DD222129A1 - Amperometrische enzymelektrode - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Enzymelektrode fuer amperometrische Konzentrationsbestimmungen. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, eine deutlich verbesserte mechanische und Langzeitstabilitaet, eine geringere Ansprechzeit, eine homogenere Enzymverteilung bei einfacher Herstellung zu erreichen. Eine amperometrische Enzymelektrode zur Konzentrationsbestimmung bestehend aus einem elektronenleitenden Teil und einem enzymatisch aktiven Komplex, der ein oder ggf. mehrere enzymatische Teile mit unterschiedlicher oder gleicher Substratspezifitaet und Aktivitaet aufweist und der ein Enzym, mehrere Enzyme ode Enzymgemische, Traegermaterial fuer die Enzyme, wie z. B. Gelatine und wasserloesliche Cellulosederivate und Kleber enthaelt, besteht erfindungsgemaess aus dem enzymatischen, einteiligen oder mehrteiligen Komplex (immobilisierte Enzyme), der unmittelbar ohne Zwischenmembran, ggf. mittels Kleber, auf dem elektronenleitenden Teil haftet und von einer Klebeschicht umhuellt ist. Die Teile des enzymatischen Komplexes sind durch Zwischenmembranen und/oder Kleberumhuellungen voneinander getrennt. Die Erfindung wird in der medizinischen Diagnostik und in der Lebensmittelindustrie eingesetzt.

Description

Amperometrische Enzymelektrode

Die Erfindung bezieht sich auf eine Enzymelektrode für amperometrische Konzentrationsbestimmungen. Die Elektrode eig net sich insbesondere zur quantitativen Bestimmung von Glukose, Harnsäure und Milchsäure.

Sie wird in der medizinischen Diagnostik und in der Lebensmittelindustrie eingesetzt.

Für die Anwendung in Sensoren und Reaktoren werden Enzyme vor allem durch Einschluß in Biopolymere wie Collagen, Gelatine oder Alginsäure, Vernetzung in einem Gemisch mit einem Inertprotein, z,B. Serumalbumin, Gelatine mittels bifunktioneller Agentien wie Glutardialdehyd sowie kovalenter Fixierung z.B. nach der Bromcyan- oder Azidmethode an Polysaccharide wie Sephadex oder Kollagen immobilisiert (K. Mosbach; Methods in Enzyme1. 44 (1976), Ju.Ou. Kulys "Analytische Systeme auf der Grundlage iummobilisierter Enzyme", Verlag Moskslas, Vilnius (1981), G.G. Guilbault "Analytical use of immobilized enzymes" in Enzyme engineering, Vol. 6, 395 (1982)). Die so erhaltenen Immobilisate besitzen den Nachteil, daß die mechanische Stabilität niedrig ist, so daß für eine praktische Anwendung eine zusätzliche Erhöhung der mechanischen Belastbarkeit durch Einschluß zwischen Membranen, Filtern erforderlich ist. Außerdem werden die als Träger verwendeten Biopolymere durch Enzyme wie Protease oder Dextranasen sowie durch Bakterien abgebaut und damit zersetzt.

Es ist.weiterhin bekannt, Enzyme durch Verkleben zu immobilisieren (DD-WP 153237). Bei dieser Immobilisierung von Enzymen besteht die Schwierigkeit, daß die Enzyme in den Klebern nicht löslich sind und deshalb eine gleichmäßige Verteilung des Enzyms schwer zu realisieren ist. Weiterhin wurde beschrieben, daß die mechanische Stabilität von körnigen Immobilisaten durch Aufbringen auf einen Formgegenstand, der mit Klebstoff überzogen ist, verbessert werden kann (IE 2438436). Bei diesem Verfahren wird offensichtlich ein Eindringen des Klebers in die körnigen Immobilisate dadurch vermieden, daß man den Kleber vor Aufbringen der immobilisierten Enzyme leicht antrocknen läßt und für empfindliche Enzyme größere Körner verwendet.

Die nach den bisher beschriebenen Verfahren hergestellten Immobilisate werden jeweils durch semipermeable Membranen an der Elektrodenoberfläche fixiert und so von der Meßlösung abgetrennt. Diese Membranen verlängern die Ansprechzeit der Elektrode und erniedrigen die Empfindlichkeit durch den zusätzlichen Diffusionswiderstand.Deshalb erscheinen Enzymelektroden,) bei denen die Enzymmoleküle direkt auf der Elektrodenoberfläche kovalent fixiert sind, als besonders günstig, Da hier aber nur eine monomolekulare Schicht an Enzym auf der Elektrode fixiert wird, ist die Funktionsstabilität niedrig, weil keine Reserve an Enzym vorliegt. Deshalb fällt die Empfindlichkeit - ausgedrückt durch die Steilheit der Eichkurve - relativ schnell ab./' '

Ziel der Erfindung ist es, gegenüber den beschriebenen Lösungen eine deutlich verbesserte mechanische und Langzeitstabilität, eine geringere Ansprechzeit sowie eine homogenere Enzymverteilung bei einfacher Herstellung zu erreichen

Wesens_der

Aufgabe der Erfindung ist es eine amperometrische Enzymelek trode zu schaffen, die deutlich verbesserte Funktionseigenschaften aufweist.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch eine amperometrische Enzymelektrode zur Konzentrationsbestimmung, bestehend aus einem elektronenleitenden Teil und einem enzymatisch aktiven Komplex, der aus einem oder ggf. mehreren enzymatischen Teilen mit unterschiedlicher oder gleicher Substratspezifität und Aktivität zusammegesetzt ist und der ein Enzym, mehrere Enzyme oder Enzymgemische in immobilisierter Form, wie z.B. in Gelatine und wasserlösliche Cellulosederivate, und Kleber enthält, gelöst.

Die erfindungsgemäße Lösung ist dadurch gekennzeichnet, daß der enzymatische Komplex unmittelbar ohne Zwischenmembran, ggf. mittels Kleber auf den elkektronenleitenden Teil haftet und von einer Kleberschicht umhüllt ist. Weiterhin ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß die Teile des enzymatischen Komplexes durch Zwischenmembranen und/oder Kleberumhüllungen voneinander getrennt sind. Die Kleberumhüllungen sind sauerstoff- und wasserstoffperoxiddurchlässig. Dafür eignen sich insbesondere Kleber auf Epoxid-, Pqlyesterharzbasis und Polyurethanbasis.

Folgende Enzyme lassen sich auf der erfindungsgemäßen Enzymelektrode immobilisieren: Glukoseoxidase, Katalase, Laktatoxidase, Uricase.

Die erfindungsgemäße Enzymelektrode wird im folgenden noch näher erläutert.

Der elektronenleitende Teil besteht in der Regel aus Platin oder Kohlenstoff. Es lassen sich aber auch handelsübliche Sauerstoffelektroden verwenden. '.

Der enzymatische Komplex enthält ein oder mehrere Enzyme oder Enzymgemische. Er ist folienartig ausgeführt und läßt sich dadurch verschiedenen Formkörpern anpassen. Bei der Bestimmung von Glucose wird das Enzym Glukoseoxidase mit einem Kleber zu einer Suspension angerührt und ein Tropfen von etwa 0,005 ml auf die Oberfläche der Indikatorelektrode aufgebracht. Nach dem Trocknen bei Raumtemperatur ist die Enzymelektrode einsetzbar zur Glukosebestimmung.

Die so hergestellten Enzymelektroden besitzen eine kurze Ansprechzeit, hohe Empfindlichkeit und sind einfach zu regenerieren.

Die Erfindung soll nachstehend an drei Beispielen erläutert werden.

Beispiel 1 ⁽

Glucoseoxidase wird nach bekanntem Verfahren mittels Gelatine wie folgt immobilisiert: ' In 1 ml 3 %iger Gelatinelösung werden 800 U Glucoseoxidase bei 40 ⁰C gelöst und die Lösung auf einer PVC-Platte mit

einer Fläche von 16 cm ausgestrichen. Nach 12 h Trocknungsdauer wird die enzymhaltige Gelatineschicht von^vder Unterlage gelöst und in 0,25 cm große Plättchen geschnitten. Ein glucoseoxidasehaltiges Gelatineplättchen wird auf eine Folie (Nephrophan) gebracht. Anschließend werden 10 μΐ einer Lösung aus Syspur K 8011 ® und Aceton (Konzentration der Lösung 1 g Syspur K 8011 ^yIOO ml Aceton) aufgetropft, eine zweite Folie (Polyäthylen) darübergedeckt und festgewalzt. Das System läßt man 24 h bei Raumtemperatur trocknen. Die so präparierte Enzymfolie wird auf eine handelsübliche Sauerstoffelektrode gespannt. Die so hergestellte Enzymelektrode wird in 2 ml 0,12 M Phosphatpuffer, pH 7,0 getaucht. Nach Einstellen eines konstanten Stromes bei -600 mV werden 0,5 ml einer glucosehaltigen Lösung zugesetzt und als Meßwert wird der Sauerstoffverbrauch verwendet. Der maximale Anstieg der Strom-Zeit-Kurve, nach Zugabe der Meßprobe, dient als Maß für die Glucosekonzentration.

Beispiel 2

Herstellung von Enzymfolien, mit mehreren Enzymen bzw. Enzymgemischen, für die erfindungsgemäße Enzymelektrode. - Herstellung der Schicht 1

Ein Gemisch aus 8Ö0 U Glucoseoxidase und 4800 U Katalase wird in 1 ml 3 %iger Gelatinelösung gelöst. Die Herstellung der enzymhaltigen Gelatineschicht erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.

2 Ein 0,25 cm großes enzymhaltiges Gelatineplättchen wird auf Folie (Nephrophan) gebracht. Anschließend werden 10 μΐ einer Lösung aus Syspur K 8011 -^ und Aceton (Konzentration wie in Beispiel 1) aufgetropft. Das System wird bei Raumtemperatur ca. 10 min getrocknet.

- Herstellung der Schicht 2 ₍

Ein Gemisch aus 800 U Glucoseoxidase und 1600 U Invertase wird in 1 ml 3 %iger Gelatinelösung gelöst. Die Herstellung der enzymhaltigen Gelatineschicht erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben. ι

2 Ein 0,25 cm großes enzymhaltiges Gelatineplättchen wird auf eine Folie (Nephrophan) gebracht. Anschließend werden 10 μΐ einer Lösung aus Syspur K 8011 ® und Aceton (Konzentration wie Beispiel 1) aufgetropft. Das System wird bei Raumtemperatur ca. 10 min getrocknet.

- Herstellung des Gesamtensembles

Schicht 1 und 2 werden aufeinandergelegt und.fest zusammengewalzt.

Das Gesamtsystem läßt man ca.: 24 h bei Raumtemperatur trocknen. '

Die so hergestellte Enzymfolie wird auf eine handelsübliche Sauerstoffelektrode gespannt. Das Enzymelektrodensystem wird in 2 ml Phosphatpuffer, pH 7,0, getaucht und 0,5 ml einer Saccharoselösung, die auch Glucose enthält, zugegeben. Gemessen wird die,HpOp-Bildung.

Beispiel 3

Zu einer Lösung von 1 ml.Syspur K 8011 ^ (Konzentration der Lösung: 1 g Syspur K 8011 ® pro 100 ml Aceton) werden 2000 U Glucoseoxidase gegeben. Dieses Gemisch wird in einen Kugelhomogenisator 15 min homogenisiert. Anschließend werden 10 μΐ dieses so erhaltenen Gemisches auf die Oberfläche einer Graphitelektrode (Fläche der Elektrode: 0,25 cm.) getropft. Das System wird bei Raumtemperatur ,ca. 20 min getrocknet. Nach insgesamt 24 h Lagerung im Kühlschrank ist das Elektrodensystem einsatzfähig.

Das Elektrodensystem wird in 2 ml Ph^vosphatpuffer getaucht. Nach Einstellen eines konstanten Stromes bei +600 mV werden 0,5 ml einer glucosehaltigen Lösung zugesetzt und-als Meßwert wird die Bildung von H„0₂ verwendet. Der maximale^Anstieg der Strom-Zeit-Kurve, nach Zugabe der Meßprobe, dient als Maß für die Glucosekonzentration .

Claims (3)

1. Λ-

   1. Amperometrische Enzymelektrode zur Konzentrationsbestimmung bestehend aus einem elektronenleitenden Teil und einem enzymatisch aktiven Komplex, der ein oder ggf. mehrere enzymatische Teile mit unterschiedlicher oder gleicher Substratspezifität und Aktivität aufweist und der ein Enzym, mehrere Enzyme oder Enzymgemische, Trägermaterial für,die Enzyme, wie z.B. Gelatine und wasserlösliche Cellulosederivate und Kleber enthält, gekennzeichnet daduch, daß der enzymatische, einteilige oder mehrteilige Komplex (immobilisierte Enzyme) unmittelbar ohne Zwischenmembran, ggf. mittels Kleber, auf dem elektronenleitenden Teil haftet und von einer Kleberschicht umhüllt ist und daß die Teile des enzymatischen Komplexes durch Zwischehmembranen und/oder Kleberumhüllungen voneinander getrennt sind.
2. 2. Amperometrische Enzymelektrode' nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß die Kleberumhüllung sauerstoff- und wasserstoff peroxiddurchlassig ist.
3. 3. Amperometrische Enzymelektrode nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß die Enzyme Oxidasen für Glucose, Laktat, Harnsäure oder Dehydrogenasen für Glutamat, Alkohol oder Laktat sind.