CZ311998A3 - Antifungální polypeptid a způsoby regulace rostlinných pathogenních plísní - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Antifungální polypeptid AlyAFP, který reguluje poškození rostlin plísněmi. DNA kódující tento polypeptid lze klonovat do vektorů pro transformaci mikroorganismů kolonizujících rostliny nebo nebo do rostlin. Tím se zajistí způsob pro inhibici růstu plísní na rostlinách. Polypeptid se může formulovat do kompozic, které se mohou použít pro regulaci nežádoucích plísní na rostlinách a jinde.

Antifungální polypeptid a způsoby regulace rostlinných pathogenních plísní

Oblast techniky

Vynález se týká anti&ngálního polypeptidu, AlyAFP, který se získá z květů rostlin rodu Alyssum a způsobů regulace pathogenních plísní použitím tohoto antifungálního polypeptidu. Antifungální polypeptid se může použít přímo na rostlinu, použít na rostlinu ve formě mikroorganismu, který produkuje polypeptid nebo lze geneticky modifikovat samotné rostliny, aby produkovaly polypeptid. Tento vynález se také týká DNA sekvencí, mikroorganismů, rostlin a směsí užitečných při těchto způsobech.

Dosavadní stav techniky

Rada rostlinných polypeptidů a proteinů vykazujících antifunfální aktivitu proti řadě pathogenních plísní se izolovala (Bowles (1990) Annu. Rev. Biochem. 59:873-907, Brears aj. (1994) Agro-Food-Industry Hi-Tech. 10-13). Věří se, že tyto antifungální polypeptidy a proteiny zahrnující mnoho tříd včetně chitináz, chitin vázajících proteinů bohatých na cystein, β-1,3glukanáz, permatinů (včetně zematinů), thioninů, proteinů inaktivujících ribosomy a nespecifickým proteinům pro přenos lipidů, hrají důležité role při obraně rostlin proti plísňovým infekcím.

Nedávno byla nalezena jiná skupina rostlinných proteinů působících jako defensiny při boji proti infekcím rostlinnými pathogeny (PCT mezinárodní publikace WO 93/05153). Zjistilo se, že dva malé proteiny bohaté na cystein izolované ze semen ředkve, Rs-AFPl a Rs-AFP2, inhibují růst řady pathogenních plísní, když se čistý protein k antifungálnímu testovacímu mediu in vitro. Zjistilo se, že transgenní rostliny tabáku, obsahující gen kódující Rs-AFP2 protein, jsou odolnější proti útoku plísněmi než netransformované rostliny.

Proteiny podobné Rs-AFP2 ze semen ředkve se izolovaly ze semen řady jiných rostlin (PCT mezinárodní publikace WO 93/05153, Broekaert aj. (1995) Plant Physiol. 108: 13531358). Všechny proteiny této skupiny sdílí podobnost svých sekvencí aminokyselin, avšak liší se svými antifungálními aktivitami proti různým plísním, zejména v přítomnosti různých mono- a divalentních solí v testovacím mediu, což se více podobá fyziologickým podmínkám v buňkách rostlin: antiíungální aktivity některých antifungálmch proteinů se dramaticky sníží v přítomnosti 1 mM CaCl₂ a 50 mM KC1 (Terras aj. (1992) J. Biol. Chem. 267:15301-15309). Užitečnost antifungálního proteinu pro odolnost rostlin proti nemocím v genetickém inženýrství může být

velmi ovlivněna citlivostí antifungální aktivity ke koncentraci solí, poněvadž kovové ionty jako K⁺, Na⁺, Ca a Mg⁺ jsou potřeba k normálním fyziologickým funkcím a jsou tedy hojně přítomné v buňkách rostlin.

Použití přírodních proteinových produktů ke kontrole rostlinných pathogenů bylo ukázáno například v Evropské patentové přihlášce 0 392 225.

Podstata vynálezu

Tito vynálezci objevili nový polypeptid, AlyAFP, který vykazuje široké spektrum antifungální aktivity proti rostlinným pathogenním a jiným houbám. Tento vynález zajišťuje izolovaný antifungální polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2 a její biologické funkční ekvivalenty.

AlyAFP nebo její biologické funkční ekvivalenty lze izolovat z rostlin nebo produkovat či syntetizovat jakýmkoliv vhodným způsobem známým v oboru, včetně přímé chemické syntézy, syntézy v heterogenních biologických soustavách, jako mikrobiálních, rostlinných a zvířecích soustavách, tkáňových kulturách, buněčných kulturách nebo in vitro translačních soustavách.

Vynález také zajišťuje izolované DNA sekvence kódující antifungální polypeptidy podle vynálezu a genetické konstrukty a způsoby pro vložení takových DNA sekvencí do hostitelských buněk pro produkci jimi kódovaných polypeptidů.

Vynález také zajišťuje mikroorganismy a rostliny transformované DNA sekvencemi nukleotidů kódujícími polypeptidy podle vynálezu.

Vynález také zajišťuje transformované rostliny, které exprimují antifungální polypeptidy podle vynálezu, jakož i rostliny, které spoluexprimují tyto antifungální polypeptidy spolu s jinými antifungálními, protibakteriálními nebo protivirovými polypeptidy spjatými s pathogenezí nebo proteiny, insekticidní proteiny, například proteiny Bacillus thuringiensis (B.t.) a proteiny účastnící se zlepšení kvality produktů nebo agronomické výkonnosti rostlin. Současné spoluexprese řady antifungálních proteinů v rostlinách jsou výhodné, neboť využívají více než jeden způsob účinku pro regulaci plísňových poškození. To může minimalizovat vývoj odolných kmenů plísní, rozšířit rozsah odolnosti a možná vést k synergickému antifunfálnímu účinku a tím zvýšit úroveň odolnosti. Všimněte si například v tomto směru WO 92/17591.

Příklady rostlin transformovaných, aby exprimovaly B.t. geny jsou popsány v Evropské patentové číslo 0 385 962, která odpovídá US přihlášce pořadové číslo 07/476,661, podané 12. února 1990 Fishhoffem aj..

• · » · « • · · · • · • · <

Neomezující příklady DNA, která může být spoluexprimována sDNA kódujícími polypeptidy podle vynálezu zahrnují 1) DNA kódující enzymy jako: glukóza oxidáza (která přeměňuje glukózu na kyselinu glukonovou za současné produkce peroxidu vodíku, což působí široké spektrum odolnosti proti pathogenům) pyruvátoxidáza, oxylátoxidáza, cholesteroloxidáza, oxidáza amino kyselin a jiné oxidázy, které využívají molekulární kyslík jako primární nebo sekundární substrát k produkci peroxidu, 2) proteiny spojené s pathogenézou, jako proteiny SAR8.2a a SARB.2b, kyselé a bazické formy proteinů tabáku PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-1’, PR2, PR-3, PR-4, PR-5, PR-N, PR-O, PR-Θ’, PR-P, PR-Q, PR-S a PR-R, chitinázy, jako bazická chitináza tabáku a chitináza/lysozym okurky, peroxidázy, jako bazická peroxidáza okurky, glutanázy, jako bazická glutanáza tabáku, proteiny podobné osmotinu, 3) virové kapsidm proteiny a repliky rostlinných virů, 4) rostlinné R-geny (geny odolnosti), jako Arabinopsis (Bent aj. (1994) Science 265: 1856-1860), Arabinopsis RPM1 (Grant aj. (1995) Science 269: 843-846) N- a Ν’- geny tabáku (Whitham aj. (1994) Cell 78: 1101-1115), rajčatový Cf-9 (Jones aj. (1994) Science 266: 789-793), L6 ze lnu (Ellis a j. (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 4185) a Xa21 z rýže (Song aj. (1995) Science 270: 1804-1806). Tyto geny lze exprimovat s použitím konstitučmch promotorů, promotorů specifických ke tkáni nebo promotorů indukovatelných fimgálními pathogeny, nebo jinými biologickými nebo chemickými induktory, 5) geny AVR pathogenu, například Claudiosporium fulvum Avr9 (Van Den Ackerveken aj. (1992) Plant J. 2: 359), které lze exprimovat s použitím pathogenně nebo chemicky indukovatelných promotorů a 6) genů, které se účastní biosyntézy salicylové kyseliny, například 2-hydroxyláza benzoové kyseliny (Leon a j. (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92: 10413-10417).

Řada publikací diskutovala použití rostlinných a bakteriálních glukanáz, chitináz a lysozymů pro produkci transgenních rostlin ukazujících zvýšenou odolnost proti různým mikroorganismům, jako jsou plísně. Ty zahrnují EP 0 292 435, EP 0 290 123, WO 88/00975, US patent 4,940,840, WO 90/07001, EP 0 392 225, EP 0 307 841, EP 0 332 104, EP 0 440 304, EP 0 418 695, EP 0 448 511 a WO 91/06312. Použití proteinů podobných osmotinu se diskutovalo v WO 91/18984.

Aby se dosáhlo výše uvedeného, zajišťuje se v souladu s různými aspekty vynálezu:

Isolovaný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2.

Isolovaná molekula DNA kódující tento izolovaný polypeptid. Izolovaná molekula DNA může být molekulou cDNA obsahující sekvenci nukleotidů ukázanou v SEQ ID NO: 12. Alternativně tato molekula cDNA může obsahovat nukleotidy 116 až 269 sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12.

• · · ·

Rekombinantní molekula DNA s dvojitou šroubovnicí obsahující operativně spojená ve směru 5’ke 3’:

a) promotor, který vyvolává v rostlinné buňce produkci RNA sekvence,

b) strukturní kódující sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující sekvenci amino kyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2 a

c) 3’ nepřeloženou oblast, která zapříčiňuje v rostlinných buňkách transkripční terminaci a přípojem polyadenylátových nukleotidů k 3’ konci uvedené RNA sekvence.

Strukturní kódující sekvencí předcházející molekulu DNA může být molekula cDNA obsahující sekvenci nukleotidů ukázanou v SEQ ID NO: 12, nebo nukleotidy 116 až 269 sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12.

Podobné rekombinantní molekuly DNA s dvojitou šroubovnicí obsahující vhodné promotory a jiné regulační sekvence se mohou zavést do zvířecích, plísňových a antibakteriálních buněk, aby se získaly transformované buňky exprimující strukturní kódující sekvenci.

Promotorem předcházející molekuly DNA může být promotor FMV 35S, promotor CaMV 35S, promotor ssRUBISCO, promotor oIF-4A, promotor LPT, promotor aktinu nebo promotor ubikvitinu.

Způsob regulace poškození rostliny plísněmi zahrnující zabezpečení stanoviště dané rostliny izolovaným polypeptidem obsahujícím nezbytnou sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2. Poškození plísněmi může být způsobeno plísněmi vybranými ze skupiny složené z rodů Altemaria, Ascochyta, Botrytis, Cercospora, Colletotrichum, Diplodia, Erysiphe, Fusarium, Gaeumannomyces, Helminthosporium, Macrophomina, Nectria, Peronospora, Phoma, Phymatotrichum, Phytophora, Plasmopara, Podosphaera, Puccinia, Puthium, Pyrenophora, Pyricularia, Pythium, Rhizoctomia, Scerotium, Selerotinia, Septoria, Thielaviopsis, Uncinula, Venturia a Verticillium. Při tomto způsobu se polypeptid může zajistit na stanoviště rostliny mikroorganismy kolonizujícími rostliny, které produkují antifungální polypeptid, nebo aplikací směsi obsahující izolovaný polypeptid nebo expresí DNA kódující polypeptid v buňkách rostliny.

Způsob regulace poškození rostliny plísněmi zahrnující kroky:

a) vložení do genomu rostlinné buňky rekombinantní molekulu DNA s dvojitou šroubovnicí obsahující:

i) promotor, který vyvolává v rostlinné buňce produkci RNA sekvence, • · ii) strukturní kódující sekvenci, která kóduje sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2.

iii) 3’ nepřeloženou oblast, která způsobuje vdaných rostlinných buňkách transkripční terminaci a připojení polyadenylátových nukleotidů k 3’ konci uvedené RNA sekvence,

b) získání transformovaných rostlinných buněk a

c) regeneraci buněk z geneticky transformované rostliny, které exprimují antifungálně účinné množství uvedeného polypeptidu.

V předešlém způsobu strukturní kódující sekvence může obsahovat sekvenci nukleotidů ukázanou v SEQ ID NO: 12, nebo nukleotidy 116 až 269 sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12.

Promotorem může být promotor FMV 35S, promotor CaMV 35S, promotor ssRUBISCO, promotor oIF-4A, promotor LPT, promotor aktinu nebo promotor ubikvitinu.

Rostlina jejíž buňky obsahují antifungální účinné sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12.

Předešlá rostlina může být produkována způsobem zahrnujícím kroky:

a) vložení do genomu rostlinné buňky rekombinantní molekulu DNA s dvojitou šroubovnicí obsahující:

i) promotor, který vyvolává v rostlinné buňce produkci RNA sekvence, ii) strukturní kódující sekvenci, která kóduje sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2.

iii) 3’ nepřeloženou oblast, která způsobí v daných rostlinných buňkách transkripční terminaci a připojení polyadenylátových nukleotidů k 3’ konci uvedené RNA sekvence,

b) získání transformovaných rostlinných buněk a

c) regeneraci buněk z geneticky transformované rostliny, které exprimují antifungálně účinné množství uvedeného polypeptidu.

Strukturní kódující sekvence použitá v předešlém způsobu může obsahovat sekvenci nukleotidů ukázanou v SEQ ID NO: 12 nebo nukleotidy 116 až 269 sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12.

Dále může genom této rostliny obsahovat jednu či více molekul DNA kódujících antifungální peptid, polypeptid nebo protein, kde tato jedna či více molekul DNA je exprimována a produkuje antifungálně účinné množství uvedeného peptidu, polypeptidu nebo proteinu, který kóduje. Další molekula DNA může také obsahovat DNA kódující endotoxin B.t., φ · φφφφ φ φ φφφ φ · φ · φ · · φ · φ φ ···· ·· φφ kde tato molekula DNA je exprimována a produkuje antiinsekticidně účinné množství endotoxinu B.t.. Tato rostlina může být členem vybraným ze skupiny složené z jablka, ječmene, brokolice, zelí, kanoly, mrkve, citrusu, kukuřice, bavlny, česneku, cibule, okrasné rostliny, bobu, podzemnice, pepře, brambory, rýže, žita, sága, sóji, maliny, cukrové řepy, cukrové třtiny, rajčete, hroznů a pšenice. Vynález také zahrnuje semena brambor produkovaná touto rostlinou.

Způsob boje s nežádoucími plísněmi kontaktem nežádoucí plísně s antifungálně účinným množstvím izolovaného polypeptidů obsahujícího sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2.

Antifonfální kompozice obsahující antifungálně účinné množství izolovaného polypeptidů obsahujícího sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2 a přijatelný nosič. Antifongáhu kompozice se může použít pro inhibici růstu nebo usmrcení pathogenmch plísní. Tyto kompozice lze formulovat konvenčními metodami, jako jsou popsány například v WinnackerKuchler (1986) Chemical Technology, čtvrté vydání, svazek 7, Hanser Verlag, Mnichov, van Falkenberg (1972-1973) Pesticide Formulations, druhé vydám, Marcel Dekker, N.Y. a K. Martens (1979) Spray Drying Handbook, třetí vydání, G. Goodwin, Ltd., Londýn. Nutné pomocné prostředky formulace, jako jsou nosiče, inertní materiály, povrchově aktivní látky a jiná additiva jsou dobře známá a jsou popsaná například ve Watkins, Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers, druhé vydání, Darland Books, Cadwell, N.J, a Winnacker-Kuchler (1986) Chemical Technology, čtvrté vydání, svazek 7, Hanser Verlag, Mnichov. S použitím těchto kombinací se také mohou připravit směsi tohoto antifungálního polypeptidů s jinými pesticidně aktivními látkami, hnojivý anebo regulátory růstu a podobně ve formě konečných formulací nebo směsí pro nádrže.

Antifungální kompozice zde zamýšlené také zahrnují kompozice ve formě hostitelských buněk, jako jsou bakteriální a plísňové buňky schopné produkovat tento antifungální polypeptid a které kolonizují kořeny a nebo listy rostlin. Příklady bakteriálních buněk, které lze použít zahrnují kmeny Agrobacterium, Arthrobacter, Azospyrillium, Clavibacter, Escherichia, Pseudomonas, Rhizobacterium a podobně.

Četná konvenční plísňová antibiotika a chemické fungicidy, se kterými se tento antifungální polypeptid může kombinovat, jsou v oboru známé a jsou popsány v Worthington a Walker, sedmé vydám, British Crop Protection Council. Ty zahrnují například polyoxiny, nikkomyciny, karboxyamidy, aromatické uhlovodany, karboxiny, morfoliny, inhibitory sterolové biosyntézy a organofosforové sloučeniny. Jiné aktivní složky, které lze formulovat v kombinaci s tímto antifungálním polypeptidem zahrnují například insekticidy, atraktanty, sterilizační • · · · · ·· •« « · · ·· · • · · · · · • · · ···· · • * · ·· ··· ···· ·· ··· ···· ·· ·· činidla, akaricidy, nematocidy a herbicidy. US patent obsahuje obsažný souhrn řady aktivní složek, s kterýmižto látkami se tento antifungální polypeptid může formulovat.

Ať samotný nebo v kombinaci s jinými aktivními látkami, antifungální polypeptid podle vynálezu by se měl aplikovat při koncentraci v rozmezí asi od 0,1 pg/ml do 100 mg/ml, s výhodou v rozmezí asi od 5 pg/ml do 5 mg/ml, a pH v rozmezí asi od 3,0 do 9,0. Takové kompozice lze pufrovat například pomocí fosfátových ústojů mezi asi 1 mM a 1 M, s výhodou mezi asi 10 mM a 100 mM, nejlépe asi mezi 15 mM a 50 mM,. V případě nízké koncentrace ústoje je žádoucí přidat sůl k zvýšení iontové síly, s výhodou NaCl v rozmezí asi od 10 mM do 100 mM.

Další rozsah aplikovatelnosti podle vynálezu bude zřejmý z podrobného popisu a obrázků daných níže. Rozumí se však, že podrobný popis a specifické příklady, které naznačují výhodná provedení vynálezu, jsou dány jen pro ilustraci, poněvadž různé změny a modifikace v duchu a rozsahu podle vynálezu budou zřejmé odborníkům z tohoto podrobného popisu.

Krátký popis obrázků

Shora uvedené a jiné předměty, rysy a výhody vynálezu budou lépe pochopeny z následujícího podrobného popisu a doprovázejících obrázků, které jsou pouze ilustrativní, a neomezují vynález.

Fragmenty DNA společné plazmidovým mapám zde uvedeným jsou: AMP: odolnost ampicillinu, Ori-pUC: počátek replikace je odvozen z pUC plasmidu, LAC: parciální sekvence Lac Z genu, p-e35S: promotor E35S, intron HSP70: intron tepelného šoku proteinu 70 z kukuřice, NOS3’: 3’ nepřeložená oblast genu nopalin syntházy (nos) z Agrobacterium Ti plazmidu, Ori-M13; počátek replikace fágu M13, Spc/Str: bakteriální gen odolnosti spectinomycinu / streptomycinu. p-FMV: promotor 35S mozaikového Figwort viru, EPSPS/CTP2: tranzitní peptid chloroplastu zArabinopsis genu syntházy 5-enolpyruvyl-3fosfošikimátu (EPSPS), CP4 syn: syntetický gen bakteriální odolnosti glyfosátu, CP4: gen syntházy 5-enopyruvyl-3-fosfoshikimátu (EPSPS), E9 3’: 3’ nepřeložená oblast genu bobu ssRUBISCO, PetHSP70-vůdce: 5’ nepřeložená vedoucí sekvence genu proteinu 70 tepelného šoku z muškátu, Ori-322: počátek replikace pUC322.

Obr. 1 ukazuje cDNA sekvenci nukleotidů a odvozenou sekvenci aminokyselin AlyAFP. Trojúhelník ukazuje počátek zralého AlyAFP polypeptidů. Podtržená sekvence aminokyselin ukazuje signální peptid. Dvojitě podtržená sekvence ukazuje možnou polyA signální sekvenci. Hvězdička znamená stop kodon.

8·· ···· · ·· ·· ·· « · · ··*· ···© • · · · · · ·· • · · · ······· ··· ·· ··· ···· ·· ··· ···· ·· ··

Obr. 2 je shrnující srovnání sekvencí aminokyselin AlyAFP, Rs-AFPl a Rs-AFP2. Trojúhelník ukazuje počátek zralých AlyAFP a Rs-AFPl polypeptidů. Podtržená sekvence aminokyselin ukazuje signální peptidy (signální sekvence peptidů Rs-AFP2 nebyla určena) a hvězdička ukazuje rozdíly mezi těmito třemi peptidy.

Obr. 3 je fyzikální mapa pMON23317.

Obr. 4 je fyzikální mapa pMON22652.

Obr. 5 je fyzikální mapa pMON22575.

Obr. 6 je fyzikální mapa pMON22655.

Obr. 7 je fyzikální mapa pMON17227.

Obr. 8 je fyzikální mapa pMON22657.

Obr. 9 je fyzikální mapa pMON22634.

Obr. 10 je fyzikální mapapMON22635.

Obr. 11 je sloupcový graf odpovídající údajům v tabulce 3, ukazující výsledky testů s chorobou vadnutí Verticillium provedenými s transgenními rostlinami brambor exprimujícími AlyAFP cDNA.

Obr. 12 je sloupcový graf odpovídající údajům v tabulce 4, ukazující výsledky testů s chorobou vadnutí Verticillium provedenými s transgenními rostlinami bramborami exprimujícími Rs-AFPl a Rs-AFP2.

Následující podrobný popis vynálezu má pomoci odborníkům při provádění vynálezu. Proto následující podrobný popis vynálezu nemá být chápán tak, aby zbytečně neomezoval tento vynález, protože modifikace a variace provedení zde diskutované mohou odborníci provést, aniž by se odklonili od ducha nebo rozsahu tohoto vynálezeckého objevu.

Obsah každého odkazu diskutovaného v tomto popisu, včetně referencí zde citovaných je zde zahrnut ve své úplnosti.

Tak jak se zde používá, výraz „antifungální polypeptid“ se týká polypeptidů majícího antifungální účinky, například který inhibuje růst plísňových buněk, nebo který zabíjí plísňové buňky, nebo který přerušuje nebo opožďuje stadia životního cyklu plísní, jako germinace spor, sporulace a dozrávám.

Fráze „boj s poškozením nebo regulace poškození pbsněmi“ v zemědělském kontextu se týká snížení poškození úrody v důsledku infekce plísňovými pathogeny. Obecněji se tato fráze týká zmenšení nepříznivých účinků způsobených nežádoucí plísní na kterémkoliv místě.

Výraz „strukturní kódující sekvence“ znamená DNA sekvenci, která kóduje peptid, polypeptid nebo protein, který vzniká v buňce transkripcí strukturní kódující sekvence na mediátorovou RNA (mRNA) s následující translací mRNA na žádoucí peptidový, polypeptidový nebo proteinový produkt.

Způsob podle vynálezu lze provádět různými metodami. Tyto antiíungální polypeptidy, připravené jakýmkoliv způsobem poznamenaným shora, lze aplikovat přímo na rostliny ve směsi s nosiči a jinými additivy včetně jiných antifimgálních látek, které jsou v oboru známé. Alternativně může být polypeptid exprimován bakteriálními a plísňovými buňkami, které se mohou aplikovat na rostlinu. Rostlinné buňky se také mohou transformovat konvenčními způsoby, aby obsahovaly DNA kódující antiíungální polypeptidy. Ty lze exprimovat konstitučně, ve specifických tkáních, nebo po vystavením této rostliny plísňovému pathogenu.

Vynález dále zahrnuje použití polypeptidu obsahujícího sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 2, která vykazuje silnou antifungální aktivity proti rozmanitým rostlinným pathogenním plísním.

Sekvence aminokyselin tohoto antifungálního polypeptidu se stanovila přímým sekvenováním a translací její klonované cDNA. Ačkoliv je částečně homologní, například má částečnou sekvenční identitu vzhledem k jiným rostlinným defensinům, tento antifungální polypeptid se liší od všech ostatních rostlinných defensinů více než 10 % svých zbytků aminokyselin. Mimoto je antiíungální aktivita tohoto polypeptidu významně vyšší než nejblíže příbuzných rostlinných defensinů (Rs-AFPl a Rs-AFP2), zejména při zkoušení v přítomnosti anorganických kationtů při fyziologických koncentracích. Sloupcový diagram srovnávající sekvence aminokyselin AlyAFP se sekvencemi Rs-AFPl a Rs-AFP2 je ukázán na obrázku 2.

Tento vynález také zahrnuje použití kterékoliv DNA sekvence nebo jejích biologicky funkčních ekvivalentů, zde popsaných, k produkci rekombinantních plazmidů transformovaných mikroorganizmů, zkoušek a primérů užitečných při identifikaci příbuzných DNA sekvencí, které dodávají rezistenci proti plísftovým pathogenům na buňkách rostlin a k produkci transgenních rostlin. Vynález také zahrnuje způsoby dodávání rezistence proti plísňovým pathogenům na buňkách rostlin a rostlinách použitím DNA sekvence nebo jejich biologicky funkčních ekvivalentů zde popsaných.

Jak ve uvedeno výše antifungální polypeptidy podle vynálezu se mohou použít v kombinaci s jinými antifungálními činidly, včetně jiných peptidů, polypeptidů a proteinů, které vykazují antifungální aktivitu, aby se dosáhlo široké spektrum aktivity, například kontrola dalších pathogenů a nebo aby se dosáhly mnohonásobné módy akce pro inhibici stejných plísňových pathogenů. Příklady takových jiných antifimgálních látek zahrnují chitinázy, proteiny

vázající chitin bohaté na cystein, 3-l,3-glukanázy, permatiny (včetně zematinů), thioniny, proteiny inaktivující ribosom, a nespecifické proteiny přenosu lipidů.

Zdroje takových antifungálních polypeptidů a proteinů zahrnují rostliny jako Arabidopsis, ječmen, brokolice, zelí, kanola, mrkev, kukuřice, česnek, cibule, bob, pepř, brambory, rýže, podzemnice, cukrová řepa, tabák, rajče a pšenice; mikroorganismy jako Aspergillus, Penicillium, Streptomyces, Alternaria (Altemaria brassicola; Alternaria solani); Ascochyta (Ascochyta pisi); Botrytis (Botrytis cinerea); Cercospora (Cercospora kikuchii; Cercospora zaea-maydis); Colletotrichum (Colletotrichum lindemuthianum.); Diplodia (Diplodia maydis), Erysiphe (Erysiphe graminis f.sp. graminis; Erysiphe graminis f.sp. hordei); Fusarium (Fusarium nivale; Fusarium oxysporum; Fusarium graminearum; Fusarium culmorum, Fusarium solani; Fusarium moniliforme; Fusarium roseum); Gaeumanomyces (Gaeumanomyces graminis f.sp. tritici); Helminthosporium (Helminthosporium turcicum, Helminthosporium carbonum, Helminthosporium maydis); Macrophomina (Macrophomina phaseolina, Maganaporthe grisea), Nectria (Nectria heamatococca); Peronospora (Peronospora manshurica; Peronospora tabacina); Phoma (Phoma betae); Phymatotrichum (Phymatotrichum omnivorum); Phytophthora (Phytophthora cinnamomi; Phytophthora cactorum; Phytophthora phaseoli: Phytophthora parasitica; Phytophthora citrophthora; Phytophthora megasperma f.sp. sojae; Phytophthora infestans); Plasmopara (Plasmopara viticola); Podosphaera (Podosphaera leucotricha); Puccinia (Puccinia sorghi; Puccinia striiformis; Puccinia graminis f.sp. tritici; Puccinia asparagi; Puccinia recondita; Puccinia arachidis); Puthium (Puthium aphanidermatum); Pyrenophora (Pyrenophora tritici repentens); Pyricularia (Pyricularia oryzae); Pythium (Pythium ultimum); Rhizoctonia (Rhizoctonirf solani; Rhizoctonia cerealis); Scerotium (Scerotium rolfsii); Sclerotinia (Sclerotinia sclerotiorum), Septoria (Septoria lycopersici; Septoria glycines; Septoria nodorum; Septoria tritici); Thielaviopsis (Thielaviopsis basicola), Uncinula (Uncinula necator); Venturia (Venturia inaequalis); a Verticillium (Verticillium dahliae; Verticillium albo-atrum); a jiné nerostlinné organismy.

Tento vynález lze lépe pochopit z následujících příkladů, které nejsou tímto neomezeny.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Molekulová hmotnost AlyAFP

Gelová elektroforéza

Molekulová hmotnost AlyAFP se nejprve stanovila elektroforeticky způsobem podle Laemmli (1970) Nátuře 227: 680-685. Polypeptid se rozpustil vústoji pro denaturaci vzorku obsahujícím 450 mM Tris-HCl, pH 8,45, 12 % glycerolu, 4 % SDS, 0,06 % Coomasie modř G a 0,0025 % fenolové červeni (Novex, San Diego, CA) povařením po dobu 10 minut a podrobil se elektroforéze se v elektroforetickém ústoji obsahujícím 100 mM Tris a 1 % SDS při 125V konstantního napětí po dvě hodiny. Barvení stříbrem (Integrated Separation Systems, Natick, MA) ukázalo pás mající molekulovou hmotnost přibližně 6 kDa.

Hmotnostní analýza hmotnostní spektrometrií s elektrorozprašovámm pozitivních iontů.

AlyAFP se hmotnostně analyzovala hmotnostní spektrometrií s elektrorozprašováním pozitivních iontů, jak je popsáno vScoble aj. ((1993) v A Practical Guide to Proteine and Peptide Purification for Microsequencing, P. Matsudaria, Ed., Academie Press, lne, San Diego, strany 125-153).

Pozorovaná molekulová hmotnost nativního polypeptidů byla 5 657 daltonů.

Analýza tryptických fragmentů

Antifungální polypeptid se redukoval, karboxymethyloval a štěpil se trypsinem způsobem podle Stone a Williams ((1993) A Practical Guide to Proteine and Peptide Purification for Microsequencing, P. Matsudaria, Ed., Academie Press, lne, San Diego, strany 43-69). Tryptické fragmenty se analyzovaly kapilární kapalinovou chromatografií/hmotnostní spektrometrií, aby se stanovila molekulová hmotnost tryptických fragmentů jako pomůcka při stanovení sekvence aminokyselin proteinu.

Jeden z tryptických fragmentů polypeptidů měl stejnou molekulovou hmotnost a eluční dobu jako C-terminální tryptický fragment popsaný v PCT publikaci číslo WO 93/05153, což ukazuje, že dva polypeptidy sdílí stejný C-konec. Žádné jiné molekulové hmotnosti tryptických fragmentů polypeptidů se nehodily k Rs-AFPl, což ukazuje, že tento polypeptid se liší od RsAFP1 viz obr.l.

Příklad 2

Sekvence aminokyselin AlyAFP

Aby se stanovila sekvence aminokyselin AlyAFP, vyčištěný polypeptid (čistota přes 98% podle údajů hmotnostní spektrometrie) se denaturoval v 8 M močovině obsahující 8 mM dithiothreitolu. Cysteinové zbytky se modifikovaly, S-karboxymethylovaly a štěpily tiypsinem, jak je popsáno v Stone a Williams ((1993) A Practical Guide to Proteine and Peptide Purification for Microsequencing, P. Matsudaria, Ed., Academie Press, lne, San Diego, strany 55-56).

BB ·· • · · · • BBB • · · · B • · B ·· BB • · BB · Β ·· • · ΒΒΒΒ Β Β Β · • · · Β · • · Β Β •··Β Β· ·······

Reagenty se odstranily dialýzou proti destilované vodě s použitím membrány mající řez molekulové hmotnosti 1000. Automatizovaná Edman degradace se provedla na sekvenčním analyzátoru proteinů Applied Bioystems mode 1470A (Applied Bioystems, Norwalk, CT). Příslušné PTH deriváty aminokyselin se identifikovaly analýzou v reverzní fázi způsobem v linii s použitím analyzátoru Applied Bioystems model 120 PTH.

N-terminální sekvenace polypeptidů identifikovalo 49 aminokyselin, jak je ukázané v SEQ ID NO: 1, s nejasnými odezvami v polohách 10, 44, 45 a 46. Informace odvozená z analýzy hmotnostní spektrometrií tiyptických fragmentů (příklad 1) naznačila, že tyto neurčené aminokyseliny musí být tryptofan v poloze 10, cystein-isoleucin-cystein v polohách 44-45-46 a cystein v koncové poloze 50.

Úplná sekvence aminokyselin zralého AlyAFP polypeptidů je ukázaná v SEQ ID NO: 2. Příklad 3

Bioúčinnost AlyAFP

Antifungální aktivitu AlyAFP lze vyjádřit jako její koncentraci vpg/ml potřebnou k dosažení 50 % inhibice fungálního růstu hyf (IC50). Procento inhibice fungálního růstu hyf se definuje jako 100 x poměr průměrné délky hyfy v testovaném vzorku kultury dělenému průměrnou délkou hyfy v kontrolním vzorku kultury, ke kterému se přidal ústoj místo vzorku polypeptidů.

Antifungální aktivita AlyAFP se stanovila měřením inhibice délky hyf plísní řady různých plísní v přítomnosti tohoto polypeptidů pod inverzním mikroskopem. Spory plísní (2 χ 10⁴ spór/ml) se nechaly germinovat 5 až 15 hodin v závislosti na plísni užité v testu v 50 μΐ media s dvojnásobnou silou. Konečné testovací medium o jednotné síle obsahovalo KH2PO4 (2,5 mM), MgSO₄ (50 μΜ), CaCl₂ (50 μΜ), FeSO₄ (5 μΜ), CoCl₂ (0,1 μΜ), CuSO₄ (0,1 μΜ), Na₂MoO₄ (2 μΜ), H₃BO₃ (0,5 μΜ), KI (0,1 μΜ), ZnSO₄ (0,5 μΜ), MnSO₄ (0,1 M), glukózu (10 g/1), asparagin, (1 g/1), methionin (20 mg/1), myo-inositol (0,2 mg/1). Pro pokusy s antagonistickým účinkem kationtů se přidaly CaCl₂ a KCl na konečnou koncentraci 1 mM a 50 mM. Toto medium se solemi se označuje jako „medium s vysokými solemi“ a původní medium se označuje jako „medium s nízkými solemi“. Po germinaci spor se přidalo 50 μΐ roztoku polypeptidů sterilovaného filtrací v destilované vodě do testovací jamky obsahující germinované spory a směs se inkubovala při 24 °C 15 až 24 hodin. AlyAFP se testoval v rozmezí koncentrací od 0 do 80 pg/ml, aby se stanovily hodnoty IC50. Koncentrace polypeptidů se stanovily pomocí BCA proteinové testovací soupravy získané od Pierce (Rockford, II).

• · • ·· ·· ···· ·· ······· ·· ··

Tabulka 1 ukazuje antifungální aktivitu AlyAFP proti Fusarium culmorum, příčině nárůstů klasů pšenice a Verticillium dahliae, příčině předčasného úhynu brambor.

Tabulka 1

Protiplísňová aktivita AlyAFP

IC₅o (pg/ml)

Pbseň nízká sůl vysoká sůl

F. culmorum <2 <10

V. dahliae <1 <5

Údaje v tabulce 1 ukazují, že AlyAFP má silnou antifungální aktivitu proti Fusarium a Verticillium, které působící nemoci mnoha kulturních rostlin, včetně ječmene, kukuřice, bavlny, ovsa, brambor, podzemnice, sóji, rajčat a pšenice. Antifungální aktivita tohoto polypeptidů je mnohem méně citlivá k antagonistickému účinku solí přítomných v testovacím medium ve srovnám s jinými antifungálními polypeptidy popsanými v PCT mezinárodní publikace WO 93/05153. Koncentraci v pg/ml potřebnou k dosažení 50 % inhibice fungálního růstu hyf (IC50) lze realisticky dosáhnout v rostlinách transformovaných DNA kódující AlyAFP. Tyto IC hodnoty spadají do rozsahu mnoha komerčně dostupných fungicidů a odráží užitečnost použití tohoto antifungálního polypeptidů na infekční místo rostlin.

Údaje v tabulce 2 srovnávají antifungální aktivitu tohoto polypeptidů sRs-AFPl a RsAFP2 popsanými v PCT mezinárodní publikaci WO 93/05153.

Tabulka 2

Srovnám antifungální aktivity AlyAFP, Rs-AFPl a Rs-AFP2

IC₅o(pg/ml)

Pbseň	nízká sůl	vysoká sůl
F. culmorum
AlyAFP	<2	< 10
Rs-AFPl	5	70
Rs-AFP2	2	5
V. dahliae
AlyAFP	< 1	< 5
Rs-AFPl	5	> 100
Rs-AFP2	1,5	50

Tyto údaje ukazují, že aktivita AlyAFP na F. culmorum při podmínkách nízkých solí a vysokých solí je podobná Rs-AFPl a Rs-AFP2. Avšak aktivita tohoto polypeptidu na V. dahliae je významně vyšší než Rs-AFPl a Rs-AFP2 při podmínkách vysokých solí.

AlyAFP a její biologické funkční ekvivalenty se mohou použít ke kontrole plísní vybraných z následujících rodů a druhů:

Alternaria (Alternaria brassicola; Altemaria solani);

Ascochyta (Ascochyta pisi);

Botrytis (Botrytis cinerea);

Cercospora (Cercospora kikuchii; Cercospora zaea-maydis);

Colletotrichum (Colletotrichum lindemuthianum.);

Diplodia (Diplodia maydis),

Erysiphe (Erysiphe graminis f.sp. graminis; Erysiphe graminis f.sp. hordei);

Fusarium (Fusarium nivale; Fusarium oxysporum; Fusarium graminearum; Fusarium culmorum, Fusarium solani; Fusarium moniliforme; Fusarium roseum);

Gaeumanomyces (Gaeumanomyces graminis f.sp. tritici);

Helminthosporium (Helminthosporium turcicum, Helminthosporium carbonum,

Helminthosporium maydis);

Macrophomina (Macrophomina phaseolina, Maganaporthe grisea),

Nectria (Nectria heamatococca);

Peronospora (Peronospora manshurica; Peronospora tabacina);

Phoma (Phoma betae);

Phymatotrichum (Phymatotrichum omnivorum);

Phytophthora (Phytophthora cinnamomi;

Phytophthora cactorum; Phytophthora phaseoli: Phytophthora parasitica;

Phytophthora citrophthora; Phytophthora megasperma f.sp. sojae; Phytophthora infestans);

Plasmopara (Plasmopara viticola);

Podosphaera (Podosphaera leucotricha);

Puccinia (Puccinia sorghi; Puccinia striiformis; Puccinia graminis f.sp. tritici; Puccinia asparagi; Puccinia recondita; Puccinia arachidis);

Puthium (Puthium aphanidermatum);

9999 • · 9 ·9 9 9 •999 99 999 9999 99 99

Pyrenophora (Pyrenophora tritici repentens);

Pyricularia (Pyricularia oryzae);

Pythium (Pythium ultimum);

Rhizoctonia (Rhizoctonir) solani; Rhizoctonia cerealis);

Scerotium (Scerotium rolfsii);

Sclerotinia (Sclerotinia sclerotiorum),

Septoria (Septoria lycopersici; Septoria glycines; Septoria nodorum; Septoria tritici); Thielaviopsis (Thielaviopsis basicola),

Uncinula (Uncinula necator);

Venturia (Venturia inaequalis);

Verticillium (Verticillium dahliae; Verticillium albo-atrum).

Přiklad 4

Klonování DNA kódující AlyAFP Isolace mRNA

Úplná RNA se připravila z květů rostlin Alyssum získaným v místní školce pomocí RNaide Plus Kit od Bio 101 lne. (La Jolla, Ca) podle protokolu navrženého výrobcem. Pólyadenylováná RNA se isolovala pomocí oligo(dt)celulózy (GIBCO BRL/Life Technologies, Gaithersburg, MD) jak je popsáno v Celano aj. (1993) BioTechniques 15: 27-28.

Klonování cDNA

5’ oblast cDNA polypeptidů se klonovala pomocí soupravy 5’RACE (GIBCO BRL/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Prvý řetězec cDNA se generoval z polyadenylované RNA reversní transkripcí s použitím oligo-dT priméru. Po odstranění řetězce rDNA odštěpením RNázou H1 a separací v otáčivé kazetě se přidal k jednořetězové cDNA konec poly-C s použitím terminální deoxynukleotidové transferázy a za podmínek doporučených výrobcem. 5’ oblast cDNA polypeptidů se amplifikovala pomocí PCR za použití soupravy GeneAmp DNA Amplification Reagent Kit (Perkin Elmer Cetus) a reakčních podmínek doporučených výrobcem. Dva priméry použité pro amplifikaci byly 1) smíšené 35-mery oligonukleotidů (14 nukleotidů pro klonující místa a 21 nukleotidů pro specifiku genu, degenerace 24, SEQ ID NO: 3), připojené k aminokyselinám na C-konci sekvence polypeptidů v protisměrné orientaci a 2) oligodG primér, který se připijil k poly-C koneci cDNA (SEQ ID NO: 4) teplotní hybridizací. Produkty PCR reakce se analyzovaly elektroforézou na agarózovém gelu. V úplné reakční směsi

• · ·· byl přítomen jediný pás asi 250 bp, ale nebyl v kontrolní reakčni směsi, která obsahovala pouze primér. Tento pás se z gelu vyřízl a DNA se isolovala pomocí centrifugační filtrační jednotky Ultrafree-MC (Millifore, Bedford, MA). DNA fragment se štěpil Bam Hl, klonoval se do plazmidu pGEMllZf(+) (Promega, Madison, WI) a insert se sekvencoval na 373 DNA Sequencer Střech Model od Applied Bioystems s použitím PRISM Ready Reaction DYeDeoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied Bioystems). Sekvence je ukázaná v SEQ ID NO: 5.

3’ oblast cDNA polypeptidu se klonovala následovně. Prvý řetězec cDNA generovaný z 5’RACE se použil jako vzor pro amplifikaci 3’ oblasti cDNA polypeptidu pomocí PCR za použití soupravy GeneAmp DNA Amplification Reagent Kit (Perkin Elmer Cetus) a reakčmch podmínek doporučených výrobcem. Dva priméry použité pro amplifikaci byly 1) smíšené 34mery oligonukleotidů (14 nukleotidů pro klonující místa a 20 nukleotidů pro specifiku genu, degenerace 16, SEQ ID NO: 6), připojené k aminokyselinám v polohách 13 a 19 sekvence polypeptidu a 2) oligo-dT primér, který se připojil k poly-(A+) konci cDNA (SEQ ID NO: 7) teplotní hybridizaci. Produkty PCR reakce se analyzovaly elektroforézou na agarózovém gelu. V úplné reakčni směsi byl přítomen jediný pás asi 300 bp, ale nebyl v kontrolní reakčni směsi, která obsahovala pouze jeden primér. Tento pás se z gelu vyřízl a DNA se izolovala pomocí centrifugační filtrační jednotky Ultrafree-MC (Millifore). DNA fragment se štěpil Bam Hl, klonoval se do plazmidu pGEMllZf(+) a inzert se sekvenoval na 373 DNA Sequencer Střech Model od Applied Bioystems s použitím PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied Bioystems). Sekvence je ukázaná v SEQ ID NO: 8.

5’ a 3’ oblasti cDNA polypeptidu se překrývaly 114 nukleotidy a spojem těchto dvou oblastí dala sekvenci celé délky polypeptidu cDNA (SEQ ID NO: 9).

Jak je ukázané na obr. 1, cDNA antifungálního polypeptidu kóduje 52 bp 5’ vedoucí sekvenci, 240 pb otevřený čtecí rámec kódující polypeptid s 79 aminokyselinami a 3’ nepřeloženou oblast 170 bp až kpoly(A+) konci. Odvozený polypeptid (obr. 1) se skládá z předpokládaného signálního peptidů s 29 aminokyselinami (podtrženo na obr. 1) a zralého polypeptidu s 50 aminokyselinami, což souhlasí se sekvencí stanovenou analýzou hmotnostní spektrometrií a přímým sekvenováním aminokyselin (viz příklady 1 a 2). Sekvence aminokyselin v blízkosti předpokládaného místa štěpení signálního peptidů se podobá Rs-AFPl (viz obr. 2) a skutečné štěpení probíhá mezi alaninem a argininem, například u šipky na obr. 1. Výsledný neblokovaný N-konec může přispívat k pozorované vysoké antifungální aktivitě tohoto polypeptidu ve srovnám s aktivitou Rs-AFPl.

·· ···· · ·· ·· ··

1*7 · · · ···· ····

1/ ·« · ····· • · · · ······ · • · · ·· ··· ···· ·· ······· ·· ··

Pro usnadnění klonování se restrikční místa konstruovaly pomocí PCR do konců cDNA fragmentu, který obsahoval kódující oblast cDNA polypeptidu. Přiměř specifický pro 5’gen 14 bp sekvence proti směru exprese genu od startovního kodonu (ATG) prepolypeptidu se zahnízděnými Eco R1 a Bam HI restrikčními místy (SEQ ID NO: 10) a primér specifický pro 3’gen po stop kodonu (TAA) se zahnízděnými Eco R1 a Bam HI restrikčními místy (SEQ ID NO: 11) se použily pro amplifikaci cDNA fragmentu cDNA nukleových kyselin připravených reversní transkripcí mRNA, jak je popsané výše. Fragment amplifikovaný pomocí PCR je ukázán v SEQ ID NO: 12.

Tento PCR produkt se subklonoval jako 264 bp Bam HI fragment do Bam HI místa předem konstruovaného kazetového vektoru E. coli pMON23317 (obr. 3) obsahujícího E35S promotor s intronem Hsp70 z kukuřice za vzniku pMON22652 (obr. 4). 3’ nepřeložená polyadenylová sekvence genu nos se použila jako terminátor. Vektor také obsahoval multispojovací místo mezi intronem a sekvencemi terminátoru, Notl místa před a za promotorem a sekvencemi terminátoru a gen odolnosti ampicillinu. cDNA insert vpMON22652 se sekvenoval s použitím priméru (SEQ ID NO: 13) na sekvenci HSP70 intronu 50 bp proti směru exprese Bam HI klonovacího místa. Sekvence tohoto cDNA insertu je ukázaná v SEQ ID NO: 14, která je ve správné transkripční orientaci a její odvozená sekvence aminokyselin (SEQ ID NO: 15) se shoduje s polypeptidem získaným přímou analýzou sekvence aminokyselin (srovnej SEQ ID NO: 2).

Geny kódující AlyAFP, včetně přirozeně se vyskytujících muteinů a jejich variant, se pravděpodobně vyskytují v genomu různých rostlinných druhů. Tyto geny lze izolovat z chromozomální DNA těchto rostlinných druhů konvenčními molekulárně biologickými způsoby. Například chromozomální DNA knihovny lze zabudovat do vektorů, jako jsou vektory bakteriofágu lamda-EMBL3 a lamda-gtlO, kosmidů nebo plazmidů pomocí způsobů známých v oboru (Sambrook aj. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Geny kódující polypeptidy mající stejnou nebo podobnou antifungální aktivitu jako AlyAFP lze isolovat pomocí PCR provedené na chromozomální DNA nebo na chromozomální DNA knihovny, nebo hybridizací nukleotidové sondy genomických DNA knihoven. Priméry pro PCR a nukleotidové sondy pro hybridizační screening lze navrhnout na základě nukleotidové sekvence cDNA polypeptidu ukázané v SEQ ID NO: 12. Priméry by neměly mít samy o sobě komplementární sekvence, ani komplementární sekvence na svých 3’ koncích, aby se zabránilo tvorbě primér-dimér. Priméry mohou obsahovat restrikční místa. Priméry se spojí telpotní hybridizací k DNA a provede se dostatečný počet cyklů PCR, aby daly produkt snadno detekovatelný gelovou elektroforézou a barvením. Priméry mají obecně délku alespoň 16 nukleotidů, typicky délku alespoň 20 nukleotidů a nejlépe délku alespoň 28 nukleotidů. Takové primery by měly být schopné specificky značkovat geny kódující antifimgální polypeptidy nebo proteiny mající stejnou nebo podobnou antifungální aktivitu jako AlyAFP. Amplifikované fragmenty se mohou čistit a vložit do vhodného vektoru a množit konvenčními způsoby známými v oboru.

Příklad 5

Peptidy, polypeptidy a proteiny biologicky funkčně ekvivalentní AlyAFP

Tento vynález nezahrnuje jenom polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2, která může být ve formě kyselé nebo bazické sob nebo v neutrální formě, ale také biologicky funkčně ekvivalentní peptidy, polypeptidy a proteiny. Fráze „biologicky funkčně ekvivalentní peptidy, polypeptidy a proteiny“ znamená peptidy, polypeptidy a proteiny, které obsahují sekvenci nebo skupinu vykazující sekvenční podobnost k AlyAFP a které vykazují stejnou nebo podobnou antifungální aktivitu jako tento polypeptid zde popsaný.

Peptidy, polypeptidy a proteiny obsahující konzervativní změny aminokyselin v základní sekvenci polypeptidů

Peptidy, polypeptidy a proteiny biologicky funkčně ekvivalentní AlyAFP zahrnují sekvence aminokyselin konzervativní změny aminokyselin v základní sekvenci polypeptidů ukázané v SEQ ID NO: 2. V takových sekvencích aminokyselin jedna či více aminokyselin v základní sekvenci je (jsou) nahrazena(y) jinou(ými) aminokyselinou(ami), jejichž náboj a polarita je podobná nativní aminokyselině, například konzervativní substituce aminokyselin vedoucí k tiché záměně.

Substituenty pro aminokyselinu v základní sekvenci polypeptidů lze vybrat z jiných členů třídy, do které přirozeně se vyskytující aminokyselina patří. Aminokyseliny lze rozdělit do následujících čtyř skupin: (1) kyselé aminokyseliny, (2) bazické aminokyseliny, (3) neutrální polární aminokyseliny, (4) neutrální nepolární aminokyseliny. Reprezentativní aminokyseliny těchto různých skupin zahrnují, ale nejsou na ně omezeny: (1) kyselé (negativně nabité) aminokyseliny, jako je kyselina asparágová a kysebna glutamová, (2) bazické (pozitivně nabité) aminokyseliny, jako je arginin, histidin a lysin, (3) neutrální polární aminokyseliny, jako je glycin, serin, threonin, cystein, cystin, tyrosin, asparagin a glutamin, (4) neutrální nepolární (hydrofobní) aminokyseliny, jako je alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin.

• * · · · ·

Konzervativní záměny aminokyselin v základní sekvenci polypeptidu lze provést substitucí jedné aminokyseliny v těchto skupinách za jinou aminokyselinu ve stejné skupině. Biologicky funkčně ekvivalentní AlyAFP mohou mít 10 nebo méně konzervativních záměn aminokyselin, s výhodou sedm nebo méně konzervativních záměn aminokyselin a nejvýhodněji pět nebo méně konzervativních změn aminokyselin. Kódující sekvence nukleotidů (gen, plazmidová DNA, cDNA nebo syntetická DNA) tedy budou mít odpovídající substituce bází, dovolující kódovat biologicky funkčně ekvivalentní formu AlyAFP.

Biologicky funkčně ekvivalentní peptidy, polypeptidy a proteiny zde míněné by měly mít asi 70 % nebo více sekvenční podobnosti, s výhodou 80 % nebo více sekvenční podobnosti a nejlépe 90 % nebo více sekvenční podobnosti k sekvenci, nebo odpovídající skupině v ní, základní sekvence polypeptidu.

Fragmenty a varianty AlyAFP

Zatímco antifungální polypeptid podle vynálezu s výhodou obsahuje sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2, fragmenty a varianty této sekvence mající stejnou nebo podobnou antifunfální aktivitu jako tento antifungální polypeptid a jsou též zahrnuty do tohoto vynálezu.

Fragmenty AlyAFP

Fragmenty AlyAFP mohou být zkrácené formy, kde jedna či více aminokyselin je odstraněna zN- konce, C- konce, středu polypeptidu nebo jejich kombinace. Tyto fragmenty mohou být přirozeně se vyskytující nebo syntetické mutanty AlyAFP a měly by si zachovat antifunfální aktivitu AlyAFP.

Varianty AlyAFP

Varianty AlyAFP zahrnují formy, kde jedna či více aminokyselin je (jsou) vložena(y) do přirozené sekvence. Tyto varianty mohou být přirozeně se vyskytující nebo syntetické mutanty AlyAFP a měly by si zachovat antifunfální aktivitu AlyAFP.

Kombinace předcházejícího, například formy antifunfálního polypeptidu obsahující jak vynechám, tak přidání aminokyselin jsou též zahrnuty do vynálezu. Mohou být přítomné též náhrady aminokyselin.

Fragmenty a varianty AlyAFP zahrnuté do tohoto vynálezu by měly mít asi 70 % nebo více sekvenční podobnosti, s výhodou 80 % nebo více sekvenční podobnosti a nejlépe 90 % nebo více sekvenční podobnosti k odpovídajícím oblastem přirozeně se vyskytující AlyAFP mající sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2.

Peptidy. polypeptidy a proteiny reagující s protilátkami proti AlyAFP

Biologicky funkčně ekvivalentní formy AlyAFP také zahrnují peptidy, polypeptidy a proteiny, které reagují, například se specificky vážou k protilátkám proti AlyAFP a které vykazují stejnou nebo podobnou antifunfální aktivitu jako tento polypeptid. Takové protilátky mohou být polyklonálm a monoklonální protilátky.

Jiné biologicky funkčně ekvivalentní formy AlyAFP

Biologicky funkčně ekvivalentní formy AlyAFP užitečné ve vynálezu zahrnují konjugáty tohoto polypeptidu nebo jeho biologicky funkční ekvivalenty, jak jsou popsané výše, s jinými peptidy, polypeptidy a proteiny tvořícími produkty fuze vykazující stejnou, podobnou nebo vyšší antifunfální aktivitu ve srovnám s AlyAFP mající sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2. Příklady takových peptidů, polypeptidů a proteinů se diskutovaly výše v popisu vynálezu.

Příklad 6

Sekvence nukleotidů biologicky funkčně ekvivalentní sekvenci cDNA kódující AlyAFP

Vynález zahrnuje nejen sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 12, ale také biologicky funkčně ekvivalentní sekvence nukleotidů. Fráze „biologicky funkčně ekvivalentní sekvence nukleotidů“ znamená DNA a RNA, včetně genomické DNA, plazmidové DNA, cDNA, syntetické DNA a sekvencí nukleotidů mRNA, které kódují peptidy, polypeptidy a proteiny vykazující stejnou nebo podobnou antifunfální aktivitu jako AlyAFP, například když se zavede do hostitelských buněk funkčně operačním způsobem, takže se mohou exprimovat, produkují peptidy, polypeptidy a proteiny vykazující antifunfální aktivitu na úrovni dostačující pro dodání takovým buňkám odolnosti proti plísňovým pathogenům.

Sekvence nukleotidů kódující konzervativní záměny aminokyselin v AlyAFP

Biologicky funkčně ekvivalentní sekvence nukleotidů podle vynálezu zahrnují sekvence nukleotidů kódující konzervativní záměny aminokyselin v základním řetězci aminokyselin AlyAFP, vedoucí k jejich tichým záměnám. Takové sekvence nukleotidů obsahují odpovídající substituce bází ve srovnání se sekvencemi nukleotidů kódujícími divoký typ AlyAFP.

• ·

Sekvence nukleotidů obsahující substituce bází, vložení nebo odstranění

Mimo sekvence nukleotidů kódující konzervativní změny aminokyselin v základním řetězci aminokyselin AlyAFP zahrnují biologicky funkčně ekvivalentní sekvence nukleotidů podle vynálezu sekvence nukleotidů obsahující jiné substituce bází, vložení nebo odstranění. Ty zahrnují nukleové kyseliny obsahující stejnou vnitřní informaci jako je obsažena v cDNA SEQ ID NO: 12 a která kóduje peptidy, polypeptidy nebo proteiny dodávající do hostitelských buněk a rostlin antifunfální aktivitu stejnou nebo podobnou jako má AlyAFP. Takové sekvence nukleotidů lze označit za „geneticky modifikované formy“ cDNA ukázané v SEQ ID NO: 12 a lze je identifikovat metodami zde popsanými.

Mutace provedené v cDNA, plazmidové DNA, genomické DNA, syntetické DNA nebo jiné nukleové kyselině kódující AlyAFP výhodně zachovávají čtecí rámec kódující sekvence. Mimo to tyto mutace s výhodou netvoří komplementární oblasti, které by mohly hybridizovat, což by vedlo ke vzniku sekundární struktury mRNA ve formě smyčky nebo vlásenky, což by mohlo nepříznivě ovlivňovat translaci mRNA.

Ačkoliv lze místa mutace předem určit, není nutné, aby byla povaha mutace per se předem určena. Aby se například vybraly pro optimální charakteristiky mutanty na daném místě, lze provádět na cílovém kodonu náhodné mutageneze.

Alternativně lze mutace zavést na zvláštním místě syntézou oligonukleotidů obsahujících mutantm sekvence obklopené místy restrikce umožňujícími ligaci k fragmentům nativní AlyAFP cDNA sekvence. Po ligaci vzniklá rekonstruovaná nukleotidová sekvence kóduje odvozenou formu AlyAFP obsahující žádoucí inzerci, substituci nebo deleci aminokyselin.

V každém případě lze exprimované mutanty podrobit screeningu na žádoucí antifunfální aktivitu, například způsobem popsaným v příkladě 3.

Specifické příklady užitečných geneticky ekvivalentních modifikovaných forem cDNA SEQ ID NO: 12 zahrnují DNA mající nukleotidovou sekvenci, která vykazuje vysokou hladinu homologie, například sekvenční identitu k cDNA SEQ ID NO: 12. Ta může mít rozpětí od asi 70 % nebo více sekvenční podobnosti, s výhodou 80 % nebo více sekvenční podobnosti a nejlépe 90 % nebo více sekvenční podobnosti k cDNA nebo její odpovídající oblasti v SEQ ID NO: 12.

Takové geneticky ekvivalentní modifikované formy lze snadno izolovat s použitím konvenčních technik hybridizace DNA-DNA nebo DNA-RNA (Sambrook aj. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spríng Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) nebo amplifikace pomocí metod řetězové reakce polymerázy (PCR). Tyto formy by měly být schopné

• · · · · · • · · · • · • · · • · · • · · · · · · dodat odolnost proti plísňovým pathogenům, když se zavedou konvenčními transformačními technikami do rostlinných buněk normálně citlivých k takovým pathogenům.

Sekvence nukleotidů kódující fragmenty a varianty AlyAFP

Fragmenty a varianty AlyAFP diskutované v příkladě 5 lze kódovat cDNA, plazmidovou DNA, genomickou DNA, syntetickou DNA nebo mRNA. Tyto nukleové kyseliny by měly mít asi 70 % nebo více sekvenční podobnosti, s výhodou 80 % nebo více sekvenční podobnosti a nejlépe 90 % nebo více sekvenční podobnosti k odpovídajícím oblastem nebo skupinám cDNA mající sekvenci nukleotidů ukázanou v SEQ ID NO: 12 kódující AlyAFP nebo jí odpovídající mRNA.

V tomto vynálezu nukleové kyseliny biologicky funkčně ekvivalentní cDNA AlyAFP mající sekvenci nukleotidů ukázanou v SEQ ID NO: 12 zahrnují:

(1) DNA mající délku, která se může měnit buď přirozenými nebo umělými mutacemi, jako jsou částečné odstranění, vložení, adice nebo podobně, nukleotidů, takže když celá délka SEQ ID NO: 12 se vezme jako 100 %, biologicky funkčně ekvivalentní sekvence má přibližnou délku 60-120 % SEQ ID NO: 12, s výhodou 80-110 %, nebo (2) sekvence nukleotidů obsahující částečné (obvykle 20 % nebo méně, s výhodou 10 % nebo méně, nejlépe 5 % nebo méně, celkové délky) přirozených nebo umělých mutací, takže takové sekvence kódují různé aminokyseliny, avšak výsledný polypeptid si zachová antifungální aktivitu AlyAFP. Mutovaná DNA vytvořená tímto způsobem obvykle kóduje polypeptid mající 70 % nebo více, s výhodou 80 % nebo více a nejlépe 90 % nebo více sekvenční podobnosti k sekvenci aminokyselin AlyAFP (SEQ ID NO: 2) kódovanou nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 12.

V tomto vynálezu použité způsoby pro vznik umělých mutací nejsou specificky omezené a takové mutace lze provádět všemi prostředky známými v oboru.

Například cDNA nebo gen AlyAFP lze ošetřit vhodnými restrikčními enzymy, aby se vložily nebo odstranily příslušné fragmenty DNA, aby se zachoval vlastní čtecí rámec aminokyselin. Po ošetření restrikční endonukleázou se štěpená DNA upraví tak, aby se vyplnily jakékoliv převisy a DNA se narovná.

Mutace lze také zavést na určitém místě syntézou oligonukleotidů obsahujících mutantní sekvenci lemovanou místy restrikce umožňujícími ligaci k fragmentům nativní AlyAFP cDNA sekvence. Po ligaci vzniklá výsledná rekonstruovaná nukleotidová sekvence kóduje derivát obsahující žádoucí inzerci, substituci nebo delecí aminokyselin.

» · · · · ·

Alternativně lze oligonukleotidově řízené mutagenní procedury specifické k místu nebo mutagenní procedury specifické k segmentu použít k produkci zaměněné cDNA nebo genomické DNA sekvence mající dané kodony zaměněné podle žádané substituce, delece nebo inzerce.

Příkladné způsoby provedení záměn popsaných výše jsou popsané v Ausubel aj. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, lne., Bauer aj. (1985) Gene 37: 73, Craig aj. (1985) BioTechniques 3: 12-19, Frits Eckstein aj. (1982) Nucleic Acids Research 10: 6487-6497, Sambrook aj. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Smith aj. (1981) vGenetic Engineering Principles and Methods, Setlow aj. Eds., Plenům Press, NY, strany 1-32, Osuna aj. (1994) Critical Rewievs in Microbiology, 20: 107-116 a Walder aj. (1986) Gene 42:133. Biologicky funkční ekvivalenty k sekvenci cDNA zde popsané produkované kteroukoliv z těchto metod lze vybrat pro výrobu peptidu, polypeptidu nebo proteinu jimi kódovaných technikami popsanými v příkladě 3.

Sekvence nukleotidů kódující peptidy, polypeptidy nebo proteiny, které reagují s protilátkami proti AlyAFP

Biologicky funkčně ekvivalentní formy cDNA kódující AlyAFP zahrnují sekvence nukleotidů kódující peptidy, polypeptidy a proteiny, které reagují, například se specificky vážou k protilátkám proti AlyAFP, a které vykazují stejnou nebo podobnou antifungální aktivitu jako tento polypeptid. Takové mohou být polyklonální a monoklonální protilátky.

Geneticky degenerované sekvence nukleotidů

V důsledku degenerace genetického kódu, například existence více než jednoho kodonu pro většinu přirozeně se vyskytujících proteinů, lze použít jiné sekvence DNA (a RNA), které obsahují podstatně stejnou genetickou informaci jako cDNA tohoto vynálezu a které se kódují sekvencí nukleotidů SEQ ID NO: 12, pro provedení vynálezu. Tento princip se aplikuje též k jakékoliv jiné sekvenci nukleotidů zde diskutované.

Syntetické sekvence DNA navržené pro zesílenou expresi v daných hostitelských buňkách

Biologicky funkčně ekvivalentní formy cDNA podle vynálezu také zahrnují syntetické DNA navržené pro zesílenou expresi v daných hostitelských buňkách. Hostitelské buňky často exprimují výhodný vzor využití kodonů (Murray aj. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 47724 • · · · 1 • · ( ·· · ·

498). Syntetické DNA navržené pro zesílenou expresi v daném hostiteli by tedy měly odrážet vzor využití kodonů v hostitelských buňkách.

V tomto vynálezu se může stanovit sekvenční podobnost nebo identita s použitím ,3estFit“ nebo „Gap“ programů vSequence Analysis Software Package, Genetic Computer Group, lne., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI 53711.

Sekvence nukleotidů kódující fúzované formy AlyAFP

Jiné biologicky funkčně ekvivalentní formy cDNA SEQ ID NO: 12 užitečné v tomto vynálezu zahrnují ty, které se modifikovaly, aby kódovaly konjugáty sjinými peptidy, polypeptidy nebo proteiny, které jsou diskutované v popisu a v příkladě 5, a tím kódují jejich produkty spojení.

Biologicky funkčně ekvivalentní formy cDNA AlyAFP nalezené hybridizaci

Ačkoliv je jedno provedení sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12, mělo bybýt zřejmé, že tento vynález také zahrnuje sekvence nukleotidů, které se hybridizují k sekvenci SEQ ID NO: 12 a její komplementární sekvenci a které kódují expresi peptidů, polypeptidů a proteinů vykazujících stejnou nebo podobnou antifungální aktivitu jako AlyAFP. Takové sekvence se s výhodou hybridizují k sekvenci SEQ ID NO: 12 nebo její komplementární sekvenci za podmínek mírné nebo vysoké přesnosti (Sambrook aj. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Příkladné podmínky zahrnují počáteční hybridizace v 6X SSC, 5X Denhardtově roztoku, 100 pg/ml DNA rybího spermatu, 0,1% SDS, při 55 °C po dostatečnou dobu, aby se umožnila hybridizace, s následujícím dvojnásobným promytím po 15 minutách vždy v 2X SSC, 0,1% SDS při teplotě místnosti a dvojnásobným promytím po 15 minutách vždy v 0,5-lX SSC, 0,1% SDS při 55 °C s následující autoradiografií. Molekula nukleové kyseliny je typicky schopná hybridizace, když hybridizační směs se promyje alespoň jednou 0,lX SSC SDS při 55 °C, s výhodou při 60 °C a nejlépe při 65 °C.

Tento vynález také zahrnuje sekvence nukleotidů, které se hybridizují k sekvenci cDNA SEQ ID NO: 12 za podmínek salinity a teplot ekvivalentních popsaným výše a které kódují expresi peptidu, polypeptidů a proteinu vykazujícího stejnou nebo podobnou antifungální aktivitu jako AlyAFP zde popsané.

Sekvence nukleotidů popsané výše se považují za mající biologickou funkci podstatně k sekvenci cDNA SEQ ID NO: 12 kódující AlyAFP, pokud kódují peptidy, polypeptidy a proteiny mající antifungální účinek lišící se od AlyAFP o plus/minus 25 % nebo méně.

Genomické sondy a PCR priméry

Genomické sondy

Vynález zajišťuje oligonukleotidové hybridizační sondy užitečné při screeningu genomických a jiných knihoven nukleové kyseliny pro DNA sekvence, které kódují peptidy, polypeptidy a proteiny vykazující stejnou nebo podobnou antifungální aktivitu jako AlyAFP. Takové sondy mohou mít délku od asi 16 do asi 28 nukleotidů, obecně délku asi 16 nukleotidů, typičtěji délku asi 20 nukleotidů, s výhodou délku asi 24 nukleotidů a nejlépe délku asi 28 nukleotidů. Tyto sondy se s výhodou hybridizují ke genomickým DNA a jiným DNA sekvencím, které kódují peptidy, polypeptidy a proteiny vykazující stejnou nebo podobnou antifungální aktivitu jako AlyAFP. Takové oligonukleotidové sondy lze syntetizovat automatizovanou syntézou a lze je pohodlně označit na 5’ konci s reportér molekulou, jako je radionuklid, například P nebo biotin. Knihovna se dá na desky jako kolonie nebo fág v závislosti na použitém vektoru a rekombinantní DNA se přenese na nylonové nebo nitrocelulózové membrány. Po denaturaci, neutralizaci a fixaci DNA na membránu se membrána hybridizuje se značenou sondou. Potom se membrána promyje a reportér molekula se detekuje. Kolonie nebo fág nesoucí hybridizující DNA se pak izolují a množí. Kandidátní klony nebo fragmenty amplifikované pomocí PCR lze ověřit na obsah DNA kódující AlyAFP nebo příbuzných peptidů, polypeptidů a proteinů vykazujících stejnou nebo podobnou antifungální aktivitu jako AlyAFP řadou způsobů. Kandidátní klony se například mohou hybridizovat s druhou nepřekrývající sondou nebo se podrobit sekvenční analýze DNA. Antifungální aktivita peptidu, polypeptidů nebo proteinu takto zakódovaného lze stanovit klonováním a expresí DNA ve vhodné hostitelské buňce, jako jsou kvasinky nebo E. coli, s následující izolací peptidu, polypeptidů nebo proteinu a testováním jejich antifungální aktivity způsobem popsaným v příkladě 3. Takovými technikami lze izolovat nukleové kyseliny kódující AlyAFP nebo peptidy, polypeptidy a proteiny jí biologicky funkčně ekvivalentní užitečné pro kontrolu nežádoucích plísní a pro ochranu rostlin proti plísňovým pathogenům.

PCR priméry

Biologicky funkčně ekvivalentní genomické DNA a cDNA lze izolovat z organizmů včetně vyšších rostlin s použitím degenerovaných primérů založených na sekvenci aminokyselin (EQ ID NO: 2) AlyAFP (T. Compton (1990) vlnnis aj., Eds., A Guide to Methods and • ·

Applications, Academie Press, lne, San Diego, strany 39-45). Takové degenerované oligonukleotidové priméry lze použít ve spojení s technologu PCR s použitím reverzní transkriptázy k amplifikaci biologicky funkčního ekvivalentu cDNA (E.S.Kawasaki (1990) v Innis aj., Eds., A Guide to Methods and Applications, Academie Press, lne, San Diego, strany 21-27). Tyto cDNA lze pak snadno klonovat do vhodných vektorů transformace/exprese a vložit do jednoděložných a dvouděložných rostlin. Transformované rostliny s expresí DNA v těchto vektorech lze izolovat s využitím zavedených procedur diskutovaných níže.

K přímému sereeningu genomických knihoven lze použít degenerované oligonukleotidy přímo a izolované kódující sekvence lze přenést do vektorů transformace/exprese pěstovaných rostlin.

Nebo se mohou použít degenerované oligonukleotidy jako sondy ke sereeningu cDNA knihoven z rostlin, například vektorů lamda fágu, jako je lamdaZapII (Stratagene, La Jolla, CA). Takto izolovanou cDNA lze přenést do vhodných vektorů transformace/exprese pro zavedení do jednoděložných a dvouděložných rostlin, jak se popisuje níže.

Příklad 7

DNA konstrukty pro expresi AlyAFP v transgenmch rostlinách

Jak je uvedeno výše vynález zajišťuje DNA konstrukty nebo vektory exprese, které usnadňují zde diskutovanou expresi DNA sekvencí do vyšších rostlin a různých mikroorganismů. Tak jak je zde použito výraz „konstrukt vektoru“ nebo „vektor exprese“ se týká souborů fragmentů DNA operativně spojených funkčním způsobem, tak že určují zde diskutovanou expresi DNA sekvence, jakož i jakékoliv další zajímavé sekvence nebo genů.

Exprese strukturní kódující sekvence rostliny (gen, cDNA, syntetická DNA nebo jiná DNA), která existuje ve formě dvouřetězové DNA vyžaduje transkripci mediátorové RNA (mRNA) z jednoho řetězce DNA enzymem RNA polymerázou a následující zpracování primárního mRNA transkriptu do jádra. Toto zpracování vyžaduje 3’ nepřeloženou oblast, která aduje polyadenylátové nukleotidy na 3’ konec mRNA.

Transkripce DNA do mRNA je regulována oblastí DNA, která se obvykle označuje jako „promotor“. Promotorová oblast obsahuje sekvenci baží, která signalizuje RNA polymeráze, aby se připojila k DNA a iniciovala transkripci mRNA na jednom z řetězců DNA jako matrice, za vzniku odpovídajícího řetězce RNA.

Vektory užitečné v tomto vynálezu tedy zahrnují prvky promotoru operativně, připojené ke kódující sekvenci a mohou také zahrnovat 5’ nepřeložené oblasti a jeden či více volitelných signálních znaků. Řada takových signálních znaků je v oboru dobře známá.

Promotory

Expresi DNA kódující AlyAFP v rostlinných buňkách lze regulovat přirozeně se vyskytujícím homologním promotorem nebo různými heterologními promotory. V literatuře byla popsaná řada promotorů, které jsou aktivní v rostlinných buňkách. Tyto zahrnují například promotory nopalinsyntházu (nos), mannopinsyntházu (mas) a oktopinsyntházu (ocs), které se přenáší na tumory způsobující plazmidy Agrobacterium tumefaciens, promotory 19S a 35S mozaikového viru květáku (CaMV), zesílený promotor CaMV 35S, promotor mozaikového Figwort viru (FMV) 35S, světlem buzený promotor z malé části ribulosy-l,5-bisfosfát karboxylázy (ssRUBISCO), promotor EIF-4A z tabáku (Mandel aj. (1995) Plant Mol. Biol. 29: 995-1004, promotor chitinázy z Arabinopsis (Samac aj. (1991) Plant Cell 3: 1063-1072), promotory LPT (protein přenosu lipidů) z brokolice (Pyee aj. (1995) Plant J. 7: 49-59), promotor ubichitinu z kukuřice (Christensen aj. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689) a promotor akinu z rýže (McElroy aj. (1990) Plant Cell 2: 163-171). Všechny tyto promotory se také použily k expresi různých typů DNA konstruktů, které se v rostlinách exprimovaly. Viz například v tomto ohledu PCT mezinárodní publikaci WO 84/02913.

Promotory užitečné v konstruktech dvojité šroubovnice DNA podle vynálezu lze vybrat na základě jejich schopnosti zavést specifickou expresi kódující sekvence v odpovědi na plísňovou infekci. Infekce rostlin plísňovými pathogeny spouští indukci široké řady proteinů, zvaných obranné nebo pathogen-obranné proteiny (PR) (Bowles (1990) Ann. Rev. Biochem. 59:873-907, Bol aj. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28: 113-138, Linthorst (1991) Crit. Rev. Plant Sci. 10: 123-150). Takové obranné nebo PR geny mohou kódovat enzymy fenylpropanoidového metabolismu (například fenylalanin-amoniak lyáza, chalkonsyntháza), proteiny modifikující stěny buněk rostlin (například glykoproteiny bohaté na hydroxyprolin, proteiny bohaté na glycin, peroxidázy), enzymy, které degradují stěnu houby (například chitinázy, glutanázy), proteiny podobné thamatinu nebo proteiny s dosud neznámou funkcí. Obranné nebo PR geny se izolovaly a charakterizovaly z řady druhů rostlin. Promotory těchto genů se mohou použít k expresi AlyAFP a jejich biologických funkčních ekvivalentů v transgenních rostlinách, když jsou napadeny pathogeny. Takové promotory se například odvodily od obranných nebo PR genů izolovaných z brambor (Fritzmeier aj. (1987) Plant Physiol. 85: 34-41, Cuypers aj. (1988) Mol. Plant-Microbe Interact. 1: 157-160, Longeman aj. (1989) Plant Cell 1: 151-158, Matton aj.

• · (1989) Mol. Plant-Microbe Interact. 2: 325-331, Schroder aj. (1992) Plant J. 2: 161-172). Alternativně lze použít promotory indukované pathogeny, jako je promotor PRP1, který lze získat z tabáku (Martini aj. (1993) Mol. Gen. Genet. 263:179).

Promotory užitečné v konstruktech dvojité šroubovnice DNA podle vynálezu lze vybrat na základě jejich schopnosti umožnit specifickou expresi ve tkáních, kde AlyAFP protein je nejúčinnější, jako v kvetoucích částích rostlin (Weigel (1995) Annu. Rev. Genetics 29: 19-39).

V každém případě daný promotor vybraný pro expresi AlyAFP v transgenních rostlinách by měl být schopen způsobit dostatečnou expresi tohoto polypeptidu, aby vedla k produkci antifungálně účinného množství AlyAFP v tkáních rostlin. Příklady konstitučních promotorů schopných způsobit takovou expresi jsou promotory e35S, FMV 35S, aktin z rýže, ubichitin z kukuřice a eIF-4A.

Promotory použité v DNA konstruktech podle vynálezu lze modifikovat, pokud je to žádáno, aby se ovlivnily jejich kontrolní charakteristiky. Například promotor CaMV35S lze spojit s částí genu ssRUBISCO, která potlačuje expresi ssRUBISCO při nepřítomnosti světla, aby vznikl promotor, který je aktivní v listech, ale ne v kořenech. Pro účely tohoto popisu fráze „CaMV35S“ promotor zahrnuje variace CaMV35S promotoru, například promotory získané vázáním s operátorovými oblastmi, náhodnou a kontrolovanou mutagenezí, atd.. Promotory užitečné v tomto vynálezu lze dále měnit, aby obsahovaly mnohonásobné sekvence zesilovačů transkripce podporující zvýšenou úroveň expresi genu. Příklady takových sekvencí zesilovačů transkripce byly uvedeny Kay aj. (1987) Science 236:1299.

5’ nepřeložené vedoucí sekvence

RNA produkovaná DNA konstruktem podle vynálezu by také měla obsahovat 5’ nepřeloženou vedoucí sekvenci. Tuto sekvenci lze získat z promotoru vybraného k expresi genu a lze ji specificky modifikovat, aby se zvýšila translace mRNA. 5’ nepřeložené oblasti lze také získat z virových RNA, z vhodných eukaryotních genů, nebo ze syntetických sekvencí genu. Vynález není omezen na konstrukty, kde je nepřeložená oblast odvozena z 5’ nepřeložené oblasti, která provází sekvenci promotoru. Nepřeloženou vedoucí sekvenci lze spíše odvodit z nepříbuzného promotoru nebo kódující sekvence. Například protein tepelného šoku 70 (Hsp70) petúnií, který obsahuje takovou vedoucí oblast (Winter (1988) Mol. Gen. Genet. 221: 315-319).

3’ nepřeložené oblasti

Jak jeuvedeno výše, 3’ nepřeložená oblast chimémích konstruktů podle vynálezu by měla obsahovat terminátor transkripce nebo prvek s ekvivalentní funkcí a polyadenylační signál, jehož funkcí v rostlinách je působit adici adenylových nukleotidů na 3’ konec mRNA. Příklady takových 3’ oblastí zahrnují 3’ přepsané nepřeložené oblasti obsahující polyadenylační signál genů tumory působících plazmidů (Ti) z Agrobacterium, jako je gen nopalinsyntházy (nos), a rostlinné geny, jako jsou geny zásobních proteinů sóji a fazolový ssRUBISCO E9 gen (Fischhoff aj. Evropská patentová přihláška 0 385 962).

Všechny předešlé prvky se mohou spojit za vzniku rekombinantní molekuly dvouřetězové DNA operativně spojené ve směru 5’ke 3’:

a) promotor, který vyvolává v rostlinné buňce produkci RNA sekvence,

b) DNA strukturní kódující sekvenci, která kóduje AlyAFP a

c) 3’ nepřeloženou oblast, která působí v rostlinných buňkách terminaci transkripce a přípojem polyadenylátových nukleotidů k 3’ konci uvedené RNA sekvence.

AlyAFP kódující sekvence může obsahovat celou sekvenci nukleotidů ukázanou v SEQ ID NO: 12, nebo může obsahovat nukleotidy 116 až 269 sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12. V prvém případě se AlyAFP transportuje do mezibuněčného prostoru, v druhém případě se bude akumulovat uvnitř buněk rostlin.

Přiklad 8

Produkce transgenních rostlin brambor exprimujících AlyAFP a výsledek testů s chorobou vadnutí Verticillium

Výzkum zde popsaný určil cDNA a jiné nukleové kyseliny, které jsou schopné dodat rostlinám rezistenci proti plísňovým pathogenům.

Zemědělské, zahradnické, okrasné a jiné ekonomicky nebo komerčně užitečné rostliny lze učinit rezistentní proti plísňovým pathogenům, když se do nich zavedou tyto DNA operativně spojené funkčním způsobem, aby se exprimovaly na úrovni schopné dodat těmto rostlinám rezistenci proti plísňovým pathogenům.

Transgenní rostliny, které exprimují protiplísňově účinné množství AlyAFP a jejích biologicky funkčních ekvivalentů mohou být produkovány:

a) transformací rostlinné buňky rekombinantní molekulou DNA obsahující operativně spojené v sekvenci ve směru od 5’ k 3’:

• ·

i) promotorovou oblast, která řídí transkripci genu v rostlině, ii) DNA kódující sekvenci, která kóduje DNA sekvenci, která kóduje AlyAFP nebo její biologicky funkční ekvivalenty mající stejnou nebo podobnou antifungální aktivitu jako AlyAFP a iii) 3’ nepřeloženou oblast, která kóduje signál polyadenylace, který způsobí v rostlinných buňkách terminaci transkripce a přípojem polyadenylových nukleotidů k 3’ konci uvedené RNA sekvence,

b) výběrem rostlinných buněk, které se mají transformovat,

c) regenerací rostlinných buněk, které se transformovaly k produkci diferenciovaných rostlin a

d) výběrem transformovaných rostlin, jejichž buňky exprimují uvedenou kódující DNA sekvenci a produkují účinné množství AlyAFP nebo jejich uvedených biologicky funkčních ekvivalentů.

Alyssum, ze kterého se AlyAFP původně izolovala, je dvouděložná rostlina. Jak diskutovali Campbell aj. (1990) Plant Physiol. 92: 1-11, zatímco existuje jasný rozdíl ve využití kodonů mezi jednoděložnými a dvouděložnými, je známo, že jednoděložné exprimují geny podobné těm, které se nalézají v dvouděložných. Na základě tohoto pozorování se zdá, že využití kodonů ve dvouděložných by nepředstavovalo větší překážku exprese dvouděložných genů v jednoděložných. V každém případě odborníci jsou seznámeni s principy řízené adaptace využití kodonů vyhovující hostitelské rostlině (viz Murray aj. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498) a exprese DNA konstruktů je nyní v oboru novou rutinou.

Souhrn literatury uvádějící produkce transgenních jednoděložných a dvouděložných rostlin je následující.

Transformace jednoděložných

Způsoby produkce transgenních rostlin mezi jednoděložnými jsou nyní dostupné. Úspěšné transformace a regenerace rostlin se dosáhly u chřestu (Asparagus officinalis, Bytebier aj. (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84:5345), ječmene (Hordeum vulgare, Wan a Lemaux, (1994) Plant Physiol. 104:37), kukuřice (Zea mays, Rhodes aj. (1988) Science 240:204, Gordon-Kamm aj. (1990) Plant Cell 2:603, Fromm aj. (1990) Bio/Technology 8:833, Koziel aj. (1993) Bio/Technology 11:194), ovsa (Avena sativa, Sommers aj. (1990) Bio/Technology 10:1589), sadové trávy (Dactylis glomerata, Hom aj. (1988) Plant Cell Rep. 7:469, rýže (Oryza sativa, • · · · · · • ·

včetně variant indické a japonské, Toriyama aj. (1988) Bio/Technology 6:10, Zhang aj. (1988) Plant Cell Rep. 7:379, Luo a Wu (1988) Plant Mol. BioL Rep. 6:165, Zhang a Wu (1988) Theor. Appl. Genet. 76:835, Christou aj. (1990) Bio/Technology 9:657, žita (Secale cereale, De la Pěna aj. (1987) Nátuře 325: 274), čirok (Sorghum bicolor, Cassas aj. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90: 11212, cukrové třtiny (Saccharum spp., Bower a Birch, (1992) Plant J. 2:409, kostřavy (Festuca arundinacea, Wang aj. (1992) Bio/Technology 10:691, trávníkové trávy (Agrostis palustris, Zhang aj. (1993) Plant Cell Rep. 13:1, pšenice (Triticum aestvum, Vasil aj. (1992) Bio/Technology 10:667, Troy Weeks aj. (1993) Plant Physiol. 102:1077, Becker aj., (1994) Plant J. 5:299).

DNA kódující AlyAFP nebo její biologicky funkční ekvivalenty zde diskutované lze zavést do kterékoliv z těchto rostlin, aby produkovaly transgenní rostliny exprimující antifungální účinné množství AlyAFP.

Transformace dvouděložných

Způsoby transformace velké řady různých dvouděložných a získání transgenních rostlin jsou dobře v literatuře dokumentované (viz Gasser a Fraley (1989) Science 244:1293, Fisk a Dandekar (1993) Scientia Horticulturae 55: 5-36, Christou (1994) Agro Food Industry HI Tech. (březen/duben 1994) strana 17 a odkazy tam citované).

DNA kódující AlyAFP nebo jejich biologicky funkční ekvivalenty zde diskutované lze zavést do kterékoliv z těchto rostlin za účelem produkce transgenních rostlin exprimujících antifungálně účinné množství AlyAFP.

Jako neomezující příklady cDNA kódující AlyAFP se exprimovala v rostlinách brambor, dodávajíc jim resistenci proti plísním, jak je podrobně popsáno níže.

Plazmidy pro transformaci brambor

Fragment 290 bp Bam Hl/Eco RI kódující AlyAFP se klonoval z plazmidů pMON22652 (obr. 4) do předem konstruovaného kazetového vektoru E. coli pMON22575 (obr. 5), kde nahrazuje gen p46. Vzniklý plazmid, označený jako pMON22655 (obr. 6) se štěpil sNot I, aby se izoloval Not I fragment obsahující polypeptid kódující cDNA. Tento Not I fragment se pak vložil do Not I místa pMON17227 (obr. 7), vektoru transformace rostliny s dvojím okrajem. Tento Not I fragment se pak označil jako pMON22657 (obr. 8) a obsahuje následující fragmenty DNA: bakteriální gen odolnosti spectinomycinu / streptomycinu (Spc/Str) (Fling aj. (1985) Nucleic Acids Research 13:7095-7106), potom pravý okraj T-DNA. U pravého okraje je

syntetický gen bakteriální odolnosti glyfosátu CP4, gen syntházy 5-enolpyruvyl-3-fosfošikimátu (EPSPS) zavedený FMV promotorem (viz PCT publikaci WO 92/04449). CP4 gen dodává transformantům odolnost proti glyfosátu a tím schopnost využít glyfosát jako prostředek výběru transformantů. Tranzitní peptid chloroplastu z Arabinopsis 5-enolpyruvyl-3fosfošikimátsyntházy (EPSPS) se spojil kCP4 genu, aby zacílil CP4-EPSPS protein do chloroplastů. U konce 3’ CP4 genu je E9 3’ konec, který zajišťuje místo transkripční terminace a polyadenylátovou signální sekvenci. Další chimémí segment se skládá z FMV promotoru, cBNA antofungálního polypeptidů a konce 3’ nos. Pak následuje levý okraj T-DNA a počátek replikace (ori-322) (Stalker aj. (1981) Mol. Gen. Genet. 181:8-12).

Pro účely porovnání antifungální aktivity AlyAFP s Rs-AFPl a Rs-AFP2, Rs-AFPl a RsAFP2 se syntetické DNA také transformovaly do rostlin brambor. Syntetická DNA Rs-AFPl a Rs-AFP2 se chemicky syntetizovala Midland Certified (Midland, TX ) jako fragmenty 273 bp Bam HI/Eco RI (SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 17) a nejprve se klonovaly do předem konstruovaného kazetového vektoru E. coli pMON22575 (obr. 5), nahrazujíc tam gen p46. Not I fragmenty obsahující DNA Rs-AFPl a Rs-AFP2 se nezávisle klonovaly do vektoru transformace rostliny pMON17227 (obr. 7) stejným postupem použitým pro klonování cDNA pro AlyAFP. Vzniklé plazmidy se označily pMON22634 (Rs-AFPl) (obr. 9) a pMON22635 (Rs-AFP2) (obr. 10).

Postup triparentálního spojení

Před transformací se E. coli, každá obsahující pMON22657, pMON2264 a pMON22635 spojily s Agrobacterium ABI postupem triparentálního spojení s£. Coli se zakotveným pomocným plazmidem pRK2013 (Ditta aj. (1980) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 77:7347). ABI je A208 kmen Agrobacterium tumefaciens nesoucí odzbrojený pTiC58 plazmid pMP90RK (Koncz aj. (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396). Odzbrojený Ti plasmid zajišťuje funkce genu trfA, které jsou potřeba pro autonomní replikaci pMON vektorů po konjugaci s ABI kmenem. Když se rostlinná tkáň inkubuje s AB::pMON konjugáty, vektory se přenesou do rostlinných buněk pomocí funkcí viru, které jsou kódovány odzbrojeným plazmidem pMP90RK Ti.

Agrobacterium se pěstovaly 30 hodin při 30 °C v LB mediu (lOg tryptonu, 5 g extraktu z kvasnic a 5 g NaCl na litr) obsahujícím 25 pg/ml chloramfenicolu a 50 mg/ml kanamycinu. E. coli obsahující pMON22657, pMON22634 a pMON22635 se pěstovaly přes noc v LB mediu obsahujícím 75 pg/ml spektomycinu. Když všechny kultury vyrostly, 4 ml LB media se přidalo do zkumavky obsahujícím po 100 μΐ Agrobacterium ABI, E. coli/ pRK2013 a E. coli/ pMON.

• · ·*·· • ·· ·· ·· «·» · · ·· · • · · · ·· • ···»·· · . · ·· ··· «··· ·· ······· ·· ··

Tato směs se odstřeďovala v mikroodstředivce 1 minutu a frakce matečného louhu se dekantovala. Frakce peletu se znovu rozsuspendovala ve zbývající kapalině (asi 100 μΐ) a alikvotní podíl (asi 25 μΐ) se pipeto val do středu LB agarové (1,5%) desky. Po růstu přes noc při 30 °C se alikvotní podíl buněk z této desky nanesl LB agarovou desku obohacenou 75 pg/ml spektomycinu, 50 pg/ml kanamycinu a 25 pg/ml chloramfenikolu.

Po 24 až 48 hodinách při 30 °C byly kolonie přítomné na desce potřené buňkami vzniklými z triparentálního spojení E. coli obsahující plazmid pMON, E. coli obsahující pRK2013 a Agrobacterium ABI, zatímco nebyly žádné kolonie přítomné na kontrolní desce potřené buňkami vzniklými ze spojení E. coli obsahujícími pMON a ABI (bez E. coli obsahující pRK2013, což je potřeba pro mobilizaci plazmidu). Po triparentálním spojem se vybraly 4 kolonie z předešlé desky a každá se odděleně očkovala do kapalné LB kultuře obohacené 75 pg/ml spektomycinu, 50 pg/ml kanamycinu a 25 pg/ml chloramfenikolu a pěstovaly se při 30 °C. Přítomnost DNA kódující různé antifungální polypeptidy se potvrdila restrikčni analýzou DNA plazmidu izolovaného z buněk Agrobacterium. Kultury obsahující DNA kódující AlyAFP, Rs-AFPl a Rs-AFP2 se použily individuálně k transformaci rostlin brambor.

Transformace rostlin brambor

Agrobacterium obsahující pMON22657, pMON2264 a pMON22635 se pěstovalo přes noc v 2 ml LB media obsahujícího 75 pg/ml spektomycinu, 25 pg/ml chloramfenikolu a 50 pg/ml kanamycinu, pH 7,0. Příští den se bakterie zředily 1:10 sMSO mediem obsahujícím 4,4 g MS solí (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 30 g sacharozy a 2 ml vitaminu B5 (Sigma katalog číslo G 1019) v objemu 1 1), pH 5,7, nebo dokud se nedosáhlo odečtení optické hustoty 0,2 0,33 při 600 nm.

Stvoly rostlin brambor (Solanum Tuberosum var. Russet Burbank) se vypěstovaly z odřezků stvolů obsahujících očka za sterilních podmínek včetně teploty 19 C a cyklu 16 hodin světla / 8 hodin tmy a intenzity světla 100 μΕ/sek/m² po tři týdny na PM mediu obsahujícím 4,4 g MS solí (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 30 g sacharozy, 0,17 g NaH₂PO₄ .H₂O, 0,4 mg thiamin-HCl, 25 g kyseliny askorbové a 0,1 g inositolu na litr, pH 6,0 a 0,2% Geldrit agaru. Stvoly se rozřezaly na 3 až 6mm segmenty.

segmentů stvolů se před očkováním daly na misku pro společné kultury, aby sloužily jako neočkované kontroly. Desky pro kultury obsahovaly 0,9% 1/10 MS solí zpevněných agarem (Murashige aj. (1962) Physiol. Plant. 15:473) a 3 % sacharozy, a připravily se nejprve pokrytím agaru 2 ml suspenze buněk tabáku starou 6 až 7 dní jako živnou vrstvou (Fraley aj. (1983) Proč.

• ·

Nati. Acad.Sci. USA 80:4803), a pak překrytím těchto buněk s 8,5 cm kotoučem sterilního filtračního papíru Whatman.

Segmenty z rostlin, které se měly transformovat, se očkovaly vlitím zředěné bakteriální suspenze na kousky lodyh a ponecháním směsi se po 15 minut inkubovat. Bakteriální suspenze se pak ze segmentů rostlin odsála a explantáty se pak rovnoměrně rozprostřely na misky pro společnou kulturu (asi 90 kousků lodyh namisku). Po 2 dnech při 19 °C a cyklu 16 hodin světla / 8 hodin tmy a intenzitě světla 100 μΕ/sek/m² se explantáty daly na 0,9% medium indukující kalus obsahující IX MS soli, 5,0 mg/1 zeatin ribosidu, 10 mg/1 AgNO₃, 3 % sacharozy, 500 mg/1 karbenicillinu a 0,1 mg/1 naftalenoctové kyseliny a inkubovaly se při 19 °C a cyklu 16 hodin světla / 8 hodin tmy po 2 dny. Explantáty se pak přenesly pro selekci na medium indukující kalus obohacené 0,025 mM glyfosátu. Po 4 týdnech se explantáty daly na 0,9% indukční medium zpevněné agarem obsahující IX MS soli, 5,0 mg/1 zeatin ribosidu, 10 mg/1 AgNO₃, 3 % sacharozy, 500 mg/1 karbenicillinu, 0,3 mg/1 GA3 a 0,025 mM glyfosátu. Výhonky se začaly objevovat po 8 týdnech. Explantáty se přenášely na čerstvá media indukující výhonky každé 4 týdny po období 12 týdnů. Výhonky se z kalusů odstřihly a daly se na PM medium zpevněného 0,2% Geldrit agarem asi na 2 týdny, nebo pokud si nevyvinuly kořeny a nebyly dost velké, aby se daly do hlíny. Jednou transplantované sazenice do Metro-Mix 350 (Humbert Seeds Co., St. Louis) se pěstovaly ve skleníku po 2 až 3 měsíce při režimu 14 hodin světla / 8 hodin tmy a intenzity světla 600-700 μΕ/sek/m² a denní teplotě 18-24°C, noční teplotě 13-18 °C a relativní vlhkosti 60 %.

Analýza exprese antifungálního polypeptidů v transgenních rostlinách brambor

Z transgenních rostlin vyrostlých na výšku 2,5 až 5 cm se vzaly vzorky listů (20 až 100 mg). Vzorky listů rozdrtily v PBST ústoji (15 μΐ/ml tkáně) obsahujícím 1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KC1, pH 7,4 a 0,05 % Tween-20, a nechaly se stát při 4 °C přes noc. Po odstředění se 100 μΐ matečného louhu použilo v testu ELISA. Polyklonální protilátky proti Rs-AFPl polypeptidů (SEQ ID NO: 18) se připravily vPocono Rabbit Farm (Pocono, Pa). Jamky ve Nunc Maxi-sop desky s 96 jamkami (Nunc číslo 4-39454) se pokryly protilátkami proti Rs-AFPl polypeptidů přidáním 100 μΐ protilátek (1 mg IgG/ml) zředěné 1:200 v pokrývačům ústoji obsahujícím 1,59 g Na₃CO₃ a 2,93 g NaHCO₃ na litr destilované vody, pH 9,6, a inkubovaly se při 4 °C přes noc. Pokrývači roztok se pak z jamek odstranil a ty se promyly třikrát s PBST. Do jamek se přidalo 100 μΐ supematantu z listí nebo vhodně zředěné standardy polypeptidů v PBST obohaceným 0,2% (hmotnost/objem) BSA frakcí V (Sigma, St. Louis). Koncentrace každého polypeptidů v extraktech z transgenních rostlin se stanovila ze ······ 9 ·· · · ·· « · · 9··· 9999

-- 9 9 9 · · · ·· ♦····· ··· · ·

999 99 999

9999 99 999 9999 99 99 standardních křivek konstruovaných pomocí měnících se množství daného čištěného polypeptidu. AlyAFP, Rs-AFPl a Rs-AFP2 křížově reagovaly s preparáty polyklonálních protilátek. Po inkubaci při 4 °C přes noc se roztoky z jamek odstranily a jamky se promyly třikrát s PBST. Do každé jamky se přidalo 100 μΐ konjugátu Rs-AFPl protilátek/ alkalická fosfatáza (0,5 mg/ml zředěné 1:1000 v PBST, připraveného podle Boorsma aj. ((1975) J. Histochem. Cytochem. 23: 200-207). Desky se inkubovaly při 22 °C 4 hodiny a jamky se promyly pětkrát sPBST. Do každé jamky se přidalo 100 μΐ čerstvě připraveného roztoku pnitrofenylfosfátu (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), rozpuštěného v 200 mM Tris ústoje, pH 9, a desky se inkubovaly při 22 °C 1 hodinu. Optická hustota při 405 nm se stanovila pomocí odčítače mikrodesek (Molecular Devices, Menlo Park, CA) ze standardních křivek. Rostliny exprimující různé úrovně antifungálního polypeptidu se použily v následujících testech chorob.

Kontrola choroby vadnutí Verticillium

Konidia a mycelia 2 až 3 týdny staré kultury virulentní Verticillium dahliae se použily k očkování PDA (brambory, 200 g/1, Bacro dextrózy 20 g/1 a Bacro agaru 15 g/1) Petriho misky. Tato kultura se nechala růst při 22 °C 4 až 5 dní. Konidia se potom sklidila promytím kultivační desky se sterilní destilovanou vodou a filtrací kapaliny dvěma vrstvami hladké režné bavlněné tkaniny. Koncentrace spor konidií se stanovila s použitím hematocytometru a nastavil se na 1 x 10 konidií se sterilní destilovanou vodou.

Transgenní a netransgenní rostliny brambor se pěstovaly z kousků stvolů, jak je popsané výše, v plastikových květináčích obsahujících 50 ml agarového media. Když byly rostliny vysoké asi 2,5 až 5 cm, vzaly se z media a jejich kořeny se namočily do suspenze spor (Joaquim aj. (1991) Phytopathology 81:552-558). Naočkované rostliny se přesadily do 15 cm květináčů obsahujících Metro-Mix 350. Po přesazení každá rostlina dostala dalších 5 ml suspenze spor na povrch zeminy okolo základny stvolu. Hrnky se daly do růstové komory za následujících podmínek: teplota 20 °C, intenzita světla 320 pEinstein/sek/m², 12 hodinový denní cyklus/ 12 hodinový noční cyklus, spodní zavlažování vodou dvakrát denně, vždy 20 minut nasávám. Čtyři týdny po očkování se rostliny hodnotily na závažnost choroby na stupnici 0-100 % (Horsfall aj. (1945) Phytopathology 35:655, aby se získala křivka postupu choroby v čase, rostliny se hodnotily jedenkrát týdně alespoň 8 týdnů.

Výsledky testů jsou uvedeny níže.

Odolnost proti chorobě vadnutí Verticillium v rostlinách brambor exprimujících AlyAFP

9 » · ·

I · « • · · · • ·

9 «

Deset nezávislých linií rostlin brambor exprimujících AlyAFP se testovalo na odolnost proti chorobě vadnutí Verticillium. Mezi těmito liniemi 5 exprimovalo AlyAFP velmi silně, obsahovaly od 5,2 do 14,9 pg AlyAFP/ g čerstvých tkání listů, 3 exprimovaly AlyAFP středně, obsahovaly 2,6 pg AlyAFP/ g čerstvých tkání Uštů a 2 exprimovaly AlyAFP nízko, obsahovaly od 0,9 do 1,1 pg AlyAFP/ g čerstvých tkám listů (Tabulka 3). Hladina exprese v listech je indikátorem exprese v celé rostlině, poněvadž promotor FMV, použitý křížení exprese odpovídajících kódujících DNA, řídí expresi genu konstitutivně ve všech typech tkání rostlin brambor. V tomto testu se zahrnuly také 3 nezávislé transgenní linie jako negativní kontroly. Ty se generovaly z transformací užívajících Agrobacterium kotvící plazmid pMON17227 (vektorová kontrola, obr. 7), který neobsahuje žádnou DNA kódující antifungální polypeptid. Jiné kontroly v tomto testu zahrnuté byly netransgenní brambora Russet Burbank, která se použila jako hostitel pro transformační pokusy, netransgenní odrůda brambor Russet Ranger, která je odolnější proti Verticillium než Russet Burbank, a netransgenní odrůda brambor Norchip, která je náchylnější k vadnutí Verticillium než Russet Burbank.

Tabulka 3 shrnuje hladinu exprese proteinu ve všech liniích a hodnocení závažnosti choroby každé jednotlivé linie 44 dní po očkování. Hodnocení závažnosti choroby byl průměr ze tří opakování. Pro lepší názornost jsou stejné údaje také uvedeny do sloupcového grafu na obr. 11. Pořadí všech odrůd brambor v tabulce 3 (od shora dolů) a na obr. 11 (od leva do prava) je stejné.

Tabulka 3

Exprese AlyAFP a odolnost proti chorobě vadnutí Verticillium v transgenních rostlinách brambor

Rostliny Linie č. Exprese proteinu Závažnost choroby (%) Průměr (pg AFP/g tkáně) (44 dní po očkování)

AlyAFP	17575	14,9	7,5	+
rostliny	17578	12,7	15	+
	17581	9,2	24,3	+
	17587	9,6	6,3	+
	17595	5,2	21	+
	17618	2,6	16,3	+

• · • · « · • ft • · · · > ftft 4 » · · · • · · · I • · I • · ««

	17593	2,6	17,3	+
	17592	2,6	11,8	+
	17589	1,1	43,8
	17580	0,9	33,3	14,9
Vektorová	17227-1	0	31,3	+
kontrola	17227-2	0	45	+
	17227-3	0	41,3	+

Netransgenní
Russet Burbank	0	16,7
Netransgenní Russet Ranger	0	13,3
Netransgenní Norchip	0	75

39,2

Jak je ukázáno v tabulce 3 a obr. 11, závažnost choroby u rostlin exprimujících AlyAFP silně a středně, byla v průměru o 62 % menší než u vektorové kontroly. To se vypočetlo následovně: ((průměr 3 vektorových kontrolních liniích) - (průměr 8 linií silných a středních expresorů))x 100 %/(průměr 3 vektorových kontrolních liniích). Nejlepší ze silně exprimujících linií, například linie 17575 a linie 17587, vykazovaly závažnost choroby o 82 % menší než u vektorové kontroly. Slabě exprimující linie nevykazovaly žádnou významnou hladinu odolnosti k chorobě ve srovnání s vektorovými kontrolami. V tabulce 3 „+“ označuje linie, které byly zahrnuty do předcházejícího výpočtu průměru závažnost choroby.

Tyto výsledky ukazují, že rostliny brambor, exprimující AlyAFP při a více než 2,6 pg AlyAFP/ g čerstvých tkání listů, vykazují odolnost proti chorobě vadnutí Verticillium. Úroveň odolnosti proti chorobě koreluje s hladinou exprese AlyAFP. Tyto výsledky také ukazují, že hladina exprese AlyAFP potřebná k významné odolnosti je blízká k hodnotě IC₅o stanovené v in vitro antifungálních testů ukázaných v příkladě 3. Ačkoliv netransgenní rostliny Russet Burbank vykazovaly relativně nízké hodnocení závažnosti choroby, rostliny byly silně zakrslé ve srovnání s rostlinami Russet Ranger. Tento zakrslý fenotyp se nezapočítal do hodnocení závažnosti choroby.

Odolnost proti chorobě vadnutí Verticillium v rostlinách brambor exprimijících Rs-AFPl a Rs-AFP2

Transgenní rostliny brambor exprimující Rs-AFPl a Rs-AFP2 se testovaly na odolnost proti chorobě vadnutí Verticillium. 5 nezávislých linií rostlin exprimující Rs-AFPl obsahujících od 5,2 do 26 pg Rs-AFPl/ g čerstvých tkání listů a 5 nezávislých linií rostlin exprimující RsAFP2 obsahujících od 10,8 do 25,2 pg Rs-AFP2/g čerstvých tkání Uštů se testovalo v tomto pokusu, jehož výsledky jsou ukázány v tabulce 4. Použily se stejné kontroly jako se použily v případě rostlin exprimujících AlyAFP.

V tomto testu se symptomy choroby objevily u experimentálních a kontrolních rostlin 49 dní po očkování. Postup choroby se hodnotil 49, 58 a 64 dní po očkování. Nepozoroval se žádný rozdíl mezi liniemi exprimujícími Rs-AFPl a Rs-AFP2 a kontrolními liniemi. Hodnocení závažnosti choroby byl průměr ze tří opakování. Tabulka 4 shrnuje expresi proteinu v každé z těchto linií a hodnocení závažnosti choroby 58 dní po očkování. Pro názornost jsou stejné údaje také znázorněny ve sloupcovém grafu na obr. 12. Pořadí všech odrůd brambor v tabulce 4 (od shora dolů) a na obr. 12 (od leva do prava) je stejné.

Tabulka 4

Exprese Rs-AFPl a Rs-AFP2 a odolnost proti chorobě vadnutí Verticillium v transgenních rostlinách brambor

Rostliny Linie č. Exprese Závažnost choroby (%) Průměr proteinu (58 dní po očko vám) (pg AFP/g tkáně)

Rs-AFPl	15124	26	56,3	+
Rostliny	15143	18,3	78,8	+
	15117	9,7	47,5	+
	15120	8,0	50,0	+
	15154	5,2	66,3	+
				59,8
Rs-AFP2	13501	25,2	76,3	+

• · · · • · · · · · • « · · · • · · · · ···· · * ·······

rostliny	13503	25,1	53,8	+
	13532	17,5	35,0	+
	13531	16,2	72,5	+
	13500	10,8	82,5	+
				64,0
Vektorová	17227-1	0	56,3	+
kontrola	17227-5	0	63,8	+
				60,0
Netransgenm
Russet Burbank		0	85
Netransgenm
Russet Ranger		0	16,3
Netransgenm Norchip		0	82,5

Jak je ukázáno v tabulce 4 a obr. 12, průměrná závažnost choroby u rostlin silně exprimujících Rs-AFPl a Rs-AFP2 byla 59,8 a 64,0. To bylo podstatně stejné jako u vektorové kontroly (60,0 %). V Tabulce 4 „+“ označuje linie, které byly zahrnuty do kalkulace průměru závažnost choroby.

V souhrnu výsledky testů choroby získané s transgenními rostlinami brambor , které exprimují AlyAFP, Rs-AFPl a Rs-AFP2, demonstrují, že AlyAFP poskytuje rostlinám brambor odolnost proti vadnutí Verticillium při hladině exprese tak nízké jak je 2,6 pg / g čerstvých tkání listů, zatímco Rs-AFPl a Rs-AFP2 nezajišťují žádnou významnou hladinu odolnosti proti vadnutí Verticillium při hladině exprese tak vysoké jako je 25 pg / g čerstvých tkání listů. Tyto výsledky ukazují, že hladiny IC50 pro AlyAFP stanovené v příkladě 3 jsou spolehlivým ukazatelem užitečnosti tohoto proteinu při kontrole poškození působeného nežádoucími plísněmi a při genetickém inženýrství odolnosti rostlin proti chorobám.

Je zřejmé, že vynález takto popsaný lze měnit mnoha způsoby. Takové variace nemají být odklonem od vynálezu a všechny modifikace, které budou zřejmé odborníkům, se zamýšlí, aby byly v rozsahu následujících nároků.

• · · · • ·

Seznam řetězců (1) Všeobecné informace (i) Vynálezci: Liang, Jihong Shah, Dilip M.

Wu, Yonnie S.

Rosenberger, Cindy A.

(ii) Název vynálezu: Antifungální polypeptid a způsoby regulace rostlinných pathogenních plísní (iii) Počet řetězců: 19 (2) Informace o řetězci SEQ ID NO: 1 Charakteristika řetězce:

1) A) Délka: 49 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Vinutí:

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: peptid xi) popis řetězce : SEQ ID NO: 1

Arg Leu Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Xaa Ser Gly Val Cys Gly Asn 15 10 15

Asn Asn Ala Cys Arg Asn Gin Cys Arg Asn Leu Glu Arg Ala Glu His

25 30

Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Xaa Xaa Xaa Tyr Phe

40 45

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 2

i) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 50 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Vinutí:

D) Topologie: lineární • « • · · · ii) Typ molekuly: peptid xi) Popis řetězce : SEQ ID NO:2

Arg Leu Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn ¹ 5 10 15

Asn Asn Ala Cys Arg Asn Gin Cys Arg Asn Leu Glu Arg Ala Glu His

25 30

Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro

40 45

Cys 50

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 4

i) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 35 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) vinutí: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina

B) Popis: /desc = „syntetická DNA“ ix) Rys:

A) Jméno/klíč: modifikovaná báze

B) Lokace: 18

D) Jiná informace: /mod_base= i ix) Rys:

A) Jméno/klíč: modifikovaná báze

B) Lokace: 21

D) Jiná informace: /mod_base= i xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 3

GGGAATTCGG ATCC ACANGG NAARTARCAD ATRCA ······ · ·· ·· ·· • · · · · · ♦ ···· ·· ······

9 9 9 9999999

9 9 9 9 9 9 9

9999 99 999 9999 99 99

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 4

i) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 30 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina

A) Popis: /desc = „syntetická DNA“ ix) Rys:

A) Jméno/klíč: modifikovaná báze

B) Lokace 18

D) Jiná informace: /mod_base= i ix) Rys:

A) Jméno/klíč: modifikovaná báze

B) Lokace 19

D) Jiná informace: /mod_base= i ix) Rys:

A) Jméno/klíč: modifikovaná báze

B) Lokace 23

D) Jiná informace: /mod_base= i ix) Rys:

A) Jméno/klíč: modifikovaná báze

B) Lokace 24

D) Jiná informace: /mod_base= i ix) Rys:

A) Jméno/klíč: modifikovaná báze

B) Lokace 28

D) Jiná informace: /mod_base= i ix) Rys:

A) Jméno/klíč: modifikovaná báze

B) Lokace 29

• 9 9 9

9 9 9

D) Jiná informace: /mod_base= i xi) (xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 4 : GGGAATTCGG ATCCGGGNNG GGNNGGGNNG

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 5

1) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 308 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduchá

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 5

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 6

GGGGGGGGGG	GGGGGGCACA	CNTCCCCTAC	ACATAGATAT	ACATACAAAA	TCACAGAAAG	60
TAATAGATAT	GGCTAAGTGT	gcttccatca	TCTCCCTTGT	CTCTCCTGCT	CTTGTTCTCT	120
TTGCTGCTTT	TGAAGCACCA	GCAATGGTGG	AGTCACGGAA	GTTGTGCGAG	AGTCCAAGTG	180
GAACATGGTC	AGGCGTGTGT	GGAAACAACA	ATGCTTGCAA	GAATCAGTGC	ATTAACCTTG	240
AAGGAGCNCG	ACATGGATCT	TGCAACTATG	TCTTCCCAGC	TCACAAGTGC	ATATGCTACT	300

TCCCCTGT 308

i) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 34 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduchá

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina a) Popis: /desc = „syntetická DNA“ ix) Rys:

A) Jméno/klíč: modifikovaná báze

B) Lokace 23

D) Jiná informace: /mod_base= i xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 6

GGGAATTCGG ATCCGTNTGY GGNAAYAAYA AYGC 34

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 7

1) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 32 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduchá

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina a) Popis: /desc = „syntetická DNA“ xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 7

GGGAATTCGG ATCCTTTTTT TTTTTTTTTT TT 32

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 8

1) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 306 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduchá

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 8

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 9

GTGTGTGGGA ATAATAACGC ATGCAGGAAC CAATGCAGAA ACCTTGAAAG AGCAGAACAC 60

GGATCTTGCA ACTATGTCTT CCCAGCTCAC AAATGTATTT GTTACTTCCC ATGTTAATCT

120

ACCAAATCAC	TTTTTGTGCT	TGTGTGTGTA	TTTTACATGT	TATGTGTTTA	TTTACATGAA	180
ATAAGTCTGT	GTCATCCTTA	TGGGTGACCT	TATGACATGT	ACCAGATATA	TCATATATGT	240
ATGTTGGTTT	GTTGTGTGGC	AATTATAAAC	TTTTATTTGT	GGATGCAAAA	AAAAAAAAAA	300
AAAAAA						306 -

1) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 500 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduchá

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 9

GGGGGGGGGG GGGGGGCACA CNTCCCCTAC ACATAGATAT ACATACAAAA 50

TCACAGAAAG TAATAGATAT GGCTAAGTGT GCTTCCATCA TCTCCCTTGT 100

CTCTGCTGCT CTTGTTCTCT TTGCTGCTTT TGAAGCACCA GCAATGGTGG 150

AGTCACGGAA GTTGTGCGAG AGTCCAAGTG GAACATGGTC AGGCGTGTGT 200

GGGAATAATA ACGCATGCAG GAACCAATGC AGAAACCTTG AAAGAGCAGA 250

ACACGGATCT TGCAACTATG TCTTCCCAGC TCACAAATGT ATTTGTTACT 300

TCCCATGTTA ATCTACCAAA TCACTTTTTG TGCTTGTGTG TGTATTTTAC 350

ATGTTATGTG TTTATTTACA TGAAATAAGT CTGTGTCATC CTTATGGGTG 400

ACCTTATGAC ATGTACCAGA TATATCATAT ATGTATGTTG GTTTGTTGTG 450

TGGCAATTAT AAACTTTTAT TTGTGGATGC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 500

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 10

i) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 38 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduchá

D) Topologie: lineární • · ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina a) Popis: /desc = „syntetická DNA“ xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 10

GGGAATTCGG ATCCAAS AAA GTAATAGWTA TGGCTAAG 3 8

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 11

1) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 40 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduchá

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina

a) Popis: /desc = „syntetická DNA“ xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 11

GGGAATTCGG ATCCTTATTA ACATGGGAAG TAACAAATAC 40

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 12

i)Charakteristika řetězce:

A) Délka: 286 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 12

GGGAATTCGG	ATCCAAGAAA	GTAATAGATA	TGGCTAAGTT	TGCTACCATC	ATCTCTCTTC	60
TCTTTGCTGC	TCTTGTTCTC	TTTGCTGCCT	TTGAAGCACC	AACAATGGTG	GATGCAAGGT	120
TGTGCGACAG	ACCAAGTGGG	ACATGGTCAG	GAGTTTGTGG	GAACAACAAT	GCATGCAGGA	180
ACCAATGCAG	AAACCTTGAA	AGAGCAGAAC	ACGGATCTTG	CAACTATGTC	TTCCCAGCTC	240

ACAAATGTAT TTGTTACTTC CCATGTTAAT AAGGATCCGA ATTCCC

286 • · ··«· · · · ·· ·· • · · · ♦ · · · · · ·

J7 ·· · ····· t · ··· ······· • · · ·· ··· ···· ·« ··· ···· ·· ··

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 13

1) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 22 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina

a) Popis: /desc = „syntetická DNA“ xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 13

CTAGTGTTGA CCAGTGTTAC TC 22

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 14

i) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 270 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 14

GGATCCAASA AAGTAATAGW TATGGCTAAG TTTGCTACCA TCATCTCTCT TCTCTTTGCT 60

GCTCTTGTTC TCTTTGCTGC CTTTGAAGCA CCAACAATGG TGGATGCAAG GTTGTGCGAG 120

AGACCAAGTG GGACATGGTC AGGAGTTTGT GGGAACAACA ATGCATGCAG GAACCAATGC 180

AGAAACCTTG AAAGAGCAGA ACACGGATCT TGCAACTATG TCTTCCCAGC TCACAAATGT 240

ATTTGTTACT TCCCATGTTA ATAAGGATCC 270 (2) Informace o řetězci SEQ ID NO: 15

Charakteristika řetězce:

i) A) Délka: 79 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Vinutí:

·· ··« ·

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: peptid xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 15

Met Ala Lys Phe Ala Thr Ile Ile Ser Leu Leu Phe Ala Ala Leu 1 5 10 15

Val Leu Phe Ala Ala Phe Glu Ala Pro Thr Met Val Asp Ala Arg

25 30

Leu Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn

40 45

Asn Asn Ala Cys Arg Asn Gin Cys Arg Asn Leu Glu Arg Ala Glu

55 60

His Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys

70 75

Tyr Phe Pro Cys

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 16

i)Charakteristika řetězce:

A) Délka: 285 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina

a) Popis: /desc = „syntetická DNA“ xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 16

TCCGGATCCT CTAGAGTTTT ATTAGTGATC ATGGCTAAGT TTGCGTCCAT CATCGCACTC 60

CTCTTTGCTG CTCTCGTTCT CTTTGCTGCT TTCGAGGCAC CAACTATGGT GGAGGCACAA 120

AAGTTGTGCG AGAGGCCATC AGGGACTTGG TCAGGAGTCT GCGGAAACAA CAACGCATGC 180

AAGAACCAAT GCATCAACCT CGAGAAGGCA CGGCATGGAT CTTGCAACTA CGTCTTCCCA 240

GCTCACAAGT GCATCTGCTA CTTTCCATGC TAATAGGAAT TCGAA 285

• · ··· · ·· ··

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 17

i) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 285 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vinutí: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina

a) Popis: /desc = „syntetická DNA“ xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 17

TCCGGATCCT	CTAGAGTTTT	ATTAGTGATC	ATGGCTAAGT	TTGCGTCCAT	CATCGCACTC	60
CTCTTTGCTG	CTCTCGTTCT	CTTTGCTGCT	TTCGAGGCAC	CAACTATGGT	vavAlajcAcaa	120
AAGTTGTGCC	AAAGGCCATC	AGGGACTTGG	TCAGGAGTCT	GCGGAAACAA	CAACGCATGC	180
AAGAACCAAT	GCATCAGACT	CGAGAAGGCA	CGGCATGGAT	CTTGCAACTA	CGTCTTCCCA	240
GCTCACAAGT	GCATCTGCTA	CTTTCCATGC	TAATAGGAAT	TCGAA		285

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 18

i) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 51 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Vinutí:

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: peptid xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 18

Gin Lys Leu Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys 15 10 15

Gly Asn Asn Asn Ala Cys Lys Asn Gin Cys Ile Asn Leu Glu Lys

25 30

Ala Arg His Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys

40 45

Ile Cys Tyr Phe Pro Cys •fr ···· fr · fr fr · • frfr • frfr ···« frfr • · • frfr ··»* frfr ·· frfr · • frfr frfrfrfr fr • · · frfr frfr

2) Informace o řetězci SEQ ID NO : 19

i) Charakteristika řetězce:

A) Délka: 51 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Vinutí:

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: peptid xi) Popis řetězce : SEQ ID NO: 19

Gin Lys Leu Cys Gin Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys 15 10 15

Gly Asn Asn Asn Ala Cys Lys Asn Gin Cys Ile Arg Leu GluLys

25 30

Ala Arg His Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys 35 40 45

Ile Cys Tyr Phe Pro Cys

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2.
2. 2. Izolovaná DNA molekula kódující polypeptid podle nároku 1.
3. 3. Izolovaná DNA molekula podle nároku 2, kde uvedená izolovaná DNA molekula je cDNA molekula.
4. 4. cDNA molekula podle nároku 3 obsahující sekvenci nukleotidů ukázanou v SEQ ID NO: 12.
5. 5. cDNA molekula podle nároku 3 obsahující nukleotidy 116 až 269 sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12.
6. 6. Rekombinantní dvouřetězová molekula DNA obsahující operativně spojené ve směru 5’ke3’:

   a) promotor, který vyvolává v rostlinných buňkách produkci RNA sekvence,

   b) strukturní kódující sekvenci, která kóduje polypeptid obsahující sekvenci amino kyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2 a

   c) 3’ nepřeloženou oblast, která způsobí v rostlinných buňkách terminaci transkripce a připojení polyadenylátových nukleotidů k 3’ konci uvedené RNA sekvence.
7. 7. DNA molekula podle nároku 6, kde uvedená strukturní kódující sekvence je cDNA molekula.
8. 8. DNA molekula podle nároku 7, kde uvedená cDNA molekula obsahuje člen vybraný ze skupiny sestávající ze sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12 a nukleotidů 116 až 269 sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12.

   • · · · · ·
9. 9. DNA molekula podle nároku 6, kde uvedený promotor je vybraný ze skupiny sestávající z promotoru FMV 35S, promotor CaMV 35S, promotor ssRUBISCO, promotor EIF-4A, promotor LTP, promotor aktinu a promotor ubichitinu.
10. 10. Způsob regulace poškození rostliny plísněmi zahrnující zabezpečení stanoviště dané rostliny uvedeným izolovaným polypeptidem podle nároku 1.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že uvedené poškození plísněmi je způsobeno plísněmi vybranými ze skupiny sestávající zrodů Altemaria, Ascochyta, Botrytis, Cercospora, Colletotrichum, Diplodia, Erysiphe, Fusarium, Gaeumanomyces, Helminthosporium, Macrophomina, Nectria, Perenospora, Phoma, Phymatotrichum, Phytophora, Plasmopara, Podosphaera, Puccinia, Putimím, Pyrenophora, Pyricularia, Pythium, Rhizoctonia, Scerotium, Selerotinia, Septoria, Thielaviopsis, Uncinula, Venturia a Verticillium.
12. 12. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že uvedený polypeptid se zajistí na stanoviště rostliny mikroorganismy kolonizujícími rostliny, které produkují uvedený antifungální polypeptid.
13. 13. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že uvedený polypeptid se zajistí na stanoviště rostliny aplikací směsi obsahující uvedený izolovaný polypeptid.
14. 14. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že uvedený polypeptid se zajistí na stanoviště rostliny expresí DNA kódující uvedený polypeptid v buňkách rostliny.
15. 15. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že uvedený polypeptid se skládá v podstatě ze sekvence aminokyselin ukázané v SEQ ID NO: 2.
16. 16. Způsob regulace poškození rostliny plísněmi zahrnující kroky:

    a) vložení do genomu rostlinné buňky rekombinantní molekulu dvouřetězové DNA obsahující:

    i) promotor, který zapříčiňuje v rostlinné buňce produkci sekvence RNA, • · • · · · ii) strukturní kódující sekvenci, která kóduje sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2.

    iii) 3’ nepřeloženou oblast, která způsobí vdaných rostlinných buňkách terminaci transkripce a připojení polyadenylátových nukleotidů k 3’ konci uvedené RNA sekvence,

    b) získání transformovaných rostlinných buněk a

    c) regeneraci buněk z geneticky transformované rostliny, které exprimuji antifungální účinné množství uvedeného polypeptidu podle nároku 1.
17. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačený tím, že uvedená strukturní kódující sekvence je člen vybraný ze skupiny složené ze sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12 a nukleotidů 116 až 269 sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12.
18. 18. Způsob podle nároku 16, vyznačený tím, že uvedený promotor je vybraný ze skupiny složené z promotoru FMV 35S, promotoru CaMV 35S, promotoru ssRUBISCO, promotoru oIF-4A, promotoru LPT, promotoru aktinu a promotoru ubichitinu.
19. 19. Rostlina jejíž buňky obsahují antifungálně účinné množství polypeptidu podle nároku 1.
20. 20. Rostlina podle nároku 1, vyznačená tím, že uvedená rostlina se produkuje způsobem zahrnujícím kroky:

    a) vložení do genomu rostlinné buňky rekombinantní molekuly dvouřetězové DNA obsahující:

    i) promotor, který umožňuje v rostlinné buňce produkci RNA sekvence, ii) strukturní kódující sekvenci, která kóduje sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID NO: 2.

    iii) 3’ nepřeloženou oblast, která působí vdaných rostlinných buňkách terminaci transkripce a přípojem polyadenylátových nukleotidů k 3’ konci uvedené RNA sekvence,

    b) získám transformovaných rostlinných buněk a

    c) regeneraci buněk z geneticky transformované rostliny, které exprimuji antifungálně účinné množství uvedeného polypeptidu.

    • · · · · ·
21. 21. Rostlina podle nároku 20, vyznačená tím, že uvedená strukturní kódující sekvence je člen vybraný ze skupiny složené ze sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12 a nukleotidů 116 až 269 sekvence nukleotidů ukázané v SEQ ID NO: 12.
22. 22. Rostlina podle nároku 19, vyznačená tím, že její genom obsahuje jednu či více dalších molekul DNA kódujících antifungální peptid, polypeptid nebo protein, kde tato jedna či více dalších molekul DNA je exprimována a produkuje antifungálně účinné množství uvedeného peptidů, polypeptidů nebo proteinu, který kóduje.
23. 23. Rostlina podle nároku 19, vyznačená tím, že její genom obsahuje DNA kódující endotoxin B.t., kde tato molekula DNA je exprimována a produkuje anti-insekticidně účinné množství endotoxinu B.t..
24. 24. Rostlina podle nároku 19, vyznačená tím, že tato rostlina je členem vybraným ze skupiny složené z jablka, ječmene, brokolice, zelí, kanoly, mrkve, citrusu, kukuřice, bavlny, česneku, cibule, okrasné rostliny, bobu, podzemnice, pepře, brambory, rýže, žita, sága, sóji, maliny, cukrové řepy, cukrové třtiny, rajčete, hroznů a pšenice.
25. 25. Rostlina podle nároku 19, vyznačená tím, že tato rostlina je rostlina brambor.
26. 26. Semeno brambor produkovaná rostlinou uvedenou v nároku 25.
27. 27. Antifungální kompozice obsahující antifungálně účinné množství uvedeného izolovaného polypeptidů podle nároku 1 a přijatelný nosič.
28. 28. Způsob boje s nežádoucími plísněmi zahrnující kontakt nežádoucí pbsně s antifungálně účinným množstvím izolovaného polypeptidů.