisch zweimal jeweils 6 Stunden lang gerührt wird. Das Gel wird entfernt, dreimal mit jeweils 100 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0), dreimal mit jeweils einer 0,1 molaren, 1 Mol Natriumchlorid enthaltenden Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) und dreimal mit jeweils 100 ml einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen. Das Gel wird schließlich fünfmal mit je 200 ml destilliertem Wasser gewaschen und liophylisiert. Ausbeute: 1,55 g. .

Aktivität: 740,.UMoI hydrolysiertes Hippuryl-L-Arginin/ Minute/g Trockensubstanz, ·

- 28 -

r~\

	2 * 1 2 2	^^XCPB (g)	Tabelle 4	Immobili sierte -	Immobili siertes	'- . '	Aktivität verlust	o/	Spezifische Aktivität	19 18 83 10	,51 ,23 ,89 ,63
		510 510 255 1020		Aktivität	Protein	Iη gelöster Form zurückgewonnene	, Finhfij t	/0	F -i nhp i 1
			Immobilisierung von Carboxypeptidase B	Einheit %	Einheit %	Aktivität		86 85 65 91	V
			1008 11, ,987 11, 1408 32, 1147 6,	6 313,7 61 4 328 64 5 102 40 6 655,6 64	Einheit %	7444,1 7387,8 2848,3 15799,1		3,21 ,3 3,00 ,813,80 ,3 1,75
		Aktivität des Produk		,5 5 207 2,4 ,3 285 3.3 73,3 71,3 .3 371,9 2,1
Zusammensetzung des Reaktions-	tes (Einheit/
qemisches	g Xerogel)
	630 690 880 740
^lxAC-100 ^2XCMG (g) (g)
1 1 . 1 1

Ix = AC-IOO, Akrielx 100;

2x a CMC, N-Cyclohexyl-N'-/~2-(4-morpholinyl)-äthyl7--carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat 3x = CPB₁ Carboxypeptidase B

4x = Die spezifische Aktivität des gelösten Enzyms wurde als 100 % angesehen

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Immobilisierung von Carboxypeptidase-B-Enzym, gekennzeichnet dadurch, daß man ein aus Acrylsäure und/oder Methacrylsäure bzw. Acrylamid und/oder Methacrylamid hergestelltes, mindestens 0,1 m-Aquiv./g funktioneile Carboxygruppen enthaltendes polymeres Gel mit einer wasserlöslichen oder in organischen Lösungsmitteln bei einer Temperatur unter O⁰C löslichen Carbo-. diimid-Verbindung behandelt, auf den so aktivierten Träger das Carboxypeptidase-B-Enzym aus einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,5-8,5, vorzugsweise von 6,0-7,0 aufbringt, das so erhaltene immobilisierte Enzym wäscht und in wäßriger Suspension bei 0-4⁰C lagert und gegebenenfalls trocknet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man den Träger, das Carbodiimid und das Enzym in einem Verhältnis von 1:1 bis 2:0,25 bis 1, insbesondere von 1:2:0,25, verwendet., · '