CZ40494A3 - Recombinant sequence dna, protein, micro-organism and a plant containing such dna - Google Patents

Description

Vynález se týká rodiny genu hsr (souvisejících s hypersenzitivitou) a jejích jednotlivých komponent včetně jejích promotoru a jejích regulačních oblastí, jejích kódujících oblastí a jejích genových produktů; jejich modifikací; použití tohoto genu, promotorové oblasti, regulační oblasti a kódující oblasti a jejich modifikací; a DNA-konstruktú, vektorů a transformovaných rostlin, které obsahují tento gen nebo jeho část.

Dosavadní stav techniky

Hypersenzitivní reakce (HR) vyšších rostlin je místně indukovatelná odpověd související s rezistencí vůči chorobě způsobované patogenem. Tato odpověd je charakterizována rychlou a lokalizovanou nekrosou tkání napadených nekompatibilním (avirulentním nebo nehostitelským) patogenem, která zabraňuje dalšímu šíření mikroorganismu, který napadl rostlinu. Některé obranné geny, jejichž produkty se mohou účastnit odpovědi rostliny, byly rozsáhle zkoumány. Pazří mezi ně enzymy fenylpropanoidové dráhy účastnící se syntézy antimikrobiálních fytoalexinů, enzymy s hydrolytickou akzivitou, toxické sloučeniny a proteiny buněčné stěny. V infikovaných rostlinách jsou tyto geny indukovány v okolí nekrosy poté co se tato nekrosa vytvoří, t.j. v pozdních fázích hypersenzitivní reakce. Kromě toho je většina z nich též silně exprimována během kompatibilní interakce vedoucí ke vzniku choroby rostliny, a některé .z nich během normálního -vývoje rostliny. Nedostatek specificity těchto obranných genu, stehně jako jejich aktivace v pozdních fázích hvpersenzizivní reakce svědčí o tom, že nemohou samy vysvětlovat vytvoření komplexní indukovatelné odpovědi, kterou je hypersenzitivní reakce, ale spíše mohou tuto reakci doprovázet. V současnosti nejsou známé molekulární mechanismy vedoucí od rozpoznání kontaktu rostlina - patogen k rozvinutí hypersenzitivní reakce. Podle hypotézy gen pro gen zahrnuje počáteční krok rozpoznání kontaktu rostlina - patogen vedoucího k rezistenci předpokládanou interakci mezi produkty genu rostliny a odpovídajícího avirulentního genu

Genetické výzkumy skutečně svědčí o tom, že výsledek mnoha interakcí rostlina - patogen je určován jedinými dominatními geny v obou partnerech. Byla zjištěna též některých rychlých fyziologických změn, jako elektrolytu, změny v rychlosti respirace a v současné době oxidativní zesítění proteinů buněčné stěny, s hypersenzitivní reakcí. V žádném případě však nebyl popsán rostlinný gen, jehož aktivace je specifická nebo alespoň přednostní během rezistentní reakce, a který předchází vzniku hypersenzitivní reakce.

rezistence patogena.

souvislost je unikání

Podstata vvnálezu

Je známo, že cévní bakterie Pseudomonas solanacearum způsobuje letální vadnutí různých druhů rostlin,- včetně rostlin z rodu Solanaceae. U této bakterie bylo zjištěno, že shluk genů hypersenzitivní odpovědi (hrp) a patogenity řídí jak schopnost vyvolat hypersenzitivní reakci v případě nehostitelských rostlin tak způsobit chorobu v případě « hostitelských rostlin. Mutanti Pseudomonas solanacearum zmutovaní v genu hrp zejména ztrácí schopnost vyvolat hypersenzitivní reakci u rostlin tabáku. V současné době bylo stanoveno, že gen hrpN ze shluku genů hrp jiného bakteriálního patogena, Erwinia amylovora, kóduje proteinový elicitor hypersenzitivní reakce, zvaný harpin. Toto zjištění potvrzuje důležitou roli genů hrp při vyvolání hypersenzitivní reakce. Po infiltraci listů tabáku nekompatibilním izolátem způsobujícím hypersenzitivní reakci bylo charakterizováno šest odlišných genových rodin, které jsou aktivovány v časné fázi interakce, dříve než byla zjištěna jakákoli nekrosa listu. Tyto geny, které nebyly indukovány po infiltraci hrp-izolátem, se liší v úrovních akumulace jejich transkripčních produktů během nekompatibilní interakce ve srovnání s kompatibilní interakcí: geny str (související se senzitivitou) jsou exprimovány v podobném rozsahu v případě obou typů interakcí, zatímco geny hsr jsou aktivovány přednostně během hypersenzitivní reakce.

Vynález se týká rodiny genů hsr reprezentované genem, který je zde dále označován hsr203J, jehož sekvence je znázorněna v SEQ ID č. 1. Předpokládaný protein (znázorněný v sekvenci SEQ ID č. 2), který je produktem genu vykazuje malou, pokud vůbec nějakou, podstatnou homologii se známými proteiny. Testy používající m.j. promozorovou oblast strukturního genu hsr203J operabilně navázanou k repcrtérovému genu při testech využívajících dočasnou expresi genu a v transgenických rostlinách svědčí o tom, že exprese genu hsr203J úzce souvisí s rozvojem hypersenzitivity: promozer je specificky aktivován během hypersenzitivní reakce několik hodin předtím, než se objeví nekrosa, a z hlediska lokalizace je jeho aktivace omezena na buňky inokulované nekompatibilním bakteriálním izolátem.

Vynález popisuje rekombinantní sekvenci DNA, která obsahuje oblast tvořenou nukleotidovou sekvencí znázorněnou v SEQ ID č. 1 nebo jejím funkčním ekvivalentem, a rekombinanzní sekvenci tvořenou částí shora uvedené oblasti nebo shora uvedeného ekvivalentu.

V textu používaný termín funkční ekvivalent, pokud se týká oblasti sekvence DNA kódující protein, označuje tuto oblast, ve které jeden nebo více kodónů bylo nahrazeno jejich synonymy, t.j. kodóny, které specifikují odpovídající aminokyselinu nebo odpovídající signál ukončující transkripci.

Pokud se používaný termín funkční ekvivalent týká oblastí sekvence regulujících transkripci, označuje tuto oblast, ve které jeden nebo více nukleotidů bylo nahrazeno odlišnými nukleotidy nebo/a oblast, ve které jeden nebo více nukleotidů bylo přidáno nebo odstraněno, s tou podmínkou, že si takto vytvořené ekvivalenty zachovávají transkripčně regulační aktivitu a vykazují podstatnou homologii s oblastí, rebo její částí, která se nachází v poloze směrem k 5' -konci cd výše uvedené oblasti kódující protein.

Termín podstatně homologní,

a.< 3 e zae používán, hybridizačních Vý hodně tyto oři které je označuje sekvenci DNA, podmínek hybridizuje s ,<tera za oeznycn eferenční sekvencí hybridizační podmínky označují hybridizaci, hodnota poloviční teploty denaturace (TM) mezi 35 a 45 °C. Nejvýhodněji termín podstatně homologní označuje sekvenci DNA, která hybridizuje s referenční sekvencí za přísných podmínek (jak jsou definovány níže).

Termín regulační oblast, jak je zde používán, označuje nukleotidovou oblast v sekvenci znázorněné jako EEQ ID č. 1, která se nachází v poloze směrem k 5' -konci od protein kódující oblasti sekvence. Termín regulační oblast t.ak zahrnuje promotor genu hsr203J a funkční komponenty promotoru, které ovlivňují transkripci. Mezi takové funkční komponenty patří deletovaný promotor a zesilovače a 'zeslabovače transkripce.

Deletovaným promotorem je v kontextu vynálezu libovolný promotor odvozený od hsr203J, který je ve srovnání s nativním promotorem deletován, a který si stále zachovává promotorovou aktivitu. Tato promotorové aktivita může být ve srovnání s nativním promotorem zesílená nebo v podstatě stejná. Odborníkovi je zřejmý způsob, jakým může být u deletovaných promotorů testováno zachování jejich promotorové aktivity. Deletované promotory podle vynálezu jsou indukovatelné, mimo jiné, rostlinnými patogeny, a lze je použít v konstruktech obsahujících strukturní geny poskytující zlepšenou rezistenci vůči chorobám.

Pokud je používán termín funkční ekvivalent ve spojení s proteinem, jehož sekvence je určována alespoň částí sekvence DNA znázorněné v SEQ ID č. 1, označuje protein, který má podobnou funkci a podobnou nebo zlepšenou specifickou aktivitu, a podobnou aminokyselinovou sekvenci. Vynález též popisuje čisté proteiny, které mají aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 60 % podobná sekvenci proteinu znázorněného v SEQ ID č. 2 nebo jeho části (viz níže). Výhodně činí stupeň podobnosti alespoň 60 %, výhodněji činí stupeň podobnosti alespoň 70 % a ještě výhodněji činí stupeň podobnosti alespoň 80 %.

V kontextu vynálezu jsou dvě sekvence aminokyselin, které si jsou alespoň z 60 % podobné definovány tak, že mají při optimálním porovnání alespoň 70 % identických nebo podobných aminokyselinových zbytků ve stejné poloze, s tím, že se připouští až 4 delece nebo až 10 adicí.

Pro účely vynálezu platí, že:

alanin, serin a threonin jsou si podobné, kyselina glutamová a kyselina asparagová jsou si podobné, asparagin a glutamin jsou si podobné, arginin a lysin jsou si podobné, isoleucin, leucin, methionin a valin jsou si podobné, a fenylalanin, tyrosin a tryptofan jsou si podobné.

Termín část, pokud je používán v souvislosti se sekvencí proteinu, označuje peptid obsažený v sekvenci znázorněné v SEQ ID č. 2, který má alespoň 5 aminokyselin. Výhodněji má peptid alespoň 20 aminokyselin a ještě výhodněji má peptid alespoň 40 aminokyselin.

Termín část,' pokud je používán v souvislosti s rukleotidovou sekvencí, označuje nukleotidovou sekvenci cbsaženou v sekvenci znázorněné v SEQ ID č. 1, která má clespoň 15 nukleotidů. Výhodněji má tato část alespoň 25 rukleotidů a ještě výhodněji má tato část alespoň 40 rukleotidů.

Vynález též zahrnuje rekombinantní sekvenci DNA cbsahující oblast tvořenou nukleotidy 1413 až 2417 ze sekvence znázorněné jako SEQ ID č. 1 nebo její funkční ekvivalent, a rekombinantní sekvenci cbsahující část této cblasti nebo tohoto ekvivalentu. Nukleotidy 1413 až 2417 odpovídají protein kódující oblasti genu hsr203J, užitečná tím, že genový produkt hraje funkčn rostlinách při regulaci nebo poskytování chorobám. Sekvenci kódující protein, nebo hsr203J lze fúzovat s indukovatelným promotorem, jako promotory regulující expresi proteinů WIN, WUN nebo PR, že je po infekci kompatibilním patogenem indukován strukturní cen hsr203J. Následná aktivace hypersenzitivní odpovědi pomocí proteinu hsr203J v infikovaných rostlinných buňkách zabrání dalšímu šíření patogena.

,<tera je roli v rezistence vůči její část, genu jsou tak,

Vynález též zahrnuje rekombinantní sekvenci DNA cbsahující oblast tvořenou nukleotidy 1 až 1341 ze sekvence znázorněné jako SEQ ID č. 1 nebo její funkční ekvivalent, a iekombinantní sekvenci obsahující část této oblasti nebo tohoto ekvivalentu. Nukleotidy 1 až 1341 odpovídají protein nekódující oblasti sekvence, která se nachází v poloze směrem k 5' -konci od shora uvedené protein kódující oblasti. Oblast výše uvedené sekvence DNA obsahující nukleotidy 1 až 1341 obsahuje transkripčně regulační oblast genu hsr203J, včetně promotoru (vazebného místa pro RNA-polymerasu) a zeslabovačů a zesilovačů transkripce.

Zeslabovací a zesilovací elementy mají ten význam, že umožňují modulovat úroveň exprese strukturního genu pod jejich kontrolou.

Vynález dále zahrnuje rekombinantní sekvenci DNA obsahující oblast tvořenou nukleotidy 1 až 651 ze sekvence znázorněné jako SEQ ID č. 1 nebo její funkční ekvivalent, a rekombinantní sekvenci obsahující část této oblasti nebo tohoto ekvivalentu. Oblast tvořená nukleotidy 1 až 651 obsahuje zeslabovač transkripce.

Vynález též zahrnuje rekombinantní sekvenci DNA obsahující oblast tvořenou nukleotidy 652 až 1341 ze sekvence znázorněné jako SEQ ID č. 1 nebo její funkční ekvivalent, a rekombinantní sekvenci obsahující část této oblasti nebo tohoto ekvivalentu. Oblast tvořená nukleotidy 652 až 1341 obsahuje zesilovač transkripce a promotor (t.j. vazebné místo RNA-polvmerasy) genu hsr203J.

Vynález dále popisuje použití promotorové sekvence hsr203J jako afinitního substrátu pro identifikaci a následnou purifikaci proteinů vázajících se na promotor hsr203J (hsr203J promotér binding proteins, hsr-P3P's) a proteiny spojené s těmito hsr-P3P's. Takové proteiny hsr-P3P' s byly částečně charakterizovány, jsou pravděpodobně přítomny konstitutivně a mohou se vázat na promotorové sekvence hsr203J při nekompatibilní reakci hostitelské rostliny, ke které dochází například pokud je tabák Nicotiana tabacum L. inokulován specifickým kmenem Pseudomonas solanacearum.

Vynález dále zahrnuje rekombinantní sekvenci DNA obsahující oblast tvořenou nukleotidy 1195 až 1341 ze sekvence znázorněné jako SEQ ID č. 1 nebo její funkční ekvivalent, a rekombinantní sekvenci obsahující část této oblasti nebo tohoto ekvivalentu. Oblast tvořená nukleotidy 1195 až 1341 obsahuje element, kterým rostlina odpovídá na přítomnost bakterií (bacterial response element), který je schopen vázat se na specifické proteiny vytvářené patogeny během infekce tkáně, a podmiňující rozvinutí hypersenzitivní odpovědi (viz výše).

Vynález dále zahrnuje rekombinantní sekvenci DNA obsahující oblast tvořenou nukleotidy 1135 až 1268 ze sekvence znázorněné jako SEQ ID č. 1 nebo její funkční ekvivalent, a rekombinantní sekvenci obsahující čász této oblasti nebo tohoto ekvivalentu. Tato oblast přesněji vymezuje element, kterým rostlina odpovídá na přítomnost bakterií.

Vynález dále zahrnuje rekombinantní sekvenci DNA, jak je popsána výše, ve které je shora uvedená oblasz, její část nebo ekvivalent umístěna směrem k 5'-konci od, a je operabilně navázána k, protein kódující sekvenci heterorogního genu nebo sekvenci obsahující nukleotidy 1413 až 2417 ze sekvence znázorněné jako SEQ ID č. 1 či jejímu funkčnímu ekvivalentu. Je zejména výhodné, pokud je přítomna sekvence zesilující translaci v poloze směrem k 3' -konci mezi touto oblastí, její částí nebo ekvivalentem a protein kódující oblastí sekvence DNA.

Heterologním genem může být libovolný vhodný strukturní gen, včetně markéru používaného pro výběr nebo vyhledávání, genu, jehož produkt je schopen poskytovat rezistenci nebo toleranci vůči alespoň jedné z položek skupiny zahrnující hmyz, herbicidy, houby, bakterie a viry, markerového genu pro použití při předpovědi výskytu choroby a genů proti požeru.

Promotorové nebo/a regulační oblasti genu hsr203J mohou být fúzovány se strukturním genem, který kóduje nedifusibilní cytotoxický genový produkt, jako je ribonukleasa, proteasa, lipasa nebo glukanasa. Indukce exprese takových strukturních genů způsobuje rychlou a lokalizovanou odpověa na infekci způsobenou patogeny, a může byt užitečná při poskytování rezistence nebo zlepšené tolerance rostliny vůči patogenů.

Kromě toho mohou být regulační oblasti genu hsr203J použity při vytváření detektorových rostlin umožňujících časnou detekci výskytu choroby. Promotor hsr203J, nebo/a jeho regulační oblasti, mohou být fúzovány s nukleotidovou sekvencí způsobující vizuální změnu fenotypu hostitelské rostliny při aktivaci promotoru infekcí. Mezi takovéto nukleotidové sekvence patří v anti-sense orientaci gen kódující malou podjednotku ribulosa-3-fosfo-karboxylasy (SS-RU3ISC0), která způsobuje lokalizované odbarvení zelených tkání. Tyto sekvence mohou též kódovat gen kódující klíčový enzym v biosyntéze pigmentu, jako je chalkon-synthasa.

Vynález též zahrnuje rekombinantní DNA podle vynálezu, která je modifikována tak, že jsou použity kodóny, které jsou preferovány organismem, do kterého má být rekombinantní DNA inzertována, takže se expresí takto modifikované DNA v shora uvedeném organismu získá v podstatě podobný protein jako expresí nemodifikované rekombinantní DNA v organismu, ve kterém jsou komponenty rekombinantní DNA, které kódují protein, endogenní.

Vynález dále zahrnuje sekvenci DNA, která je komplementární k sekvenci, která za přísných podmínek hybridizuje s libovolnou z výše popsaných rekombinantních sekvencí DNA.

Termín přísné hybridizační podmínky označuje podmínky, kdy je hybridizace prováděna při teplotě mezi 50 a 60 °C v 2X citratovém pufru s chloridem sodným (SCC) obsahujícím 0,1 % dodecylsulfátu sodného (SDS) s následným několikanásobným promytím při stjené teplotě, ale v pufru se sníženou koncentrací SCC, která neovlivňuje hybridizaci, která proběhla. Takovou sníženou koncentrací pufru je (a) 1 x SCC, 0,1 % SDS, nebo (b) 0,5 x SCC, 0,1 % SDS, respektive ;c) 0,1 x SCC, 0,1 % SDS.

Vynález dále zahrnuje DNA-vektor obsahující rekombinantní sekvenci DNA podle vynálezu, nebo sekvenci DNA, která je komplementární k sekvenci, která s ní za přísných podmínek hybridizuje.

Výhodné je použití vektoru podle vynálezu pro transformaci eukaryotického hostitele, s výhodou rostlinného původu. Je třeba vzít v úvahu, že tímto vektorem mohou byt transformovány vhodné mikroorganismy, a takové mikroorganismy tvoří další provedení vynálezu.

Termín rostlina je zde používán v širokém smyslu slova, a označuje diferencované rostliny stejně jako nediferencovaný rostlinný materiál, jako jsou protoplasty, rostlinné buňky, semena, klíční rostliny atd., ze kterého se ta vhodných podmínek mohou vyvinout maturované rostliny, a dále jejich potomstvo a jejich části, jako jsou řízky a plody takových rostlin.

Výhodné vektory se samozřejmě liší v závislosti na •vybrané hostitelské rostlině. U dvouděložnýcn může být vektor zaveden do protoplastu pomocí kontaktu vektoru s protoplastem ”e vhodném mediu a za vhodných podmínek, které způsobují, že e protoplast schopný přijmout DNA; může být též použit vektor ve formě derivátu Ti-plasmidu Agrobacterium tume^:aciens, který infikuje rostlinné buňky nebo protoplasty.

Jednoděložné rostliny se výhodně transformují pomocí mikroinjektáže, elektroporace nebo pomocí vstřelování mikroza použiti taxzvane případě jsou vhodné v oboru dobře známé.

projektilů (micro-projectile gun) balistické techniky. V každém transformační vektory a postupy

Transformované buňky nebo protoplasty se kultivují ve vhodném kultivačním mediu, a transformované rostliny se regenerují o sobě známým způsobem. Introdukovaný jaderný materiál je stabilně začleněn do genomu regenerovaných transformovaných rostlin, které v souladu s tím exprimují požadované geny.

Příklady geneticky modifikovaných rostlin podle vynálezu zahrnují: ovocné plodiny , včetně rajčete, pepřovníku, mangovníku, broskvoně, jabloně, hrušně, jahodníku, banánovníku a melounu, polní plodiny jako je řepka a řepice typu canola, slunečnice, tabák, cukrová řepa, drcbnozrnné obilniny jako je pšenice, ječmen a rýže, kukuřice a bavlník, a zeleniny jako je brambor, mrkev, salát, Brassica oleracea jako je zelí, a cibule. Zejména výhodnými rostlinami jsou cukrová řepa a kukuřice.

Vynález dále zahrnuje potomstvo a semena takových rostlin, a semena a potomstvo tohoto potomstva. Vynález dále zahrnuje protein získaný expresí rekombinantní DNA podle vynálezu, a zejména exprimovaný protein, který má sekvenci aminokyselin znázorněnou v SEQ ID č. 2, nebo jeho část nebo funkční ekvivalent shora uvedené sekvence nebo části.

Vynález dále ilustri připojené obrázky a sekvence.

následuj ící příklady, a

Popis obrázků

Obrázek 1 znázorňuje chimérický konstrukt používaný při testech dočasné exprese genu v protoplastech tabáku a při transformaci rostlin tabáku pomocí Agrobacterium turnéřaciens. Obrázek (A) zobrazuje restrikčni mapu chimérického genu beta-glukuronidasy v pHG21 (nebo pHG21A). Tento gen je tvořen translační fúzí mezi 5' lemovací sekvencí o velikosti 1,4 kb z genu hsr203J a kódující oblastí genu uidA navázanou k polyadenylačnímu signálu genu nopalin-synthasy (nos T) . Symbol p označuje promotor genu hsr203J, symbol g označuje gen beta-glukuronidasy. Obrázek (B) znázorňuje sekvenci (SEQ ID č. 2) místa spojení translační fúze pHG21. Sekvence genu hsr203J je zapsána tučným písmem a sekvence uidA je zapsána obyčejným písmem. Orientace je od 5' -konce k 3' -konci, šipka v obrázku označuje polohu fúze mezi sekvencemi.

Obrázek 2 znázorňuje účinek infekce různými izoláty (hrp, K 60 a GMI 1000) Pseudomonas solanacearum na aktivicu promotoru hsr203J v transformovaných protoplastech tabáku. Sako kontrola byla k protoplastům přidávána voda. Plazmidy p3l201 a p3l221 jsou negativní, respektive pozitivní kontrolní plazmidy; pHG21 představuje fúzi genů hsr203J-uidA. Měření aktivity GUS bylo provedeno 24 hodin po inkubaci. Uvedené údaje představují průměr z tří oddělených pokusů. Symbol A označuje aktivitu GUS v pmol / min / mg proteinu.

Obrázek 3 znázorňuje časový průběh aktivace promotoru lsr203J genu GUS v listech transgenického tabáku infiltrovaných různými izoláty (hrp, K 60 a GMI 1000) Pseudomonas solanacearum. Aktivita GUS byla měřena v extraktech ze čtyř listů z dvou rostlin transformovaných pHG21-14A. Symbol A cznačuje relativní aktivitu GUS a symbol t čas po inokulací v fodinách.

Obrázek 4 znázorňuje kvantitativní analýzu aktivity GUS v transgenických rostlinách tabáku lokálně infikovaných bakteriemi. Obrázek (A) zobrazuje indukci aktivity beta-glukuronidasy v inokulovaném třetím listu a ve vyšších a nižších neinokulovaných listech. Obrázek (3) znázorňuje indukci aktivity beta-glukuronidasy v lézi a v okolí léze na inokulovaném třetím listu. 3yly zkoumány následující vzorky tkání: léze (v obrázku označeno symbolem 1), která označuje nekrotickou tkáň vzniklou jako důsledek poranění nebo/a bakteriální infekce, 0 - 3 mm označuje očividně zdravou tkáň ve vzdálenosti až 3 mm od léze, mm označuje očividně zdravou tkáň obklopující lézi ve vzdálenosti 3 až mm.

Inokulace byla prováděna na pHG21-14A. Malé perforace bakteriální suspenze (3 ,ul, bakteriálních buněk) / ml) rostlinách transformovaných listů byly překryty kapičkou koncentrace 10^b c.f.u. (živých nebo vody, jak je uvedeno v obrázku. Vzorky tkání byly odebrány 18 hodin po inokulaci. Symbol A označuje aktivitu GUS v pmol / min / mg proteinu, symbol i znamená inokulovaný list, symbol v vyšší liszy a symbol n nižší listy.

Obrázek 5 znázorňuje vliv hrp-mutanzů na aktivaci promotoru hsr203J v transgenických rostlinách tabáku (transformovaných pHG21(14A)). Obrázek (A) znázorňuje lokalizaci hrp-mutací v odlišných transkripčních jednotkách shluku genů hrp. Obrázek (3) zobrazuje výsledky měření aktivity GUS v listech 18 hodin po inokulaci izoláty hrp, KfcO nebo GMI 1000 či vodou, nebo hrp-mutanty uvedenými v obrázku (A). Inokulace byla prováděna jak je popsáno v popisu obrázku. 4. Symbol s znamená shluk hrp, symbol A představuje relativní akzivitu GUS.

Obrázek 6 schematicky znázorňuje kontrukci plazmidů pHGD majících deletované některé části z pHG2l·. 'Symbol p označuje promotor genu hsr203J,

Obrázek 7 znázorňuje expresi genu GUS v transgenických rostlinách tabáku transformovaných pomocí konstruktů získaných deletováním promotoru v pHG21 od 5' -konce (podle schématu uvedeného na obrázku 5). Rostliny byly transformovány 5 _zug DNA, a hodnota 100 udává aktivitu GUS dosaženou při transformaci pomocí konstruktu pHG21. Obrázek znázorňuje zvýšení aktivity genu GUS (po 18 hodinách), jako důsledku infilitrace transformovaných rostlin bakteriálními kmeny Delta 3, K60 a GMI 1000. Kontrolní rostliny byly infilitrovány vodou. Symbol P znamená promotor (bp) a symbol A představuje relativní aktivitu GUS (v % ve srovnání s promotorem o plné délce při infiltraci kmeneme GMI 1000) .

Popis sekvencí

Sekvence SEQ ID č. .1 zobrazuje nukleotidovou sekvenci genu nsr203J, včezně protein kódující oblasti a jejích promotorových elementů a elementů regulace transkripce, izolovaného z tabáku. Protein kódující oblast genu je v sekvenci tvořena nukleotidy 1413 až 2417. Předpokládané polvadenylační signály jsou přítomny v poloze směrem k 3'-konci od protein kódující oblasti genu a sekvence odpovídající za hypersenzitivní reakci se nachází v 5' -nekódující oblasti genu o velikosti 1,4 kb. Sekvence v podstatě obsahuj e

a) vedoucí sekvenci mRNA o velikosti 72 bp, umístěnou v nukleotidové poloze 1341 až 1412 včetně,

b) konvenční sekvence CAAT a TATA umístěné v nukleotidové poloze 1282 až 1286, respektive 1313 až 1316,

c) kodón místa počátku translace umístěný v nukleotidóvé poloze 1413 až 1415,

d) sekvenci deletovaného promotoru umístěnou v nukleotidóvé poloze 1 až 1341 včetně, která je v podstatě odpovědná za promotorovou aktivitu

e) sekvenci umístěnou v nukleotidóvé poloze 1155 až 1268, která má zesilující účinek na promotorovou aktivitu,

f) sekvenci umístěnou v nukleotidóvé poloze 1 až 651, která má zeslabující účinek na promotorovou aktivitu.

Sekvence SEQ ID č. 2 znázorňuje translační produkt strukturního genu hsr203J, kódovaný nukleotidy 1413 až 2417 v sekvenci SEQ ID č. 1.

Sekvence SEQ ID č. 3 zobrazuje oblast linkeru chimérického genu obsahujícího 5' -lemovací oblast strukturního genu hsr203J a kódující oblast reportérového genu uidA. Počáteční kodón strukturního genu hsr203J je umístěn v poloze 10 až 12 v sekvenci, a nukleotidy 13 až 64 kódují N-koncovou sekvenci produktu genu hsr203J.

Příklady provedení -vvnálezu

Bakteriální kmeny a rostlinný materiál

Zdroj používaných kmenů Pseudomonas solanacearum je uveden v tabulce 1.

Tabulka 1

Používané kmeny divokého typu a mutantní kmeny Pseudomonas solanacearum, a jejich schopnost indukovat symptomy na tabáku

Kmeny Zdroj nebo odkaz Izolované z Odpověd tabáku

Divoký typ

DMI 1000 Boucher a kol. (1) rajčete HR

K60 Lozano a kol. (17) rajčete choroba

Mutanti odvození od GMI 1000 (delece shluku genů hrp)

Ahrp Boucher a kol., žádné symptomy nepublikováno

Mutanti ve shluku genů hrp odvození cd C-MI 1000 (mutageneze Tn5-320)

DMI 1462,

1475, 1494, Arlat a kol. (18) žádné symptomy

1492, 1487

DMI 1423, Arlat a kol. (18) částečná nebo/a

1425 opožděná HR

Mutanti odvození od GMI 1000 (mutageneze Tn5-320 vně shluku genů hrp)

GMI 1485 Arlat a kol. (18) HR

Barberis, P.

(1985) J. Gen

Legenda k tabulce 1:

(1)

Boucher, C. A Demery, D. A . 2457

A., Trigalet, A. P., a Microbiol. 131, 2449 (17) (18)

Lozano,- J. 833 - 838-	C. a	Sequeira, L.	(1970)	Phytopathol. 60,
Arlat, M.,	Gough,	C. L., Zischek, C.,	Barberis, P. A.,
Trigalet,	A. , a	Boucher, C.	A. (1992) Mol. Plant
Microbe Interact.	5, 187 - 193

Izoláty GMI1000

K60 isou kmeny Pseudomonas solanacearum divokého typu, z nichž dříve zmíněný indukuje na reakce během 24 oů sobu ie tvpi ck é listech tabáku vytvoření hypersenzitivní hodin po infiltraci, a později zmíněný letální vadnutí. Derivát izolátu GMI1C00, zvaný óhrp v němž je deletován shluk genu hrp, nevyvolává na inokulovaných listech žádné zjevné symptomy. Osm mutantních kmenu odvozených od GMI1000 pomocí mutageneze využívající transpozon Tn5-320 se použije jak je popsáno níže. Každý z kmenu GMI1462, 1475, 1494, 1485, 1423 a 1425 je zmutován v jedné ze šesti předpokládaných transkripčních jednotek shluku genů hrp. Všechny tyto kmeny ztratily schopnost vyvolávat u tabáku hypersenzitivní reakci, s výjimkou laněmi GMI1423 a 1425, které jsou zmutovány na pravém konci shluku genu hrp, a indukují u tabáku pouze částečnou nebo/a opožděnou hypersenzitivní reakci, a kmenu GMI1485, který je zmutován vně shluku genů hrp a vyvolává u tabáku normální hypersenzizivní reakci a konstitutivně exprimuje strukturní gen beta-galaktosidasy. Všechny tyto kmeny se pěstují při teplotě 28 °C v mediu 3 nebo 3GT (Boucher, C. A., Bar-beris, ?. A.,

Trigalet, A. P., a Demery, D. ,A. (1985) J. Gen. Microbiol.

131, 2449 - 2457). Používané kultivary tabáku Nicotiana tabacum L. , Bottom Speciál a Samsun, vykazují po inokulaci bakteriemi podobné odpovědi. Semenáčky se pěstují in vitro na mediu Murashige a Skoog (MS) (Murashige, T. a Skoog, F. (19629 Physiol. Plant 15, 473 - 497) po dobu 4 až 5 týdnů, (při teplotě 25 °C, fotoperiodě 16 hodin, 15 Watt / m²) a poté přeneseny do půdy v. růstové komoře (při teplotě 25 °C, fotoperiodě 16 hodin, 30 Watt / m²) .

Izolace genu hsr203J, a analýza nukleotidové sekvence cDNA-klonem pNt203 (Marco, Y. J., Ragueh, F., Godiard, L., a Froissard, D. (1990) Plant Mol. Biol. 15, 145 - 154) se provede screening genomové knihovny tabáku (Nicotiana tabacum L. kultivar NK326) zkonstruované v bakteriofágu Iambda-Embl3 'Clontech). Inzert pSTI z pNt203 se označí pomocí náhodných primerů (random primer technique) (Feinberg, A. P. a Vogelstein, 3. (1983) Anal. Biochem. 132, 6 - 13) . Nitrocelulosové filtry genomové knihovny se ošetří a hybridizují podle pokynů výrobce (Amersham). Izolují se čtyři odlišné ς-enomové klony včetně hsr203J. Pomocí exonukleasy III se provedou delece na oboji. koncích inzertů DNA subklonovaných do iágmidu pKS (Stratagene) podle Henikoffa (Henikoff, S. (1984) Gene 28; 351 - 359), a obě vlákna se sekvenují pomocí postupu využívajícího dideoxyribonukleotidú jako terminátorů reakce dideoxy chain termination method) (Sanger, F., Nicklen, S. a Goulson, R. (1977) Pnas. (USA) 74, 5463 - 5467) za použití

Sequenasy (US Biochemical, Corp.). Kompilace a analýzy sekvence se provádí za použití softwaru Genetics Computer Group z univerzity University of Wisconsin (Devereux, J., Faeberli, P. a Smithies, O. (1984) Nucleic Acids Res. 13, : 87 - 395) . Zkoumání homologie za použití databází Genebank verze 71,0) a Swissprot (verze 21,0) se provádí pomocí e.lgoritmu FASTA (Pearson, W. R., a Lipman, D. J. (1988) PNAS.

(USA) 85, 2444 - 2448). Proteinové sekvence se analyzují z hlediska výskytu potenciálních N-koncových signálních sekvencí a domén procházejících membránou za použití verze 5,0 programu PC/Gene Programme (Department of Medical Biochemistry, University of Geneva, Švýcarsko). Místo počátku transkripce se určí pomocí postupu primer extension za použití polyA+ RNA extrahované z listů tabáku 9 hodin po inokulaci nekompatibilním izolátem a oligonukleotidu umístěného na kodónů ATG (nukleotidy 1413 až 1415 v sekvenci SEQ ID č. 1).

Konstrukty reportérových genů

Fragment 3glII o délce 2,2 kilobází (kb), který obsahuje 1,3 kb 5' -nekódující oblasti genu hsr203J tabáku a 390 párů bází (bp) nukleotidová sekvence downstream od mísza počátku transkripce se klonuje do místa BamHI fágmidu pKS, čímž se získá pKJ2,2. Tento plazmid se rozštěpí pomocí BstBI, která provede jedno štěpení 55 bp směrem k 3' -konci od kodónů iniciace translace hsr203J, konce vytvořené BstBI se otupí a ligují pomocí Klenow fragmentu DNA-polymerasy a pocé se provede rozštěpení pomocí Sáli. Tento fragment Sáli - BstBI o velikosti 1,5 kb se klonuje do místa Sáli - Smál expresivního binárního vektoru p3I101,2 exprimujíčího beta-glukuronidasu (Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A. a 3evan, M. W. (1987) EM30 J. 6, 3901 - 3907), čímž se dosáhne genové fúze hsr203J-uidA pHG21A. Fragment DNA HindlII-EcoRI o velikosti 3,5 kb z pHG21A, obsahující promotor hsr203J a kódující sekvenci uidA, se liguje do vektoru pUCIS rozštěpeného HindlII - EcoRI, čímž se získá pHG21, pro provedení testů dočasné exprese genu (obrázek 1). Konstrukty. pHG21 a pHG21A tedy obsahují 5' -nekódující sekvenci o velikosti 1341 bp, vedoucí sekvenci o velikosti 72 bp, prvních 55. bp kódující sekvence hsr203J fúzovaných ve stejném čtecím rámci se sekvencí kódující GUS, a polyadenylační signál genu nopalin-synthasy (nos). Vznik translační fúze se potvrdí pomocí přímého sekvenování obou vláken za použití primeru specifického pro GUS (Jefferson, R. A. (1987) Plant Mol. Biol. Reportér 5, 387 - 405). Dva další plazmidy, p3l201 a p3I221 obsahují gen uidA bez promotoru, respektive promotor. 'viru mozaiky květáku (CaMV) 35S a gen uidA, upstream (Clontech) .

od terminátoru nos, ve vektoru pUC19 izolace protoplastu a testy dočasné exprese

Listy 4 až 5 týdnů starých rostlin tabáku, kultivaru Samsun NN, pěstovaných in vitro, se použijí pro izolaci protoplastů pomocí inkubace Částí listu v mediu TO (Chupeau, Y., Bourgin, J. P,, Missonier, C., Dorion, N. a Mcrel, G. (1974) Compte-rendu á 1 Académie des Sciences Paris 278, 1565 - 1568) obsahujícím 1 g / 1 celuiasy R10 Onozuka, 200 mg/1 macerozymu Onozuka (Yakult Honsha, Nishinomiya, Japonsko) a 500 mg / 1 pektolyasy Y23 (Seishin Pharmaceutical Ind.) po dobu 15 hodin při teplotě 22 °C v temnu. Protoplasty se oddělí odporušených buněk za použití nylonové tkaniny o velikosti ok 85 _zum a následnou centrifugací při 50 g po dobu 5 minut nad 1 ml 19% roztoku (hmotnost / objem) sacharosy. Protoplasty nacházející se v kapalné fázi se jednou promyjí mediem TO, spočítají, a jejich hustota se upraví na hodnotu 1,5 x 10° protoplastů / ml. Transformace se provádí pomocí inkubace protoplastů (vzorky o objemu 320 _zul) při teplotě 45 °C po dobu 5 minut, po rychlém ochlazení na teplotu místnosti, za přidání plazmidové DNA (50 _zug na vzorek v lOmM Tris-HCl, pH 8) a 160 _zul roztoku polyethylenglykolu (PEG) (40 % PEG, 0,4 M manitolu, 30 mM chloridu hořečnatého, 0,1 % morfolinethansulfonové kyseliny (Mes), pH 5,8). Protoplasty se mírně míchají po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Poté se oddělí pomocí centrifugace a znovu převedou do suspenze v 500 _zul media TO. Poté se přidá bakteriální suspenze (10 bakterií na protoplast) , připravená jak bylo popsáno dříve (Ragueh, F., Lescure, N., Roby, D. a Marco, Y. (1989) Physiol. Mol. Plant Pathol. 35, 23 - 33). Po inkubaci po dobu 24 hodin při teplotě 28 °C se protoplasty lyžují pomocí přidání 50 _zul 10X pufru GUS, provede se centrifugace a v supernatantu se zkoumá aktivita GUS (Jefferson, R. A. (19'8-7) Plant Mol. Biol. Reportér 5, 387 - 405).

Transgenické rostliny tabáku pHG2A, p3I121 a p3I101 se přenesou z Escnerichia coli THSalfa do kmenu Agrobacterium tumefaciens L3A 4404 (3evan, M. W. (1384) Nucleic Acids Res. 12, 8711 - 8721) a vytvoří se transgenické rostliny tabáku (Nicotiana tabacum, 3ottom Speciál) pomocí postupu využívajícího listových terčíků (Horsch, R. 3., Fraley, R. T., Rogers, S. G., Sanders, ?. R. Lloyd, A. a Hoffmann, N. L. (1384) Science 223, 436 - 438) . Provede se selekce transformovaných rostlin na mediu MS obsahujícím agar Difco (0_r8 %), kanamycin v koncentraci 100 _zug / ml a karbenicillin v koncentraci 500 ,ug Z ml. ϋ transgenických rostlin se provede samoopylení a sklidí se semena . Jejich genotypy se stanoví za použití analýzy potomstva (T2), pomocí klíčení na mediu MS obsahujícím kanamycin (500 _zug / ml).

Inokulace transgenických rostlin bakteriálními izoláty

Všechny pokusy s inokulací se provádí na rostlinách T2 rezistentních vůči kanamycinu, s alespoň dvěma rostlinami stejného genotypu na každé konkrétní podmínky pokusu. Pro· vyhledávání transformovaných rostlin a kinetické pokusy se listy tabáku oddělí z rostlin starých osm týdnů a infiltrují se ve vakuu bakteriální suspenzí (10⁷ c.f.u. / ml) nebo vodou, jak popsali Ragueh, F., Lescure, N., Roby, D. a Marco, Y. (1989) Physiol. Mol. Plant Pathol. 35, 23 - 33. Pokusy s infiltrací pomocí injekční stříkačky se provádí na rostlinách starých osm dnů pomocí infiltrace bakteriální suspenze (10⁸ c.f.u. / ml) do malé oblasti neporušených listů za použití injekční stříkačky bez jehly. V některých pokusech se provádí inokulace rostlin starých pět týdnů pěstovaných v miskách Magenta (Magenta cubes, Sigma) na mediu MS. Každá polovina listu se šestkrát perforuje jehlou (Hamilton) o objemu 10 ,ul a na poraněná místa se okamžitě nanese kapička bakteriální suspenze (10⁸ c.f.u. / ml v 0,4% agaru Difco) o objemu 3 _zul.

Při lokalizované inokulaci kořenů se rostliny staré 4 týdny hydroponicky pěstují na plujících podložkách (Sigma) v kontaktu s mediem MS obsahujícím 0,2% agar Difco, a inokulují se kapičkou bakteriální suspenze o objemu 3 ,ul přes zranění způsobené jehlou ve vzdálenosti jeden centimetr od vrcholu kořene nebo v místě, kde se objevuje sekundární kořen. Při celkové inokulaci kořenů se celá rostlina opatrně vyjme z plující podložky tak, aby se předešlo poranění, a kořenový systém se ponoří do 7 ml bakteriální suspenze (10® c.f.u. / / ml) .

Inokulované rostliny se pěstují při teplotě 28 °C, a po inkubační době se analyzují bud přímo nebo jsou skladovány při -80 °C.

Testy za použití GUS

Rostlinná tkáň se rozmělní v kapalném dusíku, homogenizuje v IX pufru GUS, centrifuguje po dobu 5 minut při 10.000 g a u supernatantu se stanoví aktivita GUS, jak bylo popsáno dříve (Roby,' D., Broglie, K., Cressman, R., Biddle, Chet, I. a Broglie, R. (1990) Plant Cell 2, 999 - 1007).

Koncentrace proteinu se stanoví za použití Bradfordova barvicího činidla. Aktivita GUS se vyjádří jako pikomoly 4-methylumbelliferonu za minutu na mg proteinu. Alternativně se provedou histochemické testy na čerstvé tkáni za použití X-gluc (5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glukuronid, Clontech) nebo Magenta-gluc (Biosynth AG) jako substrátu (Jefferson, R. A. (1937) Plant Mol. 3iol. Reportér 5, 387 - 405). Pro některé pokusy se vzorky fixují ve směsi 0,3 % formaldehydu s 50 mM natriumfosfátového pufru, pH 7, poté se vyčeří varem v ethanolu a skladují v 70% ethanolu.

Testy za použití beta-galaktosidasy

Monoagu, M. 333 - 838)

Po histochemickém testu za použití GUS se některé vzorky ekvilibrují s pufrem Z' (Teeri, T. H., Lehvaslaiho,

K., Franck, M., Uotila, J., Heino, P., Palva, Ξ. T., Van a Herrera-Estralla, L. (1970) Pnytopathol. 60, (lOOmM natriumfosfátový pufr chlorid draselný, ImM síran hořečnatý), glutaraldehydu po dobu 1 hodiny kvůli inaktivací endogenních rostlinných beta-galaktosidas, promyjí a obarví při teplotě 28 °C 0,8 mg / ml činidla Magenta-Gal

X-gal v pufru Z' obsahujícím 5 mM draselného a 5 mM hexakyanoželeznatanu draselného, poté se vyčeří varem v ethanolu a mikroskopicky pozorují.

o pH 7,4, lOmM fixují v 1,25% (Biosynth Ag) nebo hexakyanoželezitanu

Charakterizace genu hsr203J

Gen hsr203J se izoluje pomocí screeningu genomové knihovny tabáku cDNA-klonem pNt203. Patří do malé multigenové rodiny sestávající minimálně ze 4 genů (viz Marco, Y. J., Ragueh, F.,' Godiard, L., a Froissard, D. (1990) Plant Mol. Biol. 15, 145 - 154) a alespoň dva geny této rodiny odpovídající dvěma odlišným cDNA-klonům (pNt203 a pNt239) jsou exprimovány během hypersenzitivní reakce.

Analýzou sekvence oblasti DNA hsr203J o velikosti 2,7 kb (SEQ ID č. 1) byl nalezen jediný otevřený čtecí rámec (ORF) bez intronu s potenciální kódující kapacitou 355 aminokyselin. Nukleotidová sekvence této oblasti o velikosti 2,7 kb je identická s cDNA-klonem pNt239 s výjimkou dvou substituovaných páru bází (není uvedeno). Tato místa, kde je porušena homologie jsou přítomna pravděpodobně díky izolaci genomového klonu a cDNA-klonu z odlišných kultivarů tabáku.:

genomový klon je izolován cDNA-klon pNt239 je získán kultivaru NK326, zatímco kultivaru Bottom Speciál.

Předpovídaný strukturní protein hsr203J (SEQ ID č. 2'.

ma molekulovou hmotnost 37,5 kDa a teoretický izoelektrický bod 5,17.

;e zmapované pomoci postupu 7 2 bp upstreain od předtranslace. Promotorové a

Místo počátku transkripce primer extension do polohy pokládaného kodónu iniciace

5'-nepřekládaná oblast nevykazují zřejmou homologii sekvence s cis-elementy,- které byly již dříve popsány v obranných genech.

Dočasná exprese fúze genů hsr203J-uidA v protoplastech tabáku

Plazmid pHG21 se skládá z translační fúze mezi 5' -lemovací sekvencí z genu hsr203J o velikosti 1,4 kb a kódující oblastí reportérového genu uidA, navázaného k 3' -nepřekládané oblasti genu nopalin-synthasy (obrázek 2). Při testech dočasné exprese se používá plazmidů p3I201 a p3I221 jako negativní, respektive pozitivní kontroly.

Počáteční pokusy ukazují, že životaschopnost protoplastů kvantifikovaná pomocí stanovení za použití Evansovy modři není podstatně měněna při přítomnosti bakterií v množství 10 až 100 bakterií na protoplast (údaje nejsou uvedeny). Následující pokusy se provádějí s množstvím 10 bakterií na protoplast. Při této hustotě bakterií je exprese GUS fúzovaného s promotorem hsr203J jako odpověd na izolát GMI1000 šestkrát vyšší než odpověd na kontroly (inokulace vodou nebo ^hrp) (obrázek 3) . Pro porovnání, inokulace kompatibilním izolátem, K60, vede k dvojnásobnému zvýšení aktivity enzymu. Tyto hodnoty aktivity GUS musí být porovnány s hodnotami naměřenými v případě protoplastú transformovaných pomocí genové fúze CaMV 35S-uidA (p3l221), které vykazují vysokou a téměř konstitutivní hodnotu při různých inokulacích (obrázek 3).

Výsledky testů dočasné exprese tedy jasně svědčí o tom, že promozor hsr203J obsahuje všechny elementy nutné pro jeho přednostní aktivaci pomocí bakteriálního izolátu indukujícího hypersenzitivní reakci, a že tento systém exprese výborně napodobuje interakci rostlina - patogen.

Exprese cenové fúze hsr203J-uid A v transgenickém tabáku

Pro stanovení charakteru exprese promotoru hsr203J v rostlinách z prostorového a časového hlediska se přenese genová fúze hsr203J-uidA do tabáku pomocí transformace využívající liszcvých terčíků. Ve všech pokusech se používají rostliny T2 rezistentní vůči kanamycinu. Z 23 transformovaných rostlin rezistentních vůči kanamycinu jich 20 exprimuje genovou fúzi a všech těchto 20 rostlin vykazuje stejný celkový charakter exprese: maximální aktivita GUS se zjiszí po infiltraci GMI1000, kdy je stimulace dvojnásobná až devadesátinásobná ve srovnání s kontrolními infiltracemi (voďcu nebo úhrp) , a při infiltraci K60 je indukce 2- až '.25-násobná, 18 hodin po inokulaci (není zobrazeno). Tyto hodnoty jsou porovnatelné s hodnotami získanými při pokusech s dočasnou expresí po inokulaci GMI 1000 nebo K60.

Na základě této analýzy se vybere transformovaná rostlina (pHG21-14A), která vykazuje devadesátináscbnou stimulaci aktivity GUS po nekompatibilní inokulaci ve srovnání s kontrolními infiltracemi, a obsahuje jednu inzertovanou genovou fúzi na haploidní genom. Přítomnost nativní genové fúze se prověří pomocí Southernovy analýzy cíenomové DNA (není uvedeno) .

o tom, že infiltraci

Pro monitorování aktivity promotoru hsr203J v různých orgánech během vývoje rostliny a jako odpovědi na bakteriální inokulaci byly použity test extrahovatelné aktivity GUS a test histochemické lokalizace GUS. V semenáčcích tabáku pHG21-14A starých 4, 7 nebo 15 dnů nebyla zjištěna žádná aktivita GUS, ani ve zdravých listech, ani v květech plně 'vyvinutých rostlin (údaje nejsou uvedeny). Tyto údaje svědčí je promotor hsr203J silně aktivován 18 hodin pc v listech inokulovaných izolárem indukujícím hypersenzitivní reakci, GMI1000, jak ukazuje zkoumání všech získaných transformovaných rostlin. Na transformovaných 3'ostlinách pHG21-14A byla provedena kinetická scudie (obrázek

3), která ukazuje, že se v listech infiltrovaných GMI1000 aktivita GUS zvyšuje 6 hodin po inokulaci na hodnotu dvanáctinásobku kontrolní hodnoty, dosahuje maxima 200-násobné stimulace po 9 hodinách a snižuje se na šerední hodnotu ^osmdesátinásobná indukce) po delší inkubaci. Po infiltraci K60 byly naměřeny mnohem nižší hodnoty, a v listech infiltrovaných vodou nebo izolátem Ahrp nebyla po jakékoliv znkubační době zjištěna detekovatelná úroveň aktivity GUS.

Rostliny transformované konstruktem pHIlOl neobsahujícím promotor vykazují bezvýznamnou úroveň aktivity GUS. Kromě toho, rostliny transformované pBI121, který obsahuje genovou fúzi CaMV 35S-uid A, vykazují podobnou úroveň aktivity enzymu bez ohledu na povahu inokula (není uvedeno). Genová fúze hsr203J-uid A tedy vykazuje zvláštní a specifický charakter aktivace po bakteriální inokulací transgenických rostlin tabáku, který vykazuje úzkou podobnost s in vivo charakterem akumulace transkriptu hsr203J v infiltrovaných listech tabáku (obrázek .3). Tyto výsledky též svědčí o tom, že je promotor hsr2'03J časně a specificky aktivován během nekompatibilní interakce rostlina - patogen, a že je jeho indukce závislá na genech hrp, jelikož bakteriální izolát, ve kterém jsou deletované geny hrp není schopen aktivovat promotor hsr203J.

Lokalizace aktivace hsr203J-uidA při odpovědi na bakteriální inokulací

Na transformovaných rostlinách pHG21-14A se provádí různé inokulační testy kvůli stanovení přesné lokalizace aktivace promotoru hsr203J při odpovědi na bakteriální inokulací. Tyto testy se provádí za prvé na listech tabáku, kvůli zkoumání indukce promotoru během typické hypersenzitivní reakce, a za druhé na kořenech, což jsou orgány přirozeně infikované bakteriemi.

Inokulace listů: Pro stanovení, zda je exprese hsr203J-gen GUS lokální nebo systémová, se inokulují listy 5 týdnů starých transgenických rostlin kapičkami bakteriální suspenze. Po inkubaci po dobu 18 a 70 hodin se stanoví aktivita GUS v polovině inokulovaného listu, a stejně tak ve vyšších a nižších listech. Výsledkem je patnáctinásobná indukce aktivity GUS v inokulovaných listech, zatímco v nižších a vyšších., -listech jsou zjištěny jen velmi nízké hodnoty (obrázek 4A) . Druhá polovina inokulovaného listu se použije pro histcchemický test GUS. Úzká modře zbarvená oblast se vizualizuje 18 a 70 hodin po inokulací bakteriálním izolátem indukujícím hypersenzitivní reakci. Tato oblast obklopuje místo poranění, které je omezené na několik vrstev buněk, a je lokalizovaná velmi blízko žloutnoucích, pravděpodobně mrtvých, buněk. Intenzita obarvení se 70 hodin po inokulaci zvyšuje. Po inokulaci K60 vykazuje pouze několik rozptýlených buněk slabé modré zbarvení. Inokulace vodou nebo izolátem ůhrp neindukuje detekovatelnou expresi GUS. Obarvení transgenických rostlin obsahujících chimérický gen uidA pod kontrolou promotoru CaMV 35S má za následek obarvení celého listu, a nedochází k přednostnímu obarvení v okolí lézí, což dokazuje specifickou povahu indukce promotoru hsr203J v této oblasti. Přesnější lokalizace této aktivace během infekce se provede pomocí měření aktivity GUS v malých plochách obklopujících lézi 18 hodin po inokulaci (obrázek 43) . Vysoké hodnoty aktivity enzymu (48-násobná stimulace v porovnání s kontrolními hodnotami) po inokulaci GMIiOOQ se zjistí pouze v samotných nekrotických lézích. V tkáni až 3 mm od léze se nezjistí detekovatelná aktivita enzymu.

Pro stanovení, jak časně je promotor hsr203J v inckulované oblasti aktivován, se provede histochemická lokalizace GUS na listech 8 týdnů starých transgenických rostlin lokálně infiltrovaných pomocí injekční stříkačky bakteriální suspenzí nebo K60. Již 6 hodin po inokulaci izolátem GMI1000, kdy ~eště není viditelná nekrosa tkáně, vykazuje infiltrovaná oblast listu modré zbarvení, jehož intenzita se zvyšuje 9 hodin po inokulaci. Po delší době inkubace se objevuje postupující žlutá nekrosa, ohraničená na svých okrajích úzkou modrou plochou, která je stále umístěná v infiltrované části listu.

Tyto pokusy jasně dokazují, že k expresi hsr203J-GUS dochází pouze v omezené oblasti odpovídající přesně vrstvám buněk infikovaným ' izolátem indukujícím hypersenzitivní reakci, GMI1000.

-29 Inokulace kořenů: Kořeny hydroponicky pěstovaných transgenických rostlin se poraní a inokulují kapičkou bakteriální suspenze. Po 48 hodinách inkubace se provede histochemická lokalizace aktivity GUS. Obarvení, které je pozorováno pouze v kořenech infikovaných GMI1000 se rozkládá v kořenu od původně inokulováného místa do vzdálenosti 2 mm. Cytologická zkoumání svědčí o tom, že aktivace promotoru hsr203J zřejmě není závislá na typu buňky (není uvedeno). Provede se též celková inokulace kořenů pomocí ponoření celého kořenového systému do bakteriální suspenze. V tomto případě se aktivita GUS zjistí v omezených oblastech kořenů, v místě vzniku sekundárních kořenů. Exprese genové fúze v těchto specifických místech odpovídá existenci upřednostňovaných míst vstupu bakterií do hostitele, která byla nalezena kolem místa vzniku pochvy sekundárních kořenů. V těchto specifických místech svědčí dvojité obarvení pro zjištění aktivity GUS a přízomncszi bakterií, při použití bakteriálního izolátu obsahujícího beta-galaktosidasovcu fúzi, o dobré korelaci mezi aktivací promotoru hsr203J a přítomností bakterií. Eyla též pozorována povrchová a intercelulární bakteriální kolonizace špiček kořenů, která měla za následek aktivaci promotoru hsr203J v této části kořenů.

Genová fúze hsr203J-GUS tedy vykazuje zvláštní a specifický charakter aktivace v transgenických rostlinách tabáku jako odpověd na bakteriální infekci, a tato aktivace úzce odpovídá způsobu vstupu bakterii do rostliny.

Závislost aktivace hsr203J-uidA na genech hro

K inokulaci transgenických rostlin (pHG21-14A) kapičkovou metodou se použijí různé kmeny Pseudomonas. solanacearum zmutované v jedné ze šesti transkripčních jednotek shluku genů hrp (obrázek 5A). Tyto mutantní kmeny ztratily schopnost vyvolávat u tabáku hypersenzitivní reakci, i když dva z nich, GMI1425 a GMI1423 způsobují částečnou nebo opožděnou hypersenzitivní reakci. 18 hodin po inkubaci se nezjistí žádný vliv na aktivitu GUS u šesti ze sedmi testovaných mutantů, pouze GMI1423 způsobuje zvýšení aktivity enzymu ve srovnání s aktivitou při použití kmenu divokého typu, GMI1000 (obrázek 53) . Tyto údaje svědčí o tom, že pro aktivaci hsr203J je nutný téměř cely funkční shluk genů hrp.

Až dosud nebyl identifikován žádný gen, který má specifický význam při rozeznání nekompatibilního patogena, přenosu tohoto signálu do celé buňky nebo při konečné programové smrti buňky (hypersenzitivní reakci) představující účinný mechanismus pro ohraničení a konečnou eliminaci patogena.

Gen hsr203J (SEQ ΙΌ č. 1) je prvním izolovaným genem souvisejícím s hypersenzitivitou, jehož promotor vykazuje rychlou, vysoce lokalizovanou a specifickou aktivaci jako odpověď na bakteriální izolát indukující hypersenzizivní reakci.

Vytváření delecí od 5' -konce promotorové oblasti pKG21

Jednosměrné delece promotoru chimérického genu se provedou počínaje od 5' -konce podle Henikoffa (Henikoff, S. (19S4) Gene 28, 351 - 359) . Pro tento účel se linearizuje plazmid pHG21 (obrázek 1) za použití restrikčních enzymů Shpl a Sáli a poté se rozštěpí exonukleasou III. Vyberou se konstrukty postupně deletované vždy po vzdálenosti přibližně 200 bp. Lokalizace 5' -konce deletovaných konstruktů se stanoví sekvenováním oblasti a porovnáním s nukleotidovou sekvencí genu hsr203J (viz obrázek 6).

Vliv delecí na genovou expresi chimérického genu v transgenických rostlinách tabáku

Do rostlin tabáku se pomocí transformace zavede 50 _zug plazmidové DNA odpovídající různým delecím (obrázek 6). Aktivita GUS se měří 18 hodin po inokulaci.

Obrázek 7 znázorňuje expresi genu GUS pomocí konstruktů získaných deletováním promotoru v pKG21 od 5' -konce (podle schématu na obrázku 5). Rostliny byly transformovány 5 _zug DNA, a hodnota 100 představuje aktivitu GUS dosaženou pomocí transformace konstruktem pKG21. Obrázek znázorňuje zvýšení aktivity genu GUS po 18 hodinách, jako následek infiltrace transformovaných rostlin bakteriálními kmeny Delta 3, K60 a GMI 1000. Kontrolní rostliny byly infiltrovány vodou. Tyto pokusy svědčí o přítomnosti dvou hlavních cblaszí deletovaného promotoru genu hsr203J, které mají regulační efekt.

Jeden nebo více elementů umístěných v oblasti nukleocidů 1 až 651 v sekvenci SEQ ID č. 1 je odpovědných za zeslabení exprese chimérického genu, a druhé oblasti (nukleotidv 652 elementy umisžene v vykazují pozitivní až 1268) vliv na aktivaci promotoru genu hsr203J.

Studium prostorového a časového charakteru aktivace promotoru v kořenech a listech transgenických rostlin inokulovaných Pseudomonas solanacearum svědčí o tom, že:

promotor je specificky aktivován během hypersenzitivní reakce několik hodin předtím, než se objeví nekrotické léze, lokalizace jeho aktivace je omezena na několik vrstev buněk v kontaktu s bakteriemi, promotor netvoří odpověd na různé stresové podmínky a je velmi slabě aktivován během kompatibilní interakce, aktivace promotoru je silně závislá na genech hrp (hypersenzitivní odpovědi a patogenity) Pseudomonas solanacearum. Tyto geny kontrolují schopnost bakterie vyvolávat hypersenzitivní reakci u rezistentních nebo nehostitelských rostlin a způsobovat chorobu u hostitelských rostlin.

Hlavní úlohu bakteriálních genů hrp v aktivaci promotoru genu hsr203J potvrzuje skutečnost, že je promotor hsr203J exprimován při odpovědi na specifický elicitor hypersenzitivní reakce, harpin, který je produktem jednoho z genů hrp Erwinia amylovora. Při odpovědi na tento polypeptid, je promotor aktivován na podobnou úroveň jako je pozorována v případě odpovídajícího avirulentního kmenu, ale dochází k tomu rychleji. Další potenciální induktory, jako biotické a abiotické elicitory, induktory rezistence, neovlivňují jeho expresi. Všeobecná platnost specifičnosti exprese hsr203J během nekompatibilních interakcí s bakteriálními patogeny byla demonstrována při testech s jinými patogeny, jako je Pseudomonas syringae pv pisi, Pseudomonas syringae pv tabaci a Erwinia amylovora.

Kromě toho byla provedena funkční analýza cis-elementů odpovědných za transkripčni aktivaci genu hsr203J při odpovědi na nekompatibilní bakteriální kmen. Tato analýza byla zahájena vytvořením řady konstruktů deletovaných od 5' -konce a analýzou těchto konstruktů pomocí testu dočasné exprese a v transgenických rostlinách. Výsledkem bylo zjištění přítomnosti distálního zeslabovacího elementu a dvou pozitivně regulujících elementů, z nichž jeden je kvantitativní (tvořen nukleotidy 655 - 770 v sekvenci SEQ ID č. 1), a druhý je specifický pro odpověd vůči bakteriím, a nachází se mezi nukleotidy 1195 až 1268 sekvence znázorněné jako SEQ ID č. 1.

Tyto výsledky svědčí o tem, že promotor genu hsr203J vzhledem k dosud studovaným obranným genům rostlin vykazuje nové a originální charakteristiky aktivace. Průběh jeho aktivace z prostorového a časového hlediska společně s jeho specifickou indukcí během hypersenzitivní reakce zdůrazňuje význam tohoto genu jako molekulárního nástroje pro studium vzniku a regulace hypersenzitivní reakce. Kromě toho byla určena sekvence o velikosti 74 bp odpovědná za indukovatelnost promotoru avirulentním patogenem.

Ačkoli byl vynález popsán specificky pro případ aktivace promotoru hsr203J při odpovědi na kontakt rostlin tabáku s nekompatibilním patogenem, je třeba vzít v úvahu, že může byt tento promotor podobně aktivován kontaktem jiných rostlin, transgenickvch pokud se týká tohoto genu, s jinými patogeny, včetně určitých virů a určitých hub, což svědčí o tom, že je specifická exprese promotoru hsr203J obecným jevem nekompatibilní interakce mezi hostitelem a patogenem, která vede k hypersenzitivní odpovědi.

Kromě toho se nukleotidová sekvence tvořená nukleotidy v poloze 1195 až 1268 v sekvenci znázorněné jako SEQ ID č. 1 obsahující element, kterým rostlina odpovídá na přítomnost bakterií (bacterial response element, 3ΕΞ) , váže na extrakty jaderných proteinů z různých zdrojů (zdravých rostlin, rostlin inokulovaných kompatibilními, nekompatibilními a hrp-mutantními kmeny Pseudomonas solanacearum po různých inkubačních dobách). Tato vazba může být hodnocena pomocí retardační gelové analýzy za použití například oblasti o velikosti 74 bp a některých subfragmentů, což umožňuje identifikaci jednot1ivých sekvencí v oblasti 3RE, které jsou použitelné při vytváření genetických konstruktů obsahujících indukovatelné geny rezistence vůči chorobám.

Zobrazení sekvencí

Informace o sekvenci SEQ ID č. 1:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2778 párů bází (3) typ : nukleová kyselina (C) počet řetězců : jednořetězcová (D) topologie : neznámá (ii) typ molekuly: genomová DNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (vi) původní zdroj:

(A) organismus: tabák Nicotiana tabacum (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: CDS (3) lokace: 1413..2417 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 1:

3GATCTTAAT	GTTAGTTTAT	CTCTTGTTTT	GAATATTTGA	TCTTAATTAT	AATTTATCCA	60
•SCAT AAA T T T	TATTTTCAAA	GATCAAACTA	TTGATATGAC	ATTTCACTTT	φ	120
7GTTTGTAGA	ATCATTAGTG	GTATTGACTC	TTACCAATCA	TTTTTTTTTC	TTTCTCACAC	180
ATTTATATTC	m rp 2^ T *T 'J’ T Q	TTAGTTATTG	TTTAATAATT	GGGTATTTTT	TAATATTACA	240
CGAAAAATTG	ATTAAAAAAA	TATTATTTGA	GTAGAAAAAT	AGTTCAAATA	TAATATAAAC	300
rirmrrrif'	GTGGGAGTAT	TTTTTTCTCA	ATTTCAACTC	TTTATGCAGT	CCACTTAATA	360
^TACTTTTAT	T T m T 'T' f* ψ T fX ťD	TATTAGACAT	TATGGAGTGG	TAATGTATTG	CCAATACGGC	420
7GATTCTTAT	GAAATTGATT	TTATTAAACC	TTCCTACATT	TTTAATAATA	ATTTAATAGA	480
GAAAATTTTA	TTAATTTTAA	ATATTAAATA	TTAAAAATTA	GTAGCATATA	AGGTATTATA	540

GTCCAAAAAA	TAGCTTATTA	CAGTTACGTA	CTCTTCCTAT	GAGTTCTTTC	£rr,rr,rp , £φ ^φ	SCO
GTAGGGCTAT	TTTGATATAT	TAATATTGTA	777A7GC777	7 A. 7 AA. 7 AA 7 A	TAGGCTCTCT	660
TTTTTCTATA	TGAATTTGGA	CAATATAATA	CA7777CAAA	77AAA77AG7	ATCAAA7AA7	720
TG7ATTTTTG	CTTTTTTAAT	AATTTATACG	CATGAATTTC	ATAA7CCAGC	ATATTATGCT	760
AGAACTTTTC	GTGTTTCAAC	TAAAATAATG	ACTATTTTTC	AATGACG77A	CAAACACTGA	340
CTAATTTTTG	ATTGCAGTCC	GAAAACTATC	TAGTCTATGC	Φ rp r-ι cn £ ^ £	TTTCTAAACT	900
CCCTGCCACT	GTATGCTTTC	AT-TGGATTAA	CCTTTAACCA	C AC?-AA7 AT 7	TTAAAGAG7A	960
ATGTTTGACA	GCGTAATTTG	AAACATCTAC	TATGCCTCTG	7 A 7AT AATA7	C7AA7G777G	1020
TTCGTAGACC	AATATTCTAA	TTCCTCTCTT	G7AGAC7AAA	CC-GGGCTGTA	AC7AAC7AAC	1060
CACCATAGTT	ATCTAAATTA	GTGACCCTAG	CGACCATTC-A	7AA.777GA.7A	CTGA7CA77G	1140
ACTTCCACCA	AATCTACTTT	CTAAATGTGG	ACTC-ACTCAT	TA7GAA777G	TGAGGAAAA7	1200
ACTTTCCTAA	TGCTAGTGCT	CTTCCCATTA	TCTAAACTCC	AAAA7 77 7G 7	Ji AJi	12 60
GAACCTTCCT	TTAAACTACC	A.C AAAT T 7 7 C	φ rp p φ £ r* φ φ r* £	C7A7C7CACC	iii λ i“i	1220
GCCACGCACA	TGCAAACCAA		TAAACAAACT	T<£	* rpr»·	13 3 0
TAC7 CGλΑΑΑ	AAACACTTCA	— Q T Q Ji	AA A7G G77 Mez Val	CA7 GAA AAG His Glu Lys	; CAA G7G i Gin Val	1433

A7A Ile

C-AG Glu

GAA Glu 10

GCA Val

CCC Ser

GGC Gly

TGG rn

z->i-Rpn - Leu 15

AC-A Ar o

φφΓΠ Val

Phe

GAA. Glu

GAC As o 2*0

GGT Gly

CCA Ser

GTA. Va —

GAC

CGG

ACT

CGG

ACC

GGT

CCA

CCC

GAA

GTC

AAA

TTC

M

GCC

GAG

CCA

1329

Asp

Arg

Thr

Trp

Thr

Gly

Pro

Pro

Glu

Val·

Lvs

Phe

Meo

Ala

Glu

Pro

25

30

35

C-7C

CCA

CCC

CA7

GAC

TAC

TTC

ACC

C-AC

GGC

GTT

GCC

GTC

AAA

GAT

GTA

1577

Val

Pro

Pro

His

Asp

Tyr

?1ίθ

Ile

Asp

GLy

Val

Ala

Val

Lys

Asp

Val

40

45

50

55

G7C

GCC

GAC

GAA

AAA

CCC

GGC

AGC

CGT

CTC

CGC

ATC

TAC

TTA

CCT

GAA

1625

Val

Ala

Asp

Glu

Lvs

Ser

Gly

Ser

Arg

Leu

Arg

Ile

Tyr

Leu

Pro

Glu

60

65

70

CGA

AAC

GAC

AAT

TCC

GCC

AGC

AAG

CCT

CCC

GCC

ATT

CTT

CAC

TTC

CAA

1673

Arg

As n

Asp

Asn

Ser

Ala

Ser

Lys

Leu

Pro

Val

Ile

Leu

His

Phe

Gin

75

80

85

GGC

GGC

GGC

777

Φ,φ^τ»

GCC

AGC

CA7

GCT

GA7

TGG

TTC

ATG

TAC

TAC

ACT

1721

Gly

Gly

C-lv

Phe

Cys

Val

Ser

His

Ala

Asc

Trp

Phe

Met

Tyr

7vr

TU -

.90

95

100

GTC

7AC

ACG

C3C

CCA

C-CG

CGC

GCG

GCC

AAA

GCT

ATC

A77

GTC

TCC

GTC

1769

Val

7 vr

Wk V-

Arg

Leu

Ala

Arg

Ala

Ala

Lys

Ala

Ile

ILe

Val

Ser

Val

105

110

115

TTC

CCC

CCC

CTC

rfr·

CCG

C-AG

CAC

CGC

CTC

CCA

GCT

GCC

TGC

GAT

GCC

1317

Phe

Leu

Pro

Leu

Ala

Pro

Glu

His

Arg

Leu

Pro

Ala

Ala

Cys

Asp

Ala

120

125

130

135

Ο Οι Η H U U OJ

GGT

TTC

GCC

C-CT

CTC

CTC

TGG

CTC

CGG

GAC

CTC

TCC

CGG

CAG

CAA

GGA

Gly

Phe

Ala

Ala

Leu 140

Leu

Trp

Leu

Arg

Asp 145

Leu

Ser

Arg

Gin

Gin 150

Gly

GAC

GAG

CCG

TC-G

CTC

AAC

C-AT

TAC

GCA

GAT

TTC

AAC

CGA

GTA

TTC

CTC

Ais

Glu

Pro

Tro 155

Leu

Asn

Asp

Tyr

Ala 160

Asp

Phe

Asn

Arg

Val 165

Phe

Leu

ATC

GC-A

GAC

AGC

TCC

GGC

GGG

AAC

ATA

GTC

CAC

CAA

GTT

GCC

GTC

AAA

Ile

Gly

As o 170

Ser

Ser

Gly

Gly

Asn 175

Ile

Val

His

Gin

Val 180

Ala

Val

Lys

(SCC

GGC

GAG

GAA

AAC

TTA

TCT

CCA

ATG

CGA

CTG

GCC

GGC

GCA

ATT

CCG

Ala

Gly 185

Glu

Glu

Asn

Leu

Ser 190

Pro

Met

Arg

Leu

Ala 195

Gly

Ala

Ile

Pro

ATC

CAT

CCA

GGT

TTC

GTG

CGG

TCC

TAT

CGG

AGC

AAA

TCG

GAG

CTA

GAA

::ie 2 00

Kis

Pro

Gly

Phe

Val 205

Arg

Ser

Tyr

Arg

Ser 210

Lys

Ser

Glu

Leu

Glu 215

CAA

GAG

CAA.

ACC

CCG

TTT

TTA

ACA

TTA

GAT

ATG

GTG

GAT

AAA

TTT

CTA

Gin-

Glu

Gin

Thr

Pro 220

? he

Leu

Thr

Leu

Asp 225

Met

Val

Asp

Lys

Phe 230

Leu

GGG

rprn

-

rpm £

CCA

GTA

GGG

AGC

AAC

AAG

GAT

CAT

CAA

ATA

ACA

TGT

Gly

Leu

Ala

Leu 235

Pro

Val

Gly

Ser

Asn 240

Lys

Asp

His

Gin

Tle 245

Thr

Cys

CCG

ATG

GGA

GAG

GCG

GCG

CCG

GCA

GTG

GAG

GAG

CTT

AAA

TTA

CCG

CCT

? xs

MSC

Glv 250

w uU

.“.1 a

Ala

Pro

Ala 255

Vs x

<?xu

Glu

Leu

Lys 260

Leu

Pro

Pro

Ί A.T

TTC·

TAC

TGT

GCG

GAG

AAA

GAT

CTG

ATA

AAG

GAC

ACT

GAA

ATG

Tyr

Leu 265

Tvr

Cys

Val

A±a

Glu 270

Lys

Asp

Leu

Tle

Lys 275

Asp

Thr

Glu

Me u

C-AG

‘JTT1

TAC

GAA

GCT

ATG

AAA

AAG

GGG

GAA

AAG

GAT

GTA

GAG

CTG

TTT

Glu 230

Phe

Tyr

Glu

Ala

Met 285

Lys

Lys

Gly

Glu

Lys 290

Asp

Val

Glu

Leu

Phe 295

ATT

AAC

AAT

GGA

GTG

GGA

CAT

AGC

TTT

TAT

CTT

AAC

AAA

ATT

GCT

GTT

Tle

Asn

Asn

Gly

Val 300

Gly

Kis

Ser

Phe

Tyr 305

Leu

Asn

Lys

Ile

Ala 310

Val

AGA

ATG

GAC

CCT

GTA

ACT

GGT

TCT

GAA

ACT

GAA

AAA

CTT

TAT

GAA

GCC

Arg

Met.

Asp

Pro 315

Val

Thr

Gly

Ser

Glu 320

Thr

Glu

Lys

Leu

Tyr 325

Glu

Ala

GTT vsi

GCA Ala

GAG Glu 330

TTC Phe

ATC Tle

AAC Asn

AAG Lys

CAT His 335

TA AAAGGAGAAA ATTTGTC-GTT

TTGCAGAATA TTTGTTTGTT GCATGCATGT TCAAGATTTT GATGTACCGT CTTGATTGTC

ACGTTCTAAT GGTTTTGTAA TTATAATTAT GAGGAGT.AAA TTTCTAT7GT TGCGTAGAAA

TGTTTTTTCT TTGGTAGTAA ATGTTTATTT GTAATACTTT AAAAAGTGGA CAAATTTCTT

TVGAGATTCA TGAAATAATA TCTTTAAATT. TCGAATGTCA ATAAGTCCAG AAATTGAAAT

GVATCTGTAC CSTCAATGAA GTCTCCTTGA GGCTTTT-TTT CACATGATAT CGTCTATACC

T ATACAA.TATG AGATTCTCG

1865

1913

1961

2009

2057

2105

2153

2201

2249

2297

345

2393

2439

2499

2559

2619

2579

3 9

ACCAAAAAG7 T7GATAAGC

2773

Informace o sekvenci SEQ ID č. 2:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 335 aminokyselin (B) typ : aminokyselinová (D) topologie : lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 2:

Met 1

Val

His

Glu

Lys 5

Gin

Val

Ile

Glu Glu 10

Val

Ser Gly Tr?

Leu 15

Val

Phe

Glu

Aso 20

Gly

Ser

Val

As?

Arg Thr 25

Tr?

Thr Glv Pro 30

Pro

Glu

Val

Lys

Phe 35

Met

Ala

Glu

Pro

Val 40

Pro Pro

His

Asd Tvr Phe 45

Tle

A c o

C-ly

Val 50

A 3» 3

Val

Lys

As?

Val 55

Val

Ala As?

Glu

Lvs Ser Glv 60

Ser

Are

Leu 65

Arg

Ile

Tyr

Leu

Pro 70

Glu

Arg

Asn As?

Asn 75

Ser Ala Ser

Lys

Leu = 0

Pro

Val

Ile

Leu

His 85

P he

C-ln

Gly

Glv Glv 90

Phe

Cys Val Ser

His 95

Ala

As?

Tr?

Phe

Met 100

Tyr

Tyr

Thr

Val

Tvr Thr 105

Arg

Leu Ala Arg 110

Ala

Ala

Lys

Ala

Ile 115

Ile

Val

Ser

Val

Phe 120

Leu Pro

Leu

Ala Pro Glu 125

His

Arg

Leu

Pro 130

Ala

Ala

Cys

Asp

Ala 135

C-ly

Phe Ala.

Ala

Leu Leu Tro 140

Leu

Arg

Aso 145

Leu

Ser

Arg

Gin

Gin 150

C-ly

His

Glu Pro

Tro 155

Leu Asn Asp

Tyr

Ala 160

As?

Phe

Asn

Arg

Val 165

Phe

Leu

Ile

Gly Aso 170

Ser

Ser Gly Gly

Asn 175

Tle

Val

His

Gin

Val 180

Ala

Val

Lys

Ala

Glv Glu 185

Glu

Asn Leu Ser 190

Pro

Met

Arg

Leu

Ala 195

Gly

Ala

Ile

Pro

Ile 200

His Pro

Gly

Phe Val Arg O Λ c Lu J

Ser

Tvr

Arg

Ser 210

Lys

Ser

Glu

Leu

Glu 215

Gin

Glu Gin

Thr

Pro Phe Leu 220

Thr

Leu

Aso 225

Mec

Val

Asp

Lys

Phe 230

Leu

Gly Leu Ala

Leu Pro Val Gly Ser 235

Asn 240

Lys

Asp

His

Gin

Ile

Thr

Cys

Pro

Met

Gly

Glu

Ala

Ala

Pro

Ala

Val

245

250

255

Glu

Glu

Leu

Lvs

Leu

Pro

Pro

Tyr

Leu

Tyr

Cys

Val

Ala

Glu

Lys

Asp

260

265

270

Leu

Ile

Lvs

Asp

Thr

Glu

Met

Glu

Phe

Tyr

Glu

Ala

Met

Lys

Lys

Gly

275

2S0

285

Glu

Lys

Asp

Val

Glu

Leu

Phe

Ile

Asn

Asn

Gly

Val

Gly

His

Ser

Phe

290

295

300

Tvr

Leu

Asn

Lys

Ile

Ala

Val

Arg

Met

Asp

Pro

Val

Thr

Gly

Ser

Glu

305

310

315

320

Thr

Glu

Lys

Leu

Tvr

Glu

Ala

Val

Ala

Glu

Phe

Ile

Asn

Lys

His

325

330

335

Informace o sekvenci SEQ ID č (i) charakteristiky sekvence:

(A)	délka:	: 93 párů	bází
(3)	typ :	nukleová	kyselina
(C)	počet	řetězců :	: jednořetězcová
(D)	topologie : neznámá

(ii) typ molekuly: genomová DNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 3:

TTTC-CCAAAA TGGTTCATGA AAAGCAAGTG ATAC-AGGAAG TATCCGGCTG GCTTAGAGTT 60

TTCGGGGTAG GTCAGTCCCT TATGTTACGT CCT 93

ING. JAN KUBÁT patentový zástupce

Ή

W

Claims (20)

PATENTOVÉ N A R O-K Y ...

1. Rekombinantni sekvence

DNA obsahující oblast zahrnující nukleotidovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID č. 1 nebo její funkční ekvivalent, a rekombinantni sekvence zahrnující část této oblasti nebo tohoto ekvivalentu.

obsahuj ící oblasi

2. Rekombinantni sekvence DNA zahrnující nukleotidy 1413 až 2417 sekvence znázorněné v SEQ ID č. 1 nebo její funkční ekvivalent, a rekombinantni sekvence zahrnující část této oblasti nebo tohoto ekvivalentu .

3. Rekombinantni zahrnující nukleotidy

SEQ ID č. sekvence lentu.

neoo sekvence DNA obsahující oblast až 1341 sekvence znázorněné v funkční ekvivalent, a rekombinantni zahrnující část této oblasti nebo tohoto

4. Rekombinantni sekvence DNA obsahující obiasz zahrnující nukleotidy 1 až 651 sekvence znázorněné v SEQ ID :č1 nebo její funkční ekvivalent, a rekombinantni sekvence zahrnující část této oblasti nebo tohoto ekvivalentu .

5. Rekombinantni sekvence DNA obsahující oblast zahrnující nukleotidy 652 až 1341 sekvence znázorněné v SEQ ID č. 1 nebo její funkční ekvivalent, a rekombinantni sekvence zahrnující část této oblasti nebo tohoto ekvivalentu .

6. Rekombinantni sekvence DNA obsahující oblast zahrnující nukleotidy 1195 až 1341 sekvence znázorněné v SEQ ID č. 1 nebo její funkční ekvivalent, a rekombinantni sekvence zahrnující část této oblasti nebo tohoto ekvivalentu .

7. Rekombinantní sekvence DNA obsahující oblast zahrnující nukleotidy 1195 až 1258 sekvence znázorněné v SEQ ID č. 1 nebo její funkční ekvivalent, a rekombinantní sekvence zahrnující část této oblasti nebo tohoto ekvivalentu .

8. Rekombinantní sekvence DNA, vyznačuj ící se t í m , že obsahuje alespoň jednu oblast nebo její část nebo její ekvivalent podle libovolného z nároků 3 až 7, přičemž je tato oblast nebo část nebo ekvivalent umístěna na 5' -straně od, a je operabilně navázána k protein kódující sekvenci heterologního genu nebo sekvenci obsahující nukleotidy 1413 až 2417 sekvence znázorněné v SEQ ID č. 1 nebo jejího funkčního ekvivalentu.

9. Rekombinantní sekvence DNA podle nároku 8, vyznačující se tím, že je v ní přítomna mezi uvedenou oblastí nebo její částí nebo jejím ekvivalentem a protein kódující oblastí sekvence DNA, v poloze směrem k 3' -konci od ní, sekvence zesilující translaci.

a)

10. Rekombinantní sekvence DNA podle nároků 8 nebo 9, vyznačující heterologním genem je markerový gen vyhledávání, nebo gen, jehož produkt je schopen poskytovat rezistenci nebo toleranci vůči alespoň jedné z položek skupiny zahrnující hmyz, herbicidy, houby, bakterie a viry.

libovolného z

se tím, že pro výběr nebo

11. Rekombinantní sekvence DNA podle nároků 1 až 10, vyznačující se této rekombinantní sekvenci přidán, odstraněn libovolného z tím, ž e by 1 nebo nahrazen jeden nebo více nukleotidů, aniž by byla podstatně ovlivněna její funkce nebo její schopnost kódovat aminokyseliny.

12. Rekombinantní DNA podle libovolného z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že je modifikována tak, že jsou použity kodóny, které jsou preferovány organismem,do kterého má být rekombinantní DNA inzertována, takže se expresí takto modifikované DNA v shora uvedeném organismu získá v podstatě podobný protein jako expresí nemodifikované rekombinantní DNA v organismu, ve kterém jsou komponenty rekombinantní DNA, které kódují protein, endogenní.

13. Sekvence DNA, vyznačující se tím, že je komplementární k sekvenci, která za přísných podmínek hybridizuje s rekombinantní sekvencí DNA podle libovolného z nároků 1 až 12.

14. DNA-vektor, vyznačující se tím že obsahuje rekombinantní sekvenci DNA podle libovolného z nároků 1 až 12, nebo sekvenci DNA podle nároku 13.

15. Protein získaný expresí DNA podle libovolného z nároků 1 až 13.

16. Protein, vyznačující se tím, že má sekvenci aminokyselin znázorněnou v SEQ ID č. 2, nebo funkční ekvivalent této sekvence.

17. Mikroorganismus nebo rostlinná buňka nebe protoplast, vyznačující se tím, že byl transformován rekombinantní DNA podle libovolného z nároků 1 až 11 nebo sekvencí DNA podle nároku 12.

18. Rostlina, jejíž genom obsahuje vektor podle nároku 14, v kteréžto rostlině je exprimována rekombinantní DNA.

19. Rostlina podle nároku 18, vybraná ze skupiny zahrnující rajče, pepřovník, mangovník, broskvoň, jabloň, hrušeň, jahodník, banánovník, meloun, řepku a řepici typu canola,. slunečnici, tabák, cukrovou řepu, pšenici, ječmen, rýži, kukuřici, bavlník, brambor, mrkev, salát, brukev zelnou a cibuli.

20. Potomstvo a semena rostlin podle libovolného z nároku 18 nebo 19, a semena a potomstvo tohoto potomstva.

patentový zástupce

ING. JAN KUBÁT ίpHG 21 £

<

o

H <

H o

<e <

<

<

<

<

o <

S

O o

l·<

<

<

<

o

H £

H

H

Ό <

b o

H <

u u

H <

H o

< Γo

0«

0'

H

H

H

H <

O <

Η u

Η τΗ μ

X)

Ο !

ř i

I <

<