CZ290347B6

CZ290347B6 - Cyklopeptidy stimulující uvolňování růstového hormonu a způsob jejich přípravy

Info

Publication number: CZ290347B6
Application number: CZ1997369A
Authority: CZ
Inventors: Jan Rndr. Csc. Hlaváček; Miroslava Ing. ®Ertová; Rudolf Ing. Je®Ek
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie AV ČR
Priority date: 1997-02-07
Filing date: 1997-02-07
Publication date: 2002-07-17
Also published as: CZ36997A3

Abstract

e en se t²k nov²ch cyklick²ch peptid stimuluj c ch uvol ov n r stov ho hormonu obecn ho vzorce I, kde A znamen zbytky histidinu nebo cysteinu v L nebo D konfiguraci nebo zbytek 3-merkaptopropionov kyseliny, B a D znamenaj zbytky tryptofanu, terc.leucinu nebo neopentylglycinu v L nebo D konfiguraci, C znamen zbytek alaninu v L nebo D konfiguraci, E znamen zbytky lysinu, fenylalaninu nebo tetrahydroizochinolinkarboxylov kyseliny v L nebo D konfiguraci, F znamen zbytky lysinu nebo cysteinu v L nebo D konfiguraci nebo zbytek 3-merkaptopropionov kyseliny; nebo je cyklus tvo°en disulfidovou p° padn thiomethylenovou vazbou mezi postrann mi °et zci zbytk cysteinu v L nebo D konfiguraci, p° padn v kombinaci se zbytkem 3-merkaptopropionov kyseliny; zp sob p° pravy t chto cyklopeptid spo v v tom, e se N.sup..alfa..n.-Fmoc-N.sup..epsilon..n.-Boc-lysin nebo N.sup..alfa..n.-Fmoc-S-Trt-cystein, p° padn S-Trt-3-merkaptopropionov kyselina p°ipojen na polymern nosi postupn kondenzuj s aktivn mi hydroxybenztriazolov²mi estery N.sup..alfa..n.-Fmoc-aminokyselin v p° tomnosti diizopropylethylaminu, p°i em kondenza n reakce se nech prob hnout v syntetick m cyklu za p° davku dimethylsulfoxidu, N.sup..alfa..n.-Fmoc chr nic skupina se v ka d m kroku synt zy od t p p soben m piperidinu v dimethylformamidu a v z v re n m stupni se hexapeptid po od t pen z prysky°ice p soben m slab alkalick ho inidla s n sledn²m okyselen m nebo 1% TFA kyselinou cyklizuje p soben m difenylfosforylazidu, zat mco hexapeptidy se zbytky aminokyseliny cysteinu v jej L nebo D konfiguraci, p° padn 3-merkaptopropionov kyseliny se od t p z prysky°ice za sou asn ho uza

Description

Vynález se týká cyklopeptidů stimulujících uvolňování růstového hormonu a způsobu jejich přípravy

Dosavadní stav techniky

Cyklické peptidy jsou silné a specifické stimulátory sekrece růstového hormonu (dále jen GH) u rozmanitých živočišných druhů, které mají určité aminokyselinové pořadí.

Mechanismus biologické úlohy GH spočívá v regulaci funkce různých růstových faktorů (GFs, Rothe M., Falanda V.,: Arch. Dermatol. 125, 1390 (1989); Cohen S., Carpenter G.: Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 72, 1317 (1975): Lynch S. E., Nixon J. C., Colvin R. B., Anthonianes Η. N.: Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84, 7696 (1987); Baxter R. C.: Adv. Clin. Chem. 25, 49 (1986); Gospodarowicz D., Neufeld G., Schweigerer L.: Mol. Cell. Endocrinol. 16, 187 (1986)), které mají komplexní význam pro růst a syntézu buněk. Jsou považovány za důležité mediátory při hojení ran, při fibróze a obměně tkání. Nedostatečná sekrece GH má za následek poruchu funkce GFs a následně omezuje růst a regulaci tkáňového systému v různých organismech. Na druhé straně, zvýšený přísun GH vede ke stimulaci funkce GFs v metabolismu a zlepšuje růst, stav či hojení tkání a orgánů člověka a živočichů (Rothe M., Falanga V.,: Arch. Dermatol. 125, 1390 (1989).

Neuroendokrinní systém, kde GH a GFs hrají tak důležitou funkci se uplatňuje rovněž v procesu stárnutí organismu (Meites J., Goya R., Takahasni S.: Exp. Gerontol. 22, 1 (1987); Fabris N.: Intem. J. Neuroscience, 51, 373 (1990), Ďoubal S.: Mech. Ageing Dev. in press). Teprve nedávno byly popsány účinky nízkých dávek GH na imunitní systém a stárnutí myší (Khansari D. N., Gustad T.: Mech. Ageing Dev. 56, 87 (1991)).

Endogenní sekrece GH může být kromě tzv. releasing faktoru (GRF) z hypothalamu, obsahujícího 44 aminokyselinových zbytků, stimulována i tzv. releasing peptidem : His-D-TrpAla-Trp-D-Phe-Lys-HN2 (GHRP), složeným pouze ze 6 aminokyselinových zbytků a působícím sekreci GH in vitro i in vivo (Momany F. A., Bowers C. Y., Reynolds G. A., Chang D., Hong A., Newlander K.: Endocrinology 108, 31 (1981); Bowers C. Y., Momany F. A., Reynolds G. A., Hong A.: Endocrinology, 114, 1537 (1984)).

Tento hexapeptid amid neinteraguje se stejným receptorovým místem v hypofyze jako GRF a je patrně zapojen do jiného mechanismu sekrece GH (Sartor O., Bowers C. Y., Chang D.: Endocrinology, 116, 952 (1985); Cheng K., Chán W. W. S., Barrets, Jr. A., Convey D. M., Smith R. G.: Endocrinology 124, 2791 (1989)). U člověka je jeho potence dokonce vyšší než účinek zmíněného GRF (Yellin T. O., Huffman W. F. in „Peptides“; Chemistry, Structure and Biology. Proč. ll^th A.P.S. (Rivier. J. E., Marshall G. R., Eds.), p. 214. ESCOM, Leiden, 1990). Pro svou krátkou aminokyselinovou sekvenci je z praktického hlediska GHRP, případně jeho analogy, zajímavější než GRF obsahující desítky aminokyselinových zbytků a mohl by být proto využíván v humánní i veterinární medicíně.

Před časem jsme objevily, že GHRP také výrazně zpomaloval proces stárnutí myší v experimentu trvajícím 10 měsíců (Hlaváček J., Smékal O., Barth T., Ďoubal S., Robinson I.: Peptides 1992 (Schneider C. H. and Eberle A. N., Eds.), p. 741, ESCOM, 1993).

Na základě výpočtů (Momany F. A., Bowers C. Y., Reynolds G. A., Hong A., Newlander K.: Endocrinology, 114, 1531 (1984)) byla pro GHRP navržena pseudocyklická konformace

-1 CZ 290347 B6 umožněná flexibilním zbytkem alaninu v centrální části molekuly a stabilizovaná interakcí mezi aromatickými zbytky aminokyselin opačné chirality v amino- (His, D-Trp) a karboxy- (Trp,

D-Phe) terminální části. Navržená konformace je spojována s účinkem GHRP na stimulaci uvolňování GH.

Výše uvedené poznatky nás vedly k myšlence kovalentně fixovat výše uvedenou pseudocyklickou konformaci. Proto jsme syntetizovali řadu cyklopeptidů (I) podle schématu hlava k ocasu a sledovali jejich účinek na uvolňování GH do plazmy. Některé z analogů vykazují agonistický účinek lineárního hexapeptid amidu, což potvrzuje naši představu, že cyklické uspořádání je relevantní pro interakci cyklopeptidů s odpovídajícím receptorem a nebrání následujícím procesům, které vedou k sekreci GH. Navíc, při dlouhodobém experimentu na myších (10 měsíců), byl jeden z cyklických analogů dokonce účinnější než GHRP při zpomalení procesu stárnutí u experimentálních zvířat.

Tyto peptidy a jejich kombinace působí přímo na přední lalok hypofýzy za specifického spouštění GH a jsou potenciálními analogy GHRP s protrahovaným účinkem. Některé z nich rovněž v dlouhodobém testu zpomalují pochody vedoucí ke stárnutí experimentálních zvířat.

Podstata vynálezu

Cyklické peptidy stimulující uvolňování růstového hormonu obecného vzorce I

A - B - C (I),

F - E - D kde A znamená zbytky aminokyselin histidinu nebo cysteinu v jejich L nebo D konfiguraci nebo zbytek 3-merkaptopropionové kyseliny,

B a D znamenají zbytky aminokyselin tryptofanu, terc.leucinu nebo neopentylglycinu v jejich L nebo D konfiguraci,

C znamená zbytek aminokyseliny alaninu v jeho L nebo D konfiguraci,

E znamená zbytky aminokyselin lysinu, fenylalaninu nebo tetrahydroizochinolinkarboxylové kyseliny v jejich L nebo D konfiguraci,

F znamená zbytky aminokyselin lysinu nebo cysteinu v jejich L nebo D konfiguraci nebo zbytek 3-merkaptopropionové kyseliny;

nebo je cyklus tvořen disulfídovou případně thiomethylenovou vazbou mezi postranními řetězci zbytků aminokyseliny cysteinu v jeho L nebo D konfiguraci, případně v kombinaci se zbytkem 3-merkaptopropionové kyseliny.

Způsob přípravy cyklopeptidů podle vynálezu spočívá vtom, že se N“-Fmoc-N^e-Boc-lysin nebo N“-Fmoc-S-Trt-cystein, případně S-Trt-3-merkaptopropionová kyselina připojené na polymemí nosič postupně kondenzují s aktivními hydroxybenztriazolovými estery N“-Fmocaminokyselin v přítomnosti diizopropylethylaminu, přičemž kondenzační reakce se nechá proběhnout v syntetickém cyklu za přídavku dimethylsulfoxidu, N“-Fmoc chránící skupina se v každém kroku syntézy odštěpí působením piperidinu v dimethylformamidu a v závěrečném stupni se hexapeptid po odštěpení z pryskyřice působením slabě alkalického činidla s následným okyselením nebo 1% TFA kyselinou cyklizuje působením difenylfosforylazidu, zatímco

-2CZ 290347 B6 hexapeptidy se zbytky aminokyseliny cysteinu v její L nebo D konfiguraci, případně

3-merkaptopropionové kyseliny, jsou odštěpeny z pryskyřice za současného uzavření disulfidové vazby působením jodu ve směsi rozpouštědel AcOH, TFE a DCM.

Peptidy jsou syntetizovány podle obecného postupu modifikacemi standardních metodik na polymemím nosiči nebo v roztoku. V prvním případě se ke karboxyterminální aminokyselině připojené na polymemí nosič s výhodou chlormethylovou Merrifieldovu pryskyřici nebo její kysele labilnější hydroxymethylové, případně chlortritylové modifikace postupně připojují N^a-Fmoc-aminokyseliny v trojnásobném přebytku. Jejich karboxylová skupina je aktivovaná pomocí diizopropylkarbodiimidu (dále jen DIC) a N-hydroxybenztriazolu (dále jen HOBt) jako HOBt ester a kondenzace prováděna v přítomnosti dimethylformamidu (dále jen DMF) resp. N-methylpyrrolidonu (dále jen NMP). Syntetický cyklus pro požadované připojení aminokyseliny zahrnuje odštěpení N“-Fmoc chránicí skupiny působením 20% piperidinu v DMF (5+20 min), pětinásobné promytí peptidyl-pryskyřice DMF, 2-propanolem, DMF resp. NMP. Acylační reakce zpravidla vyžaduje cyklus 2 hod, přičemž po 40 min se přidá dimethylsulfoxid (15% v reakční směsi). Dokončení reakce je kontrolováno ninhydrinovým testem (KaiserE., Colescott R. L., Bossinger C. D., Cook P. I.: Anal. Biochem. 34, 595 (1970)) a změnou zbarvení bromfenolové modři (Krchňák V., Vágner J., Šafář P., Lebl M.: Collect. Czech. Chem. Commun. 53, 2542 (1988)). V případě nekompletní kondenzace (pod 99%) je přidáno BOP činidlo ve třímolámím přebytku s DIEA a reakce prodloužena o 1 h. Nekompletní kondenzace i po této operaci je eliminována acylační reakcí s 25% acetanhydridem v DMF po dobu 5 až 10 min.

Peptid se odštěpí z pryskyřice mírně alkalickým vodným roztokem 0,1 M NaOH ve směsi rozpouštědel MeOH a dioxan, během 3 min, přičemž štěpení se provede celkem třikrát. Poté se roztok okyselí octovou kyselinou k regeneraci karboxylové funkce. V případě kysele labilní pryskyřice se peptid odštěpí působením 1% TFA. Surový produkt analogu GHRP se odsolí na koloně s náplní biogelu Sephadex G-10 za použití 0,2M octové kyseliny. Po Iyofilizaci se peptid dále čistí gelovou filtrací na Sephadexu G-25 v 0,2M octové kyselině, preparativní kontinuální průtokovou elektroforézou (Prusík Z., Kašička V., Mudra P., Štěpánek J., Smékal O., Hlaváček J.: Electrophoresis 11, 932 (1990)) v 0,5M octové kyselině a nakonec preparativní vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (dále jen HPLC). Preparativní HPLC byla prováděna na zařízení fy Spectra Physics s kolonou Vydac C18 při gradientu: 0 až 30% MeOH, 10 min a 30 až 80 % MeOH, 40 min v 0,05% trifluoroctové kyselině, průtoková rychlost 3 ml/min s detekcí při 222 resp. 254 nm. Analytická kontrola čistoty produktů byla prováděna pomocí TLC v systémech Sl(2-butanol-98% HCOOH-voda, 75:13,5:11,5), S2(2-butanol-25% vodný amoniak-voda, 85:7,5:7,5), S3(l-butanol-octová kyselina-voda, 4:1:1) a S4(l-butanol-pyridinoctová kyselina-voda, 15:10:3:6) dále elektroforézou na papíře Whatman 3MM při potenciálovém spádu 20V/cm, 1 h v 1M octové kyselině (pH 2,4) a v pufru pyridin-acetát (pH 5,7) a pomocí analytické HPLC (kolona Vydac Cl8, 20 až 80 % MeCN/0,5% trifluoroctová kyselina, 60 min, průtok 1 ml/min, detekce 222 a 280 nm), aminokyselinové analýzy na přístroji Durrum Instrum. Corp. USA, po hydrolýze peptidu v 6M-HC1, 20 h při 110 °C a hmotové spektrometrie na přístroji VG Analytical, England.

V dalším je vynález a obecný experimentální postup blíže objasněn v příkladech provedení aniž se tím jakkoli omezuje.

- j CZ 290347 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

N^a-Fmoc-N^E-Boc-lysyM-oxomethylenfenyl-pryskyřice

Merrifieldova pryskyřice (substituce 0,7 mmol/g, 2% kopolymer s divinylbenzenem, Fluka, 2,8 g) byla promyta DMF, vodou, vysušena ve vakuu a promyta benzenem. K pryskyřici byl přidán roztok cezné soli připravené z N“-Fmco-N^e-Boc-Lys-OH (3,42 g) a Cs₂CO₃ (3,1 g) mícháním obou komponent ve směsi DMF-voda, 3 hod a celá směs byla míchána 48 hod při 40 °C. Po odstranění rozpouštědla byl polymemí materiál s navázanou aminokyselinou promyt na fritě EtOH a DCM a po vysušení bylo 1,67 g použito pro postupnou výstavbu peptidového řetězce.

Příklad 2 cyklo(D-His-T rp-Ala-D-T rp-Pre-Lys)

N^a-Fmoc chránící skupina z navázaného Lys(Boc) podle příkladu 1 byla odštěpena 20% piperidinem v DMF (5 + 20 min) a po promytí polymemího materiálu DMF, 2-propanolem a opět DMF byl produkt acylován postupně N“-Fmoc deriváty Phe (0,75 g, 2 h), D-Trp (0,46 g, 3 h), Ala (0,57 g, 2 h), Trp (0,38 g, 3 h) a D-His(Boc) (0,42 g, 2 h). Fmoc skupina byla odštěpena 20% piperidinem v DMF a všechny kondenzace probíhaly působením DIC v přítomnosti HOBt v DMF. Částečně chráněný hexapeptid byl posléze odštěpen z pryskyřice v prostředí vodného 0,lM NaOH vMeOH-dioxan (3x50 ml) při teplotě místnosti a od polymemího materiálu oddělen filtrací a promytím 50 ml DMF, DCM a MeOH. Získáno 0,52 g surového produktu, který byl cyklizován působením difenylfosforylazidu v přítomnosti 1M roztoku K₂HPO₄. Po cyklizaci byl produkt čištěn gelovou filtrací na Sephadexu G-10 a G-25 v 0,2M octové kyselině a pomocí HPLC. Aminokyselinová analýza: His 0,93, Ala 0,98, Trp 1,72, Phe 1,05, Lys 1,0. Pro C56H69N11O10 (1056,2) byl zjištěn /Μ+ΗΛ 1057,1. V posledním stupni byl cyklopeptid rozpuštěn ve směsi TFA(90)-anisol(5)-ethandithiol(5) s přídavkem 100 mg indolu a roztok po 1 h odpařen do sucha za vakua, zbytek extrahován etherem, rozpuštěn ve 3M octové kyselině a roztok promyt 3x etherem a po zředění vodou lyofilizován. Surový produkt byl čištěn semipreparativní HPLC v gradientu mobilní fáze 50-90% MeOH v 0,05% TFA, 30 min (retenční čas 5,21 min).

Pro C₄6H5₃NiiOé (856,02) byl stanoven /Μ+ΗΛ = 857. Aminokyselinová analýza: Lys 1, Phe 1,03, Trp 1,84, Ala 1,04, His 0,96; E_Gi_y ²’⁴1,18, E_His ⁵’⁷ 0,82.

Příklad 3 cyklo(His-D-Trp-Ala-Trp-D-Tic-Lys)

Fmoc-Lys(Boc)-oxymethylenfenyl-resin (0,62 g) byla po odštěpení Fmoc-chránicí skupiny 20% piperidinem v DMF postupně acylována HOBt estery Fmoc derivátů D-Tic (0,6 g, 3 h), Trp (0,7 g, 4 h), Ala (0,3 g, 2 h), D-Trp (0,7 g, 3 h) a His(Boc) (0,73 g, 2 h). Částečně chráněný hexapeptid byl odštěpen z pryskyřice jako v příkladu 2 a cyklizován rovněž pomocí difenylfosforylazidu v přítomnosti K₂HPO₄. Po odštěpení Boc chránících skupin jako v příkladu 2 byl cyklohexapeptid čištěn preparativní HPLC za použití gradientu mobilní fáze 50 až 90% MeOH v 0,05% TFA, 30 min, s retenčním časem 5,64. Aminokyselinová analýza: His 0,94, Trp 1,56, Ala 1,08, Tic0,93, Lys 1,0 . E_Gly ^2,4 1,16, EHís^5,7 0,82. Pro Ο47Η₅₃Ν]ΐθ6 (868,0) stanoven /M+HT = 868,4.

-4CZ 290347 B6

Příklad 4 cyklo(His-D-Neo-Ala-Trp-D-Phe-Lys)

N“-Fmoc chránící skupina z navázaného Lys(Boc) byla odštěpena 20% piperidinem v DMF (5 + 20 min) a po promytí polymemího materiálu DMF, 2-propanolem a opět DMF byl produkt acylován postupně N“-Fmoc deriváty D-Phe (0,75 g, 2 h), Trp (0,46 g, 3 h), Ala (0,57 g, 2 h), D-Neo (0,31 g, 2 h) a His(Boc) (0,42 g, 3 h). Fmoc skupina byla odštěpena jako v předchozích případech. Všechny kondenzace probíhaly působením DIC v přítomnosti HOBt v DMF. Částečně chráněný hexapeptid byl uvolněn z pryskyřice jako v příkladu 2 a cyklizován rovněž pomocí difenylfosforylazidu v přítomnosti K2HPO4. Po odštěpení Boc chránících skupin jako v příkladu 2 měl cyklohexapeptid aminokyselinové složení: His 0,94, Neo 0,97, Trp 0,82, Ala 1,08, Phe 0,93, Lys 1,0 . E_Gly ²·⁴ 1,12, E_Hí_s ⁵’⁷ 0,79.

Pro C42H56N10O6 (796,97) byl zjištěn /M+H/⁴ = 797. Preparativní HPLC poskytla při použití gradientu mobilní fáze 50 až 90% MeOH v 0,05% TFA, 30 min čistý produkt III s retenčním časem 6,68.

Příklad 5

N“-Fmoc-N^E-Boc-Lys-2-methoxy—4-alkoxybenzylalkohol-pryskyřice

K Sasrin pryskyřici (substituce 0,9 mmol/g, Bachem, 1 g) v DMF byl za míchání přidán aktivní ester vytvořený reakcí Fmoc-Lys(Boc)-OH (1,15 g) s HOBt (0,76 g) a „komplexu“ pentafluorfenol/DCC (3,74 g) při 0 °C, 30 min a dimethylaminopyridin (30 mg). pH směsi bylo upraveno na 7 přídavkem DIEA (1,2 ml) a po 4 dnech míchání při teplotě místnosti byla pryskyřice s navázanou aminokyselinou odsáta na fritě a promyta 5x 10 ml DMF, EtOH, iPrOH a MeOH a sušena v exsikátoru do konstantní váhy. Vážením (1,24 g) a stanovením Fmoc skupiny byla zjištěna substituce 0,57 mmol aminokyseliny na 1 g pryskyřice. Nezreagované OH-CH₂skupiny linkeru byly acetylovány směsí acetanhydrid (1,3 ml)-DIEA(2 ml)-DCM(8 ml) a po 1 hod pryskyřice odsáta na fritě a promyta 3x 10 ml DCM, iPrOH a DMF. Po odštěpení Fmoc skupiny 20% piperidinem v DMF a promytí 5x10 ml DMF byl materiál připraven pro postupnou výstavbu peptidového řetězce jako v příkladu 1.

Příklad 6

H-Cys-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Cys-OH

Do roztoku Fmoc-Cys(Trt)-OH (0,96 g) v DCM (20 ml) a DMF (I ml) byla za míchání při teplotě místnosti přidána chlortritylová pryskyřice (2 g, subst. 1,3 mmol Cl/g, NovaBiochem, Švýcarsko) a po 5 min 0,26 ml a po dalších 5 min 0,52 ml DIEA. Po 60 min míchání byla reakce stopnuta přídavkem MeOH (2 ml) a po 10 min rozpouštědlo odfiltrováno a na fritě pryskyřice s navázanou aminokyselinou promyta 3x20 ml DCM, DMF, iPrOH, DMF, iPrOH, MeOH, etheru a sušena nad KOH v exsikátoru. Vážením a stanovením Fmoc skupiny byla zjištěna substituce 0,54 mmol/g pryskyřice. Poté byla odštěpena Fmoc chránící skupina 5%, resp. 20% piperidinem ve směsi DCM/DMF 1:1 (10+15 min) a po 4x promytí DMF byl produkt acylován postupně N-Fmoc deriváty D-Phe (0,75 g, 2 h), Trp (0,46 g, 3 h), Ala (0,57 g, 2 h), D-Trp (0,38 g, 3 h) a Cys(Trt) (0,72 g, 2 h). Fmoc skupina byla odštěpena 20% piperidinem v DMF a všechny kondenzace probíhaly působením DIC v přítomnosti HOBt v DMF. Částečně chráněný hexapeptid byl posléze uvolněn z pryskyřice a současně uzavřena disulfidová vazba mezi oběma Cys zbytky působením jodu (0,76 g) ve směsi rozpouštědel: AcOH (1,2 ml), TFE (2,4 ml),

-5 CZ 290347 B6

DCM(8,4 ml), 10 min při teplotě místnosti. Roztok byl extrahován 10 ml 0,1% Na₂S₂O₃ do odbarvení roztoku, který byl posléze odpařen a zbytek rozpuštěn ve 3M AcOH a lyofílizován.

Surový produkt byl čištěn semipreparativní HPLC v gradientu mobilní fáze 5% až 90% ACN v 0,05% TFA, 30 min (retenční čas 24,3 min) a pro C4oH4₄N80₇S₂ (813,0) zjištěn /M+Hf =813,3. Aminokyselinová analýza: Ala 1, Trp 1,64, Phe 1,03, Cys 2,02.

Zkratky

Zkratky aminokyselin odpovídají nomenklatuře navržené IUPAC-IUB (Nomenclature and ío Symbolism for Amino Acids and Peptides, Recommendations 1983: Eur. J. Biochem. 138, 9 (1984)). Dále jsou pro chránící skupiny aminokyselin použity tyto zkratky: AcOH, octová kyselina; Boc; terc.butyloxykarbonyl; DCC; Ν,Ν-dicyklohexylkarbodiimid; DCM, dichlormethan; DIC, Ν,Ν-diizopropylkarbodiimid; DIEA, diizopropylethylamin; DMF, dimethylformamid; EtOH, ethanol; Fmoc, fluorenylmethyloxykarbonyl; HOBt, 1-hydroxybenztriazol, 15 MeOH, methanol; iPrOH, 2-propanol; TFA, trifluoroctová kyselina; Trt, trifenylmethyl.

Průmyslová využitelnost

Látky podle vynálezu mohou být využity v humánní a veterinární medicíně při ovlivnění imunitního systému v souvislosti s regulací funkce některých růstových faktorů za účelem zpomalování pochodů uplatňovaných v procesu stárnutí.

Claims

30 1. Cyklické peptidy stimulující uvolňování růstového hormonu obecného vzorce I

A - B - C (I),

F - E - D kde A znamená zbytky aminokyselin histidinu nebo cysteinu v jejich L nebo D konfiguraci nebo zbytek 3-merkaptopropionové kyseliny,

35 B a D znamenají zbytky aminokyselin tryptofanu, terc.leucinu nebo neopentylglycinu v jejich L nebo D konfiguraci,

C znamená zbytek aminokyseliny alaninu v jeho L nebo D konfiguraci,

40 E znamená zbytky aminokyselin lysinu, fenylalaninu nebo tetrahydroizochinolinkarboxylové kyseliny v jejich L nebo D konfiguraci,

F znamená zbytky aminokyselin lysinu nebo cysteinu v jejich L nebo D konfiguraci nebo zbytek 3-merkaptopropionové kyseliny;

nebo je cyklus tvořen disulfidovou případně thiomethylenovou vazbou mezi postranními řetězci zbytků aminokyseliny cysteinu v jeho L nebo D konfiguraci, případně v kombinaci se zbytkem 3-merkaptopropionové kyseliny.

-6CZ 290347 B6
2. Způsob přípravy cyklopeptidů podle nároku 1 obecného vzorce I, vyznačující se tím, že se N“-Fmoc-N^E-Boc-lysin nebo N“-Fmoc-S-Trt-cystein, případně S-Trt-3merkaptopropionová kyselina připojené na polymemí nosič postupně kondenzují s aktivními hydroxybenztriazolovými estery bT-Fmoc-aminokyselin v přítomnosti diizopropylethylaminu, 5 přičemž kondenzační reakce se nechá proběhnout v syntetickém cyklu za přídavku dimethylsulfoxidu, N“-Fmoc chránící skupina se v každém kroku syntézy odštěpí působením piperidinů v dimethylformamidu a v závěrečném stupni se hexapeptid po odštěpení z pryskyřice polymemího nosiče působením slabě alkalického činidla s následným okyselením nebo 1% TFA kyselinou cyklizuje působením difenylfosforylazidu, zatímco hexapeptidy se zbytky aminoio kyseliny cysteinu v její L nebo D konfiguraci, případně 3-merkaptopropionové kyseliny se odštěpí z pryskyřice za současného uzavřené disulfídové vazby působením jodu ve směsi rozpouštědel AcOH, TFE a DCM.