CZ20022756A3

CZ20022756A3 - Prostředky a způsoby pro léčení a diagnostiku rakoviny prostaty

Info

Publication number: CZ20022756A3
Application number: CZ20022756A
Authority: CZ
Inventors: Jiangchun Wu; Davin C. Dillon; Jennifer L. Mitcham; Susan L. Harlocker; Yuqiu Jiang; Steven G. Reed; Michael D. Kalos; Gary Richard Fanger; Craig H. Day; Marc Retter; John A. Stolk; Yasir Skeiky; Aijun Wang; Madeleine Joy Meagher
Original assignee: Corixa Corporation
Priority date: 2000-01-14
Filing date: 2001-01-16
Publication date: 2003-02-12
Also published as: PL356908A1; JP2003528591A; WO2001051633A9; MXPA02006934A; CN1436234A; BR0107643A; AU3447401A; HUP0203968A2; WO2001051633A3; NO20023402L; IL150732A0; WO2001051633A2; NO20023402D0; KR20030016217A; CA2397741A1; RU2002121771A; HUP0203968A3; ZA200206400B; EP1261708A2

Description

Prostředky a způsoby pro léčení a diagnostiku rakoviny prostaty

Oblast techniky

Obecně se vynález týká léčení a diagnostiky rakoviny, jako je rakovina prostaty. Zvláště se vynález týká polypeptidů, obsahujících alespoň část proteinu specifického pro prostatu a polynukleotidů kódujících takové polypeptidy. Takové polypeptidy a polynukleotidy jsou použitelné ve farmaceutických prostředcích, například ve vakcinách a v jiných prostředcích k diagnostice a léčení rakoviny prostaty.

Dosavadní stav techniky

Rakovina je významným zdravotním problém v celém světě, ftčkoli došlo k určitému pokroku v detekci a terapii rakoviny, není běžně dostupná vakcina nebo jiná úspěšná metoda pro prevenci nebo léčbu. Běžné terapie, které jsou obecně založeny na kombinaci chemoterapie nebo chirurgie a ozařování, se jeví jako nepřiměřené u mnoha pacientů.

Rakovina prostaty je nejběžnější formou rakoviny mužů, postihující odhadem 30 % mužů ve věku nad 50 let. Celosvětové klinické poznatky dokládají, že lidská rakovina prostaty má schopnost metastázovat na kostech a tato choroba se jeví jako nevyhnutelně postupující k lámavosti kostí závislé na androgenu, vedoucí až k úmrtí pacienta. Toto onemocnění je v současné době druhou příčinou úmrtí mužů na rakovinu ve Spojených státech anerických.

Přes rozsáhlý výzkum v terapii této nemoci zůstává rakovina prostaty chorobou obtížně léčitelnou- Obvyklá léčba je založena na chirurgii a/nebo léčbě ozařováním, avšak tyto způsoby jsou neúčinné ve významném procentu případů. Dva dříve identifikované proteiny specifické pro prostatu (prostatě spe2 » » ) ) > 1 ) i 1 ) > ) > 1

I t ) ) ϊ > ) > -»

Ϊ ) 1 ) > > > ) cific antigen [PSA] a prostatic acid phosphatase [PAP]) mají omezenou terapeutickou a diagnostickou účinnost- Například hladiny PSA nejsou vždy ve vztahu k existenci rakoviny prostaty a nenaznačují míru metastáz.

Přes usilovný výzkum terapie těchto a jiných zhoubných nádorů zůstává rakovina prostaty obtížně diagnostikovátelnou a obtížně účinně léčitelnou. Hledají se proto stále zlepšené způsoby zjišťování a ošetřování takových rakovin. Vynález plní současné požadavky a ve srovnání se současným stavem přináší další pokroky.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci vybranou ze souboru zahrnujícího (a) sekvence v SEQ ID NO: 1 až 111, 115 až 171, 173 až 175, 177, 179 až 305, 307 až 315, 326, 328, 330, 332 až 335, 340 až 375, 381, 382 a 384 až 476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 až 572, 587, 591, 593 až 606, 618 až 626, 630, 631, 634, 636, 639 až 655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720 až 722, 735, 737 až 739, 751, 753, 764, 765, 773 až 776 a 786 až 788;

Cb) komp1eraenty sekvencí v SEQ ID N0= i až 111, 115 až 171, 173 až 175, 177, 179 až 305, 307 až 315, 326, 328, 330, 332 až 335, 340 až 375, 381, 382 a 384 až 476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 až 572, 587, 591, 593 až 606, 618 až 626, 630, 631, 634, 636, 639 až 655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720 až 722, 735, 737 až 739, 751, 753, 764, 765, 773 až 776 a 786 až 788;

Cc) sekvence sestávající z alespoň 20 přilehlých zbytků ze sekvence v SEQ ID N0^; 1 až 111, 115 až 171, 173 až 175, 177, rt-»^^«e«iŠiie«iĚ®eS«S<«^iŽ®!«íee^S»sM3l«MíWÍ«(W*í«Síeíe^»iíSÍ^JĚ<«^r«^»*4í

Ί » Λ i I >5 ·) > 1 i S » » ) » 7 >1 > ) » » >7 7)7 >7 ) ) 7 ) »

7 7 7 )7

179 až 305, 307 až 315	, 326	, 328, 330, 332	až 335, 340 až	375,
381, 382 a 384 až 476,	524,	526, 530, 531,	533, 535, 536,	552,
569 až 572, 587, 591,	593	až 606, 618 až	626, 630, 631,	634,
636, 639 až 655, 674,	680	, 681, 711, 713	, 716, 720 až	722,
735, 737 až 739, 751,	753,	764, 765, 773 až	; 776 a 786 až	788;

(d) sekvence, které hybridizují na sekvenci v SEQ ID NC1:

1 až	111,	115	až 171, 173 až 175,	177,	179 až 305, 307 až	315,
326,	328,	330,	332 až 335, 340 až	375,	381, 382 a 384 až	476,
524,	526,	530,	531, 533, 535, 536,	552,	569 až 572, 587,	591,
593	až 606, 618 až 626, 630, 631	, 634	, 636, 639 až 655,	674,
680,	681,	711	, 713, 716, 720 až	722,	735, 737 až 739,	751,
753,	764,	765,	773 až 776 a 786 až 788	za mírně přísných	pod-

mínek;

Ce) sekvence mající alespoň 75% identitu k sekvenci SEQ ID NO:

1 až	111, 115	až 171, 173	až 175, 177,	179 až 305, 307 až	315,
326,	328, 330,	332 až 335	, 340 až 375,	381, 382 a 384 až	476,
524,	526, 530,	531, 533,	535, 536, 552,	569 až 572, 587,	591,
593	až 606, 618 až 626,	630, 631, 634	, 636, 639 až 655,	674,
680, 753,	681, 711 764, 765,	, 713, 716, 773 až 776	720 až 722, a 786 až 788	735, 737 až 739,	751,

(f) sekvence mající alespoň 75% identitu k sekvenci SEQ ID N0 = 1 až 111, 115 až 171, 173 až 175, 177, 179 až 305, 307 až 315, 326, 328, 330, 332 až 335, 340 až 375, 381, 382 a 384 až 476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 až 572, 587, 591, 593 až 606, 618 až 626, 630, 631, 634, 636, 639 až 655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720 až 722, 735, 737 až 739, 751, 753, 764, 765, 773 až 776 a 786 až 788

Cg) generované varianty sekvence v SEQ ID NO: i _až 111, 115 až 171, 173 až 175, 177, 179 až 305, 307 až 315, 326, 328, 330, 332 až 335, 340 až 375, 381, 382 a 384 až 476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 až 572, 587, 591, 593 až

- 4 ϊ > i > » )1 )1 11

J r ) ·» 1)11 11» ‘ > » > » > > '1 ) 1 » ) I ) 1)1 ) ) 1 ¹ > » > > > > » » 1 » ) ) » ->

606, 618	až 626, 630, 631, 634, 636,	639	až 655,	674, 680,
681,	711,	713, 716,	720 až 722, 735,	737	až	739,	751, 753,
764,	765,	773 až 776	a 786 až 788.

Podle výhodného provedení polynukleotldové prostředky podle vynálezu jsou expresovány alespoň přibližně 10 %, výhodněji alespoň přibližně 30 % a ještě výhodněji alespoň přibližně 50 % testovaných vzorků prostatové tkáně v míře alespoň přibližně dvojnásobně, s výhodou alespoň přibližně pětinásobně a nejvýhodněji alespoň přibližně desetinásobně větší než jinými normálními tkáněmi.

Vynález se také týká polynukleotidových prostředků obsahujících aminokyselinovou sekvenci, která se kóduje polynukleotidovou shora popsanou sekvencí.

Vynález se dále týká polypeptidových prostředků obsahujících aminokyselinovou sekvenci vybranou ze souboru zahrnujícího sekvence uvedené v SEQ ID NO: 112 až 114, 172, 176, 178,

327, 329, 331,	336,	339,	376 až 380, 383, 477 až	483,	496,
504, 505, 519,	520,	522,	525, 527, 532, 534,	537 až 551	, 553
až 568, 573 až	586,	588	až 590, 592, 627 až	629,	632,	633,
635, 637, 638,	656 až	671,	675, 683, 684, 710,	712,	714,	715,

717 až 719, 723 až 734, 736, 740 až 750, 752, 754, 755, 766 až 772, 777 až 785 a 789 až 791.

Podle určitých výhodných provedení jsou polypeptidy a/nebo polynukleotidy podle vynálezu imunogenické, to znamená, že jsou schopné vyvolávat imunní odezvu, zvláště humorální a/nebo buněčnou imunitní odezvu, jak bude níže objasněno.

Vynález se také týká fragmentů, variant a/nebo derivátů polypeptidu a/nebo polynukleotidových sekvencí, přičemž fragmenty, varianty a/nebo deriváty mají s výhodou imunugenickou aktivitu alespoň přibližně 50%, s výhodou alespoň přibližně

- 5 70% a nejvýhodněji alespoň přibližně 90% se zřetelem na imunogenickou aktivitu polypeptidové sekvence uvedené v SEQ ID N0 = 112 až 114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376 až

380, 383, 477	až	483,	496, 504, 505, 519, 520,	522,	525,	527,
532, 534, 537	až	551,	553 až	568, 573 až 586,	588 až	590,	592,
627 až 629,	632,	633	, 635,	637, 638, 656 až	671,	675,	683,

684, 710, 712, 714, 715, 717 až 719, 723 až 734, 736, 740 až 750, 752, 754, 755, 766 až 772, 777 až 785 nebo 789 až 791, nebo polypeptidové sekvence zakódované polynukleotidovou sekvencí uvedené v SEQ ID NO: i _ag 111, 115 _ag 171, 173 až 175, 177, 179 až 305, 307 až 315, 326, 328, 330, 332 až 335, 340 až 375, 381, 382 a 384 až 476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 až 572, 587, 591, 593 až 606, 618 až 626, 630, 631, 634, 636, 639 až 655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720 až 722, 735, 737 až 739, 751, 753, 764, 765, 773 až 776 a 786 až 788.

Vynález se dále týká polynukleotidů, které kódují shora popsaný polypeptid, expresních vektorů, obsahujících takové polynukleotídy a hostitelských buněk transformovaných nebo transfektovaných takovými expresními vektory.

Vynález se také týká farmaceutických prostředků obsahujících polypeptid nebo polynukleotid shora popsaný a fyziologicky přijatelný nosič.

Vynález se odvozeně týká farmaceutických prostředků například vakcinových prostředků pro profylaktické nebo terapeutické použití. Takové prostředky obsahují obecně imunogenický polypeptid nebo polynukleotid podle vynálezu a imunostimulant, například adjuvant, spolu s fyziologicky přijatelným nosičem.

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků obsahujících Ca) protilátku nebo její fragment vázající antigen, které se specificky váží na polypeptid podle vynálezu nebo je6 ho fragment, Cb) fyziologicky přijatelný nosič.

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků obsahujících (a) antigen poskytující buňku, která expresuje polypeptid shora charakterizovaný, (b) farmarmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient. Příkladně se jako antigen prezentující buňky uvádějí dendritické buňky, makrofágy, monocyty, fibroblasty a B buňky.

Vynález se odvozeně týká farmaceutických prostředků, které obsahují Ca) antigen poskytující buňku, která expresuje polypeptid shora charakterizovaný a Cb) imunostimulant.

Vynález se dále týká fúzovaných proteinů, které obsahují alespoň jeden shora charakterizovaný polypeptid jakož také polynukleotidy kódující takové fúzní proteiny, zpravidla ve formě farmaceutických prostředků, například vakclnových prostředků, obsahujících fyziologicky přijatelný nosič a/nebo imunostimulant. Fúzní proteiny mohou obsahovat několik imunogeniekých polypeptidů nebo jejich porcí/variant, jak shora popsáno, a mohou dále obsahovat jeden nebo několik polypeptidových segmentů pro usnadnění a/nebo podporu exprese, čistění a/nebo imunogenicity polypeptidů nebo polypeptidů.

Vynález se také týká způsobu stimulace imunitní odezvy pacienta zvláště odezvy T buněk lidského pacienta, pří kterém se podává farmaceutický prostředek podle vynálezu. Pacient může být postižen rakovinou prostaty, přičemž se způsob týká přímého ošetřování nemoci nebo prevence v případě pacientů, kteří by touto nemocí mohli být ohroženi.

Vynález se také týká způsobu Inhibice vývoje rakoviny u pacienta, při kterém se podává pacientovi farmaceutický prostředek podle vynálezu. Pacient může být postižen rakovinou prostaty, přičemž se způsob týká přímého ošetřování nemoci ne7 bo prevence v případě pacientů, kteří by touto nemocí mohli být ohroženi.

Vynález se také týká způsobu pro odstraňování nádorových buněk z biologických vzorků, při kterém se uvádí do styku biologický vzorek obsahující T buňky, které reagují specificky s polypeptidem podle vynálezu, přičemž uvádění do styku se provádí za podmínek a po dostatečnou dobu k umožnění odstranění buněk expresujících polypeptid ze vzorku.

Vynález se také týká způsobu inhibice rozvoje rakoviny u pacientů, při kterém se podává pacientům shora popsaný biologický vzorek.

Vynález se také týká způsobu stimulace a/nebo expandování T buněk specifických pro polypeptid podle vynálezu, při kterém se uvádějí do styku T buňky s jedním nebo s několika činiteli ze souboru zahrnujícího Ci) shora popsaný polypeptid, Cii) polynukleotid kódující tento polypeptid a Clil) antigen poskytující buňka, která expresuje takový polypeptid, za podmínek a po dostatečnou dobu k umožnění stimulace a/nebo odpanze T buněk. Vynález se také týká izolovaných T buněčných populací obsahujících T buňky, připravených shora popsaným způsobem.

Vynález se také týká způsobu inhibice vývoje rakoviny, při kterém se podává pacientovi účinné množství shora popsané populace T buněk.

Vynález se také týká způsobu inhibice vývoje rakoviny, který zahrnuje následující stupně: Ca) inkubaci CD4·*· a/nebo CD8⁺ T buněk, izolovaných od pacientů vykazujících jeden nebo několik členů ze souboru zahrnujícího (i) polypeptid obsahující alespoň jednu imunogenickou porci polypeptidu podle vynálezu, Cii) polynukleotid kódující takový polypeptid, Ciii) anti8 gen poskytující buňku, která expresuje takový polypeptid a Cb) a podání pacientům účinného množství proliterovaných T buněk a tím zabránění vývoji rakoviny u pacienta. Proliterované buňky mohou být avšak nemusí být klonovány před podáním pacientovi.

Vynález se také týká způsobu stanovení existence nebo neexistence rakoviny, zvláště rakoviny prostaty u pacienta, při kterém se Ca) uvádí do styku biologický vzorek od pacienta s vázacím činidlem, které váže shora uvedený polypeptid, Cb) zjistuje se ve vzorku množství polypeptidu, které se váže na vázací činidlo a Cc) porovnává se množství polypeptidu s předem stanovenou hodnotou a tak se určí existence nebo neexistence rakoviny pacienta. Podle výhodného provedení je vázacím činidlem protilátka, ještě výhodněji monoklonální protilátka.

Vynález se také týká způsobů monitorování progrese rakoviny u pacienta. Takový způsob zahrnuje Ca) uvádění do styku biologického vzorku od pacienta nejdříve s vázacím činidlem, které váže shora uvedený polypeptid, Cb) zjištění ve vzorku množství polypeptidu, které se váže na vázací činidlo, Cc) opakování stupně Ca) a Cb) za použití biologického vzorku od pacienta po uplynutí doby a Cd) porovnání množství zjištěného polypeptidu ve stupni Cc) s množstvím polypeptidu ve stupni Cb) a z toho monitorovat progresi pacientovy rakoviny.

Vynález se také týká způsobu stanovení existence nebo neexistence rakoviny u pacienta, který zahrnuje Ca) uvádění do styku biologického vzorku od pacienta s o1igonukleotidem, který hybridizuje do polypeptidu podle vynálezu, Cb) zjištění ve vzorku množství polynukleotidu, s výhodou mRNA, který hybridizuje do oligonukleotidu a Cc) porovnání množství polynukleotidu, který hybridizuje do oligonukleotidu s předem stanovenou hodnotou a z toho stanovit existenci nebo neexistenci rakoviny u pacienta. Podle určitého provedení tohoto způsobu se množství mRNA stanovuje prostřednictvím palymerázového řetězce

- *·«»·>*>· *«HP>ť*»»f«^r» «*»»» ·· za použití například alespoň jednoho oligonukleotidového příměru, který hybridizuje do polynukleotidu podle vynálezu nebo do komplementu takového polynukleotidu. Podle jiného provedení se množství mRNA stanovuje hybridizační technikou za použití o1igonukleotidové sondy, která hybridizuje do polynukleotidu podle vynálezu nebo do komplementu takového polynukleotidu.

Podobně se vynález týká monitorování progrese rakoviny, při kterém se Ca) uvádí do styku biologický vzorek pacienta s oligonukleotidem, který hybridizuje do polynukleotidu podle vynálezu, Cb) zjišťuje se ve vzorku množství polynukleotidu, které hybridizuje do oligonukleotidu a Cc) opakuje se stupeň Ca) a Cb) za použití biologického vzorku pacienta po uplynutí doby a Cd) porovnává se množství zjištěného polynukleotidu ve stupni Cc) s množstvím polynukleotidu zjištěného ve stupni Cb) a z toho se monitoruje progrese pacientovy rakoviny.

Vynález se také týká protilátek, například monoklonálmích protilátek, které se vážou na polypeptid podle vynálezu a diagnostického kitu obsahujícího takové protilátky. Diagnostické kity obsahují alespoň jednu oligonukleotidovou sondu nebo primer shora popsaný.

Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis a výkresy.

Seznam obrázků na výkresech

Obr. 1 objasňuje schopnost T buněk zabíjet fibroblasty expresu jící reprezentativní polypeptid P502S, specifický pro prostatu, ve srovnání s kontrolními fibroblasty- Procento lýze se ukázáno jako série efektorfi: cílová dávka, jak naznačeno. Na ose x je poměr efektor=cíl, na ose y procento lýze.

Obr .

Obr.

A a 2B objasňuje schopnost T buněk rozpoznávat buňky expresu jící reprezentativní polypeptid P502S, specifický pro prostatu. V každém případě počet gama-interferonových skvrn je uveden pro odlišné počty responderfl. Na obr. 2A jsou uvedeny hodnoty pro fibroblasty pulzované s P2S-12 peptidem ve srovnání s fibroblasty pulzovanými s kontrolním E75 peptidem. Na obr. 2B jsou uvedeny hodnoty pro fibroblasty expresující P502S ve srovnání s fibroblasty expresujícími HER-2/neu. V obou případech je na ose x počet responderfl a na ose y počet gama-interferonových skvrn.

ukazuje zkoušku peptidové kompetitivní vazby dokládající, že PlSttlO peptid, odvozený od P5O1S, váže HLA-A2. Peptid PlSttlO inhibuje HLA-A2 omezenou prezentaci fluM58 peptidu do CTL klonu D15OM58 v TNF uvolňujícím biotestu. D15OM58 CTL je specifický pro HLA-A2 vázající matricový peptid fluM58 chřipky.

objasňuje schopnost T buněčných linií, generovaných z PlSttlO imunizované myši, ke specifické lýzy PlSttlOpulzovaných Jurkat A2Kb cílů a P501S trandsukovaných Jurkat A2Kb cílfl ve srovnání do EGFP-transdukováného Jurkat A2Kb. Procento lýze je ukázáno jako série poměrfl efektor^:cí1, jak naznačeno. Na ose x je poměr efektor: cíl, na ose y procento lýze.

objasňuje schopnost T buněčného klonu rozpoznávat a podrobovat specifické lyži Jurkat A2Kb buňky expresující reprezentativní polypeptid P5O1S specifický pro prostatu a tak doložit, že PlSttlO peptid může být přírodním epitopem P5O1S polypeptidu. Na ose x je frakce kultury, na ose y procento lýze.

Obr. 6A a 6B jsou diagramy objasňující specificitu CD8 buněčné

- 11 linie C3A-1) pro reprezentativní antigen specifický pro prostatu CP501S?. Obr 6A ukazuje výsledky testu uvolňování ⁵¹Cr. Procento specifické lýze je ukázáno jako série poměru efektor:cíl. Obr. 6B ukazuje produkci gamainterferonu 3A-1 buňkami stimulovanými autologově B-LCL transdukovanými P5O1S při uvedeném měněném poměru efektor:cíl. Na ose x je vždy poměr efektor:cíl, na ose y obr. 6A je procento specifické lýze, obr. 6B. ING gama skvrny.

Obr. 7 je Western blot ukazující expresi P501S v baculoviru.

Obr. 8 objassňuje výsledky epitopové mapovací studie P501S.

Obr. 9 schematicky znázorňuje P501S protein ukazující lokaci a transmembránových domén a předvídaných intracelulárních a extracelulárních domén.

Podtržené sekvence představují předpověděné transraembránové domény, tučně vytištěné sekvence představují předpověděné extracelulární domény a kurzivou vyznačené sekvence představují předpověděné intracelulární domény. Sekvence podtržená i tučně vytištěná je sekvencí použitou ke generování polyklonálního králičího séra. Ilmístění transmembránových domén bylo předpověděno za použití HHMTOP, který popsali Tusnady a Simon (Principles Governing Amino Acid Composition of Integrál Membráně Proteins: Application to Topology Prediction, J. Mol. Biol. 283, str 489 až 506, 1998j.

Obr. 10 je genomová mapa ukazujícící lokaci prostátových genů P775P, P704P, B305D, P712P a P774P v regionu Cat Eye

Syndrom chromosomu 22qll.2.

Obr. 11 ukazuje výsledky testu ELISA ke stanovení specificity králičího polyklonálního antiséra proti P501S. Na ose x je ng myšího polyklonálního séra a na ose y O.D. 450.

SEQ	ID	NO:	1	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	2	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	3	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	4	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	5	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	6	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	7	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	8	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	9	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	10	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	11	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	12	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	13	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	14	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	15	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	16	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	17	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	18	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	19	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	20	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	21	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	22	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	23	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	24	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	25	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	26	je	stanovená
SEQ	ID	ΝΟ-	27	je	stanovená
SEQ	ID	ΝΟ:	28	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	29	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	30	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	31	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	32	je	stanovená
SEQ	ID	NO:	33	je	stanovená

cDNA sekvence pro Fl-13.

3'	cDNA	sekvence	pro	Fl-12.
5'	cDNA	sekvence	pro	Fl-12.
3'	cDNA	sekvence	pro	Fl-16.
3'	cDNA	sekvence	pro	Hl-1.
3'	cDNA	sekvence	pro	Hl-9.
3'	cDNA	sekvence	pro	Hl-4.
3'	cDNA	sekvence	pro	Jl-17.
5'	cDNA	sekvence	pro	Jl-17.
3^J	cDNA	sekvence	pro	Ll-12.
5'	cDNA	sekvence	pro	Ll-12-
3’	cDNA	sekvence	pro	Nl-1862
5’	cDNA	sekvence	pro	Nl-1862
3'	cDNA	sekvence	pro	Jl-13.
5'	cDNA	sekvence	pro	Jl-13.
3'	cDNA	sekvence	pro	Jl-19.
5'	cDNA	sekvence	pro	Jl-19.
3'	cDNA	sekvence	pro	Jl-25.
5'	cDNA	sekvence	pro	Jl-25.
5^J	cDNA	sekvence	pro	Jl-24.
3'	cDNA	sekvence	pro	Jl-24.
5'	cDNA	sekvence	pro	Kl-58.
3'	cDNA	sekvence	pro	Kl-58.
5'	cDNA	sekvence	pro	K1-63-
3’	cDNA	sekvence	pro	Kl-63-
5'	cDNA	sekvence	pro	Ll-4.
3'	cDNA	sekvence	pro	Ll-4.
5'	cDNA	sekvence	pro	Ll-14.
3’	cDNA	sekvence	pro	Ll-14.
3'	cDNA	sekvence	pro	Jl-12.
3'	cDNA	sekvence	pro	Jl-16.
3'	cDNA	sekvence	pro	Jl-21-
3’	cDNA	sekvence	pro	Kl-48.

SEQ	ID	NO:	34	je stanovená	3' cDNA sekvence pro Kl-55.
SEQ	ID	NO:	35	je stanovená	3’ cDNA sekvence pro LI-2.
SEQ	ID	NO:	36	je stanovená	3^J cDNA sekvence pro Ll-6.
SEQ	ID	NO:	37	je stanovená	3' cDNA sekvence pro Nl-1858.
SEQ	ID	NO:	38	je stanovená	3' cDNA sekvence pro Nl-1860.
SEQ	ID	NO:	39	je stanovená	3' cDNA sekvence pro NI-1861.
SEQ	ID	NO:	40	je stanovená	3' cDNA sekvence pro Nl-1864.
SEQ	ID	NO:	41	je stanovená	cDNA sekvence pro P5.
SEQ	ID	NO:	42	je stanovená	cDNA sekvence pro P8.
SEQ	ID	NO:	43	je stanovená	cDNA sekvence pro P9.
SEQ	ID	NO:	44	je stanovená	cDNA sekvence pro P18.
SEQ	ID	NO:	45	je stanovená	cDNA sekvence pro P20.
SEQ	ID	NO:	46	je stanovená	cDNA sekvence pro P29.
SEQ	ID	NO:	47	je stanovená	cDNA sekvence pro P30.
SEQ	ID	NO:	48	je stanovená	cDNA sekvence pro P34.
SEQ	ID	NO:	49	je stanovená	cDNA sekvence pro P36.
SEQ	ID	NO:	50	je stanovená	cDNA sekvence pro P38.
SEQ	ID	NO:	51	je stanovená	cDNA sekvence pro P39.
SEQ	ID	NO:	52	je stanovená	cDNA sekvence pro P42.
SEQ	ID	NO:	53	je stanovená	cDNA sekvence pro P47.
SEQ	ID	NO:	54	je stanovená	cDNA sekvence pro P49.
SEQ	ID	NO:	55	je stanovená	cDNA sekvence pro P5Q.
SEQ	ID	NO^:	56	je stanovená	cDNA sekvence pro P53.
SEQ	ID	NO:	57	je stanovená	cDNA sekvence pro P55.
SEQ	ID	NO:	58	je stanovená	cDNA sekvence pro P60.
SEQ	ID	NO:	59	je stanovená	cDNA sekvence pro P64.
SEQ	ID	NO:	60	je stanovená	cDNA sekvence pro P65-
SEQ	ID	NO:	61	je stanovená	cDNA sekvence pro P73.
SEQ	ID	NO:	62	je stanovená	cDNA sekvence pro P75.
SEQ	ID	NO:	63	je stanovená	cDNA sekvence pro P76.
SEQ	ID	NO:	64	je stanovená	cDNA sekvence pro P79.
SEQ	ID	NO:	65	je stanovená	cDNA sekvence pro P84.
SEQ	ID	NO:	66	je stanovená	cDNA sekvence pro P68.
SEQ	ID	NO:	67	je stanovená	cDNA sekvence pro P8Q (označováno

také jako P704P).

SEQ	ID	NO:	68	je stanovená cDNA sekvence pro P82.
SEQ	ID	NO:	69	je stanovená cDNA sekvence pro Ul-3064.
SEQ	ID	NO:	70	je stanovená cDNA sekvence pro Ul-3065.
SEQ	ID	NO:	71	je stanovená cDNA sekvence pro Vl-3692.
SEQ	ID	NO:	72	je stanovená cDNA sekvence pro 1A-3905.
SEQ	ID	NO:	73	je stanovená cDNA sekvence pro Vl-3686.
SEQ	ID	NO:	74	je stanovená cDNA sekvence pro Rl-2330.
SEQ	ID	NO:	75	je stanovená cDNA sekvence pro 18-3976.
SEQ	ID	NO:	76	je stanovená cDNA sekvence pro VI-3679.
SEQ	ID	NO:	77	je stanovená cDNA sekvence pro 10-4736-
SEQ	ID	NO:	78	je stanovená cDNA sekvence pro 1G-4738.
SEQ	ID	NO:	79	je stanovená cDNA sekvence pro 1G-4741.
SEQ	ID	NO:	80	je stanovená cDNA sekvence pro 1G-4744-
SEQ	ID	NO:	81	je stanovená cDNA sekvence pro 1G-4734.
SEQ	ID	NO:	82	je stanovená cDNA sekvence pro 1H-4774.
SEQ	ID	NO:	83	je stanovená cDNA sekvence pro 1H-4781.
SEQ	ID	NO:	84	je stanovená cDNA sekvence pro 1H-4785.
SEQ	ID	NO:	85	je stanovená cDNA sekvence pro 1H-4787.
SEQ	ID	NO:	86	je stanovená cDNA sekvence pro 1H-4796.
SEQ	ID	NO:	87	je stanovená cDNA sekvence pro 11-4807.
SEQ	ID	NO:	88	je stanovená cDNA sekvence pro 11-4810.
SEQ	ID	NO:	89	je stanovená cDNA sekvence pro 11-4811.
SEQ	ID	NO:	90	je stanovená cDNA sekvence pro 1J-4876-
SEQ	ID	NO:	91	je stanovená cDNA sekvence pro 1K-4884.
SEQ	ID	NO:	92	je stanovená cDNA sekvence pro 1K-4896.
SEQ	ID	NO:	93	je stanovená cDNA sekvence pro 1G-4761.
SEQ	ID	NO:	94	je stanovená cDNA sekvence pro 16-4762.
SEQ	ID	NO:	95	je stanovená cDNA sekvence pro 1H-4766.
SEQ	ID	NO:	96	je stanovená cDNA sekvence pro 1H-4770.
SEQ	ID	NO:	97	je stanovená cDNA sekvence pro 1H-4771.
SEQ	ID	NO:	98	je stanovená cDNA sekvence pro 1H-4772.
SEQ	ID	NO:	99	je stanovená cDNA sekvence pro 1D-4297.
SEQ	ID	NO:	100	je stanovená cDNA sekvence pro 1D-4309.
SEQ	ID	NO:	101	je stanovená cDNA sekvence pro ID.1-4278.
SEQ	ID	NO:	102	je stanovená cDNA sekvence pro 1D-4288.

¹⁵

SEQ	ID	NO:	103	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	1D-4283.
SEQ	ID	NO:	104	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	ID-4304.
SEQ	ID	NO:	105	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	1D-4296.
SEQ	ID	NO:	106	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	1D-4280.
SEQ	ID	NO:	107	je	stanovená	plné	délky cDNA i	sekvence

Fl-12 (označováno také jako P504S).

SEQ ID NO: 108 je předpověděná aminokyselinová sekvence pro

Fl-12.

SEQ ID N0= 109 je stanovená plné délky cDNA sekvence pro Jl-17. SEQ ID NO; no je stanovená plné délky cDNA sekvence pro Ll-12.

označováno také jako P501S).

SEQ ID NO: ni je stanovená plné délky cDNA sekvence pro Nl-1862 (označováno také jako P503S).

SEQ ID NO: 112 je předpověděná aminokyselinová sekvence pro Jl-17.

SEQ ID NO: lig je předpověděná aminokyselinová sekvence pro Ll-12 (označováno také jako P501S).

SEQ ID NO: 114 je předpověděná aminokyselinová sekvence pro Nl-1862 (označováno také jako P503S).

SEQ	ID	NO:	115	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P89-
SEQ	ID	NO:	116	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P90.
SEQ	ID	NO:	117	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P92.
SEQ	ID	NO:	118	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P95.
SEQ	ID	NO:	119	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P98.
SEQ	ID	NO:	120	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P102-
SEQ	ID	NO:	121	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P110.
SEQ	ID	NO:	122	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	Plil.
SEQ	ID	NO:	123	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P114.
SEQ	ID	NO:	124	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P115.
SEQ	ID	NO:	125	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P116.
SEQ	ID	NO:	126	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P124.
SEQ	ID	N0-‘	127	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P126.
SEQ	ID	NO:	128	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P130.
SEQ	ID	NO:	129	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P133-
SEQ	ID	NO:	130	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P138.

SEQ	ID	NO:	131	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P143.
SEQ	ID	NO:	132	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P151.
SEQ	ID	NO:	133	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P156.
SEQ	ID	NO:	134	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P157.
SEQ	ID	NO:	135	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P166.
SEQ	ID	NO:	136	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P176.
SEQ	ID	NO:	137	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P178.
SEQ	ID	NO:	138	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P179.
SEQ	ID	NO:	139	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P185.
SEQ	ID	NO:	140	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P192.
SEQ	ID	NO:	141	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P201-
SEQ	ID	NO:	142	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P204.
SEQ	ID	NO:	143	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P208.
SEQ	ID	NO:	144	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P211.
SEQ	ID	NO:	145	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P213.
SEQ	ID	NO:	146	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P219.
SEQ	ID	NO:	147	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P237.
SEQ	ID	NO:	148	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P239.
SEQ	ID	NO:	149	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P248
SEQ	ID	NO:	150	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P251.
SEQ	ID	NO:	151	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P255.
SEQ	ID	NO:	152	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P256.
SEQ	ID	NO:	153	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P259.
SEQ	ID	NO:	154	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P260-
SEQ	ID	NO:	155	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P263.
SEQ	ID	NO:	156	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P264.
SEQ	ID	NO:	157	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P266.
SEQ	ID	NO:	158	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P270.
SEQ	ID	NO:	159	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P272.
SEQ	ID	NO:	160	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P27.8.
SEQ	ID	NO:	161	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P105.
SEQ	ID	NO:	162	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P107.
SEQ	ID	NO:	163	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P137.
SEQ	ID	NO:	164	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P194.
SEQ	ID	NO:	165	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	PÍ 95.

- ,17 -

SEQ	ID	NO:	166	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P196.
SEQ	ID	NO:	167	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P220.
SEQ	ID	NO:	168	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P234.
SEQ	ID	NO:	169	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P235.
SEQ	ID	NO:	170	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P243.
SEQ	ID	NO:	171	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P703P-DE1.

SEQ ID NO-' 172 je předpověděná aminokyselinová sekvence pro P703P-DE1.

SEQ ID	NO:	173	je	stanovená cDNA sekvence pro	P703P-DE2.
SEQ ID	NO:	174	je	stanovená cDNA sekvence pro	P703P-DE6.
SEQ IĎ	NO:	175	je	stanovená cDNA sekvence pro	P703P-DE13.
SEQ ID	NO:	176	je	předpověděná am i nokyse1 i nová	sekvence pro
P703P-	DE13-
SEQ ID	NO-'	177	je	stanovená cDNA sekvence pro	P703P-DE14.
SEQ ID	NO:	178	je	předpověděná aminokyselinová	sekvence pro

P703P-DE14SEQ ID NO: 179 je stanovená prodloužená sekvence pro 16-4736. SEQ ID N0^: 180 je stanovená prodloužená cDNA sekvence pro

16-4738

SEQ ID NO: 181 je stanovená prodloužená cDNA sekvence pro 16-4741

SEQ ID N0- 182 je stanovená prodloužená cDNA sekvence pro

10- 4744

SEQ ID NO: 183 je stanovená prodloužená cDNA sekvence pro 1H-4774

SEQ ID NO: 184 je stanovená prodloužená cDNA sekvence pro 1H-4781

SEQ ID NO: 185 je stanovená prodloužená cDNA sekvence pro 1H-4785

SEQ ID NO: 186 je stanovená prodloužená cDNA sekvence pro 1H-4787

SEQ ID NO: 187 je stanovená prodloužená cDNA sekvence pro 1H-4796

SEQ ID N0^: 188 je stanovená prodloužená cDNA sekvence pro

11- 4807

SEQ ID NO:	189 je	stanovená 3* cDNA sekvence pro 11-4810.
SEQ ID NO:	190 je	stanovená 3' cDNA sekvence pro 11-4811.
SEQ ID NO:	191 je	stanovená prodloužená cDNA sekvence pro
1J-4876-
SEQ ID NO: 1K-4884.	192 je	stanovená prodloužená cDNA sekvence pro
SEQ ID NO:	193 je	stanovená prodloužená cDNA sekvence pro
1K-4896.
SEQ ID NO:	194 je	stanovená prodloužená cDNA sekvence pro
1G-4761.
SEQ ID NO:	195 je	stanovená prodloužená cDNA sekvence pro
1G-4762.
SEQ ID NO:	196 je	stanovená prodloužená cDNA sekvence pro
1H-4766.
SEQ ID NO:	197 je	stanovená 3'cDNA sekvence pro 1H-4770.
SEQ ID NO:	198 je	stanovená 3'cDNA sekvence pro 1H-4771.
SEQ ID NO:	199 je	stanovená prodloužená cDNA sekvence pro
1H-4772.
SEQ ID NO:	200 je	stanovená prodloužená cDNA sekvence pro
1D-4309.
SEQ ID NO:	201 je	stanovená prodloužená cDNA sekvence pro

ID.1-4278.

SEQ ID NO: ID-4288.	202	je stanovená	prodloužená	cDNA sekvence pro
SEQ ID NO:	203	je stanovená	prodloužená	cDNA sekvence pro
1D-4283.
SEQ ID NO:	204	je stanovená	prod1oužená	cDNA sekvence pro
1D-4304.
SEQ ID NO:	205	je stanovená	prod1oužená	cDNA sekvence pro
1D-4296.
SEQ ID NO:	206	je stanovená	prodloužená	cDNA sekvence pro
1D-4280.
SEQ ID NO:	207	je stanovená	cDNA sekvence pro 10-d8fwd.
SEQ ID NO:	208	je stanovená	cDNA sekvence pro 10-10H10con.
SEQ ID NO:	209	je stanovená	cDNA sekvence pro ll-C8rev.

*Γ^;*<^^·«^χ·^:ίί4^*ίίίί.ΐ^ί'**ϊίώΐ'-Μ :->*.??>-'>:« ishn-i <..-:·

SEQ	ID	NO:	210	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	7.g6fwd.
SEQ	ID	NO:	211	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	7.g6rev.
SEQ	ID	NO:	212	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	8-b5fvd.
SEQ	ID	NO:	213	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	8-b5rev.
SEQ	ID	NO:	214	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	8-b6fvd.
SEQ	ID	NO:	215	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	8-b6rev.
SEQ	ID	NO:	216	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	8-d4fwd.
SEQ	ID	NO:	217	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	8-d9rev.
SEQ	ID	NO:	218	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	8-g3fwd.
SEQ	ID	NO:	219	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	8-g3rev.
SEQ	ID	NO:	220	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	8-hllrev
SEQ	ID	NO:	221	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	g-f!2fwd
SEQ	ID	NO:	222	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	g-f3řev.
SEQ	ID	NO:	223	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P509S-
SEQ	ID	NO:	224	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P510S-
SEQ	ID	NO:	225	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P703DE5.
SEQ	ID	NO:	226	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	9-A11-.
SEQ	ID	NO:	227	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	8-C6.
SEQ	ID	NO:	228	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	8-H7-
SEQ	ID	NO:	229	Ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN13.
SEQ	ID	NO:	230	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN14
SEQ	ID	NO:	231	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN23.
SEQ	ID	NO:	232	Ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN24.
SEQ	ID	NO:	233	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN25.
SEQ	ID	NO:	234	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN3O.
SEQ	ID	NO:	235	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN34.
SEQ	ID	NO:	236	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN35.
SEQ	ID	NO:	237	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN36.
SEQ	ID	NO’-	238	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN38.
SEQ	ID	NO:	239	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN39.
SEQ	ID	NO:	240	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN40.
SEQ	ID	NO:	241	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN41.
SEQ	ID	NO:	242	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN42.
SEQ	ID	NO:	243	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN45.
SEQ	ID	NO:	244	ie	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN46.

SEQ	ID	NO:	245	le	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN51.
SEQ	ID	NO:	246	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN56.
SEQ	ID	NO:	247	Je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN64.
SEQ	ID	NO:	248	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN65.
SEQ	ID	NO:	249	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN67.
SEQ	ID	NQ:	250	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN76
SEQ	ID	NO:	251	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN84.
SEQ	ID	NO:	252	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN85-
SEQ	ID	NO:	253	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN86.
SEQ	ID	NO:	254	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN87.
SEQ	ID	NO:	255	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JPTPN88.
SEQ	ID	N0--	256	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1F1-
SEQ	ID	NO:	257	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1F2-
SEQ	ID	NO:	258	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1C2.
SEQ	ID	NO:	259	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1B1.
SEQ	ID	NO:	260	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1B2.
SEQ	ID	NO:	261	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1D3.
SEQ	ID	NO:	262	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1A4-
SEQ	ID	NO:	263	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1F5.
SEQ	ID	NO:	264	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1E6:
SEQ	ID	NO:	265	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1D6.
SEQ	ID	N0^:	266	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1B5.
SEQ	ID	NO:	267	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1A6-
SEQ	ID	NO:	268	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1E8.
SEQ	ID	NO:	269	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1D7.
SEQ	ID	NO:	270	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1D9.
SEQ	ID	NO:	271	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1C10.
SEQ	ID	NO:	272	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1A9.
SEQ	ID	NO:	273	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1F12
SEQ	ID	NO:	274	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1E12.
SEQ	ID	NO:	275	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1D11.
SEQ	ID	NO:	276	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1C11.
SEQ	ID	NO:	277	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1C12.
SEQ	ID	NO:	278	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1B12.
SEQ	ID	NO:	279	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP1A12.

-,21 -

SEQ	ID	NQ:	280	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8G2.
SEQ	ID	NO:	281	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8H1.
SEQ	ID	NO:	282	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8H2.
SEQ	ID	NO:	283	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8A3.
SEQ	ID	NO:	284	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8A4.
SEQ	ID	NO:	285	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8C3.
SEQ	ID	NO:	286	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8G4-
SEQ	ID	NO:	287	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8B6.
SEQ	ID	NO:	288	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8D6.
SEQ	ID	NO:	289	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8F5.
SEQ	ID	NO:	290	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8A8.
SEQ	ID	NO:	291	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8C7.
SEQ	ID	NO:	292	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8D7.
SEQ	ID	NO:	293	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8D8.
SEQ	ID	NO:	294	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8E7.
SEQ	ID	NO:	295	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8F8.
SEQ	ID	NO:	296	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8G8.
SEQ	ID	NO:	297	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8B10.
SEQ	ID	NO:	298	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8C1Q.
SEQ	ID	NO:	299	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8E9.
SEQ	ID	NO:	300	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8E10-
SEQ	ID	NO:	301	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8F9.
SEQ	ID	NO:	302	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8H9.
SEQ	ID	NO:	303	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8C12.
SEQ	ID	NO:	304	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8E11.
SEQ	ID	NO:	305	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	JP8E12.
SEQ	ID	NO:	306	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	PS2#12.
SEQ	ID	NO:	307	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P711P.
SEQ	ID	NO:	308	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P712P.
SEQ	ID	NO:	309	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	CL0NE23.
SEQ	ID	NO:	310	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P774P.
SEQ	ID	NO:	311	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P775P.
SEQ	ID	NO:	312	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P715P.
SEQ	ID	NO:	313	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P710P.
SEQ	ID	NO:	314	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P767P.

SEQ	ID	NO:	315	je stanovená	cDNA	sekvence	pro	P768P.
SEQ	ID	NO-'	316	až 325 jsou stanovené cDNA	sekvence pro
dříve izolované geny.
SEQ	ID	NO:	326	je stanovená	cDNA	sekvence	pro	P703PDE5.
SEQ	ID	NO:	327	je stanovená	cDNA	sekvence	pro	P703PDE5.
SEQ	ID	NO:	328	je stanovená	cDNA	sekvence	pro	P703P6.26.
SEQ	ID	NO:	329	je stanovená	cDNA	sekvence	pro	P703P6.26.
SEQ	ID	NO:	330	je stanovená	cDNA	sekvence	pro	P703PX-23-
SEQ	ID	NO:	331	je stanovená	cDNA	sekvence	pro	P703PX-23.
SEQ	ID	NO:	332	je stanovená	plné	délky cDNA sekvence pro

P509S.

SEQ ID NO- 333 je stanovená prodloužená cDNA sekvence pro

P707P (označováno také jako 11-C9).

SEQ ID	NO:	334	je	stanovená	cDNA	sekvence pro	P714P.
SEQ ID	NO:	335	je	stanovená	cDNA	sekvence pro	P705P.
SEQ ID	NO:	336	je	stanovená	cDNA	sekvence pro	P705P
(označováno také jako 9-F3).
SEQ ID	NO:	337	je	stanovená	cDNA	sekvence pro	P1S#1O-
SEQ ID	NO:	338	je	aminokyselinová sekvence peptidu p5.
SEQ ID	NO:	339	je	předpověděná aminokyselinová sekvence P509S
SEQ ID	NO:	340	je	stanovená	cDNA	sekvence pro	P778P.
SEQ ID	NO:	341	je	stanovená	cDNA	sekvence pro	P786P.
SEQ ID	NO:	342	je	stanovená	cDNA	sekvence pro	P789P.
SEQ ID	NO:	343	je	stanovená	cDNA	sekvence pro	klón vykazuj ící
homologi i	ke	Homo sapiens	MM46	mRNA.
SEQ ID	NO:	344	je	stanovená	cDNA	sekvence pro	klón vykazující
homologi i	ke	Homo sapiens	THF-alfa stimulovaný ABC protein
(ABC50) mRNA
SEQ ID	NO:	345	je	stanovená	cDNA	sekvence pro	k1ón vykazu jící
homologi i	ke	Homo sapiens	mRNA	pro E-cadherin.
SEQ ID	NO:	346	je	stanovená	cDNA	sekvence pro	klón vykazující

homologii k lidské nukleárně kódované mitochondriální serinové hydroxymethy1transferáze (SHMT).

SEQ ID NQ^: 347 je stanovená cDNA sekvence pro klón vykazující homologii ke Homo sapiens přírodnímu resistancí asociovanému íÍíj^WsiíSS^řší makrofágovému proteinu2 (NRAMP25.

SEQ ID NO: 348 je stanovená cDNA sekvence pro klon vykazující homologii ke Homo sapiens fosfoglukomutázoodvozenému proteinu CPGMRP).

SEQ ID NO: 349 je stanovená cDNA sekvence pro klón vykazující homologii k lidské mRNA pro proteosomovou subjednotku p40.

SEQ	ID	NO:	350	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P777P.
SEQ	ID	NO:	351	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P779P.
SEQ	ID	NO:	352	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P790P.
SEQ	ID	NO:	353	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P784P.
SEQ	ID	NO:	354	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P776P.
SEQ	ID	NO:	355	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P780P.
SEQ	ID	NO:	356	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P544P.
SEQ	ID	NO:	357	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P745P.
SEQ	ID	NO:	358	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P782P.
SEQ	ID	NO:	359	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P783P.
SEQ	ID	NO:	360	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	neznámý	17984.
SEQ	ID	NO:	361	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P787P.
SEQ	ID	NO:	362	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P787P.
SEQ	ID	NO:	363	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	neznámý	17994.
SEQ	ID	NO:	364	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P781P.
SEQ	ID	NO:	365	je	stanovená	cDNA	sekvence	pro	P785P.
SEQ	ID	NO:	366	až	375 jsou stanovené cDNA	sekvence pro

sestřihovou variantu B3O5D.

SEQ ID NO= 376 je předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID N0= 366.

SEQ ID NO: 377 je předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID N0= 372.

SEQ ID NO: 378 je předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID NO: 373.

SEQ ID NO: 379 je předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID N0= 374.

SEQ ID NO: 380 je předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID N0= 375.

SEQ ID NO: 381 je stanovená cDNA sekvence pro B716P.

- 24 SEQ ID NO:

P711P. SEQ ID NO:

P711P. SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO- SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO

PDEF.

SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NOSEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NOSEQ ID NO: SEQ ID NO:

P1020C}SEQ ID NO: SEQ ID NO^;SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:

382 je stanovená plné délky cDNA sekvence pro

383 je předpověděná aminokyselinová sekvence pro

384	je	cDNA sekvence pro P1000C.
385	je	cDNA sekvence pro CGI-82.
386	je	cDNA sekvence pro 23320.
387	je	cDNA sekvence pro CGI-69.
388	je	cDNA sekvence pro L-idl t-ol-2-dehydrogenázu
389	je	cDNA sekvence pro 23379.
390	je	cDNA sekvence pro 23381.
391	je	cDNA sekvence pro KIAA0122.
392	je	cDNA sekvence pro 23399.
393	je	cDNA sekvence pro dříve izolovaný gen.
394	je	cDNA sekvence pro HCLBP.
395	je	cDNA sekvence pro transglutaminázu.
396	je	cDNA sekvence pro dříve izolovaný gen.
397	je	cDNA sekvence pro PAP.
398	i je cDNA sekvence pro Ets transkripění fakti
399	je	cDNA sekvence pro hTGR.
400	je	cDNA sekvence pro KIAA0295.
401	je	cDNA sekvence pro 22545.
402	je	cDNA sekvence pro 22547.
403	je	cDNA sekvence pro 22548.
404	je	cDNA sekvence pro 22550.
405	je	cDNA sekvence pro 22551.
406	je	cDNA sekvence pro 22552.
407	je	cDNA sekvence pro 22553 Cznámá také jako
408	je	cDNA sekvence pro 22558.
409	je	cDNA sekvence pro 22562.
410	je	cDNA sekvence pro 22565.
411	je	cDNA sekvence pro 22567.
412	je	cDNA sekvence pro 22568-

SEQ	ID	NO:	413	je	cDNA	sekvence	pro	22570.
SEQ	ID	NO:	414	je	cDNA	sekvence	pro	22571.
SEQ	ID	NO:	415	je	cDNA	sekvence	pro	22572.
SEQ	ID	NO:	416	je	cDNA	sekvence	pro	22573.
SEQ	ID	NO:	417	je	cDNA	sekvence	pro	22573.
SEQ	ID	NO:	418	je	cDNA	sekvence	pro	22575.
SEQ	ID	NO:	419	je	cDNA	sekvence	pro	22580.
SEQ	ID	NO:	420	je	cDNA	sekvence	pro	22581.
SEQ	ID	NO:	421	je	cDNA	sekvence	pro	22582.
SEQ	ID	NO:	422	je	cDNA	sekvence	pro	22583.
SEQ	ID	NO:	423	je	cDNA	sekvence	pro	22584.
SEQ	ID	NO:	424	je	cDNA	sekvence	pro	22585.
SEQ	ID	NO:	425	je	cDNA	sekvence	pro	22586.
SEQ	ID	NO:	426	je	cDNA	sekvence	pro	22587.
SEQ	ID	NO:	427	je	cDNA	sekvence	pro	22588.
SEQ	ID	NO:	428	je	cDNA	sekvence	pro	22589.
SEQ	ID	NO:	429	je	cDNA	sekvence	pro	22590.
SEQ	II)	NO:	430	je	cDNA	sekvence	pro	22591.
SEQ	ID	NO:	431	je	cDNA	sekvence	pro	22592.
SEQ	ID	NO:	432	je	cDNA	sekvence	pro	22593.
SEQ	ID	NO:	433	je	cDNA	sekvence	pro	22594.
SEQ	ID	NO:	434	je	cDNA	sekvence	pro	22595.
SEQ	ID	NO:	435	je	cDNA	sekvence	pro	22596.
SEQ	ID	NO:	436	je	cDNA	sekvence	pro	22847.
SEQ	ID	NO =	437	je	cDNA	sekvence	pro	22848.
SEQ	ID	NO:	438	je	cDNA	sekvence	pro	22849.
SEQ	ID	NO:	439	je	cDNA	sekvence	pro	22851.
SEQ	ID	NO:	440	je	cDNA	sekvence	pro	22852.
SEQ	ID	NO:	441	je	cDNA	sekvence	pro	22853.
SEQ	ID	NO:	442	je	cDNA	sekvence	pro	22854.
SEQ	ID	NO:	443	je	cDNA	sekvence	pro	22855.
SEQ	ID	NO:	444	je	cDNA	sekvence	pro	22856.
SEQ	ID	NO:	445	je	cDNA	sekvence	pro	22857.
SEQ	ID	NO:	446	je	cDNA	sekvence	pro	23601.
SEQ	ID	NO:	447	je	cDNA	sekvence	pro	23602.

SEQ	ID	NO:	448	je	cDNA	sekvence	pro	23605.
SEQ	ID	NO:	449	je	cDNA	sekvence	pro	23606.
SEQ	ID	NO:	450	je	cDNA	sekvence	pro	23612.
SEQ	ID	NO:	451	je	cDNA	sekvence	pro	23614.
SEQ	ID	NO:	452	je	cDNA	sekvence	pro	23618.
SEQ	ID	NO:	453	je	cDNA	sekvence	pro	23622.
SEQ	ID	NO:	454	je	cDNA	sekvence	pro	f 01áthydrogenázu.
SEQ	ID	NO:	455	je	cDNA	sekvence	pro	LIM protein.
SEQ	ID	NO:	456	je	cDNA	sekvence	pro	známý gen.
SEQ	ID	NO:	457	je	cDNA	sekvence	pro	známý gen.
SEQ	ID	NO:	458	je	cDNA	sekvence	pro	dříve izolovaný gen.
SEQ	ID	NO :	459	je	cDNA	sekvence	pro	23045.
SEQ	ID	NO:	460	je	cDNA	sekvence	pro	23032.
SEQ	ID	NO:	461	je	cDNA	sekvence	pro	23054.
SEQ	ID	NO:	462	až	467	jsou cDNA	sekvence pro známé geny.
SEQ	ID	NO:	468	až	471	jsou cDNA	sekvence pro P710P.
SEQ	ID	NO:	472	je	cDNA	sekvence	pro	P1001C.

SEQ ID N0^: 473 jsou stanovená cDNA sekvence pro první sestřihovou variantu P775P (označovanou jako 27505).

SEQ ID NO - 474 jsou stanovená cDNA sekvence pro druhou sestřihovou variantu P775P (označovanou jako 19947).

SEQ ID N0^: 475 jsou stanovená cDNA sekvence pro třetí sestřihovou variantu P775P (označovanou jako 19941).

SEQ ID NO: 476 jsou stanovená cDNA sekvence pro čtvrtou sestřihovou variantu P775P (označovanou jako 19937).

SEQ ID NO: 477 je první předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID NO: 474.

SEQ ID NO: 478 je druhá předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID NO: 474.

SEQ ID N0^: 479 je předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID NO: 475.

SEQ ID NO: 480 je první předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID NO- 473.

SEQ ID NO: 481 je druhá předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID NO: 473- 27 SEQ ID NO: 482 je třetí předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID N0= 473.

SEQ ID NO: 483 je čtvrtá předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID N0= 473.

SEQ ID NO: 484 je prvních 30 aminokyselin M.tuberculosis	ant i
genu	Ral2.
SEQ ID	NO: 485 je PCR přiměř AV025.
SEQ ID	NO: 486 je PCR přiměř AV003.
SEQ ID	N0‘- 487 je PCR přiměř AV027.
SEQ ID	NO: 488 je PCR příměr AV026.
SEQ ID	NO: 489 až 501 jsou peptidy použité ve studii epitopo-
vého	mapování.
SEQ ID	NO: 502 je stanovená cDNA sekvence komplementarity	sta
novující region pro anti-P503S monoklonální protilátku	20D4
SEQ ID	NO: 503 je stanovená cDNA sekvence komplementarity	sta
novující region pro anti-P503S monoklonální protilátku	JA1.

SEQ ID NO: 504 a 505 jsou peptidy použité ve studii epit-opového mapování

SEQ ID NO: 506 je stanovená cDNA sekvence komplementarity stanovující region pro anti-P503P monoklonální protilátku 8H2.

SEQ ID NO: 507 je stanovená cDNA sekvence komplementarity stanovující region pro anti-P503P monoklonální protilátku 7H8.

SEQ ID NO: 508 je stanovená cDNA sekvence komplementarity stanovující region pro anti-P503P monoklonální protilátku 2D4.

SEQ ID NQ^: 509 až 522 jsou peptidy použité ve studii epitopového mapováníSEQ ID NO: 523 je zralá forma P703P použitá pro zvýšení protilátek proti P703P.

SEQ ID NO: 524 je domělá plné délky cDNA sekvence pro P703P.

SEQ ID NO: 525 je předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID NO: 524.

SEQ ID NO: 526 je plné délky cDNA sekvence pro P790P.

SEQ ID NO: 527 je předpověděná aminokyselinová sekvence pro 790P. SEQ ID NO: 528 a 529 jsou PCR primery.

SEQ ID NO: 530 je cDNA sekvence sestřihové varianty SEQ ID NO:

366.

SEQ ID NO: 531 je cDNA sekvence otevřeného čtecího rámce SEQ ID NO: 530.

SEQ ID N0^: 532 je předpověděná aminokyselinová sekvence kódo-
váná	sekvenc í	SEQ ID NO’- 531.
SEQ ID	NO-' 533	je cDNA sekvence domělé ORF P775P.
SEQ ID	NO: 534	je předpověděná aminokyselinová sekvence kódo-
váná	sekvenc í	SEQ ID NO·- 533.
SEQ ID	NO: 535	je první plné délky cDNA sekvence pro P510S.
SEQ ID	NO'- 536	je druhá plné délky cDNA sekvence pro P510S.
SEQ ID	NO: 537	je předpověděná aminokyselinová sekvence kódo-
váná	sekvenc í	SEQ ID NO: 535.
SEQ ID	NO: 538	je předpověděná aminokyselinová sekvence kódo-
váná	sekvenc í	SEQ ID NO: 536.
SEQ ID	NO: 539	je peptid P501S-370.
SEQ ID	NO: 540	je peptid P501S-376.
SEQ ID	NO: 541	je až 551 jsou epitopy P501S.
SEQ ID	NO- 552	je prodloužená cDNA sekvence pro P712P.
SEQ ID	NO: 553	až 568 je aminokyselinová sekvence kódovaná

předpověděným otevřeným čtecím rámcem v SEQ ID NO: 552.

SEQ ID NO:	569	je	prod1oužená	cDNA	sekvence	pro	P776P.
SEQ ID NO:	570	je	prodloužená	cDNA	sekvence	pro	sestřihovou
variantu	P776P,	označovanou	jako	contig 6.
SEQ ID N0--	571	je	prodloužená	cDNA	sekvence	pro	sestřihovou
variantu	P776P,	označovanou	jako	contig 7.
SEQ ID NO:	572	je	prodloužená	cDNA	sekvence	pro	sestřihovou

variantu P776P, označovanou jako contig 14.

SEQ ID NO: 573 j_e aminokyselinová sekvence kódovaná prvním předpověděným ORF sekvence SEQ ID NO: 570.

SEQ ID NO: 574 j_e aminokyselinová sekvence kódovaná druhým předpověděným ORF sekvence SEQ ID NO: 570.

SEQ ID NO: 575 je aminokyselinová sekvence kódovaná předpověděným ORF sekvence SEQ ID NO: 571.

SEQ ID NO: 576 až 586 je aminokyselinová sekvence kódovaná předpověděnými ORF sekvencemi SEQ ID N0= 569.

«?5ί*«^ί&®»ήίίί®ί4ΐί,ί5ί <·> «.

SEQ ID NQ: 587 je DNA konsenzová sekvence sekvencí P767P a P777P.

SEQ ID NQ: 588 až 590 jsou aminokyselinové sekvence kódované předpověděnou ORF sekvencí SEQ ID N0 = 587.

SEQ ID	NO:	591	je	prodloužená cDNA sekvence	pro P1020C.
SEQ ID	NO:	592	je	předpověděná aminokyselinová sekvence kódovaná
sekvencí	SEQ	ID	NO: P1020C.
SEQ ID	NO:	593	je	sestrihová varianta P775P	označovaná jako

50748.

SEQ ID	NO:	594	je	sestrihová	varianta	P775P	označovaná	jako
50717
SEQ ID	NO:	595	je	sestrihová	varianta	P775P	označovaná	jako
45985	-
SEQ ID	NO:	596	je	sestrihová	varianta	P775P	označovaná	jako

38769.

SEQ ID NO: 37922.	597 je	sestrihová	varianta P775P	označovaná	jako
SEQ ID NO:	598	je	sestrihová	varianta	P775P	označovaná	jako
49274.
SEQ ID NO:	599	je	sestrihová	varianta	P510S	označovaná	jako

39487.

SEQ ID NO: 5167.16.	600	je	sestrihová	varianta	P504S	označovaná	jako
SEQ ID NO: 5167.1.	601	je	sestrihová	varianta	P504S	označovaná	jako
SEQ ID NO: 5163.46.	602	je	sestrihová	varianta	P504S	označovaná	jako
SEQ ID NO: 5163.42.	603	je	sestrihová	varianta	P504S	označovaná	jako
SEQ ID NO: 5163.34.	604	je	sestrihová	varianta	P505S	označovaná	jako
SEQ ID NO: 5163.17.	605	je	sestrihová	varianta	P504S	označovaná	jako
SEQ ID NO:	606	je	sestřihová	varianta	P505S	označovaná	jako

10640.

SEQ ID NO: 607 až 615 jsou sekvence PCR prierfl.

SEQ ID N0^: 616 je stanovená cDNA sekvence pro fúzní P703P a PSA.

SEQ ID NO: 617 je aminokyselinová sekvence pro fúzní P703P a PSA.

SEQ ID NO: 618 je cDNA sekvence genu DD3.

SEQ ID NO: 619 je prodloužená cDNA sekvence pro P714P.

SEQ ID NO: 620 až 622 jsou sekvence cDNA sestřihových variant

P704P.

SEQ ID NO: 623 je	sekvence cDNA sestrihové	varianty	P553S
označovaná jako	P553S-14.
SEQ ID NO: 624 je	sekvence cDNA sestrihové	varianty	P553S
označovaná jako	P553S-12.
SEQ ID NO-' 625 je	sekvence cDNA sestrihové	varianty	P553S
označovaná jako	P553S-10.
SEQ ID NO: 626 je	sekvence cDNA sestrihové	varianty	P553S
označovaná jako	P553S-6.
SEQ ID NO: 627 je	am i nokyse1 i nová sekvence	kódovaná	sekvenc í

SEQ ID NO: 626.

SEQ ID NO:	628	je	první aminokyselinová	sekvence	kódovaná
sekvenc í	SEQ	ID	NO: 623.
SEQ ID NO:	629	je	druhá am i nokyse1 i nová	sekvence	kódovaná
sekvenc í	SEQ	ID	NO-' 623.
SEQ ID NO:	630	je	první plné délky cDNA	sekvence	pro gen spe

cifický pro prostátovou transglutaminázu (také označovaná jako P558S).

SEQ ID NO: 631 je druhá plné délky cDNA sekvence pro gen specifický pro prostatovou transglutaminázu

SEQ ID	NO:	632 je	am i nokyse1 i nová	sekvence	kódovaná	sekvenc í
SEQ	ID NO	: 630.
SEQ ID	NO:	633 je	am i nokyse1 i nová	sekvence	kódovaná	sekvenc í
SEQ	ID NO	: 631.
SEQ ID	NO:	634 je	plné délky cDNA	sekvence	pro P788P.
SEQ ID	NO-'	635 je	aminokyse1 inová	sekvence	kódovaná	sekvenc í
SEQ	ID NO	: 634.

SEQ ID NO: 636 je stanovená cDNA sekvence pro polymorfní variantu P788P.

SEQ ID NO: 637 je SEQ ID NO: 636.	aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí
SEQ ID NO:	638 je	aminokyselinová sekvence peptidu 4 z P703P.
SEQ ID NO:	639 je	aminokyselinová sekvence, která kóduje
peptid 4	z P7O3P.
SEQ ID NO:	640 až	655 jsou cDNA sekvence kódující epitopy P703P
SEQ ID NO:	656 až	671 jsou aminokyselinové sekvence epitopů

P703P.

SEQ ID NO: 672 až 673 jsou PCR příměry.

SEQ ID N0^; 674 je cDNA sekvence kódující N-koncovou porci P788P expresovanou v E.coli.

SEQ ID NO: 675 je cDNA sekvence kódující N-koncovou porci P788P expresovanou v E.coli.

SEQ ID NO: 676 je aminokyselinová sekvence M. tuberculosis ant-igenu Ral2.

SEQ ID N0^: 677 až 678 jsou PCR primery.

SEQ	ID	NO:	679	je	cDNA sekvence pro Ral2-P51OS-C konstrukt
SEQ	ID	NO:	680	je	cDNA sekvence pro P510S-C konstrukt.
SEQ	ID	NO:	681	je	cDNA sekvence pro P510S-E3 konstrukt.
SEQ	ID	NO:	682	je	aminokyselinová sekvence pro Ral2-P510S-

konstrukt.

SEQ ID NO: 683 je aminokyselinová sekvence pro P510S-C konstrukt.

SEQ ID NO: 684 je aminokyselinová sekvence pro P51OS-E3 konstrukt.

SEQ	ID	NO:	685	až	690 jsou PCR primery.
SEQ	ID	NO:	691	je	cDNA sekvence pro Ral2-P775P-	-0RF3	kostrukt.
SEQ	ID	NO:	692	je	aminokyselinová sekvence pro	Ral2	-P775P-0RF3

konstrukt.

SEQ ID NO: 693 a 694 jsou PCR primery.

SEQ ID NO^: 695 je stanovená aminokyselinová sekvence pro P7O3P His připojený fúzní protein (tag fusion protein).

SEQ ID NO: 696 je stanovená cDNA sekvence pro P7O3P His připo32 jený fúzní protein.

SEQ ID NO: 697 a 698 jsou PCR primery.

SEQ ID NO: 699 je stanovená aminokyselinová sekvence pro P7O5P His připojený fúzní protein.

SEQ ID NO: 700 je stanovená cDNA sekvence pro P705P His připojený fúzní protein.

SEQ ID NO: 701 a 702 jsou PCR primery.

SEQ ID NO-' 703 je stanovená aminokyselinová sekvence pro P711P His připojený fúzní protein.

SEQ ID NO: 704 je stanovená cDNA sekvence pro P711P His připojený fúzní protein.

SEQ ID NO: 705 je aminokyselinová sekvence M. tuberculosis antigenu Ral2.

SEQ ID NO-' 706 a 707 jsou PCR primery.

SEQ ID NO: 708 je stanovená cDNA sekvence pro Ral2-P501S-E2 konstrukt.

SEQ ID NO: 709 je stanovená aminokyselinová sekvence pro Ral2-P501S-E2 konstrukt.

SEQ	ID	NO:	710	je	aminokyselinová sekvence pro	epítop P501S.
SEQ	ID	NO:	711	je	DNA sekvence kódující SEQ ID	N0:710.
SEQ	ID	NO:	712	je	aminokyselinová sekvence pro	epitop P501S.
SEQ	ID	NO:	713	je	DNA sekvence kódující SEQ ID	N0:712.
SEQ	ID	NO:	714	je	peptid používaný ve studii mapování epitopu.
SEQ	ID	NO:	715	je	aminokyselinová sekvence pro	epitop P501S.
SEQ	ID	NO:	716	je	DNA sekvence kódující SEQ ID	N0^:715.
SEQ	ID	NO:	717	až	719 jsou aminokyselinová sekvence pro CD4
epitopy	P501S	1 .
SEQ	ID	NO:	720	až	722 jsou DNA sekvence kódující sekvence

SEQ ID NO: 717 až 719.

SEQ ID NO: 723 až 734 jsou aminokyselinové sekvence pro domělé

CTL epitopy P703P.

SEQ ID	NO:	735	je	plné délky cDNA	sekvence	pro P789P.
SEQ ID	NO:	736	je	aminokyselinová	sekvence	kódovaná SEQ
735.
SEQ ID	NO:	737	je	stanovená plné	délky cDNA	; sekvence pro

fe^:^fcSŘ!fcŠ<ÍMisiŠŮi«S(«V«i sestrihovou variantu P776P označovanou jako kontig 6.

SEQ ID NO: 738 až 739 jsou stanovené plné délky cDNA sekvence pro sestrihovou variantu P776P označovanou jako kontig 7.

SEQ ID NO: 74Q až 744 jsou aminokyselinové sekvence kódované

SEQ ID NO: 737.

SEQ ID NO’- 745 až 750 jsou aminokyselinové sekvence kódované sestrihovou variantou P776P označovanou jako kontig 7.

SEQ ID NO: 751 je plné délky cDNA sekvence pro lidský transmembránový proteázový serin 2.

SEQ ID NO: 752 je aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí SEQ ID NO: 751.

SEQ ID NO: 753 je cDNA sekvence kódující prvních 209 aminokyselin lidského transmembránového proteázového šeřinu 2.

SEQ ID NO-· 754 je prvních 209 aminokyselin lidského transmembránového proteázového šeřinu 2.

SEQ ID NO: 755 je aminokyselinová sekvence peptidu 296 až 322 P501S.

SEQ ID NO: 756 a 759 jsou PCR primery.

SEQ ID NO: 760 je stanovená cDNA sekvence Vb řetězce receptoru T buněk pro P50íS-specifický T buňkový klon 4E5.

SEQ ID NO: 761 je stanovená cDNA sekvence Va řetězce receptoru T buněk pro P501S-specifický T buňkový klon 4E5.

SEQ ID 760.	NO:	762	je	aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ	ID N0--
SEQ ID	NO:	763	je	aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ	ID NO:
761-
SEQ ID	NO:	764	je	plné délky otevřený čtecí rámec pro P768P

začleňující stop kodon.

SEQ ID NO: 765 je plné délky otevřený čtecí rámec pro P768P bez stop kodonu.

SEQ ID NO: 766 je aminokyselinová sekvence kódovaná SEQ ID N0= 765.

SEQ ID NO: 767 až 772 jsou aminokyselinové sekvence pro předpověděné domény P768P.

SEQ ID NO: 773 je plné délky cDNA sekvence P835P.

SEQ ID N0^: 774 je cDNA sekvence dříve identifikovaného klonu

FLJ13581.

SEQ ID NO: 775 je cDNA sekvence otevřeného čtecího rámce pro P835P se stop kodonem.

SEQ ID NO: 776 je cDNA sekvence otevřeného čtecího rámce pro P835P bez stop kodonu.

SEQ ID NO: 777 je plné délky aminokyselinová sekvence pro P835P SEQ ID NO: 778 až 785 jsou aminokyselinová sekvence extracelulárních a intracelulárních domén P835P.

SEQ ID NO: 786 je plné délky cDNA sekvence pro P1OOOC.

SEQ ID NO: 787 je cDNA sekvence otevřeného čtecího rámce pro P1OOOC včetně stop kodonu.

SEQ ID NO: 788 je cDNA sekvence otevřeného čtecího rámce pro P1OOOC bez stop kodonu.

SEQ ID NO: 789 je plné délky aminokyselinová sekvence pro

P1OOOC.

SEQ ID NO: 790 jsou aminokyseliny 1 až 100 SEQ ID NO: 789.

SEQ ID NO'- 791 jsou aminokysel iny 100 až 492 SEQ ID N0= 789.

SEQ ID NO: 792 je aminokyselinová sekvence a. prepro-P501S rekombinantního proteinu.

Vynález dále objasňuje podrobný popis.

Vynález je obecně zaměřen na prostředky a na jejich použití při terapii a diagnostice rakoviny, zvláště rakoviny prostaty. Jak bude dále objasněno, objasňující prostředky podle vynálezu obsahují, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, polypeptidy, zvláště imunogenické polypeptidy, polynukleotidy kódující takové polypeptidy, protilátky a jiná pojidlová činidla, antigen poskytující buňky (antigen presenting cells, SPC) a buňky imunního systému (například T buňky}.

Praxe vynálezu využívá, pokud není uvedeno jinak, běžné způsoby virologie, imunologie, mikrobiologie, molekulární biologie a rekombinantních DNA technik, známých pracovníkům v oboru, přičemž mnohé takové způsoby jsou níže popsány. Takové techniky jsou také plné vysvětleny v literatuře (například Sambrook a kol., Melecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, 1989; Maniatis a kol., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 1982; DNA Cloning; A Practícal Approach, svazek I & II, vydavatel D. Glover; 01igonucleotide Synthesis, vydavatel N. Gait, 1984; Nucleic Acid Hybridization. vydavatel B. Hames & S. Higgins, 1985; Transcription and Translation, vydavatel B Hames & S. Higgins, 1984; Animal Cell Culture, vydavatel R. Freshney, 1986; Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 1984).

Výrazy uváděné v jednotném čísle zahrnují rovněž výrazy v množném čísle, pokud to souvislost nevylučuje.

Polypept. idové kompozice

Výraz polypeptid se zde používá v běžném smyslu tohoto slova, to je jako sekvence aminokyselin. Polypeptidy nejsou omezeny na specifickou délku produktu; proto peptidy, oligopeptidy a proteiny jsou zahrnuty do definice polypeptidu a takové výrazy se mohou zaměnitelně používat, pokud není vysloveně uvedeno jinak. Tento výraz se netýká nebo nezahrnuje postexpresní modifikace polypeptidu, například glykosylace, acetylace a fosforylace, jakož také jiné v oboru známé modifikace probíhající jak přírodně tak nepřirodně. Polypeptidem může být celý protein nebo jeho subsekvence. Zvláště zajímavé polypeptidy podle vynálezu jsou aminokyselinové sekvence obsahující epitopy, to znamená antigenové determinanty podstatně zodpovědné pro imunogenické vlastnosti polypeptidu a schopné vyvolávat imunitní odezvu.

Obzvláště ilustrativní polypeptidy podle vynálezu zahrnují polypeptidy kódované polynukleotidovou sekvencí ve kterékoliv z následujících sekvencí; SEQ ID N0= 1 až 111, 115 až

171, 173 až 175, 177, 179 až 305, 307 až 315, 326, 328, 330, 332 až 335, 340 až 375, 381, 382 a 384 až 476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 až 572, 587, 591, 593 až 606, 618 až 626, 630, 631, 634, 636, 639 až 655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720 až 722, 735, 737 až 739, 751, 753, 764, 765, 773 až 776 a 786 až 788, nebo sekvence, které hybridizují za mírně přísných podmínek nebo za vysoce přísných podmínek na polynukleotidovou sekvenci ze souboru zahrnujícího kteroukoliv z následujících sekvencí: SEQ ID N0 = 1 až 111, 115 až 171, 173 až

175,	177, 179	až 305, 307	až 315, 326,	328, 330, 332 az 335,
340	až 375,	381, 382 a 384 až	476,	524,	526, 530, 531,	533,
535,	536, 552	, 569 až 572,	587,	591,	593	až 606, 618 až	626,
630,	631, 634	, 636, 639 až	655,	674,	680,	681, 711, 713,	716,

720 až 722, 735, 737 až 739, 751, 753, 764, 765, 773 až 776 a 786 až 788. Podle zvláštěních provedení zahrnují polypeptidy podle vynálezu aminokyselinové sekvence ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO: 112 až 114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376 až 380, 383, 477 až 483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537 až 551, 553 až 568, 573 až 586, 588 až 590, 592, 627 až 629, 632, 633, 635, 637, 638, 656 až 671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717 až 719, 723 až 734, 736, 740 až 750, 752, 754, 755, 766 až 772, 777 až 785 a 789 až 791.

Polypeptidy podle vynálezu jsou někdy zde označovány jako proteiny specifické pro prostatu nebo pro prostatu specifické polypeptidy, přičemž toto označení znamená jejich identifikaci alespoň z části založenou na jejich zvýšené expresi ve vzorcích tkáně prostaty. Proteiny specifické pro prostatu nebo pro prostatu specifické polypeptidy se proto obecně týkají polypeptidové sekvence podle vynálezu nebo polynukleoti dové sekvence kódující takový polypeptid, která je expresována podstatným podílem vzorkfi tkáně prostaty, například podílem větším než o přibližně 20 %, výhodněji větším než o přibližně 30 ještě výhodněji větším než o přibližně 50 % nebo ještě i**

-’ ‘•r»-··» - - H . _t 4^.^ «ιΜ^^ν*ι»^^ίβ^^Ο^^®Ο^®ίί5Β!»^^ί^.ίί«Κ

- 37 větším nožstvím testovaných vzorků tkáně prostaty v míře alespoň dvakrát a s výhodou alespoň pět krát větší než je expresní míra jiných normálních tkání, jak se stanoví níže popsanými testy- Pro prostatu specifická polypeptidová sekvence podle vynálezu, založená na zvýšeném množství exprese v nádorových buňkách má zvláštní užitečnost jak jako diagnostický markér tak jako terapeutický cíl, jak bude ještě níže uvedeno.

Podle určitých výhodných provedení jsou polypeptidy podle vynálezu imunogenické, to znamená, že zjistitelně reagují v rámci imunotestu (jako je například test ELISA nebo test stimulace T-buněk) s antisérem a/nebo s T buňkami pacienta s rakovinou prostaty. Skríning na imunogenickou aktivitu se může provádět za použití způsobů dobře známých pracovníkům v oboru. Například se takový skríning může provádět způsobem, který popsal Harlov a Lané (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Podle jednoho objasňujícího případu se může polypeptid imobilizovat na pevném nosiči a uvádět do styku se sérem pacienta, aby došlo k vázání protilátek v séru na imobi1izovaný polypeptid. Nevázané sérum se pak může odstranit a vázané protilátky se mohou stanovit například ¹²⁵J-značeným proteinem A.

Vynález zahrnuje také imunogenické porce polypeptidů podle vynálezu. Výrazem ”imunogenická porce se zde vždy míní fragment imunogenického polypeptidů podle vynálezu, který je sám imunologicky reaktivní (to znamená, že specificky váže) s B-buňkami a/nebo s T-buňkami povrchu antigenových receptorů, které rozpoznávají polypeptid. Imunogenické porce se mohou obecně identifikovat za použití dobře známých způsobů, které shrnul například Paul (Fundamental Immunology, 3. vydání, str. 243 až 247, Raven Press, 1993). Takové způsoby zahrnují skrínování polypeptidů se zřetelem na schopnost reagovat s pro antigen specifickými protilátkami, s antisérem a/nebo s T-buněčnými liniemi a/nebo s klony. Antisérem a protilátkami se zde míní antigen specificické látky, které se specificky vážou na antigen (to znamená, že reagují s proteinem v testu ELISA nebo v jiném imunotestu a nereaguje zjistitelně s nepríbuznými proteiny). Taková antiséra a protilátky se mohou připravovat níže popsaným způsoben za použití dobře známých postupů .

Podle jednoho výhodného provedení imunogenická porce polypeptidu podle vynálezu je porce, který reaguje s antisérem a/nebo s T-buňkami v míře, která není podstatně nižší než reaktivita plné délky polypeptidu (například v testu ELISA a/nebo v testu reaktivity T-buněk). S výhodou odpovídá imunogenická aktivita imunogenické porce alespoň přibližně 50 s výhodou alespoň přibližně 70 % a nejvýhodněji alespoň přibližně 90 % imunogenicity plné délky polypeptidu. V některých případech výhodné imunogenické porce mají podle zjištění imunogenickou aktivitu větší než odpovídající plné délky polypeptid, například větší než přibližně 100 % nebo 150 % nebo má ještě větší imunogenickou aktivitu.

V některých jiných případech ilustrativní imuogenické porce mohou zahrnovat peptidy, ve kterých N-koncová vedoucí sekvence a/nebo transmembránová doména je vypuštěna. Jiné ilustrativní imuogenické porce obsahují malou N-koncovou nebo C-koncovou deleci (například 1 až 30 aminokyselin, s výhodou 5 až 15 aminokyselin) se zřetelem na zralý protein.

Podle jiného provedení polypeptidový prostředek podle vynálezu může také obsahovat jeden nebo několik polypeptidů, které jsou imunologicky reaktivní s T-buňkami a/nebo s antilátkami generovanými proti polypeptidu podle vynálezu, zvláště polypeptidu majícímu aminokyselinovou sekvenci zde popisovanou nebo její imunogenický fragment nebo imunogenickou variantu.

Podle jiného provedení se vynález týká polypeptidů, které

- 39 obsahují jeden nebo několik polypeptidů, které jsou schopny vyvolat T buňky a/nebo protilátky, které imunologicky reagují s jedním nebo s několika zde popsanými polypeptidy nebo s jedním nebo s několika polypeptidy zakódovanými přilehlými aminokyselinovými sekvencemi obsaženými v polynukleotidových sekvencích zde popisovaných nebo s jejich imunogenickými fragmenty nebo variantami nebo s jednou nebo s několika sekvencemi nukleové kyseliny, které hybridizují na jednom nebo na několika těchto sekvencích za podmínek mírné nebo vysoké přísností.

Vynález se také týká polypeptidových fragmentů obsahujících alespoň přibližně 5, 10, 15, 20, 25, 50 nebo 100 nebo více přilehlých aminokyselin včetně všech přechodných délek polypept-idového prostředku, jako jsou v sekvencích ze souboru zahrnujícího sekvence SEQ ID NO: 112 až 114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376 až 380, 383, 477 až 483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537 až 551, 553 až 568, 573 až 586, 588 až 590, 592, 627 až 629, 632, 633, 635, 637, 638, 656 až 671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717 až 719, 723 až 734, 736, 740 až 750, 752, 754, 755, 766 až 772, 777 až 785 a 789 až 791 nebo sekvence kódované polynukleot i dovou sekvencí ze souboru zahrnujícího sekvenci:

1 až 111, 115	až 171, 173 až 175,	177,	179 až 305,
326, 328, 330.	332 až 335, 340 až	375,	381, 382 a
524, 526, 530,	531, 533, 535, 536,	552,	569 až 572
593 až 606, 618 až 626, 630, 631,	634,	636, 639 až
680, 681, 711	, 713, 716, 720 až	722,	735, 737 až
753, 764, 765,	773 až 776 a 786 až	788 .

SEQ ID NO:

307 až 315,
384 až	476,
, 587,	591,
655,	674,
739,	751,

Vynález se také týká variant polypeptidových prostředků zde popisovaných. Polypeptidové varianty obecně zahrnuté vynálezem vykazují zpravidla alespoň přibližně 70¾. 75¾. 80¾. 85¾. 90¾. 91¾. 92¾. 93¾. 94¾. 95¾. 96¾. 97¾. 98¾ nebo 99¾ nebo ještě vyšší identitu (stanovenou níže popsaným způsobem) ve své délce s popisovanou polypeptidovou sekvencí.

Podle jednoho výhodného provedení jsou polypeptidové fragmenty a varianty podle vynálezu imunologicky reaktivní s protilátkou a/nebo s T-buňkami, které reagují s polypeptidem plné délky specificky popsaným.

Podle dalšího výhodného provedení polypeptidové fragmenty a varianty podle vynálezu mají imunogenickou aktivitu alespoň přibližně 50%, s výhodou alespoň přibližně 70% a nejvýhodněji alespoň přibližně 90% nebo ještě vyšší ve srovnání s polypeptidovou sekvencí plné délky specificky popsané.

Výrazem polypeptidová varianta*' se zde vždy míní polypeptid, který se typicky liší od polypeptidu zde specificky popisovaného jednou nebo několika substitucemi, delecemi, adicemi a/nebo inzercemi. Takové varianty se mohou vyskytovat přírodně nebo se mohou generovat synteticky například modifikací jedné nebo několika shora uvedených polypeptidových sekvencí podle vynálezu a vyhodnocením jejich imunogenické aktivity, jak zde popsáno, za použití jakéhokoliv o sobě známého způsobu.

Například určité objasňující varianty polypeptidfl podle vynálezu zahrnují varianty, ve kterých jedna nebo několik porcí, jako například N-koncová řídící nebo transmembránová doména, jsou odstraněny. Jakožto jiná objasňujícíc varianta se uvádí varianta, ve které malá porce (například 1 až 30 aminokyselin, s výhodou 5 až 15 aminokyselin) je odstraněno z Nkoncového a/nebo z C-koncového zralého proteinu.

V mnoha případech obsahuje varianta konzervativní substituce. “Konzervativní substitucí se míní substituce, při které je jedna amonokyselina nahrazena jinou aminokyselinou, která má podobné vlastností, jak pracovník v oboru peptidové chemie očekává, přičemž se sekundární struktura a hydropatická povaha polypeptidu v podstatě nemění. Jak shora uvedeno, pro•ϋΛ,^Λ'ΜτΜΜ ť» Μ-Τ»»Κ 4, „ .

) > ) ) ·» > } >

) ) ) 5 » > Ϊ > > ·> » » » >

) > ) ) » )

1)1 ) )

11 1 » »

1 1 ) > 1 ) ) 1 ) 1 ) ) 1 vádě jí se modifikace ve sturukture polynukleotidu a polypeptidů podle vynálezu a vždy se získá funkční molekula, která kóduje variantu nebo derivát polypeptidu s žádoucími charakteristikami, například imunogenickými charakteristikami. Pokud je žádoucí měnit, aminokyselinovou sekvenci polypeptidu k vytvoření ekvivalentního nebo i zlepšeného imunogenického variantu nebo porce polypeptidu podle vynálezu, mění pracovník v oboru zpravidla jeden nebo několik kodonfi kódujících DNA sekvence podle tabulky I.

Například uričité aminokyseliny se moho nahradit jinými aminokyselinami v proteinové struktuře bez závažnější ztráty interaktivní vázací kapacity strukturami, jako jsou například antigen vázající regiony protilátek nebo. vázací místa na substrátových molekulách. Jelikož to je interaktivní kapacita a povaha proteinu, která definuje proteinovou biologickou funkční aktivitu, náhrady Určité aminokyselinové sekvence se mohou provádět v proteinové sekvenci a ostatně v jejich podléhající DNA kódující sekvenci a nicméně se může obdržet protein s podobnými vlastnostmi- Uvažuje se, že se mohou provádět různé změny v peptidových sekvencích prostředků podle vynálezu nabo v odpovídajících DNA sekvencích, které kódují uvedené peptidy bez podstatnější ztráty jejich biologické užitečnosti nebo aktivity.

Tabulka I

Aminokyseliny	Kodony
alanin	Ala	A	GCA	GCC	GCG	GCU
cystein	Cys	C	UGC	UGU
asparágová kyselina	Asp	D	GAC	GAU
glutamová kyselina	Glu	E	GAA	GAG
fenylalanin	Phe	F	UUG	uuu
glycin	Gly	G	GGA	GGC	GGG	GGU

i

histidin	His	H	CSC	CAU
isoleucin	Ile	I	ADA	AUC	AUU
lysin	Lys	K	AAA .	AAG
leucin	Leu	L	UUA	UUG	CUA	CUC	CUG	CDU
methionin	Met	M	AUG
asparagin	Asn	H	AAC	AAU
prolin	Pro	P	CCA	CCC	CCG	CCll
glutamin	Gin	0	CAA	CAG
arginin	Arg	R	AGA	AGG	CGA	CGC	CGG	CGU
šeřin	Ser	S	AGC-	AGU	UCA	UCC	UCG	UCU
threonin	Thr	T	ACA	ACC	ACG	ACU
valin	Val	V	GUA	GUC	GUG	GUU
tryptofan	Trp	V	UGG
ryrosin	Tyr	y	UAC	UAU
Při	provádění takových	změn	se	může	brát	v úvahu

tický index aminokyselin. Význam hydropatického indexu aminokyselin při udílení interaktivní biologické funkce proteinu je obecně v oboru znám CKyte a Doolittle, 1982). Máše zato, že relativní hydropatický charakter aminokyseliny přispívá k sekundární struktuře výsledného proteinu, což vzápětí definuje interakci proteinu s ostatními molekulami, například s enzymy, se substráty,s receptory, s DNA, s protilátkami a s antigený. Každá aminokyselina je označena hydropatickým indexem na bázi své hydrofobicity a nábojové charakteristiky CKyte a Doolittle, 1982). Tyto hodnoty jsou: isoleucin ¢-+-4,5), valin ¢+4,2), leucin ¢+3,8), fenylalanin ¢+2,8), cystein/cystin ¢+2,5), methionin ¢+1,9), alanih C+l,8), glycin ¢-0,4), threonin ¢-0,7), šeřin ¢-0,8), tryptofan ¢-0,9), tyrosin ¢-1,3), prolin ¢-1,6), histidin ¢-3,2), glutamát ¢-3,5), glutamin ¢-3,5), aspartát ¢-3,5), asparagin ¢-3,5), lysin ¢-3,9) a arginin C-4,5).

V oboru je známo, že určité aminokyseliny mohou být nahrazeny jinými aminokyselinami majícími podobný hydropatický

index nebo skoré a přesto je jejich výsledkem protein s podobnou biologickou aktivitou, tedy získá se biologicky funkčně rovnocenný protein. K provádění takových změn substituce aminokyselin, jsou jejich hydropatické indexy ±2 výhodné, ±1 obzvlášť. výhodné a ±0,5 ještě obzvláště výhodnější. V oboru je rovněž známo, že náhrada podobných aminokyselin může být účinně prováděna na bázi hydrofi 1icity. Zvláště v americkém patentovém spise číslo US 4 55410Ϊ se konstatuje, že největší lokální průměrná hydrofi 1icita proteinu, řízená hydrofi 1icitou jeho sousedních aminokyselin, je ve vztahu k biologickým vlastnostem proteinu.

Jak je podrobně popsáno v americkém patentovém spise číslo US 4 554 101, jsou zbytkům aminokyselin přiřazeny následující hodnoty hydrofi 1 ici ty - arginin ¢+3,0), lysin ¢+3,0), aspartát ¢+3,0+1), glutamát. ¢+ 3,0 ±1), šeřin ¢+0,3), asparagin ¢+0,2), glutamin ¢+0,2), glycin (0), threonin ¢-0,4), prolin ‘ _s -S ¢-0,5+1), alanin (-0,5), histidin ¢-0,5), cystein ¢-1,0), methionin ¢-1,3), valin ¢-1,5), leucin ¢-1,8), isoleucin ¢-1,8), tyrosin ¢-2,3), fenylalanin ¢-2,5), tryptofan (-3,4). Je zřejmé, že aminokyselina může být nahrazena jinou aminokyselinou, mající podobnou hodnotu hydrofi 1icity a ještě se může získat biologicky rovnocenný a obzvláště imunologicky rovnocenný protein. Při takových změnách se dává přednost náhradě aminokyselin, jejichž hodnoty hydrofi 1icity jsou v rozmezí + 2, výhodněji +1 a nejvýhodněji ±0,5.

Jak shora uvedeno, je náhrada aminokyselin proto obecně založena na relativní podobnosti substituentň aminokyselin s vedlejším řetězcem, například na jejich hydrofobicitě, hydrofillcitě, náboji, velikosti. Příkladné náhrady, které berou v úvahu různé shora uvedené charakteristiky, jsou pracovníkům v oboru dobře známy a patří k nim: arginin a lysin, glutamát a aspartát, šeřin a threonin, glutamin a asparagin, a valin, leucin a isoleucin.

,’h 44, ) > » I > · » ) >

) > > t ) 7 I ) ) i 7 »

Ί i i >

> , > Λ » 1 » > » } » > ' > » >»71

Kromě toho může být každý polynukleotid modifikován ke zvýšení své stálosti in vivo. Mezi možné modifikace patří, bez na jakémkoliv omezení, adice lemovacích sekvencí na záměru koncích či , použití fosforothionátu nebo 2 -O-methylu spíše než fosfodiesterázových spojovníků v kostřeá/nebo zahrnutí netradičních bází, jako je inosin, queosin a vybutosin, stejně jako acetylforem, thioforem a ostatních modifikovaných forem adertinu, cyt-idinu, guanidinu, thyminu a uridinu.

Substituce aminokyselin se může provádět dále na základě podobnosti a.polarity, náboje, rozpustnosti, hydrofobicity, hydrof i 1 i c i ty a/nebo amfipatické povahy zbytků. Například mezi záporně nabité aminokyseliny patří kyselina asparagová a glutamová, kladně nabitými aminokyselinami jsou lysin a arginin a mezi aminokyseliny s polárními hlavovými skupinami bez náboje, mající podobnou hodnotu hydrofi 1icity patří leucin, isoleucin a valin, glycin a alanin, asparagin a glutamin, a šeřin, threonin, fenylalanin a tyrosin. Mezi další skupiny aminokyselin/ které mohou poskytovat konzervativní změny patří'- Cl) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; C2) cys, ser, tyr, thr; C3) val, ile, leu, met., ala, phe; (4) lys, arg, his a <5) phe, tyr, trp a his. Varianta může obsahovat také nebo alternativně nekonzervativní změny. Ve výhodném provedení se variantní polypeptidy liší od nativní sekvence substitucí, delecí, nebo adicí pěti nebo méně aminokyselin. Varianty mohou být také Cnebo alternativně) modifikovány, například delecí nebo adicí aminokyselin, které mají minimální vliv na imunogenicitu, sekundární strukturu a hydropatickou povahu polypeptidu.

Jak je uvedeno shora, mohou polypeptidy tvořit signální Cnebo vůdčí) sekvenci na konci N-zakončení proteinu, který ko-translačně nebo post-translačně usměrní transfer proteinu. Polypeptid může být také konjugován na.spojovník nebo na jinou sekvenci k usnadnění syntézy, čištění nebo identifikace polypeptidu, Cnapříklad poly-His), nebo k usnadnění vazby polypep-

tidu na pevný nosič. Například může být polypeptid konjugován na oblast Fc imunoglobulinu.

Když se porovnávají polypeptidové sekvence, označují se dvě sekvence jako identické (totožné), je-li sekvence aminokyselin v obou sekvencích stejná při srovnání do maxima korespondence jak dále popsáno. Dvě sekvence se typicky porovnávají porovnáním sekvencí přes porovnávací okénko k identifikaci a k porovnání lokálních regionů sekvenční podobnosti. Zde použitým porovnávacím okénkem se rozumí segment alespoň 20 přilehlých poloh, obvykle 30 až přibližně 75, 40 až přibližně 50, ve kterých se mohou sekvence porovnávat s referenční sekvencí se stejným počtem přilehlých poloh, když se obě sekvence optimálně uvedou do zákrytu.

Optimální seřazení sekvencí pro porovnání se může provádět za použití programu Megalign v softwaru Lasergene suitě Of bioinformatics software (DNASTAR lne., Madison, VI) za pomocí parametrů prodlení (default parameters). Tento program zahrnuje několik schémat seřazení které popsali: Dayhoff M.O. (A model of evolutionary change in proteins- Matrices for detecting distant reáltionships. v Dayhoff, M.O. (vydavatel) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Reseach Foundation, Washington DC, sv. 5 (3) str. 345 až 358 1978): Hein J. (Unified Approach to Alignement and Phylogenes, str. 626 až 645 Methods in Enzymology sv. 183, Academie Press, Inc. San Diego, CA, 1990); Higgins D.G. a Sharp P.M. CABIOS 5, str. 151 až 153, 1989); Myers E.V. a Muller V. (CABIOS 4, str. 11 až 17, 1988); Robinson E.D. (Comb. Theor. 11, str- 105, 1971); Santou Ní, Nes M. (Mol. Biol. Ecol. 4. str.406 až 425, 1987); Sneath P.H.A. á Šakal R. R. (Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Nuáerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA, 1973); Vilbur V.J. a Lipman D.J. (Proč. Nati. Acad. Sci USA 80, str. 726 až 730, 1983).

,46, Jinak se může optimální seřazení sekvencí k porovnání provádět lokálním algoritmem identity (Smith and Waterman Add. APL. Matli 2, str.482, 1981), razeným algoritmem identity (Needleman and Wunch, J. Mod. Biol. 48, str. 443, 1970), pátráním po způsobech podobnosti (Pearson and Lipman, Proč. Mat. Acad- Sci. USA 85, str. 2444 (1988), číslicovým doplněním těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA a TFASTA ve.Visčonsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG) Science Dr., Madison, VI) nebo inspekcí.

Jedním výhodným příkladem algoritmů, které se hodí ke stanovení procenta sekvenční identity a sekvenční podobnosti, jsou algoritmy BLAST a BLAST 2,0, které jsou popsal Altschul a kol. (Nucl. Acids Res. 25, str, 3389 až 3402, 1977) a Altschul a kol. (J. Mol. Biol. 215, str. 403 až 410, 1990). Algoritmů BLAST a BLAST 2,0 může být použito, například se zde popsanými parametry k určení identity sekvencí polynukleotidů a polypeptidů podle vynálezu. Software k provádění BLAST analýz je obchodní produkt (společnost National Center for Biotechnology Information). Pro sekvence aminokyselin je možno použít k výpočtu kumulativního výsledku seřazovací matrice. Rozšíření slova hits v každém směru se zastaví, když'- skoře kumulativního seřazení vypadne v množství X z maximálně dosažené hodnoty; komulativní skoré se blíží k nule nebo níže, díky nahromadění jednoho nebo několika negat. ivně-skoru j ících zbytkových seřazení; nebo se dosáhne konce některé sekvence. Parametry V, T a X algoritmu BLAST určují citlivost a rychlost seřazení.

Podle jednoho způsobu se procentová sekvenční identita stanovuje porovnáním dvou optimálně seřazených sekvencí v okně srovnáním alespoň 20 pozic, přičemž porce polypeptidové sekvence v porovnávacích oknech může obsahovat adicí nebo delecí (to znamená mezer) 20 % nebo méně, zpravidla 5 až 15 nebo 10 až 12 ve srovnání s referenčními sekvencemi (které neobsahují adice nebo delece) pro optimální seřazení dvou sekvencí.

, * ’τ ,47 - -,; , · ’, ι ) ) ) Λ i ) » Ί ) I ' ' . I ι ί i , ' ’ * '

5'

Procento se vypočte stanovením počtu pozic, ve kterých je identický aminokyselinový zbytek v obou sekvencích k dosažení počtu sledovaných pozic, dělením počtu sledovaných pozic celkovým počtem pozic v referenční sekvenci (to je velikost okna a násobením výsledků 100 k získání výsledného procenta sekvenční identity. · .

Podle jiného objasňujícího provedení polypeptidem může být fúzní polypeptid, který obsahuje množinu polypeptidů zde popsaných a nepříbuznou sekvenci, například známý nádorový protein. Fúzní partner může například asistovat při vytváření T pomocných epitopfl (imunologického fúzního partneru), s výhodou T pomocných epitopfl rozpoznávaných lidmi, nebo může asistovat při expresi proteinu (zesilovač exprese) ve vyšším výtěžku než nativní rekombinantní protein. Určití výhodní pomocní partneři jsou fúzní partneři, kteří podporují jak imunologické působení tak expresi. Jiní fúzní partneři mohou být voleni tak, aby vzyšovaly solibilitu polypeptidu nebo umožnili polypeptidu, aby se zaciloval na žádaný intracelulární obor. Ještě další fúzní partneři zahrnují afinitni konečky, které usnědfíují čištění polypeptidu.

Polpeptidy mohou být fúzní polypeptidy, které obsahují množinu polypeptidu podle vynálezu nebo obsahují alespoň jeden polypeptid podle vynálezu a nepríbuznou sekvenci jako nádorový protein. Fúzní partner může například asistovat v případě T pomocníkového epitopu (imunologický fúzní partner), s výhodou T pomocníkového epitopu rozpoznávaného 1 idmi, nebo může aistovat při expresi proteinu (zesilorovač exprese) ve vyšších výtěžcích než vykazuje nativní rekombinantní protein. Určití výhodní fúzní partneři jsou imunulogické a expresi poporující fúzní partneři. Jiní fúzní partneři mohou být selektováni tak, aby zvyšovaly solubilitu peptidu, nebo aby umožňovaly zacilovat polypeptid do žádané intracelulární oblasti: Ještě další fúzní partneři zahrnují afínitní přívěs, ( tag“), který usnadnu jí čištění polypeptidu.

Fúzní polypeptidy se mohou obecně připravovat o sobě známými způsoby, včetně chemické konjugace. S výhodou se fúzní polypept id expresu je jako rekombinantní polypeptid, za umožnění produkce většího množství se zřetelem na nefúzní polypeptidy v expresním systému. DNA sekvence, kódující polypeptidové složky, se mohou sestavovat odděleně a ligovat do vhodného expresního vektoru. 3' konec DNA sekvence, kódující polypeptidovou složku, se liguje š polypeptidovým spojovníkem nebo bez polypeptidového spojovníku na 5' konec DNA sekvence, kódující druhou polypeptidovou složku, takže čtecí rámce sekvencí jsou ve fázi. To umožňuje translaci do jednotlivého fúzního polypeptidu, který si ponechává biologickou aktivitu obou složek polypeptidfl.

Polypeptidová spojovníková sekvence se může používat k oddělení první a druhé polypeptidové složky dostatečnou vzdáleností k zajištění, že každý polypeptid se zahne do svých sekundárních a terciárních struktur. Taková peptidová spojovníková sekvence se včleňuje do fúzního polypeptidu standardním způsobem, známým v oboru- Vhodná peptidová spojovníková sekvence se může volit na základě následujících faktorů: (1) své schopnosti přijmout flexibilní prodlouženou konformaci: (2) své neschopnosti přijmout sekundární strukturu, která může vzájemně působit s funkčními epitopy na prvním a na druhém polypeptidu: a C3) nepřítomnost hydrofobních nebo nabitých zbytků, které by mohly reagovat s polypeptidovými funkčními epitopy. Výhodná peptidová spojovníková sekvence obsahuje Gly, Asn a Ser zbytky. Jiné téměř neutrální aminokyseliny, jako Thr a Ala, mohou být rovněž použity jako spojovníkové sekvence. Aminokyselinové sekvence,,které mohou být vhodně použity jako spojovníky, zahrnují sekvence, které popsal Maratea a kol CGene 40, str. 39 až 46, 1985): Murphy a kol. CProc. Nati. Acad. Sci. USA 83, stř. 8258 až 8262, 1986) a které jsou po/-,4¾ psány v patentové literture (americký patentový spis číslo US 4 935233 a US 4 751180). Spojovníková sekvence může mít délku 1 až přibližně 50 aminokyselin. Spojovníkové sekvence nejsou nutné, pokud první a druhé polypeptidy mají neesenciální N-koncové aminokyselinové regióny, kterých se může používat k oddělení funkčních domén a k předcházení sterické interference.

Ligované DNA sekvence jsou operativně vázány na vhodné transkripční nebo translační regulační prvky. Regulační prvky, zodpovědné za expresi DNA, jsou lokalizované pouze 5’ k DNA sekvenci kódující první polypeptidy. Podobně stop kodony, požadované k ukončení translačních a transkripčních terminačních signálů, jsou pouze 3^J k DNA sekvenci kódující druhý polypeptid.

Eúzní polypeptid může obsahovat polypeptid zde popsaný spolu s nepříbuzným imunogenickým proteinem, jako je imunogenický protein schopný vyvolat zpětnou odezvu. Jakožto příklady takových proteinů se uvádějí proteiny tetanu, tuberkulózy a žloutenky (například Stouťe a kol., Nev Engl. J. Med. 336, str. 86 až 91, 1997).

Podle jednoho výhodného provedení se imunologický fúzní partner odvozuje od Mycobacterium sp., jako je od Mycobacterium tuberculosís odvozený Ral2 fragment. Ral2 prostředky a způsoby jejich použití při podpoře exprese a/nebo imunogenicity heterologových polynukleotid/polýpeptidových sekvencí je popsáno v americké přihlášce vynálezu číslo 60/158,585. V podstatě se Ral2 týká polynukleotidového regionu, který je subsekvencí Mycobacteri um tuberculosis MTB32A nukleové kyseliny. MTB32A je serinová proteáza 32 KD molekulové hmotnosti kódovaná genem ve virulentních a avirulentních kmenech M. tuberculosis. Nukleotidová sekvence a aminokyselinová sekvence MTB32A je v literatuře popsána (například americká přihláška

30, vynálezu čísle 60/158,585; také Skeiky a kol., Infection and Immun. 67, str.3998 až 4007, 1999). C-Koncové fragmenty MTB32A kódující sekvence expresuje ve vysoké míře a zůstává jako rozpustné polypeptidy v průběhu procesu čištění. Kromě toho Ral2 může podporovat imunogenicitu heterologových imunologických polypeptidů, se kterými je fúzována. Jeden výhodný Ral2 fúzní polypeptid obsahuje 14 KD C-koncový fragment odpovídající aminokyselinovým zbytkům 192 až 323 MTB32A. Jiné výhodné Ral2 polynukleotidy obecně obsahují alespoň přibližně 15 po sobě jdoucích nukleotidů, alespoň přibližně 30 nukleotidů, alespoň přibližně 60 nukleotidů, alespoň přibližně 100 nukleotidů, alespoň přibližně 200 nukleotidů nebo alespoň přibližně 300 nukleotidů, které kódují porci Ral2 polypeptidů. Ral2 polynukleotidy mohou obsahovat nativní sekvenci (například endogenní sekvenci, která kóduje Ral2 polypeptid nebo jeho porci) nebo mohou obsahovat variant takové sekvence. Ral2 polynukleotidové varianty mohou obsahovat jednu nebo několik substitucí, adicí, delecí a/nebo inzercí, přičemž biologická aktivita zakódovaného fúzního polypeptidů se podstatně nezmenší se zřetelem na fúzní polypeptid obsahující nativní Ral2 polypeptid. Varianty s výhodou mají alespoň přibližně 70¾ identitu, výhodněji alespoň přibližně 80¾ identitu a nejvýhodněji alespoň přibližně 90¾ identitu s polynukleotidovou sekvencí, která kóduje nativní Ral2 polypeptid nebo jeho porci.

Podle jiného výhodného provedení je imunologický fúzní partner Odvozen od proteinu I), povrchového proteinu gram-negativní bakterie Haemophilus influenza B (světový patentový spis číslo V0 91/18926). S výhodou protein D derivát obsahuje přibližně první třetinu proteinu (například první N-koncové 100 až 110 aminokyseliny) a protein D derivát může být lipidován. Podle určitých výhodných provedení prvních 109 zbytků lipoproteinového D fúzního partneru je začleněno do N-konce k poskytnutí polypeptidů s přídavnými exogenními T-buněčnými epitopy a ke zvýšení expresní hladiny v E. coli (čímž působí jako podpo51 rovač exprese). Lipidové zakončení zajišťuje optimální poskytnutí antigenu do antigen poskytujících buněk. Jiní fúzní partneři zahrnují nestrukturální protein z viru chřipky, NS1 (hemaglutinin). Zpravidla N-koncové 81 aminokyseliny se používají, jakkoliv se mohou použít odlišné fragmenty, které zahrnují T-pomocné epitopy.

Podle jiného provedení imunologickým fúzním partnerem je protein známý jako LYTA nebo jeho porce (s výhodou C-koncový protein). LYTA je odvozen od mikroorganizmu Stroptococcus pneumoniae, který syntetizuje N-acetyl-L-alaninamidázu známou jako amidáza LYTA (kódovaná genem LytA; Gene 43, str. 265 až 292, 1986). LYTA je autolyzin. který specificky odbourává určité vazby v peptidoglykanové kostře. C-Koncová doména proteinu LYTA je zodpovědná za _r afinitu k cholinu nebo.k některým cholinovým analogům, jako například k DEAE. Vlastnost se využívá pro vývoj E. coli C-LYTA expresujících plasmidů užitečných pro expresi fúzních proteinů. Čištění hybridových proteinů obsahujících C-LYTA fragment na aminozakončení je popsáno v literatuře (Biotechnology 10, str. 795 až 798, 1992) . V rámci výhodného provedení opakující se porce LYTA se mohou začlenit do fúzního proteinu. Opakující regionu, vycházejícím ze zbytku 178, se porce začleňuje zbytky 188 až 305.

se porce je v C-koncovém Zvláště výhodná opakující

Jiné objasňující provedení zahrnuje fúzní polypeptidy a polynukleotidy, které je. klónuj í, přičemž fúzní partner obsahuje cílový signál schopný vésti polypeptid do endosomálního/ lyzosomálního oddílu (americký patentový spis číslo US 5 633234). Imunogenický polypeptid podle vynálezu, fúzovaný s tímto cílovým signálem, asociuje efektivněji se MHC třídou II molekul a tím poskytuje podpořenou in vivo stimulaci CD4⁺T-buněk specifických pro polypeptid.

Polypeptidy podle vynálezu se př i právuj í kterýmkoliv z četných známých způsobů a/nebo rekombinantními způsoby, přičemž rekombinantní způsoby jsou dále popsány. Polypeptidy, porce a jiné varianty obecně menší než přibližně 150 aminokyselin se mohou generovat syntetickými způsoby za použití dobře známých způsobů prcovníkůra v oboru. Podle objasňujícího příkladu se takové polypeptidy syntetizují za použití jakékoliv obchodně dostupné techniky s pevnou fází, jako je Merrifieldův způsob syntézy s pevnou fází, přičemž se aminokyseliny sekvenci álně přidávájí do rostoucího aminokyselinového řetězce (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, str. 2149 až 2146, 1963). Zařízeni pro automatizované syntézy polypeptidů je obchodně dostupné (například Perkin Elmer/Applied BioSystems Divišion, Foster City, CA) a mohou se používat podle návodu výrobce.

Obecně polypeptidové prostředky (včetně fúzních polypeptidů) podle vynálezu jsou izolovány. Výrazem “izolovaný polypeptid se míní polypeptid, který je odstraněn ze svého původního prostředí. Například přírodně se vyskytující protein nebo polypeptid se izoluje, jestližese oddělí od některého nebo od veškerého koexistujícího materiálu v přírodním systému. S výhodou se takový polypeptid také čistí, například na alespoň přibližně 90% čistotu, výhodněji na alespoň přibližně 95% čistotu a nejvýhodněji na alespoň přibližně 99% čistotu.

Polynukleotidové prostředky

Vynález se také týká polynukleotidových prostředků. Výrazy “DNA a polynukleotid se zde používají v podstatě zaměnitelně k označení DNA molekuly, která která je izolována od cekové genomové DNA zvláštních druhů. Výrazem izolovaná“ se zde míní, že je polynukleotid v podstatě prostý jiných kódujících sekvencí a že DNA molekula neobsahuje velké porce nepřibuzné kódující DNA, jako jsou velké chromosomální fragmenty nebo jiné funkční geny nebo po1ypeptid kódující regiony. Výraz se týká DNA molekuly původně .izolované a nevylučuje geny nebo kódu53 jící regiony později adované na segment synteticky.

Pracovníkům v oboru je známo, že polynukleotidové prostředky podle vynálezu zahrnují genomové sekvence, extragenomové a plasmidem zakódované sekvence a menší konstruované genové segmenty, které expresují nebo mohou být přizpůsoby pro expresi například proteinu, polypeptidů a peptidů. Takové segmenty mohou být přírodně izolovány nebo mohou být modifikovány synteticky.

Pracovníkům v oboru je také známo, že polynukleotidy podle vynálezu mohou být jednořetězcové (kódující nebo bez informačního obsahu Cantisnse3) nebo dvouřetězcové a mohou být DNA (genomové, cDNA nebo syntetické) nebo RNA molekulami. RNA molekuly mohou zahrnovat HnRNA molekuly, které obsahují introny a odpovídají DNA molekule při způsobu jedna k jedné a RNA molekuly, které neobsahují introny. Přídavné kódující nebo nekódující sekvence mohou, avšak nemusí, být obsaženy v polynukleotidu podle vynálezu a polynukleotid může, avšak nemusí, být vázán na jiné molekuly a/nebo nosičové materiály.

Polynukleotidy mohou obsahovat nativní sekvenci (to je endogenní sekvenci, která kóduje systém polypeptid/protein podle vynálezu nebo jeho porci) nebo mohou obsahovat sekvenci, která kóduje variant nebo derivát, s výhodou imunogenický variant nebo derivát takové sekvence.

Vynález se proto také týká polynukleotidových prostředků, které obsahují některou nebo všechny sekvence uvedené ve kterékoliv sekvenci ze souboru zahrnujícího sekvenci SEQ ID NO: 1 až 111, 115 až 171, 173 až 175, 177, 179 až 305, 307 až 315, 326, 328, 330, 332 až 335, 340 až 375, 381, 382 a 384 až 476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 až 572, 587, 591, 593 až 606, 618 až 626, 630, 631, 634, 636, 639 až 655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720 až 722,

- 54 735, 737 aš 739, 751, 753, 764, 765, 773 aš 776 a 786 aš 788, komplefflenty polynukleotidové sekvence ze souboru zahrnujícího kteroukoliv 2 následujících sekvencí: SEQ ID NO: 1 aš 111, 115

aš 171,	173 aš 175,	177,	179 aš	305,	307 aš 315, 326,	328,
330, 332	aš 335, 340	aš 375, 381,	382 a	. 384 aš 476, 524,	526,
530, 531,	533, 535,	536,	552, 569 aš	572, 587, 591, 593 aš
606, 618	aš 626, 630, 631, 634,	636,	639 aš 655, 674,	680,
681, 711,	713, 716,	720	aš 722,	735,	737 aš 739, 751,	753,
764, 765	, 773 aš 776 a	786 aš	788	a degenerované varianty
polynukleotidové sekvence	ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO:
1 aš 111,	115 aš 171	, 173	aš 175,	177,	179 aš 305, 307 aš	315,
326, 328,	330, 332 aš 335,	340 aš 375,	381, 382 a 384 aš	476,
524, 526,	530, 531,	533,	535, 536, 552, 569 aš 572, 587,	591,
593 aš 606, 618 aš	626, 630, 631,	634,	636, 639 aš 655,	674,
680, 681,	711, 713,	716,	720 aš	722,	735, 737 aš 739,	751,
753, 764	, 765, 773 aš	776 a	786	aš 788. Podle urŠitých

výhodných provedení polynukleotidové sekvence zde popisované zakódovávají imunogenické polypeptidy, jak shora uvedeno.

Podle jiného provedení se vynález týká polynukleotidových variant majících v podstatě identitu se sekvencemi ze souboru

zahrnujíčího SEQ ID NO:	1 aš 111,	115 aš 171, 173 aš	175,	177,
179 aš 305, 307 aš 315,	326, 328,	330, 332 aš 335, 340 aš	375,
381, 382 a 384 aš 476,	524, 526, 530, 531, 533, 535,	536,	552,
569 aš 572, 587, 591,	593 aš 606,	618 aš 626, 630,	631,	634,
636, 639 až 655, 674,	680, 681,	711, 713, 716, 720 až	722,

735, 737 aš 739, 751, 753, 764, 765, 773 aš 776 a 786 aš 788, například se sekvencemi majícími alespoň přiblišně 70%, sekvenční identitu, s výhodou alespoň 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% nebo 99% nebo ještě vyšší identitu ve srovnání s polynukleotidovou sekvencí podle vynálezu za poušití zde popraných způsobů (například analýzy BLAST za poušití níže uvedených parametrů). Pracovníkům v oboru je zřejmé, še se hodnoty mohou vhodně nastavit ke stanovení odpovídající identity proteinů kódovaných dvěma nukleotidovými sekvencemi při uvažování například kodonové degenerace, aminokyselinové podobnos- 55 ti, pozice čtecího rámce.

Zpravidla polynukleotidové varianty obsahují jednu nebo několik substitucí, adicí, delecí a/nebo inzercí, s výhodou takových, že iaiunogenecita zakódovaného polypeptidu variantem polynukleotidu není podstatně snížena se zřetelem na polypeptid zakódovaný polynukleotidovou sekvencí speciálně pro účely vynálezu. Výrazem varianty se míní zahrnutí homologových genů xenogeového původu.

Přídavně se vynález týká polynukleotidových framentů obsahujících různé délky přilehlých prodloužení (stretch) sekvencí identických nebo komplementárních k jedné nebo k několika sekvencím podle vynálezu. Například polynukleotidy podle vynálezu obsahují alespoň 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 nebo 1000 nebo více přilehlých nukleotidů s jednou nebo s několika zahrnutými sekvencemi jakož také všechny mezilehlé délky mezi nimi. Výrazem “mezilehlé délky se zde míní jakékoliv délky mezi uvedenými hodnotami, jako 16, 17, 18, 19 a dále; 21, 22, 23 a dále; 30, 31, 32 a dále; 50, 51, 52, 53 a dále; 100, 101, 102, 103 a dále; 150, 151, 152, 153 a dále; včetně všech celých čísel 200 až 500; 500 až 1000; a podobně.

Podle jiného provedení se vynález týká polynukleotidových prostředků, které jsou schopny hybridizovat za mírných nebo vysoce přísných podmínek do polynukleotidové sekvence nebo do jejího fragmentu nebo do její komplementární sekvence. Hybrid i začni techniky jsou v oboru molekulární biologie, dobře známy. Pro účely objasnění zahrnují vhodné mírně přísné podmínky pro testování hybridizace polynukleotidu podle vynálezu s jinými polynukleotidy předběžné promytí v roztoku 5X SSC, O,5 % SDS, 1,0 mři EDTA (hodnota pH 8,0); hybridizaci při teplotě 50 až 60 C, 5 X SSC, přes noc; následně promytí dvakrát při teplotě 65 C po dobu 20 minut s každým z 2X, 0,5X a 0,2X SSC ob- 56 sáhujícím 0,1 % SDS. Pracovníkům v oboru je zřejmé, že se s přísností hybridizace dá snadno manipulovat, například obměnou obsahu soli v hybridizačním roztoku a/nebo teploty, při které se hybridizace provádí. Například podle jiného provedení jsou vysoce přísné hybridizační podmínky stejné jako shora, e

jedině se zvýší hybridizační teplota například na 60 až 65 C nebo 65 až 70 C. Podle určitých výhodných provedení polynukleotidy shora popsané například polynukleotidové varianty, fragmenty a hybridizační sekvence, kódují polypeptidy, které jsou imunologicky křížově reaktivní s po1ypeptidovou sekvencí specificky zde popisovanou. Podle jiného výhodného provedení takové polynukleotidy kódují polypeptidy, které mají hladinu imunogenické aktivity alespoň přibližně 50%, s výhodou alespoň přibližně 70% a ještě výhodněji alespoň přibližně 90% se zřetelem na polypept idovou sekvenci specificky zde popisovanou.

Polynukleotidy podle vynálezu nebo jejich fragmenty bez zřetele na délku kódující sekvence samotné, se mohou kombinovat s jinými DNA sekvencemi, například s promotory, s polyadenylačními signály, s přídavnými restrikčními enzymovými místy, s množinou klónovacích míst nebo s kódujícími segmenty, takže se jejich celková délka může značně měnit. Proto se uvažuje, že se může použít fragment nukleové kyseliny prakticky jakékoliv délky s celkovou délkou s výhodou omezenou snadností přípravy a za použití záměrně rekombinantního DNA protokolu. Například objasňující po1ynuk1eotidové segmenty s celkovou délkou například přibližně 10000, přibližně 5000, přibližně 3000, přibližně 2000, přibližně 1000, přibližně 500, přibližně 200, přibližně 100, přibližně 50 páru bází (včetně všech mezilehlých délek) se považují za použitelné v mnoha provedeních vynálezu.

Při porovnávání polynukleotidových sekvencí se dvě sek57 vence považují za identické“, když je sekvence nukleotidů ve dvou sekvencích tatáž při seřazení pro maximání korespondenci, jak bude vysvětleno. Porovnání dvou sekvencí se zpravidla provádí porovnáním sekvencí přes porovnávací okno k identifikaci a k porovnání lokálních regionů sekvenční podobnosti. Výrazem porovnávací okno se zde vždy míní segment alespoň přibližně 20 přilehlých pozic, zpravidla 30 až přibližně 75 a s výhodou 40 až přibližně 50, ve kterém se sekvence mohou porovnávat s referenční sekvencí se stejným počtem přilehlých posic po optimálním seřazením dvou sekvencí.

Optimální seřazení. sekvencí pro porovnání se může provádět za použití programu Megalign v softwaru “Lasergene suitě of bioinformatics software (DNASTAR lne., Madison, WI) za pomoci parametrů prodlení (“default parameters). Tento program zahrnuje několik schémat seřazení které popsali: Dayhoff M.O. (A model of evolutionary change in proteins- Matrices for detecting distant re lat ionships, v Dayhoff, Γ1.0. (vydavatel) Atlas of Protein SequenCe and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, sv. 5 (3) str. 345 až 358 1978); Hein J. (Unified Approach to Alignement and Phylogenes, str. 626 až 645 Methods in Enzymo1ogy sv. 183, Academie Press, lne. San Diego, CA, 1990); Higgins D.G. a Sharp P.M. CABIOS 5, str. 151 až 153, 1989); Myers E.W. a Muller W. (CABIOS 4, str. 11 až 17, 1988); Robinson E.D. (Corab. Theor. 11, str. 105, 1971); Santou N., Nes M. (Mol. Biol. Ecol. 4. str.406 až 425, 1987); Sneath P.H.A. a Sokal R. R. (Numerica1 Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA, 1973): Wilbur W.J. a Lipman D.J. (Proč. Natí. Acad. Sci USA 80, str. 726 až 730, 1983).

Jinak se může optimální seřazení sekvencí k porovnání provádět lokálním algoritmem identity (Smith and Waterman Add. APL. Math 2, str.482, 1981), řazeným algoritmem identity (Needleman and Wunch, J. Mod. Biol. 48, str. 443, 1970), pát58 ráním po způsobech podobnosti (Pearson a Lipman, Proč. Nati. Acad. Sci .' USA 85, str. 2444, 1988), číslicovým doplněním těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA a TFASTA ve Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG) Science Dr. , Madison, HI) nebo inspekcí,

Jedním výhodným příkladem algoritmů, které se hodí ke stanovení procenta sekvenční identity a sekvenční podobnosti, jsou algoritmy BLAST a BLAST 2,0, které popsal Altschul a kol. (Nucl. Acids Res. 25, str. 3389 až 3402, 1977) a Altschul a kol. (J. Mol. Biol. 215, str. 403 až 410, 1990). Algoritmů

BLAST a BLAST 2,0 může být použito, například se zde popsanými parametry k určení procentové identity sekvencí polynukleotidů podle vynálezu. Softwar k provádění BLAST analýz je obchodní produkt (společnost National Center for Biotechnology Information). Podle objasňujícího příkladu pro nukleotidové sekvence je možno použít k výpočtu kumulativního skoré parametrů M (odměňující skoré pro dvojici měřených zbytků; vždy větší než nula) a (trestné skoré pro nevhodně spojené zbytky; vždy menší než nula). Rozšíření slova “hits” v každém směru se zastaví, když: skoré kumulativního seřazení vypadne v množství X z maximálně dosažené hodnoty: komulativní skoré se blíží k nule nebo níže, v důsledku nahromadění jednoho nebo několika negativně skorujících zbytkových seřazení; nebo se dosáhne konce některé sekvence. Parametry Η, T a X algoritmu BLAST určují citlivost a rychlost seřazení. Program BLASTN (pro nukleotidové sekvence) používající prodlení a slovní délku (Wordlength“ W) 11 a očekávání (“expectation E) 10 a skorovací matrice BL0SUM62 (Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, str. 10915, 1989) seřazení, (B) 50, očekávání (E) 10, M = 5, N = -4 a porovnání dvou řetězců.

S výhodou se procentová sekvenční identita stanovuje porovnáním dvou optimálně seřazených sekvencí v okně srovnání alespoň 20 pozic, přičemž porce po1ynuk1eidové sekvence v po59 rovnávacích oknech může obsahovat adicí nebo delecí (to znamená mezeru) 20 % nebo méně, zpravidla 5 až 15 % nebo 10 až 12 %, ve srovnání s referenčními sekvencemi (které neobsahují adice nebo delece) pro optimální seřazení dvou sekvencí. Procento se vypočte stanovením počtu pozic, ve kterých jsou identické báze nukleové kyseliny v obou sekvencích k dosažení počtu sledovaných pozic, dělením počtu sledovaných pozic celkovým počtem pozic v referenční sekvenci (to je velikost okna) a násobením výsledků stem k získání výsledného procenta sekvenční identity.

Pracovníkům v oboru je jasné, že, výsledkem degenerace genetického kódu, jsou četné nukleotidové sekvence, které kódují polypeptid zde popisovaný. Některé z těchto polynukleotidů mají minimální homologii k nukleotidové sekvenci jakéhokoliv nativního genu. Nicméně polynukleotidy, které se mění v důsledku roždílporceů použitého kodonu, jsou předmětem zájmu tohoto vynálezu, Vynlez zahrnuje aleiy genů, obsahujících polynukleot idové sekvence zde popisované. Alely jsou endogenní geny, které se obměňují jako výsledek jedné nebo několika mutaci, jako jsou delece, adice a/nebo substituce nukleotidů. Rezultucící mRNA a protein mohou, avšak nemusí, mít obměněnou strukturu nebo funkci. Alely se mohou identifikovat o sobě známými způsoby (jako jsou hybridizace, zesílení a/nebo porovnání databázových sekvencí).

Vynález se tedy také týká použití mutagenezí, jako jsou pro místo specifické mutageneze, pro přípravu imunogenních variant a/nebo derivátů zde popisovaných polypeptidů. Takovým způsobem se mohou provádět specifické modifikace polypeptidových sekvencí mutagnezí polynukleotidů, které je kódují. Tyto způsoby jsou pokrokovým přístupem pro přípravu ^testovacích sekvenčních , variant, například začleněním jednoho nebo několika úvah, zavedením jedné nebo několika nukleotidových sekvenčních zněm do po1ynuk1eotidu.

- 60 i', !) ' > !> ! 1.

u , : i » 1 i ! ’ · >

- ',( >> , . ; í i » ; » ’- i : ' >

' 1 ' ’ ) > - ·. >·»->

Pro místo specifická Butageneze umožňuje produkci mutantů použitím specifických oligonukleidových sekvencí, které kódují DNA sekvenci žádoucí mutace, jakož také dostatečný počet přilehlých nukleotidů za poskytnutí priměrové sekvence dostatečné velikosti a sekvenční komplexnosti k vytvření stabilního duplexu na obou stranách delečního spojení. Mutace se mohou použít pro vybrané polynukleotidé sekvence ke zlepšení, ke směně, k odbourání, k modifikaci nebo k jiné změně vlastností samotného polynukleotidu a/nebo ke změně vlastností, aktivity, složení, stability nebo primární sekvence kókovaného polypept i du.

Podle určitých provedení vynálezu se uvažuje fflatagenéze polynukleotidových sekvencí podle vynálezu pro měnění jedné nebo několika vlastností zakódovaného polypeptidu, jako imunogenicity po 1 ypept i do vé vakciny,- Techniky pro místně specifické matagenéze jsou v oboru dobře známé a široce využívané k vytvoření variant jak polypeptidů tak polynukleotidů. Například se místně specifické mutageneze často používá k měnění specifické porce DNA molekuly. Podle takového provedení se používá primer obsahující zpravidla přibližně 14 až přibližně 25 nukleotidů ve své délce s přibližně 5 až přibližně 10 změněnými zbytky na obóu stranách spojení sekvence.

Pracovníkům v oboru je jasné, že pro místo specifická mutageneze často používá fágového vektoru, který je jak v jednořetězcové tak ve dvouřetězcové formě. Typické vektory, použitelné v místně cílené mutageneze, zahrnují vektory, jako je M13 fág. Tyto fágy jsou snadno obchodně dostupné a jejich používání je pracovníkům v oboru obecně známo. Dvouřetězcové plasmidy se také rutinně používají pro místně cílenou ffiutagenezi, která eliminuje stupeň přenosu příslušného genu z plasmidu na fág.

Místně řízená mutageneze podle vynálezu se provádí nej-- dříve za získání jednořetězcového vektoru nebo odtavením dvou řetězců z dvouřetězcového vektoru, který zahrnuje ve své sekvenci DNA sekvenci, která kóduje žádaný pěptid. 01igonukleoti dový primer, nesoucí žádanou mutovanou sekvenci,, se připravuje obecně synteticky. Tento primer se pak konjuguje s jednořetězcevým vektorem a podrobuje se DNA polymerizujícím enzymům, jako je E.coli polymeráza I Klenowův fragment, k ukončení syntézy řetězce nesoucího mutaci. Tak se vytvoří heteroduplex, přičemž jeden řetězec kóduje původní nemutovanou sekvenci a druhý řetězec nese žádanou mutaci. Heteroduplexový vektor se pak používá ke transformaci vhodných buněk, například buněk E. coli, a selektuji se kiny, které zahrnují rekombinantní vektory nesoucí mutované sekvenční uspořádání.

Příprava sekvenčních variant selektovaných peptid kódujících DNA segmentů za použití místně řízení mutageneze je prostředkem pro výrobu potenciálně užitečných druhů a není míněna jako omezení, jelikož existují jiné způsoby, kterými se mohou získat sekvenční varianty peptidů a DNA sekvence, které je kódují. Například rekombinantní vektory, kódující žádanou peptidovou sekvenci, se mohou zpracovávat mutagenními činidly, jako jsou hydroxylamin, k získání sekvenčních variant. Specifické podrobnosti takových způsobů a protokoly popsal Maloy a kol. (1994), Segal (1974), Prokop a Bajpai (1991); Kuby (1994); a Maniatis a kol. (1982).

Výrazem “oligonukleotidem řízená mutageneze“ se zde vždy míní na matrici závislý proces a vektorem zprostředkovávaná propagace, která vede ke zvýšení koncentrace specifické molekuly nukleové kyseliny se zřetelem na její počáteční koncentraci nebo ke zvýšení koncentrace zjistitelného signálu, jako je zesílení. Výraz “oligonukleotidem řízená mutageneze“ se týká způsobu, který zahrnuje na matrici závislé prodloužení primerové molekuly. Výrazem “na matrici závislé se vždy míní syntéza nukleové kyseliny RNA nebo DNA molekuly, přičemž sek^{1 !} - ,03 - , ;

vence nově syntetizovaného řetězce nukleové kyseliny je řízena dobře známými pravidly komplementárního párování bází (například Hatson, 1987). Zpravidla vektorem zprostřekovávaná metodika zahrnuje začlenění fragmentu nukleové kyseliny do DNA nebo RNA vektoru, klonové zesílení vektoru a získání zešíleného fragmentu nukleové kyseliny. Příklady takových metod jsou popsány zvláště v americkém patentovém spise číslo US 4 237224.

Jiným přístupem k produkci polypeptidových variant podle vynálezu je rekurzní sekvenční rekombinace, popsaná v americkém patentovém spise číslo US 5837458. Podle tohoto způsobu se opakující cykly rekombinace a skríningu nebo selekce provádějí tak, aby vyvolávaly jednotlivé polynukleotidové varianty podle vynálezu mající například podpořenou imunogenickou aktivitu.

Podle jiného provedení se mohou zde popisované polynukleot idové sekvence výhodně využívat jakožto sondy nebo primery pro hybridizaci nukleové kyseliny. Uvažuje se, že zvláštní užitečnost mají segmenty nukleové kyseliny, které obsahují sekvenční region s alespoň přibližně 15 přilehlými nukleotidy, které mají stejnou sekvenci jako 15 nukleotidových dlouhých přilehlých sekvencí podle vynálezu newbo komplementární sekvenci k 15 nukleotidovým dlouhým přilahlým sekvencím. Delší přilehlé identické nebo komplementární sekvence například sekvence mající přibližné 20, 30, 40, 50, 1OO, 200, 500, 1000 (včetně všech mezilehlých délek) a dokonce plnou sekvenční délku se rovněž používají v určitých provedeních.

Schopnost takových sond nukleové kyseliny, specificky hybridizovat na určitou sekvenci, umožňuje její použiti při detekci přítomnosti komplementárních sekvencí v daném vzorku. Počítá se však také s jiným použitím například s použitím jako informační sekvence pro přípravu mutantových druhů primerů nebo primerů pro použití při přípravě jiných genetických koni-» 69 >··»·> ϊ ) ) ) » ( > i > >

i ) ) ) ) ) ) ) strukcí.

Polynukleotidová molekuly, mající sekvenční regiony sestávající s přilehlých prodloužených nukleotidů mající napřík.lad 10 až 14, 15 až 20, 30, 50 nebo dokonce 100 až 200 nukleotidů (včetně mezilehlých délek), identické nebo komplementární k polynukleotidové sekvenci podle vynálezu, mají zvláštní význam jako hybridizačni sondy pro použití například ve způsobu Southern a Northern blotting. To umožňuje analýzu genového produktu nebo jeho fragmentu vždy v odlišných typech buněk a také v různých bakteriálních buňkách. Celková velikost fragmentu, jakož také velikost komplementárního prodloužení (“stretch) závisí na záměru použití nebo na použití zvláštního segmentu nukleové kyseliny. Menší fragmenty se zpravila používají v hybridizačních provedeních, přičemž se délka přilehlého komplementárního regionu může měnit, například od přibližně 15 do přibližně 100 nukleotidů avšak větší přilehlé komplementarity prodloužení se může použít podle délky komplementárních sekvencí, které se mají stanovit.

Použití hybridizační sondy s přibližně 15 až 25 nukleotidy v délce umožňuje vytvořit duplexní molekulu, která je jak stálá tak selektivní. Molekuly mající přilehlé komplementární sekvence v prodloužení větším než 15 bází v délce jsou obecně výhodnější ke zvýšení stability a selektivity hybridu a tím ke zlepšení kvality a stupně spécificity hybridové molekuly. Obvykle se dává přednost konstrukci molekul nukleové kyseliny majících gen komplementární prodloužení 15 až 25 přilehlých nukleotidů nebo popřípadě ještě delších.

Hybridizační sondy se mohou selektovat z jakékoliv porce jakýchkoliv sekvencí podle vynálezu. To vše je žádoucí pro přezkoumání sekvencí podle vynálezu nebo pro jakoukoliv kontinuální porci sekvencí od přibližně 15 až 25 nukleotidů v délce až do plné délky sekvence a včetně této plné délky, pokud je >-> 6·^ - ' -> > > \ » » > > >

> ! ( > . ) ) ' ) 1 * * ) ) ) > ) 1 ) » > > >

» 1 , ·» > » λ ' > » » ) 1 ’> ) 1 ) zájem ο použiti jako sondy nebo primeru. Volba sondových a příměrových sekvencí se může řídit různými faktory, například může být žádoucí použít primery ze současného zakončení celkové sekvence.

Malé polynukleotidové segmenty nebo fragmenty se mohou snadno připravit například přímou syntézou fragmentu chemickými způsoby, jak se běžně provádí za použití automatizovaného oligonukleotidového syntetizéru. Rovněž fragmenty se mohou zíksat použitím reprodukční technologie nukleové kyseliny, jako je PCR™ technologie podle amerického patentového spisu číslo US 4 683202, zavedením vybraných sekvencí do rekombinantních vektorů pro rekombinantní produkci a jinými DNA rekombinantními způsoby obecně známými pracovníkům v oboru molekulárníbiologie.

Nukleotidové sekvence podle vynálezu se mohou používat podle své schopnosti selektivněji vytvářet duplexové molekuly s komplementárním prodoužením celého příslušního genu nebo fragmentu příslušného genu. V závislosti na záměru použití se zpravidla žádá použít rozdílných podmínek hybridizace k dosažení různých stupňů selektivity sondy se zřetelem na cílovou sekvenci. Pro použití vyžadujících vysokou selektivitu je zpravidla žádoucí používat poměrně přísných podmínek k vytvoření hybridů, například se volí poměrně nízké množství soli a/nebo vysoká teplota k dosažení koncentrace soli přibližně o

0,02 M až přibližně 0,15 M při teplotě přibližně 50 C až přibližně 70 C. Takové selektivní podmínky málo, pokud vůbec, tolerují nevhodné spojení mezi sondou a matricí nebo cílovým řetězcem a byly by zvláště vhodné pro izolaci příbuzných sekvencí.

Pro některá použití, například pokud je žádoucí připravit mutanty za použití mutantového příměrového řetězce hybridováného do podložené matrice, jsou méně přísné (snížená i ) přísnost) hybridizačni podmínky zpravidla zapotřebí k umožnění vytvořit heteroduplex. V takovém případě může být žádoucí používat soli například přibližně 0,15 M až přibližně 0,9 M při o o teplotě přibližně 20 C až přibližně 55 C, Zkřížené, hybridi začni druhy mohou být tak snadněji identifikovány jako positivně hybridizační signály se zřetelem na kontrolní hybridizaci . V mnoha případech se obecně hodnotí, že podmínky mohou být mnohem přísnější adicí vzrůstajícího množství formamidu, který slouží k destabi1izaci hybridového duplexu stejným způsobem jako zvýšená teplota. Hybridizační podmínky se tak mohou snadno manipulovat a obecně se může volit způsob podle žádoucích výsledků.

Podle jiného provedení se vynález týká polynukleoti dových prostředků obsahujících oligonukleotidy bez informačního obsahu (antisense) . 01 igonukleotidy bez informačního obsahu jsou účinnými a cílovými inhibitory syntézy proteinů a tím znamenají terapeutický přístup, při kterém se nemoc může léčit inhibicí syntézy proteinů, které podporují nemoc. Účinnost oligonukleotidů bez informačního obsahu na inhibici syntézy proteinů je dobře dokázaná. Například syntéza polygalakturonázy a muskarin typ 2 acetylcholinového receptoru se ihnibuje o1igonukleotidy bez informačního obsahu zaměřenými na jejich odpovídající mRNA sekvence (americký patentový spis číslo US 5 739119 a US 5 759829). Příklady inhibice bez informačního obsahu byly objasněny s nukleárním proteinem cyklin, s genem odolávajícím množině drog (MDG1), ICAM-1, E-selektin, STK-1, striatal GABAa receptor a lidský J2GF (Jaskulski a kol., Science 240 (4858) str. 1544 až 1546, 10. července 1988; Vasanthakumar a Ahmed, Cancer Commun. 1(4) str. 225 až 232, 1989; Peris a kol., Brain Res. Mol Brain Res 57(2), str. 310 až 320,

15. července 1998; americký patentový spis číslo US 5 801154; US 5 789573; US 5 718709 a US 5 610288). Konstrukty bez informačního obsahu podle publikací inhibují a mohou se používat k ošetřování množiny abnormálních buněčných proliferací, na<-· , 66 příklad rakoviny (americký patentový spis číslo US 5 747470; US 5591317; a US 5 783683).

Proto podle určitých‘provedení se vynález týká oligonukleotidových sekvencí, které obsahují všechnu nebo porci každé sekvence která je schopná specifické va2by na polynukleotidovou sekvenci zde popisovanou, nebo je s ní komplementní. Podle jednoho provedení oligonukleotidy bez informačního obsahu obsahují DNA nebo její deriváty. Podle jiného provedení oligonukleot idy obsahují RNA nebo její deriváty. Podle třetího provedení jsou oligonukleotidy modifikovanými DNA obsahujícími fosforhiomodifikovanou kostru. Podle čtvrtého provedení obsahují oligonukleotidové sekvence peptidové nukleové kyseliny nebo jejich deriváty. V každém případě obsahují výhodné prostředky sekvenční region, který je komplementární a výhodněji v podstatě komplementární a ještě výhodněji dokonale komplementární s jednou nebo s několika porcemi polynukleotidů podle vynálezu. Selekce prostředku bez informačního obsahu specifických pro danou sekvenci je založena na analýze volené cílové sekvence a na stanovení sekundární struktury, Tm, vázací energii a relativní stabilitě. Prostředky bez informačního obsahu se mohou volit na základě své relativní neschopnosti vytvářet dimery, vlásenky nebo jiné sekundární struktury, které by snižovaly nebo znemožňovaly specifickou vazbu na cílovou mRNA v hostitelské buňce. Vysoce výhodnými cílovými regiony mRNA jsou regiony na AUG translačním iniciačním kodonu nebo v jeho blízkosti a takové sekvence, které jsou v podstatě komplementární s 5’ regiony mRNA. Mohou se provádět sekundární strukturní analýzy a selekce cílových míst například za použití analytického softwaru v.4 OLIGO primeru a/nebo BLASTN 2.0.5 algori trnového softwaru (Altschul a kol., Nucleic Acids Res. 25(17), str. 3389 až 3402, 1. září 1997).

Použití metody uvolňování bez informačního obsahu za použití krátkého peptidového vektoru ukončeného MPG (27 zbytků)

I ( >

m “ ¹ ‘ _t ¹ * > I I i -> > > i ) 1 , t · ' ' * , , ; ; >.)!> ) ’· se rovněž uvažuje. MPG peptid obsahuje hydrofóbní doménu odvozenou od fúsní sekvence HIV gp41 a hydrofilní doménu z nukleární lokalizační sekvence SV40 T-antigen (Morris a kol., Nucleic Acid Res., 25(14), str.2730 až 2736, 15. červenec 1997). Je doloženo, že některé molekuly MPG peptidu povlékají oligonukleotid bez informačního obsahu a mohou být uvolňovány do kultivačního prostředí savčích buněk dříve než za jednu hodinu s poměrně vysokou účinností (90%). Interakce s MPG silně zvyšuje jak stabilitu oligonukleotidu k nukleáze tak schopnost pronikat plasmovou membránou.

Podle dalšího provedení vynálezu polynukleotidový prostředek podle vynálezu se používá při konstruování a přípravu ribozymových molekul pro inhibici exprese nádorových polypeptidů a proteinů podle vynálezu v nádorových buňkách. Ribozymy jsou RNA proteinové komplexy, které štěpí nukleové kyseliny způsobem specifickým pro místo. Ribozymy mají specifické katalytické domény, které mají endonukleázovou aktivitu (Kim a Cech, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84(24), str. 8788 až 8792, prosinec 1987; Forster a Symons, Cell. 49(2), str. 211 až 220, 24. dubna 1987). Například velký počet ribozymů urychluje fosforesterové transferové reakce s vysokým stupněm spécificity často za štěpení pouze jednoho z množiny fosfoesterú voligonukleotidovém substrátu (Cech a kol·., Cell 27(E Pt 2), str. 487 až 496, prosinec 1981; Michel a Westhof, J. Mol. Biol. 216(3), str. 585 až 610, prosinec 1990; Reinhold-Hurek a Shub, Nátuře 257 (6374), str, 173 až 176, 14. května 1992). Tato spécificita se přičítá požadavku, že se substrát váže prostřednictvím specifických interakcí báze-párování na vnitřní vůdčí sekvenci (IGS) ribozymů před chemickou reakcí.

Šest základních variet přírodně se vyskytujících enzymatických RNA je známo v současné době. Každá může katalyžovat hydrolýzu RNA fosfodiesterových vazeb i trans (a tak může štěpit jiné RNA molekuly) za fyziologických podmínek. Obecně ·>

-> 68, - i ) .-. > > I >

) 1 * i i » enzymatické nukleové kyseliny působí první vazbou na cílovou RNA. K tátové vazbě dochází prostřednictvím cílové vázací porce enzymatické nukleové kyseliny, která se drží v těsné blízkosti k enzymatické porci molekuly, která působí ke štěpení cílové RNA. Proto enzymatická nukleová kyselina nejdříve rozpoznává a pak váže cílovou RNA prostřednictvím komplementárního párování bází a jakmile je vázána na správném místě, působí enzymaticky k odříznutí cílové RNA. Strategické štěpení takové RNA rozrušuje její schopnost přímo syntetizovat zakódovaný protein. Po tom, co se enzymatická nukleová kyselina váže a štěpí RNA cíl, uvolňuje se z RNA a hledá jiný cíl a může se opakovaně vázat a štěpit nové cíle.

Enzymatická povaha ribozymu je výhodnější než mnohé technologie, jako je technologie bez informačního obsahu (kde se molekula nukleové kyseliny jednoduše váže na cíl nukleové kyseliny k blokování translace), jelikož koncentrace ribozymu nutná pro terapeutické ošetřní je nižší než oligonukleotidu bez informačního obsahu. Tato schopnost se projevuje schopností ribozymu enzymaticky působit. Proto je jednotlivá molekula ribozymu schopná štěpit četné molekuly cílové RNA. Kromě toho je rybozym vysoce specifickým inhibitorem se spécificitou inhibice v závislosti nejen na bázovém pérovacím mechanizmu vázání na cílovou RNA, ale také na mechanizmu štěpení cílové RNA. Jednotlivé nevhodné spojení nebo bázová substituce blízko místa štěpení může dokonale eliminovat katalytickou aktivitu ribozymu. Podobné nevhodné spojení v molekulách bez informačního obsahu nezabránuje jejich působení (Woolf a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 89(16), str. 7305 až 7309, srpen 1992). Proto je spécificita působení ribozymu větší než spécificita oligonukleotidu bez informačního obsahu vázajícího stejné RNA místo.

Molekula enzymatické nukleové kyseliny může být vytvořena jako hlava kladívka, jako vlásénka, 5 virus hepatitis, skupina 1 intron nebo RNaseP RNA (spolu s RNA vůdčí sekvencí) nebo jako motiv Neurospora VS RNA. Příklad motivu kladívkové hlavy popsal Rossi a kol. (Nucleic Acids Res. 20(17), str. 4559 až 4565, 11. září 1992). Příklad motivů vlásenky popsal Hampel a kol. (evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EP 0360257), Hampel a Tritz (Biochemistry 28(12), str. 4929 až 4933, 13. června 1989), Hampel a kol. (Nucleic Acid REs. 18(2), str. 299 až 304, 25. ledna 1990) a je také popsán v americkém patentovém spise číslo US 5 631359. Příklad motivu S viru hepatitis popsal Perrotta a Been (Biochemistry 31(47), str. 11843 až 11852, 1. prosince 1992). Příklad motivu RNaseP popsal Guerrier-Takada a kol. (Cell 35(3 Pt 2), str. 849 až 857, prosinec 1983). Motiv Neurospora VS RNA ribozymu popsal Collins (Saville a Collins, Cell 61(4), str. 685 až 696, 18. května 1990; Saville a Collins, Proč. Nati. Acad. Sči USA 88 (19), str. 8826 až 8830, 1. října 1999): Collins a Olivě, Biochemistry 32(11), str. 2795 až 2799, 23. března 1993) a příklad skupiny I intronu je popsán v americkém patentovém spise číslo US 4 987071). Podle vynálezu je důležité, aby měla molekula enzymatické nukleové kyseliny specifické substrátové vázací místo, které je komplementární k jednomu nebo k několika cílovým genovým RNA regionům a aby měly nuk1eotidové sekvence uvnitř nebo obklopující substrátové vázací místo, které /

dodává štěpící aktivitu molekule RNA. Proto ribozymové konstrukty nejsou omezovány na specifické, zde zníměné, motivy.

Ribozymy se mohou označovat způsoby popsanými ve světové zveřejněné přihlšce vynálezu číslo W0 93/23569 a W0 94/02595 a mohou se syntetizovat k testování in vitro a in vivo, jak je popsáno. Takové ribozymy mohou být také optimalizovány pro uvolňování. Jakkoliv existují specifické příklady je známo, že mohou být popřípadě použity ekvivalenty RNA cílů v jiných druzích.

Ribozymová aktivita se může optimalizovat měněním délky %- ,£f ~ < · — » 4 W-W' fa - *-„ - , r, v - t-i, «. r w”,,a-WMJ->4« Λ •S^-^-tf ribozymového vázacího ranénka nebo chemickou syntézou ribozymů s modifikacemi, které předcházejí jejich odbourání sérovými ribonukleázami (napřiklad-světové zveřejněné přihlášky vynálezu číslo WO 92/07065; WO 93/15187; WO 91/03162; evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EP 92110298.4; americký patentový spis číslo US 5 334711 a světová zveřejněná přihláška vynálezu číslo WO 94/13688, přičemž tyto dokumenty popisují různé chemické modifikace, které se mohou provádět na cukerném podílu enzymatických^JRNA molekul), modifikacemi, které podporují jejich účinnost v buňkách a odstraněním kmenových II bází ke zkrácení RNA syntézní doby a ke snížení požadavků na chemikálie. ^x

Sul li van a kol . (světová zveřejněná přihláška vynálezu číslo WO 94/02595) popisuje obecné způsoby pro dodání enzymatických RNA molekul. Ribozymy se mohou podávat buňkám různými způsoby známými pracovníkům v oboru včetně, bez záměru na jakémkoliv omezení, zapouzdření do 1iposomů, iontoforézy nebo začlenění do jiného nosiče, jako jsou hydrogely, cyklodextriny, b iologicky odbouráte1né nanokapsle a bioadhezivni mi krokuličky. Pro některé případy ribozymy se mohou přímo dodávat ex vivo do buněk nebo tkání sě shora uvedenými nosiči nebo bez nich. Nebo se kombinace RNA/nosič může místně dodávat přímou inhalací, přímou injekcí nebo použitím katetheru, infuzní pumpy nebo stentu. Jako jiné cesty dodání se uvádějí, bez záměru na jakémkoliv omezení, podání intravaskulární, intraauskulární, subkutanní nebo kloubní injekcí, aerosolovou inhalací, orální (ve formě tablet nebo pilulek), topické, systémové, oční, intraperitoneálnl a/nebo intrathekální. Podrobnější popis dodání ribozymu a jeho podávání je ve světové zveřejněné přihlášce vynálezu číslo W0 92/23565.

Jinými způsoby akumulace vysokých koncentrací ribozymu nebo ribozymů v buňkách je začlenění ribozym kódujících sekvencí do DNA expresního vektoru. Transkripce ribozymových sek- 74 věnci začíná od promotoru pro eukařyotické RNA polymerázy I (pol I), RNA polymerázy II (pol II) nebo RNA polymgrázy III (pol III). Transkripty z pol II nebo z pol III promotorů jsou expresovány ve vysoké míře ve všech buňkách; Množství v promotoru pol II je dáno typem buňky a závisí na povaze genových regulačních sekvencí (například zesilovači, silencery) blízko obsažených. Prokaryotické RNA polymerázové promotory se rovněž mohou používat, pokud prokaryotický RNA polymerázový enzym se expresuje ve vhodných buňkách expresujících ribozymy expresovanými z takových promotorů fungujících v savčích buňkách. Takové transkripcní jednotky se mohou začleňovat do variet vektorů pro zavedení do savčích buněk, včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, plasmidových DNA vektorů, virových DNA vektorů (jako jsou adenovirus nebo adenoasociováné vektory) nebo virové RNA vektory (jako vektory retrovirové, viru Semliky forest a vektoru viru sidbis).

Vynález se také týká prostředků peptidových nukleových kyselin (PNA). PNA je DNA napodobující, přičemž jsou nukleobáze vázány na pseudopeptidovou kostru (Good a Nielsen, Antisense nucleic Acid Drug Dev. 7(4), str. 431 až 437, 1997). PNA se může využít v četných způsobech, které tradičně využívají RNA nebo DNA. Často se PNA sekvence lépe uplatňují v technikách než odpovídající RNA a DNA a mají užitečnosti, které nemají RNA a DNA. Přehled PNA a způsobu jejich přípravy, jejich charakteristik a způsobů použití popsal Corey (Tends Biotechnol. 15, str. 224 až 229, červen 1997). Podle určitých provedení se PNA sekvence mohou připravovat tak, aby byly komplementární s jednou nebo s několika porcemi ACE mRNA sekvencí a aby PNA prostředky mohly být použity k regulaci, obměně, odbourání nebo redukování translace ACE-spécifické mRNA a tím aby mohly měnit míru ACE aktivity v hostitelské buňce, které se takové PNA prostředky podáváj í.

PNA mají 2-aminoethylglycinové vazby nahrazující normál»” 7o3 » ► > ·>

> ) > y t > > ) ) Ί 1 » > » 1 1 » i · \

1 )

7 >

) I i

-i y ? t >

ní fosfodiesterovou kostru DNA (Nielsen a kol., Science 254 (5037), str. 1497 aš 1500, 6. prosince 1991; Hanvey a kol., Science 258 (5087), str. 1481 aš 1485, 27. listopadu 1992; Hyrup a Nielsen, Bioorg. Med. Chem. 4(1), str. 5 aš 23, leden 1994). Tato chemie má tři důsledky: předně na rozdíl od NDA nebo fosforthiooligonikleotidů jsou PNA neutrální molekuly; za druhé PNA jsou achirální, čímž není nutné vyvíjet stereoselektivni syntézy; za třetí PNA syntéza využívá standardních Boc a Fmóc protokolů pro peptidovou syntézu na pevné fázi jakkoliv jiné způsoby, včetně modifikovaného Merrifieldova způsobu, se mohou pouš í vat.

PNA monomery nebo snadno připravítelné oligomery jsou obchodně dostupné (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA). PNA syntézy buď podle Boc nebo Fmoc protokolů jsou jednoduché za použití ručních nebo automatizovaných protokolů (Norton a kol., Bioorg. Med. Chem. 3(4), str. 437 až 445, duben 1995) Ruční protokoly samy pomáhají produkci chemicky modifikovaných PNA nebo zároveň syntézu rodiny těsně příbuzných PNA.

Jako v případě syntézy peptidu úspěch syntézy určité PNA závisí na vlastnostech zvolené sekvence. Například zatímco teoreticky PNA může začleňovat kombinaci nukleotidových bází, může vést přítomnost přilehlých purinů k deleci jednoho nebo několika zbytků z produktu. Jelikož se počítá s touto potíží, doporučuje se pro produkci PNA s přilehlými puriny opakovat kopulaci zbytků, které se adovaly neúčinně. To je možné čištěním PNA reverzní fázovou vysoce výkonnou kapalinovou chromátografií poskytující výtěžky a čistotu produktu podobnou, jako se zjišťuje při syntéze peptidů.

Modifikace PNA pro dané použití se může provádět kopulací aminokyselin v průběhu syntézy na pevné fázi nebo vázáním sloučenin, které obsahují skupinu karboxylóvé kyseliny na exponovaný N-koncový amin. Nebo se PNA mohou modifikovat po synčištění nukleových kyselin, izolace transkripčně aktivních genů, blokování vazeb transkripčního faktoru, štěpení genomu, biosensory a hybridizace in šitu.

Identifikace polynukleotidů, charakterizace a exprese

Polynukleotidové prostředky podle vynálezu se mohou identifikovat, připravovat a/nebo se s nimi může zacházet pomoci rozmanitých dobře zavedených způsobů (obecně Sambrook a kol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Co ld Spring Harbor, NY, 1989 a podobné publikace). Polynukleotid může být například identifikován, jak je dále podrobněji popsáno, scríningem microřad cDNA z hlediska exprese související s nádory (tedy exprese, která je nejméně dvakrát větší v nádoru než v normální tkáni podle zde popsané reprezentativní zkoušky). Takový skríning se může provádět například způsobem microařad společnosti Affymetrix, lne. (Santa Clara, CA) podle výrobcových instrukcí (v podstatě jak ji popsal Schena a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, str. 10614 až 10619, 1996; a Heller a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA

94, str, 2150 až 2155, 1997). Alternativně mohou být polynukleot i dy zesilovány z cDNA připravených z buněk expresujících zde popisované proteiny, jako jsou nádorové buňky.

Existují četné způsoby závisející na matricích k zesílení cílových sledovaných sekvencí obsažených ve vzorku. Jedním z nejznámějších způsobů zesilování je polymerázová řetězová reakce (PCR™), která je podrobně popsána v amerických patentových spisech číslo US 4 683195, US 4 683202 a US 4 800159. V podstatě se v PCR™ připraví dvě priměrové sekvence, které jsou komplementární s regiony na opačných komplementárních řetězcích cílové sekvence. Do reákční směsi se přidá nadbytek deoxynukleotidových trifosfátů spolu s polymerázou DNA (tak zvanou Taq polymerázou). Jestliže je. ve vzorku obsažena cílová sekvence, primery se vážou k cíli a polymeráza způsobí, že se <»?>ί.ν^ί'ίβ=»»Λ#’Λ'^ΛΤί«'

- 7,5 primery rozloží podél cílové sekvence adicí na nukleotidy. Zvyšováním a snižováním teploty reakční směsi, prodloužené primery od cíle disociují za vytváření reakčních produktů, nadbytek primerů se váže k cíli a k reakčnímu produktu a proces se opakuje. S výhodou se může provádět reversní transkripce a zesilovací procedura PCR™ za účelem kvantifikace množství zesílené mRNA. Metodiky polymerázové řetězové reakce jsou v oboru dobře známy.

Každý z řady jiných způsobů závislých na matrici, z nichž mnohé jsou obměnou zesilovací způsobu PCR™, jsou již známé a v oboru používané. Pro objasnění lze uvést způsoby zahrnující ligázovou řetězovou reakci (nazývanou LCR) (například v evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo 320308 a americký patentový spis číslo US 4 883 750); Qbeta replikace (mezinárodní PCT zveřejněná přihláška vynálezu číslo PCT/US87/00880); zesílení vytěsňování řetězce (Strand Displacement Amplificati on, SDA) a opravná reakce řetěze^ (Repair Chain Reacti on,RCR) . Ještě další zesilovací způsoby jsou popsány v btiské zveřejněné přihlášce vynálezu číslo GB 2 202 328 a v mezinárodní PCT zveřejněná přihláška vynálezu číslo PCT/US89/01025. Jiné způsoby zesilovaní nukleových kyselin zahrnují zesilovací systémy založené na transkripci (TAS) (mezinárodní PCT zveřejněná přihláška vynálezu číslo W0 88/10315), včetně zesilování založeného na sekvenci nukleové kyseliny (NASBA) a 3SR. Evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EP 329 822 popisuje způsob zesilování nukleové kyseliny zahrnující cyklickou synthézu jednořetězcové RNA (ssRNA“), ssDNA a dvouřetězcové DNA (dsDNA). Mezinárodní PCT zveřejněná přihláška vynálezu číslo W0 89/06700 popisuje schéma zesilování sekvence nukleové kyseliny založené na hybridizaci sekvence promotér/primer na cílové jednořetězcové DNA (ssDNA) následované transkripcí mnoha RNA kopií sekvence. Pracovníkům v oboru jsou známé i jiné způsoby zesilování, jako je “RACE (Frohman, 1990) a one-sided PCR (Ohará, 1989).

_t - 76 ,Zesílené porce polynukleotidu podle vynálezu je mošno použít k izolování genu v plné délce ze vhodné knihovny (například z knihovny nádorových cDNA) použitím dobře známých způsobů. Při jednom takovém způsobu se skrínuje knihovna (cDNA nebo genomová) za pomušití jedné nebo několika polynukleotidových sond nebo primerů vhodných k zesílení. S výhodou se knihovna selektuje podle velikosti k zahrnutí větších molekul. Náhodně vybraným (primed) knihovnám se může také dávat přednost k identifikování 5 genů protisměrných regionů genů. Genomovým knihovnám se dává přednost k získání intronů a rozšiřování 5 sekvencí.

Pro hybridizačni způsobů může být parciální sekvence značena (například translací zlomů nebo koncovým značením ³²P) známým způsobem. Knihovna bakterií nebo bakteriofágů se pak obecně skrínuje hybridizací filtrů obsahujících denaturované kolonie bakterií (nebo trávníky (lawns) obsahující destičky fágů) značenou sondou (Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, 1989). Hybridizační kolonie nebo destičky se selektují a expandují a DNA se izoluje pro další analýzu. Klony cDNA mohou být analyzovány ke stanovení množství přídavné sekvence například PCR pomocí primeru z parciální sekvence a primeru z vektoru. Restrikční mapy a parciální sekvence mohou být generovány k identifikování jednoho nebo několika překrývajících se klonů. Úplná sekvence může pak být stanovena použitím o sobě známých způsobů, které mohou zahrnovat generování řady delečních klonů. Výsledné překrývající se sekvence mohou být seskupeny do jediné přilehlé sekvence. Molekula cDNA plné délky může být generována 1igací vhodných fragmentů použitím známých způsobů.

Alternativně mohou být shora popsané zesilovací způsoby užitečné k získání kódující sekvence plné délky z parciální sekvence cDNA. Jedním takovým zesilovacím způsobem je inversní

- ^7,7 PCR (Triglia á kol., Nucl. Acids Res. 16, str. 8186, 1988), který používá restrikčních enzymů ke generování fragmentu ve známém regionu genu. Fragment je cirkularizován intramolekulární Íigací a použit jako matrice pro PCR s divergentními primery odvozenými ze známého regionu. Podle alternativního provední mohou být sekvence sousedící s parciální sekvencí napraveny zesílením s primerem ke spojovníkové sekvenci a k primeru specifickému pro známý region. Zesílené sekvence se zpravidla podrobují druhému kolu zesílení se stejným spojovníkovým primerem a s druhým primerem specifickým pro známý region. Varianta tohoto způsobu, která používá dvou primerů, které iniciují prodloužení v opačných směrech od známé sekvence, je popsána ve světovém patentovém spise číslo WO 96/38591. Jiný takový způsob je znám pod označením rychlé zesílení konců cDNA (rapid amplification of cDNA ends“, neboli RACE). Tento způsob zahrnuje použití vnitřního primeru a vnějšího primeru, který hybridizuje k póly A regionu nebo ve vektorové sekvenci, k identifikování sekvencí, kterými jsou 5 a 3 známé sekvence. K dalším způsobům patří získávací (“capture“) PCR (Lagerstrom a kol., PCR Methods Applic. 1, str. 111 až 119, 1991) a vyhazovači “valking PCR (Parker a kol., Nucl. Acids. Res. 19, str. 3055 až 3060, 1991). Ostatních způsobů, používajících zesílení, může být také použito k získání sekvence cDNA plné délky.

V některých případech je možno získat plné délky sekvenci cDNA analýzou sekvenci v databázi expresované připojené sekvence (expressed sequence tag, EST) dostupných v genové bance. Pátrání po překrývajících se EST může být obecně provedeno pomocí dobře známých programů (například NCBI Blast searches) a takových EST je možno použít ke generování přilehlé sekvence plné délky. Sekvence DNA plné délky lze také získat analýzou genomových fragmentů.

Podle jiného provedení vynálezu je možno použít polynuk- 78 leotidových sekvencí nebo jejich fragmentů, které kódují polypeptidy podle vynálezu, nebo fúzních proteinů nebo jejich funkčních ekvivalentů v rekombinantních molekulách DNA k přímé expresi polypeptidu v příslušných hostitelských buňkách. Vzhledem k inherentní degeneraci genetického kódu, je mošno produkovat jiné sekvence DNA, které kódují v podstatě stejnou nebo funkčně ekvivalentní aminokyselinovou sekvenci a těchto sekvencí může být použito ke klónování a expresování daného polypeptidu.

Jak je pracovníkům v oboru známo, může být za jistých okolností výhodné produkovat nukleotidové sekvence kódující polypeptid, mající kodony, které se přírodně nevyskytují. Například kodony preferované konkrétním prokaryotickým nebo eukaryotickým hostitelem mohou být selektovány ke zvýšení míry exprese proteinu nebo k produkování rekombinantního DNA transkriptu majícího výhodné vlastnosti, jako je poločas životnosti, který je delší než poločas transkriptu generovaného přírodně se vyskytující sekvencí.

Polynukleotidové sekvence podle vynálezu mohou být konstruovány s použitím způsobů známých v oboru k měnění sekvencí kódujících polypeptid z rozmanitých důvodů včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, změn, které modifikují klónování, zpracování a/nebo expresi genového produktu. Například posouvání DNA nahodilou fragmentací a PCR přeskupování genových fragmentů a syntetických oligonukleotidů je možno použít ke konstruování nukleotidové sekvence. Kromě toho místně zaměřené mutageneze je mošno použít například k začleňování nových restrikčních míst, k měnění glykosylační modely, k měnění preference kodonů, k produkci štěpné varianty nebo k zavádění mutace.

Podle jiného provedení vynálezu mohou být přírodní, modifikované něbo rekombinantní sekvence nukleových kyselin vázány

- 79 na heterologové sekvence ke kódování fúzního proteinu. Například při pátrání v peptidových knihovnách po inhibitorech polypeptidové aktivity může být užitečné kódovat chimerní protein, který může být poznán obchodně dostupnou protilátkou. Fúzní protein může být také zkonstruován, aby obsahoval štěpné místo umístěné vedle polypeptid kódující sekvence a heterologové proteinové sekvence tak, že polypeptid může být rozštěpen a čištěn vzdáleně od heterologového podílu.

Sekvence, kódující požadovaný polypeptid, může být syntetizována vcelku nebo po částech za použití v oboru dobře známých chemických způsobů (Caruthers M.H. a kol., Nucl. Acids Res. Symp. Ser., str. 215 až 223, 1980; Horn T. a kol., Nucl. Acids Res. Symp. Ser., str. 225 až 232, 1980). Alternativně může být protein sám produkován chemickými způsoby k syntetizování aminokyselinové sekvence polypeptidu nebo jeho porce. Například se může syntéza peptidu provádět za použití způsobů s pevnou fází (Roberge J.Y. a kol. , Science 269, str. 202 až 204, 1995) a může být dosaženo automatické syntézy například použitím syntetizéru ABI 431A Peptide Synthertiser (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).

Nedávno syntetizovaný peptid může být čištěn preparativní vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií (například Creighton T., Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and CO., New York, N.Y.) nebo porovnatelnými v oboru známými způsoby. Složení syntetických peptidů může být potvrzeno aminokyselinovou analýzou nebo sekvencováním .(například odbouráním Edman degradation proceduře). Kromě toho amidokyselinová sekvence polypeptidu, nebo její část, může být měněna během přímé syntézy a/nebo kombinována chemickými způsoby se sekvencemi jiných proteinů, nebo jejich částí, k vytvoření variantního polypeptidu.

K expresováni žádaného polypeptidu mohou být nuktleotidové sekvence, kódující polypeptid, nebo funkční ekvivalenty začleněny do vhodného expresního vektoru, tedy vektoru, který obsahuje potřebné prvky pro transkripci a translaci začleněné kódující sekvence. Ke konstrukci expresních vektorů, obsahujících sekvence kódující žádaný polypeptid a příslušné transkripční a translační řídicí prvky, se může použit způsobů dobře známých pracovníkům v oboru. K těmto způsobům patří rekombinantní způsoby DNA, syntetické způsoby a genetické rekombinace in vivo. Takové způsoby jsou popsány v literatuře (například Sambrook J. a kol. Molecular Cloning, A Laboratory Manuál, Cold Spring Harbor Press 1989, Plainview, N.Y.: a Ausubel F.M. a kol., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.).

K zajištění obsahu a exprese polynukleotidových sekvencí je mošno použít řady expresních systémů vektor/host ite1. Patří k nim, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, mikroorganismy, jako bakterie transformované rekombinantním bakteriofágem, plasmidové nebo cosmidové DNA expresní vektory, kvasinky transformované kvasinkovým expresaním vektorem, buněčné hmyzí systémy infikované vektory expresujícími virus (například baculovirus), rostlinné buňky transformované virus expresujícími vektory (na příklad květákový mozajkový virus CaMV, tabákový mozajkový virus, TMV) nebo bakteriální expresní vektory (například TI nebo pBR322 plasmidy) nebo živočišné buněčné systémy.

Řídicími prvky” nebo “regulačními sekvencemi” obsašenými v expresním vektoru se míní netranslatované regiony vektorových zesilovačů, promotorů, netranslatovaných regionů 5 a 3 , které jsou v interakci s proteiny hostitelských buněk k provedeni transkripce a translace. Síla a specifičnost těchto prvků může být různá. V závislosti na použitém systému vektoru a hostitele, může být použito jakéhokoli počtu vhodných transkripcních a translačních prvků, včetně konstitutivních a za84 veditelných promotorů. Když se například klónují bakteriální systémy, může se používat zaveditelných promotorů, jako je hybrid lacZ promotor fagemidu BLUESCRIPT (Stratagene, La Jol la, CA) nebo plasmidu PSP0RT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). V buněčném systému savců se obvykle dává přednost promotorům ze savčích genů nebo ze savčích virů. Je-li nutno generovat buněčnou linii, která obsahuje několikanásobné kopie sekvence kódující polypeptid, může se s výhodou použít vektorů založených na SV40 nebo EBV s vhodným selektovatelným markérem.

V bakteriálních systémech může být volen kterýkoli z expresních vektorů v závislosti na zamýšleném použití pro expresovaný polypeptid. Je-li například potřeba velkých množství, například k indukci protilátek, může být použito vektorů, které usměrňuj í expresi velkého množství fúzních proteinů, které jsou právě vyčištěné. K takovým vektorům patří například, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, multifunkční klonující vektory E.colí a expresní vektory, jako je, BLUESCRIPT (Stratagene), ve kterých může být sekvence kódující žádaný polypeptid vázána do vektoru v rámci se sekvencemi pro aminokoncový Met a následnými sedmi zbytky β-galaktosidázy, takže se vytvoří hybridní protein; vektory pIN (Van Heeke G. a Schuster S. M., J. Biol. Chem. 264, str. 5503 až 5509, 1989). K expresování cizích polypeptidů je možno použít vektorů pGEX (Promega, Madison, Wis.) jako fúzních proteinů s glutation S-transferázou (GST). Obvykle jsou takové fúzní proteiny rozpustné a dají se snadno čistit z lysovaných buněk adsorpcí na glutation-agarových perlách následovanou elucí v přítomnosti glutationu. Proteiny, připravené v takových systémech, mohou být konstruovány tak, aby obsahovaly heparin, thrombin nebo faktory XA proteázových štěpných míst, takže žádaný polypeptid může být z podílu GST uvolňován libovolně.

V kvasinkách, Saccharomyces cerevisiae, je možno použít řadu vektorů obsahujících konstitutivní nebo zaváděcí promoto- 82 ry, jako je oř-faktor, alkoholoxidáza a PGH. Přehled je ve shora uvedené literatuře (Ausubel a kol. a Grant a kol. Methods Enzymol. 153, str. 516 až 544, 1987).

V případech, kde je použito rostlinného expresního vektoru, muže být exprese sekvencí kódujících polypeptidů vedena kterýmkoli znýmým promotorem. Například virových promotorů 35S a 19S CaMV může být použito samotných nebo v kombinaci s vůdčí sekvencí omega od TMV (Takamatsu N., EMBO J. 6, str. 307 až 311, 1987). Alternativně může být použito rostlinných promotorů, jako je malá subjednotka RUBISCO nebo promotorů teplotního šoku (Coruzzi G. a kol., EMBO J. 3, str. 1671 až 1680, 1984; Broglie R a kol., Science 224, str. 838 až 843 1984; a Winter J. a kol. Results Probl. Cell Díffer. 17, str. 85 až 105, 1991). Tyto konstrukty lze zavést do rostlinných buněk přímou transformací DNA nebo pathogeny zprostředkovanou transfekcí. Takové způsoby jsou popsány v obecně dostupné literatuře (například Hobbs S. nebo Murry L.E., ročenka McGraw Hill Yearbook of Science and Technology McGraw Hill, New York, N.Y. str. 191 až 196, 1992).

Použít lze také hmyzího systému k expresováni žádaného polypeptidů. Například v jednom takovém systému se Autographa californica nukleárního polyhedrosového viru (Autographa californica nucklear polyhedrosis virus, AcNPV) používá jako vektoru pro expresi cizích genů v buňkách Spodoptera frugiperda nebo v larvách Tri chopíusi a. Sekvence kódující polypeptid mohou být klonovány do neesenciálního regionu viru, jako je polyhedrinový gen a umístit za řízení polyhedrinového promotoru. Úspěšné inzerce polypeptid kódující sekvence zbaví polyhedrinový gen aktivity a vyprodukuje rekombinantní virus postrádající obalový protein. Rekombinantnícb virů je pak možno použít k infikování například buněk S. frugiperda nebo larev Trichoplusia, ve kterých může být žádaný polypeptid expresován (Engelhard E.K. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 91, str. 3224 až

- 83 3227, 1994).

V savčích hostitelských buňkách je obecně k disposici řada expresních systémů na virovém základě. Například v případech, kdy je použito jako expresního vektoru adenoviru, mohou být sekvence, kódující žádaný polypeptid, vázány do adenovirového transkripčně-translačního komplexu sestávajícího z pozdního promotoru a tripartitové vůdčí sekvence. Začlenění nepodstatného regionu El nebo E3 virového genomu může být použito k získání živého viru, který je schopen expresovat polypeptid v infikovayných hostitelských buňkách (Logan J. a Shenk T., Proč. Nati. Acad. Sci. 81, str. 3655 až 3659, 1984). Kromě toho je možno použít zesilovačů transkripce, jako je Rous sarcoma virus (RSV), zesilovač ke zvětšení exprese v savčích hostitelských buňkách.

K dosažení účinnější translace sekvencí kódujících žádaný polypeptid je mošno použít také specifických iniciačních signálů. Jako takové signály se uvádí příkladně ATG iniciační kodon a související sekvence. V případech, kdy se sekvence kódující polypeptid, jejich iniciační kodon a protisměrné sekvence začleňují do příslušného expresního vektoru, mohou být nutné transkripční a translační signály. Avšak v případech, kdy je začleněna pouze kódující sekvence nebo její porce, mají být zajištěny exogenní translacni řídící signály včetně ATG iniciačního kodonu. Kromě toho má být iniciační kodon ve správném čtecím rámci k zaručení translace celého inzertu. Exogenní translační prvky a iniciační kodony mohou být různého původu, jak přírodního tak syntetického. Účinnost exprese může být zlepšena začleněním zesilovačů transkripce, které se hodí pro příslušný použitý buněčný systém a které jsou posány v literatuře (Scharf D. a kol., Results Probl. Cell Differ. 20, str. 125 až 162, 1994).

Kromě toho může být zvolen kmen hostitelských buněk podle jejich schopnosti modulovat expresi začleněných sekvencí nebo ke zpracování expresovaného proteinu žádaným způsobem. K takovým modifikacím polypeptidů patří bez omezení acetylace, karboxylace, glykosylace, fosforylace, lipidace a acylace. Posttranslační zpracování, které štěpí prepro formu proteinu, se také může použít k usnadnění správného začleňování a/nebo vinutí a/nebo funkce. K zajištění správné modifikace a zpracování cizích proteinů je možno volit různé hostitelské buňky, jako CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 a WI38, které mají specifické buněčné vybaveni a charakteristické mechanismy pro takové post-trans1ační aktivity.

K dlouhodobé vysokovýtěžkové produkci rekombinantních proteinů je obecně výhodná stabilní exprese. Například buněčné linie, které stabilně expresují žádaný polynukleotid, se mohou transformovat použitím expresních vektorů, které mohou obsahovat replikační a/nebo endogenní expresní prvky virového původu a selektivní markerové geny na tomtéž nebo na odděleném vektoru. Po zavedení vektoru se mohou buňky nechat růst jedn až dva dny v obohaceném prostředí před zapojením do selektivního prostředí. Účel selektivního markéru je udělit odolnost vůči selekci a jeho přítomnost umožňuje růst a výtěžek buněk, které následně expresují začleněné sekvence. Odolné klony stabilně transformovaných buněk mohou být proliferovány pomocí tkáňových kultivačních způsobů vhodných pro příslušný typ buněk.

Ke získáni transformovaných buněčných linií se může použít různých selekčních systémů. Příkladně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, se uvádějí herpes simplex birus thimidinkinázy (Wigler M. a kol., Cell 11, str. 223 až 232 1977) a adeninfosforibosyltransferázové geny (Lovy I. a kol. Cell 22, str. 817 až 823, 1990), kterých je možno použít v tk.sup- nebo aprt.sup.-buňkách. Použít lze také antimetabolitové, antibiotické nebo herbicidní odolnosti jako základu pro selekci; například dhfr, který udílí odolnost methotrexatu (Wigler M. a i^isswwgí^^^Syí

8S< _;kol., Proč. Nat. Acad. Sci. 77, str. 3567 až 3570, 1980); npt, který udílí odolnost proti aminog1ykosidům, neomycinu a G-418 (Colbere-Garapin F, a kol., J. Mol. Biol. 150, str. 1 až 14,

1981); a ais nebo pat, které udílí odolnost proti chlorsulfuronu a fosfinotricin acety1transferáze (Murry), Jsou popsány přídavné selektovatelné geny, například trpB, které umožňují buňkám využít indolu místo tryptofanu, nebo hisD, které umožňují buňkám využít histinolu místo histidinu (Hartman S.C. a Mulligan R.C., Proč. Nati. Acad. Sci. 86, str. 8047 až 8051, 1988). Použití viditelných markérů získalo popularitu markérů, jako jsou anthocynanin, beta-glucuronidáza a její substrát GUS a luciferáza a její substrát luciferin, kterých se používá nejenom k identifikování transformantů, ale také ke kvantifikování množství přechodné nebo stálé exprese proteinu přisuzovatelnou specifickému vektorovému systému (Rhodes C.A a kol., Methods Mol. Biol. 55, str. 121 až 131, 1995).

Ačkoli přítomnost nebo nepřítomnost markér genové exprese naznačuje, že žádaný gen je také přítomen, je třeba jeho přítomnost a expresi potvrdit. Například je-li sekvence kódující polypeptid začleněna dovnitř markerové genové sekvence, mohou být rekombinantní buňky, obsahující sekvence, identifikovány nepřítomností markerové genové skupiny. Alternativně může být markerový gen umístěn v tandemu s peptid kódující sekvencí pod kontrolou jediného promotoru. Exprese markerového genu v odezvě na indukci nebo selekci obvykle rovněž indikuje expresi tandemového genu.

Alternativně mohou hostitelské buňky, které obsahují a expresují žádanou polynukleotidovou sekvenci, být identifikovány řadou způsobů známých pracovníkům v oboru. K těmto způsobům se bez záměru na jakémkoliv omezení počítá DNA-DNA nebo RNA-DNA hybridizace a způsoby proteinového biotestu nebo imunotestu, které zahrnují například způsoby na bázi membrány, roztoku nebo čipu pro detekci a/nebo kvantifikaci nukleové kyseliny nebo proteinu.

V oboru je známo mnoho protokolu k detekci a měření exprese polynukleotid kódujících produktu, za použití polyklonálních nebo monoklonálních protilátek specifických pro produkt. Příkladem jsou enzymy-řízená imunosorbentní zkouška (ELISA), radioimunotest (RIA) a fluorescencí aktivované třídění buněk (FACS). Dvoustranný monoklonálně založený imunotest, používající monoklonální protilátky reaktivní vůči dvěma neiterferujícím epitopům na daném polypeptidu, mohou být výhodné pro některé aplikace, lze však také použít konkurenční vazebnou zkoušku. Tyto a ostatní zkoušky popsal napři- klad Hafflton R. a kol. (Sérologie Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul. Minn. 1990) a Maddox D.E. a kol. (J. Exp. Med. 158, str. 1211 až 1216, 1983).

Pracovníkům v oboru je známa řada způsobů značení a konjugace a může jich být použito v různých zkouškách nukleových kyselin a aminokyselin. Prostředky k vytváření značkovací hybridizace nebo sond PCR k detekci sekvencí týkajících se polypeptidů zahrnují oligoznačení, posun jednořetězcového zlomu, koncové značení nebo PCR zesílení pomocí značeného nukleotidu. Alternativně mohou být sekvence, nebo jejich jakékoli porce klonovány do vektoru pro produkci mRNA sondy. Takové vektory jsou v oboru známy, jsou obchodně dostupné a může se jich používat k syntéze RNA sond in vitro přidáním příslušné RNA polymerázy, jako jsou T7, T3 nebo SP6 a značené nukleotidy. Tyto způsoby mohou být prováděny za použití obchodně dostupných kitů. Jakožto vhodné reportérové molekuly nebo značky, kterých lze použít, se uvádějí například radionukleotidy, enzymy, fluoresceční, chemi luminiscenční nebo chromogenická činidla i substráty, kofaktory, inhibitory, magnetické částice.

Hostitelské buňky, transformované žádanou polynukleotidovou sekvencí, mohou být kultivovány za podmínek vhodných pro expresi a pro výtěžek proteinu z buněčné kultury. Protein, produkovaný rekombinantní buňkou, může být sekretován nebo ob>Λ;».«Μί.ϊΐ«Χίκ«<ι ,- 87, sazen intracelulárně v závislosti na použité sekvenci a/nebo na použitém vektoru. Jak je pracovníkům v oboru známo, mohou být expresní vektory obsahující polynukleotidy podle vynálezu konstruovány tak, aby obsahovaly signální sekvence, s přímou sekrecí kódovaného polypeptidů přes prokaryotickou nebo eukaryotickou buněčnou membránu. K připojení sekvencí kódujících žádaný polypeptid k nuk1eotidové sekvenci kódující polypeptidovou doménu, která usnadní čištění rozpustných proteinů, je možno použít i jiných rekombinantních konstrukcí. Jako takové domény usnadňujícím čištění se příkladně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, uvádějí kov chelatující peptidy jako histidin-tryptofanové moduly, které dovolují čištění na imobilizovaných kovech, proteinové A domény, které umožňují čištění na imobi1izovaném imunoglobulinu a domény používané ve FLACS extenzním/afinitním čisticím systému (Immunex Corp., Seatle, Wash.). Začlenění štěpných spojovníkových sekvencí, jako jsou sekvence specifické pro faktor XA nebo enterokinázu (Invilrogen, San Diego, Ca.) vedle čisticí domény a zakódovaného polypeptidu může být použito k usnadnění čištění. Jeden takový expresní vektor zajišťuje expresi fúzního proteinu obsahujícího žádaný polypeptid a nukleovou kyselinu kódující šest histidinových zbytků předcházejících thioredoxinové nebo enterokinázové štěpné místo. Histidinové zbytky usnadňují čištěni na imobilizované kovové iontové afin i tni chromátografi i (immobilized metal ion affinity chromatography, IMIAC), (Porath J. a kol., Prot. Exp. Purif. 3, str. 263 až 281, 1992), zatímco enterokinázové štěpné místo poskytuje prostředky pro čištění žádaného polypeptidů od fúzního proteinu. Pojednání o vektorech, které obsahují fúzní proteiny, napsal Kroll D.J. a kol. (DNA Cell Biol. 12, str. 441 až 453, 1993).

Vedle rekombinantních výrobních způsobů, mohou se polypeptidy podle vynálezu a jejich fragmemty vyrábět přímou syntézou peptidů za použití způsobů na pevné fázi (Merrifield J., J. Am. Chem. Soc, 85, str. 2149 až 2154, 1963). Syntézu proteinů > i 88 ->

> ' > » > > » ) ) ! >

> - i ) I ) » > ) i » ) ) i ) » ) je mošno provádět ručně nebo automatizovaně. Automatizovanou syntézu lze dosáhnout například použitím zařízení Applied Biosystems 431A Peptide Syntethiser (Perkin Elmer). Alternativně se mohou různé fragmenty chemicky syntetizovat odděleně a kombinovat s použitím chemických způsobů k vytvoření molekuly plné délky.@LH 4

Složení protilátek, jejich fragmentů a jiných vázacích činidel

Vynález se týká dále vázacích činidel, jako jsou protilátky a jejich antigen-vázající fragmenty, které vykazují imunologické vazby na nádorový polypeptid podle vynálezu, nebo na jeho porci, variantu nebo derivát. Protilátka, nebo její antigen vázající fragment specificky váže, imunologicky váže” a/nebo je imunologicky reaktivní“ vůči polypeptidů podle vynálezu, pokud zjistitelně reaguje (například v testu ELISA) s polypeptidem a nereaguje zjistitelně s nepříbuznými polypeptidy za podobných podmínek.

Imunologická vazba zde znamená obecně nekoválentní interakci takového typu, který je mezi imunoglobulinovou molekulou a antigenem, pro který je imunoglobulin specifický. Síla, nebo afinita imunologických vázacích interakci může být vyjádřena jako disociační konstanty (Ka) interakce, přičemž menší hodnoty Ka znamenají větší afinitu. Imunologické vázací vlastnosti vybraných polypeptidů mohou být kvantifikovány v oboru dobře známými způsoby. Jeden takový způsob je založen na měření míry tvorby a disociace komplexu antigen vázací místo/antigen, přičemž tato míra závisí na koncentracích komplexních partnerů, na afinitě interakcí a na geometrických parametrech, které rovněž ovlivňují míru v obou směrech. Lze tedy stanovit jak konstantu “on rate constant“ (Kon) tak konstantu off rate constant (Koff) vypočtením koncentrací a skutečné míry asociace a disociace. Poměr konstant Koff/Kon umožňuje vyloučit ,, ,·, 89 ) l .

» ) ) ) » > > I )

Ί ) ) ) >')>>

všechny parametry neodvozené od afinity, a je tudíž roven disociační konstantě Ka (Davies a kol., Annual Rev. Biochem. 59, str. 439 až 473, 1990).

Antigenové vázací místo (antigen binding site ) nebo vázací porce (binding portion) protilátky se týká molekuly imunoglobul inu, která se podílí na vazbě antigenu. Vazební místo antigenu je tvořeno aminokyselinovými zbytky N-koncových variabilních ( V“) regionů těžkých (Η) a (L“) lehkých řetězců. Tři úseky vysoce divergentně rozptýlené uvnitř V regionů těžkých a lehkých řetězců se nazývají hypervariabilni regiony, které jsou vloženy mezi více konzervovaná lemovací prodloužení známá jako úseky základní struktury (framework regions” neboli “FR“). Označení “FR” se týká afflinokyselinových sekvencí, které se přirozeně nacházejí mezi a vedle hypervariabi lních regionů v imunoglobulinech. V proti látkové molekule jsou tři hypervariabilni regiony lehkých řetězců a tři hypervariabi lni regiony těžkých řetězců umístěny ve vzájemné poloze ve trojrozměrném prostoru k vytvoření povrchu vázacího antigen. Antigen vázající povrch je koplementární s trojrozměrným povrchem vázaného antigenu a tyto tři hypervariabi 1ní regiony každého z těžkých a lehkých řetězců se nazývají regiony určující komplementaritu (complementarity-determining regions neboli CDR).

Vázací činidla mohou být dále schopna diferenciace mezi pacienty s rakovinou a bez rakoviny, jako je rakovina prostaty, za použití reprezentativních testů podlé vynálezu. Například protilátky nebo jiná vázací činidla, která se vážou na nádorový protein, vytvářejí s výhodou signál vyznačující rakovinu u alespoň 20 % pacientů s touto chorobou, výhodněji až 30 % pacientů. Alternativně nebo přídavně, vytváří protilátka negativní signál vyznačující neexistenci nemoci u alespoň 90 % pacientů bez rakoviny. K určení, zda vázací činidlo splňuje tuto podmínku, mohou se zkoumat, jak je zde popsaáno, biologické ! ) > » ) 1 ; Ί ι ) ϊ ) vzorky (například krev, sérum, sputum, moč a/nebo nádorové biopsie) od pacientů s rakovinou a bez rakoviny (jak se zjišťuje standardními klinickými testy) z hlediska přítomnosti polypeptidů, které se vážou na vázací činidlo. S výhodou se zkoumá statisticky významný počet vzorků s nemocí nebo bez nemoci. Každé vázací činidlo by mělo splňovat shora uvedená kriteria; avšak pracovníkům v oboru je známo, še vázacích činidel může být použito v kombinaci ke zlepšení citlivosti.

Každé činidlo, které splňuje uvedené požadavky, může být vázacím činidlem. Například může být vázacím činidlem ribosom s peptidovou složkou nebo bez ní, molekula RNA nebo polypeptid. Ve výhodném provedení je vázacím činidlem protilátka nebo její fragment vázající antigen. Protilátky se mohou připravovat jakýmkoli známým způsobem pracovníkům v oboru (například Harlow a Lané, Ant ibodi es^: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, 1988). Obecně lze protilátky připravovat kultivací buněk, včetně generování monoklonálních protilátek, jak je zde popsáno, nebo transfekcí genů do vhodných bakteriálních nebo savčích hostitelských buněk k umožnění produkce rekombinantních protilátek. Při jednom způsobu se imunogen obsahující polypeptid napřeď injekčně vpraví do velmi rozmanitých savců (například myší, krys, králíků, ovcí a koz). Při této operaci mohou polypeptidy podle vynálezu sloužit jako nemodifikovaný imunogen. Alternativně, zejména u poměrně krátkých polypeptidů, může být vyvolána vyšší imunitní odezva, jeli polypeptid spojen s nosným proteinem, jako je albumin hovězího séra nebo keyhole přídržná (keyhole límped“) hemocyanin. Imunogen se injektuje do živočišného hostitele, s výhodou podle předem stanoveného seznamu, obsahujícího jednu nebo několik posilovačích imunizací a živočichovi se periodicky odebírá krev. Polyklonální protilátky specifické pro polypeptidy se pak mohou čistit od takových antisér, například afinitní chromatografií za použití polypeptidu kopulovaného na vhodný pevný nos i č.

^pí^i^ňgW^^ííSŘ^áíiuftKř^

Monoklonální protilátky, specifické pro žádaný antigenový polypeptid, se mohou připravovat například způsobem, který popsali Kohler a Mílstein (Eur. J. Immunol. 6, str.511 až 519, 1976) a který je popřípadě vylepšen. Tyto způsoby zahrnují přípravu nesmrtelných buněčných řad schopných vytvářet protilátky mající požadovanou specifičnost (například reaktivitu s žádaným polypeptidem). Takové buněčné linie se mohou vytvářet například ze slezinných buněk získaných od imunizovaných zvířat. Slezinné buňky se pak imortalizují například fúzí buněk myeloma fúzního patnera, který je s výhodou syngenický s imunizovaným živočichem. Použit lze četných fúzních způsobů. Například buňky sleziny a myeloma se mohou kombinovat s neionickým detergentem po dobu několika minut, načež se natřou při nízké hustotě na selektivní medium, které podporuje růst hybridních buněk, nikoli však buněk myeloma. Výhodný selektivní způsob používá selekce HAT (hypoxanthinu, aminopterinu, thymididu). Po dostatečně dlouhé době, přibližně jednoho až dvou týdnů, se pozorují kolonie hybridů. Oddělí se jednotlivé kolonie a jejich supernatanty se testují na vázací aktivitu vůči polypeptidu. Přednost se dává hybridomům majícím vysokou reaktivitu a specifičnost.

Monoklonální protilátky se mohou izolovat ze supernatantů rostoucích kolonií hybridom. Kromě toho je možno použít různých způsobů ke zlepšení výtěžku, jako je injektování buněčné linie hybridomů do peritoneální dutiny obratlovce, jakým je například myš. Monoklonální protilátky se pak mohou sklízet z kapaliny shromažďující se v dutině břišní (acites) nebo z krve. Nečistoty se z protilátek odstraňují obvyklými způsoby, jako je chromatografie, gelová filtrace, precipitací a extrakcí. Polypeptidů podle vynálezu je možno použít v čisticím procesu jako je například afinitní chromatografie.

V oboru je známo mnoho terapeuticky užitečných molekul, příkladně se uvádějí antigen-vázajicí místa, která jsou schop, . ,* ,92 ná vykazovat imunologické vázací vlastnosti proti látkové molekuly. Proteolytický enzym papain s výhodou štěpí molekuly IgG za poskytnutí několika fragmentů, z nichž dva (fragmenty ”F(ab)) obsahují kovalentní heterodimer, který zahrnuje intaktní antigen-vázající místo. Enzym pepsin je schopen štěpit molekuly IgG k poskytnutí několika fragmentů, včetně fragmentu “F(ab )2”, který obsahuje obě antigen-vázající místa. Fragment Fv lze produkovat proteolytickým přednostním štěpením IgM a v řídkých případech iraunoglobulinové molekuly IgG a IgA. Fragmenty Fv jsou častěji odvozovány použitím rekombinantních způsobů známých v oboru. Fragment Fv zahrnuje nekoválentní heterodimer Vh — Vl obsahující ant igen-váza j ící místo, který si ponechává mnoho z antigenového rozlišení a vázacích kapacit nativní proti látkové molekuly (Inbar a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69, str. 2659 až 2662, 1972; Hochman a kol., Biochem. 15, str. 2706 až 2710, 1976); a Ehrlich a kol., Biochem. 19, str. 4091 až 4096, 1980).

Jednořetězcový polypeptid Fv (sFv) je kovalentně vázaný heterodimer Vh ^{: :}Vl, který je expresován z genové fúze včetně genů kódujících geny Vh a Vl, vázané peptid-kódujícím spojovníkem (Huston a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85(16), str. 5879 až 5883, 1988). K rozlišení chemických struktur je popsána řada způsobů k přeměně přírodně agregovaných avšak chemicky separovaných lehkých a těžkých polypeptidových řetězců z proti látkového regionu V na molekulu sFv, která se vine do trojrozměrné strukury v podstatě podobné struktuře antigen-vázací místo (americké patentové spisy číslo US 5091513 a US 5132405, Huston a kol.; a americký patentový spis číslo US 4 946778, Ladner a kol.).

Každá z popsaných molekul zahrnuje skupinu těžkých řetězců a lehkých řetězců CDR vloženou mezi skupinu těžkých řetězců a lehkých řetězců FR, která zajišťuje podporu na CDRS a definuje vzájemný prostorový poměr CDR. Zde použitý výraz skupina CDR se týká tří hypervariabilnich regionů V-regionu těžkého a lehkého řetězce. Postupem od N-konce těžkého a lehkého řetězce jsou tyto regiony označeny CDR1“, CDR2 a CDR3”. Antigen-vázající místo zahrnuje tedy šest CDR obsahující skupinu CDR od V regionů těžkého a lehkého řetězce. Polypeptid obsahující samotnou CDR (tedy CDR1, CDR2 nebo CDR3) se zde označuje jako molekulární rozpoznávací jednotka (“molecular recognition unit). Z krystalografické analýzy řady komplexů antigen-protilátka vyplývá, že aminokyselinové zbytky CDR tvoří rozsáhlý kontakt s vázaným antigenem, přičemž nejrozsáhlejší antigenový kontakt je s těžkým řetězcem CDR3. Proto jsou molekulární rozlišovací jednotky zodpovědné primárně za specifičnost systému antigen-vázající místo.

Zde použité označení FR set se týká čtyř lemovacích aminokyselinových sekvencí, které rámují CDR skupiny CDR těžkého a lehkého řetězce V-regionu. Některé zbytky FR mohou kontaktovat vázaný antigen; avšak FR primárně zodpovídají za vinutí V-regionu do systému antigen-vázací místo, obzvláště zbytky FR přímo sousedící s CDR. Uvnitř FR jsou zbytky některých aminokyselin a některé strukturání charakteristiky velmi vysoce konzervované. Z tohoto hlediska obsahují všchny sekvence V-regionu vnitřní disulfidovou smyčku přibližně 90 aminokyselinových zbytků. Když se V-regiony vinou do vázacího místa, jsou CDR vyjádřeny jako motivy projekční smyčky, které tvoří antigen-vázací povrch. Obecně se soudí, že existují konzervované strukturální regiony FR, které ovlivňují tvar vinutí smyček CDR do určité “kanonické struktury, nezávisle na přesné CDR aminokyselinové sekvenci. O některých zbytcích FR je dále známo, že se podílejí na nekovalentních interdoménových kontaktech, které stabilizují interakci proti 1átkových těžkých a 1ehkých ře tězců.

Byla popsána řada “humanizovaných“ proti 1átkových molekul obsahujících antigen-vázací místo, odvozené od nelidského ifflu299 , 1991: Lobuglio

USA 86, str. 4220 až 4224, noglobulinu, včetně chimerních protilátek majících hlodavcové V regiony a jejich CDR fúzované na lidské konstantní domény (Winter a kol,, Nátuře 349, str. 293 aš a kol., Proč. Nati. Acad. Sci.

1989); Shaw a kol., J.Immunol. 138, str.4534 až 4538, 1987; a Brown a kol., Cancer Res. 47, str. 3577 aš 3583, 1987), hlodavčí CDR naroubované do lidské nosičové FR před fúzí s příslušnou lidskou proti látkovou konstantní doménou (Riechmann a kol., Nátuře 332, str. 323 aš 327, 1988; Verhoyen a kol., Science 239, str. 1534 až 1536, 1988; a Jones a kol., Nátuře 321, str. 522 aš 525 1986) a hlodavcové CDR nesené rekombinantně opláštěnými hlodavcovými FR (evroská přihláška vynálezu číslo EP 519596 zveřejněná 23. prosince 1992). Tyto humanizované molekuly jsou určeny k minimalizování nežádoucí imunologické odezvy proti hlodavcovým proti lidským proti látkovým molekulám, které omezují trvání a účinnost terapeutických aplikací takových podílu v lidských recipientech.

Zde použitý výraz opláštěné FR (”veneered FR) a rekombinantně opláštěné FR (”recombinant1y veneered FR“) se vztahují k náhradě zbytků FR například z hlodavčího těžkého a lehkého řetězce V regionu se zbytky lidských FR k získání xenogenní molekuly obsahující antigen-vázající místo, které zachovává v podstatě všechno z nativní FR polypeptidové struktury vinutí. Způsoby opláštění jsou založeny na poznatku, še ligand vytvářející charakteristiky systému antigen-vázající místo je určeny předně strukturou a relatini disposicí skupin CDR těžkých a lehkých řetězců uvnitř systému antigen-vázací povrch (Davies a kol., Ann. Re v. Biochem. 59, str. 439 aš 473, 1990). Specifičnost antigenové vazby může být zachována v humanizované protilátce struktury CDR, pouze jsou-li jejich vzájemné interakce a jejich interakce se zbytkem domén V regionu pečlivě dodrženy. Při použití opi áští o vacích způsobů jsou vnější FR zbytky (tedy dostupné pro rozpouštědlo), které se již setkaly s imunitním systémem, selektivně nahrašeny lidskými zbytky k zajištění hybridní molekuly, která obsahuje buď chabě imunogenický nebo podstatně neimunogenický opláštěný povrch.

Proces opláštění používá dostupných sekvenčních dat pro variabilní domény lidské protilátky, který popsal (Kabat a kol v knize Sequences of Proteins of Immuno1ogica1 Interest, 4. vydání (U.S Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987) podle Kabatovy databáze a jiných dostupných amerických a cizích databází (jak nukleových kyselin tak proteinů). Rozpouštědlová dostupnost V regionu aminokyselin se dá odvodit ze známé trojroměrné struktury pro lidské a myší proti látkové fragmenty. Jsou dva obecné způsoby opláštění myšího antigen-vázajícího místa. Napřed se FR proměnné domény molekuly žádané proti 1átky porovnájí s odpovídajícími sekvencemi FR lidských variabilních domén, získaných ze shora uvedených zdrojů. Nejvíce homologové lidské regiony se pak porovnají zbytek po zbytku s odpovídajícími myšími aminokyselinami. Zbytky myší FR, které se liší od lidského protějšku, se nahradí zbytky obsaženými v lidském podíle za použití v oboru dobře známých rekombinantních způsobů. Přepínání zbytků se provede pouze s podíly, které jsou alespoň parciálně exponované (přístupné rozpouštědlu) a s pečlivostí se nahradí zbytky aminokyselin, které mohou mít významný účinek na terciární strukturu domén V regionu, jako jsou prolin, glycin a nabité aminokyseliny.

Tímto způsobem jsou tedy zkonstruována výsledná opláštěná (veneered) myší antigen-vázací místa, aby zadržela myší zbytky CDR v podstatě přiléhající k CDR, zbytky identifikované jako pohřbené nebo téměř pohřbené (rozpouštědlem nedosažitelné) zbytky, o nichž se předpokládá, že se podílejí na nekovalentních (například elektrostatických nebo hydrofobních) kontaktech mezi doménami lehkých a těžkých řetězců a zbytky ze zakonzervovaných strukturních regionů FR, o kterých se předpokládá, že ovlivňují kanonické terciární struktury a smyčky

CDR. Těchto konstrukčních kriterií se pak použije k přípravě rekombinantních nukleotidových sekvencí, které kombinují CDR jak těžkých tak lehkých řetězců myšího systému antigen-vázací místo ve FR vyskytujících se u lidí, kterých je mošno použít ke transfekci savčích buněk pro expresi rekombinantních lidských protilátek, které vykazují antigenovou specifičnost myší proti látkové molekuly.

Vynález se týká dále monoklonálních protilátek podle vynálezu, které mohou být kopulovány k jednomu nebo k několika terapeutickým činidlům. Vhodnými činidly jsou z tohoto hlediska radionukleotidy, látky vyvolávající diferenciaci, drogy, toxiny a jejich deriváty. Jako radionukleotidy se příkladně uvádějí ⁹°Y, ¹²³J, ¹²⁵J, ¹³¹J, ^1S6Re,^1S8Re,²¹¹At a ²¹²Bi. K výhodným drogám patří methotrexát a analogy pyrimidinu a purinu. Výhodnými diferenciačními induktory jsou forbolestery a kyselina mléčná. Výhodnými toxiny jsou ricin, abrin, toxin záškrtu, toxin cholery, gelonin, Pseudomomas exotoxin, Shigella toxin a “pokeweed“ protivirový protein.

Terapeutické činidlo může být spojeno (například kovalentní vazbou) s vhodnou monoklonální protilátkou buď přímo nebo nepřímo (například spojovníkovou skupinou). Přímá reakce mezi činidlem a protilátkou je možná, jestliže kašdý obsahuje substituent schopný vzájemné reakce. Například nukleofilní skupina, jako je aminoskupina nebo sulfhydry1ová skupina, můše být schopná reagovat s karbonyl obsahující skupinou, jako je anhydrid nebo halogenid kyseliny nebo s alkylovou skupinu obsahující dobře uvolňovanou skupinu (například halogenid).

Alternativně můše být žádoucí kopulovat terapeutické činidlo s protilátkou prostřednictvím spojovníku. Spojovníková skupina můše fungovat jako vložka oddělující protilátku od činidla k zabránění interference s vázacími schopnostmi. Spojovníková skupina může sloužit také ke zvýšení chemické reaktiviI > -> i » >1 > > -> f > ·> y i -> }

II 1 í ·> ϊ τ 1 ty substituentu na činidle nebo na protilátce a tím zvyšovat účinnost kopulace. Nárůst chemické reaktivity může také usnadnit použití činidel nebo funkčních skupin na čindlech, což by jinak bylo nemožné.

Pracovníkům v oboru je zřejmé, že je možno použít jako spojovníku řady bifunkčních nebo polyfunkčních činidel, jak homofunkčních tak heterofunkčních (jak jsou popsána v katalogu Pierce Chemical Co., Rockford, IL) . Spojení může být provedeno například prostřednictvím aminoskupin, karboxylových skupin, sulfhydrylových skupin nebo oxidovaných glycidových zbytků. Metodika je popsána v četné literatuře (například v americkém patentovém spise číslo US 4 671 958, Rockwell a kol.

Je-li terapeutické činidlo schopnější je-li zbaveno proti látkové porce imunokonjugátů podle vynálezu, může být žádoucí použít spojovníkové skupiny, která je štěpitelná během nebo po internalizaci do buňky. Je popsáno mnoho různých štěpitelných skupin. Mechanismus intracelulárního uvolňování činidla od spojovníkové skupiny zahrnuje štěpení redukcí disulfidové vazby (například americký patentový spis číslo US 4 489 710, Spitler) ozářením fotolabilni vazby (například americký patentový spis číslo US 4 625014 Senter a kol.), hydrolýzou deriva- _ tizovaných bočních řetězců aminokyselin (americký patentový spis číslo US 4 638045 Kohn a kol.) hydrolýzou zprostředkovanou sérovým komplementem (například americký patentový spis číslo US 4 671958 Rodwell a kol.) a kyselinou katalyžovanou hydrolýzou (například americký patentový spis číslo US 4569789 Blattler a kol.).

Může být žádoucí kopulovat na protilátku více než jedno činidlo, V jednom provedení je kopulováno několik molekul činidla na molekulu protilátky. V jiném provedení může být na jednu protilátku kopulováno více než jeden typ činidla. Nezávisle na příslušném provedení je možno připravit imunokonjugá- 98ty s více než jedním činidlem různými způsoby. Například více než jedno činidlo může být přímo kopulováno na molekulu protilátky, nebo se může použít spojovníků majících několik míst ke kopulaci. Alternativně může být použito nosiče.

Nosič může nést činidla různými způsoby, včetně kovalentní vazby přímé nebo prostřednictvím spojovníků. K vhodným nosičům patří proteiny, jako albuminy (například americký patentový spis číslo US 4 507234, Kato a kol.), peptidy a polysacharidy, jako je aminodextran (americký patentový spis číslo

699784, Shih a kol.). Nosič může nést činidlo nekovalentní vazbou nebo zapouzdřením, jako uvnitř liposomové vesi kuly (americký patentový spis číslo 4 429008 a 4 873088). Nosiče, specifické pro radionukleotidová činidla, zahrnují radiohalogenované malé molekuly a chelatační sloučeniny. Například americký patentový spis číslo 4 735792 popisuje reprezentativní radiohalogenované malé molekuly a jejich syntézu. Radionuklidový chelát může sestávat z chelatačních sloučenin, které obsahují atomy dusíku a síry jako donorové atomy k vazbě na kov nebo na oxid kovu, na radionuklid. Například v americkém patentovém spise číslo 4 673562 popisuje Davidson a kol. reprezentativní chelatační sloučeniny a jejich syntézu,

Kompoz i ce T-buněk

Vynález se kromě jiného týká také T-buněk specifických pro nádorový polypeptid nebo pro jeho variantu nebo derivát. Takové buňky se mohou obecně připravovat in vitro nébo ex vivo za použití standardních způsobů. Například může být T buňka izolována z kostní dřeně, periferní krve nebo z frakcí kostní dřeně nebo z periferní krve pacienta, za použiti obchodně dostupného systému separace buněk, jako je Isolex™ System (obchodní produkt společnosti Nexell Therapeutics, lne.) (Irvine CA; viz též americký patentový spis číslo US 5 240 856; US

215926; světový patentový spis číslo W0 89/06280; W0 91/

- ,99

16116: a HO 92/07243). Alternativně mohou být T buňky odvozeny ze příbuzných nebo nepříbuzných lidských, nelidských savčích buněčných linií nebo kultur.

T buňky mohou být stimulovány polypeptidem, polynukleoti dem kódujícím polypeptid a/nebo antigen představujícími buňkami (APC), které expresují takový polypeptid. Taková stimulace je vedena za podmínek a po dobu postačující ke generování T-buněk, které jsou specifické pro žádaný polypeptid. S výhodou nádorový polypeptid nebo polynukleotid podle vynálezu je obsažen uvnitř uvolňujícího nosiče, jako je mikroku1 íčka, k usnadnění generace specifických T-buněk.

T buňky jsou považovány za specifické pro polypeptid podle vynálezu, když T buňky specificky proliferují a sekretují cytokiny nebo zabíjejí cílové buňky povlečené polypeptidem nebo expresující gen kódující polypeptid. Specifičnost T buňky může být hodnocena použitím různých standardních způsobů. Například při testu uvolňování chrómu nebo při proliferačním testu indikuje specifičnost T buňky stimulační index s větším než dvojnásobným nárůstem lýze a/nebo proliferace, ve srovnání s negativní kontrolou. Takové testy se mohou provádět například podle Chena a kol. (Cancer Res. 54, str. 1065 až 1070, 1994). Alternativně lze detekci proliferace T buněk provádět řadou známých způsobů. Například může být proliferace T buňky zjišťována měřením zvýšené míry syntézy DNA (například pulsem značených kultur T buněk tritiatovaným thymidinem a měřením množství trtiatovaného thymidinu začleněného do DNA). Styk s nádorovým polypeptidem (100 ng/ml až 100 pg/ml, s výhodou 200 ng/ml až 25 pg/ml) po dobu tří až sedmi dní vede obvykle k alespoň dvojnásobnému nárůstu proliferace T-buněk. Uvedený styk po dobu dvou až tří hodiny by měl vést k aktivaci T buněk, měřeno standardní cytokinovou zkouškou, kde dvojnásobný nárůst stupně uvolňování cytokihů (například TNF nebo INF-gama) je indikativní pro aktivaci T-buněk (Coligan a kol., Cur; 1QQ ,rent Protocols in Immunology, sv. 1, Wiley Interscience, Greene 1998). T Buňky aktivované v odezvě na nádorový polypeptid, polynukleotid nebo polypeptid-expresující APC mohou být CD4⁺a/nebo CD8⁺. T Buňky specifické pro nádorový polypeptid se mohou rozšiřovat standardními způsoby. Ve výhodném provedení se T buňky odvozují od pacienta, příbuzného nebo nepříbuzného donoru a podávají se pacientovi po stimulaci a expanzi.

Pro terapeutické účele CD4⁺ a/nebo CD8⁺ T buňky, které proliferují v odezvě na nádorový polypeptid, polynukleotid nebo APC mohou expandovat co do počtu buď in vitro nebo in vivo. Proliferaci T buněk in vitro lze provádět řadou způsobů. Například mohou být T buňky reexponovány do nádorového polypeptidu nebo krátkého peptidu odpovídajícího imunogenické porci takového polypeptidů s přidáním nebo s nepřidáním růstového faktoru T buněk, jako jsou interleukin-2, a/nebo stimulátorové buňky, která syntetizuje nádorový polypeptid. Alternativně může být T buňka nebo více T buněk, které proliferují v přítomnosti nádorového polypeptidů, expandována řadou klonování. Způsoby klonování buněk jsou v oboru dobře známé a zahrnuj í omezující ředění.

Farmaceutické prostředky

Vynález se přídavně také týká formulací, které obsahují jeden nebo několik polynukleotidových, polypeptidových, T buněčných a/nebo proti 1átkových prostředků podle vynálezu ve famrmaceuticky přijatelném nosiči pro podávání buňce nebo živočichovi, buď samotných nebo v kombinaci s jednou nebo s několika obvyklými terapeutickými prostředky.

Prostředek podle vynálezu se může podávat v kombinaci s jinými činidly, jakož také například s jinými proteiny nebo polypeptidy nebo různými farmaceuticky účinnými látkami. Ve skutečnosti neexistuje žádé omezení pro jiné složky, které r 101; mohou být také začleněny, za podmínky, že tyto další složky nemají významné nepříznivé působení na styk s cílovou buňkou nebo s hostitelskou tkání. Prostředky se tak mohou uvoňovat spolu s různými jinými činidly jak je žádoucí za určitých okolností. Takové prostředky se mohou oddělovat od hostitelských buněk nebo z jiných biologických zdrojů nebo se mohou chemicky syntetizovat, jak zde popsáno. Podobně takové prostředky mohou dále obsahovat substituované nebo deri vatizované RNA nebo DNA prostředky.

Vynález se proto také týká farmaceutických prostředků obsahujících jeden nebo několik polynukleotidových, polypeptidových, proti 1átkových a/nebo T buněčných prostředků podle vynálezu spolu s fyziologicky přijatelným nosičem. Podle výhodného provedení obsahuje farmaceutický prostředek podle vynálezu imunologický polypeptidový a/nebo polynukleotidový prostředek podle vynálezu pro profylaktické nebo terapeutické vakcinační použití. Způsob přípravy vakciny je obecně popsán například v publikaci M.F. Povel 1 a M.J. Newman, vyd, . Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach“), Plenům Press (NY, 1995). Obecně takové prostředky obsahují jeden nebo několik polynukleotidových a/nebo polypeptidových prostředků podle vynálezu v kombinaci s jedním nebo s několika stimulanty.

Je zřejmé, že každý takový farmaceutický prostředek, zde popisovaný, může obsahová farmaceuticky přijatelné soli polynukleotidů a polypeptidů podle vynálezu. Takové soli se mohou připravovat například za použití farmaceuticky přijatelných netoxických zásad, včetně organických zásad (například soli primárních, sekudárních nebo terciárních aminů a bázických aminokyselin) a anorganických zásad (například soli sodné, draselné, lithiové, amoniové, vápenaté a hořečnaté).

Podle jiného provedení imunogenické prostředky, například vakcinové prostředky podle vynálezu obsahují DNA kódující > Λ Ή V , ť '- 103 jeden nebo několik polypeptidů shora popsaných, takže se polypeptid generuje in šitu. Jak shora uvedeno, polynukleotid se muže podávat uvnitř jakéhokoliv uvolňovacího systému známého pracovníkům v oboru, popsaného v literatuře (Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15, str. 143 až 198, 1998).

Vhodný polynukleotidový expresní systém obsahuje nutné regulační DNA regulační sekvence pro expresi v pacientovi (například vhodný promotor a terminační signál). Nebo mohou bakteriální uvolňovací systémy zahrnovat podávání bakterie (například Bací 1lus-Calmette-Guerrin), která expresuje imunogenickou porci polypeptidu na buněčný povrch nebo sekretuje takový epitop.

Podle určitých provedení se po1ynukleotidy kódující imunogenické polypeptidy, zde popsané, zavádějí do vhodných savčích hostitelských buněk pro expresi za použití kteréhokoliv z četných různých systémů na virové bázi. Podle objasňujícího provedení předstatuje retrovir běžnou a účinnou platformu pro gen uvolňující systémy. Vybraná nukleotidová sekvence kódující polypeptid podle vynálezu se může inzertovat do vektoru a zabalit do retrovirových částic o sobě známými způsoby v oboru. Rekombinantní vir se pak může izolovat a uvolňovat do subjektu. Jsou popsány četné objasňující retrovirové systémy (například americký patentový spis číslo 5 219740; Miller a Rosman, Bio Techniques 7, str. 780 aš 790, 1989; Miller A.D., Human Gene Therapy 1, str. 5 až 14, 1990; Scarpa a kol. , Virology 180, str. 849 až 852, 1991: Bums a kol., Proč. Natl.Acad. Sci. USA 90, str. 8033 aš 8037, 1993: a Boris-Lawrie a Temin, Cur. Opín. Genet. Develop, 3, str. 102 až 109, 1992).

Jsou popsány také četné objasňující na adenoviru založené systémy. Na rozdíl od retrovirů, které integrují do hostitelské buňky, adenoviry zůstávají extrachromosomálně a minimalizují nebezečí spojené s inzercionální mutagenezí (Haj-Ahm.ad a Graham, J. Virol. 57, str. 267 aš 274, 1986; Bett a kol., J.

Virol. 67, str.5911 aš 5921, 1993; Mittereder a kol., Human ”, ¹⁰⁷ Gene Therapy 5, str. 717 až 729, 1994; Seth a kol., 3. Virol. 68, str. 933 až 9401, 1994; Barr a kol., Gene Therapy 1, str. 51 až 58, 1994; Berkner K.L., Biotechniques 8, str. 616 až 629, 1988: a Rich a kol., Human Gene Therapy 4, str. 461 až 476, 1993).

Různé adeno-asociované virové (AAV) vektorové systémy jsou také vyvinuty pro uvolňování polynukleotidů. AAV vektory se snadno konstruují za použití dobře známých zůsobů v oboru (například americký patentový spis číslo US 5 173414; a US 5 139941: mezinárodní zveřejněná přihláška vynálezu číslo WO 92/01070; a WO 93/03769; Lebkowski a kol., Holec. Cell. Biol. 8, str. 3988 až 3996, 1988; Vincent a kol., Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; Carter B.J., Current Opini on in Biotechnology 3, str. 533 až 539, 1992; Muzyczka N. Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158, str. 97 až 129, 1992: Kotin R.M., Human Gene Therapy 5, str. 793 až 801, 1994; Shelling a Smith, Gene Therapy 1, str. 165 až 169, 1994; a Zhou a kol., J. Exp. Med. 179, str. 1867 až 1875, 1994.

Přídavné virové vektory, užitečné pro uvolňování polynukleotidů kódujících polypeptidy podle vynálezu genovým transferem, zahrnují vektory odvozené z rodiny virů neštovic, jako jsou vir kravských neštovic a vir ptačích neštovic. Například rekombinanty viru kravských neštovic expresující nové molekuly se mohou konstruovat následujícím způspobem. DNA kódující polypeptid se nejdříve inzertuje do vhodného vektoru, takže je přilehlý k promotoru kravských neštovic a lemuje DNA sekvence kravských neštovic jako sekvence kódující thymidinkinázu (TK). Tento vektor se používá k transfektování buněk, které jsou současně infikovány kravskými neštovicemi. Homologová rekombinace slouží k inzerci promotoru kravských neštovic plus genu kódujícího žádaný polypeptid do virového genomu. Vzniklý TK. sup.(-)rekombinant se může selektovat kultivací buněk v přítomnosti 5-bormdeoxyuridinu a mohou se sbírat virové plaky, říieei^a^iíWř^lřeSíeřieteíi*

- 104 které jsou mu odolné.

Na kravských neštovicích založený infekční/transfekční systém se může obvykle používat pro zaveditelnou pomíjivou expresi nebo koexpresi jednoho nebo několika polypeptidů, zde popsaných, v hostitelských buňkách organizmu. V tomto zvláštním systému se buňky nejdříve infikují in vitro rekombinantem viru kravských neštovic, který kóduje bakteriofág T7 RNA polymer ázy. Tato polymeráza má vynikající spécificitu tím, že pouze transkribuje matrice nesoucí T7 promotory. Po infekci se buňky transfektují s příslušným polynukleotidem nebo příslušnými polynukleotidy za přítomnosti T7 promotoru. Polymeráza, expresovaná v cytoplasmě z rekombinantu viru kravských neštovic, transkribuje transfektovanou DNA do RNA, která se pak translatuje do polypeptidu hostitelskou translační mašinérií. Způsob představuje vysokovýtěžkovou, pomíjivou, cytoplasmovou produkci velkých množství RNA a jeho translačních produktů (například Elroy.Stein a Moss, Proč. Nati. Acad. Sci USA 87, str. 6743 až 6747, 1980; Fuerst a kol

USA 83, str. 8122 až 8126, 1986).

Proč. Nati. Acad. Sci

Nebo se může také používat vir ptačích neštovic, například vir drůbežích neštovic nebo vir kanářich neštovic k uvolňování kódujících sekvencí. Je známo, že rekombinantní vir ptačích neštovic, expresující imunogeny ze savčích pathogenů, přispívá protektivní imunitě při podávání neptačím druhům. Použití vektoru viru ptačích neškovic je obzvláště žádoucí pro lidi a jiné savčí druhy, jelikož členy rodu ptačích neštovic se mohou produktivně replikovat jen v náchylných ptačích druzích a nejsou infekční v savčích buňkách. Způsoby produkce virů ptačích neštovic jsou v oboru známy a používají genetické rekombinace, jak shora popsáno se zřetelem na viry kravských neštovic (například světový patentový spis číslo WI 91/12882; W0 89/03429; a W0 92/03545).

- 105 Jakéhokoli počtu vektorů alfaviru se rovněž může používat pro uvolňování polynukleotidových prostředků podle vynálezu například vektorů popsaných v americkém patentovém spise číslo US 5 843723; US 6 015686; US 6 008035; a US 6 015694. Mohou se také používat určité vektory na bázi venezuelské koňské encefalitidy (VEE), přičemž objasňující příklady jsou v americkém patentovém spise číslo US 5 505947 a US 5 643576.

Molekulární konjugované vektory, například adenovirové chimérní vektory, které popsal Michael a kol. (J. Biol. Chem. 268, str. 6866 až 6869, 1993) a Wagner a kol. (Proč. Acad. Nati. Sci. USA 89, str. 6099 až 6103, 1992) se také mohou používat pro genové uvolňování podle vynálezu.

Další objasňující informace o těchto a o jiných uvolňovacích systémech na virové bázi jsou popsány v literatuře (Fisher-Hoch a kol., Proč. Acad. Nati. Sci. USA 86, str. 317 až 321, 1989): Flexner a kol., Ann. N.Y. Acad Sci. 569, str. 86 až 103, 1989: Flexner a kol., Vaccine 8, str. 17 až 21, 1990; americký patentový spis číslo US 4 603112; US 4 769330; a US 5 017487: světový patentový spis číslo W0 89/01973; americký patentový spis číslo US 4 777127; britský patentový spis číslo GB 2 200651; evropský patentový spis číslo EP 0 345242: světový patentový spis číslo W0 91/02805; Berkner, Biotechniques 6, str. 616 až 627, 1988; Rosenfeld a kol., Science 252, str.431 až 434, 1991; Kolls a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 91, str. 215 až 219, 1994; Kass-Eisler a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 90, str. 11498 až 11502, 1993; Guzman a kol., Circulation 88, str. 2838 až 2848, 1993; a Guzman a kol., Cir. Res. 73, str. 1202 až 1207, 1993.

Podle určitých provedení se může polynukleotid integrovat do genomu cílové buňky. Tato integrace může být do specifické lokace a orientace prostřednictvím homologové rekombinace (genová náhrada) nebo může být integrace do nahodilé, nespecific, .- 106 V » : I ' i I » ké lokace (genové zvětšení). Podle ještě dalšího provedení se může polynukleotid udržovat stabilně v buňce jako separát, episomální segment DNA. Takové polynukleotidové segmenty nebo “episomy kódují sekvence dostatečně k udržení a replikaci nezávisle nebo v synchronizaci s hostitelským buněčným cyklem. Způsob, jaký se expresní konstruk uvolňuje do buňky a jak v buňce polynukleotid zůstává, závisí na typu exprese použitého konstruktu.

Podle jiného provedeni vynálezu se polynukleotid podává/uvolňuje jako “nahá DNA (například Ulmer a kol., Science 259, str. 1745 až 1749, 1993; Cohen, Science 259, str. 1691 až

1692, 1993). Absorpce nahé DNA se může zvýšit zabalením DNA do biologicky odbouráte1ných kuliček, které se účinně přenášejí do buňky.

Podle ještě dalšího provedení vynálezu se prostředek podle vynálezu může uvolňovat prostřednictvím bombardování částic. Podle jednoho objasňujícího příkladu se urychlení částice plynem může dosahovat za použití zařízení, které je obchodním produktem společnosti Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford,

UK) a Powderject Vaccines lne. (Madison, WI) . Příklady takového řešení jsou popsány také v patentové literatuře (americký patentový spis číslo US 5 846796; US 6 010478; US 5 865796; US 5 584807; a evropský patentový spis číslo EP O 500799). Tento přístup nabízí podávání bez jehly, přičemž prostředek ve formě suchého prášku s mikroskopickou velikostí částic, například polynukleotidových nebo polypeptidových částic se urychluje na vysokou rychlost v heliovém plynu generovaným ručním zařízením hnajícím částice na příslušnou cílovou tkáň.

Podle příbuzného provedení jsou zařízeni a způsoby, které mohou být užitečné pro jehly prosté plynem hnané injektování prostředku podle vynálezu, možné využitím Biojet, lne. (Portland, 0R) ; některé příklady takového řešení jsou popsány v pa107 tentové litarauře US 5 06-4413; US 5 a 5 993412).

(americký patentový spis číslo US 4 790824; 312335; US 5 383851; US 5399163; US 5 520639

Podle jiného provedení obsahují farmaceutické prostředky podle vynálezu jeden nebo několik imunostimulantů kromě imunogenického polynukleotidu, polypeptidů, protilátky, T buňky a/nebo APC prostředku podle vynálezu. Imunostimulantem se zde míní v podstatě každá látka, která podporuje nebo zvyšuje imunitní odezvu (protilátka a/nebo buněčně zprostředkovávaná) na exogenní antigen. Jedním typem imunostimulantu je adjuvant. Četné adjuvanty obsahují látku určenou k chránění antigenu před rychlým katabolismem, jako je například hydroxid hlinitý nebo minerální olej, nebo stimulátory imunitní odezvy, jako jsou lipid A a proteiny odvozené z Bordatella pertussis nebo Mycobacterium tuberculosis. Určité adjvanty jsou obchodně dostupné, například adjuvant Freunďs Incomplete Adjuvant a Complete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, lne. Rahvay, NJ) ; AS-2 (SmithKline Beecbam, Philadelphia, PA); hlinité soli, například gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý; soli vápníku, železa nebo zinku; nerozpustná suspenze acylovaného tyrosinu; acylované cukry; kationtově nebo aniontově derivátizované polysacharidy; polyfosfazeny: biologicky odbouráte1né mikrokuličky; monofosforyl1ipid A a quil A. Cytokiny, například GM-CSF, interleukin-2, -7, -12 a jiné podobné faktory se rovněž mohou použít jako adjuvanty.

Podle určitých provedení vynálezu jsou výhodnými adjuvantové kompozice, které navozují imunitní odezvu přednostně typu Thl. Vysoké hladiny Thl-typu cytokinú (například IFN-gama, TNFoc, IL-2 a IL-12) mají sklon podporovat indukci buňkou zprostředkovávané imunitní odezvy do podávaného antigenu. Na rozdíl od toho vysoké hladiny Th-2-typu cytokinú (například IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10) mají sklon podporovat induk-..>»-, ¹⁰⁰ ;’.· .’·,,” ci humorálních imunitních odezev. Po aplikaci vakciny podle vynálezu vykazuje pacient imunitní odezvu, která zahrnuje odezvu typu Thl a Th2. Podle výhodného provedení, kdy je odezva přednostně typu Thl, hladina Thl typu cytokinů vzrůstá větší měrou než hladina cytokinů typu Th2. Hladina těchto cytokinů se může snadno posoudit za použití o sobě známých testů. Přehlad rodin cytokinů podal Mosmann a Coffman (Ann. Rev. Immunol. 7, str. 145 až 173, 1989).

Určité výhodné adjuvanty pro vyvolání převážně Thl-typové odezvy, zahrnují příkladně kombinaci monofosforyl1ipidu A, s výhodou 3-de-0-acylovaného monofosforyl1ipidu A, spolu s jeho hlinitou solí. MPL^R adjuvanty jsou obchodním produktem společnosti Corixa Corporation (Settle W.A; například americký patentový spis číslo US 4 436727; US 877611; US 4 866034; US 4 912094). CpG obsahující oligonukleotidy (ve kterých je CpG dinukleid nemethylován) zavádějí rovněž převážné Thl odezvu. Takové oligonikleotidy jsou dobře známy a jsou popsány (například světový patentový spis číslo W0 96/02555; W0 99/33488; americký patentový spis číslo US 6 008200; a 5 856462). Imunostimulační DNA sekvence jsou rovněž popsány (například Sáto a kol., Science 273, str. 352, 1996). Jiný výhodný adjuvant obsahuje saponin, například Quil A, nebo jeho deriváty včetně QS21 a QS7 (Aquila Biopharmaceuticals lne., Framingham, MA) ; Escin; Digitonin; nebo Gypsophila nebo Chemopodium quinoa saponiny. Jiné výhodné prostředky obsahují více než jeden saponin v adjuvantní kombinaci podle vynálezu, například kombinaci alespoň dvou členů skupiny zahrnující QS21, QS7, Quil A, fS-escin nebo digitonin.

Nebo se mohou saponinové prostředky kombinovat s vakcinovým nosičem složeným z látek, jako jsou například chitosan nebo jiné polykat iontové polymery, polylaktid a polylaktid-koglykolidové částice, polymerní matrice na bázi poly-N-acetylglukosaminu, částice složené z po1ysacharidu nebo z chemicky modifikovaných polysacharidů, liposomy a částice na bázi lipidu a částice složené z glycerolmonoesterů. Saponiny se také mohou formulovat v přítomnosti cholesterolu za vytvoření částicové struktury, jako jsou liposomy nebo ISOMy. Saponiny se také mohou formulovat spolu s polyethylenetherem nebo s polyethylenesterem buď v nečásticovém roztoku nebo suspenzi nebo v částicové struktuře, jako jsou málo lamelární liposomy a ISCOM. Saponiny se také mohou formulovat s excipienty, jako jsou Carbopol^R ke zvýšení viskozity nebo se mohou formulovat ve formě scuchého prášku s práškovým excipientem jako je laktóza.

Podle jednoho provedení zahrnuje adjuvantový systém kombinaci monofosforyl1ipidu A a saponinového derivátu, například kombinaci QS21 a 3D-MPLK^R adjuvantu (světový patentový spis číslo HO 94/00153) nebo méně reaktogenní prostředek, přičemž QS21 je ovlivněn cholesterolem, jak se popisuje ve světovém patentovém spise číslo HO 96/33739. Jiné výhodné prostředky obsahují emulzi olej ve vodě a tokoferol. Jiné obzvláště výhodné adjuvantové prostředky, obsahující QS21, 3D-MPL^R adjuvant a tokoferol v emulzi olej ve vodě, jsou popsány ve světovém patentovém spise číslo HO 97/17210.

Jiný podpořený adjuvantové systém zahrnuje kombinaci CpG-obsahující oligonukleotid a saponinový derivát, zvláště kombinaci CpG a QS21 (světový patentový spis číslo HO 00/09159). S výhodou prostředek obsahuje přídavně emulzi olej ve vodě a tokoferol .

Přídavné adjuvanty pro použití ve farmaceutických prosředcích podle vynálezu zahrnují například Montanide ISA 720 (Seppic, Francie), SAF (Chiron, California, Spojené státy americké), ISCOMS (CSL) MP-59 (Chiron), SBAS řady adjivantů (například SBAS-2 nebo SBAS-4, obchodní produkty společnosti SmithKline Beecham, Rixensart, Belgie) Detox (Enhanzyn^R; CoriAvl -r <- x - - - - ' *'” •‘ř í*^u« í·»·' ·-»*»* íjwwtóš^iii^r/fc*·*·'**»» *»*0·«·»«· •***’»~«WH^9í 'W’* .«we®»*.* ><« t. ”'. ¹¹θ , xa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton MT) a jiné aminoalkylglukosaminid-4-fosfáty (AGP), například popsané v amerických přihláškách vynálezu (dosud v řízení) číslo 08/853,826 a 09/074720 a polyoxyethylenetherové adjuvanty (světový patentový spis číslo VfO 99/52549 AI).

Jiné výhodné adjuvanty zahrnují adjuvantové molekuly obecného vzorce (I): H0(CH₂CH₂0)_n-A-R, kde znamená η 1 aš 50, A vazbu nebo skupinu -C(0)-, R alkylovou skupina s 1 až 50 atomy uhlíku nebo fenylalkylovou skupinua s 1 aš 50 atomy uhlíku v alkylovém podílu.

Podle jednoho provedení vynálezu vakcinová formulace obsahuje polyoxyethylenether obecného vzorce I, kde znamená n číslo 1 aš 50, s výhodou 4 aš 24, nejvýhodněji 9; složkou R je alkylová skupina s 1 aš 50 atomy uhlíku, s výhodou se 4 aš 20 atomy uhlíku, nejvýhodněji s 12 atomy uhlíku a A je vazba. Koncentrace polyoxyethylenetherů má být 0,1 aš 20 %, výhodněji 0,1 aš 10 % a hejvýhodněji 0,1 aš 1 %. Výhodné polyoxyethylenethery se volí ze souboru zahrnujícího polyoxyethylen-9-laurylether, polyoxyethylen-9-steorylether, polyoxyethylen-8-steorylether, polyoxyethylen-4-laurylether, polyoxyethylen-35-laurylether a polyoxyethylen-23-laurylether. Polyoxyethylenethery, jako je polyoxyethylenlaurylether, jsou popsány v indexu Merck (12. vydání: vstup 7717). Tyto adjuvantové molekuly jsou ppsány ve světovém patentovém spise číslo VfO 99/52549. Polyoxyethylenether obecného vzorce I může být popřípadě kombinován s jiným adjuvantem. Například je výhodnou kombinací adjuvantu s CpG (britská zveřejněná přihláška vynálezu GB 9820956.2).

Podle jiného provedení vynálezu se přivádí zde popsaný imunogenický prostředek do hostitelových antigen vykazujících buněk (APC), jako jsou dendritické buňky, makrofágy, B-buňky,

I ir 1 1 li - I I ' ' >'·

1· ( ) i · t i I '

II , , < Ί ' ' , i I > I i - Ί ' . . > < > · · >

monocyty a ostatní buňky, které mohou být konstruovány k citlivosti na APC. Takové buňky mohou, avšak nemusejí, být geneticky modifikovány ke zvýšení kapacity pro zavedení anti genu, ke zlepšení aktivace a/nebo k zachováni odezvy T-buněk, pro protinádorový účinek samotných, a/nebo aby byly imunologicky kompatibilní s příjemcem (například vhodný HLA haplotyp). Antigen vykazující buňky (APC) mohou být obecně izolovány z kterékoli biologické tekutiny a z kteréhokoliv orgánu, včetně nádorových a perinádorových tkání a mohou to být autologové, allogenické, syngenické nebo xenogenické buňky.

Určitým výhodným provedením vynálezu je použití dendri tických buněk jako APC. Dendritické buňky jsou silně potentní APC (Banchereau a Steinman, Nátuře 392, str. 245 až 251,

1998) a zjistilo se, že jsou účinné jako fyziologický adjuvant k vyvolání profylaktické nebo terapeutické proti nádorové imunity (Timmerman a Levý, Ann. Rev. Med. 50, str. 507 až 529,

1999) . Obecně mohou být dendritické buňky identifikovány na základě svého typického tvaru (ste11ate in sítu s výraznými mi cytoplasmickými procesy (dendrity) viditelnými in vitro), své schopnosti přijímat, zpracovávat a poskytovat antigeny s vysokou účinností a své schopností aktivovat odezvy naivní T buňky. Dendritické buňky lze ovšem konstruovat k expresování specifických réceptorů buněčného povrchu nebo ligandu, které se běžně v dendritických buňkách nevyskytují in vivo nebo ex vivo, a takové modifikované dendritické buňky vynález zahrnuje. Jako alternativa k dendritickým buňkám může být ve vakcině použito sekretovaných vesikul antigenem naplněných dendritických buněk (nazávaných exosomy) (Zitvogel a kol. Nátuře Med, 4, str. 594 až 600, 1998).

Dendritické buňky a progenitory lze získat z obvodové krve, z kostní dřeně, z buněk infi 1trujících do nádroru, z buněk infiltruj ících do perinádorových tkání, z lymfatických uzlin, ze sleziny, z pokožky, z umbilikální míšní krve nebo z jakékoli

T Í4***«c « » I *

112 ·>„ vhodné tkáně nebo tekutiny. Například mohou být dendritické buňky diferencovány ex vivo přidáním kombinace cytokinů, jako jsou GM-CSF, IL-4, IL-13 a/nebo TNFot do kultur monocytů sklizených z periferní krve. Nebo mohou být CD34 pozitivní buňky, sklizené z periferní krve, z umbilikální míšní krve nebo z kostní dřeně diferencovány do dentritických buněk přidáním do kultivačního prostředí kombinací GM-CSF, IL-3, TNFot, 1igandu CD40, LPS ligandu fit3 a/nebo jiných sloučenin, které navozují diferenciaci, zrání a proliferaci dendritických buněk.

Dendritické buňky se obvykle dělí na zralé“ a nezralé“, což umožňuje jednoduše rozlišovat mezi dobře charakterizovanými fenotypy. Toto pojmenování nemá však vylučovat všechny možné mezistupně rozlišení. Nezralé dendritické buňky se označují APC s vysokou kapacitou výtěžku a zpracování, což odpovídá vysoké expresi receptoru Fcgama a receptoru mannmózy. Zralý fenotyp je typicky charakterizován nižší expresí těchto markérů, avšak vysokou expresí molekul buněčného povrchu zodpovídajícího za aktivaci T-buněk jako třída I a třída II MHC, adhezních molekul (například CD54 a CD li) a kostimulačních molekul (například CD40, CD80, CD86 a 4-1BB).

APC mohou být transfektovány s polynukleotidem podle vynálezu (porcí nebo jinou jeho variantou), takže kódovaný polypeptid, nebo jeho imunogenická porce, jsou expresovány na povrchu buněk. Taková transfekce může probíhat ex vivo a farmaceutický prostředek, obsahující takové transfektované buňky, může pak být použit k terapeutickým účelům, jak je zde popsáno. Alternativně může být pacientovi podáván gen dodávací nosič, který směřuje na dendritickou nebo jinou buňku poskytující anti gen, pocházející z transfekce, ke které dochází in vivo. Transfekce in vivo a ex vivo dendritických buněk, může být například obecně prováděna jakýmkoli v oboru známým způsobem (světový patentový spis číslo WO 97/24447) nebo genovým dělem (Mahvi a kol., Immunology and cell Biology 75, str. 456 aš > ) > ) > > ), ) > > ) ) ’ > ) ) ) > i » > > > ) ) » ) » λ * ) ) > > > > ) )»))))

460, 1997). Antigenové nakládání dendritických buněk lze dosáhnout inkubací dendritických buněk nebo progenitorových buněk s nádorovým polypeptidem, s DNA (holé nebo uvnitř plasmidového vektoru) nebo s RNA; ne s antigen expresujíčími rekombinantními bakteriemi nebo viry (například viry kravských neštovic, drůbežích neštovic, adenovir nabo lentivirové vektory). Před nakládáním se polypeptid může koválentně vázat na imunologický partner, který představuje T buňkovou pomoc (například nosičová molekula). Nebo se dendritická buňka může pulzovat s nekonjugovaným imunologickým partnerem, odděleně nebo v přítomnosti polypeptidu.

Jakkoliv se může použít ve farmaceutických prostředcích podle vynálezu jakéhokoliv vhodného nosiče, známéhb pracovníkům v oboru, závisí volba nosiče zpravidla na způsobu podávání farmaceutického prostředku. Prostředky podle vynálezu se mohou formulovat pro jakýkoliv vhodný způsob podávání. Příkladně se uvádí podání topické, orální nasálni, mukozální, intravenózní, intrakraniální, intraperitoneální, subkutání a intramuskulárn í .

Nosiče, používané ve farmaceutických prostředcích, jsou biokompatibilni a mohou být také biologicky odbouráte1né. Pro určitá provedení vykazují farmaceutické prostředky podle vynálezu poměrně konstantní množství uvolňování účinné látky. Podle jiných provedení však může být žádoucí rychlejší uvolňování účinné látky bezprostředně po podání. Formulace takových prostředků je dobře známá pracovníkům v oboru a je možná o sobě známými způsoby. Příkladně se jako nosiče, užitečné z tohoto hladiska, uvádějí mikročástice poly(laktidkoglykolidu), polyakrylátu, latexu, škrobu, celulózy a dextranu. Jakožto objasňující nosiče se zpožděným uvolňováním se uvádějí supramolekulární biovektory, které obsahují nekapalné hydrofobní jádro (například zesítěný polysacharid nebo oligosacharid) a popřípadě externí vrstvu obsahující amfifilní sloučeninu, například wtf.^Fí^řW^^íť^ias.Ésiš» > > y i 1 11 >

> )11 > ) ) 11 ) ) 1 1 ) 1 1 1 ,ťi4 -,’ 1 1 » ) 11) ) ) ) fosfolipid (americký patentový spis číslo US 5 151254; a zveřejněná přihláška vynálezu číslo WO 94/20078; WO 94/23701; a WO 96/06638). Množství účinné látky, obsažené ve farmaceutickém prostředku pro trvalé uvolňování, závisí na místě implantace, na rychlosti a očekávaném trvání uvolňování a na povaze a podmínkách ošetřovaného stavu nebo prevence.

Podle jiného objasňujícího provedení se mohou biologicky odbouratelné mikrokuličky (například polylaktát polyglykolát) používat jako nosiče pro prostředky podle vynálezu. Vhodné biologicky odbourateoné mikrokuličky se popsány v patentové literatuře (například americký patentový spis číslo US

897268; US 5 075109; US 5 928647: US 5 811128; 5 820883; US

853763; US 5 814344; US 5 407609; a US 5 942252). Modifikované hepatitis B jádrové proteinové nosičové systémy (světový patentový spis číslo W0 99/40934) jsou pro mnohá použití rovněž vhodné. Jiný příkladný systém nosič/uvolňování používá nosiče obsahujícího částicové proteinové komplexy (americký patentový spis číslo 5 928647), které jsou schopny zavádět v hostiteli odezy na třídu Ί-restriktovaný cytotoxický T lymf ocyt.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu často dále obsahují jeden nebo několik pufrů (například neutrální pufrovanou solanku nebo fosfátem pufrovanou solanku), uhlohydráty (například glukózu, mannózu, sacharózu nebo dextrany), mannit, proteiny, polypeptidy nebo aminokyseliny, jako je glycin, antioxidanty, baktoeriostatická činidla, chelatační činidla, jako jsou EDTA nebo glutathion, adjuvanty (například hydroxid hlinitý), soluty, které dodávají prostředku isotonicit,u, hypotonicitu nebo slabou hypertonicitu s krví nebo s recipientem, suspenz^ční činidla, zahušťovadla a/nebo konzervační činidla. Prostředky podle vynálezu se také mohou formulovat jako lyofilizáty.

li 5

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou být ve formě jedné dávky nebo kontejnerů s četnými dávkami, jako jsou utěsněné ampule nebo lékovky. Takové kontejnery jsou zpravidla utěsněné, aby uchovávaly sterilitu a stabilitu prostředku až do použití. Prostředky podle vynálezu se mohou skladovat jako suspenze, roztoky nebo emulze v olejových nebo ve vodných nosičích. Nebo se farmaceutické prostředky mohou skladovat ve stavu vysušeném vymrazováním a vyžadovat pouhé přidání sterilního kapalného nosiče bezprostředně před použitím.

Jakožto vhodné dávkovači formy pro režimu ošetření podle vynálezu se uvádějí například prostředky pro podání orální, parenterální , intravenózní, intranasální a intralíuskulární , jak je v oboru známo a které budou nyní krátce popsány.

Pro určitá použití se farmaceutické prostředky podle vynálezu podávají živočichům orálně. Takové prostředky se formulují s inertním ředidlem nebo s asimilovatelným jedlým nosičem nebo se mohou uzavírat do tvrdých nebo do měkkých že lat inových kapslí nebo se mohou lisovat na tablety, nebo se mohou přímo začleňovat do potravin nebo do krmivá.

Účinné sloučeniny se mohou začleňovat s excipienty a používat Ve formě například tablet, bukálních tablet, pastilek, kapslí, vodiček, suspenzí, sirupů, vaflí (například Mathiowitz a kol., Nátuře 386(6623), str. 410 až 414, 27, března 1997; Hwang a kol., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 15(3), str. 243 až 284, 1998; americký patentový spis číslo 5 641515; US

580579; US 5 792451). Například tablety pastilky, pilulky a «

kapsle mohou obsahovat také nejrůznější přídavné složky, jako jsou například pojidlo jako klovatina tragakanth, akacia, kukuřičný škrob nebo želatina; excipienty jako dikalciumfosfát; desintegrační činidla jako kukuřičný škrob, bramborový škrob, alginová kyselina; mazadla jako stearát hořečnatý; sladidla jako sacharóza, laktóza nebo sacharin; a ochucovací

-í WWW!»·!¹»* ·' )

-; l.ťó, činidla jako peprmint, olej 1ibavky položené nebo šery. Pokud je jednotkovou dávkovači formou kapsle, může obsahovat kromě shora uvedených složek kapalný nosič. Různé jiné látky mohou být obsaženy jako povlak nebo mohou jinak modifikovat fyzikální formu dávkovači jednotky. Například tablety, pululky nebo kapsle mohou být povlečeny šelakem a/nebo cukrem. Jakékoliv materiály pro přípravu jakékoliv dávkovači formy mají být farmaceuticky čisté a v podstatě netoxické v používaném množství. Účinné látky se mohou začleňovat do prostředků a formulací s trvalým uvolňováním.

Zpravidla obsahují farmceutické prostředky alespoň O,1 % účinné látky, přičemž se obsah účinné látky může samozřejmě měnit a obvykle je přibližně 1 nebo 2 % až 60 až 70 % nebo ještě větší, přičemž jsou procenta míněna hmotnostně nebo objemově, vztaženo na farmaceutický prostředek jako celek. Množství účinné látky v kterémkoliv terapeuticky užitečném prostředku se upravuje do vhodné dávky k získání jakékoliv žádoucí jednotkové dávky. Faktory, jako jsou solubilita, biologická dostupnost, biologický poločas, cesta podání a další farmakologické úvahy pracovník v oboru zohledňuje pro výrobu farmaceut i ckých prostředků vhodných pro daný úče1.

Pro orální podání mohou být prostředky podle vynálezu upravovány s alespoň jedním excipientem do formy ústní vody, prostředku na čištění zubů, bukálních tablet, orálních sprejů nebo podjazykových orálně podávaných prostředků. Nebo může být účinná látka začleňována do orálních roztoků obsahujících například natriumborát, glycein hydrogenuhličitan draselný nebo může být účinná látka dispergována do zubní pasty nebo se terapeuticky účinné množství může přidávat do prostředků obsahujících vodu, pojidla, abrasiva, ochucovadla, pěnidla a zvlhčovadla. Nebo se prostředky mohou upravovat na formu tablet nebo roztoků, které se mohou umísťovat pod jazyk nebo jinak rozpouštět v ústech.

l,ť% Může být také žádoucí podávat farmaceutický prostředek podle vynálezu parenterálně, intravenózně, intramuskulárně nebo i intraperitoneálně. Takový přístup je pracovníkům v oboru znám a vhodné formy jsou popsána v literatuře (například americký patentový spis číslo US 5 543158; US 5 641515; US 5 399363). Roztoky účinné látky ve formě volné zásady nebo farmaceuticky přijatelné soli se mohou připravovat ve vodě vhodně v přítomnosti povrchově aktivního činidla, jako je hydroxypropyl celulóza. Mohou se také připravovat disperze v glycerolu, v kapalných polyethylenglykolech a v jejich směsích a v olejích. Za běžných podmínek skladování a použití obsahují také zpravidla takové farmaceutické prostředky konzervační činidlo k předcházení růstu mikroorganizmů.

Příkladně farmaceutické prostředky pro injektování jsou vodnými sterilními roztoky nebo disperzemi a sterilními prášky pro přípravu na místě sterilních roztoků nebo disperzí (například americký patentový spis číslo US 5 466468). Ve všech případech musí být farmaceutická forma stetrilní a musí být kapalná do takové míry, aby mohla být snadno podána injekční stříkačkou. Musí být stabilní za podmínek výroby a skladování a musí být chráněna před kontaminačním působením mikroorganismů, jako jsou bakterie a houby. Nosičem může být rozpouštědlo nebo dispergační prostředí, například voda, ethanol, polyol (například glycerol, propylenglykol a kapalné polyethylenglykoly) jejich vhodné směsi a/nebo rostlinné oleje. Vhodná tekutost se může udržovat například použitím povlaků jako lecithinu, dodržováním žádané velikosti částic v případě disperzí a nebo použitím povrchově aktivních činidel. Prevence působení mikroorganizmů se můžře usnadnit použitím různých antibakteriáoních a antifugálních činidel, jako jsou například parabeny, chlorbutanol, fenol, kyselina sorbová a thimerosal. V mnoha případech je výhodné začlenit izotonická činidla, například cukry nebo chlorid sodný. Prodloužené absorpce injektovatelných prostředků se může dosáhnout použitím či nidlel zpožďujících absorpci, jako jsou například monostearát hlinitý a želatina.

Pro parentarální podání ve vodném roztoku se může roztok popřípadě vhodně pufrovat a kapalné ředidlo se nejdříve může upravit na isotonické přidáním dostatečného množství solanky nebo glukózy. Tyto zvláštní vhodné vodné roztoky jsou obzvláště vhodné pro intravenózní, intramuskulární, subkutání a intraperitoneální podání. Sterilní vodné prostředí, kterého se může použít, je pracovníkům v oboru známé. Dávka se může například rozpouštět v 1 ml isotonického roztoku chloridu sodného a buď přidávat do 1OOO ml hypodermoklyzové kapaliny nebo vstřikovat v navrženém místě infuze (Například Remington's Pharmaceutical Science”, 15, vydání, str. 1035 až 1038 a 1570 až 1580). Dávkovači forma se přirozeně upravuje podle stavu ošetřovaného jedince. Pro podání lidem musí prostředek splňovat požadavek sterility, pyrogenicity a obecně bezpečnost a čistotu podle norem FDA úřadu pro biologické materiály (FDA Office of Biologics).

Prostředky se mohou formulovat za použití účinné látky v neurální formě nebo ve formě soli. Jakožto farmaceuticky přijatelné soli se příkladně uvádějí adiční soli kyselin (vytvářených s volnými aminoskupinami proteinu) anorganických kyselin, jako jsou kyselina chlorovodíková a fosforečné nebo organických kyselin, jako jsou například kyseliny octová, štiavelová, vinná a mandlová. Soli vytvářené s volnou hydroxylovou skupinou se mohou odvozovat od anorganických zásad, jako je například hydroxid sodný, draselný, amonný, vápenatý nebo železitý nebo od organických zásad, jako je například isopropylamin, trimethylamin, histidin a prokain. Po formulaci se roztoky podávají způsobem odpovídajícím dávkovači formě v terapeuticky účinném množství.

Nosiče mohou dále obsahovat například jakákoliv rozpouši- 119 tědla, dispergační prostředí, nosič, povlaky, ředidla, antibakteriální a antifugální činidla, isotonická činidla, činidla prodlužující absorpci, pufry, nosičové roztoky, suspenze a kolo idy. Použití takových prostředí a činidal pro farmaceuticky účinné látky je v oboru dobře známo. Prostředí a činidla musí být kompatibilní s účinnou látkou. Do farmaceutických prostředku se také mohou začleňovat přídavné terapeuticky účinné látky. Výrazem farmaceuticky přijatelný se zde vždy míní molekulární jednotky a kompozice, které nevyvolávají alergickou nebo podobně nežádoucí reakci po podání lidem.

Farmaceutické prostředky mohou mít také formu nasálnich sprejů, inhalačních nebo aerosolových prostředků. Způsoby dodávání prostředů zavádějících geny, nukleové kyseliny a peptidy přímo do plic cestou nasál nich aerosolových sprejů jsou v literatuře popsány (například americký patentový spis číslo US 5 756353; a US 5 804212). Podobně je ve farmaceutickém oboru dobře známo dodávání drog za použití intranasálních mikročásticových pryskyřic (Takenaga a kol., J. Controlled Release 52 (1-2), str. 81 až 87, 2. března 1998) a lysofosfatidylglycerolových sloučenin (americký patentový spis číslo US 5 725871). Podobně je popsáno podávání transmukosálních drog ve formě polytetrafluorethylenové nosičové matrice (americký patentový spis číslo US 5 780045).

Prostředky a použití 1iposomů a liposomovité prostředky jako možné nosiče drog jaou obecně pracovníkům v oboru známy (například Lasic, Trends Biotechnol. 16(7), str. 307 až 321, červenec 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56(3), str. 691 až 695,

Indián J. Exp. Biol. 53(8), str. Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug březen 1998; Chandran a kol 801 až 809, srpen 1997;

Carrier Syst. 12(2-3), str. 233 až 261, 1995; tový spis číslo US 5 567445; US 5 552157; 5 738868; US 5 579587).

americký patenUS 5 565213; US r- 120

Λ, 3»ηΰί'».-»ι i W

Líposomy se úspěšně používají s četnými typy buněk, které se normálně obtížené transfektují jinými způsoby včetně Suspenzí T buněk, primárních hepatocytových kultur a PC 12 buněk (Renneisen a kol., J. Biol. Chem.265(27), str. 16337 aš 16342, 25. září 1990; Muller a kol., DNA Cell Biol. 9(3), str. 221 až 229, duben 1990). Liposomy jsou kromě toho prosté omezovačů DNA délky, které jsou zpravidla uvolňovacími systémy na virové bázi. Liposomy se účinně používají k zaváděni například genů, různých drog, radioterapeutických činidel, enzymů, virů a transkripčních faktorů allosterických efektorů do nejrůznějších kultur buněčných linií a do živočichů. Kromě toho není použití liposomů spojeno s autoimunitní odezvou nebo nepřijatelnou toxicitou po systémovém uvoňování.

Liposomy se mohou vytvářet z fosfolipidů, které se dispergují ve vodném prostředí a spontáně vytvářejí multi 1amelární koncentrické dvouvrstvové vesikuly (označované také jako multilamelární vesikuly, MLV).

Vynález se také týká farmaceuticky přijatelných nanokapslových prostředků. Nanokapsle mohou obecně dodávat sloučeniny stabilním a reprodukovatelným způsobem (například Quintanar-Guerrero a kol., Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12), str. 1113 až 1128, prosinec 1998). K předcházení místnímu působení intracelulárního polymerního přetížení takové ultrajemné částice (rozměr přibližně 0,1 μη) se mohou kontruovat za použití polymerů schopných odbourání in vivo. Takové částice se mohou vyrábět způsoby popsanými v literatuře (například Couvreur a kol., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1), str. 1 aš 20,

Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2), str.

J. Controlled Release a americký patentový

1988; zur Muhlen a kol.,

149 aš 155, březen 1998; Zambaux a kol., 50(1-3), str. 31 aš 40, 2. ledna 1998; spis číslo 5 145687),

Způsoby terapie rakoviny

Vynález se také týká shora popsaných terapeutických prostředků, kterých se může používat k léčení rakoviny zvláště pro imunoterapii rakoviny prostaty. Farmaceutické prostředky podle vynálezu se podávají pacientům, zpravidla teplokrevným pacientům a zvláště lidem. Pacient může, avšak nemusí být napaden rakovinou. Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou používat pro předcházení vývoje rakoviny nebo pro ošetřování pacienta rakovinou napadeného. Farmaceutické prostředky a vakciny se mohou podávat před chirurgickým odstraněním primárních nádorů nebo po něm a/nebo po ošetřování radioterapií nebo obvyklými chemoterapeutickými drogami. Farmaceutické prostředky se mohou podávat jakýmkoliv obvyklým způsobem: například podáním intravenóznim, intraperitoneálním, intramuskulárním, subkutanním, intranasálním, intradermálnim, análním, čípky, topickým a orálním.

V určitých případech může být imunoterapie aktivní imunoterapi i, při které ošetření spočívá na in vivo stimulaci endogenního hostitelského imunitního systému k reakci proti nádoru za podání imunitní odezvu modifikujícího činidla (jako jsou polypeptidy a polynukleotídy podle vynálezu).

Podle jiného provedení může být imunoterapii pasivní imunoterapie, při které ošetření zahrnuje uvolňování činidla s imunitní reaktivitou s nádorem (například efektorových buněk nebo protilátek), takže se může přímo nebo nepřímo zprostředkovávat protinádorové působení a ošetření není nutně závislé na intaktním hostitelském imunitním systému. Jakožto příklady efektorových buněk se uvádějí shora charakterizované T buňky, T lymfocyty (například CD8 + cytotoxické T lymfocyty a CD4⁺T pomocníkové do nádoru infiltrující lymfocyty), zabíječské buňky (například buňky Natural Killer a lymfokinem aktivované zabíječské buňky), B buňky a antigen poskytující buňky (napři<: 122, expresující polypeptid poklad dendritické buňky a makrofágy) dle vynálezu. T buněčné receptory a proti látkové receptory specifické pro polypeptidy podle vynálezu se mohou klonovat, expresovat a transferovat do jiných vektorů nebo do efektorových buněk pro adoptivní imunoterapii. Polypeptidy podle vynálezu se také mohou používat ke generování protilátek nebo antiidiotypických protilátek (americký patentový spis číslo US 4 918164) pro pasivní imunoterapii.

Efektorové buňky se mohou obecně získat v dostatečných množstvích pro adoptivní imunoterapii růstem in vitro, jak zde popsáno. Kultivační podmínky pro expanzi jednotlivé antigenově specifické efektorové buňky na několik bilionů s retencí antigenovým rozpoznáváním in vivo jsou v oboru dobře známy. Takové in vitro kultivační podmínky zpravidla používají občasnou stimulaci antigenem, často v přítomnosti cytokinů (jako IL-2) a nedělícího dodavače buněk. Jak shora uvedeno, imunoreaktivní polypeptidy podle vynálezu se mohou používat k rychlé expanzi antigenově specifických T buněčných kultur za účelem generace dostatečného počtu buněk pro imunoterapii. Obzvláště antigen poskytující buňky například dentritické, makrofágy, monocyty, fibroblasty a/nebo B buňky se mohou pulzovat s imunoreaktivními polypeptidy nebo transfektovat s jedním nebo s několika polynukleotidy za použití obvyklých způsobů známých v oboru. Například se mohou antigen poskytující buňky transfektovat s polynuk1eotidem majícím promotor vhodný pro zvýšení exprese v rekombinantním viru nebo v jiném expresním systému. Kultivované efektorové buňky pro použití v terapii musí být schopné růstu a široké distribuce a dlouho přežívat in vivo. Studie ukásaly, že kultivované efektorové buňky se mohou indukovat k růstu in vivo a k přežívání po dlouhou dobu v podstatných množstvích opakovanou stimulací antigenem doplněným IL-2 (například Cheever a kol., Immunological Reviews 157, str. 177, 1997).

Nebo vektor expresujícl polypeptid podle vynálezu se může zavádět do buněk poskytujících antigen odebraných pacientovi a klonálně propagovaných ex vivo pro zpětné přenesení témuž pacientovi. Transfektované buňky se mohou zpět zavádět pacientovi za použití prostředků v oboru známých, s výhodou ve sterilní formě intravenózním, intrakavitárním, intraperi toneálním nebo intranádorovým podáním.

Cesty a četnost podávání terapeutických prostředků podle vynálezu, jakož také podávaná dávka se mění od jedince k jedinci a může se snadno stanovit o sobě známými způsoby. Obecně se farmaceutické prostředky a vakciny podávají injekčně (například intrakutánně, intramuskulárně, intravenozně nebo subkutánně), intranasálně (například vdechováním) nebo orálně. S výhodou se podává 1 až 10 dávek v průběhu 52 týdnů. S výhodou se podává šest dávek v jednoměsíčních intervalech, načež se může periodicky provádět podpůrná vakcinace. Alternativní protokoly mohou být vhodné pro jednotlivé pacienty. Vhodnou dávkou je množství sloučeniny, které při shora popsaném podání je schopné podpořit antinádorovou imunitní odezvu a je alespoň 10 až 50 % nad bazální (to je neošetřovanou) hladinou. Taková odezva se může monitorovat měřením antinádorových protilátek u pacienta nebo na vakcině závislou generací cytolytických efektorových buněk schopných zabíjet pacientovy nádorové buňky in vitro. Takové vakciny mají být také schopné vyvolávat imunitní odezvu, která vede ke zlepšení klinického důsledku (například častější remise, kompletní nebo částečné nebo delší přežívání bez nemoci) u vakcinovaných pacientů ve srovnání s nevakcinovanými pacienty. Obecně obsahují farmaceutické prostředky a vakciny jeden nebo několik polypeptidů, přičemž množství polypeptidů, obsažené v dávce, je přibližně 25 ng až 5 mg na kg pacienta. Vhodná dávka se mění s hmotností pacienta, zprvidla však je přibližně 0,1 ml až přibližně 5 ml.

Obecně vhodná dávka a režim ošetřování zajišťují účinnou

ΑΛΛ'·**»·»*^»*^*'''·*^’»’* -<«»‘ -« Λ ·*&· fc látku nebo účinné látky v dostatečném množství k dosažení terapeutického a/nebo profylaktického prospěchu. Odezva na ošetření se muže monitorovat stanovením zlepšeného klinického stavu (například častější remise, kompletní nebo částečné nebo delší přežívání bez nemoci) u ošetřovaných pacientů ve srovnání s neošetřovanými pacienty. Zvýšení již existující imunitní odezvy na nádorový protein je obecně v souvislosti se zlepšeným klinickým stavem. Taková imunitní odezva se obecně může hodnotit za použití standardních testů proliferace, cytotoxicity nebo cytokinu, které se mohou provádět za použití vzorků získaných od pacienta před ošetřením a po ošetření.

Zjišťování rakoviny a diagnostické prostředky, způsoby a kity

Obecně se rakovina může zjišťovat u pacienta na základě přítomnosti jednoho nebo několika proteinů nádoru prostaty a/nebo polynukleotidů kódujících takové proteiny v biologickém vzorku (jako jsou například krev, sérum, spůtum, moč a/nebo nádorová biopse), získaných od pacienta. Neboli se takových proteinů může použít jako markérů k indikaci existence nebo neexistence rakoviny například rakoviny prostaty. Kromě toho mohou být takové proteiny užitečné pro detekci jiných nádorů. Vázací činidla podle vynálezu umožňují detekci množství antigenu, které se váže na činidlo v biologickém vzorku. Polynukleotidové primery a sondy se mohou používat k detekci množství mRNA kódující nádorový protein, což je také indikativní pro existenci nebo neexistenci rakoviny. Obecně prostatová nádorová sekvence má být obsažena v množství alespoň třikrát vyšším v nádorové tkáni než v normální tkáni.

Jsou známy nejrůznější testovací formáty pracovníkům v oboru pro použiti vázacích činidel k detekci polypeptidových markérů ve vzorku (například Harlow a Lané, Ant ibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Obecně se může stanovit existence nebo neexistence rakoviny (a) uve,125’,- , děním do styku biologického vzorku pacienta s vázacím činidlem, (b) detekcí ve vzorku obsahu polypeptidu, který se váže na vázací činidlo a (c) porovnáním obsahu polypeptidu s předem stanovenou hodnotou.

Podle výhodného provedení zahrnuje test použití vázacího činidla immobli 1izovaného na pevném» nosiči k vázání a k odstranění polypeptidu ze vzorku. Vázaný polypeptid se pak může stanovit detekčním činidlem, které obsahuje reportérovou skupinu a specificky se váže na komplex vázací činidlo/polypeptid Taková detekční činidla mohou například zahrnovat vázací činidlo, které se specificky váže na polypeptid nebo na protilátku nebo na jiné činidlo, které se specificky váže na vázací činidlo, jako je antiimunoglobulin, protein G, protein A nebo lektin. Nebo se může používat konkurenčního testu, při kterém se polypeptid značkuje reportérovou skupinou a umožňuje vazbu na imobi1izované vázací činidlo po inkubaci vázacího činidla se vzorkem. Míra, kterou složky vzorku inhibuj i vázání značeného polypeptidu na vázací činidlo je indikativní pro reaktivitu vzorku s imobi1 izováným vázacím činidlem. Vhodné polypeptidy pro použití při takových testech zahrnují plnou délku prostátových nádorových proteinů a příslušných po1ypeptidových porcí, na které se váže vázací činidlo, jak shora popsáno.

Pevným nosičem může být jakýkoliv materiál známý pracovníkům v oboru, na který se nádorový protein může vázat. Například pevným nosičem může být testovací důlek v mikrobitracní destičce mebo nitrocelulózová nebo jiná vhodná membrána. Nosičem může být kulička nebo kotouč, například ze skla, ze skla s vlákny, z latexu nebo z plastového materiálu, jako polystyren nebo polyvinylchlorid. Nosičem mohou být také magnetické částice nebo vlákenný optický senzor známý z literatury (například americký patentový spis číslo US 5 359681). Vázací činidlo se může imobilizovat na pevném nosiči nejrůznějšími způsoby známými pracovníkům v oboru a dostatečně popsanými

-'.126 ; · i , , ' II v patentové a ve vědecké literatuře. Výrazem imobilizace se zde vždy mini jak nekoválentni vazba tak adsorpce a kovalentní připoutání (kterým muže být přímá vazba mezi činidlem a funkčními skupnami na nosiči nebo to může být vazba sesíťujícím činidlem). Imobilizace adsorpcí na důlek v mikrotitrační destičce nebo na membránu je výhodná. V takových případech se může adsorpce dosahovat uváděním do styku vázacího činidla ve vhodném pufru s pevným nosičem pro vhodnou dobu. Doba styku se mění s teplotou, je to však zravidla přibližně jedna hodina až jeden den. Obecně je uvádění do styku důlky plastové mikrotitrační destičky (například polystyrénové nebo polyvinylchlori dové) s množstvím vázacího činidla přibližně 10 ng až přibližně 10 ng a s výhodou přibližně 100 ng až 1 jug dostatečné k imobioizaci přiměřeného množství vázacího činidla.

Kovalentní pojení vázacího činidla na pevný nosič se může obecně dosahovat nejdříve reakcí nosiče s bifunkčním reakčním činidlem, které reaguje jak s nosičem tak s funkční skupinou, jako je hydroxylová skupina nebo aminoskupina vázacího činidla. Například může být vázací činidlo kovalentně spojeno s nosiči majícími vhodný polymerní povlak za použití benzochinonu nebo kondenzací aldehydové skupiny nosiče s aminem a s aktivním vodíkem vázacího činidla (například Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, str. A12 až A13).

Při určitých provedeních je testem dvouproti 1átkový sendvičový test. Tento test se provádí nejdříve uváděním do styku protilátky, která je imobi1izovaná na pevném nosiči zpravidla na důlku mikrotitrační destičky, se vzorkem, takže polypeptidy ve vzorku se mohou vázat na imobi 1 izovanou protilátku. Nevázaný vzorek se pak odstraní od imobi1izováných komplexů polypeptid-proti látka a přidá se detekční činidlo (s výhodou druhá protilátka schopná vázat se na různé strany polypeptidu) pro styk s reportérovou skupinou. Množství detekčního činidla, které zůstává vázáno na pevném nosiči, se pak stanoví za poušití vhodných způsobů pro specifickou reportérovou skupinu.

Jakmile je protilátka zmobilizovaná na nosiči, jak shora uvedeno, zbylá proteinová vázací místa na nosiči jsou zprvidla blokována. Jakékoliv blokovací činidlo, známé pracovníkům v oboru, například hovězí sérový albumin nebo Tveen 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0) může být použito. Imobi1 izovaná protilátka se inkubuje se vzorkem a polypeptid se nechá vázat s protilátkou. Vzorek se zředí vhodným ředidlem, jako je například fosfátem pufrovaná solanka (PBS) před inkubací. Vhodnou dobou kontaktu (to je inkubační doba) je časový úsek, který je dostatečný ke zjištění přítomnosti polypeptidu ve vzorku získaného od jedince s rakovinou prostaty. S výhodou je doba styku dostatečná k dosažení stupně vázání, které je alespoň 95 % vázání dosaženého v rovnováze mezi vázaným a nevázaným polypept i dem. Pracovní kom v oboru je jasné, že je snadné stanovit potřebný čas k dosažení rovnováhy zjišťováním stupně vázání, ke kterému dochází v průběhu doby. Při teplotě místnosti je doba inkubace přibližně 30 minut obecně dostačující.

Nevázaný vzorek se pak může odstranit promytím pevného nosiče vhodným pufrem, jako je PBS obsahující 0,1 % Tweenu 20™. Druhá protilátka, která obsahuje reportérovou skupinu, se může přidávat na pevný nosič. Výhodnými jsou shora uvedené reportérové skupiny.,

Detekční činidlo se pak inkubuje po dostatečnou dobu k detekci vázaného polypeptidu. Vhodná doba se může obecně stanovit zkoušením stupně vázání, ke kterému v průběhu doby dochází. Nevázané detekční činidlo se pak odstrní a vázané detekční činidlo se stanoví za použití reportérové skupiny. Způsob používaný pro detekci reportérové skupiny závisí na povaze reportérové skupiny. V případě radioaktivních skupin jsou obecně vhodné scintilační sčítání nebo autoradiografické způsoby.

Spektroskopické způsoby se mohou používat pro detekci barviv,

128: -, » i z ) 5 i luminiscenčních skupin a fluorescenčních skupin. Biotin se může stanovit použitím avidinu kopulovaného na různé reportérové skupiny (obvykle radioaktivní nebo fluorescenční skupiny nebo enzym). Enzymové reportérové skupiny se mohou obecně detekovat přidáním substrátu (obecně pro specifický časový úsek), následnou spektroskopickou nebo jinou analytickou metodou reakčních produktů.

Pro stanovení existence nebo neexistence rakoviny, například rakoviny prostaty, signál, zjištěný z reportérové skupiny, která zůstává vázána na pevný nosič, je obecně srovnáván se signálem, který odovídá předem stanovené hodnotě. Podle výhodného provedení předem stanovená hodnota pro detekci rakoviny je průměrný střední signál získaný v případě, kdy iminobilizovaná protilátka se inkubuje se vzorky pacientů bez rakoviny. Obecně vzorek generující signál, který představuje tři stnadardní odchylky nad předem stanovenou hodnotou je považován za pozitivní pro rakovinu. Podle jiného výhodného provedení se předem stanovená hodnota zjišťuje za použití křivky Receiver Operátor Curve, způsobem který popsal Sackett a kol., (Clinical Epidemiology” A Basis Science for Clinical Medicíně, Little Brown and Co., str. 106 až 107, 1985). Podle takového provedení se předem stanovená hodnota může zjišťovat z vynesení párů skutečně pozitivních dávek (to je citlivost) a falešných pozitivních dávek (100% spécificita) , které odpovídají každé možné hodnotě pro diagnostický výsledek testu. Hodnota na vynesení, která je nejblíže hornímu levému rohu (to je hodnota, která zahrnuje největší plochu) je nejpřesnější hodnotou a vzorek generující signál, který je vyšší než hodnota stanovený tímto způsobem může být považována za pozitivní pro rakovinu.

Podle podobného provedení se test provádí průtokovým nebo proužkovým testovacím formátem, přičemž se vázací činidlo imobilizuje na membráně, například na nitrocelulózové membráně.

«Μβ^ίΑ»»»!—** -# A,129,-, ) i

Při průtokovém testu se polypeptidy ve vzorku váží na zmobilizované vázací činidlo, když vzorek prochází membránou. Druhé, značené vázací činidlo se pak váže na komplex vázací činidlo-polypeptid když roztok, obsahující druhé vázací činidlo, protéká membránou. Detekce vazby druhého vázacího činidla se může provádět shora popsaným způsobem. Při proužkovém testovacím formátu se jeden konec membrány, na který je vázáno vázací činidlo, ponořuje do roztoku obsahujícího vzorek. Vzorek migruje po membráně přes oblast obsahující druhé vázací činidlo a plochu imobi1izovaného vázacího činidla. Koncentrace druhého vázacího činidla na ploše imobi1izované protilátky indikuje přítomnost rakoviny. Zpravidla koncentrace druhého vázacího činidla v tom místě vytváří obrazec, například linku, která je snadno viditelná. Nepřítomnost takového obrazce indikuje negativní výsledek. Obecně množství vázacího činidla, imobi1izovaného na membráně, se volí ke generaci vizuálně rozeznatelného obrazce, když biologický vzorek obsahuje množství polypeptidů, které je dostatečné ke generaci positivního signálu ve dvouproti 1átkovém sendvičovém testu, ve shora uvedeném formátu. Výhodnými vázacími činidly pro použití v takových testech jsou protilátky a jejich fragmenty vázající protilátky. S výhodou je množství imobi1 isováných protilátek na membráně přibližně 25 ng až 1 pg a výhodněji přibližně 50 ng až přibližně 500 ng. Takové testy se zpravidla provádějí s velmi malým množstvím biologického vzorku.

Existují ovšem četné jiné protokoly, které jsou vhodné pro použití s nádorovými proteiny nebo vázajícími činidly podle vynálezu. Shora uvedený popis je tedy toliko objasňujícím příkladem. Například je pracovníkům v oboru zřejmé, že se shora uvedené protokoly mohou snadno obměňovat k použití nádorových polypeptidů k detekci protilátek, které se váží na takové polypeptidy v biologickém vzorku. Detekce takových pro nádorový protein specifických protilátek může být ve vztahu k existenci rakoviny.

1301 _;

Rakovina se také nebo alternativně může zjišťovat na základě přítomnosti T buněk, které specificky reagují s nádorovým proteinem v biologickém vzorku. V rámci určitých způsobů biologický vzorek, obsahující CD4+ a/nebo CD8⁺ buňky izolované od pacienta, se inkubuje s nádorovým po1ypeptidem, s polynukleotidem kódujícím takový polypeptid a/nebo s APC, který expresu je alespoň jednu imunogenní porci takového polypeptidů a zjišťuje se přítomnost nebo nepřítomnost specifické aktivace T buněk. Vhodné biologické vzorky zahrnuji, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, izolované T buňky. Například T buňky se mohou izolovat od pacienta rutinní technikou (například Ficol1/Hypague odstřeďováním periferních krevních lymfocytů podle gradientů hustoty). T buňky se mohou inkubovat in vitro po dobu dvou až devíti dnů (zpravidla čtyři dny) při teplotě 37 C s polypeptidem (například 5 až 25 ug/ml). Může být žádoucí inkubovat jiný podíl T buněk vzorku v nepřítomnosti nádorového polypeptidů jakožto kontrole. Pro CD4⁺ buňky se aktivace s výhodou zjišťuje hodnocením proliferace T buněk. Pro CD8⁺ T buňky se aktivace s výhodou zjišťuje hodnocením cytolytícké aktivity. Hodnota proliferace alespoň dvojnásobná a/nebo hodnota cytolytícké aktivity je alespoň o 20 % větší než u pacientů bez nemoci indikuje existenci rakoviny pacientů.

Jak shora uvedeno, rakovina se také nebo alternativně může zjišťovat na základě hladiny mRNA kódující nádorový protein v biologickém vzorku. Například alespoň dva oligonukleotidové primery se mohou používat v polymerázové řetězcové reakci (PCR) na základě testu zesílení porce nádorové cDNA uvolňované z biologického vzorku, přičemž alespoň jeden polynukleotidový primer je specifický pro (to je hybridizuje do) polynukleotid kódující nádorový protein. Zesílená cDNA se pak oddělí a detekuje za použití způsobů známých v oboru, jako je gelová elektroforéza. Podobně oligonukleotidové sondy, které specificky hybridizují do polynukleotidu kódujícího nádorový protein, se mohou používat při hybridizačních testech k detekci přítomnos- 13Í·'-· ‘ '>!·,. > i > >»>,., ti po1ynuk1eotidu kóduj ícího vzorku.

K umožnění hybridizace nádorový protein v biologickém za podmínek testu mají oligonukleotidové primery a sondy obsahovat oligonukleidovou sekvenci, která má alespoň přibližně 60%, s výhodou slespoň přibližně 75% a ještě výhodněji alespoň přibližně 90% identitu s porcí polypeptidu kódujícího nádorový protein podle vynálezu, což je alespoň 10 nukleotidů a s výhodou alespoň 20 nukleotidů v délce. S výhodou oligonukleotidové primery a/nebo sondy hybridizují do polynukleotidů kódujících polypeptid podle vynálezu za mírně přísných podmínek, shora definovaných. 01igonukleotidové primery a/nebo sondy, které se mohou užitečně používat v diagnostice zde popisované, mají alespoň 10 až 40 nukleotidů v délce. Podle výhodného provedení obsahují oligonukleotidové primery alespoň 10 přilehlých nukleotidů, výhodněji alespoň 15 přihlehlých nukleotidů DNA molekuly mající sekvenci podle vynálezu. Způsoby, jak na PCR založených testů tak hybridizačni ch testů, jsou v oboru dobře známy (například Mul lis a kol., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51, str. 263, 1987; Ehrlich vyd. PCR Technology, Stockton Press, NY. 1989).

Výhodný test používá RT-PCR, přičemž se PCR používá spolu s reverzní transkripcí. Zpravidla se RNA extrahuje z biologického vzorku, jako je tkáň biopsie, a je reverzně transkribována do produkce DNA molekul. PCR zesílení za použití alespoň jednoho specifického primeru generuje cDNA molekulu, která se může oddělit a zviditelnit za použití například gelové elektroforézy. Zesílení se může provádět na biologických vzorcích odebraných testovanému pacientovi a jedinci, který není napaden rakovinou. Zesilující reakce se může provádět na několika zředěních cDNA v rozsahu zvětšení dvou řádů. Dvojnásobný nebo větší vzrůst exprese v několika zředěních vzorku testovaného pacienta ve srovnání se stejným zředěním jedince bez rakoviny se zpravidla považuje za pozitivní.

- ¹³², ) >

Podle jiného provedení se prostředky podle vynálezu mohou používat jako markéry pro postup rakoviny. Podle takového provedení testy shora popsané pro diagnostiku rakoviny se mohou provádět v průběhu doby a změny hladiny reaktivního polypeptidu nebo polypeptidů nebo polynukleotidu nebo polynukleotidů se vyhodnocují. Například se mohou testy provádět každých 24 aš 72 hodin po dobu šesti měsíců aš jednoho roku a popřípadě déle. Obecně rakovina postupuje u pacientů, u nichž zjištěná hladina polypeptidů nebo polynukleotidu v průběhu doby vzrůstá. Na rozdíl od toho rakovina nepokračuje, jestliže je hladina polypeptidů nebo polynukleotidu v průběhu doby konstantní nebo klesá.

Určité testy in vivo se mohou provádět přímo na nádoru. Jeden takový test zahrnuje uvádění nádorových buněk do styku s vázacím činidlem. Vazba vázacího činidla se můše zjišťovat přímo nebo nepřímo prostřednictvím reportérové skupiny. Takové vázací činidlo může být také použito v histologických aplikacích, Nebo se při takových aplikacích můše poušít polynukleotidových sond.

Jak shora uvedeno, ke zlepání citlivosti se v případě daného vzorku můše při testu používat četných markérů. Je také jasné, še vázací činidla, specifická pro různé proteiny se mohou kombinovat v jednotlivých testech. Souběžně se mohou používat četné primery nebo sondy. Selekce nádorových proteinových markérů můše být založena na rutinních pokusech ke stanovení kombinací, které vedou k optimální citlivosti. Kromě toho nebo alternativně se shora uvedené testy na nádorové proteiny mohou kombinovat s testy pro jiné známé nádorové antigeny.

Vynález se také týká kitů pro poušití při kterékoliv diagnostické metodě. Takové kity zpravidla obsahují dvě nebo několik slošek nutných k provedení diagnostického testu. Složkami mohou být sloučeniny, reakční činidla, obaly a/nebo září«. .. -„—-«W ,^·?;-'·?*^- «.SíWrtt.-tóW'*'· '^M' ' > > » t ;- ;i’?? > ’ ’ i ) zení. Například obal v kitu může obsahovat monoklonální protilátku nebo její fragment, které se specificky vážou na nádorový protein. Takové protilátky nebo jejich fragmenty mohou být vázány na nosičový materiál, shora popsaný. Jeden nebo několik dalších obalů mohou obsahovat prvky, jako jsou reakční činidla nebo pufry, kterých se při testu používá. Takové kíty mohou také nebo alternativně obsahovat detekční reakční činidlo, shora popsané, které obsahuje reportérovou skupinu vhodnou pro přímou nebo nepřímou detekci vazby protilátky.

Nebo může být kit určen k detekcí hladiny mRNA kódující nádorový protein v biologickém vzorku. Takové kity obecně obsahují alespoň jednu oligonukleotidovou sondu nebo primer, shora popsané, které hybridizují do polynukleotidu kódujícího nádorový protein. Takového oligonukleotidu se může použít například s PCR nebo s hybridizačním testem. V takovém kitu mohou být obsaženy přídavné složky včetně druhého oligonukleotidu a/nebo diagnostického činidla nebo obalu k usnadnění detekce polynukleotidu kódujícího nádorový protein.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace a charakterizace polypeptidů specifických pro prostatu

Tento příklad popisuje izolaci některých polypeptidů specifických pro prostatu z knihovny cDNA nádorů prostaty.

Knihovna exprese cDNA 1idských nádorů prostaty je sestavena z póly A⁺RNA prostatových nádorů za použití systému Su~ perscript Plasmid System for cDNA Synthesis a soupravy PÍasmid

1Š’4

1 ) )

Cloning kit (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD 20897) podle protokolu výrobce. Tkáně nádorů prostaty se homogenizují za použití polytronu (Kinematica, Švýcarsko) a celková RNA se extrahuje za použití reakčního činidla Trizol (BRL Life Technologies) podle výrobcových směrnic. Póly A⁺RNA se čistí za použití čisticí soupravy mRNA Qiagen oligotex spin column mRNA purification kit (Qiagen Santa Clarita, CA 91355) podle výrobcova protokolu. První řetězec cDNA se syntetizuje za použití primeru Not 1/01igo-dT18. Dvojřetězcová cDNA se syntetizuje, liguje s adaptéry EcoRI/BAXI (Invitrogen, San Diego, California) a digeruje s Notl. Po frakcionači na sloupci Chromá Spin-100O (Clontech, Palo AI to, CA) se cDNA liguje do místa EcoRI/ Notl pCDNA3.1 (Invitrogen) a transformuje se na buňky ElectroMax E.coli DH10B (BRL Life Technologies) elektroporací.

Stejným způsobem se připraví expresní knihovna cDNA normální lidské slinivky ze souboru šestí tkáňových vzorků (Clontech). Knihovny cDNA se charakterizují určením počtu nezávislých kol onií, „procentem klonů, které nosič inzertuje, průměrnou inzertovanou velikostí a sekvenční analýzou. Knihovna nádorů prostaty obsahuje 1,64 x 10⁷ nezávislých kolonií se 70 % klonů majících inzert a průměrnou velikost inzertu 1745 párů bází. Normální knihovna cDNA slinivky obsahuje 3,3 x 10⁶ nezávislých kolonií, přičemž 69 % klonů má inzerty a průměrnou velikost insertu 1120 párů bází. Pro obě knihovny ukázala sekvenční analýza, že většina klonů má sekvenci cDNA plné délky a syntetizuje se z mRNA s minimálním znečištěním rRNA a mitochondriové DNA.

Subtrakce knihovny cDNA se provádí za použití shora uvedené knihovny cDNA nádorů prostaty a knihovny cDNA normální slinivky, jak to popsal Hara a kol

199, 1994) s několika modifikacemi subtrahovaná knihovna cDNA specifická pro nádory prostaty takto: knihovna cDNA normální slinivky (70 jjg) se digeruje s Eco(Blood 84, str. 189 až Speciálně se sestavuje ’ ’ > » > I , ’

Jí ) _{( k} * ' » » . . , ’ ' >

RI, Notl, a Sful, s následnou plnicí reakcí s Klenowovým fragmentem DNA polymerázy. Po extrakci systémem fenol/chloroform a vysrážení ethanolem, se DNA rozpustí ve 100 pl vody, denaturuje se teplem a smísí se se 100 μΐ (100 pg) biotinové fotosondy (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Jak je výrobcem doporučeno, ozařazuje se výsledná směs 20 minut na ledu 270 W sluneční lampou. Přidá se další biotinová fotosonda (50 pl) a biotinylační reakce se opakuje. Po 5 krát opakované extrakci butanolem se DNA vysráží z ethanolu a rozpustí se ve 23 μΐ vody k získání řídící (''driver) DNA.

K vytvoření indikátorové Ctracer) DNA se 10 pg knihovny cDNA nádorů prostaty digeruje s Banhl a Xhol, extrahuje se chloroformem a vede se sloupci Croma spin-400 (Clontech). Po vysrážení ethanolem se indikátorová DNA rozpustí v 5 μΐ vody. Indikátorová DNA se smísí s 15 μΐ řídící DNA a 20 μΐ 2x hybridizačního pufru (1,5M NaCl/lOmM EDTA/50 mM HEPES pH 7,5/0,2 % natriumdodecylsulfátu) překryje se minerálním olejem a úplně o

se denaturuje teplem. Vzorek se okamžitě převede do 68 C teplé vodní lázně a inkubuje se 20 hodin (dlouhá hybridizace [LH]). Reakční směs se podrobí zpracování streptavidinem a následuje extrakce systémem fenol/chloroform. Tento postup se opakuje třikrát. Subtrahovaná DNA se vysráží, rozpustí se ve 12 Ml vody, smísí se S 8 ul řídící DNA a 20 ul 2x hybridizačniho pufru á podrobí se hybridizaci při teplotě 68 C po dobu dvou hodin (krátká hybridizace [SH3). Po odstranění biotinylisované dvouřetězcové DNA se substraktovaná DNA liguje do místa BamHI/ Xhol chloramfenikol resistantní pBCSK⁺ (Stratagene, La Jolla, CA 92037) a transformuje se na buňky ElectroMax E.coli DH10B elektroporací k vytvoření specificky subtrahovane knihovny cDNA nádorů prostaty (nazývané prostatě subtraction 1“).

K analýze subtrahované knihovny cDNA se připraví plasmid DNA ze 100 nezávislých klonů, náhodně vybraných ze subtrahované knihovny nádorů prostaty a rozdělí se do skupin podle vel ikosti inzertu. Příslušné klony cDNA se dále charakterizují sekvencováním DNA za použití zařízení Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Automated Sequencer Model 373A (Foster City, CA). Ukazuje se, že v subtrahované knihovně cDNA, specifické pro nádory prostaty, je v nadbytku šest klonů cDNA, označených Fl-13, Fl-12, Fl-16, Hl-1, Hl-9 a Hl-4. Stanovené sekvence 3 a 5 cDNA pro Fl-12 jsou v SEQ ID NO:2 a 3 s určenými sekvencemi 3 cDNA pro Fl-13, Fl-16, Hl-1, Hl-9 a Hl-4 v SEQ ID NO: 1 a 4 až 7.

Sekvence cDNA pro izolované klony se porovnávají se známými sekvencemi v bance genů s použitím databáze EMBL a GenBank (vydání 96). Zjišťuje se, že čtyři klony cDNA nádoru prostaty Fl-13, Fl-16, Hl-1, Hl-4 kódují následující prve identifikované proteiny: prostatový specifický antigen (PSA), lidský glandulární kallikrein, gen poporující expresi lidského nádoru a C-oxidázovou podjednotku II mitochondriového cytochromu. Zjistilo se, že Hl-9 je totožný s dříve identifikovanou lidskou autonomně replikující sekvencí. Nebyly zjištěny žádné významné homologie se sekvencí cDNA pro Fl-12.

Následné studie vedly k izolaci sekvence cDNA plné délky pro Fl-12 (nazývané též P5Q4S). Tato sekvence je v SEQ ID NO 107, přičemž odpovídající předpověděná sekvence aminokyselin je v SEQ ID NO: 108. Sestřihové varianty P504S jsou zajištěny v SEQ ID NO: 600 až 605.

Ke klonování méně hojných genů specifických pro nádor prostaty, se provádí subtrakce shora popsané knihovny cDNA s knihovnou cDNA normální slinivky a se třemi nejhojnějšími geny v prve subtrahované knihovně cDNA specifické pro nádor

v.

prostaty: lidský glandulární kallikrein, prostatový specifický antigen (PSA) a mitochondriová cytochromová C-oxidázová podjednotka II. Zvláště se přidá do řídící CDA po 1 yg lidského gladulového kallikreinu, PSA a mitochondriové cytochromové , ~J í,^ Ι-Κ^-·!!^’-'—

2?7 C-oxidázové podjednotky II cDNA v pCDNA3.1 a subtrakce se provede jak shora popsáno k získání druhé subtrahované knihovny cDNA, dále nazývané subtrahovaná knihovna cDNA specifická pro nádor prostaty se špičkou (“subtracted prostatě tumor specific cDNA 1ibrary with spike).

Ze subtrahované knihovny cDNA specifické pro nádor prostaty se špičkou se izoluje 22 klonů cDNA. Určené sekvence 3 a 5 cDNA pro klony JI-17, Ll-12, Nl-1862, Jl-13, Jl-19,

Jl-25, Jl-24, Kl-58, Kl-63, Ll-4 a Ll-14 jsou v SEQ ID NOS8-9, 10-11, 12-13, 14-15, 16-17, 18-19, 20-21, 22-23, 24-25,

26-27 a 28-29. Určené sekvence 3 cDNA pro klony označené jako Jl-12, Jl-16, Jl-21, Kl-48, Kl-55, Ll-2, LI-6, Nl-1858,

NI-1860, NI-1861, NI-1864 jsou v SEQ ID NO: 30-40. Shora popsané porovnání těchto sekvencí se sekvencemi v genové bance neukazuje žádné významné homologie se třemi až pěti hojnými druhy DNA (Jl-17, Ll-12, a Nl-1862; SEQ ID NOS: 8-9, 10-11 a

12-13). Ze zbývajících dvou nejhojnějších druhů se zjistilo, že jeden (Jl-12, SEQ ID NO: 30) je identický s dříve definovaným proteinem asociovaným s lidským pulmonárním surfaktantem a druhý (Kl-48, SEQ ID NO:33) má určitou homologii s R. norvegicus mRNA pro 2-ary1propiony1-CoA epimerázu. Zjistilo se, že ze sedmnácti méně hojných klonů cDNA, izolovaných ze subtrahované knihovny cDNA specifické pro nádor prostaty se špičkou, čtyři (Jl-16, Kl-55, LI-6 a NI-1864; SEQ ID NOS: 31, 34, 36 a 40) jsou identické s dříve identifikovanými sekvencemi, dvě vykazují určitou homologii s lidskými sekvencemi (Jl-21 a NI-1860; SEQ ID NO: 32 a 38) a zjistilo se, že dvě vykazují určitou homologii s nelidskými skevencemi a dvě (Ll-2 a NI-1861; SEQ ID NOS: 35 a 39) vykazují určitou homologii se známými lidskými sekvencemi. Nebyly zjištěny žádné významné homologie k polypeptidům Jl-13, Jl-19, Jl-24, Jl-25, Kl-58, Kl-63, Ll-4, Ll-14 (SEQ ID NOS: 14-15, 16-17, 20-21, 18-19, 22-23, 24-25, 26-27,

28-29), ', 1,33 » 1 11

Následující studie vedly k izolaci sekvencí plné délky cDNA pro Jl-17, Jl-12 a Nl-1862; (SEQ ID NOS: 109-111). Odpovídající předpověděné aminokyselinová sekvence jsou v SEQ ID NOS: 112-114. Ll-12 je také označována jako P501S. Rozštěpená varianta cDNA P501S je zajištěna v SEQ ID NO: 606.

V dalším pokusu byly identifikovány čtyři další klony odečtením knihovny cDNA nádoru prostaty s cDNA normální prostaty připravené ze souboru tří póly A+RNA normální prostaty (nazvaném jako prostatě subtraction 2“). Stanovené sekvence cDNA pro tyto klony, dále nazývané Ul-3064, lil-3065, VI-3692 a 1Ά-3905, jsou v SEQ ID NO: 69-72. Z porovnání stanovených sekvencí se sekvencemi v genové bance nevyplývají žádné významné homologie s Ul-3065.

Druhá subtrakce se špičkou (nazvaná prostatě subtraction spike 2“) se provede odečtením knihovny cDNA specifické pro nádor prostaty se špičkou s knihovnou cDNA normální slinivky a dále vyhrocené s PSA, JI-17, plicním proteinem spojeným s povrchově aktivním činidlem, mitochondriovou DNA, cytochromovou c oxidázovou subjednotkou II, Nl-1862, autonome replikační sekvencí, Ll-12 a genem usnadňjujicím expresi mádoru. Izolují se čtyři další klony, dále označované VI-3686, R1-2330, 1B-3976 a VI-3679. Stanovené sekvence cDNA pro tyto klony jsou v SEQ ID NO: 73 až 76. Z porovnání těchto sekvencí se sekvencemi v genové bance nevyplývají žádné významné homologie s VI-3686 a Rl-2330.

Výsledkem další analýzy shora popsaných tří prostatových subtrakcí (prostatové subtrakce 2, odečtené knihovny cDNA specifické pro nádor prostaty se špičkou a prostatové subtrakční špičky 2) je identifikace šestnácti přídavných klonů, označených 1G-4736, 1G-4738, 1G-4741, 1G-4744, 1G-4734, 1H-4774, 1H-4781, 1H-4785, 1H-4787, 1H-4796, 11-4810, 11-4811, 1J-4876, 1K-4884 a 1K-4896. Stanovené sekvence cDNA pro tyto ^V«rtSřS^5V5Š«S»feíP~<iW

klony jsou v SEQ ID NOS: 77 až 92. 2 porovnání těchto sekvencí se sekvencemi v genové bance nevyplývají žádné významné homologie s 1G-4741, 1G-4734, 11-4807, 1J-4876 a 1K-4896 (SEQ ID NOS: 79, 81, 87, 90 a 92). Další analýza izolovaných klonů vede ke stanovení rozšířšných sekvencí cDNA pro 1G-4736, 1G-4738, 1G-4741, 1G-4744, 1H-4774, 1H-4781, 1H-4785, 1H-4787, 1H-4796, 11-4807, 1J-4876, 1K-4884 a 1K-4896, v SEQ ID NOS: 179 až 188 a 191 až 193 a ke stanovení dodatečných parciálních sekvencí cDNApro 11-4810 a 11-4811, v SEQ ID NOS: 189 až 190.

Výsledkem další studie prostatové subtrakce špičky 2 vede k izolaci tří dalších klonů. Jejich sekvence se stanoví, jak shora uvedeno, a porovnají se s nejnovější bankou genů. Zjišťuje se, že všechny tři klony mají homology se známými geny, kterými jsou cysteinem bohatý protein KIAA0242 a KIAA0280 (SEQ ID NO·¹ 317, 319 a 320) . Další analýza těchto klonů způsobem Syn ten i mikrořady (Syn ten i mikrořady”) (Syn ten i, Palo AI to, CA) ukazuje, že všechny tři klony jsou nadměrně expresovány ve většině prostatových nádorů a prostatové BPH, stejně jako většina normálních prostatových tkání, avšak nízce expresovány ve všech ostatních normálních tkáních.

Provedla se přídavná subtrakce odečtením normální knihovny cDNA s normální cDNA slinivky (nazývaná “prostatě subtraction 3). Ta vedla k identifikaci šesti přídavných klonů nazvaných 1G-4761, 1G-4762, 1H-4766, 1H-4770, 1H-4771 a 1H-4772 (SEQ ID NOS: 93 až 98). Z porovnání těchto sekvencí se sekvencemi v genové bance nevyplývají žádné významné homologie s 1G-4761 a 1H-4771 (SEQ ID NOS: 93 a 97). Další analýza izolovaných klonů vede k určení rozšířených sekvencí cDNA 1G-4761, 1G-4762, 1H-4766 a 1H-4772 v SEQ ID NOS: 194 až 196 a 199 a k určení dodatečných parciálních sekvencí cDNA pro 1H-4770 a 1H-4771, v SEQ ID NOS: 197 a 198.

140 Subtrakce knihovny cDNA nádoru prostaty, připravené se souboru polyft + RNA od tří pacientů s rakovinou prostaty, od knihovny cDNA normální slinivky (prostatě subtraction 4) vede k identifikaci osmi klonů nazvaných ID-4297, ID-4309, ID.1-4278, 1D-4288, 1D-4283, 1D-4304, 1D-4296 a 1D-4280 (SEQ

ID NOS^: 99 až 107). Tyto sekvence se porovnají se sekvencemi v genové bance, jak shora popsáno. Žádná významná homologie není nalezena k ID-4283 a ID-4304 (SEQ ID NOS·’ 103 nebo 104). Další analýza těchto izolovaných klonů vede k určeni rozšířených sekvencí cDNA pro 1D-4309, ID.1-4278, 1D-4288, 1D-4283,

1D-4304, ID-4296 a 1D-4280 (SEQ ID NOS: 200 až 206).

Klony cDNA, isolované ve shora popsaných subtrakcích, prostatě subtraction 1“ a prostatě subtraction 2“ jsou zesílenými koloniemi PCR a jejich hladiny exprese mRNA v nádoru prostaty, v normální prostatě a v různých jiných normálních tkáních se stanoví za použiti technologie mikrořaedy (microarray technology) (Synteni, Palo Alto, CA). Zesílení produktů PCR se zobrazí stopami na snímcích v řadě formátu, přičemž každý produkt zaujímájedinečné umístění v řadě. mRNA se extrahuje z testovaného vzorku tkáně, reversně se transkribuje a generují se fluorescencí značené vzorky cDNA. Mikrořady se porovnají se značenými vzorky cDNA, snímky se skanují a měří se intenzita fluorescence. Tato intenzita je v korelaci s intenzitou hybridizace. Zjišťuje se, že dva klony (P509S a P510S) jsou nadměrně expresovány v nádoru prostaty a v normální prostatě a expresovány méně ve všech ostatních normálních testovaných tkáních (v játrech, ve slinivce, v pokožce, v kostní dřeni, v mozku, v prsu, v adrenalní žláze, v měchýři, ve varlatech, ve slinné žláze, v tenkém střevě, v ledvinách, ve vaječní cích, v plicích, v míše, v kosterním svalstvu a v tlustém střevu). Stanovené sekvence cDNA pro P509S a P51OS jsou v SEQ ID NO:223 a 224, Porovnání těchto sekvencí se sekvencemi v genové bance ukazuje urči tou homologi i s dříve testovanými EST.

.'-· w - ..: ·./ .. ,

Následné studie vedly pro P509S. Tato sekvence je k izolaci cDNA sekvence plné délky v SEQ ID NO: 332, přičemž odpovídající předpověděná aminokyselinová sekvence je v SEQ ID NO: 339. Dvě varianty cDNA sekvencí plné délky pro P510S jsou v SEQ ID NO: 535 a 536, přičemž odpovídající předpověděné sekvence jsou v SEQ ID NO: 537 a 538. Přídavné rozštěpené varianty P510S jsou v SEQ ID NO: 598 a 599.

Příklad 2

Určení tkáňové specifičnosti polypeptidu specifických pro prostatu

Za použití specifických primerů se zkoumají expresní hladiny mRNA pro reprezentativní polypeptidy specifické pro prostatu El-16, Hl-1, Ji-17 (nazývané také P502S), LI-12 (nazývaný také P501S), El-12 (nasávaný také P504S a Ní-1862 (nazývaný také P503S) v různých normálních a nádorových tkáních za použití RT-PCR.

Z různých normálních a nádorových tkání se extrahuje celková RNA za použití reakčního činidla Trizol, jak shora popsáno, Syntesa prvního kmene se provede za použití 1 až 2 «g celkové RNA reversní transkriptázou SuperScript II (BRL Life o

Technologies) jednu hodinu při teplotě 42 C. cDNA se pak zesílí PCR genspecifickým primerem. K zajištění semikvant itativní povahy RT-PCR se jako vnitřní kontroly použije β-akt inu pro každou ze zkoumaných tkání. Napřed se provedou sériová ředění cDNA prvního kmene a zkoušky RT-PCR se provedou primery specifickými pro p-actin. Pak se najde zředění, které umožňuje zesílení matrice p-actinu v lineárním rozsahu, která byla dostatečně citlivá k refektování rozdílů v počtu výchozích kopií. Za použití těchto podmínek, se stanoví hladiny p-akti nu pro každou reversní transkripční reakci od každé tkáně. Kontaminace DNA se minimalizuje zpracováním DHasou a zaručením negativ- ,i42 η i ho výs1edku PCR za pouši t í připraven bez přidání reversní cDNA prvního kmene, který byl transkriptázy.

normálních tkání plic, vaječníků,

Hladiny exprese mRNA se zkoumají u čtyř různých typů nádorových tkání (nádoru prostaty od dvou pacientů, nádoru prsu od tří pacientek, nádoru tlustého střeva a plic) a u šestnácti prostaty, tlustého střeva, ledvin, jater, slinivky, kosterního svalstva, pokožky, žaludku, varlat, kostní dřeně a mozku. Zjišťuje se, še Fl-16 je expresován ve vysoké níře tkání nádoru prostaty, nádoru tlustého střeva a normální prostaty a v menší míře v normálních játrech, v pokožce a ve varlatech, přičemž exprese je nezjistitelná v ostatních zkoumaných tkáních. H1 - 1 je expresován ve vysoké míře v nádoru prostaty, tě, v normálním tlustém střevě plic, prsu, v normální prostaa v normálním mozku, ve značně menší míře v normálních plicích, slinivce, kosterním svalstvu, pokožce, tenkém střevě, kostní dřeni a nebyl zjištěn v ostatních testovných tkáních. JI-17 (P502S) a LI-12 (P501S) se jeví jako specificky nadměrně expresované v prostatě, přičemž oba geny jsou expresovány velkou měrou v nádoru prostaty a v normální prostatě, avšak v malé, téměř nezjistitelné míře ve všech ostatních zkoušených tkáních. Zjišťuje se, že NI-1862 (P503S) je nadměrně expresován (o 60 %) v nádorech prostaty a zjistitelný je v normálním tlustém střevě a v ledvinách. Výsledky RT PCR tedy ukazují, že Fl-16, H1- 1, JI-17 (P502S), Nl-1862 (P503S) a LI-12 (P501S) jsou buď specifické pro prostatu nebo jsou expresovány ve významně zvýšené míře v prostatě.

Další studie RT-PCR ukazují, še Fl-12 (P504S) je nadměrně expresován (o 60 %) v nádorech prostaty, zjistitelný v normálních ledvinách, nezjistitelný však ve všech ostatních zkoumaných tkáních. Podobně Rl-2330 ukazuje, še je nadměrně exprsován (o 40 %) v nádorech prostaty, zjistitelný v normálních ledvinách a v játrech, nezjistitelný však ve všech ostatních

- 1·;3 testovaných tkáních. Ul-3064 je nadměrně expresován (o 60 %) v nádorech prostaty a je expresován také v nádorech prsu a tlustého střeva, není však zjistitelný v normálních tkáních.

Charakteristika RT-PCR, Rl-2330, Ul-3064 a 1D-4279 ukazuje, že tři antigeny jsou nadměrně expresovány v prostatě a/nebo v nádoru prostaty.

Northern analýza čtyř prostatových nádorů, dvou normálních vzorků prostaty, dvou BPH prostaty a normálního tlustého střeva, ledvin, jater, plic, slinivky, kosterního svalstva, mozku, žaludku, varlat, tenkého střeva a kostní dřeně ukazuje, že LI-12 (P501S) je nadměrně expresován v nádorech prostaty a v normální prostatě, zatímco je nezjistitelný v jiných normálních testovaných tkáních. JI-17 (P502S) se zjistil ve dvou nádorech prostaty a nezjistil se v jiných testovaných tkáních. NI-1862 (P5O3S) je nadměrně expresován ve třech nádorech prostaty a expresován v normální prostatě, v tlustém střevě a v ledvinách, avšak nikoliv v ostatních testovaných tkáních. Fl-12 (P504S) je vysoce expresován ve dvou nádorech prostaty a je nezjistitelný ve všech ostatních testovaných tkáních.

Shora popsané technologie mikrořad se použije ke zjištění míry exprese reprezentativních antigenů zde popsaných v nádoru prostaty, prsu a v normálních tkáních ze souboru zahrnujícího: prostatu, játra, slinivku, pokožce, kostní dřeni, mozeu, prsy, adrenální žlázy, měchýř, varlata, slinné žlázy, tenké střevo, ledviny, vaječníky, plíce, míchu, kosterní svalstvo a tlusté střevo. LI-12 (P5O1S) je nadměrně expresován v normální prostatě a v nádoru prostaty, přičemž jakási exprese je zaznamenána v normálním kosterním svalstvu. Jak JI-12 tak Fl-12 (P504S) jsou nadměrně expresovány v nádoru prostaty, přičemž exprese je nižší až nezjistitelná ve všech ostatních testovaných tkáních. NI-1862 (P503S) je expresován ve velké míře v nádoru prostaty a v normální prostatě a v malé míře v normálním tenkém střevě a v normálním tlustém střevě, přičemž exprese je nezjistitelná ve všech ostatních testovaných tkáních. R1-233Q je expresován ve velké míře v nádoru prostaty a v normální prostatě a v malé míře ve všech ostatních testovaných tkáních, iD-4279 je expresován ve velké míře v nádoru prostaty a v normální prostatě, v menší míře v normální míše a je nezjistitelný ve všech ostatních testovaných tkáních.

Další analýza microřady zaměřená specificky na rozsah exprese P501S (SEQ ID NO:110) _v nádoru prsu ukazuje mírnou nadměrnou expresi nejenom v nádoru prsu, ale také v metastázovém nádoru prsu (2/31), přičemž je zanedbatelná až nízká exprese v normálních tkáních. Tyto údaje naznačují, že P501S může být nadměrně expresován v různých plicních nádorech i v nádoru prostaty.

Míra exprese 32EST (expresované sekvence tag), které popsal Vasmatzis a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95, str. 300 až 304, 1998) v různých nádorových a normálních tkáních se zkoumá mikrořadovou technologií jak shora popsáno. Zjišťuje se, že dva z těchto klonů (P1000C a P1001C) jsou nadměrně expresovány v nádoru prostaty a v normální prostatě a expresovány v nízké nebo nezjistitelné míře ve všech ostatních testovaných tkáních (normální aorta, thymus, stávající nebo aktivovaná PBMC, epitelové buňky, mícha, adrenální žláza, zárodečné buňky, pokožka, slinná žláza, zažívací ústrojí, kostní dřeň, játra, plíce, dendritické buňky, žaludek, lymfatické uzliny, mozek, srdce, tenké střevo, kosterní svalstvo, tlusté střevo a ledviny). Zjištěné sekvence cDNA pro PlOOOC a PIOOIC jsou v SEQ ID NO:384 a 472. Ukazuje se, že sekvence PIOOIC vykazuje určitou homologii s dříve izolovanou lidskou mRNA pro protein JM27. Následné porovnání sekvence SEQ ID NQ: 384 se sekvencemi ve veřejných databázích vede k identifikaci cDNA sekvence plné délky PlOOOC (SEQ ID NO: 786), která kóduje aminokyselinovou sekvenci 492. Analysa sekvence aminokyselin programem PSORT II vede k identifikaci domnělé transmembránové domény z aminokyselin 84 aš 100. Sekvence cDNA otevřeného čtecího rámce P1000C, včetně stop kodonu je zajištěna v SEQ ID NO: 787, přičemž otevřený čtecí rámec bez stop kodonu je v SEQ ID NO: 788. Sekvence plné délky aminokyseliny P1000C je v SEQ ID NO: 789. Sekvence SEQ ID NO: 790 a 791 reprezentují aminokyseliny 1 aš 100 a 100 aš 492 P1000C.

Exprese polypeptidu kódovaného plnou délkou cDNA sekvence Fl-12 (nazývané téš P504S, SEQ ID NO: 108) se zkoumá imunohistochemickou analýzou. Standardní technikou se generují král ičí-anti-P504S polyklonální proti 1átky proti proteinu P504S plné délky. Následná izolace a charakterizace polyklonálních protilátek se také provede v oboru známým způsobem. Imunohistochemická analýza ukazuje, že polypeptid P504S je 100% expresován v testovaných vzorcích (n=5) rakoviny prostaty.

Nejeví se, že králičí-anti-P504S polyklonální protilátka značkuje benigní buňky prostaty stejným cytoplasmickým granulárním zabarvením, ale spíše lehkým nukleovým zabarvením. Analýza normálních tkání ukazuje, že kódovaný polypeptid je expresován v několika avšak ne ve všech normálních lidských tkáních. Pozitivní cytoplasmické zabarvení králičí-anti-P504S polyklonální protilátkou je v normálních lidských ledvinách, v játrech, v mozku, v tlustém střevu a v makrofágách spojených s plícemi, zatímco srdce a kostní dřeň jsou negativní.

Tyto údaje naznačují, že polypeptid P504S je obsažen v tkáních rakoviny prostaty, a že existují kvalitativní a kvantitativní rozdíly v zabarvení mezi tkáněmi benigní prostatické hyperplasie a tkáněmi rakoviny prostaty, což značí, že tento polypeptid může být pozitivně selektivně zjištěn v nádorech prostaty, a proto může být užitečný v diagnostice rakoviny prostaty.

Př í k1 ad 3

Izolace a charakterizace polypeptidů specifických pro prostatu subtrakcí na bázi PCR

Subtrakční knihovna cDNA, obsahující cDNA z normální prostaty subrahovaná s deseti normálními tkáněmi cDNA (mozek, srdce, ledviny, játra, plíce, vaječníky, placenta, kosterní svalstvo, slezina a brzlík) a pak předaná na první okruh zesílení PCR, se opatří od společnosti Clontech. Tato knihovna se podrobí druhému okruhu zesílení PCR podle výrobcova protokolu. Výsledné fragmenty cDNA se subklonují do vektoru pT7 Blue T-vector (Novagen, Madison, WI) a transformují se do XL-1 Blue MRF E.colí (Stratagene). DNA se izoluje z nezávislých klonů a sekvencuje se za použití Perkin Elffler/Applied Biosystems Diviši on AutoBiated Sequencer Model 373A.

Sekvencuje se 59 pozitivních klonů. Porovnání sekvenci DNA těchto klonů se sekvencemi klonů v genové bance, jak shora popsáno, neukazuje významné homologie u 25 z těchto klonů, dále označených P5, P8, P9, P18, P20, P30, P34, P36, P38, P39, P42, P49, P50, P53, P55, P60, P64, P65, P73, P75, P76, P79 a P84. Zjištěné sekvence cDNA pro tyto klony jsou v SEQ ID NO: 41 až 45, 47 až 52 a 54 až 65. U sekvencí P29, P47, P68, P80 a P82 (SEQ ID NO: 46, 53 a 66 až 68), se zjišťuje, že mají určitý stupeň homologie s dříve identifikovanými sekvencemi DNA. Pokud je známo, nebylo dosud o žádné z těchto sekvencí popsáno, že se vyskytuje v prostatě.

Výsledkem dalších studii, používajících sekvence SEQ ID NO: 67 jako sondy při standardním způsobu klonování v plné délce, je izolace tří sekvencí cDNA, které se jeví jako rozštěpené varianty P80 (známé také jako P704P). Tyto sekvence jsou v SEQ ID NO: 620 až 622.

- 147 mi. Stanovené sekvence cDNA pro 115 aš 123, 127, 131, 137, 145, a 160. Dvacet tři klony (SEQ ID 132 aš 136, 138 aš 144, 146, 152,

Výsledkem dalších studií, používajících metodologie na bázi PCR popsané shora, je izolace více než 180 dalších klonů, z nichž 23 nevykazuje významné homologie se známými sekvencetyto klony jsou v SEQ ID NO: 147 až 151, 153, 156 až 158

NO: 124 až 126, 128 až 130,

154, 155 a 159) vykazují nějakou homologii s dříve identifikovanými EST. U deseti dalších klonů (SEQ ID NO: 161 aš 170) se zjišťuje, že mají určitý stupeň homologie se známými geny. Větší klony cDNA, obsahující sekvenci P20, vykazují rozštěpné varianty genu označeného jako P703P. Stanovené sekvence DNA pro varianty označené DE1, DE13 a DE14 jsou zajištěny v SEQ ID NOS: 171, 175 a 177, s odpovídajícími předpověděnými aminokyselinovými sekvencemi v SEQ ID NO: 172, 176 a 178. Stanovená sekvence cDNA pro rozšířenou rozštěpenou formu P703 je v SEQ ID NO·’ 225. Sekvence DNA pro rozštěpené varianty označované jako DE2 a DE6 jsou v SEQ ID NOS: 173 aš 174.

Expresní míra mRNA pro reprezentativní klony v nádorových tkáních (prostaty (n=5), prsu (n=2), tlustého střeva a plic), v normálníh tkáních (prostaty (n=5), tlustého střeva, ledvin, jater, plic (n=2), vaječníků (n=2) kosterního svalstva, pokožky, žaludku tenkého střeva a mozku) a aktivovaných a nektivovaných PBMC se stanoví RT-PCR, jak shora popsáno. Pokud není uvedeno jinak, zkoumá se exprese na jednom vzorku z každého typu tkáně.

Zjišťuje se, še P9 je vysoce expresován v normální prostatě a v nádoru prostaty ve srovnání s normálními testovanými tkáněmi, s výjimkou normálního tlustého střeva, kde vykazuje porovnatelnou expresi. P20, což je část genu P703P, je vysoce expresován v normální prostatě a v nádoru prostaty, ve srovnání se všemi dvanácti normálními testovanými tkáněmi. Mírný nárůst exprese P20 v nádoru prsu (n=2), v nádoru tlustého střeva

- ,148 -.>

a v nádoru plic je patrný ve srovnání se všemi ostatními tkáněmi s výjimkou plic (1 ze 2). Zvýšená exprese P18 je patrná u normální prostaty, nádoru prostaty a nádoru prsu ve srovnání s ostatními normálními tkáněmi s výjimkou plic a žaludku. Střední nárůst exprese P5 je patrný u normální prostaty ve srovnání s většinou ostatních normálních tkání. Avšak určitá zvýšená exprese je patrná u normálních plic a PBMC. Zvýšená exprese P5 je patrná také u nádoru prostaty (2 z 5), nádoru prsu a u jednoho vzorku plic. U P30 jsou patrné podobné míry exprese v normální prostatě a v nádoru prostaty, ve srovnání se 6 ze 12 ostatních normálních testovaných tkání. Zvýšená exprese se jeví u nádorů prsu u jednoho vzoru nádoru plic a nádoru tlustého střeva a také u normální PBMC. Nadměrně expresován je P29 v nádoru prostaty (5 z 5) a v normální prostatě (5 z 5) ve srovnání s většinou normálních tání. Avšak podstatná exprese P 29 je patrná v normálním tlustém střevu a v normálních plicích (2 ze 2). Nadměrně expresován je P80 v nádoru prostaty (5 z 5) a v normální prostatě (5 z 5) ve srovnání se všemi ostatními testovnými tkáněmi, se zvýšenou expresí patrnou také v nádoru tlutého střeva.

Výsledkem dalších studíí je izolace 12 dalších klonů dále označovaných 10-d8, 10-hl0, 11-c8, 7-g6, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9, 8-g3, 8-hll, 9-fl2 a 9-f3. Stanovené sekvence DNA pro

10- d8, 10-hl0, ll-c8, 8-d4, 8-d9, 8-hll, 9-fl2 a 9-f3 jsou v SEQ ID NO: 207, 208, 209, 216, 217, 220, 221 a 222. Stanovené sekvence DNA ve směru a proti směru pro 7-g6, 8-b5, 8-b6 a 8-g3 jsou v SEQ ID NO: 210 a 211, 212 a 213, 214 a 215 a 218 a 219. Z porovnání stanovených sekvencí s genovou bankou nevyplývají významnější homologie sekvence 9-f3. Klony 10-d8,

11- c8 a 8-hll vykazují určitou homologii s dříve izolovanými EST zatímco klony 10-hl0, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9, 8-g3 a 9-fl2 vykazují určitou homologii s dříve identifikovanými geny. Z další charakteristiky vyplývá identita klonů 7-G6, a 8-G3 se známými geny PAP a PSA..

1'49 Expresní míra mRNA pro tyto klony se stanoví pomocí shora popsané technologie mikrořady. Klony 7-G6, 8-G3, 8-B5, 8-B6,

8-D4, 8-D9, 9-F3, 9-F12, 9-H3, 10-A2, 10-A4, 1Í-C9 a 11-F2 jsou nadměrně expresovány v nádoru prostaty a v normální prostatě, přičemž exprese v ostatních tkáních je nezjistitelná. Zvýšená exprese 8-F11 se pozoruje v nádoru prostaty a v normální prostatě, v měchýři, v kosterním svalstvu a v tlustém střevu. Zvýšená exprese 10-H10 se pozoruje v nádoru prostaty a v normální prostatě, v měchýři, v plicích, v tlustém střevu, v mozku a v zažívacím traktu. Zvýšená exprese 9-B1 se pozoruje v nádoru prostaty, v nádoru prsu a v normální prostatě, ve slinné žláze, v zažívacím traktu a v pokožce, přičemž zvýšená exprese 11-C8 je patrná v nádoru prostaty, v normální prostatě a v zažívacím traktu.

Zjišťuje se, že další fragment cDNA, odvozený substrakcí na bázi PCR normální prostaty, shora popsané, je specifický pro prostatu jak technologií microřady tak RT-PCR. Stanovená sekvence cDNA tohoto klonu (označovaného 9-A11) je v SEQ ID NO: 226. Z porovnání této sekvence se sekvencemi ve veřejných databázích vyplývá 99% totožnost se známým genem H0XB13.

Výsledkem dalších studií je izolace klonů 8-C6 a 8-H7. Stanovené sekvence cDNA pro tyto klony jsou v SEQ ID NO: 227 a 228. Ukazuje se, že tyto sekvence mají určitou homologii s dříve isolovanými EST.

K získání delších sekvencí cDNA pro klon P20 (nazývaný též P7O3P) se použije metodologií na bázi hybridizace, jež poskytují tři další fragmenty cDNA, které progresivně rozšiřují 5 konec genu. Tyto fragmenty se nazývají P703PDE5, P703P6.26 a P703PX-23 (SEQ ID NO: 326, 328 a 330, přičemž předpověděné odpovídající aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO: 327, 329 a

331) a obsahují přídavnou sekvenci 5 . Skrínováním knihovny cDNA (#141-26) se získá P703PDES s částí P703P jako sondy.

Ρ703Ρ6.26 se získá se směsi tří cDNA nádoru prostaty a P703PX-23 z knihovny cDNA (#438 až 48). Dodatečné sekvence zahrnují tedy všechny domnělé zralé proteázy šeřinu s částí domnělé signální sekvence. cDNA sekvence plné délky pro P703P je v SEQ ID NO: 524, přičemž odpovídající aminokyselinová sekvence je v SEQ ID NO: 525.

Za použití počítačového algoritmu sé následující regiony P703P předpovídají k reprezentaci potenciálních HLA A2-vázajících CTL epitopy: aminokyseliny 164 až 172 SEQ ID NO·· 525 (SEQ ID NO: 723), aminokyseliny 160 až 168 SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO'· 724), aminokyseliny 239-247 SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 725), aminokyseliny 118 až 126 SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO:726), aminokyseliny 112 až 120 SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO= 727), aminokyseliny 155 až 164 SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO=728), aminokyseliny 117 až 126 SEQ ID NO:525 (SEQ ID N0:729), aminokyseliny 164 až 173 SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO:730), aminokyseliny 154 až 163 SEQ ID NO: 525 (SEQ ID N0‘· 731), aminokysel iny 163 až 172 SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 732), aminokyseliny 58 až 66 SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 733) a aminokyseliny 59 až 67 SEQ ID NO: 525 (SEQ ID NO: 734).

Zjišťuje se, že P703P vykazuje určitou homologii s dříve identifikovanými proteázami, jako je thrombin. Thrombinový receptor je, podle zjištění, přednostně expresován ve vysoce metastázových buňkách rakoviny prsu a ve vzorcích biopsie rakoviny prsu. Zavedení thrombinového receptoru anti médiátorové cDNA inhibuje invazi metastázových buněk rakoviny prsu v kultuře. Protilátky proti thrombinovému receptoru inhibuji aktivaci thrombinového receptoru a aktivaci destiček vyvolanou thrombinem. Kromě toho se zdá, že peptidy, které ohrazují ligandovou doménu, inhibuji shlukování destiček thrombinem. P703P může mít význam v rakovině prostaty prostřednictvím proteázou aktivovaného receptoru na rakovinové buňce nebo na stromálních buňkách. Potenciální proteázové aktivity P703P po- 151 dobné trypsinu mohou buď aktivovat proteázou aktivovaný receptor na membráně rakovinové buňky k vyvolání geneze nádoru nebo aktivovat proteázou aktivovaný receptor na sousedních buňkách (jako jsou stromální buňky) k sekretování růstových faktorů a/nebo proteáz (jako je matrice metaloproteinázy), které mohou podpořit angiogenezi nádoru, invazi a metastázu. P7O3P může tedy podporovat progresi a/nebo metastázu nádoru aktivováním proteázou aktivovaného receptoru. Polypeptidy a protilátky, které blokují P703P-receptorovou interakci, mohou být proto s úspěchem použity v léčení nádoru prostaty.

K určení, zda exprese P703P vzrůstá se zvýšenou závažností Gleasonova stupně, což je indíktor nádorového stavu, se provede kvantitativní PCR analýza vzorků nádoru prostaty v rozmezí Gleasonova stupně 5 až >8. Střední míra exprese P703P, zvýšená s rostoucím stupněm Gleasonovým stupněm, indikuje, že exprese P703P může být ve vztahu se zvýšenou závažnost í choroby.

Další studií za použití na bázi PCR subtrakční knihovny souboru nádoru prostaty subtrahovaného proti souboru normálních tkání (označováno až jako JP:PCR subtrakce) vede k izolací třinácti přídavných klonů, z nichž sedm nevykazuje žádnou významnou homologii se sekvencemi banky genů. Stanovené cDNA sekvence pro těchto sedm klonů (P711P, P712P, nový 23, P774P, P775P, P710P a P768P) jsou v SEQ ID NO: 307 až 311, 313 až 315. Zbývajících šest klonů (SEQ ID NO: 316 a 321 až 325) vykazuje určitou homologii se známými klony. Analýzou microřady je zjištěno, že všech třináct klonů vykazuje trojnásobnou nebo vícenásobnou nadměrnou expresi v prostátových tkáních včetně nádoru prostaty, BPH a normální prostaty v porovnání s normálními neprostatovými tkáněmi. Klony P711P, P712P, nový 23 a P768P vykazují nadměrnou expresi ve většině nádorů prostaty a v testovaných tkáních BPH (n=29) a ve většině tkání normální prostaty (n=4), avšak prostředí pro nízké expresní míry u

- 15’3 všech normálních tkání. Klony P774P, P775P a P71OP vykazují poměrně nízkou expresi a expresi v několika nádorech prostaty a ve vzorcích BPH s negativní až nízkou expresí v normální prostatě.

Další studie vede k isolaci rozšířené sekvence cDNA pro P712P (SEQ ID N0:552). Aminokyselinové sekvence kódované 16, předpověděnými rámci volného čtení, obsažené v sekvenci SEQ ID NO: 552, jsou v SEQ ID NO: 553 až 568.

cDNA plné délky pro P711P se získá použitím dílčí sekvence SEQ ID NO: 307 ke skrinování prostatové knihovny cDNA. Standardními způsoby se připraví směrově klonovaná cDNA prostatové knihovny. Na destičky LB/Amp se nanese milion kolonií této knihovny. K posunu těchto kolonií se použije nylonových membránových filtrů a cDNA zachycené těmito filtry se denaturu j í a zesíťují na filtrech UV-světlem. Fragment P711P cDNA SEQ ID NO:307 se radiačně označí a použije se ho k hybridizaci s těmito filtry. Vyberou se pozitivní klony a cDNA se připraví a sekvencují se za použití zařízení Perkin Elmer/Applied Biosystems. Sekvence P711P je v SEQ ID NO: 382 s odpovídající předpověděnou aminokyslinovou sekvencí v SEQ ID NO: 383.

Za použití PCR a metodologií založených na hybridizaci se odvodí informace o sekvencích cDNA ze shora uvedených klonů, 11-C9 a 9-F3, nazývaných P707P a P714P (SEQ ID NO: 333 a 334). Po porovnání s nejnovější genovou bankou se zjišťuje, še P707P je rozštěpenou variantou známého genu HoxB13. Nenalezly se však žádné významné homologie s P714P. Výsledkem daších studií za použití sekvence SEQ ID N0= 334 jako sondy ve standardních způsobech klonování v plné délce, je rozšířená sekvence cDNA pro P714P. Tato sekvence je v SEQ ID NO: 619. Tato sekvence má určité homologie s genem, který kóduje lidský ribosomální protein L23A.

^«sfe^aw^s^wíAtíeBí ► ·.

- ,ť53 Klony 8-B3, P89, P98, P130 a P201 (podle americké přihlášky vynálezu číslo US 09/020,956, podané 9. února 1998) jsou obsaženy uvnitř souvislé sekvence nazvané P705P SEQ ID NO'· 335 s předpověděnou aminokyselinovou sekvencí (SEQ ID NO=336), která je rozštěpenou variantou známého genu NKX3.1.

Výsledkem další studie na P775P je izolace čtyř dalších sekvencí (SEQ ID NO^-· 473 až 476), které jsou rozštěpenými variantami genu P775P. Sekvenci SEQ ID NO: 474 obsahuje dva otevřené čtecí rámce (ORF). Předpověděné aminokyselinové sekvence kódované těmito ORF jsou v SEQ ID NO ^: 477 a 478. Sekvence cDNA SEQ ID NO·' 475 obsahuje ORF, který kóduje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 479. Sekvence cDNA SEQ ID NO: 473 obsahuje podle zjištění čtyři ORF. Předpověděné aminokyselinové sekvence, kódované těmito ORF, jsou v SEQ ID NO-'480 až 483. Další rozštěpené varianty P775P jsou v SEQ ID NO ^: 593 až 597.

Další studie vede k identifikaci genomového regionu na chromosomu 22ql1.2, známé jako region Cat Eye Syndrom”, který obsahuje všech pět prostatových genů P704P, P712P, P774P, P775P a B305D. Relativní umístění každého z těchto pěti genů uvnitř genomového regionu je znázorněno na obr.10. Tento region může proto souviset s malignantními nádory a uvnitř tohoto regionu mohou být jiné potenciální nádorové geny. Tyto studie vedly také k identifikaci potenciálního otevřeného čtecího rámce (ORF) pro P775P (v SEQ ID N0= 533), který kóduje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 534.

Z porovnání klonu SEQ ID NO·’ 325 (označeného P558S) se sekvenemi v genové bance a v databázích GeneSeq DNA vyplývá, že P558S je identický s transglutaminovým genem specifickým pro prostatu, o kterém je známo, že má dvě formy. Sekvence plné délky pro obě formy jsou v SEQ ID NO·¹ 630 a 631 s odpovídajícími aminokyselinovými sekvencemi v SEQ ID NO: 632 a 633. cDNA sekvence SEQ ID NO: 631 má 15 párů základního začlenění,

- 154

které vede k pěti inzertům aminokyselin v odpovídající aminokyselinové sekvenci (SEQ ID N0 = 633). Tento inzert není obsažen v sekvenci SEQ ID N0 = 630.

Další studie P768P (SEQ ID N0 = 315) vede k identifikaci domnělého otevřeného rámce plné délky (ORF). cDNA sekvence ORF se stop kodonem je v SEQ ID NQ^; 764. cDNA sekvence ORF bez stop kodonu je v SEQ ID N0 = 765, přičemž odpovídající aminokyselinová sekvence je v SEQ ID N0 = 766. Tato sekvence vykazuje 86% identitu se krysím proteinem přenosu vápníku, což naznačuje, že P768P může představovat lidský protein přenosu vápníku. Jsou předpověděna umístění transmembránových domén uvnitř P768P za použití počítačového algoritmu PSORT II. Předpověděno je šest transmembránových domén v minokyselinové poloze 118 až 134, 172 až 188, 211 až 227, 230 až 246, 282 až 298 a 348 až 364. Aminokyselinová sekvence SEQ ID Ν0= 757 _ag 772 představují aminokyseliny 1-134, 135 - 188, 189 - 227, 228 - 246, 247298 a 299 - 511 produktu P768P.

Příklad 4

Syntesa polypeptidů

Polypeptidy se mohou syntetizovat za použití peptidového syntetizátoru Perkin Elmer/Applied Biosystems 430A s použitím chemie FMOC s aktivací HPTU (O-benzotriazol-N,N,N ,N -tetramethyluroniumhexafluorfosfátu). K aminovému konci peptidu se může připojit sekvence Gly-Cys-Gly k provedení způsobu konjugace, vazby na imobi1izovaný povrch nebo značením peptidu. Odštěpení peptidu od pevného nosiče se může provádět následující štěpící směsí'- kyselina trifluoroctová/ethandithiol/thioanisol/voda/fenol (40=1:2=2:3). Po dvouhodinovém štěpení se peptidy mohou vysrážet ve studeném methyl-terc-butyl-etheru. Peptidové pelety se pak mohou rozpustit ve vodě obsahující 0,1 % kyseliny trifluoroctové (TFA) a lyofilizovat před čištěním C18 reversní fázovou chromatografií HPLC. Gradientu O až 60 % acetonitrilu (obsahujícího O,1 % TFA) ve vodě (obsahujícího O,1 % TFA) může být použito k eluování peptidu. Po lyofilizaci čistých frakcí mohou být peptidy charakterizovány pomocí electrospreje nebo jiným typem hmotové spektrometrie a analýzou aminokyselín.

Příklad 5

Další izolace a charakterizace polypeptidů specifických pro prostatu subtrakcí na bázi PCR

Knihovna cDNA, generovaná z primárního nádoru prostaty mRNA jak shora popsáno, se subtrahuje za použití cDNA z normální prostaty. Subtrakce se provádí podle protokolu na bázi PCR (Clontech), který je upraven k vytváření větších fragmentů. Podle tohoto protokolu se digerují odděleně testovací a řídící (“driver*') dvouřetězcová cDNA pěti restrikčními enzymy, které rozeznají šestínukleotidové restrikční místa (Mlul, MscI, PvuII, Sáli a stul). Výsledkem této digesce je průměrná vel ikost cDNA 600 párů bází, spíše než průměrná velikost 300 párů bází, která vychází z digesce Rsal podle protokolu Clontech. Tato modifikace neovlivňuje účinnost subtrakce. Vytvoří se pak dva testovací soubory s různými adaptéry a řídící knihovna zůstane bez adaptéru.

Testovací a řídící knihovny se pak hybridizují za použití nadbytku řídící cDNA. V první operaci hybridizace se řídící knihovna odděleně hybridizuje s každou ze dvou populací testovací cDNA. Výsledkem jsou a) nehybridizované testovací cDNA,

b) testovací cDNA hybridizované do jiných testovacích cDNA, c) testovací cDNA hybridizované do řídících cDNA a d) nehybridizované řídící cDNA. Obě oddělené hybridi začni reakce se pak zkombinují a znovu se hybridizují za přítomnosti dodatečné denaturované řídící cDNA. Po této druhé hybridizaci spolu se soubory a) až d) se generuje pátý soubor e), ve kterém se testovací cDNA s jedním adaptérem hybridizuje do testovací cDNA s druhým adaptérem. Výsledkem druhé hybridizačni operace je obohacení rozdílně expresovaných sekvencí, kterých je možno použít jako matric pro zesílení PCR s primery specifickými pro adaptér.

Konce se vyplní a provede se zesílení PCR s použitím primerů specifických pro adaptér. Pouze soubor e) , který obsahuje testovací cDNA, která nehybridizovala do řídící cDNA, se zesílí exponenciálně. Pak se provede druhá zesilovací operace PCR ke snížení šumu pozadí a k dálšímu obohacení diferenčně expresovaných sekvenc í.

Tento subtrakční způsob založený na PCR normalizuje diferenčně expresované cDNA tak, že vzácné transkripty, které jsou nadměrně expresovány v tkáni nádoru prostaty, mohou být získány. Takové transkripty by bylo možno obtížně získávat tradičními způsoby transkr i pce.

Vedle dalších genů, o nichž je známo, že jsou nadměrně expresované v nádoru prostaty, se identifikuje 77 dalších klonů. Sekvence těchto parciálních cDNA jsou v SEQ ID NO: 29 až 305. Většina těchto klonů nemá významnou homologii se skvencemi databáze. Výjimkou jsou JPTPN23 (SEQ ID NO: 231) mající podobnost s vepřovým proteinem obsahujícím val osin), JPTPN30 (SEQ ID NO: 234, podobnost s krysí mRNA pro proteásomovou podjednotku), JPTPN45 (SEQ ID NO: 243, podobnost s krysí norvegicus na cystolové NADP závislou isocitrátovou dehydrogenázou), JPTPN4 6(SEQ ID NO: 244 podobnost s lidským subklonovou H8 d4 DNA sekvencí), JPID6 (SEQ ID N0= 265, podobnost s lehkým řetězcem-A G-gallusu dyneinu), JP8D6 (SEQ ID NO'· 288, podobnost s lidským klonem BAC RG016J04), JP8F5 (SEQ ID N0=289, podobnost s,lidskou subklonovou H8 3 b5 DNA sekvencí) a JP8E9 (SEQ ID NO: 299, podobnost s lidskou Alu sekvencí).

ά«->~ * »«*·

- Io7 Další studie s použitím knihovny založené na PCR, sestávající ze souboru nádoru prostaty subtrahovaného proti souboru normální prostaty (označeném PT-PN PCR subtrakce) poskytuje další tři klony. Porovnání cDNA sekvencí těchto klonů s nejnovějším vydáním genové banky neukázalo významné homologie s těmito dvěma klony označenými P715P a P767P (SEQ ID NO·' 312 a 314). Zbývající klon vykazuje určitou homologii se známým genem KIAAOO56 (SEQ ID NO: 318). Za použití analýzy mikrořady ke změření míry exprese mRNA v různých tkáních se zjišťuje, že všechny tři klony jsou nadměrně expresovány v nádorech prostaty a ve tkáních BPH. Klon P715P je nadměrně expresován ve většině nádorů prostaty a tkáně BPH trojnásobně nebo více, se zvýšenou expresí patrnou ve většině vzorků normální prostaty a v zárodečné tkáni, avšak negativně s nízkou expresí ve všech ostatních normálních tkáních. Klon P767P je nadměrně expresován v některých nádoreh prostaty a v tkáních BPH se střední mírou exprese v polovině normálních vzorků prostaty a pozadí pro nízkou expresi ve všech ostatních testovaných normálních tkáních.

Další analýza shora popsaným způsobem mikrořady substrakční knihovny PT-PN PCR a substrakční knihovny DNA, obsahující cDNA z nádoru prostaty subtrahované souborem normální tkáně cDNA, vedla k izolaci 27 přídavných klonů (SEQ ID NQ^: 340 až 365 a 381), o kterých se zjistilo, že jsou nadměrně expresované v nádoru prostaty. Klony SEQ ID NO: 341, 342, 345, 347, 348, 349, 451, 355 až 359, 361, 362 a 364 jsou podle nálezu také expresovány v normální prostatě. Exprese všech 26 klonů v řadě normálních tkání je nízká nebo nezjistitelná, s výjimkou P544S (SEQ ID NO: 356), která je expresována v tenkém střevě. Ze 26 klonů, 11 (SEQ ID NO: 340 až 349 a 362) vykazují určitou homologii s dříve identifikovanými sekvencemi. Nezjišťují se významné homologie s klony SEQ ID NO: 350, 351, 353 až

361 a 363 až 365.

- 153 Z porovnání sekvence SEQ ID NO:362 _se sekvencemi v genové bance a v GenSeq DNA databázích vyplývá, že tento klon (označovný P788P) je totožný s GenSeq objednací číslo X27262, který kóduje protein nalezený v GenSeq protein objednací číslo Y00931. DNA sekvence plné délky P788P je v SEQ ID NO: 634, s odpovídající předpověděnou aminokyselinou v SEQ ID NO: 645. Následně cDNA sekvence plné délky pro P788P, která obsahuje polymorfismus nezjištěný v sekvenci SEQ ID NO: 634, se klonuje několikrát PCR zesílením z cDNA připravené z několik matric RNA od tří jedinců. Tato stanovená cDNA skvence této polymorfní varianty P788P je v SEQ ID N0= 636 s odpovídající aminokyselinovou sekvenci v SEQ ID NO: 637. Sekvence SEQ ID NO: 637 se liší od sekvence SEQ ID N0= 635 šesti zbytky minokyselin. Protein P788P má 7 potenciálních transmembránových domén u C-koncové části a je to plasmový membránový protein s extracelulárním N-koncovým regionem.

Výsledkem další studie klonu SEQ ID NO=352 (označeného P790P) je izolace cDNA sekvence plné délky SEQ ID NO'· 526. Odpovídající poředpověděná aminokyselina je v SEQ ID NO'· 527. Údaje ze dvou kvantitativních PCR pokusů naznačují, že P790P je nadměrně expresován v 11/15 testovaných vzorků nádoru prostaty a je expresován v malé míře v míše, přičemž není patrna žádná exprese ve všech ostatních testovaných normálních vzorcích. Údaje z dalších pokusů PCR a pokusů s mikrořadami ukazují nadměrnou expresi v normální prostatě a v nádoru prostaty, s malou nebo s žádnou expresí v ostatních testovných tkáních. Následně se zjišťuje významná homologie s dříve identifikovaným G-proteinem kopulovaným receptorem tkáně prostaty.

Přídavné studie klonu SEQ ID NO: 354 (označeného P776P) vedou k izolci rozšířené cDNA sekvence cDNA v SEQ ID NO'· 369. Zjištěné sekvence cDNA tří přídavných rozštěpených variant P776P jsou v SEQ ID NO: 570 až 572. Aminokyselinové sekvence, ' < * - - rJn* , - kódované dvěma předpověděnými otevřenými čtecími rámci (ORF), obsažené uvnitř SEQ ID NO: 570, jedna předpověděná ORF obsažená v SEQ ID NO: 571 a 11 ORF obsažených v SEQ ID NO: 569 jsou v SEQ ID NO- 573 aš 586. Další studie vedou k izolaci sekvence plné délky pro klon SEQ ID NO:570 (_v SEQ ID NO: 737), Úsilí o klónování plné délky klonu SEQ ID NO: 571 vede k izolaci dvou sekvencí (v SEQ ID NO: 738 a 739), představujících jediný klon, který je totožný s výjimkou polymorfní inserce/delece v poloze 1293. Klon SEQ ID NO:739 (oznařovaný jako klon F) má uhlík v poloze 1293. Předpověděné aminokselinová sekvence, zakódované v pěti otevřenmých čtecích rámcích uvnitř SEQ ID NO: 737, jsou v SEQ ID NO: 740 až 744, s předpověděnými aminokyselinovými sekvencemi zakódovaných klonem SEQ ID NO: 738 a 739, jež jsou v SEQ ID NO: 745 až 750.

Porovnání sekvencí cDNA pro klony P767P (SEQ ID NO: 314) a P777P (SEQ ID NO= 350) se sekvencemi v genové bance human EST database ukazuje, že oba klony mají sekvence EST společně, což znamená, že P767P a P777P mohou představovat tentýž gen. Dohodnutá DNA sekvence, odvozená od DNA sekvence vyrovnaných P767P, P777P a násobné klony EST jsou v SEQ ID NO·^- 587. Aminokyselinové sekvence, kódované třemi domnělými ORF v SEQ ID NO·' 587, - jsou v SEQ ID NO^: 588 až 590.

Ukázalo se, že klon SEQ ID NO' 342 (označený P789P) vykazuje homologii s dříve identifikovaým genem. Sekvene cDNA pro P789P a odpovídjící minokyse1 inové sekvence jsou v SEQ ID NO: 735 a 736.

Příklad 6

Peptidový priming myší a rozšiřování linií CTL

6.1 Tento příklad objasňuje přípravu CTL buněčné linie specifické pro buňky expresující gen P502S.

-..160

J 1 ) ) » > ) » > 1 > » ) > ) ) > > ϊ ί > » > ) ) ) 1 > > ) ) ϊ I V ) > > ) > > > ι » >

) 1 > ) > > ) » ) ) -> ) ) ) )

Myši, expresující transgen pro lidský HLA A2Kb (poskytnuté Dr. L. Shermanem, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) se imunizují peptidem P2SU12 (VLGWVAEL SEQ ID N0:306), který je odvozen z genu P502S (také označovaného JI-17, SEQ ID NO·^- 8), způsobem, který popsal Theobald a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, str. 11993 až 11997, 1995) s následujícími modifikacemi. Myši se imunizují 100 yg P2S#12 a 120 pg vázacího peptidu I-A^b, odvozeného od virového proteinu hepatitidy B, emulgovaného v neúplném Freundově adjuvantu. Po třech týdnech se tyto myši usmrtí a připraví se suspenze za použití nylonové síťky pro jednu buňku. Buňky se pak resuspendují po 6xl0⁶ buněk/ml do úplného prostředí (RPMI-1640, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) obsahujícího 10 % FCS, 2 mM glutaminu (Gibco BRL), natriumpyruvát (Gibco BRL), neesenciální aminokyseliny (Gibco BRL), 2xlO^_5M 2-merkaptoethanolu, 50 U/ml penicilinu a streptomycinu a kultivují se v přítomnosti pulzově ozářených (3000 rad) P2Sttl2 (5 mg/ml P2SW12 a 10 mg/ml p2-mikroglobulinu) blastů LPS (transgenických skupin buněk A2 kultivovaných v prostředí 7 pg/ml dextransulfátu a 25 ug/ml LPS po dobu tří dnů). Po šesti dnech se buňky (5xl0⁵/ml) restimulují s 2,5xl0⁶peptidu pulsově ozářené (20 000 rad) buňky EL4A2Kb (Sherman a kol., Science 258, str. 815 až 818, 1992) a 3xl0⁶/ml transgenických slinívkových živných buněk A2. Buňky se kultivují v přítomnosti 20 U/ml IL-2. Buňky se restimulují na týdenní bázi, jak popsáno, v přípravě klonování linie.

Linie P2S#12 se klonují omezující ředicí analýzou s peptidem pulzovaných nádorových buněk EL4A2Kb (lxlO⁵ buněk/důlek) jako stimulátorů a transgenických slinívkových živných buněk A2 (5xl0⁵ buněk/důlek) a nechají se růst v přítomnosti 30 U/ml IL-2, Čtrnáctého dne se buňky restimulují jako prve. Dvacátého prvního dne se pěstované klony izolují a uchovají se v kultuře. Několik z těchto klonů vykazuje významně vyšší reaktivitu (lyži) proti lidským fibroblastům (expresujícím HLA A2Kb)

-.46.1 transdukovaných P502S než proti kontrolním fibroblastům. Příklad je na obr. 1.

Tyto údaje naznačují, ěe P2S#12 představuje přírodně zpracovaný epitop proteinu P502S ve srovnání s expresovanou lidskou molekulou HLA A2Kb.

6.2 Tento příklad objasňuje přípravu myších linií CTL a klonů CTL specifických pro buňky expresujíci gen P501S

Tato série pokusů se provádí podobně jak je shora popsáno. Myši se imunizují peptidem PlSttlO (SEQ ID NO:337, který je odvozen od P501S genu (nazývaným také LI-12, SEQ ID NO:11O). Peptid PlSttlO je odvozen analýzou předpověděné polypeptidové sekvence pro P501S pro potenciální vazební sekvence HLA-A2 definované zveřejněnými HLA-A2 vázacími motivy (Parker K.C. a kol., J. Immunol. 152, str. 163, 1994). Peptid PlSttlO se syntetizuje způsobem popsaným v příkladu 4 a empiricky se testuje na vazbu HLA-A2 pomocí kompetíční zkoušky založené na T-buňkách. Předpověděné vazební peptidy A2 se testují z hlediska své schopnosti kompetice HLA-A2 specifické peptidové presentace na klon HLA-A2, omezený klonem CTL (D15OM58), který je specifický pro HLA-A2 vázající chřipkový matricový peptid fluM58 D150M58 CTL vylučuje TNF v závislosti na samopresentaci peptidu fluM58. Při zkoušce kompetice se přidají zkušební peptidy při 100 až 200 jjg/ml do kultur D150M58 CTL k vázánmi HLA-A2 na CTL. Po 30 minutách se CTL, pěstované s testovanými peptidy, nebo kontrolní peptidy testují na odezvu své antigenové dávky na pept-id fluM58 ve standardním biotestu TNF. Jak patrno z obr. 3, peptid PlSttlO výkazu kompetici HLA-A2 omezené přítomnosti fluM58, což dokazuje, že peptid PlSttlO váže HLA-A2.

Myši, expresujíci transgen pro lidský HLA A2Kb, se imunizují způsobem, který popsal Theobald a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, str. 11993 až 11997, 1995) s následujícími

162 modifikacemi. Myši se imunizují 62,5 jjg PlSttlO a 120 ug I-A^bvázacího peptidu odvozeného z proteinu viru Hepatitis B, emulgovaného v neúplném Freundově adjuvantu. Po třech týdnech se tyto myši usmrtí a připraví se suspenze za použití nylonové sítky pro jednu buňku. Buňky se pak resuspenduji po 6xl0⁶ buněk/ml do úplného prostředí (jak shora popsáno) a kultivují se v přítomnosti pulsově ozářených (3000 rad) PÍ Sít 10 (2 yg/ml PlSttlO a 10 rng/ml /32-mikroglobul inu) blastů LPS (transgenických slinivkových buněk A2 kultivovaných v prostředí 7 ug/ml dextransul f átu a 25 jjg/ml LPS po dobu tří dnů). Po šesti dnech se buňky (5xl0⁵/ml) restimulují 2,’5xlO⁶ pulsově ozářeným peptidem (20 000 rad) buněk EL4A2Kb jak shora popsáno a 3xl0⁶/ml transgenických slinivkových živných buněk A2. Buňky se kultivují v přítomnosti 20 U/ml IL-2. Buňky se restimulují na týdenní bázi, jak popsáno v přípravě klonování linie. Po třech kolech stimulací in vitro, se jedna linie generuje, která pozná cíle PlSttlO-pulsed Jurkat A2Kb a transdukované cíle Jurkat P501S jak znázorněno na obr. 4.

Linie CTL, specifická pro PlSttlO, se klonuje analýzou omezených ředění s pulsovaným peptidem EL4 A2Kb nádorových buněk (IxlO⁴ buněk/důlek) jako stimulátorů a transgenických slinivkových buněk A2 jako živných (5xl0⁵ buněk/důlek) vyrostlých v přítomnosti 30 U/ml IL-2. Čtrnáctého dne se buňky restimulují jako prve. Dvacátého prvního dne se živoucí klony izolují a uchovají se v kultuře. Jak patrno z obr. 5, vykazuje pět z těchto klonů specifickou cytolytickou reaktivitu proti transdukovaným P501S cílům Jurkat A2Kb. Tyto údaje dokládají, že PlSttlO představuje přírodní epitop proteinu P501S, který je expresován v kontextu s lidskou molekulou HLA.A2.1.

Příklad 7

Narůstání CTL in vivo za použití čisté DNA imunizace s prostatovým antigenem i, κ v ' i , -> 1163 τ ι > > > ’ >

I ·» Ί ) ·» i 1 '1 > 1 , ί > ) » > i >

. ) i ) j > > 1)) > >

> ) '-1 t > } ) > )1 1 ) ) )

Antigen LI-12 specifický pro prostatu, jak shora uvedeno, se nazývá též· P501S. Myši HLA A2Kb Tg (poskytnuté Dr.L. Shermanem, The Scripps Research Institute, La Jol 1 a,CA) se imunizují 100 ng P501S ve vektoru VR1012 jak intramuskul árně, tak intradermálně. Myši se imunizují třikrát s dvoutýdenní přestávkou mezi imunizacemi. Dva týdny po poslední imunizaci se imunované slinivkové buňky kultivují s Jurkat A2Kb-P501S transdukovanými stimulátorovými buňkami. Linie CTL se imunizují týdně. Po dvou týdnech stimulace in vitro se aktivita CTL hodnotí vůči transdukovaným cílům P501S. Dvě z osmi myší vyvinuly silné odezvy CTL anti-P501S. Tyto výsledky dokládají, že P501S obsahuje alespoň jeden přírodní HLA-A2 omezený epitop CTL.

Příklad 8

Schopnost lidských T buněk rozeznat polypeptidy specifické pro prostatu

Tento příklad objasňuje schopnost T buněk specifických pro polypeptid nádoru prostaty rozeznat nádor prostaty.

Lidské T buňky CD8⁺ se přidají in vitro do peptidu P2S-12 (SEQ ID NO: 306) odvozeného od P502S (nazývaného též Jl-17) pomocí dendritických buněk podle protokolu Van Tsai a kol. (Critical Reviews in Immunology 18, str. 65 až 75, 1998). Výsledné mikrokultury T buněk CD8⁺ se testují z hlediska své schopnosti rozeznat peptid P2S-12 v podobě autologových fibroblastů nebo fibroblastů, které byly transdukovány k expresování genu P5O2S v testu gama-interferon ELISPOT (Lalvani a kol., J. Exp. Med. 186, str. 859 až 865, 1997). Titrační čísla T buněk se zkoušejí dvojmo na 10⁴ fibroblastech v přítomnosti 3 yg/ml lidského peptidu Pz-mikroglobulinu a 1 yg/ml P2S-12 nebo kontrolního peptidu E75. Kromě toho se T buňky

- , ,164 současně zkoušejí na autologové fibroblasty transdkukované genem P502S nebo jako kontrola, fibroblasty transdkukované HER-2/neu, Před zkouškou se fibroblasty zpracovávají 10 ng/ml gama- i nterferonu po dobu 48 hodin k přeregulování exprese MHC třídy I. Jedna z mikrokultur (#5) vykazuje silnou rozlišitelnost jak pro peptidem pulsované fibroblasty, tak pro transdkukované fibroblasty v gama-interferonové zkoušce ELISPOT.^Na obr. 2A je patrný silný nárůst počtu gama-interferonových stop s rostoucím počtem T buněk na fibroblastech pulsovaných s peptidem P2S-12 (plné sloupce), avšak nikoli s kontrolním peptidem E75 (volné sloupce). To ukazuje schopnost těchto T buněk specificky rozeznat peptid P2S-12. Jak je patrno na obr. 2B, vykazuje tato mikrokultura nárůst počtu gama-interferonových stop s rostoucím počtem T buněk na fibrioblastěch transdukovaných k expresován! genu P502S avšak nikoli genu HER-2/neu. Tyto výsledky poskytují dodatečný důkaz, že peptid P2S-12 je přírodní epitop proteinu P502S. Kromě toho to dokazuje, že existuje v repertuáru lidských T buněk vysoká afinita T buněk, které jsou schopné rozeznávat tento epitop. Tyto T buňky by měly být také schopné rozeznávat lidské nádory, které expresují gen P502S.

Příklad 9

Vyvolání odezvy CTL specifické pro prostatový antigen v lidské krvi

Tento příklad objasňuje schopnost antigenu specifického pro prostatu vyvolat odezvu CTL v krvi normálních lidí.

Autologové dendritické buňky (DC) se diferencují z monocytových kultur odvozených z PBMC normálních dárců pětidenním růstem v prostředí RPMI obsahujícím 10 % lidského séra, 50 ng/ ml GMCSF a 30 ng/ml IL-4. Po kultivaci se DC infikují přes noc s virem kravských neštovic expresujících rekombinantní P501S

-165 při Μ. 0.1. 5 a nechají se zrát osm hodin s přísadou 2 pg/ml ligandu CD40. Virus se inaktivuje UV-ozářením, buňky CD8⁺ se izolují pozitivním výběrem za použití magnetických perliček a narůstání (priming) kultury se iniciuje na 24-důlkových destičkách. Po pěti stimulačních cyklech s pomocí autologových fibroblastů se identifikuji retrovirově k expresování P501S a CD80 transdukované linie CD8 ⁺ , které specificky produkují interferon-gama, jsou-li stimulovány autologově P501S-transdukovanýní fibroblasty. Aktivita, specifická pro P501S buněčné linie 3A-1 by mohla být získána následnými stimulačními cykly autologových B-LCL transdukovaných s P501S. Ukazuje se, že linie 3A-1 specificky rozlišuje autologovou B-LCL transdukovanou k expresování P501S, avšak nikoli EGFP-transdukovaný autologový B-LCL, měřeno testem cytotoxicity (uvolňování ⁵¹Cr) a produkci interferonu-gama (interferon gama Elispot; Lalvani a kol., J. Exp. Med. 186, str. 859 až 865, 1997). Výsledky těchto zkoušek jsou na obr. 6A a 6B.

Příklad 10

Identifikace přírodního epitopu CTL obsaženého v antigenu P703P specifickém pro prostatu,

Z antigenu P703P (nazývaného též P20) se odvodí 9-merní peptid p5 (SEQ ID NO: 338). Peptid p5 je imunogenický v lidských donorech HLA-A2 a je přírodním epitopem. Lidské CD8+T buňky, specifické pro antigen, se mohou pěstovat po opakovaných stimulacích in vitro monocyty pulsovanými s peptidem p5. Tyto CTL specificky rozeznají p5-pulzované P703P-transdukované cílové buňky, jak v testech ELISPOT (jak shora popsáno) tak v testech uvolňování chrómu. Kromě toho vede imunizace transgenických myší HLA-A2Kb p5 k vytváření linií CTL, které rozeznají transdukované cílové buňky HLA-A2Kb nebo.HLA-A2 expresující P703P.

- . 166 ,Počáteční studie ukazující, ěe p5 je přírodní epitop, se provádějí za použití transgenické myši HLA-A2Kb. Transgenické myši HLA-A2Kb se imunizují subkutánně do tlapky 100 jig peptidu p5 spolu se 140 gg jádrového peptidu viru hepatitidy B (Th-peptid) ve Freundově neúplném adjuvantu. Tři týdny po imunizaci, se stimulují in vitro slinivkové buňky od imunizovaných myší LPS blasty pulzujícími peptid. Aktivita CTL se posuzuje testem uvolňování chrómu pět dní po první stimulaci in vitro. Retrovirově transdukované buňky, expresující kontrolní antigen P703P a HLA-A2Kb se použijí jako cílové. Identifikují se linie CTL, které specificky rozeznají jak p5-pulsové cíle, tak cíle expresuj ící P703P.

Počáteční pokusy pěstování in vitro ukázaly, še peptid p5 je imunogenní u lidí. Dendritické buňky (DC) se diferencují z monocytových kultur, pocházejících z PMBC normálních lidských dárců, kultivací pět dní v prostředí RPMI obsahujícím 10 % lidského séra, 50 ng/ml lidského GM-CSF a 30 ng/ml lidské IL-4. Po kultivaci se DC pulsují s 1 jAg/ml peptidu a kultivují se s PBMC obohaceným CD8+T-buňkami . Linie CTL se restimulují na týdenní bází p5-pulzovaným i monocyty. Pět aš šest týdnů po iniciaci kultur CTL se jeví rozlišitelnost CTL p5-pulzovaných cílových buněk. Dodatečně se ukazuje, še CTL rozlišují lidské buňky transdukované k expresování P703P, což dokládá, še p5 je přírodní epitop.

Studie identifikující další peptidový epitop (nazvaný peptid 4), odvozený z ani genu P703P specifického pro nádor prostaty, který může být rozeznán CD4 T-buňkamí na povrchu buněk v souvislosti s molekulami HLA třídy II se provede jak dále uvedeno. Aminokyselinová sekvence pro peptid 4 je v SEQ ID NO ^:638, spolu s odpovídající cDNA sekvencí v SEQ ID NO: 639.

Standardními způsoby se vytvoří dvacet 15-merních peptidů překrytých 10 aminokyselinami a odvozených z karboxykoncového

167 fragmentu P703P. Dendritické buňky (DC) se odvodí z PBMC normálních dárkyň pomocí GM-CSF a IL-4 standardními protokoly. CD4 T buňky se odvodí od těchže dárkyň jako DC pomocí perlíček MACS a negativní selekce. DC se pulzují přes noc se soubory 15-merních peptidů, přičemž každý peptid má konečnou koncentraci 0,25 /jg/ml Pulzované DC se promyj í a vnesou v množství lxlO⁴ buněk/důlek do 96-důlových destiček se dnem tvaru V a přidají se čištěné CD4 T buňky při lxlO⁵ buněk/důlek. Kultury se doplní 60 ng/ml IL-6 a 10 ng/ml IL-12 a inkubují se při 0 teplotě 37 C. Kultury se restimulují, jak shora popsáno, na týdenní bázi za použití generovaných a pulsovaných DC, jak shora popsáno, jako antigen předávající buňky doplněné 5 ng/ml a 10 ng/ml IL-2. Po 4 stimulačních cyklech in vitro se testuje 96 linií (z nichž každá linie odpovídá jednomu důlku) na specifickou proliferaci a produkcí cytokinů v odezvě na stimulační soubory s irelevantním souborem peptidů odvozených z mafflmaglobinu použitého jako kontroly.

Jedna linie (označená 1-F9) se identifikuje ze souboru #1, a vykazuje specifickou proliferaci (měřenou testem proliferace 3H) a produkci cytokinů (měřenou testem interferon-gama ELISA) v odezvě na soubor #1 peptidů P703P. Tato linie se dále testuje na specifické rozeznání peptidového souboru, specifické rozeznání jednotlivých peptidů v souboru a v analýzách chybného párování HLA k identifikování relevantní restrikční alely. Zjišťuje se, že 1-F9 specificky proliferuje a vytváří interferon-gama v odezvě na peptidový soubor ttl a také na peptid 4 (SEQ ID NO·' 638). Peptid 4 odpovídá aminokyselinám 126 až 140 SEQ ID NO: 327. Provedou se titrační pokusy k posouzení citlivosti linie 1.F9 na specifický peptid. Zjišťuje se, že linie specificky odpovídá peptidu 4 při koncentracích tak nízkých jako 0,25 ng/ml, což naznačuje, že T buňky jsou velmi citlivé, a proto mají pravděpodobně velkou afinitu k epitopu.

Ke stanovení restrikce HLA odezvy P703P se vytváří panel

168 buněk vykazujících antigen (APC), který částečně souhlasí s donorem vytvářejícím T buňky. Pulsují se APC s peptidem a použijí se ve zkouškách proliferace a cytokinů spolu s linií 1-F9. APC souhlasící s donorem při HLA-DRB-0701 a HLA-DQB02 alel jsou schopné vnášet peptid do T buněk, což naznačuje, že specifická odezva P703P je omezena na jednu z těchto alel.

Ke zjištění, zda omezující alela je HLA-DRB0701 nebo HLA-DQB02 se využije zkoušek blokování protilátek. Anti-HLA-DR blokující protilátka L243 nebo irelevantní souhlasící isotyp IgG2a se přidá do T buněk a kultury APC se pulzují s peptidem RMPTVLQCVNVSVVS (SEQ ID NO:638) při 250 ng/ml. Provedou se standardní zkoušky interferon-gama a zkouška proliferace. Zatímco kontrolní protilátka nemá žádný účinek na schopnost T buněk rozeznat s peptidem-pus1ovanou APC, v obou zkouškách protilátka anti-HLA-DR úplně blokuje schopnost Tbuněk specificky rozlišit s peptidem-pulsovanou APC.

Ke zjištění zda peptidový epitop RMPTVLQCVNVSVVS (SEQ ID NO: 638) je přírodní, se zkoumá schopnost linie 1-F9 rozlišit APC pulzovanou s rekorabinantním proteinem P703P. K těmto pokusům se využije řady zdrojů rekombinantních P703P, P703P odvozené z E.coli, P703P odvozené z Pichia a P703P odvozené od baculoviru. Irelevantními použitými proteinovými kontrolami jsou L3E odvozené od E.coli (pro plíce specifický antigen) a mammaglobin odvozený z bačuloviru. Při zkouškách interferon-gama ELISA, je linie 1-F9 schopná účinně rozeznat jak formy E.coli P703P tak rekombinantní z Pichia-odvozené P703P, zatímco P703P odvozený z baculoviru je rozeznán méně účinně. Následné analýzy Western-blot ukazují, že přípravky proteinu E.coli a Píchia P703P jsou intaktní, zatímco přípravky baculoviru P703P jsou Přibližně ze 75 % degradované. Je tudíž peptid RMPTVLQCVNVSVVS (SEQ ID NO: 638) z P703P přírodní peptidový epitop odvozený z P703P a umístěný do Tbuněk v kontextu HLA-DRB-0701.

V další studii se standardními způsoby vytvoří 24 15-merních peptidů překrytých 10 aminokyselinami a odvozených z N-koncového fragmentu P703P (odpovídajícího aminokyselinám 27 až 154 SEQ ID NO: 525) a jejich schopnost rozeznávat buňky CD4 se stanoví v podstatě stějně jako shora popsáno. DC se pulsují přes noc se soubory peptidů, s každým peptidem v konečné koncentraci 10 pg/ml. Velký počet individuálních linií CD4 T buněk (65/480) ukazuje významnou proliferaci a uvolňování cytokinu (IFN-gama) v odezvě na peptidové soubory P703P, avšak nikoli na kontrolní soubor peptidů. Linie CD4 T buněk, které vykazují specifickou aktivitu, se rest imulují na vhodném souboru peptidů P703P a znovu se testují na individuální peptidy každého souboru, stejně jako titrací dávky peptidu souboru peptidů v testu uvolňování IFN-gama a v testu proliferace.

Rozliší se 16 imunogenických peptidů T buňkami z celé dávky testovaných peptidových antigenů. Aminokyselinová sekvence těchto peptidů je v SEQ ID NO: 656 až 671 s odpovídajícími cDNA sekvencemi v SEQ ID NO: 640 aš 655. V některých případech může být peptidová reaktivita linie T buněk mapována na jednotlivý peptid, avšak několik může být mapováno na více než jedenom peptidu v každém souboru. K dalším analýzám se vyberou linie CD4 T buněk, které vykazují reprezentativní obraz rozlišení z každého peptidového souboru s rozumnou afinitou k peptidu (1-1A, -6A; II-4C, -5E; III-6E, IV-4CB, -3F, 9B, -10F, V-5B, -4D a -10F). Tyto linie CD4 T buněk se restimulují na vhodný jednotlivý peptid a znovu se testují na analogové DC pulzované se zkomolenou formou rekombinantního proteinu P7O3P v E.coli (a.a. 96 aš 254 SEQ ID NO:525), P703P plné délky v expresním systému baculoviru a na fúzi mezi virem chřipky NS-1 a P703P v E.coli. Z testovaných linií T buněk rozeznává linie I-1A specificky zkomolenou formu P703P (E.coli) avšak žádnou jinou rekombinantní formu P703P. Tato linie rozeznává také peptid použitý k vyvolání T buněk. Linie 2-4C rozeznává zkomolenou formu P703P (E.coli) a formu P703P plné délky v ba- ,170 τ τ '' ¹ culoviru, stejně jako peptid. Ostatní testované linie T buněk jsou buď pouze specifické pro peptid (II-5E, II-6F, IV-4B, IV-3F, IV-9B, IV-10F, V-5B a V-4D) nebo jsou bez odezvy na jakýkoli testovaný antigen (V-10F). Tyto výsledky dokládají, že peptidová sekvence RPLLANDLMLIKLDE (SEQ ID NO·' 671 odpovídající a.a. 11Ο až 124 SEQ ID NO: 525) rozeznaná linií 1-1A T buněk a peptidové sekvence SVSESDTIRSISIAS (SEQ ID NO: 668, odpovídající a.a. 125 až 139 SEQ ID NO: 525) a ISIASQCPTAGNSCL (SEQ ID NO: 667 odpovídající a,a. 135 až 149 SEQ ID NO: 525) rozeznané linií II-4C T buněk mohou být přírodní epitopy proteinu P703P.

Pčříklad 11

Exprese antigenu odvozeného z nádoru prsu do prostaty

Izolace antigenu B305D z nádoru prsu diferenčním displejem je popsána v americké přihlášce vynálezu číslo 08/700 014 podané 20. srpna 1996. Izoluje se několik rozštěpených forem tohoto antigenu. Určené cDNA sekvence těchto rozštěpených forem jsou v SEQ ID NO: 366 až 375 s předpověděnými aminokyselinovými sekvencemi odpovídajícmi sekvencím SEQ ID N0= 292, 298 a 301 až 303, jež jsou v SEQ ID NO: 299 až 306. V další studii se izoluje rozštěpená varianta cDNA sekvence v SEQ ID NO· 366, která obsahuje přídavný guaninový zbytek v poloze 884 (SEQ ID NO: 530), vedoucí k rámcovému posunu otevřeného čtecího rámce. Určená DNA sekvence tohoto ORF je v SEQ ID NO: 531. Tento rámcový posun generuje proteinovou sekvenci (v SEQ ID NO: 532) 293 aminokyselin, která obsahuje C-koncovou doménu společnou ostatním isoformám B305D, která se však liší v N-koncovém regionu.

Míra exprese B305D v nádorových a v normálních tkáních se zkoumá analýzou real-time PCR a analýzou Nothern. Výsledky naznačují, že B305D je silně expresován v nádoru prsu, v nádoru

-”\71 » »

» 7 t ) > 7

7 prostaty, v normální prostatě a v normálních varlatech, přičemž exprese je nízká nebo nezjistitelkná ve všech ostatních zkoumaných tkáních (v nádoru tlustého střeva, v nádoru plic, v nádoru vajčnřků, v normální kostní dřeni, v ledvinách, v játrech, v tlustém střevu, v plicích, ve vaječníkách, v pokožce, v tenkém střevu a v žaludku). Za použití analýzy realtíme PCR na panel nádoru prostaty se ukažje, že B305D v nádorech prostaty vzrůstá s rostoudcím Gleasonovým stupněm, což dokládá, že exprese B305D zvyšuje postup rakoviny prostaty.

Příklad 12

Generace lidského CTL in vitro za použití techniky iniciace a stimulace pljného genu (Whole Gene Priming and Stimulation) s antigenem P501S specifickým pro prostatu

Za použití in vitro narůstání plného genu (whole-gene priming) P501S kravských neštovic, jimiž je infikováno DC (například Yee a kol., The Journal of Immunology 157(9), str. 4079 až 4086, 1996) se odvodí lidské linie CTL, které specificky rozlišují autologové fibroblasty transdukované P501S (známé též jako LI-12) stanovené analýzou za použití interferonu gama ELISPOT, jak shora popsáno. Pomocí panelu HLA-chybně párovaných linií B-LCL transdukovaných s P501S, se ukazuje, že tyto linie CTL jsou pravděpodobně omezeny na alely HLAB třídy I. Dendritické buňky (DC) se diferencují od monocytových kultur odvozených od PBMC normálních lidských dárců, pěstováním po dobu 5 dní v prostředí RPMI obsahujícím 10 % lidského séra, 50 ng/ml lidské GM-CSF a 30 ng/ml lidské IL-4. Následná kultura, DC se infikuje přes noc rekombinantním P501S virem kravských neštovic pětkrát opakovanou infekci (M.0.I) a dozraje přes noc za přísady 3 iig/ffll 1 igandu CD40. Vir se inaktivuje UV-ozářením. Systémem magnetických perliček se izolují buňky CD8+T a iniciuje se narůstání kultury standardními kultivačními způsoby. Kultury se rest imul ují každých 7 až 10 dní pomocí autologových primárních fibroblastů, retrovirově transdukovaných P501S a CD80. Po čtyřech stimulačních cyklech linie buněk CD8+T se zjišťuje, že specifiky produkují interferon-gama při stimulování P501S a CD80 transdukovanými autologovými fibroblasty. Vytvoří se panel HLA-chybne párovaných linií B-LCL transdukovaných P501S k definování restrikční alely odezvy. Měřením interferonu-gama v testu ELISPOT se ukazuje, že specifická odezva na P501S je pravděpodobně omezena alelami HLA B. Tyto výsledky dokládají, že odezva CD8+CTL na P501S může být vyvolána.

K identifikování rozpoznaného alespoň jednoho epitopu se cDNA, kódující P501S, fragmentuje různými restrikčními digesty a subklonuje se na retrovirový expresní vektor pBIB-KS. Retrovirové supernatanty se vytvoří transfekcí linie ihelper packaging Phoenix-Ampho”. Supernatantů se použije k transdukci buněk Jurkat/A2Kb pro skríning CTL. CTL se skrínuje v testech IFN-gama ELISPOT proti těmto cílům A2Kb transdukovaným ‘knihovnou fragmentů P501S. Výchozí positivní fragmenty P501S/H3 a P501Š/F2 se sekvencují a zjišťuje se, že kódují aminokyseliny 106 až 553 a aminokyseliny 136 až 547 SEQ ID NO: 113. Zkomolení H3 se provede zakódováním zbytků aminokyselin 106 až 351 SEQ ID NO^: 113, která není schopna stimulovat CTL, tedy lokalizovat epitop ke zbytkům aminokyselin 351 až 547. Zkonstruují se také přídavné fragmenty kódující aminokyseliny 1 až 472 (fragment A) a aminokyseliny 1 až 351 (fragment B). Fragment A, avšak nikoli fragment B stimuluje CTL, čímž lokalizuje epitop ke zbytkům aminokyselin 351 až 472. Překrytí 20-merních a 18-merních peptidů, reprezentujících tento region, se testují pulzováním buněk Jurkat/A2Kb proti CTL testu IFN-gama. Pouze peptidy P501S-369(20) a P501S-369Í18) stimulují CTL. Syntetizují se a podobně se testují 9-merni a 10-merní peptidy reprezentující tento region. Peptid P501S-370 (SEQ ID N0=539) je minimálním 9-merem dávajícím silnou odezvu. Peptid P501S-376 (SEQ ID NO: 540) dává také slabou odezvu, což naznačuje, že

173 ->

může reprezentovat křížově-reaktivní epitop,

V následných studiích se zkoumá schopnost primárních lidských buněk B převedených P501S iniciovat 1ÍHC třídu I-omezenou, P5Q1S-specifickou, autologovou CD8 T buněk. Primární B-buňky se odvodí od PBMC homozygového donoru HLA-A2 kultivací v ligandu CD-40 a IL-4, transdukovaném při vysoké frekvenci rekombínantním P501S na vektor pBIB a vybráným blastocídinem-S. K narůstání in vitro se kultivují CD8+T buňky s autologovým CD40 1igandem + IL-4 odvozenými, P501S-transdukovanými buňkami B v 96-důlkovém formátu mikrokultur. Tyto CTL mikrokultury se restimulují P501S transdukovanými B-buňkami a pak se zkoumají na spécifičmost. Po tomto úvodním skríningu se mikrokultury s významným signálem nad po-adím klonují na autologové EBV-transformované B-buňky (BLCL), také transdukované P501S. Za použití IFN-gama ELISPOTu k detekci se zjišťzuje, že několik těchto klonů CD8 T buněk je specifických pro P5Q1S, jak je doloženo reaktivitou na BLCL/P501S avšak nikoli BLCL transdukovaných s kontrolním antigenem. Je také doloženo, že specifičnost anti-P501S CD8 T buněk je HLA-A2-omezena. Předně ukazují proti látkové blokovaní pokusy s monoklonální protilátkou anti-HLA-A,B,C (W6.32), s monoklonální protilátkou anti-HLA-B, C (Bl.23.2) a s kontrolní monoklonální protilátkou, že pouze protilátka anti-HLA-A,B,C blokuje rozlišení P501S expresu jící autologovou BLCL. Za druhé anti-P501S CTL také rozlišuje HLA-A2 hodnocenou, heterologovou BLCL transdukovanou P501S, avšak nikoli odpovídající EGFP transdukovanou kontrolní BLCL.

Přírodní CD8 třídy I-restrikční peptidový epitop P5O1S se identifikuje následujícím způsobem: Dendritické buňky (DC) se izolují gradientem Percol, následovaným rozdílným přilnutím a kultivují se pět dní v přítomnosti prostředí RPMI obsahujícím 1 % lidského séra, 50 ng/ml GM-CSF a 30 ng/ml IL-4. Po kultivaci se DC infikují 24 hodin adenovirem expresujícím P501S při

- >175 jí 411 až 486 aminokyselin P501S (SEQ ID NO: 113) je rozlišitelný oběma specipickými klony P501S. K identifikování specifického 18-20-merního peptidu, rozeznaného klony, se individuálně testuje každý z 18-20 měrních peptidu, které tvoří pozitivní soubor v testu gama-Elispot schopnosti stimulovat oba klony specifické pro P501S CTL, 4E5 a 4E7. Oba, jak 4E5 tak 4E7, specificky rozeznají jeden 20 měrní peptid (SEQ ID NO: 710, cDNA sekvenci v SEQ ID NO'· 711), které zahrnují aminokyseliny 453 až 472 P5O1S. Jelikož minimální epitop rozeznaný CD8+T-buňkami je téměř vždy buď 9-merní nebo 10-merní peptidová sekvence, syntetizují se 10-merní peptidy, které zahrnují celou sekvenci SEQ ID NO: 710, které se liší jednou aminokyselinou. Každý z těchto 10-raerních peptidu se testuje z hlediska schopnosti stimulovat dva P501S-specifické klony (s výhodou 1D5 a 1E12). Jeden 10-merní peptid (SEQ ID NO: 712, cDNA sekvence v SEQ ID NO: 713) se identifikuje jako specificky stimulující P501S-spécifické klony. Tento epitop zahrnuje aminokyseliny 463 až 472 P501S. Tato sekvence definuje minimálně 10-merní epitop z P501S, který může být přírodní a ke kterému mohou být identifikovány CTL odezvy v normální PBMC. Tento epitop je tedy kandidátem pro použití jako vakcinový podíl a terapeutické a/nebo diagnostické reakční činidlo pro rakovinu prostaty.

K identifikování třídy I restrikčního elementu pro P501S odvozenou sekvenci sekvence SEQ ID NO·· 712, se provede blokování a analýzy chybného párování. Ve zkouškách gama-IFN El i spot je specifická odezva klonů 4A7 a 4E5 na P501S-transdukované autologové fibroblasty blokována preinkubací s 25 ug/ml W6/32 (pan-Class I blokující protilátka) a Bl.23.2 (HLA-B/C blokující protilátka). Tyto výsledky dokládají, že specifická odezva SEQ ID NO=712 je omezena na HLA-B nebo HLA-C allely.

Pro analýzu HLA chybného párování se autologové B-LCL (HLA-A1, A2, B8, B51, Cwl, Cw7) a heteerologové B-LCL (HLA

-176 A2, A3, B18, B51 , Cw5, Cwl4), které zahrnují HLAB51 alely, pulsují jednu hodinu s 20 ug/ml peptidu SEQ ID NO: 712, promyjí se a testují se zkouškou gama-IFN Elispot na schopnost stimulovat klony 4A7 a 4E5. Provedou se také zkoušky blokování protilátkami s Bl.23.2 (HLA-B/C blokující protilátka). Specifická odezva SEQ ID N0:712 se zjišťuje pomocí jak autologových (D326), tak heterologových (D107)B-LCL a kromě toho jsou odezvy blokovány preinkubací s 25 ug/ml Bl.23.2 HLA-B/C blokovací protilátky. Souhrnně tyto výsledky ukazují, že P501S specifická odezva na peptid SEQ ID NO: 712 je omezena na HLA-B51 alely třídy I. Molekulové klonování a analýza sekvence HLA-B51 alely z D3326 odhalují, še HLA-B51 subtypem F326 je HLA-B51011.

Na základě 10-raerního P501S-odvozeného epitopu SEQ ID NO: 712, se syntetizují a testují dva 9-mery se sekvencemi SEQ ID NO: 714 a 715 ve zkouškách El ispot na schopnost stimulovat dva P501S-specifické klony CTL, odvozené z linie 12A2. 10-merní peptid SEQ ID NO: 712, stejně jako 9-merní peptid SEQ ID NO: 715, avšak nikoli 9-merní peptid SEQ ID NO: 714 jsou schopné stimulovat P5OiS-specifické CTL k produkci IFN-gama. Tyto výsledky dokládají, še peptid SEQ ID NO'- 715 je 9-merní P501S-odvozený epitop rozlišený P501S-specifickou CTL. Sekvence DNA kódující epitop SEQ ID NO: 715 je v SEQ ID NO-· 716.

K identifikaci alely omezující třídu I pro P501S-odvozený peptid specifické odezvy SEQ ID NO: 712 a 715, se klonují alely HLA B a C z donoru použitého v pokusu in vitro narůstání. Sekvenční analýza indikuje, še relevantní alely jsou HLA-B8, HLA-B51, HLA-CwOl a HLA-CwO7. Každá z těchto alel se subklonuje na expresní vektor a kotransfektuje se spolu s genem P501S na buňky VA-13. Transfektované buňky VA-13 se pak testují z hlediska své schopnosti specificky stimulovat P501S-specifické CTL v analýze ELISPOT.Buňky VA-13 transfektované s P501S a HLA-B51 jsou shopné stimulovat P501S-specifické CTL k sek4 77 retování gama-IFN. Buňky VA-13 transfektované s HLA-B51 samotným nebo P501S + jiné HLA-alely nejsou schopny stimulovat CTL specifické pro P501S. Tyto výsledky dokládají, že restrikcní alelou pro P501S-specifickou odezvu je allela HLAB51. Sekvenční analýza ukazuje, že subtyp relevantní restrikční alely je HLA-B51011.

Ke zjištění, zda P501S-specifická CTL může rozeznat buňky nádoru prostaty, které expresuji P501S, se retrovirově převedou P501S-požitivní linie LnCAP a CRL2422 (obě expresující střední množství P501S mRNA a protein) a PC-3 (expresující malá množství P501S mRNA a protein) plus PSOlS-negativní buněčná linie DU-145 spolu s HLA-B51011 alelou, která byla klonovaná z donoru použitého k vytvoření P501S-spécifické CTL. HLA-B51011 nebo EGFP-transdukované a vybrané nádorové buňky se zpracují gama-interferonem a androgenem (k přeregulování stimulačních funkcí P501S) a použije se jich ve zkoušce gama-interferon Elispot se P501S-specifickýmí CTL klony 4E5 a 4E7. Nezpracovaných buněk se použije jako kontroly.

Obě, jak 4E5, tak 4E7, účinně a specificky rozlišují buňky LnCAP a CRL2422, které byly transdukovány s alelou HLA-B51011, avšak nikoli stejné buněčné linie transdukované EGFP. Přídavně oba CTL klony specificky rozlišují PC-3-buňky transdukované HLA-B51011, nikoli však P5O1S-negativní linii nádorových buněk DU-145. Zpracování gama-interferonem nebo androgenem nezlepšuje schopnost CTL rozlišovat nádorové buňky. Tyto výsledky dokládají, že P501S-spécifická CTL, vytvořená in vitro mařůstáním plného genu specificky a účinně rozlišuje nádorové linie buněk prostaty, treré expresují P501S.

Přírodní CD4 epitop P501S se identifikuje následujícím způsobem:

Shora popsaným způsobem se připraví buňky CD4, specifické

- 4 78 pro P5O1S, Připraví se řada 16 překrývajících peptidů, které žabírají přiblišně 50 % amino koncové části genu P501S (aminokyseliny 1-325 SEQ ID NO:113). Pro narůstání se peptidy kombinují do souborů po pěti peptidech, pulsují se 4 yg/ml do dendritických buněk (DC) po dobu 24 hodin TNF-alfa. DC se pak promyji a smísí se s negativně vybranými CD4+T-buňkámi v 96-důlkových destičkách se dnem tvaru U. Kultury se rest imul ují týdně čerstvým CD nabitým peptidovými soubory. Po celkem čtyřech stimulačních cyklech se buňky ponechají další týden a testují se na specifičnost vůči APC pulsovaným se soubory peptidů za použití zkoušek gama-IFN ELISA a proliferace. K těmto zkouškám se použijí ulpělé monocyty naplněné bud' relevantním souborem peptidů při 4 ug/ml nebo irelevantním peptidem při pg/ml jako APC. Linie T buněk, které vykazují buď specifickou sekreci cytokinů nebo proliferaci se pak testují na rozeznání individuálních peptidů obsazených v souboru. T buňky se mohou identifikovat ze souborů A a B, které rozeznaly jednotlivé peptidy z těchto souborů.

Ze souboru A rozeznávají specificky linie AD9 a AE 1O peptid 1 (SEQ ID NO : 719) a linie AF5 rozeznává peptid 39 (SEQ ID NO: 718). Ze souboru B se zjišťuje, še linie BC6 rozezná peptid 58 (SEQ ID NO: 717). Všechny tyto linie byly stimulovány na specifický peptid a testovány na specifické rozeznání peptidů titrační zkouškou i buněčnými lysáty generovanými infekcí buňkami HEK293 s adenovirem expresujícím buď P501S nebo irelevantní antigen. K těmto zkouškám se pulsují APC-ulpívající monocyty individuálně s 10, 1 nebo 0,1 ag/ml jednotlivých

P501S peptidů a DC se pulzují přes noc ve zředění 1:5 buněčných lyzátů infikovaných adenoviry. Linie AD9, AE10 a AF5 si podršují významnou rozlišitelnost relevantních z P501S odvozených peptidů i při 0,1 mg/ml. Kromě toho linie AD9 vykazuje významnou (8,1 stimulační index) specifickou aktivitu pro lyzáty z adenovirem P501S infikovaných buněk. Tyto výsledky ukazují, še vysoká afinita T-buněčných linií CD4 může být vytvo- ,)79 řena vůči epitopúm odvozeným z P501S, a že alespoň subsoubor těchto T buněk specifických pro sekvenci SEQ ID NO: 719 odvozenou od P501S je specifický pro epitop, který je přirozený v lidských buňkách. Sekvence DNA kódující aminokyselinové sekvence SEQ ID N0= 717 _až 719 jsou v SEQ ID NO: 720 až 722.

K další charakterizaci P501S-specifické aktivity AD9 se linie klonuje pomocí anti-CD3. Tři klony, označené 1A1, 1A9 a 1F5, se identifikují jako specifické pro peptid P501S-1 (SEQ ID NO: 719). Ke stanovené HLA restrikční alele pro P501S-specifickou odezvu se každý z těchto klonmů testuje zkouškami proti látkového blokování třídy II a HLA chybného párování pomocí testu proliferace a gama-interferonu. Při zkouškách proti látkového blokování a měření produkce gama-interferonu za pomoci testů ELISA je schopnost všech tří klonu rozeznávat peptidem pulsované APC specificky blokována koinkubací s buď pan-třídu II blokující protilátkou nebo HLA-DR blokující protilátkou, avšak nikoli s HLA-DQ nebo irelevantní protilátkou. Proliferační zkoušky, provedené současně se stejnými buňkami, tyto výsledky potvrzují. Tyto údaje dokládají, že P5GlS-specifická odezva klonů je omezena HLA-DR alelou. Další studie ukazují, že omezující alllela pro P501S-spécifické odezvy je HLA-DRB1501.

Příklad 13

Identifikace antigenů specifických pro prostatu analýzou microřady

Tento příklad popisuje isolaci některých polypeptidů specifických pro prostatu z knihovny cDNA nádoru prostaty

Shora popsaná expresní knihovna cDNA nádoru prostaty se skrínuje pomocí analýzy microřady k identifikování klonů, které vykazují alespoň trojnásobnou nadměrou expresi tkáně nádoru

180 „ «v. 3^»>- V* prostaty a/nebo normální tkáně prostaty, ve srovnání s neprostátovými normálními tkáněmi (nezahrnujícími varlata). Identifikuje se 372 klonů a 319, z nich se s úspěchem sekvencuje. Tabulka I obsahuje souhrn těchto klonů, které jsou v SEQ ID NO: 385 aš 400. Z těchto sekvencí odpovídají SEQ ID NO: 386, 389, 390 a 392 novým genům a SEQ ID NO: 393 a 396 odpovídají prve identifikovaným sekvencím. Ostatní (SEQ ID NO: 385, 387, 388, 391, 394, 395 a 397 aš 400) odpovídají známým sekvencím, jak je to patro z tabulky I.

Tabulka I

Souhrn antigenů nádoru prostaty

Známé geny	Dříve identifiko- Nové geny
	váné geny
gama-řetězec	P504S	23379(SEQ ID NO:389)
T buněk	-
Kal 1ikrein	P1000C	23399(SEQ ID NO:392)

Vektor	P501S	23320(SEQ ID	NO- 386)
CGI-S2 protein mRNA	P503S	23381(SEQ ID	NO:390)
(23319,SEQ ID NO:385)
PSA	P510S
Aid.6 Dehyd.	P784P

L-iditol-2-dehydro- P502S genázeí23376,SEQ ID NO:388)

181

Ets transkripční faktor PDEF (22672,SEQ ID NO:398)	P706P
hTGR (22678,SEQ ID NO:399)	19142.2 bangur.seg 22621,SEQ ID NO:396)
KIAA0295 (22685, SEQ ID NO:400)	55661 Wang (23404 SEQ ID NO:393)
Fosfatáza kyseliny prostatické (22655 SEQ ID NO:397)	P712P
transglutamináza (22611, SEQ ID NO:395)	P778P
HDLBP (23508,SEQ ID NO^:394)
CGI-69 protein (23367, SEQ ID NO:387)
KIAA0122 (23383, SEQ ID NO:391)
TEEG

CGI-82 vykazuje 4,06-násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi, Je nadměrně expresován ve 43 % nádorů prostaty, 25 % normální prostaty a nezjištěn v ostatních normálních testovaných tkáních. Dehydrogenáza L-iditol-2 vykazuje 4, 94-násobnou nadměrnou expresi v prostátových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je nadměrně expresován v 90 % nádorů prostaty, 100 % normální prostaty a nezjištěn

- 182 i ) v ostatních normálních testovaných tkáních. Transkripění faktor Ets PDEF vykazuje 5,55-násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je nadměrně expresován ve 47 % nádorů prostaty, 25 % normální prostaty a nezjištěn v ostatních normálních testovaných tkáních. hTGRI vykazuje 9,11 -násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je nadměrně expresován v 63 % nádorů prostaty a nezjištěn v ostatních normálních testovaných tkáních, včetně normální prostaty. KIAA0295 vykazuje 5,59-násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je nadměrně expresován ve 47 % nádorů prostaty, nízký až nezjištěn v ostatních normálních testovaných tkáních, včetně normální prostaty. Fosfatáza kyseliny prostatické vykazuje 9,14-násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je nadměrně expresována v 67 % nádorů prostaty, 50 % normální prostaty a nezjištěna v ostatních normálních testovaných tkáních. Transglutamináza vykazuje 14,84-násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je nadměrně expresována ve 30 % nádorů prostaty, 50 % normální prostaty a nezjištěna v ostatních normálních testovaných tkáních. Vazbový protein lipoprotein vysoké hustoty (HDLBP) vykazuje 28,06-násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je nadměrně expresován v 97 % nádorů prostaty, 75 % normální prostaty a nezjištěna v ostatních normálních testovaných tkáních. CGI-69 výkazu je '3, 56- násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je nízkobohatý gen, zjišťovaný ve více než 90 % nádorů prostaty a v 75 % normální prostaty. Exprese tohoto genu v normálních tkáních je velmi nízká. KIAA0122 vykazuje 4,24-násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je nadměrně expresován v 57 % nádorů

183 prostaty, a nezjištěn v ostatních normálních testovaných tkáních včetně tkání normální prostaty. Bangur 19142.2 vykazuje 23,25-násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je nadměrně expresován v 97 % nádoru prostaty, a 100 % normální prostaty. Je nezjistitelný v ostatních testovaných normálních tkáních. Wang 5566.1 vykazuje 3,31-násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je nadměrně expresován v 97 % nádorů prostaty, a 75 % normální prostaty a je také nadměrně expresován v normální kostní dřeni, ve slinivce a v aktivovaném PBMC. Nový klon 23379 (označovaný také jako P553S) vykazuje 4,86-násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je zjistitelný v 97 % nádorů prostaty a 75 % normální prostaty a je nezjistitelný v ostatních testovaných normálních tkáních. Nový klon 23399 vykazuje 4,09-násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je nadměrně expresován ve 27 % nádorů prostaty a je nezjistitelný ve všech ostatních testovaných normálních tkáních včetně normální prostaty. Nový klon 23320 vykazuje 3, 15-násobnou nadměrnou expresi v prostatových tkáních ve srovnání s ostatními normálními testovanými tkáněmi. Je zjistitelný ve všech nádorech prostaty a v 50 % tkání normální prostaty. Je také expresován v normálním tlustém střevu a trachee. Ostatní normální tkáně tento gen neexpresují ve vysokém množství.

Následné klonovací studie P553S plné délky za použití standardních způsobů ukazují, že je tento klon neúplně rozštěpenou formou P501S. Stanovené sekvence cDNA pro čtyři rozštěpené varianty P553S jsou v SEQ ID NO:623 až 626. Aminokyselinová sekvence, kódující v SEQ ID N0:626 je v SEQ ID N0:627. Sekvence cDNA SEQ ID NO:623 obsahuje dva otevřené čtecí rámce (ORF). Aminokyselinové sekvence, kódované těmito dvěma ORF, jsou v SEQ ID NO: 628 a 629.

184 > } t

» ) ) » ) 5

I ) ? >

» ) ) ) ) ) i ) ) > Ϊ > ·1 5

Příklad 14

Identifikace antigenů specifických pro prostatu elektronickou subtrakcí

Tento příklad popisuje použití techniky elektronické subtrakce k identififikaci antigenů specifických pro prostatu.

Potenciální geny, specifické pro prostatu, v genové bance lidské EST databáze se identifikují elektronickou subtrakcí (podobnou jakou popsal Vasmatizis a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95, str. 300 až 304, 1998). Sekvence EST klonů (43,482), odvozených z různých prostatových knihoven, se získají z veřejné lidské EST databáze genové banky. Každé prostatové EST sekvence se použije jako dotazníkové sekvence v BLASTN (National Center for Biotechnology Information) průzkumu lidské EST databáze. Všechny souhlasy, považované za identické (délka souhlasné sekvence >100 párů bází, hustota identických souhlasů nad touto oblastí >70%) se společně zařadí do skupin. Skupiny obsahující více než 200 EST se vyloučí, jelikož pravděpodobně představují opakující se elementy nebo výše expresované geny, jako jsou ribosomové proteiny. Pokud dvě nebo více skupin zahrnují společmé EST, sdruží se do superskupin“ s výsledkem 4 345 prostatových superskupin.

Záznamy pro 479 lidských knihoven cDNA, reprezentovaných ve vydání genové banky, byly složeny k vytvoření databáze těchto záznamů knihovny cDNA. Těchto 479 knihoven cDNA se rozdělilo do tří skupin: Plus (knihovny normální prostaty a nádorů prostaty, knihovny linií buněk prsu, ve kterých je exprese žádoucí), Minus (knihovny 2 ostatních dospělých tkání, ve kterých není exprese žádoucí) a Ostatní (knihovny ze zárodečných tkání, dětských tkání, tkání vyskytujících se pouze u žen, tkání neprostatových nádorů, a buněčných linií jiných než jsou prostatové buněčné liniue, ve kterých se považuje exprese za

185 ) > >

> » ·> ) ) >

·> 1 irelevantní). Souhrn těchto skupin obsahuje tabulka II.

Tabulka II

Knihovny prostatových cDNA a EST

Knihovna	S knihoven	tt EST
Plus	25	43, 482
Normál	11	18,875
Nádor	11	21,769
Buněčné linie	3	2, 838
M i nus	166
Ostatn í	287

Každá superskupina se analýzuje na EST uvnitř superskupiny. Zaznamená se tkáň každého klonu EST a použije se k zařazení superskupiny do 4 skupin: Klony EST typu 1 nacházející se pouze v knihovnách Plus; žádná exprese nebyly zjištěná v Minus nebo v ostatních skupinách knihoven; klony EST typu 2 odvozené pouze od Plus a Jiné skupiny knihoven; žádná exprese nebyla zjištěná v Minus skupině; klony EST typu 3 odvozené od Plus, Mínus nebo Ostatních knihoven, avšak počet EST odvozených od Plus je vyšší než ve skupině Minus nebo Ostatní a klony EST typu 4 odvozené od knihoven Plus, Minus a Ostatní, avšak počet odvozený v Plus skupiny je vyšší než počet odvozený z Minus skupiny. Tato analýza identifikuje 4345 prsních skupin (tabulka III). Z těchto skupin se objednají klony EST 3172 z Reseach Genetics, lne. a získají se ve zmrazených glycerolových sloho-186 -

váných	96-dú1kových	destičkách.
Tabulka	III
Souhrn	prostatových	skup i n
Typ #	superskup i n	tt seřazených EST
1	688	677
2	2899	2484
3	85	11
4	673	0
Ce1kem	4345	3172

Inserty klonů EST se zesílí PCR pomocí amino-vážených PCR primerů pro analýzu Synteni mikrořady. Získá-li se více než jeden produkt PCR pro příslušný klon, nepoužije se toho produktu PCR pro expresní analýzu. Celkem se analýzuje 2528 klonů z elektronické subtrakční metody microřad analýzou k identifikování elektronických subtrakčních klonů prsu, které měly vysoké úrovně nádorových versus normálních tkáňových mRNA. Takové skrínování se provede pomocí Synteni mikrořady (Palo AI to, CA) podle výrobcových instrukcí (a v podstatě jak popsali Schena a kol., Proč. Nat. Acad. Sci.

10619, 1996; a Heller a kol., Proč.

str. 2150 až 2155, 1997). Při těchto analýzách se klony nanesou na čip, který se pak porovná s fluorescenčními sondami generovanými z normální prostatové a z nádorové prostatové cDNA a z různých ostatních normálních tkání. Snímky se skanují a změří se intenzita fluorescence.

USA 93, str. 10614 až Nat. Acad. Sci.USA 94,

Klony s expresním poměrem vyšším než 3 (což znamená, že obsah mRNA v nádoru prostaty a v normální prostatě je alespoň

- 187

1

- · ’ ) · ) > Ί ϊ * )

trojnásobný	ve srovnání s	obsahem mRNA v ostatních	normálních
tkáních) se	i dent i f ikuj í	jako sekvence specifické	pro nádory
prostaty (tabulka IV). Sekvence těchto klonů jsou v	SEQ ID NO:
401 až 453 s	í určitými novými sekvencemi v SEQ ID NO:	407,
413, 416 aš	419, 422, 426,	427 a 450.
Tabulka IV
Klony specifické pro nádor	prostaty
SEQ ID NO:	Označení	Poznámky
	sekvence
401	22545	dř í ve i den t i f i kovaný	P100C
402	22547	dříve identifikovaný	P704P
403	22548	známý
404	22550	známý
405	22551	PSA
406	22552	sekreční protein prostaty 94
407	22553	nový
408	22558	dříve identifikovaný	P509S
409	22562	glandulový kallikrein
410	22565	dříve identifikovaný	P1000C
411	22567	PAP
412	22568	B1006C (antigen nádoru prsu)
413	22570	nový
414	22571	PSA
415	22572	dříve identifikovaný	P706P
416	22573	nový
417	22574	nový
418	22575	nový -
419	22580	nový
420	22581	PAP
421	22582	sekreční protein prostaty 94
422	22583	nový

188 ) ) 1 )

423	22584	sekreční protein prostaty 94
424	22585	sekreční protein prostaty 94
425	22586	známý
426	22587	nový
427	22588	nový
428	22589	PAP
429	22590	známý
430	22591	PSA
431	22592	známý
432	22593	dříve identifikovaný P777P
433	22594	gama-řetězec receptoru T buněk
434	22595	dříve identifikovaný P705P
435	22596	dříve identifikovaný P707P
436	22847	PAP
437	22848	známý
438	22849	sekreční protein prostaty 57
439	22851	PAP
440	22852	PAP
441	22853	PAP
442	22854	dříve identifikovaný P509S
443	22855	dříve identifikovaný P705P
444	22856	dříve identifikovaný P774P
445	22857	PSA
446	23601	dříve identifikovaný P777P
447	23602	PSA
448	23605	PSA
449	23606	PSA
450	23612	nový
451	23614	PSA
452	23618	dříve identifikovaný PlOOOC
453	23622	dříve identifikovaný P705P

Další studie klonu SEQ ID N0:407 (nazvaného také PÍ 0200 , vede k izolaci rozšířené sekvence cDNA v SEQ ID NO: 591. Tato

- 189 rozšířená sekvence cDNA obsahuje podle zjištění otevřený čtecí rámec, který kóduje předvídanou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID N0-'592. Zjišťuje se, že P1020C a cDNA aminokyselinová sekvence vykazují určitou podobnost s lidským endogenním retrovirovým pol genem HERV-K a proteinem.

Příklad 15

Další identifikace antigenů specifických pro prostatu analýzou m i krořady

Tento příklad popisuje izolaci přídavných polypeptidů specifických pro prostatu z knihovny cDNA nádoru prostaty

Shora popsaná expresní knihovna cDNA lidského nádoru prostaty se skrínuje za použití analýzy mikrořad k identifikování klonů vykazujících alespoň trojnásobnou nadměrnou expresi ve tkáních nádoru prostaty a/nebo normální prostaty ve srovnání s normálními neprostatovými tkáněmi (nezahrnujícími varlata). Identifikuje a sekvencuje se 142 klonů. Některé z těchto klonů jsou v SEQ ID NO^:454 až 467. Z těchto sekvencí představují SEQ ID NO: 459 až 460 nové geny. Ostatní (SEQ ID NO: 454 až 458 a 461 až 467) odpovídají známým sekvencím. Porovnání zjištěné sekvence SEQ ID NO: 461 se sekvencemi databází genové banky za použití programu BLAST ukazuje homologii s dříve identifikovanou transmembránovou proteázou šeřinu 2 (TMPRSS2). Sekvence cDNA plné délky pro tento klon je v SEQ ID NO: 751, s odpovídající aminokyselinovou sekvencí v SEQ ID NO: 752. Sekvence cDNA, kódující prvních 209 aminokyselin TMPRSS2, je v SEQ ID NO: 753, přičemž prvních 209 aminokyselin je v SEQ ID N0^; 754.

Zjišťuje se, že SEQ ID NO:462 (uváděná jako P835P) odpovídá dříve identifikovanému klonu FLJI3518 (objednací číslo AK023643: SEQ ID NO'· 774), který neměl související otevřený čtecí rámec (ORF). Tohoto klonu je použito k průzkumu databáze

- 190

Geneseq DNA a ke sledování klonu dříve identifikovaného jako G proteinem spojený receptorový protein (DNA Geneseq objednací číslo A09351; aminokyselina Geneseq objednací číslo Y92365) která je charakterizována sedmi transmembránovými doménami. Sekvence fragmentů mezi těmito doménami jsou v SEQ ID NO: 778 až 785 v SEQ ID NO: 778, 780, 782 a 784 představujících extracelulární domény a SEQ ID NO: 779, 781, 783 a 785 představujících intracelulární domény. SEQ ID NO: 778 až 785 představují aminokyseliny 1 až 28, 53 až 61, 83 áž 103, 124 až 143, 165 až 201, 226 až 238, 263 až 272 a 297 až 381 P835P. cDNA sekvence plné délky pro P835P je v SEQ ID NO: 773. cDNA sekvence otevřeného čtecího rámce pro P835P, včetně koncového kodonu, je v SEQ ID NO: 775, s otevřeným čtecím rámcem bez koncového kodonu v SEQ ID NO: 776 a odpovídající aminokyselinová sekvence je v SEQ ID NO: 777.

Příklad 16

Další charakterizace antigenu P710P specifického pro prostatu

Tento příklad popisuje klonování P710P plné délky. Shora popsaná prostatová knihovna cDNA se skrínuje se shora popsaným fragmentem P710P. Na destičky LB/ampici11in se nanese milion kolonií. K. vyzvednutí těchto kolonií se použije nylonových membránových filtrů a cDNA, vyjmuté těmito filtry, se denaturují a zesítí k filtrům UV-světlem. Radioaktivně se značí P710P fragment a používá se k hybridizaci s filtry. Vyberou se pozitivní klony cDNA a jejich cDNA se získají a sekvencují za použití automatického sekvenceru Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Sequencer. Získají se 4 sekvence a předvedou se do SEQ ID NO: 468 až 471. Zdá se, že tyto sekvence reprezentují různé varianty rozštěpených genů P710P. Následné porovnání CDNA sekvencí P710P se sekvencemi v genové bance vykazují homologii ke genu DD3 (objednací číslo genové banky AF103907 & AF103908). Sekvence cDNA DD3 je v SEQ ID NO: 618.

- 191 Příklad 17

Proteinová exprese antigenu specifických pro prostatu

Tento příklad popisuje expresi a čištění pro prostatu specifických antigenu v E.coli, v baculoviru v savčích a v kvasnicových buňkách

a) Exprese P501S v E.coli

Exprese v plné délce z P501S se zkouší prvním klonováním P501S bez vůdčí sekvence (aminokyselin 36 až 553 v SEQ ID NO: 113) ve směru prvních 30 aminokyselin M.tuberculosis antigenu Ral2 (SEQ ID NO: 484) v pET17b. K provedení PCR se použije zvláště P501S DNA za použití perimerů AW025 (SEQ ID NO:485) a AW003 (SEQ ID N0:486). AW025 je směrově klonující primer obsahující místo HindlII. AW003 je protisměrově klonující primer, který obsahuje místo EcoRI. Zesílení DNA se provede pomocí 5 yl pufru lOXPfu, 1 nl 20 mM dNTP, 1 μΐ obou primerů PCR při koncentraci 10 juM, 40 μΐ vody, 1 jul polymerázy Pfu DNA (Stratagene, La Jolla.CA) a 1 pl DNA při 100 ng/pl. Denaturace o

při teplotě 95 C se provádí po dobu 30 sekund, následně 10 o a cykly teploty 95 C po dobu 30 sekund, 60 C po dobu 1 minuty a 72 C po dobu 3 minuty, 20 cykly při 95 C po dobu 30 seO O kundm, 65 C po dobu 1 minuty a 72 C po dobu 3 minut a nakoo nec 1 cyklem při 72 C po dobu 10 minut. Produkt PCR se klonuje na Ral2m/pET17b za použití HindlII a EcoRI. Sekvence výsledného fúzního konstruktu (nazvaného Ral2-P501S-F) se potvrdí sekvencováním DNA.

Fuzní konstrukt se transformuje do BL21(DE3)pLysE, pLysS a Codon Plus E.coli (Stratagene) a nechají se růst přes noc v živném LB s kanamycinem. Výsledná kultura se indukuje iPTG, Protein se přesune na membránu PVDF a blokuje se 5% odtučněným mlékem (v pufru PBS-Tveen), promyje se třikrát a inkubuje se

- 192 myší protilátkou anti-His tag (Clontech) 1 hodinu. Membrána se promyje třikrát a působí se HRP-proteinem A (Zymed) 30 minut. Nakonec se membrána promyje 3x a vyvolá se ECL (Amersham), Způsobem Western blot se nezjistí žádná exprese. Podobně se nezjistí žádná exprese způsobem Western blot, použije-li se k expresi fúze Ral2-P501S-F v BL21 CodonPlus CE6 f ágem (Invitrogen).

N-Koncový fragment P501S (aminokyseliny 36 až 325 SEQ ID NO·^- 113) se klonuje ve směru prvních 30 aminokyselin M. tuberculosis antigenu Ral2 v pET17b, jak následuje. K provádění PCR se použije P501S DNA s použitím primerů AW025 (SEQ ID NO: 485) a AW027 (SEQ ID NO=487). AW027 je protisměrně klonující přiměř, který obsahuje EcoRI místo a koncový kodon. Zesílení DNA se provede v podstatě stejně, jako shora uvedeno. Výsledný produkt PCR se klonuje na Ral2 v pET17b v místě HindlII a EcoRI. Fuzní konstrukt (nazvaný Ral2-P501S-N) je potvrzen sekvencováním DNA.

Fuzního konstruktu Ral2-P501S-N se použije k expresi v BL21 (DE3)pLysE, pLysS a CodonPlus, v podstatě jako uvedeno. Při použití analýzy Western blot se pozorují proteinové pruhy při očekávané molekulové hmotnosti 36 kDa. Je patrno také několik pruhů vysoké molekulové hmotnosti, pravděpodobně v důsledku agregace rekombinantního proteinu. Exprese se nezjistila způsobem Western blot, je-li použito Ral2-P501S-F k expresi v BL21CodonPlus CE6 fage.

Fúzní konstrukt obsahující C-koncovou část P501S (aminokyseliny 257 až 553 SEQ ID NO:113), která je ve směru prvních 30 aminokyselin M. tuberculosis antigenu Ral2 (SEQ ID N0= 484) se připraví následujícím způsobem·' Použije se P501S DNA k provedení PCR s použitím primerů AW026 (SEQ ID NO: 488) a AW003 (SEQ ID NO: 486). AW026 je směrově klonující primer obsahující HindlII místo. Zesílení DNA se provede v podstatě shora uvede- 193 ným způsobem. Výsledný produkt PCR se klonuje do Ral2 v pET17b v místě HindiII a EcoRI. Sekvence fuzního konstruktu (nazvaného Ral2-P501S-C) je potvrzena.

Fusního konstruktu Ral2-P501S-C se použije k expresi v BL21(DE3)pLysE, pLysS a CodonPlus, v podstatě jako shora popsáno. Analýzou Western blot se zjišťuje malé množství proteinu s několika agregáty molekulové hmotnosti. Exprese se také zjišťuje způsobem Western blot, je-li použito fúze Ral2-P501S-C k expresi v BL21CodonPlus indukovaného CE6 fagem.

Fúzní konstrukt obsahující fragment P501S (aminokyseliny 36 aš 298 SEQ ID NO:113) umístěný ve směru li. tuberculosis antigenu Ral2 (SEQ ID NO=7O5) se připraví následujícím způsobem: P501S DNA se použije k provedení PCR s použitím primerů AWO42 (SEQ ID NO: 706) a AW053 (SEQ ID NO: 707). AW042 je ve směru klonující primer, který obsahuje EcoRI místo. AW053 je protisměrový primer s koncovým a Xhol místem. Zesílení DNA se provede v podstatě stejně jako shora popsáno. Výsledný produkt PCR se klonuje do Ral2 v pET17b v místech EcoRI a Xhol. Výsledný fúzní konstrukt (nazvaný Ral2-P5OlS-E2) je expresován v hostitelských buňkách B834 (DE3) pLys S E.coli v prostředí TB dvě hodiny při teplotě místnosti. Expresovaný protein se čistí promytím inkluzí a průchodem sloupcem Ni-NTA. Vyčištěný protein zůstává rozpuštěný v pufru obsahujícím 20 mM Tris-HCl (hodnota pH 8), 100 mM NaCl, 10 mM β-Me a 5 % glycerolu. Stanovené cDNA a aminokyselínokyselinové sekvence pro expresovaný fúzní protein jsou v SEQ ID NO: 708 a 709,

b) Exprese 0501S v baculoviru

Expresní systém baculoviru Bac-to-Bac (BRL Life Technologies lne.) se použije k expresi proteinu P501S ve hmyzích buňkách. Protein P501S (SEQ ID NO·^-113) plné délky se zesílí PCR a klonuje se do místa Xbal donorového plasmidu pFastBacI. Re- 194 > , kombinantnί bacmíd a baculovirus se připraví podle výrobcových instrukcí. Rekombinantní baculovirus se zesílí v buňkách Sf9 a vysoké titrové virové zásoby se použijí k infikování buněk High Five (invitrogen) k získání rekombinantniho proteinu. Identita proteinu plné délky se potvrdí N-koncovým sekvencováním rekombinantního proteinu analýzou Western blot (obr. 7). Infikuje se 0,6 milionu buněk High Five v šestidůlkových destičkách bud' nepříbuzným kontrolním vírem BV/EDC-PD (pruh 2), rekombinantním baculovirem pro P501S v různých množstvích MOI (pruh 4-8), nebo ne infikované (pruh 3). Buněčné lyzáty se provozují na SDS-PAGE za redukčních podmínek a analyzují se způsobem Western blot s monoklonální protilátkou anti-P501S P501S-1OE3-G4D3 (připravenou jak dále popsáno). Pruh 1 je markérem molekulové hmotnosti biotinylovaného proteinu (BioLabs).

Lokalizace rekombinantního P501S ve hmyzích buňkách se zkoumá následujícím způsobem: Hmyzí buňky expresující P501S se frakcionují na frakce jádra, mitochondri i, membrány a cytosolu. Stejná množství proteinu z každé frakce se analyzují způsobem Western blot s monoklonální protilátkou proti P501S. Díky schématu frakci onace obsahuje jádro i mitochondrové frakce několika složek membránové plasmy. Avšak membránová frakce je zásadně prostá mitochondrií a jádra. Zjišťuje se, že P501S je obsažen ve všech frakcích, které obsahují membránovou složku, což znamená, že P5O1S může být spojen s membránovou plasmou hmyzích buněk expresujících rekombinantní protein.

c) Exprese P5O1S v buňkách savců

P501S plné délky (553 amínokyselin, SEQ ID NO: 113) se klonuje do různých savčích expresních vektorů, včetně pCEP4 (invitrogenu), PVR1012 (Vical, SanDiego, CA) a modifikované formy retrovirového vektoru pBMN pojmenovaného pBIB. Transfekce p501S/pCEP4 a P501S/pVR1012 do fibroblastů HEK293 se provede transfekčním činidlem Fugene (Boehringer Mannheim). Zředí

- 195 se 2 ul reakSního činidla Fugene ve 1OO ul sera prostého prostředí a inkubuje se 5 až 10 minut při teplotě místnosti. Tato směs se přidá do 1 ug P501S plasmidové DRA, krátce se míchá a inkubuje.se 30 minut při teplotě místnosti. Směs Fugene/DNA se přidá do buněk a inkubuje se 24 až 48 hodin. Rekombinantní exprese P501S v převedených fibroblastech HEK293 se zjistí způsobem Western blot za použití monoklonální protilátky P501S.

Transfekce p501S/pCEP4 do buněk CHO-K (American Type Culture Collection, Rockville, MD) se provede použitím transfekčního činidla GenePorter (Gene Terapy Systems, San Diego, CA). Zředí se 15 «1 GenePorter v 500 μΐ sera prostého prostředí a inkubuje se 10 minut při teplotě místnosti. Směs GenePorter/ prostředí se přidá do 2 pg plasmidové DRA, která byla zředěna v 500 n1 sera prostého prostředí, krátce se míchá a inkubuje se 30 minut při teplotě místnosti. Buňky CHO-K se promyjí v PBS k odstranění sérových proteinů, přidá se směs GenePorter/DMA a inkubuje se pět hodin. Do transfektovaných buněk se přidá stejný objem dvojnásobného prostředí a inkubuje se 24 až 48 hod i n.

Analýzou FACS P501S přechodně infikovaných buněk zjistí povrchová exprese P501S. Exprese se zjistí za králičího polyklonálního antiséra proti peptidu P501S, le popsáno. Průtoková cytometrická analýza se provede žití FaCScan (Becton Dickinson) a hodnoty se analyzují žití programu Cell Quest.

CHO-K se použ i t í jak dáza pouza pouti) Exprese P501S v S.cerevisiae

Za použití prepro signální sekvence kvasinek a se expresuje P501S v kvasnicích, zaměřených do membrán. Přírodní signální sekvence první lumenální domény P501S se vypustí ke konzervování přírodního umístění expresovaného proteinu P501S.

«Η Λ- - —<- -Μ ««•ΓΜ·»·,'.- -· 4Í-M f ~«· » ’ I

- 196 a Prepro signální sekvence S. cerevisiae se specificky váže na aminokyseliny 55 aš 553 SEQ ID NO = 113 s His značeným koncem klonovaným do plasraidu pRITI5068 promotorem CUP1 a transfektuje se do kmene S. cerevisiae Y1790. Kmen Y1790 je Leu+ a His-. Exprese proteinu se zavede přísadou buď 500 pil nebo 250 μΜ síranu měďnatého při teplotě 30 C v minimu prostředí doplněného histidinem. Buňky se sklidí 24 hodin po zavedení . Extrakty se připraví růstem buněk na koncentraci 0D600 5,0 v 50 mM citrátfosfátového pufru (hodnota pH 4,0) plus 130 mM chloridu sodného doplněného inhibitory proteázy. Buňky se roztrhají za použití skleněných perel a odstřeďují se 20 minut při 15 000 g. Rekombinantni protein je podle zjištění 100% asociovaná peleta.

Exprese rekombinantního proteinu (s molekulovou hmotností 63 kD) se prokáže analýzou Westren blot, za použití anti-P501S monoklonální dále popsané protilátky 10E-D4-G3. Aminokyselinová sekvence expresovaného proteinu je v SEQ ID N0 = 792.

Fermentační proces pro výrobu cf prepro P501S-His značeného rekombinantni ho proteinu v S.cerevisiae (kmen Y1790-CUP1 indukční promotor) se vyhodnocuje následujícím způsobem: V pevném prostředí FSC004AA se rozmělní 100 yl základní násady obsahující 2,5xlO^s buněk/ml transformované S.cerevisiae Y1790. Prostředí FSC004AA má toto složení: glukosa 10 g/1; dihydrát uolybdenanu sodného 0,0002 g/1; kyselina folová 0,000064 g/1; kaliumdihydrogenfosfát 1 g/1; monohydrát síranu manganatého 0,0004 g/1; inositol 0,064 g/1: heptahydrát síranu horečnatého 0,5 g/1; kyselina boritá 0,0005 g/1; pyridoxin 0,008 g/1; di hydrát chloridu vápenatého 0,1 g/1; jodid draselný 0,0001 g/1; thiamin 0,008 g/1 ; chlorid sodný 0,1 g/1 hexahydrát chloridu kobaltnatého 0,00009 g/1; niacin 0,000032 g/1; hexahydrát chloridu šelezitého 0,0002 g/1; riboflavin 0,000016 g/1; pantotenát vápenatý 0,008 g/1; pentahydrát síranu měďnatého 0,00004 g/1 : biotin 0,000064 g/1; kyselina para-aminobenzoová

- 197 0,000016 g/1: heptahydrát síranu zinečnatého 0,0004 g/1; síran amonný 5 g/1; agar 18 g/1; histidin 0,1 g/1,

Inkubují se dvě destičky 26 hodin při Aeplotě 30 ’c. Tyto pevné předkultury se sklidí do 5 ml tekutého prostředí PSC007AA a 0, 5 ml (nebo 9,3x1ο^7, buněk) této suspenze se použije k naočkování dvou tekutých předkultur.

Prostředí PSC007AA má toto složení: glukósa 1O g/1; díhydrát molybdenanu sodného 0,0002 g/1; kyselina folová 0,000064 g/1; kalíumdihydrogenfosfát 1 g/1; monohydrát síranu manganatého 0,0004 g/1; inositol 0,064 g/1; heptahydrát síranu hořečnatého 0,5 g/1; kyselina boritá 0,0005 g/1; pyridoxin 0,008g/ 1; dihydrát chloridu vápenatého 0,1 g/1; jodid draselný 0,0001 g/1; thiamin 0,008 g/1; chlorid sodný 0,1 g/1; hexahydrát chloridu kofoaltnatého 0,00009 g/1'; niacin 0,000032 g/1; .hexahydrát chloridu železítého 0,0002 g/1; riboflavin 0,000016 g/ 1; pantotenát vápenatý 0,008 g/1; pentahydrát síranu měďnatého 0,00004 g/1: biotin 0,000064 g/1; kyselina para-aminobenzoová 0,000016 g/1: heptahydrát síranu zinečnatého 0,0004 g/1; síran amonný 5 g/1; histidin 0,1 g/1.

Tyto předkultury se ponechají 20 hodin v baňkách o obsahu dva litry obsahujících 400 ml prostředí FSC007AA k získání OD 1,8. Tyto předkultury mají tuto další charakteristiku: hodnota pH 2,8: glukósa 2,3 g/1; ethanol 3,4 g/1.

Nej lepší načasování pro tekuté předkultury pro kmen Y1790 se stanoví předběžnými pokusy. Tekuté předkultury, obsahující 400 ml prostředí, a naočkovanané různými objemy Master Seed (0,25, 0,5, 1 nebo 2 ml) se monitoruji k určení nejlepší očkovací velikosti a načasování. Mezi 16 až 23 hodinami kultivace následuje glukóza, ethanol, pH, OD a počet buněk (stanovený průtokovou cytometrií). Spotřebování glukózy a biomasy se získá po 20 hodinách inkubace s 0,5 inocula. Tyto podmínky se vo- 198 lí k přenosu předkultury do fermentace.

K naočkování 20 1 fermentoru obsahujícího 5 1 prostředí FSC002AA se použije celkem 800 ml předkultury. Před naočkováním se přidají 3 ml ozářené antipěny. Prostředí FSC002AA má toto složení: síran amonný 6,4 g/1 ; dihydrát molybdenanu sodného 2,05 mg/1; kyselina folová 0,54 mg/1; kaliumdihydrogenfosfát 8,25 g/1; monohydrát síranu manganatého 4,1 mg/1; inasitol 540 mg/1; heptahydrát síranu horečnatého 4,69 g/1; kyselina boritá 5,17 mg/1; pyridoxin 68 mg/1; dihydrát chloridu vápenatého 0,92 g/1; jodid draselný 1,03 mg/1; thiamin 68 mg/ 1; chlorid sodný 0,06 g/1; hexahydrát chloridu kobaltnatého 0,92 mg/1; niacin 0,27 mg/1; kyselina chlorovodíková 1 ml/1; hexahydrát chloridu železítého 9,92 mg/1; riboflavin 0,13 mg/1 pentahydrát síranu měďnatého 0,41 mg/1; glukóza 0,14 g/1; pantotenát vápenatý 68 mg/1; heptahydrát síranu zinečnatého 4,1 mg/1; biotín 0,54 mg/1 ; para-aminobenzoová kyselina 0,13 mg/1 ; histidin 0,3 g/1.

Zdroj uhlíku (glukóza) se dovává kontinuálním zaváděním prostředí FFBO04AA. Prostředí FFB004AA má toto složení: glukóza 350 g/1; dihydrát molybdenanu sodného 5,15 mg/1; kyselina folová 1,36 mg/1; kal iumdihydrogenfosfát 20,6 g/1; monohydrát síanu manganatého 10,3 mg/1; inositol 1350 mg/1; heptahydrát síranu horečnatého 11,7 g/1 ; kyselina boritá 170 mg/1; dihydrát chloridu vápenatého 2,35 g/1; jodid draselný 2,6 mg/1; thiamin 170 mg/1 i chlorid sodný 0,15 g/1 ; hexahydrát chloridu kobaltnatého 2,3 mg/1; niacin 0,67 mg/1; kyselina chlorovodíková 2,5 ml/1; hexahydrát chloridu železítého 24,8 mg/1; riboflavin 0,33 mg/1; pentahydrát síranu měďnatého 1,03 mg/1; biotin 1,36 mg/1 i pantotenát vápenatý 170 mg/1; heptahydrát síranu zinečnatého 10,3 mg/1; para-aminobenzoová kyselina 0,33 mg/1: hist i din 5,35 g/1 .

Zkytková koncentrace glukózy je udržována velmi nízká (®50

- 199 fflg/1) k minimalizaci produkce ethanolu při fermentaci. Toho se dosahuje omezením vývoje mikroorganismů pomocí omezeného přísunu glukózy. Obsahu standardní bioffiasy (OD 80-90) se dosáhne ve fermentaci po 44-hodinové fázi růstu.

Pak se zavede promotor CUP1 přidáním 500 μΜ síranu měďnatého k produkování antigenu P501S. Po přísadě síranu měďnatého následuje nahromadění ethanolu (do 6 g/1) a přísun glukózy se sníží ke spotřebování ethanolu. Měď, jež je k disposici pro mikroorganismy, se sleduje spektrometrickým stanovením koncentrace iontů mědi v živném supernatantu (způsobem DETC). Fermentace se ukončí síranem měďnatým během indukční fáze k udržení koncentrace v rozmezí 150 až 250 μΜ v supernatantu. Biomasa dosáhne OD 100 ke konci indukce. Buňky se sklidí po 8 hodinách indukce.

Buněčný homogenizát se připraví a testuje způsobem SDS-PAGE Western blot podle standardních protokolů. Hlavní proteinový pruh s očekávanou molekulovou hmotností 62 kD se zjistí způsobem Western blot použitím monoklonálních protilátek anti-P501S Analysa Western blot ukazuje také, že hlavní pruh 62KD se vytváří progresivně od 30. minuty indukce a dosahuje maxima po třech hodinách. Nejeví se už produkce antigenu mezi 3 až 12 hodinami indukce.

Vyhodnotí se počet průchodů lisem French Press potřebný k extrakci veškerého anti genu z buněk. Testují se jeden, tři a pět průchodů a celkové buněčné lysáty, supernatanty a pelety buněčných lysátů způsobem Western blot. Stačí tři průchody lisem French Press ke kompletní extrakci antigenu. Antigen je v nerozpustné frakci.

e) Exprese P703P v bačulov iru

Digerováním plasmidu pCDNA703 s restrikčními endonukleá- 200 zami Xbal a HindlII se získá cDNA plné délky P703P-DE5 (SEQ ID NO: 326) spolu s několika lemovacími restrikčními místy. Výsledný restrikční fragment (přibližně 800 páru bází) se váže na transferový plasmid pFastBacI, který se digeruje se stejnými restrikčními enzymy. Sekvence inzertu se potvrdí sekvencováním DNA. Rekombinantního transferového plasmidu pFB703 se použije k provedení rekombinantní bacmidové DNA a bačulov iru za použití expresního systému Bac-To-Bac bačulov iru (BRL Life Technologies). Buňky High Five se infikují rekombinantním virem BVF703, jak shora uvedeno, k získánín rekombinantního proteinu P7O3P.

f) Exprese P788P v E.Coli

Zkomolená, N-koncová část P788P (zbytky 1-644 SEQ ID NO: 777, nazvané P788P-N) fúzovaná s C-koncovým 6xHis Tag se expresu je v E.coli následujícím způsobem: P788P cDNA se zesílí primery AW080 a AW081 (SEQ ID NO:672 a 673). AW080 je primer klonující ve směru s místem Ndel. AW081 je v protisměru klonující primer s místem Xhol. PCR-zesilený P788P, stejně jako vektor pCRXl, se digerují s Ndel a Xhol, Vektor a inzert se vážou a transformují do buňky NovaBlue. Kolonie se náhodně skrínují pro inzert a pak se sekvencují. Klon P788P tt6 je identický s designovaným konstruktem. Expresní konstrukt P788P-N tt6/pCRXl se transformuje do kompetentních buněk E.coli BL21 CodonPlus-RIL. Po indukci většina buněk dobře roste a dosáhne 0D6OO větší než 2,0 po 3 hodinách. SDS PAGE vybarvené Coomassie vykazují nadměrně expresovaný pruh při přibližně 75 kD. Analýza Western blot s použitím protilátky 6xHisTag potvrzuje, že pruh je P78SP-N, Stanovená sekvence cDNA pro P788P-N je v SEQ ID NO: 674, přičemž odpovídající aminokyselinová sekvence je v SEQ ID NO:675.

,201

f) Exprese P510S v E.Coli

Protein P51OS má devět potenciálních transmembránových domén a je předurčen k umístění ma plasmovou membránu. C-Koncový protein tohoto proteinu i předpověděná třetí extracelulární doména P510S se expresují v E.coli následujícím způsobem:

Expresní konstrukt nazvaný Ral2-P510S-C je volen tak, že má 6HisTag na N-konci, následovaný M. tuberculosis anti genem Ral2 (SEQ ID NO: 676) a C-koncovou část P51OS (aminozbytky 1176-1261 SEQ ID NO: 538). Plné délky P510S se použije k zesílení P510S-C fragmentu PCR použitím primerů AW056 a AW057 (SEQ ID NO: 677 a 678). AWO56 je ve směru klonující primer s místem EcoRI. AW057 je protisměrný primer s koncem a místy Xhol. Zesílený fragment P501S a Ral2/pCRXl se digerují s EcoRI a Xhol a pak se vyčistí. Insert a vektor se navzájem vážou a transformují se do NovaBlue. Kolonie se náhodně skrínují pro inzert a sekvence. Pro expresi proteinu se expresní konstrukt transformuje do kompetentních buněk E.coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIL K optimalizaci expresních podmínek se provede mini indukční skríning. Po indukci buňky dobře rostou, dosáhnou OD 600 nm větší než 2,0 po třech hodinách. Vybarvení Comassie SDS-PAGE vykazuje vysoce nadměrně expresovaný pruh při přibližně 30 kD. Ačkoli je vyšší než očekávaná molekulová hmotnost, je analýza Western blot positivní a tento pruh je His-tag-obsahující protein. Optimizované kultivační podmínky jsou následující: Zředěná kultura přes noc/ve dne (LB + kanamycin + chloramfenikol) v 2xYT (s kanamycinem a chloramfenikolem) v poměru 25 ml kula tury na 1 litr 2xYT. Nechají se růst při teplotě 37 C až do dosažení OD 600 =0,6. Odejme se podíl jako TO vzorek. Přidá se o

mři IPTG a nechají se růst tři hodiny při teplotě 30 C. Odebere se vzorek T3, buňky se sbalí a uloží se při teplotě -80

O

C. Stanovená cDNA a aminokyselinové sekvence pro konstrukt Ral2-P510S-C jsou v SEQ ID NO: 679 a 682.

- 202 ! . >

ID NO: 685 vytváří místo Protisměrný primer SEQ ID

Expresní konstrukt P51OS-C je navržen tak, že má 5 přidaný počáteční kodon a glycinový (GGA) kodon a pak koncový fragment P510S-C následovaný v rámci 6x histidin tag a stop kodonem z vektoru pET28b. Klonovací strategie je podobnmá jako u Ral2-P5iOS-C, s tou výjimkou, že použité primery PCR jsou stejné jako v SEQ ID NO: 685 a 686 a je použito řezu Ncol/Xhol v pET28b. Primer SEQ

Ncol a přidává se výchozí kodon.

NO: 686 vytváří Xhol místo na koncovém fragmentu P510S-C. Klony se potvrdí sekvencováním. K expresi proteinu se expresní konstrukt transformuje do kompetentních buněk E.coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIL. Získá se 0D600 větší než 2,0 třicet hodin po indukci. Vybarvení Comassie SDS-PAGE vykazuje vysoce nadměrně expresovaný pruh při přibližně 11 kD. Analýza Western blot potvrzuje, že tento pruh je P510S-C, stejně jako sekvencování N-koncového proteinu. Optimalizované kultivační podmínky jsou následující: Zředěná kultura přes noc/ve dne (LB + kanamycin + chloramfenikol) v 2xYT (s kanamycinem a chloramfenikolem) v poměru 25 ml kultury na 1 litr 2xYT a nechají se růst β

při teplotě 37 C až do dosažení OD 600 = 0,5. Odejme se podíl Přidá se 1 raM IPTG a nechají se růst 3 hodiny o

C. Buňky se sbalí a uloží se při teplotě -80 o

C až do vyčištění. Stanovená cDNA a aminokyselinové sekvence pro konst-rukt P51OS-C jsou v SEQ ID NO: 680 a 683.

jako TO vzorek, při teplotě 30

Předpověděná třetí extrace1ulární doména P51OS (P51OS-E3; zbytky 328-676 sekvence SEQ ID N0=538) se expresuje v E.coli následujícím způsobem: Fragment P510S se zesílí PCR použitím primerů uvedených v SEQ ID NO: 687 a 688. Primer SEQ ID NO: 687 je směrový primer s místem Ndel k použití v ligaci do pPDM. Primer SEQ ID NO: 688 je protisměrný primer s přidaným místem Xhol k použití v ligaci do pPDM. Výsledný fragment se klonuje do pPDM na místech Ndel a Xhol. Klony se potvrdí sekvencováním. Pro expresí proteinu se klon transformuje do kompetentních buněk E.coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIL. Po indukci

- 203 í ) ) · t » ) se získá 0D600 větší než 2,0 po 3 hodinách. Vybarvení Comassie SDS-PAGE vykazuje vysoce nadměrně expresovaný pruh při přibližně 39 kD a N-koncová sekvence potvrzuje, že N-zakončení je P510S-E3. Optimalizované kultivační podmínky jsou následující·· Zředěná kultura přes noc/ve dne (LB + kanamycin + chloramfenikol) v 2xYT (s kanamycinem a chloramfenikolem) v poměru 25 ml kultury na 1 litr 2xYT a nechají se růst při teplotě 37 o

C až do dosažení OD 600=0,6. Odejme se podíl jako TO vzorek. Přidá se 1 roh IPTG a nechá se růst při teplotě 30 C po dobu tří hodin. Odebere se T3 vzorek, buňky se sbalí a uloží se při e

teplotě -80 C až do vyčištění. Stanovená cDNA a aminokyselinové sekvence pro konstrukt P510S-E3 jsou v SEQ ID NO: 681 a 684.

g) Exprese p775S v E.coli

Antigen P775P obsahuje několik otevřených čtecích rámců (ORF). Třetí ORF, kódující protein SEQ ID NO: 483 má nejlepší emotivní skoré. Expresní fuzní konstrukt obsahující M. tuberkulosis antigen Ral2 (SEQ ID NO=676) a P775P.0RF3 s N-zakončením 6xHisTag se připraví následujícím způsobem: P775P-0RF3 se zesílí pomocí směrových PCR primerů SEQ ID NO: 689 a protisměrového PCR primeru SEQ ID NO'· 690. PCR zesílenmý fragment P775P a Ral2/pCRXI se digerují s restrikčními enzymy EcoRI a Xhol. Insert a vektor se navzájem vážou a transformují se do buněk NovaBlue. Kolonie se náhodně skrínují pro inzert a sekvencuji se. Klon, mající žádanou sekvenci, se transformuje do kompetentních buněk E.coli BL21(DE3) CodonPlus-RIL. Dvě hodiny po indukci dosáhne hustota vrcholu 0D600 přibližně 1,8. Vybarvení Comassie SDS-PAGE vykazuje nadměrně expresovaný pruh při přibližně 31 kD. Analýza Western blot s použitím protilátky 6x HisTag potvrzuje, že tento pruh je Ral2-P775P-0RF3. Stanovené cDNA a aminokyselinové sekvence pro fuzní konstrukt jsou v SEQ ID NO: 691 a 692.

,204,,- ,, , . ·,, -,,

Η) Exprese HisTag fuzního proteinu P703P v E.coli cDNA pro kódovací region P703P se připraví PCR za použití primerů sekvence SEQ ID NO: 693 a 694. Produkt PCR se digeruje s restrikčním enzymem EcoRI, gelově se čistí a klonuje do modifikovaného vektoru pET28 s HisTag v rámci, který byl digerován s restríkčnímí enzymy Eco72I a EcoRI. Správný konstrukt je potvrzen analýzou sekvence DNA a pak je transformován do expresních hostitelských buněk E.coli BL2KDE3) pLys S. Stanovené cDNA a aminokyselinové sekvence pro expresovaný rekombinantní P703P jsou v SEQ ID NO: 695 a 696.

I) Exprese HisTag fusníbo proteinu P705P v E.coli cDNA pro kódovací region P705P se připraví PCR za použití primerů sekvence SEQ ID NO: 697 a 698. Produkt PCR se digeruje s restrikčním enzymem EcoRI, gelově se čistí a klonuje se do modifikovaného vektoru pET28 s HisTag v rámci, který byl digerován s restrikčními enzymy Eco72I a EcoRI. Správný konstrukt je potvrzen analýzou sekvence DNA a je transformován do expresních hostitelských buněk E.coli BL2KDE3) pLys S a BNL21 (DE3) CodonPlus. Stanovené cDNA a aminokyselinové sekvence pro expresovaný rekombinantní P705P jsou v SEQ ID NO: 699 a 700.

J) Exprese HisTag fuzního proteinu P711P v E.coli cDNA pro kódovací region P711P se připraví PCR za použití primerů sekvence SEQ ID NO:701 a 702. Produkt PCR se digeruje s restrikčním enzymem EcoRI, gelově se čistí a klonuje do modifikovaného vektoru pET28 s HisTag v rámci, který byl digerován s restrikčními enzymy Eco72I a EcoRI. Správný konstrukt je potvrzen analýzou sekvence DNA a je transformován do expresních hostitelských buněk E.coli BL2KDE3) pLys S a BL21 (DE3) CodonPlus. Stanovené cDNA a aminokyselinové sekvence pro expresovaný rekombinantní P711P jsou v SEQ ID NO: 703 a 704.@LH 4 ) » 3 »

3 > >

) ))) ) >3 3 >33 3 > 3 3 3

205 > J > ) . i i > i >

' > ) > ) ) ) ) 3 J

Př í k1ad 18

Příprava a charakterizace protilátek proti polypeptidůra specifickým pro prostatu

a) Příprava a charakterizace polyklonálních protilátek proti P703P, P5O4S a P509S

Polyklonální protilátky proti P703P, P504S a P509S se připraví takto:

Každý antigen nádoru prostaty expresovaný v rekombinantním systému E.coli se nechá růst přes noc v živném roztoku LB o

s příslušnými antibiotiky při teplotě 37 C v natřásacím inkubátoru. Následujícího rána se přidá 10 ml přes noc pěstované kultury do 500 ml 2xYT plus příslušná antibiotika ve dvoulitrové přepážkové Erlenmeyerově baňce. Když dosáhne optická hustota kultury (při 560 nm) 0,4 až 0,6, indukují se buňky s IPTG (1 mM) . Čtyři hodiny po indukci IPTG se buňky sklidí odstředěním. Buňky se promyjí fosfátem pufrovanou solankou a znovu se odstředí. Supernatant se vyhodí a buňky se buď zmrazí pro další použití, nebo se okažitě zpracují. Do buněčných pelet se přidá 20 ml lyzačního pufru a vířivě se míchá. K otevření buněk E.coli se tato směs -pak prožene lisem French Press při tlaku 11,04 MPa. Buňky se pak znovu odstředí a supernatant a pelety se kontrolují SDS-PAGE na oddělení rekombinantního proteinu. Pro proteiny na peletách se pelety resuspendují v 10 mM Tris o hodnotě pH 8,0, 1 % CHAPS a inklusní pelety se promyjí a znovu odstředí. Tento proces se opakuje dvakrát. Promyté pelety se rozpustí buď v 8M nebo 6M guanidinové kyselině chlorovodíkové obsahující 10 mM Tris (hodnota pH 8,0) plus 10 mM imidazolu. Rozpuštěný protein se přidá do 5 ml nikl-chelátové pryskyřice (Qiagen) a inkubuje se 45 minut až 1 hodinu při teplotě místnosti za stálého míchání. Po inkubaci se pryskyřice a protein prolijí sloupcem pro jedno použití a průtok se », - > 206 )1 1 > ί Ϊ shromáždí. Sloupec se promyje se zřetelem na sloupec 10 aš 20 objemy solubi1 i začni ho fufru. Antigen se eluuje se sloupce za poušití 8M močoviny, 10 mM Tris PpH 8,0 a 300 mM imidazolu a shromáždí se ve 3 ml frakcích. Ke stanovení, která frakce se použije k dalšímu čištění proběhne gelová DS-PAGE.

Jako konečné čisticí operace se vyváží silná anexová pryskyřice, jako HiPrepQ (Biorad) s vhodným pufrem a shora získané frakce se vnesou do sloupce. Každý antigen se eluuje ze sloupce se vzrůstajícím solným gradientem. Frakce se shromáždí po průchodu sloupcem a proběhne jiný gel SDS-PAGE ke stanovení, která frakce ze sloupce se shromáždí. Shromážděné frakce se dialyzují proti 10 mM Tris pH 8,0. Proteiny se pak protlačí po filtraci přes 0,22 mikronový filtr a antigen se zmraz i aš do pouš i t i k i mun i zac i.

Zkombinuje se 500 mikrogramů každého prostatového antigenu se 1O0 mikrogramy muramyldipeptidu (MDP). Každé 4 týdny se králíkům zvýší dávka 100 pg smíšených se stejným objemem neúplného Freundova Adjuvantu (IFA). Sedm dní po každém zvýšení se zvířatům odebere krev. Sera se generují inkubováním krve o

při teplotě 4 C pro 12 aš 4 hodiny následným odstředěním.

Ant igenem se povléknou 96-důlkové destčky inkubací 50 mikrolitrů (obvykle 1 pg) rekombinantního proteinu 20 hodin e

při teplotě 4 C. Do důlků se přidá se 250 mikrolitrů blokovacího pufru BSA a inkubuje se dvě hodiny při teplotě místnosti. Destičky se omyjí 6x PBS/0,01% Tween. Králičí sérum se zředí v PBS. Do každého důlku se přidá 50 pl zředěného séra a inkubuje se 30 minut při teplotě místnosti. Destičky se promyji jak popsáno, před přidáním 50 pl kozí anti-králičí křenové peroxidázy (HRP) ve zředění 1=10 000 a inkubuje se 30 minut při teplotě místnosti. Destičky se znovu promyjí, jak shora popsáno a do každého důlku se přidá 100 pl TBM microvell peroxidázového substrátu. Po 15-minutové inkubaci v temnu při teplotě místnosti se ukončí kolorimetrická reakce řidáním 100 μΐ 1N kyseliny sírové s okamžitým čtením při 450 nm. Všechny polyklonální protilátky vykazují imunoreaktivi tu na příslušný antigen.

b) Příprava a charakteristika protilátek proti P501S

Připraví se myší monoklonální protilátky zaměřené proti karboxy-ukončení pro prostatu specifického antigenu P510S následujícím způsobem:

Vytvoří se zkomolený fragment P510S (aminokyseliny 355 až 526 SEQ ID N0= 113) a klonuje se do vektoru pET28b (Novagen) a expresuje se v E.coli jako thioredoxinový fúzní protein s histidinovým značením. Fusní protein trx-P510S se vyčistí niklovou chromatografií, digeruje se thrombinem k odstranění fragmentu trx a dále se čistí kyselinovým vysrážecím způsobem následovaným reverzní fázovou chromatografií HPLC.

Myši se imunizují zkomoleným proteinem P501S. Směsi sér myší, které obsahují potenciální polyklonální séra anti P510S se testují na specifickou reaktivitu P510S testy ELISA s vyčištěnými proteiny P510S a trx-P501S. Směsi sér, jevící se jako specificky reagující s P510S se pak skrínují analýzou Western blot na rekativitu P510S. Myši, obsahující složku protilátky specifickou pro P510S, se usmrtí a slezinných buňek se použije o sobě známými způsoby k vytvoření hybridomů produkujících protilántku anti-P510S. Supernatanty hybridomů se testují napřed na specifickou reaktivitu P51OS testem ELISA a pak analýzou FACS na reaktivitu s P51OS převedenými buňkami. Na základě těchto výsledků se k dalšímu subklonování zvolí monoklonální hybridomy označované 10E3. Vytvoří se řada subklonů testovaných na specifickou reaktivitu P510S za použití testu ELISA a typují se na isotyp IgG. Výsledky této analýzy jsou obsaženy v tabulce V. Ze 16 testovaných subklonů se pro další

S>f*'»xť^--;>í“>' , > , -” 208,7 ) ) , 1 ) i S ; T T >

) i » > ) ) ) ) » : i studii vybere protilátka 10E3-G4-D3.

Tabulka V Isotypová analýza myších monoklonálních protilátek antx-P510S

K1on hybr i doma	Isotyp	Stanovený [lg] v supernatantu (^g/mi:
4D11	lgGl	14,6
1G1	lgGl	0, 6
4F6	lgGl	72,0
4H5	lgGl	13, 8
4H5-E12	lgGl	10, 7
4H5-EH2	lgGl	9,2
4H5-H2-A10	lgGl	10, 0
4H5-H2-A3	lgGl	12, 8
4H5-H2-A10-G6	lgGl	13, 6
4H5-H2-B1Í	lgGl	12, 3
10E3	1 gG2a	3,4
Í0E3-D4	lgG2a	3, 8
10E3-D4-G3	1 gG2a	9,5
10E3-D4-G6	lgG2a	10,4
10E3-E7	lgG2a	6,5
8H12	lgG2a	0, 6

Specifičnost 10E3-G4-D3 pro P51OS se zkoumá analýzou FACS. Buňky se fixují (2% formaldehydem, 10 minut), permeabi 1izuji se (0,1% saponinem, ÍO minut) a vybarví se 10E3-G4-D3 při 0,5 až 1 yg/ml a následuje inkubace se sekundární, FITC-konjugovanou kozí anti-myší Ig protilátkou (Pharmingen, San Diego, CA). Buňky se analyzují na fluorescencí FITC za použití fluorescenčního aktivovaného třídiče buněk Excalibur. Pro analýzu FACS převedených buněk se B-LCL retrovirově převedou P510S. Pro analýzu infikovaných buněk, se B-LCL infikují vakcinovým vektorem, který expresuje P510S. K předvedení specifičností v těchto zkouškách se použije B-LCL převedené s odlišným antigenem (P70SP) a neinfikovaných vektorů B-LCL. Jak se ukazuje, 10E3-G4-D3 se váže s P51OSA-převedeným B-LCL a také s P51OS-infikovaným B-LCL, avšak ani s neinfikovanými buňkami ani s P510S-převedenými buňkami.

Ke zjištění, zda sa epitop, poznaný 10E3-G4-D3, nachází na povrchu nebo v intracelulárních částech buněk, se B-LCL převede P510AS neb HLA-B jako kontrolní antigen a buď se fixuje nebo permeabi1izuje, jak shora popsáno, nebo se přímo vybarví 10E3-G4-D3 a analyzuje jako shora. Specifické poznání P510S 10E3-G4-D3 vyžaduje podle zjištění permeabi1 izaci, což naznačuje, že epitop poznaný touto protilátkou, je intracelu1árn í.

Reaktivita 10E3-G4-D3 se třemi buněčnými liniemi nádoru prostaty Lncap, PC-3 a DU-145, o nichž se ví, že expresují vysoké, střední a nízké úrovně P510S, se zkoumá permeabi1izováním buněk a jejich zpracováním jako shora. Vyšší reaktivita 10E3-G4-D3 je patrná s linií Lncap než s PC-3, která vykazuje vyšší reaktivitu než DU-145. Tyto výsledky souhlasí s reál time PCR a ukazují, že protilátka specificky pozná P510S v těchto nádorových buněčných liniích, a že epitop, poznaný v nádorových buněčných liniích, je také intracelulární.

Specifičnost 1OE3-G4-D3 pro p51OS je také doložena analýzou Western blot. Vytvoří se lysáty z nádorových buněčných linií Lncap, PC-3 a DU-145 z P510S přechodově transfektovaných buněk HEK293 a z netransfektovaných buněk HEK293. Analýzou Western blot těchto lysátů s 10E3-G4-D3 se objevilo 46 kDa imunoaktivních vazeb mezi transfektovanými HEK buňkami Lncap, PC-3 a DU-145,í avšak nikoli v buňkách DU-145 nebo v netransfektovaných buňkách HEK293. Exprese P501S mRNA je kosistentní s těmito výsedky, neboť sem ikvant itativní analýza PCR ukázala, že P501S mRNA je expresována v Lnap, v lepší, avšak zjis210

- I í*~f W- JS*«-W k > k 'ť · l· V^C *V\ -í > '> t ) > < I

J · 1 I > -I >

í 1 ) > ) ‘ i >

ti telné úrovni v bukňkách PC-3 a vůbec ne v buňkách DU-245. Bakteriálně expresovaný a vyčištěný 0501S (označený P501SStr2) je rozeznán (24 kDA)10E3-G4-D3 stejně jako P501S plné délky, který byl přechodně expresován v buňkách HEK293 za pomoci expresního vektoru VR1012 nebo pCEP4. Ačkoli je předpověděná molekulová hmotnost P501S 70,5 kD, snižuje jak transfektovaný tak nativní P501S mírně mobilitu v důsledku hydroskopické povahy.

Imunohistochemická analýza se provede na nádoru prostaty a na panelu řezů normálních tkání (prostaty, nadledvinek, mozku, tlustého střeva, žlučníku, střevní neprůchodnosti, ledvin, vaječnéků, slinivky, příušni žláze, kosterního svalstva, sleziny a varlat). Vzorky tkání se upevní na 24 hodin do lázně formalinu a zalijí se do parafinu k rozkrájení na 10 mikronové plátky. Řezy tkání se permeabi1izují a inkubují jednu hodinu 10E3-G4-D3. HRP-značené anti-myší po inkobaci DAB se použije ke zjištění imunoreaktiv i ty

P501S. Zjišťuje se, že P501S je vysoce expresován jak ve tkáni normální prostaty, tak ve tkáni nádoru prostaty, není však zjišťován v žádné jiné testované tkáni.

s protilátkou s chroraogenem

K identifikování epitopu, poznaného 10E3-G4-D3, se sleduje mapování epitopu. Syntetizuje se 13 překrývajících se merů (překrytí 5 aminokyselin k SEQ ID NO·’ 489 až 501), které překrývají fragment P501S, použitý ke generování 10E3-G4-D3, Povléknou se 96-důlkové mikrotitrační destičky s plochým dnem jednak peptidy jednak fragmentem P501S, použitým k imunizaci myší, při 1 Mg/ml po dobu dvou hodin při teplotě 37 C. Důlky se odsají a blokují se fosfátem pufrovanou solankou, obsahující 1 % (hmotnost/objem) BSA, dvě hodiny při teplotě místnosti, načež se promyjí PBS obsahujícím 0,1% Tween 20 (PBST). Vyčištěná protilátka 10E3-G4-D3 se přidá ve dvojnásobném zředění (1000 ng až 16 ng) v PBST a inkubuje se 30 minut při teplotě místnosti. Následuje šest inásobné promytí PBST a pak inkubace s HRP-konjugovaným oslím proti myším fragmentem IgG (H+L)Affinipure F( ab ) (Jackson Immunoresearch, West Grove.PA) při 1 : 20 000 po dobu 30 minut. Destičky se promyjí a inkubují 15 minut v tetramethylbenzidinu. Reakce se ukončí přísadu IN kyseliny sírové a destičky se čtou při 400 ng za použití čtecího zařízením destiček ELISA. Jak patrno z obr. 8, reaktivita je patrná s peptidem SEQ ID NO: 496 (odpovídajícím aminokyselinám 439 až 459 P501S) a s fragmentem P501S, ne však se zbývajícími peptidy, což ukazuje, že epitop poznaný 10E3-G4-D3 je lokalizován na aminokyselinách 439 až 459 SEQ ID NO: 113.

K dalšímu vyhodnocení tkáňové specifičnosti P501S, se provede mul tiřadová imunohistochemická analýza na přibližně 4700 různých lidských tkáních zahrnujících většinu normálních orgánů i neoplasie odvozené z těchto tkání. Šedesátpět z těchto vzorků lidských tkání je z prostaty. Řezy tkání o tloušťce 0,6 mm se fixují ve formalinu a zalijí se do parafinu. Vzorky se znovu zpracují HIER s použitím 10 mM citrátového pufru (hodnota pH 6,0) a vaří se 10 minut. Vzorky se vybarví 10E3-G4-D3 a imunoreaktiv i ta P501S se zviditelní za použití HRP. Všech 65 vzorků tkáně prostaty (5 normálních, 55 ne léčených nádorů prostaty, 5 hormonálních úporných nádorů prostaty) je positivních, vykazujících zřetelné perinukleární vybarvení. Všechny ostatní zkoumané tkáně jsou negativní na expresi P501S.

c) Příprava a charakterizace protilátek proti P503S

Fragment P503S (aminokyseliny 113 až 241 SEQ ID NO: 114) se expresuje a vyčistí v podstatě od bakterií, jak shora popsáno pro P501S, a použije se k imunizaci králíků i myší. Myší monoklonální protilátky se izolují standardní technologií hybridom, jak shora popsáno. Králičí monoklonální protilátky se izolují s použitím způsobu selektovaných lyrafocytových protilátek (Selected Lymphocyte Antibobody Method, SLAM) (Imm»W=«£ Sj^SSřiiMiW genics Pharmaceutical, Vancouver, BC, Canada). V tabulce VI je seznam monoklonálních protilátek vyvinutých proti P501S.

Tabulka VI

Prot i 1átka	Druh
2OD4	králík
JA1	králík
1A4	myš
1C3	myš
1C9	myš
1D12	myš
2A11	myš
2H9	myš
4H7	myš
8A8	myš
8D1O	myš
9C12	myš
6D12	myš

Sekvence DNA kódující komplementaritu určující region (CDR) pro králičí monoklonální protilátky 20D4 a JA1 se určí a jsou v SEQ ID NO: 502 a 503.

K lepšímu definování epitop vázacího regionu každé protilátky se vytvoří série překrývajících peptidů, které zahrnují aminokyseliny 109 až 213 SEQ ID NO: 114. Těchto peptidů se použije ke zmapování anti P501S monoklonálních protilátek způsobem ELISA: Rekombinantní fragment P503S, kterého se použilo jako imunogenu, se použije jako pozitivní kontroly. Destičky s 96 důlky se povléknou buď peptidem nebo rekombinantním antitigenem v množství 20 ng/důlek a ponechají se přes noc při o

teplotě 4 C. Destičky se odsají a blokují se solankou pufrovanou fosfátem, obsahující 1 % (hmotnost/objem) BSA, dvě hodí--213 ) 3 ny při teplotě místnosti, pak se promyjí PBS obsahujícím O,1 % Tweenu 20 (PBST). Vyčištěné králičí monoklonální protilátky, zředěné PBST, se přidají do důlků a inkubují se 30 minut při teplotě místnosti. Následuje promytí 6x PBST a inkubace 30 minut s konjugátem protein-A HRP ve zředění 1:2000. Destičky se promyjí 6x v PBST a inkubují se s tetramethylbenzidinovým substrátem (TMB) dalších 15 minut. Reakce se ukončí přísadou 1N kyseliny sírové a destičky se čtou při 450 nm čtecím zařízením destiček ELISA. Provede se ELISA s myšími monoklonálnImi protilátkami se supernatanty z tkáňové kultury.

Všechny protilátky se vážou na rekombinantní fragment P503S s výjimkou negativního kontrolního SP2 supernatantu. 20D4, JA1 a 1D12 se vážou přísně na peptid #2101 (SEQ ID NO= 504), odpovídající aminokyselinám 151 až 169 SEQ ID N0-‘ 114. 1C3 se váže na peptid #2102 (SEQ ID NO^; 505), což odpovídá aminokyse1 inám 165 až 184 SEQ ID NO: 114. 9C12 se váže na peptid #2099 (SEQ ID N0= 522), což odpovídá aminokyselinám 120 až 139 SEQ ID NO: 114. Ostatní protilátky se vážou ná regiony, které nebyly zkoumány v těchto studiích.

Po zmapování epitopů se protilátky testují analýzou FACS na buněčnou linii, která stabilně expresuje P503S, k potvrzení, že se protilátky vážou na epitopy povrchu buněk. Jako negativní kontroly se použije stabilně transfektovaných buněk s kontrolním plasmidem. Buňky se vybarví za živa bez fixatívu. Přidá se 0,5 ug monoklonální protilátky anti P503S a buňky se inkubují na ledu 30 minut před dvojnásobným promytím a inkubací 20 minut s FITC-značenou sekundární kozí proti-králičí nebo myší protilátkou. Po dvojnásobném promytí se buňky analyzují buněčným fluorescnčně aktivovaným třídičem Excalibur. Zjišťuje se, že monoklonální protilátky 1C3, 1D12, 9C12, 20D4 a JA1, avšak nikoli 8D3, se vážou na povrchový buněčný epitop P503S.

Ke zjištění, která tkáň expresuje P503S, se provede imu- ’ 214, nohistochemická analýza, v podstatě jako shora popsáno, na panelu normálních tkání (prostaty, nadledvinek, mozku, tlustého střeva, cervixu, dvanáctém í ku, žlučníku, ilea, ledvin, vaječníků, slinivky, příušní žlázy, kosterního svalstva, sleziny a varlat), ,Ke zviditelnění imunoreaktiví ty P503S se použije HRP-značených anti-myších a anti-král ičích protilátek s následnou inkubací TMB. Zjišťuje se, že P503S je vysoce expresován v prostatové tkáni, menší exprese je pozorována u cervixu, u tlustého střeva, u ilea a u ledvin a žádná exprese se nepozoruje u tkání nadledvinek, prsu, dvanácteraíku, žlučníku, vaječníků, slinivky, příušní žlázy, kosterního svalstva, sleziny a varlat.

K charakterizování monoklonální a proti látkové spécificity P503S se použije analýzy Western blot. Provede se SDS-PAGE na rekombinantu (rec) P503S expresovaném v bakterii a vyčištěném od bakterií a na lysátech z HEK293 buněk transfektovaných plné délky P503S. Protein se přenese na nitrocelulózu a analyzuje se způsobem Western blot s každou z anti-P503S monoklonálních protilátek (20D4, JAi, 1D12, 6D12 a 9C12) při koncentraci protilátek 1 ug/ml. Protein se zjišťuje křenovou peroxidázou (HRP) konjugovanou ke kozí anti-rayší monoklonální protilátce nebo k protein A-sepharose. Monoklonální protilátka 20D4 zjišťuje vhodnou molekulovou hmotnost 14 kDa rekombinantního P5O3S (aminokyseliny 113 až 241) a 23,5 kDa v buněčných lyzátech HEK293 transfektovaných s P503S plné délky. Ostatní anti-P503S monoklonální protilátky vykazují podobnou specifičnost při Western blot.

d) Příprava a charakterizace protilátek proti P703P

Králíci se imunizují buď zkomoleným (P703Ptrl; SEQ ID NO·172) nebo zralou formou plné délky (P703Pfl, SEQ ID NO·^- 523) nebo rekombinantího P703P proteinu expresovaného ve vyčištěné formě z bakterií, jak shora popsáno. Afinita vyčištěné póly- 215 klonální protilátky se generuje použitím imunogenu P703Pfl nebo P703Ptrl připojené k pevnému nosiči. Králičí monoklonální protilátky se izolují za pomužití technologie SLAM (Immgenics Pharmaceuticals). Tabulka VII je seznam polyklonálních a monokl onál nich protilátek generovaných proti P703P.

Tabulka VII

Protilátka	Imunogen	Druh/typ
Aff.čišť.P703P( zkomolený)#2594	P703Ptrl	králík polyklonální
Aff.čišť.P703P(p!ná délka)#9245	P703Pf1	krá1ík po1yk1onálηí
2D4	P703Ptrl	králík monoklonální
8H2	P703Ptrl	králík monoklonální
7H8	P703Ptrl	králík monoklonální

Stanoví se sekvence DNA kódující komplementaritu určující regiony (CDR) pro králičí monoklonální protilátku 8H2, 7H8 a 2D4 a jsou v SEQ ID NO: 506 až 508.

Provedou se studie mapující epitop, jak shora popsáno. Zjišťuje se, že monoklonální protilátky 2D4 a 7H8 specificky vážou peptidy SEQ ID NO: 509 (odpovídající aminokyselinám 145 až 159 SEQ ID NO: 172) a SEQ ID NO: 510 (odpovídající aminokyselinám 11 až 25 SEQ ID NO: 172). Polyklonální protilátka 2594 váže podle zjištění peptidy SEQ ID NO: 511 až 514, s polyklonální protilátkou 9427 vázající peptidy SEQ ID NO: 515 až 517.

Specifičnost protilátek anti-P703P se zjišťuje způsobem Wester blot:

Provede se SDS-PAGE (1) na bakteriálně expresovaném rekombi nantn i m antigenu; (2) na lysátech buněk HEK293 a buněk «ΜΜμΜΜΗΜΜΜΜ^^ - » · ......... ^: • - , 216 Ltk netransfektovaných nebo transfektovaných s plasmid expresujícím P703P plné délky; a (3) na supernatantu izolovaném z těchto buněk. Protein se přenese na nitrocelulózu a podrobí se Western blot za použití anti-P703P polyklonální protilátky #2594 při koncentraci protilátky 1 ug/ml. Protein se zjistí křenovou peroxidázou (HRP) konjugovanou na anti-králičí protilátku. Pozoruje se 35 kDa imunoreaktivní pruh s rekombinantním P703P. Rekombinantní P703P probíhá při mírně vyšší molekulové hmotnosti, jelikož je značeným epitopem. V lysátech a supernatantech z transfektovaných buněk plné délky P703P je patrný pruh 30 kDá odpovídající P703P. Ke zjištění specifičnosti se také testují lysáty z buněk HEK293 stabilně transfektovaných s kontrolním plasmidem a jsou negativní pro expresi P703P. Ostatní protilátky anti-P7O3P vykazují podobné výsledky.

Provedou se imunohistochemické studie, jak shora popsáno, s použitím protilátky anti-P703P. Zjišťuje se, že P703P je vysoce expresován ve tkáni normální prostaty a ve tkáni nádoru prostaty, není však zjistitelný ve všech ostatních zkoumaných tkáních (nádoru prsu, plic a normálních ledvin).

e) Příprava a charakterizace protilátek proti P504S

Expresuje se a vyčistí se od bakterií P504S (SEQ ID NO: 108) plné délky, jak shora popsáno pro P501S, a použije se ke zvýšení králičích monoklonálních protilátek s použitím způsobu selektovaných lymfocytových protilátek (SLAM) (Immgenics Pharmaceutical, Vancouver, BC, Canada). Zkouškou Western blot se zjišťuje, že monoklonální protilátka anti-P504S 13H4 se váže jak na expresovaný P504S, tak na nativní P504S v nádorových buňkách.

Provedou se imunohistochemické studie, jak shora popsáno, s použitím 13H4 k posouzení exprese P504S v různých prostatových tkáních. Monoklonální P5O4S protilátkou 13H4 se vybarví celkem 104 případů, včetně 65 případů radikálních prostatektomií s rakovinou prostaty (PC), 26 případů biopsií prostaty a 13 případů benigní hyperplasie prostaty (BPH), P504S vykazuje silné cytoplasmické glanulární zabarvení v 64/65 (98,5 %) PC v prostatektoffliích a 26/26 (100 PC v biopsiích prostaty. P504S se zbarví silně a difuzně v karcinomech (4+ v 91,2 % případů PC; 3+ ve 5,5 %; 2+ ve 2,2 % a 1+ ve 1,1 %) a prostatické intraepithe1 iální neoplasii vysokého stupně (4+ ve všech případech). Exprese P504S se nemění s Glesonovým skórem. Pouze 17/91 (18,7 %) v případech NP/BPH kolem PC a 2/13 (15,4 %) případů BPH je fokálně (1+, ne 2+ až 4+ ve všech případech) a týdně pozitivní pro P504S ve velkých žlázách. Exprese P5O4S není v malých altrofických žlázách, v prostatropické hyperplasii, v hyperplasii bazálních buněk a v metaplasii transitních buněk v každé biopsii nebo prostatektomii. P504S se tedy jeví jako přeexpresovaná ve všech Gleasonových skórech rakoviny prostaty (98,5 až 100 % citlivosti) a vykazuje jen fokální pozitivity ve velkých normálních žlázách v případech 19/104 (82,3% specifičnost). Tyto poznatky naznačují, že P504S může být s úspěchem použito k diagoze rakoviny prostaty.

Příklad 19

Charakterizace exprese buněčného povrchu a umístění chromosomů antigenu P501S specifického pro prostatu

Tento příklad popisuje studie dokládající, že antigen P501S, specifický pro prostatu, je expresován na povrchu buněk, spolu se studiemi k určení pravděpodobného chromosomálního umístění P501S.

Podle předpovědi má P501S (SEQ ID NO: 113) 11 transmembránových domén. Na základě objevu, že epitop poznaný anti-P501S monoklonální protilátkou 10E-G4-D3 (popsaný v příkladu 17) je intracelulární, se předpokládá, že následné transmem£18 í bránové determinanty by umožňovaly předpovědět extracelulární domény P501S. Na obr. 9 je schematicky znázorněn protein P5O1S vykazující předpověděné umístění transmembránových domén a intrace1ulárního epitopu, popsaného v příkladu 17. Podtržené sekvence představuj í předpověděné transmembránové domény, tučně vytištěné sekvence představují předpověděné extracelulární domény a kurzivou vyznačené sekvence představují předpověděné intracelulární domény. Sekvence podtržená i tučně vytištěná je sekvencí použitou ke generování polyklonálního králičího séra. Umístění transmembránových domén bylo předpověděno za použití HHMTOP, který popsali Tusnady a Simon (Principles Governing Amino Acid Composition of Integrál Membrane Proteine: Application to Topology Prediction, J. Mol. Biol. 283, str 489 až 506, 1998).

Podle obr. 9 je předpověděno, že doména P501S olemovaná transmembránovými doménami odpovídajících aminokyselin 274 až 295 a 323 až 342 je extracelulární. Peptid SEQ ID NO·' 518 odpovídá aminokyselinám 306 až 320 P501S a leží v předpověděné extracelulární doméně. Peptid SEQ ID NO: 519, který je totožný s peptidem SEQ ID N0= 518, s výjimkou substituce histidinu aspargininem, je syntetizován, jak popsáno shora. Cys-Gly je přidán do C-konce peptidu k usnadnění konjugace na nosičový protein. Odštěpení peptidu od pevného nosiče se provede pomocí následující štěpné směsi ^: kyselina tri f luoroctová: ethandiol ·' thioanisol : voda 'fenol ( 40 = 1 ·' 2 : 2 3. ) . Po dvouhodinovém štěpení se peptid vysráží do studeného etheru. Peptidová peleta se rozpustí v objemově 10% kyselině octové a lyofilizuje se před vyčištěním Cl8 reverzní fázovou chromatografií HPLC. Gradientu 5 až 60 % acetonitrilu (obsahujícího 0,05 % trifluoroctové kyseliny) ve vodě (obsahující 0,05 % trifluoroctové kyseliny) se použije k eluování peptidu. Čistota peptidu se ověří chromatograf i í HPLC a hmotovou spektrometrií a je >95%. Vyčištěného peptidu se použije k vytvoření králičího polyklonálního antiséra, jak shora popsáno.

Povrchová exprese P501S se zkoumá analýzou FACS. Buňky se vybarví séreffi polyklonálního peptidu anti-P501S při 10 jug/ml, promyji se, inkubují se sekundární FITC-konjugovanou kozí anti-králičí lg protilátkou (ICN), promyji se a zjišťuje se fluorescence FITC fluorescencí aktivovaným třídičem buněk Excalibur. Pro analýzu FACS transdukovaných buněk se B-LCL retrovirově transdukuji s P501S. K doložení specifičnosti těchto testů, se paralelně vybarví B-LCL transdukovaný nebo netrandukovaný irelevantním antigenem (P703P). Pro analýzu FACS linií buněk nádoru prostaty se použije Lncap, PC-3 a DU-145. Linie buněk nádoru prostaty se disociují z destiček tkáňové kultury za použití prostředí buněčné disociace a vybarví se jako shora. Všechny vzorky se zpracují před analýzou FACS propidiumjodidem (PJ) a získají se údaje z PJ-vyloučených buněk (tedy nedotčených a neperffleabi1izovaných). Zjišťuje se, že králičí polyklonální sérum, vytvořené proti peptidu SEQ ID NO·’ 519, specificky pozná povrch buněk transdukovaných k expresí P501S, což dokládá, že epitop, poznaný polyklonálním séreffi, je extracelulární.

K biochemickému zjištění, zda je P501S expresován na povrchu buněk, se izolují membrány z buněk Lncap a podrobí se analýze Western blot. Specificky se buňky Lncap lyžují za použiti hofflogenizeru v 5 ml homogenizačního pufru (250 mM sacharózy, 1O mM HEPES, 1 mM EDTA, hodnota pH 8,0, 1 úplná tableta inhibitoru proteázy (Boehringer Mannheim)). Lyzátové vzorky se a

odstřeďuji při 1000 g 5 minut při teplotě 4 C. Supernatant se pak odstřeďuje při 8000 g 10 minut při teplotě 4 C. Supernatant z odstředění při 8000 g se získá a odstřeďuje se při 100 000 g 30 minut při teplotě 4 C k získáni povrchové membrány. Vzorky se oddělí SDS PAGE a podrobí se analýze Western blot s myší monoklonální protilátkou 10E3-G4-D3 (popsané v příkladu 17) za shora popsaných podmínek. Rekombinantní vyčištěné P501S a buňky HEK293, transfektované nadměrně expresu- 220 4, ',-, '-->χ ^^^fe-w-^iweí^s^rtjř&é^ig^p^iey^.-hats®^ jícím F501S, se začlení jako pozitivní kontroly k detekci P501S. Jako negativní kontrola se zařadí lyzát buněk LCL. P501S mohl být zjištěn v totálním buněčném lyzsátu Lncap, ve frakci 8000 g (vnitřní membrány) a také ve frakci 100 000 g (plasma membrány). Výsledky naznačují, že P501S je expresován při a lokalizován na vnější membráně.

K předvedení, že králičí polyklonální sérum, vytvořené peptidem SEQ ID NO = 519, specificky pozná tento peptid, stejně jako odpovídající nativní peptid SEQ ID N0 = 518, se provedou analýzy ELISA. K těmto analýzám se 96-důlkové mikrodestíčky s důkly s plochým dnem povléknou buď peptidem SEQ ID NO: 519, delším peptidem SEQ ID NO: 520, který zaujímá celou předpověděnou extracelulární doménu, peptidem SEQ ID NO: 521, který představuje epitop poznaný protilátkou 10E3-G4-D3 specifickou pro P501S, nebo fragmentem P501S (odpovídajícím aminokyselinám 355 až 526 SEQ ID NO: 113), který nezahrnuje imunizující peptidovou sekvenci, při 1 yg/ml po dobu dvou hodin při teploo tě 37 C. Důlky se odsají, blokují se fosfátem pufrovanou solankou obsahující 1 % (hmotnost/objem) BSA dvě hodiny při teplotě místnosti a pak se promyjí PBS obsahujícím 0,1 % Tweenu 20 (PBST). Přidá se vyčištěné anti-P501S polyklonální králičí sérum ve dvou zředěních (1000 ng až 125 ng) v PBST a ínkůbují se 30 minut při teplotě místnosti. Následuje šestinásobné promytí PBST a inkubace s HRP-konjugováným kozím anti-králičím fragmentem lgG (H+L) Affinipure F(ab ) při 1=20 000 po dobu 30 minut. Dětičky se promyjí a inkubují se 15 minut v tetraměthylbenzidinu. Reakce se ukončí přísadou IN kyseliny sirové a buňky se čtou čtecím zařízením destiček ELISA. Jak patrno z obr. 11, pozná polyklonální králičí sérum anti-P501S specificky peptid SEQ ID NO: 519 použitý k imunizaci stejně jako delší peptid SEQ ID NO: 520, nepozná však irelevanní peptidy a fragmenty odvozené z P501S.

V dalších studiích se králíci imunizují peptidy odvozenými

- 221 ze sekvence P5O1S a určí se, že jsou extracelulární nebo intracelulární, jak patrno z obr. 9. Polyklonální králičí séra se izolují a polyklonální protilátky v séru se vyčistí, jak shora popsáno. Ke zjištění specifické reaktivity s P501S se použije analýzy FACS, za použití buď B-LCL transdukované s P501S nebo irelevantní ního antigenu P703P, B-LCL infikovaného virem kravských neštovic expresujíci» P501S. K povrchové expresi se z analýzy vyloučí mrtvé nebo neintaktní buňky, jak shora popsáno. Pro intracelulární zabarvení se buňky fixují a permeabi1izují se, jak shora popsáno. Králičí polyklonální sérum, generované proti peptidu SEQ ID NO: 548, který odpovídá aminokyselinám 181 až 198 P501S, pozná povrchový epitop P501S. Králičí polyklonální sérum generované proti peptidu SEQ ID N0 = 551, který odpovídá aminokyselinám 543 až 553 P501S, pozná epitop, který byl potenciálně extracelulární nebo intracelulární, protože v různých pokusech byly intaktní nebo permeabi1izované buňky poznány polyklonálními séry. Na základě dedukce mohou být sekvence SEQ ID NO: 541 až 547, 549 a 550, které odpovídají aminokyselinám 109 až 122, 539 až 553, 509 až 520, 37 až 54, 342 až 359, 295 až 323, 217 až 274, 143 až 160 a 75 až 88 P501S, považovány za potenciální povrchové epitopy P501S poznané protilátkami.

V dalších studiích se pěstují myší monoklonální protilátky proti aminokyselinám 296 až 322 až P521S, jež jsou podle předpovědi v extracelulární doméně. Imunizují se myši A/J adenovirem P501S následně dalším posíleným rekombinantním proteinem E.coli, označeným P501N, který obsahuje aminokyseliny 296 až 322 P501S a peptidem 296 -322 (SEQ ID NO: 755) kopulovaným s KLH. Myší se pak použije pro fúze B buněk sleziny k vytvoření anti-peptidových hybridomů. Výsledné tři klony, označené 4F4 (IgGl, kapa), 4G5 (IgG2a, kapa) a 9B9 (IgGl, kapa) se pěstují k produkci protilátky. 4G5 mAb se vyčistí průchodem supernatantu přes sloupec Protein A-sefarosy s následnou elucí protilátky za použití glyci nu 0,2M, hodnota pH 2,3. Vyčištěná

- 222 hodnota pH 8 protilátka se neutralizuje přísadou 1M Tris HC1, a pufr se změní na PBS.

Pro analýzu ELISA se povléknou 96-důlkové mikrodestičky peptidem P501S 296-322 (nazvaným dlouhý P501), irelevantním peptidem P775, P501S-N, P501TR2, P501S-dlouhým-KLH, peptidem P501S 306 aš 319 (nazvaným krátký) P501-KLH nebo irelevantním peptidem 2073-KLH, všemi v koncentraci' 2 ug/ml a inkubují se a

minut při teplotě 37 C. Po povléknutí se destičky promyjí 5X PBS + O, 1 % Tweenu a blokují se PBS, 0,5 % BSA, O,4 % Tweenu 20 dvě hodiny při teplotě místnosti. Po přísadě supernatantů nebo vyčištěných mAb, se destičky inkubují 60 minut při teplotě místnosti. Destičky se pak promyjí a přidá se oslí anti-myší IgHRP vázaná druhá protilátka a inkubuje se 30 minut při teplotě místnosti s následných konečným promytím, jak shora uvedeno. Přidá se TMB peroxidázový substrát a inkubuje se ve tmě 15 minut při teplotě místnosti. Reakce se ukončí přidáním IN kyseliny sírové a OD se odečtě při 450 nM. Ve všech třech hybridních klonech jsou sekretovány mAb, které poznají peptid 296 aš 322 a rekombinantní protein P501N.

Pro analýzu FACS se buňky HEK293 přechodně transfektuj í s expresními konstrukty P501S/VR1012 s poušitím reakčního činidla Fugene 6. Po dvoudenní kultivaci se buňky sklidí a promy jí , načeš se inkubuj! s vyčištěným 4G5 mAb 30 minut na ledu. Po několika promytích PBS, 0,5% BSA, 0,01% azidem se k buňkám přidá kozí anti-myší Ig-FITC a inkubuje se 30 minut na ledě. Buňky se promyjí a resuspendují v promývacím pufru obsahujícím 1 % propidiumjodidu a podrobí se analýzám FACS. Tyto analýzy potvrzují, še aminokyseliny 296-322 P501S jsou v extracelulární doméně a jsou expresovány na povrchu buněk.

Chromosomální umístění P501S se stanoví pomocí Gene-Bridge 4 Radiation Hybrid panelu (Research Genetics). Primerů PCR SEQ ID NO: 528 a 529 se poušije v PCR se soubory DNA z hybridového

- 223 panelu podle instrukcí výrobce. Po 38 zesilovacích cyklech se produkty reakce oddělí na 1,2% agarový gel a výsledky se analyzují web sereverea Whitehead Institute/MIT Center for Genoae Research (http./www-genome. wi.mít.edu/cgi-bin/contig/rhmapper. pl) k určení pravděpodobného umístění chromosoaů. Tímto přístupem je P5O1S mapován na dlouhém raménku chroaosomu 1 při WI-9641 mezi q32 a q42, Tato oblast chroaosomu 1 byla vázána na náchylnost k rakovině prostaty v dědičné rakovině prostaty (Smith a kol. Science 274, str. 1371 až 1374, 1996 a Berton a kol. (A. J. Hum. Genet. 62, str. 1416 až 1424, 1998). Tyto výsledky naznačují, že P501S mít úlohu ve zhoubné rakovině prostaty.

Příklad 20

Regulace exprese pro prostatu specifického anti genu P5O1S

Steroidní (androgenové) hormonální modulace je známým zpracováním modality rakoviny prostaty. Už dříve byla předvedena exprese řady antigenů specifických pro prostatovou tkáň odpovídajících androgenu. Odezva antigenu P501S specifického pro prostatu na zpracování androgenem se zkoumá v systému tkáňové kultury takto^:

Buňky z buněčnéé linie LNCaP nádoru prostaty se nanesou při 1,5 xlO⁶ buněk/T75 baňku (pro izolaci RNA) nebo 3xl0⁵buněk/důlek šestidůlkové destičky (pro analýzu FACS) a nechají se růst přes noc v prostředí RPMI 1640 obsahujícím 1O % na uhlí stripováného zárodečného telecího séra (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Buněčná kultura zůstává po dalších 72 hodin v prostředí RPMI 1640 obsahujícím 10 % na uhlí stropovaného zárodečného telecího séra s 1 nM syntetického androgen Methyl trienolonu (R1881: New England Nuclear) přidávaného v různých časových intervalech. Buňky se sklidí k izolaci RNA a provede se analýza FACS 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 28 a 72 hodin

Ur » r! LS-. «. „ » v , Μ. i- ·»->»Λ> _v

224 po přidání androgenu. Analýza FACS se provede s použitím anti-P501S protilátky 1OE3-G4-D3 a permeabi1izovaných buněk.

Pro Northern analýzu se ponechá 5-10 mikrogramů celkové RNA na formaldehydem denaturovaném gelu, přenese se na Hybond-N nylonovou membránu (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), zesítí se a vybarví metylenovou modří. Filtr se pak prehybridizuje Churchovým pufrem (250 mM fosforečnanu sodného, 70 mM kyseliny fosforečné, 1 mM EDTA, 1 % SDS, 1 % BSA při hodnotě pH 7,2) jednu hodinu při teplotě 65 C. P501S DNA se značí 32P značkovací soupravou High Prime random-primed DNA (Boehringer Mannheim). Jednotně provedená značka se odstraní použitím sloupců MicroSpin S300-HR (Amersham Pharmacia Biotech). Filtr RNA se hybridizuje přes noc s čerstvým Churchovým pufrem, obsahujícím značenou cDNA, promyje se IX SCP (O,1M chloridu sodného, O,03M peptahydrátu dinatriumhydrogenfosforečnanu 0,001 M dinatriufflEDTA), s 1 % sarkosylu (n-lauroylsarkosin) a exponuje se na rentgenový film.

Oběma zkouškami, FCS a Northern analýzou je zjištěno, že poselství P501S a hladiny proteinů se zvyšují v odezvě na zpracování androgenem.

Příklad 20a

Příprava fuzních proteinů antigenů specifických pro prostatu

Příklad popisuje přípravu fúzního proteinu anti genu P703P specifického pro prostatu a zkomolené formy známého prostatového antigenu PSA. Zkomolená forma PSA má 21 aminokyselin rozdělených kolem aktivního seri nového místa. Expresní konstrukt pro fúzní protein má také restrikční místo na 3 konci, těsně před ukončovacím kodonem, aby napomohl přidání cDNA pro přídavné anti geny.

-,225 ,cDNA plné délky pro PSA se získá RT-PCR ze souboru RNA z lidských tkání nádoru prostaty za použití primerů SEQ ID NO: 607 a 608, a klonuje se do vektoru pCR-Blunt II-TOPO. Výsledmé cDNA se použije jako matrice k získání dvou různých fragmentů PSA za použití PCR se dvěma sadami primerů (SEQ ID NO: 609 a 610: a SEQ ID NO: 611 a 612). Produktů PCR, majících očekávanou velikost, se použije jako matric k získání zkomolené formy PSA za použití PCR s primery SEQ ID NO: 611 a 613, které generují PSA (delta 208 až 218 v aminokyselinách). cDNA pro zralou formu P703P s 6X histidinovým značením na 5 konci se připraví PCR s P703P a primery SEQ ID NO: 614 a 615. cDNA pro fúzi P703P se zkomolenou formou PSA (označená FOPP) se pak získá PCR s použitím modifikované P703P cDNA a zkomolené formy PSA cDNA jako matric a primeů SEQ ID NO: 614 a 615. FOPP cDNA se klonuje do místa Ndel a Xhol expresního vektoru pCRXl a potvrdí se sekvencováním DNA. Určená sekvence cDNA pro fúzní konstrukt FOPP je v SEQ ID NO: 616 a sekvence aminokyselin je v SEQ ID NO: 617.

Fúze FOPP se expresuje jako samotný rekombinantní protein v E.coli následujícím způsobem: Expresní plasmid pCRXlFOPP se transformuje do kmene E.coli BL21-CodonPlus RIL. Ukazuje se, že transformant expresuje protein FOPP za indukce s lmM IPTG. Kultura odpovídajícího expresního klonu se naočkuje do živného prostředí 25 ml LB obsahujícího 50 ug/ml kanamycinu a 34 ug/ml chloramfenikolu, nechá se růst přibližně 1 hodinu při teplotě 37 C na 0D600 přibližně 1 a uloží se přes noc při o

teplotě 4 C. Kultura se zředí v 1 litru TB LB obsahujícím 50 ug/ml kanamycinu a 34 ug/ml chloramfenikolu a nechá se růst při teplotě 37 C 0D600 0,4. Přidá se IPTG na konečnou končene traci 1 mM a kultura se inkubuje 3 hodiny při teplotě 30 C. Buňky se peletují odstřeďováním 8 minut při 5 000 otáčkách za minutu. K vyčištění proteinu se buněčná peleta suspenduje v 25 ml 10 mM Tris HC1, hodnota pH 8,0, 2 mM PMSF, v úplném proteázovém inhibitoru a v 15 ug lysozymu. Buňky se lyžují 30 minut

- 226 cDNA plné délky pro PSA se získá RT-PCR ze souboru RNA z lidských tkáni nádoru prostaty za použití primeru SEQ ID NO·' 607 á 608, a klonuje se do vektoru pCR-Blunt II-TOPO. Výsledmé cDNA se použije jako matrice k získání dvou různých fragmentů PSA za použití PCR se dvěma sadami primerů (SEQ ID NO: 609 a 610; a SEQ ID NO·' 611 a 612) . Produktů PCR, majících očekávanou velikost, se použije jako matric k získání zkomolené formy PSA za použiti PCR s primery SEQ ID N0= 611 a 613, které generují PSA (delta 208 až 218 v aminokyselinách). cDNA pro zralou formu P7O3P s 6X histidinovým značením na 5 konci se připraví PCR s P703P a primery SEQ ID NO ' 614 a 615. cDNA pro fúzi P703P se zkomolenou formou PSA (označená FOPP) se pak získá PCR s použitím modifikované P703P cDNA a zkomolené formy PSA cDNA jako matric a primeů SEQ ID NO: 614 a 615. FOPP cDNA se klonuje do místa Ndel a Xhol expresního vektoru pCRXl a potvrdí se sekvencováním DNA. Určená sekvence cDNA pro fúzní konstrukt FOPP je v SEQ ID NO: 616 a sekvence aminokyselin je v SEQ ID NO: 617.

Fúze FOPP se expresuje jako samotný rekombinantní protein v E.coli následujícím způsobem: Expresní plasmid pCRXlFOPP se transformuje do kmene E.coli BL21-CodonPlus RIL. Ukazuje se, že transformant expresuje protein FOPP za indukce s lmM IPTG. Kultura odpovídajícího expresního klonu se naočkuje do živného prostředí 25 ml LB obsahujícího 50 ug/ml kanamycinu a 34 ug/ml chloramfeníkolu, nechá se růst přibližně 1 hodinu při o

teplotě 37 C na OD6OO přibližně 1 a uloží se přes noc při o

teplotě 4 C. Kultura se zředí v 1 litru TB LB obsahujícím 50 ug/ml kanamycinu a 34 ug/ml chloramfeníkolu a nechá se růst při teplotě 37 C 0D600 0,4. Přidá se IPTG na konečnou končene traci 1 mM a kultura se ínkubuje 3 hodiny při teplotě 30 C. Buňky se peletují odstřeďováním 8 minut při 5 000 otáčkách za minutu. K vyčištění proteinu se buněčná peleta suspenduje v 25 ml 10 mM Tris HC1, hodnota pH 8,0, 2 mM PMSF, v úplném proteázovém inhibitoru a v 15 ug lysozymu. Buňky se lyžují 30 minut

- 227 l ) ·' i ) při teplotě 4 C, několikrát se prozvučí a lyzát se odstřeďuje 30 minut při 10 000 g. Sraženina, která obsahuje vměstky, se promy je dvakrát 10 mil Tris HC1, hodnota pH 8,0 a 1% CHAPS. Vměstky se rozpustí ve 40 ml 10 mM Tris HC1, hodnota pH 8,0, 100 mM fosforečnanu sodného a 8 M močoviny. Roztok se váže na 8 ml NiNTA (Qiagen) jednu hodinu při teplotě místnosti. Směs se vlije do 25 ml válce a promyje se 50 ml 10 mM Tris HC1, hodnota pH 6,3, 100 mM fosforečnanu sodného, 0,5 % DOCV a 9M močoviny. Vázaný protein se zředí 350 mM imidazolu, 10 mM Tris HC1, hodnota pH 8,0, 100 mM fosforečnanu sodného a 9M močoviny. Frakce, obsahující proteiny FOPP, se kombinují a dialyžují extensivně proti podílu 10 mM Tris HC1, hodnota pH 4, 6 a uloží o

se při teplotě -70 C.

Příklad 21

Charakterizace reál time PCR antigenu P501S specifického pro prostatu v periferní krvi pacientů s rakovinou prostaty

Cirkulační epithelové buňky se izolují z čerstvé krve normálních jedinců a pacientů s metastázami rakoviny prostaty, isoluje se mRNA a připraví se cDNA s použitím procesů reál time PCR. PCR reál time se provede Taqmanovým™ způsobem s použitím jak gen specifických primerů tak sond ke stanovení úrovně genové exprese.

Epithelové buňky se obohatí z krevních vzorků s použitím separační metody imunomagnetických perel (Dynal A.S. Oslo, Norsko), Izolované buňky se lyžují a magnetické perly se odstraní . Lysát se pak zpracuje pro A+mRNA isolaci pomocí magnetických perel povlečených 01igo(dT)25. Po promytí perel pufrem se vzorky perel/póly A+RNA suspendují v 10 mM Tris HC1, hodnota pH 8,0, a podrobí se reversní transkripci. Výsledná cDNA se podrobí PCR reál time s použitím gen specifických primerů. Obsah beta-aktinu se stanoví také a použije se k normalizaci.

²²⁸ Vzorky s kopiemi P5Q1S většími než je střed normálních vzorků + 3 směrodatné odchylky se požadují za pozitivní. Reál time PCR vzorků krve se provede způsobem Taqman™, avšak rozšíří se na 50 cyklů s použitím dopředných a reversních primerů a sond specifických pro P501S. Z 8 testovaných vzorků je 6 pozitivních pro P501S a β-aktinový signál. Zbývající 2 vzorky nemají zjistitelný 0-aktin nebo P501S. Žádný signál P501S není pozorován u 4 testovaných vzorků normální krve.

Příklad 22

Exprese antigenů P703P a P501S specifických pro prostatu v SCID Mouše-Passaged nádorech prostaty

Při uvažování účinnosti antigenů v léčení nádorů prostaty je významná pokračující přítomnost antigenů v nádorech během terapie adrogenové ablace. Přítomnost antigenů P703P a P501S specifických pro prostatu ve vzorcích nádorů prostaty pěstovaných v myši SCID v přítomnosti testosteronu se hodnotí následuj i c i m způsobem:

Dva prostatové nádory, které metastázovaly na kostí, se pacientům odejmuly, implantovaly se myši SCID a nechaly se růst v přítomnosti testosteronu. Nádory se hodnotí z hlediska exprese mRNA P7O3P, P501S a PSA pomocí kvantitativní PCR reál time způsobem zeleně SYBR, Exprese P703P a P501S v nádoru prostaty je použito jako positivní kontroly a nepřítomnosti v normálním tenkém střevu a v normálním srdci jako negativních kontrol. V obou případech je specifická mRNA přítomna v nádorech latě passage. Jelikož kostní metastázy rostly v přítomnosti testosteronu, znamená to, že přítomnost těchto genů by nebyla ztracena během ablační androgenové terapie.

Příklad 23

- 229 , ) >

Monoklonálη i protilátka anti-P503S inbibuje růst nádoru in vivo

Schopnost monoklonální protilátky anti-P503S 20D4 potlačovat tvoření nádoru v myši se zkoumá následujícím způsobem:

Deseti myším SCID se súbkutánně injektují buňky HEK293, které potlačují P503S. Pět myší dostane intravenosně v den O 150 jjg 20D4 (doba injektování nádorové buňky), v den 5 a den

9. Velikost nádoru se měří 50 dní. Pět myší, které nedostaly 20D4, vykazuje po přibližně dvou týdnech zjistitelné nádory, které se zvětšují během studie. Na rozdíl od toho, nevytvořily se nádory u žádné z pěti myší, které dostaly 20D4. Tyto výsledky dokládají, že anti-P503S Mab 2OD4 vykazuje mocnou protinádorovou aktivitu in vivo.

Příklad 24

Charakterizace T-buněčného receptorového klonu z T-buněčného klonu specifického pro P5O1S

T buňky mají krátkou životnost. Avšak klonování řetězců receptoru T buněk (TCR) a následný přenos podstatně usnadňuje nekonečné šíření specifičnosti T buněk. Klonování tumor-antigenových TCR řetězců umožňuje přenos specifičnosti do T buněk izolovaných od pacientů, kteří se podílejí na TCR MHC-restrikční alele. Takové T buňky se pak mohou prodlužovat a použít v adoptivních přenosových místech k zavedení specifičností nádorového antigenu do pacientů majících nádory, které expresuji antigen. Alfa a beta-řetězce receptoru T buněk z CD8 klonu T buněk specifické pro antigen P501S specifický pro prostatu se isolují a sekvencuji následujícím způsobem:

Pomocí Trisolového reakčního činidla se izoluje celková mRNA od 2xl0⁶ buněk z CTL klonu 4E5 (popsaného v příkladu 12) a syntetizuje se cDNA. Ke stanovení sekvencí Va a Vb v tomto

23Q -,, klonu se syntetizuje panel Va a Vb subtyp-specifických primerů a použije se v reakcích RT-PCR s cDNA vytvořenou z každého z těchto klonů. Reakce RT-PCR ukazují, že každý z těchto klonů expresuje společnou sekvenci Vb, která odpovídá podrodině Vb7. Kromě toho, za použití cDNA, vytvořené z toho klonu, je expresovaná sekvence Va určena jako Va6. Ke klonování a a β-řetězců z klonu 4E5, jsou určeny primery, které zahrnují inhibitor a termínátor-kódující TCR nukleotidy. Jde o tyto primery: TCR Valfa-6 5 (mající smysl)= GGATCC-GCCGCCACC-ATGTCACTTTCTAGCCTGCT (SEQ ID N0^: 756) BamHI místo Kozák TCR alfa sekvence TCR alfa 3' (antimediátorové “antisense) GTCGACTCAGCTGGACCACAGCCGCAG (SEQ ID NO:757) Sáli místo TCR alfa konstantní sekvence TCR Vbeta-7. 5' (mající smysl):GGATCC---GCCGCCACCATGGGCTGCAGGCTGCTCT (SEQ ID NO: 756) BamHI místo Kozák TCR alfa sekvence TCR a 3' (antimediátorové) GTCGAC--TCAGCTGGACCACAGCCGCAG (SEQ ID NO 757) Sall místo TCR alfa konstantní sekvence TCR Vbeta-7. 5' (mamající smysl)GGATCC---GCCGCCACC--ATGGGCTGCAGGCTGCTCT (Seq

ID NO: 785 BamHI místo Kozák TCR alfa sekvence TCR beta 3' (antimediátorové) GTCGAC---TCAGAAATCCTTTCTCTTGAC (Seq IC NO: 759) Sall místo TCR beta konstantní sekvence. Standardních 35 cyklů reakcí RT-PCR se ustavilo za použití cDNA syntetizované z klonu CTL a shora uvedených primerů, za použití čtecí termostabilní polymerázy PWO (Roche, Nutley, NJ).

Výsledné specifické pruhy (přibližně 850 párů bází pro alfa a přibližně 950 pro beta) se vážou do PCR tupého vektoru (in vitro gen) a transformují se do E.coli. E.coli transformovaná plasmidy, obsahujícími alfa a beta řetězce plné délky se idena vytvoří se velká řada prostředků odpovídájících ti f ikuj í plasmidů.

Plasmidy obsahující TCR alfa a beta řetězce plné délky se podrobí sekvencování. Sekvenční reakce ukázaly klonování plné délky TCR alfa a beta řetězců se stanovenými cDNA sekvencemi pro řetězce Vb a Va uvedené v SEQ ID NO: 760 a 761. Odpovídající amidokyse1 inové sekvence jsou v SEQ ID NO: 762 a 763. Zjišťuje se, že Va sekvence seřazením sekvence nukleotidů

- 231 ,_r je z 99 % totožná (347/348) s Va6.2 a Vb je totožná z 99 % s Vb7 (336/338).

Z uvedeného je zřejmé, že ačkoli specifická provedení jsou zde popsána pro ilustraci, jsou možné modifikace aniž se odchýlí od ducha a rozsahu vynálezu. Vynález je tedy neomezený s výjimkou uvedených patentových nároků.

Průmyslová využitelnost

Polypeptidy, obsahující alespoň porci proteinu specifického pro prostatu a polynukleotidy kódujících takové polypeptidy pro výrobu farmaceutických prostředků k diagnostice a léčení rakoviny zvláště rakoviny prostaty.

JlíDr. Petr Kaienský advokát

A PARTNEŘI ^KY ¹²⁰ 00 Praha 2, Hůlková 2 Česká republika

Claims

PATENTOVÉ

OKY

1. Isolovaný polynukleotid obsahující sekvenci vybranou se souboru zahrnujícího (a) sekvence v SEQ ID NO: 1 aš 111, 115 aš 171, 173 aš

175, 177, 179 aš 305, 307 aš 315, 326, 328, 330, 332 aš 335,

340 aš 375, 381, 382 a 384 aš 476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 až 572, 587, 591, 593 aš 606, 618 aš 626, 630, 631, 634, 636, 639 aš 655, 674, 680, 681, 711, 713, 716,

720 aš 722, 735, 737 aš 739, 751, 753, 764, 765, 773 aš 776 a

786 až 788, (b) koraplementy sekvencí v SEQ ID NO: i aš 111, 115 aš 171,

173 aš 175, 177, 179 aš 305, 307 aš 315, 326, 328, 330, 332 aš 335, 340 aš 375, 381, 382 a 384 aš 476, 524, 526, 530, 531,

533, 535, 536, 552, 569 aš 572, 587, 591, 593 aš 606, 618 aš

626, 630, 631, 634, 636, 639 aš 655, 674, 680, 681, 711, 713,

716, 720 až 722, 735, 737 aš 739, 751, 753, 764, 765, 773 aš

776 a 786 aš 788, (c) sekvence sestávající z alespoň 20 přilehlých zbytků ze sekvence v SEQ ID NO: 1 aš 111, 115 aš 171, 173 aš 175, 177, 179 aš 305, 307 aš 315, 326, 328, 330, 332 aš 335, 340 aš 375, 381, 382 a 384 aš 476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 aš 572, 587, 591, 593 aš 606, 618 aš 626, 630, 631, 634, 636, 639 aš 655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720 aš 722, 735, 737 až 739, 751, 753, 764, 765, 773 aš 776 a 786 aš 788, (d)

1 až 326, 524, 593 sekvence, které hybridizují na sekvenci v SEQ ID NO: lil, 115 aš 171, 173 aš 175, 177, 179 aš 305, 307 aš 315, 328, 330, 332 aš 335, 340 aš 375, 381, 382 a 384 aš 476, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 aš 572, 587, 591, aš 606, 618 aš 626, 630, 631, 634, 636, 639 aš 655, 674,

680, 681, 711, 713, 716, 720 až 722, 735, 737 aš 739, 751, 753, 764, 765, 773 aš 776 a 786 aš 788 za mírně přísných podmínek, (e) sekvence mající alespoň 75% identitu k sekvencí SEQ ID NO:

1 až lil, 115 aš 171, 173 aš 175, 177, 179 aš 305, 307 aě 315, 326, 328, 330, 332 aš 335, 340 aš 375, 381 , 382 a 384 aš 476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 aš 572, 587, 591,

593 až 606, 618 aš 626, 630, 631, 634, 636, 639 až 655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720 aš 722, 735, 737 aš 739, 751, 753, 764, 765, 773 aš 776 a 786 aš 788, (f) sekvence mající alespoň 90% identitu k sekvenci SEQ ID N0= 1 aš 111, 115 aš 171, 173 aš 175, 177, 179 aš 305, 307 aš 315, 326, 328, 330, 332 aš 335, 340 aš 375, 381, 382 a 384 aš 476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 aš 572, 587, 591, 593 aš 606, 618 aš 626, 630, 631, 634, 636, 639 aš 655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720 aš 722, 735, 737 aš 739, 751, 753, 764, 765, 773 aš 776 a 786 aš 788,

<g> generované varianty sekvence v SEQ ID NO: 1 aš 111, 115 aš 171, 173 aš 175, 177, 179 aš 305, 307 aš 315, 326, 328, 330, 332 aš 335, 340 aš 375, 381, 382 a i 384 aš 476, 524, 526, 530, 531 , 533, 535, 536, 552, 569 aš 572, 587, 591 , 593 aš 606, 618 aš 626, 630, 631, 634, 636, 639 aě 655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720 aš 722, 735, 737 aš 739, 751, 753, 764, 765, 773 aš 776 a 786 aš 788.
2. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou se souboru zahrnujícího

(a) sekvence v SEQ ID NO: 112 aš 114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376 aš 380, 383, 477 aš 483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525 , 527, 532, 534, 537 aš 551 , 553 aš 568, 573 aš 586, 588 aš 590, 592, 627 aš 629, 632, 633, 635,

- 23,4

637, 638, 656 aš 671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717 aš 719, 723 aš 734, 736, 740 aš 750, 752, 754, 755, 766 až

772, 777 aš 785 a 789 aš 791, (b) sekvence mající alespoň 70% identitu k sekvenci SEQ

ID NO: 112 aš 114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376 až 380, 383, 477 aš 483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525,

527, 532, 534, 537 aš 551, 553 až 568, 573 aš 586, 588 aš 590,

592, 627 aš 629, 632, 633, 635, 637, 638, 656 aš 671, 675,

683, 684, 710, 712, 714, 715, 717 aš 719, 723 aš 734, 736, 740 aš 750, 752, 754, 755, 766 aš 772, 777 aš 785 a 789 aš 791, (c) sekvence mající alespoň 90% identitu k sekvenci SEQ

ID NO: 112 aš 114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376 aš 380, 383, 477 aš 483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525,

527, 532, 534, 537 aš 551, 553 aš 568, 573 aš 586, 588 aš 590,

592, 627 aš 629, 632, 633, 635, 637, 638, 656 aš 671, 675,

683, 684, 710, 712, 714, 715, 717 aš 719, 723 aš 734, 736, 740 aš 750, 752, 754, 755, 766 aš 772, 777 aš 785 a 789 aš 791, (d) sekvence kódované polynukleotidem podle nároku 1, (e) sekvence mající alespoň 70% identitu k sekvenci kódované po1ynuk1eotidem podle nároku 1, (f) sekvence mající alespoň 90% identitu k sekvenci kódované polynukleotidem podle nároku 1.
3. Expresní vektor obsahující polynukleotid podle nároku 1 operativně vázaný na expresní řídící sekvenci.
4. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfektovaná expresním vektorem podle nároku 3.
5.

Izolovaná protilátka nebo její antigen vázající fragment, která se specificky váže na polypeptid podle nároku 2.
6. Způsob detekce existence rakoviny u pacienta , v y značující se tím, ěe (a) se získá biologický vzorek od pacienta, (b) biologický vzorek se uvádí do styku s vázacím činidlem, které se váže na polypeptid podle nároku 2, (c) zjišťuje se ve vzorku množství polypeptidů vázaného na vázací činidlo, (d) porovnává se množství polypeptidů s předem stanovenou hod notou a z výsledku se stanovuje existence rakoviny u pa cienta.
7. Fúzní protein obsahující alespoň jeden polypeptid podle nároku 2.
8. Fúzní protein podle nároku 7 obsahující sekvenci vybranou ze souboru zahrnujícího (a) sekvence zahrnuté v sekvenci SEQ ID NO: 682, 692, 695,

699, 703 a 709 a (b) sekvence zahrnuté v sekvenci SEQ ID NO: 679, 691, 696,

700, 704 a 708.
9. 01igonukleotid, který hybridizuje na sekvenci uvedné v SEQ

ID NO: 1 až 111, 115 až 171, 173 až 175, 177, 179 až 305, 307 až 315, 326, 328, 330, 332 až 335, 340 až 375, 381, 382 a 384 až 476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569 až 572,

587, 591, 593 až 606, 618 až 626, 630, 631, 634, 636, 639 až 655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720 až 722, 735, 737 až až 788 za mírně

739, 751, 753, 764, 765, 773 až 776 a 786 přísných podmínek.
10. Způsob stimulace a/nebo expanze T buněk specifických pro nádorový protein, vyznačující se tím, Se se T buňky uvádějí do styku s alespoň jednou složkou vybranou ze souboru zahrnujícího (a) polypeptidy podle nároku 2, (b) polynukleotidy podle nároku 1 a (c) antigen poskytující buňky, které expresují polypeptid podle nároku 2, za podmínek dostatečných a po dostatečnou dobu k stimulaci a/nebo k expanzi T buněk.

i
11. Izolovaná T buňková populace obsahující T buňky připravené způsobem podle nároku 1O.
12. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje první složku vybranou ze souboru zahrnujícího fyziologicky přijatelný nosič a imunostimulanty a druhou složku vybranou ze souboru zahrnujícího (a) polypeptidy podle nároku 2, (b) polynukleotidy podle nároku 1, (c) protilátky podle nároku 5, (d) fúzní proteiny podle nároku 7, (e) T buňkovou populaci podle nároku 11 a « b > Λ-nk· ·? «-#>-»»» <·* * e· <,

- 237 -, (f) antigen poskytující buňky, které expresuji polypeptid podle nároku 2.
13. Způsob stimulace imunitní odezvy u pacienta, vyznačující se tím, že se pacientovi podává prostředek podle nároku 12.
14. Způsob ošetřování rakoviny pacienta, vyznačuj ία i se t í m , že se pacientovi podává prostředek podle nároku 12.
15. Způsob zjišťování rakoviny u pacienta, vyznačující se tím, že (a) se získá biologický vzorek od pacienta, (b) biologický vzorek se uvádí do styku s oligonukleotidem podle nároku 9, (c) zjišťuje se ve vzorku množství polynukleotidu, který hybridizuje do oligonukleotídu a (d) porovnává se množství polynukleotidu, které hybridizuje do oligonukleotidu s předem stanovenou hodnotou a z výsledku se stanovuje existence rakoviny u pacienta.
16. Diagnostický kit, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden oligonukleotid podle nároku 9.
17. Diagnostický kit, vyznač uj ící se tím, že obsahuje alespoň jednu protilátku podle nároku 5 a detekční reakční činidlo mající reportérovou skupinu.
18. Způsob inhíbice vývoje rakoviny u pacienta, vyznačující se tím, že .- 238, -., (a) inkubují sé CD4⁺ a/nebo CD8⁺ T buňky, izolované od pacienta, s alespoň jednou složkou vybranou ze souboru zahrnujícího (i) polypeptidy podle nároku 2, ( i i) polynukleotidy podle nároku 1 a (iii) antigen poskytující buňky, které expresují polypeptid podle nároku 2, takže T buňky proliferují a (b) podává se pacientovi účinné množství proliferováných T buněk,