CZ172395A3 - Oligonucleotide and the use thereof - Google Patents
Oligonucleotide and the use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- CZ172395A3 CZ172395A3 CZ951723A CZ172395A CZ172395A3 CZ 172395 A3 CZ172395 A3 CZ 172395A3 CZ 951723 A CZ951723 A CZ 951723A CZ 172395 A CZ172395 A CZ 172395A CZ 172395 A3 CZ172395 A3 CZ 172395A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- oligonucleotides
- myc
- mrna
- complementary
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3517—Marker; Tag
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález je zaměřen na oligonukleotid a jeho použití při modulaci rozrůstání buněk hladkého svalstva protisměrnými terapiemi zaměřenými proti c-myc proto-ontogenu.
f
I i
i)
Dosavadní stav techniky
Koronární angioplastika vede k úspěšné neoperativní revaskularizaci u více než 90 % pacientů. V roce 1990 se v USA provedlo více než 300 000 koronárních angioplastik. Avšak hlavním omezením koronárních angioplastik je 30-40 % podíl restenóz, ke kterým dochází v prvních šesti měsících po zákroku.
Bylo zjištěno, že vaskulární buňky hladkého svalstva (SMC) hrají důležitou roli při vzniku atherosklerózy a restenózy po koronárních angioplástikách. Jejich přítomnost se potvrdila přítomností obou typů poškození a je působena primárně změnou z kontrakčního na syntetický fenotyp SMC. Tato pozoruhodná charakteristika je spojena s množením SMC, migrací z media dovnitř a syntézou mimobuněčné matrice, což vše vede k neointimní tvorbě (zúžujlcí artérii). V protikladu s atherosklerózou, kdy tento proces probíhá během mnoha desetiletí, vaskulární restenóza představuje akutní odpověď na poranění balónkem vrcholící ve významném opětném zúžení neointimní tvorbou původně rozšířené cévy během několika měsí2
V*/ cůJTedy se stalo zřejmé, že inhibice růstu SMC je nezbytná pro kontrolu procesu restenózy. · .
Intenzivní experimentální a klinický .výzkum prevence restenózy se prováděl v uplynulém a desetiletí. Mnoho zákroků, jako terapie protidestičková, protikoagulaéní a vasodilatační, vykázaly příznivé snížení závažnosti neointimního množení po experimentálním poranění balónkem. Powell aj., Science 1989, 245, 186-188, Castellot aj., J. Cell. Physiol. 1985, 124, 21-38, Fox aj., Science 1988, 241,. 453-456.
Nedávno se také dělaly pokusy s použitím nových mechanických zařízení k omezení restenózy (například stent, atherektomie, laser, rotační fréza atd.). Avšak předběžné údaje ukázaly omezený význam těchto zákroků, protože zatím co mechanické intervence zlepšují počáteční výsledek koronární angioplastiky, mechanické techniky zvyšují poranění steny cévy spojené se zákrokem a tedy nejsou schopné snížit množe* ni SMC a podíl restenóz. Dále mechanické zákroky lze použít jen u malých skupin pacientů s optimální koronární anatomií.
*
Rovněž se navrhovalo použití antimitogenní terapie pro prevenci restenózy. Například se zkoušel koncentrovaný heparin jako protirůstové činidlo pro kontrolu problému restenózy po angioplastice. Wolinsky a Thung, JACC, 1990, 15 (2), 475-481. Jako jiné užitečné potenciální terapeutikum pro léčení restenózy byl identifikován gama-interferon. WO 90/ 03189 vydané 5. dubna 1990. Avšak dávka protirůstových činidel daná systémovým podáváním není asi dost vysoká, aby se
'.'dosáhl žádaný účinek.'Tedy · zkoušené, látky ne jsou dosti silné, aby vykázaly blahodárný účinek ve složitějších klinických situacích^ ~~Ύ i , ..
Nedávné pokroky buněčné a molekulární biologie poskytly náhled do molekulárního mechanismu množení SMC, které je působeno přenosem signálů z mimobuněčného okolí (například růstových faktorů) na buněčné jádro. Více genů se přechodně
- aktivuje během fenotypické modulace (Gabbiani aj., J. Clin. Invest. 1984, 73, 148-152, Walker aj., Proč. Nati. Aca. Sci.
USA, 1986, 83, 7311-7315, Miano aj., Am. J. Pathol. 1990,
137, 761-765, Majesky a j., Circulation Research, 1992, 71, 759-768). Tato zjištění stimulovala zájem ..na. definování role abnormálního vyjádření genu při růstu SMC a na vybrání potenciálních cílů terapie pro molekulárně založené .přístupy_____....
ke kardiovaskulárním chorobám, jako je vaskulární restenóza. #
Nedávno Speir a Epstein, Circulation, 1992, 86, 538-547, *
ukázali inhibici růstu buněk hladkéhosvalstva krys s použiť tím vysokých koncentrací protisměrným oligonukleotidem komplementárním k jaderné antigenní mRNA množící se buňky.
Jaderné proto-ontogeny jsou vysoce stabilizované fosfoproteiny úzce vázané k buněčnému množení. Ukázalo se přechodné zvýšeni jaderného(ých) proto-ontogenu(ů) mRNA nás#
- ledující po mitogenní stimulaci při přechodu do . G1 fáze a zdá se být nezbytné pro fázový přechod z G1 fáze do S fáze. Studie pěstovaných SMC ukázaly, že c-fos, c-myc a cmyb proto-ontogeny jsou aktivovány krátce po různých mito4 genní;1 stimulacích (Kindy ;aj.,'J. Biol. , Chem, 1986, 261, 12865-' 12868, Brown·' aj.,J. Biol. Chera, 1992, 267, 46254630). Exprese proto-ontogenů se také indukovala v stěně cévy po obnažení balónkem podle vzoru podobného in vitro studiím (Miamo aj., Am. J. Pathol. 1990, 137, 761-765). Shora uvedená pozorování a redundance cest přenosu signálů ukázaly možnost, že aktivace jaderného proto-ontogenu je konečnou společnou cestou, do které konverguje mnoho různých mitogenních signálů, což z něj dělá možný terapeutický cíl. Collins aj., J. Clin. Invest. 1992, 89, 1523-1527 zjistili, že protisměrné oligonukleotidy komplementární k c-myc inhibují tvorbu buněk karcinomu tlustého střeva. Jiné skupiny se zaměřily na proto-ontogen c-myc a zjistily, že inhibice c-myc inhibuje množení buněk hladkého svalstva. Nedávno Simon a Rosenbérg, Circulation Research, 1992, 70, 835-843, ukázali účinek c-myc protisměrných oligonukleotidů na inhibici růstu krysích buněk hladkého svalstva. Protisměrná technologie se objevuje jako účinný prostředek snižující hladiny produktu specifického genu. Je založená na zjištěních, že tyto protisměrné’' sekvence hybridizují gen nebo připojený cílový polynukleotid za vzniku stálého duplexu nebo triplexu, založeného na Watson- Crickových či Hoogsteenových vazbách. Specificky vázaná protisměrná sloučenina pak buď činí dané cíle citlivější k enzymatické degradaci, přesmyku bloků nebo inhibuje funkci cílového polynukleotidu. Pokud je cílovým polynukleotidem RNA, protis5 měrná sloučenině - hybridižuje na specifické ;.;.RNA transkripty ”'va přerušuje normální zpracování RNA, její stabilitu a translaci, Čímž zabraňuje vyjádření cílového genu.^Ukázalo se, že podávání protisměrných polynukleotidů nebo přenos konstrukcí vyjádření schopných tvořit vnitrobuněčné protisměrné sekvence komplementární k zajímavé mRNA blokuje translaci specifických genů in vitro. Například Holt aj., Mol. Cell Biol. 1988, 8, 963-973, zaměřujíce se na c-myc zjistili tvorbu
-vnitrobuněčný duplex s; cílovou mRNA ,a„selektivní snížení c-myc proteinu v lidských buňkách promyelotické leukemie *
HL-60.
Způsoby modulace množení buněk hladkého.svalstva spojených s restenózou;v jakémkoliv svalovém loži jsou vysoce žádoucí. Takový způsob by měl být aplikovatelný u paqientů majících široký rozsah vaskulárních chorob,. .včetně srdečních a periferních stenóz (například, blokád). Dále by měl být způsob vysoce účinný. Takové způsoby zajišťuje tento vynález.
Podstata vynálezu
Výše uvedené nedostatky do značné míry odstraňuje oligonukleotid, jehož podstata spočívá v tom, je komplementární k oblasti mRNA kódující c-myc, přičemž je dlouhý 10 až 50 nukleotidů a nukleázně rezistentní;
V jiném výhodném provedení tohoto vynálezu se pooužívá oligonukleotid pro přípravu léku pro modulaci rozrůstání buněk lidského hladkého svalstva in vivo.
Popis obrázků na výkresech
Na obrázku 1 je autoradiogram c-myc mRNA u klidné a množící se lidských SMC, elektroforézované v denaturujícím 6 % polyakrylamídovém gelu.
Obr. 2 představuje schematické znázorněni růstových křivek lidských SMC, inkubovaných v 10 mikromol protisměrných c-myc (plné kroužky), stejnosměrných (plné trojúhelníky) a náhodných (prázdné kroužky) oligonukleotidů, přičemž kontrolní buňky (otevřené trojúhelníky) se inkubovaly bez přídavku oligonukleotidů,
Obr. 3 je schematické znázorněni inhibice růstu lid-: ských SMC závislé na dávce po přidání protisměrných c-myc oligonukleotidů. Data představují průměr +/- směrodatná odchylka.
Obrázek 4 je schematické znázornění účinku stejnosměrného oligonukleotidů na inhibici růstu působenou protisměr- ·β nými oligonukleotidy. Procenta inhibice v prvém dni se počítala z trojnásobného opakování. Data představují průměr +/“ směrodatná odchylka.
Na obrázku 5 je autoradiogram gelu c-myc mRNA z lidských SMC ošetřených protisměrným a stejnosměrným oligonukleotidem, elektroforézovaným v denaturujícím 6 % polyakrylamidovém gelu. C: kontrola (bez oligonukleotidů) S: c-myc stejnosměrné oligonukleotidy (10 mikromol), A: c-myc protisměrné oligonukleotidy (10 mikromol).
Obrázek 6 je schematické znázornění vnitrobuněčné akumulace oligonukleotidů v lidských SMC. Vnitrobuněčný obsah “oligonukleotidů se odvodil’z radioaktivity spojené s buňkou.,.., měřené v scintilačním čítači.
Obrázek 7 je schematické znázornění farmakokinetiky 3SS značeného oligomeru v plasmě prasat po injekci oligomeru dosrdečních artérií (1 mg/céva) přes pórovitý balónkový katetr pod tlakem 0.40 MPa. Zvířata se utratila 30 minut,.1, a 7 dnů po podání oligonukleotidů.
Obrázek 8 je schematické znázornění farmakokinetiky 33S značeného oligomeru v srdečních artérií stejných prasat jako na obrázku 7.
Obrázky 9A a 9B jsou fotografie průřezu srdeční artérie prasete 1 měsíc po angioplastice. Podal še c-myc stejnosměr-’ ný oligonukleotid (sekvence číslo 2) vnitřní injekcí (2 ml pod tlakem 0.40 MPa během 27 sekund) bezprostředně po angioplastice. Pozoruje se významná tloušťka novotvaru (šipky).
obrázky 10A a 10B jsou fotografie podobné obrázkům 9A a 9B, pouze zvíře dostalo protisměrný oligonukleotid (sekvence číslo 1) místo stejnosměrného oligonukleotidů. Pozoruje se významné snížení počáteční tloušťky novotvaru.
Obrázek 11 je schematické znázornění vnitřní oblasti novotvaru vynesené jako funkce stupně poranění srdeční artérie (skóre poranění) indukované u prasat ošetřených stejnosměrným oligonukleotidem (prázdné kroužky) a protisměrným oligonukleotidem (plné kroužky). Jsou nakresleny regresní linie představující vztah-mezi novotvarem a skórem poranění. Významné snížení směrnice (p pod 0.01) ukazuje snížení tvorby novotvaru u zvířat ošetřených protisměrným oligonukleotidem.
Obrázek 12 je schematické znázornění účinku ná inhibici růstu působenou různými protisměrnými oligonukleotidy cílenými na c-myc mRNA u lidských SMC. Procenta inhibice v třetím dni se stanovila pro protisměrné oligonukleotidy sekvence číslo 1 a 6-12 při 8 a 16 mikromol a pro stejnosměrné (sensej, náhodné (mis) a míchané (ser) oligonukleotidy.
Protisměrné oligonukleotidy jsou velmi slibné terapeutické látky pro léčení mnoha lidských nemocí. Koncepčně je mnohem snadnější navrhnout sloučeniny, které reagují s primární strukturou, jako je molekula RNA, párováním baží než navrhnout molekulu, aby reagovala s aktivním místem enzymu. · Oligonukleotidy se sekvence specificky vážou (hybridizují) na komplementární sekvence DNA, pre-mRNA nebo zralé mRNA, v
jak se definuje Watson- Crickovým či Hoogsteenovým párováním . ..·$ baží a interferují s proudem * genetické informace z DNA na protein. Vlastnosti protisměrných oligonukleotidů, které je činí specifické pro cílovou sekvenci, je dělají také výjimečně rozmanité. Protože protisměrné oligonukleotidy jsou dlouhé řetězce čtyř monomerních jednotek, lze je snadno syntetizovat pro jakoukoliv cílovou sekvenci. Četné nedávné studie dokumentovaly užitečnost protisměrných oligonukleotidů jako biochemických nástrojů pro studiu cílových proteinů, Rothenberg aj., J. Nati. Cancer Inst., 1989, 81, 1539-1544,
Zon G., Pharmaceutical Res., 1988,.,.5, 539-549. vzhledem k nedávným pokrokům oligonukleotidové chemie a syntézy oligonukleotidů resistentních pro nukleázu, které mají zvýšenou stabilitu, je nyní možné uvažovat o použití protisměrných oligonukleotidů jako nové formy léčivi
Běžné metody léčení nebo prevence výskytu restenózy vykazují jen omezenou účinnost při léčení nebo prevenci restenózy. Tento vynález,, který je zaměřen na modulaci množení buněk hladkého svalstva, splňuje dosud nesplněné potřeby.
Výraz oligonukleotid zahrnuje přirozeně se vyskytující oligonukleotidy nebo syntetické oligonukleotidy tvořené z přirozeně se vyskytujících podjednotek nebo. analogických podjednotek navržených tak, aby daly oligonukleotidu speciální vlastnosti, aby byl stálejší v biologických soustavách, nebo se vázal pevněji na cílové sekvence. To rovněž zahrnuje modifikaci oligonukleotidů, jako chemické vazby s jinými sloučeninami, které usnadní dopravu k buňkám nebo k jádru a jiným částem buněk. Dále oligonukleotidy podle tohoto vynálezu mohou obsahovat modifikované mezinukleotidové vazby, aby se zajistila stabilita proti nukleázám. Například vynález může zahrnovat fosforothiolátové oligodeoxyribonukleotidy. Tedy výraz oligonukleotid'* zahrnuje nemodifikované oligomery ribonukleotidů a nebo deoxyribonukleotidů, jakož i oligomery kde jedna či více purinových či pyrimidonových skupin, skupin cvikru nebo vnitronukleotidových vazeb je chemicky modifikovaná.
Bez omezení obecnosti shora uvedeného, výraz !’oligonukleotid, ‘jak se zde používá,- zahrnuje lineární oligomery přirozených či modifikovaných monomerů nebo vazeb včetně deoxyribonukleosidů, ribonukleosidů, jejich alfa-anomerních forem, polyamidových aminokyselin a podobně, schopných se specificky vázat na cílový oligonukleotid podle regulárního vzoru interakcí monomer na monomer, jako je Watson- Crickovo párování baží, Hoogsteenovo či reversní Hoogsteenovo párování baží a podobně. Obvykle jsou monomery .spojeny fosfodiesterovými vazbami či jejich analogy, aby tvořily oligonukleotidy mající velikost od několika monomerních jednotek, například 3-4 až k mnoha stům monomerních jednotek. Analogy fosfodiesterových vazeb zahrnují fosforothiolát, fosforodithiolát, fosforoselenoát, fosforodiselenoát, fosforoanilinothiolát, fosforoanilidát, fosforoamidát a podobně, jak je podrobněji popsáno níže. t
Jak se zde používá, nukleosid” zahrnuje přirozené nukleosidy včetně 2'-deoxy a 2'-hydroxy1 forem, jak například jsou popsány v Kornberg a Baker, DNA Replication, 2. vydání (Fřeeman, San Frančiscó, 1992). Analogy s odkazem na nukleosidy zahrnují syntetické nukleosidy, které mají modifikované bazické skupiny a nebo modifikované skupiny cukru, například obecně popsané v Scheit, Nukleotide Analogs, (John Wiley, New York, 1980). Takové analogy zahrnují syntetické nukleosidy navržené k zvýšení vazebných vlastností, například stability duplexu nebo triplexu, specifičnosti nebo po11 '«'dobňě. 7 - ·- ; '
Protisměrný oligonukleotid specifický pro c- myc nebo c- myc protisměrný oligonukleotid je oligonukleotid mající sekvenci (i) schopnou tvorby stabilního triplexu s částí c-myc proto-ontogenu, nebo (ii) schopnou tvorby stabilního duplexu s části mRNA transkriptu c-myc proto-ontogenu.
Stabilita s odkazem na tvorbu duplexu nebo triplexu zhruba znamená, jak těsně se protisměrný oligonukleotid váže ' na tsvou zamyšlenou .cílovou sekvenci, přesněji to znamená volnou energii tvorby duplexu nebo triplexu za fysiologických podmínek. Teplota tání za standardní množiny podmínek, například jak je popsáno níže, je vhodnou mírou stability duplexu nebo triplexu. Protisměrné oligonukleotidy podle tohoto vynálezu se s výhodou vybírají tak, aby měly teplotu tání za standardních podmínek popsaných níže alespoň 50 °C, tedy za fysiologických podmínek a při výhodných koncentracích bude tvorba duplexu nebo triplexu podstatně zvýhodněna před stavem, kdy protisměrný oligonukleotid a jeho cíl jsou disociovány..Rozumí se, že stabilní duplexnebo triplex může v některých provedeních zahrnovat nesouhlas mezi páry baží a nebo triplety baží v případě triplexů. Dává se přednost, aby protisměrné oligonukleotidy podle tohoto vynálezu tvořily dokonale souhlasné duplexy nebo triplexy se svými cílovými polynukleotidy.
Dává se přednost tomu, aby oligonukleotidy podle tohoto vynálezu byly modifikované, aby se zvýšila stabilita a zab12 ránilo se vnítrobuněčné a mezibuněčné degradaci.^Ještě více se dává přednost tomu, aby oligonukleotidy podle tohoto vynálezu byly modifikované, aby se zvýšila jejich afinita k cílovým sekvencím a jejich transport do vhodných buněk a částí buněk, když jsou podávány savci ve farmaceuticky aktivní formě.
Cílovými polynukleotidy může být jednoduchá nebo dvojitá DMA nebo RNA, dává se však přednost jednoduché DNA nebo RNA. Rozumí-se, že cíl, ke kterému jsou zaměřeny c- mýc protisměrné oligonukleotidy podle tohoto vynálezu zahrnují allelické formy c-myc proto-ontogenu. V literatuře se nachází podstatné vodítko pro výběr zvláštních sekvencí pro protisměrné oligonukleotidy, dané znalostí sekvence cílového polynukleotidu, například Peyman a Ulman, Chemical Reviews, 1990, 90, 543-584, Crooke, Ann Rev. Pharmacol. Toxicol., tí
1992, 32, 329-376 a Zámečník a Stephenson, Proč. Nati. Acad. Sci., 1974, 75, 280-284. Dává sé přednost tomu, aby sekvence c- myc protisměrných sloučenin byly vybrány tak, aby obsah G-C byl alespoň 60 %. Preferované cíle mRNA proto-ontogenu zahrnuji místo 5'cap, tRNA primární vazebné místo, místo iniciace kodonu, místo, místo štěpení mRNA donoru a místo akceptoru štěpení mRNA, například Goodchild aj, US patent 4,806,463.
Protisměrné oligonukleotidy podle tohoto vynálezu mohou obsahovat jakoukoliv polymerní sloučeninu schopnou se specificky vázat na cílový polynukleotid cestou regulárního vzoru
-l- interakcí -monomer na inukleosid,- jako je.:Watspn-.>Crickovo párování baží, Hoogsteenovo či reversní Hoogsteenovoi párování baží a podobně. Protisměrné sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou také obsahovat visící skupiny nebo části, buď jako Část bazické opakované jednotky polymeru nebo odděleně nebo, aby se zvýšila specifita, stabilita proti nukleázám, doprava, nebo jiná vlastnost vztahující se k účinnosti, například cholesterové skupiny, interkalátory, duplexu, jako., je akridin, poly-L-lysin, ^koncové kapování Jednou < či >vlce spojovací skupinou odolnou proti nukleázám,.jako je fosforothiolát a podobně.
Například je známo, že zvýšená rozpustnost v lipidech a nebo odolnost proti trávení nukleázou je výsledkem substituce alkylovou skupinou-nebo- alkoxylovou skupinou za fosfátový kyslík ve vnitronukleotidové fosfodiesterové vazbě, aby se vytvořil alkylfosfonát oligonukleosidu nebo alkylfosfotriester oligonukleotidu. Neionické oligonukleotidy, jako jsou ty, které charakterizuje zvýšená odolnost proti hydrolýze nukleázami anebo zvýšené přijímání buňkami, při zachování schopnosti tvořit stabilní komplexy s komplementárními sekvencemi nukleových kyselin. Zejména jsou stálé k štěpení nukleázami a mají zvýšenou rozpustnost v lipidech alkylfosfonáty. Příprava alkylfosfonátových oligonukleosidu je popsána v Tso aj., US patent 4,469,863.
Odolnost proti nukleázám se u protisměrných sloučenin podle tohoto vynálezu preferovaně zajistí pomocí vnitronuk14 leosidických vazeb odolných proti nukleázám. V oboru je známo mnoho takových vazeb, například fosforothiolát, Zon a Geiser, Anti-Cancer Drug Design, 1991, 6, 539-568, Stecaj., US patent 5,151,510, Hirschbein, US patent 5,166,387, Bergot, US patent 5,183,885, fosforodithioát, Maršhall aj., Science, 1993, 259, 1564-1570, Caruthers a Nielsen, mezinárodní přihláška PCT/US89/02293, fosforoamidáty, například -OP(=O)(NRXR2)-O- s Rx a R2 vodík nebo Ci-C3 alkyl, Jager aj., Biochemistry, 1988, 27, 7237-7246, Froehler aj., mezinárodní přihláška PCT/US90/03138, peptidové nukleové kyseliny, Nielsen aj., Anti-Cancer Drug Design, 1991, 8, 53-63, mezinárodní přihláška PCT/EP92/01220, methylfosfonáty, Miller aj., US patent 4,507,433, Tso aj., US patent 4,469,863, Miller aj., US patent 4,757,055, a P-chirální vazby různých typů, zejména fosforothioláty, Stec aj., evropská patentová přihláška 506,242 (1992) a Lesnikowski, Bioorganic Chemistry, 1993, 21, 127-155. Další nukleázové vazby zahrnují fbsforoselenoát, fosforodiselenoát, fosforoanilinothiolát, fosforoanilidát, alkylfosfotriester, jako je methyl a ethylfosfotriester, karbonát, jako je karboxymethylester, karbamát, morfolinokarbamát, 3'-thioformacetal, silyl, jako je dialkyl (Cn-Ce) nebo difenylsilyl, sulfamátový ester a podobně. Takové vazby a způsoby jejich zavedení do oligonukleotidů jsou popsány v mnoha referencích, například se o nich obecně referuje v Peyman a Ulman, Chemical Reviews, .1990, 90, 543-? 584, Milligan aj., J. Med. Chem., 1993, 36, 1923-1937, Mat15 teucci aj., mezinárodní přihláška PCT/US91/06855. *
Odolnost proti trávení nukleázou lze také dosáhnout modifikací vnitronukleotidické vazby na obou 5'a 3' koncích fosforoamidity podle postupu Dagle aj., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 4781-4757.
Fosforové analogy fosfodiesterových vazeb se preferovaně používají u sloučenin podle tohoto vynálezu, jako je fosforothiolát, fosforodithiolát, fosforoamidát nebo methylfosfonát. Lépe se používá jako vazba odolná nukleáze fosforothiolát.
Fosforothiolátové oligonukleotidy obsahují substituci síra za kyslík ve vnitronukleotidové fosfodiesterové vazbě. Fosforothiolátové oligonukleotidy kombinují vlastnosti účinné hybridizace pro tvorbu duplexu s podstatnou odolností proti nukleáze při zachování rozpustnosti ve vodě nabitého fosfátového analogu. Věří se, že náboj dává vlastnost buněčné přijatelnosti přes receptor (Loke aj., Proč. Nati. Acad. Sci., 1989, 86, 3474-3478).
Rozumí se, že přidání preferovaných vazebných skupin podle tohoto vynálezu může zahrnovat dodatečné modifikace, například boronátované báze, Spielvogel aj., US patent 5,130,302, cholesterové skupiny, Shea aj., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783 nebo Letsinger aj., Proč. Nati. Acad. Sci., 1989, 86, 6553-6556, a 5-propynyl modifikace pyrimidinů, Froehler aj., Tetrahedron Lett. 1992, 33, 5307-5310.
Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu lze syntetizovat
-- všemizpůsoby známými v oboru. V tomto vynálezu se dává přednost, aby se oligonukleotidy připravily pomocí chemických syntetických metod, jako jsou například fosforoamiditátová chemie sulfurizací tetraethylthiuramdisulfidem v acetonitrilu. Viz například Vu a Hirschbein, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 30005-30008. Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu lze také syntetizovat pomocí in vitro a in vivo transkripčnich systémů, jako je transkripce T' polymerázou nebo výrazové vektory. Oligonukleotidy syntetizované pomocí in vitro a in vivo transkripčních systémů lze modifikovat chemickými metodami známými odborníkům. Příklady takových modifikací zahrnují zapouzdření v liposomech nebo chemickou vazbu k steroidům, antičásticíra a ligandům buněčných receptorů.
V provedeních, kde je Žádoucí tvorba triplexu, existují omezení na výběr cílových sekvencí. Obecně, asociace-třetího řetězce přes Hoogsteenův.typ vazeb je nejstabilnější podél homopyrimidin-homopurinových sledů ve dvojitě vinutém cíli. Obyčejně triplety baží se tvoří v T-A*T nebo C-G*C motivech (kde n- ukazuje Watson- Críckovo párování a ukazuje Hoogsteenův typ vazeb), avšak jsou možné také jiné motivy. Například Hoogsteenovo párování baží umožňuje paralelní a antiparalelní orientace mezi třetím řetězci (Hoogsteenův řetězec) a řetězcem duplexu bohatý na purin, ke kterému se třetí řetězec váže, v závislosti na podmínkách a složeni řetězců. Literatura poskytuje široký návod pro výběr vhodných sekvencí, orientace, podmínek, typu nukleosidu (například zda se použije ribozový nebo deoxyribozový nukleosid) modifikaci baží (například methylovaný cytosin a podobně), aby se maximalizovala nebo jinak regulovala stabilita triplexu, jak je žádoucí v jednotlivých provedeních, například Roberts aj., Proč. Nati. Acad. Sci., 1991, 88, 9397-9401, Roberts aj., Science 1992, 258, 1463-1466, Distefano aj., Proč. Nati. Acad. Sci., 1993, 90, 1179-1183, Mergny aj., Biochemist= ry, 1992, 30, 9791-9798, Ceng aj. , J. Am.. Chem. Soc., 1992, 114, 4465-4474, Beal a Dervan, Nucleic Acids Research,
1992, 20, 2773-2776, Beal a Dervan, J. Am. Chem. Soc.,
1992, 114, 4976-4982, Giovannangeli aj., Proč. Nati. Acad.
Sci., 1992, 89, 8631-8635, Moser a Dervan, Science 1987,
238, 645-650, McShan aj., J. Biol. Chem., 1992, 267, 57125721, Yóon aj., Proč. Ňatl. Acad. Sci., 1992, 89, 38403844 a Blume aj., Nucleic Acids Research, 1992, 20, 17771784. '
Délka oligonukleotidových skupin je dostatečně velká, aby zajistila, že k specifickému vázání dojde pouze na žádaném cílovém polynukleotidu a ne na jiných náhodných místech, jak se vysvětluje v mnoha odkazech, například Rosenberg aj.,
- mezinárodní přihláška PCT/US92/05305 nebo Szostak aj., Meth. Enzymol., 1979, .68, 419-429. Horní mez délky je dána mnoha faktory, včetně nevýhod a nákladů na syntézu a čistění velkých oligomerů, větší snášenlivosti delších oligonukleotidů k neshodám než u kratších oligonukleotidů, zda došlo k modifikacím, aby se zvýšily vazby nebo specifičnost, zda je žá18 < < doučí tvorba duplexu nebo triplexu a podobně. .
Dává se přednost tomu, aby délka oligonukleotidů byla mezi 5 a ' 200 nukleotidy. Ještě více se dává přednost tomu, aby oligonukleotidy byly dlouhé mezi 10 a 50 nukleotidy. Nejpreferovanější je, aby oligonukleotidy byly dlouhé mezi 15 a 25 nukleotidy. V preferovaných provedeních je oligonukleotid specificky hybridizovatelný s přenosem iniciačního místa. V jednom preferovaném provedení tohoto vynálezu oligonukleotid má sekvenci 5' AACGTTGAGG GGCAT 3' ' (sekvence číslo 1). Tento oligonukleotid je komplementární k segmentu c-myc mRNA začínajícímu s kodonem iniciace translace a jeho rozšířeni po proudu. Kodon iniciace translace obsahuje nukleotidy 559-562 c-myc mRNA. Kódující oblast obsahující nukleotidy 559-1875 je lemována nekódující oblastí, a 3' nekódující oblasti táhnoucí se k nukleotidu 2121.
Obecně protisměrné oligonukleotidy používané v praxi podle tohoto vynálezu budou mít sekvenci, která je zcela komplementární k vybrané části cílového polynukleotidu. Absolutní komplementarita se však nevyžaduje, zejména u větších oligomerů. Tedy zde odkaz na sekvenci oligonukleotidu komplementární k cílovému polynukleotidu nutně neznamená sekvenci mající 100 % komplementaritu k cílovému segmentu. Obecně jakýkoliv oligonukleotid mající dostatečnou komplementaritu, aby tvořil stabilní duplex s cílem (například c-myc mRNA), to je oligonukleotid, který je hybridizovatelný, je použitelný. Tvora stabilního duplexu závisí na sek19 věnci a délce hybridizujícího oligonukleotidu-a stupni komplementarity k cílovému polynukleotidu. .Obecně čím větší je hybridizující oligomer, tím více neshod lze tolerovat. Odborník může snadno stanovit stupeň neshod, které lze tolerovat mezi daným protisměrným oligonukleotid a cílovou sekvencí, založený na teplotě tání -a tedy na termické stabilitě vzniklého duplexu.
, .Dává se přednost tomu, aby se termická stabilita hybri- , dů tvořených protisměrnými oligonukleotidy podle tohoto vynálezu stanovila pomocí křivek tání nebo disociace svazku. Teplota padesáti procent asociace svazku se bere jako teplota tání T , která zas dává výhodnou míru stability.. Měření T^ se typicky provádí v solném roztoku při.neutrálním pH .
s'koncentracemi cíle a protisměrného oligonukleotidu mezi asi 1.0-2.0 mikromol. Typické podmínky jsou následující: 150 mmol NaCl a 10 mmol MgCl^ v 10 mmol ústoji fosforečnanu sodného (pH 7.0) nebo v 10 mmol ústoji Tris-HCl (pH 7.0). Údaje o křivkách tání se akumulují zahříváním vzorku komplexu protisměrného oligonukleotidu/ cílového polynukleotidu od pokojové teploty do asi 85-90 °C. Jak se teplota vzorku zvyšuje, sleduje se absorbance 260 nm světla v 1 °C intervalech, například pomocí spektrofotometru Cary (Austrálie) modelu 1E nebo Hewlett-Packard (Palo Alto, Ca) model HP 8459 UV/VIS a regulátoru teploty model HP 89100A.nebo podobných přístrojů. Takové techniky dají výhodné prostředky pro měření a porovnání vazebných sil protisměrných oligonukleotidů různých*’délek a'složení/ ; ·'* 2^515?
Podle jednoho provedení tohoto vynálezu jsouoligonukleotidy navrženy, aby byly hybridizovatelné s mediátorovou RNA, odvozenou od c-myc genu. Taková hybridizace, když se dosáhne, interferuje s normální úlohou mediátorové RNA a působí modulaci její funkce v buňce. Funkce mediátorové RNA, které se mají přerušit zahrnují všechny vitální funkce, jako je přemístění RNA k místu translace proteinu, skutečná translace proteinu z RNA, štěpení RNA, aby dala jeden či více druhů mRNA a možná nezávislá katalytická aktivita spojená s RNA. celkový efekt takové interference s funkcí RNÁ je modulace exprese c-myc genu. Modulací exprese c-myc genu 5 se moduluje nebo inhibuje množení buněk hladkého svalstva.
« Ve výhodném provedení tohoto vynálezu se lze zaměřit na množení buněk hladkého svalstva spojené s restenózou. Tedy buňky hladkého svalstva jsou s výhodou vaskulárni buňky hladkého svalstva, jako jsou buňky hladkého svalstva artérií, žil a kapilár,
Pro terapeutické či profylaktické použití se oligonukleotidy podávají v souladu s tímto vynálezem. Oligonukleotidy lze formulovat do farmaceutických kompozic, které mohou obsahovat vedle oligonukleotidů nosiče, zahusťovače, ředidla, ústoje, konzervační látky, povrchově aktivní látky a podobně. V některých provedeních tohoto vynálezu se oligonukleotidy mohou podávat ve spojení s jinými léky, které jsou účinné pro omezení nebo eliminaci restehózy, jako jsou nap21 říklad terapeutika protidestičková,’protikoagulační a vasodilatační. Roztok také může obsahovat vproteolytický enzym, jako je disparáza, trypsin, kolagenáza,ípapain, pepsin nebo chymotrypsin. Mimo proteolytických enzymů.lze použít lipázy. Jako mírný detergent roztok, může obsahovat NP-40, Triton X100, deoxycholát, SDS anebo podobně.
Protisměrné oligonukleotidy podle tohoto vynálezu zahr. . . . . nují jejich farmaceuticky přijatelné soli,-včetně solí alkalických zemi, například sodné nebo hořečnaté, amonné nebo NX4*, kde X je C -C · alkyl. Jiné farmaceuticky přijatelné soli zahrnují soli organických karboxylových kyselin, jako jsou kyseliny octová, mléčná, vinná, maleová, -isethionová, laktobionová a jantarová, organických sulfonových kyselin, jako jsou kyseliny inethansulf ónóvová, ethansulfonovová’ a benzensulfonovová, a anorganických kyselin, jako.*;jsou kyseliny solná, sírová, fosforečná a sulfamová. Farmaceuticky, přijatelné soli sloučenin majících hydroxylovou skupinu zahrnují anion takové sloučeniny v kombinaci s vhodným kation* tem, jako je Na*, NH^* anebo podobně.
Farmaceutické kompozice lze podávat řadou cest v závislosti na tom, zda je žádoucí ošetření lokální nebo systémové á na ploše, která se má ošetřit. Podávání lze dosáhnout způsoby známými odborníkům, jako je intravenosně nebo pomocí katetru k přímému ošetření zasažené plochy. Odborníkům jsou známy intravaskulární zařízení a jejich použití.
Lokální podávání k relevantním poškozeným cévám pomocí katetru je jednou cestou dodávky. Protisměrný oligonukleotid k c-myc se podává do blízkosti poranění přes katetr zevnitř lumenu, například pórovitým balónkem, jak popisují Wolinsky a Thung, JACC, 1990, 15 (2), 475-481, nebo adventiciem (například nejvnějšnější vrstvou stěny cévy) s materiály pomáhajícími pomalému uvolňování protisměrné sloučeniny, například soustavy pluronického gelu, jak popisují Simons a j., Nátuře, 1992, 359, 67-70. Jiné techniky pomalého uvolňování pro lokální podávání zahrnují pokrytí úžin protisměrnou sloučeninou, například použitím pojivá nebo gelu, jak popisují Wilensky aj., Trends in Cardiovaskular Med., 1993, 3,' 163-170. Dávka dodaná na cílové poškození je v-rozmezí, od 0.001 mg do 100 mg, výhodněji je dávka v rozmezí od 1 mg do 5 mg. Doba podávání je výhodně v rozmezí od asi 30 sekund do 60 minut a výhodněji v rozmezí od asi 30 sekund do asi 1-2 minut, Zalewski aj, strany 79-87 v Goldberg, editor, Goronary Angioplasty (Davis, Philadelphia, 1988).
Systémové intravenosní podávání se rovněž zamýšlí. Bez přání vázat se na jakoukoliv teorii, věří se, že jisté orgány těla mohou poskytnout oligonukleotidu útulek, z kterého se vrátí do oběhu po delší dobu, než se dříve očekávalo. Věří se, že takové depoty mohou být zdrojem pro oligonukleotid akumulující se v cévách až 72 hodin po podáváni.
Dávkování je závislé na závažnosti a ovladatelnosti stavu, který se má ošetřovat, ale bude normálně jednou či více dávkami za den v průběhu ošetřování trvajícího od mnoha *' ' dní do mnoha měsíců, nebo - pokud se nedosáhne‘uzdravení nebo snížení stavu nemoci. Běžní odborníci mohou snadno stanovit optimální dávkování, dávkovači metodologii a rychlosti opakování.
Následující příklady jsou ilustrativní, nejsou však zamýšleny jako omezení tohoto vynálezu.
...... Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 *
Buněčná kultura:
Lidské SMC pocházely z podkožních cév pacientů, kteří podstoupili rutinní obtokové operace. Buňky se isolovaly explantovou metodou.rExplanty se umístily do tkáňových kultivačních misek obsahujících modifikovaný Dulbecco: Eaglovo medium (DMEM) doplněné 20 % tepelně inaktivovaného hovězího séra (FBS), 100 IU/ml penicilinu, 0.100 mg/ml streptomycinu a 2 mmol/ml glutaminu (20 . % FBS-DMEM). Kultury se udržovaly při 37 ° ve zvlhčovaném inkubátoru s 5 % C02. Buňky vykazovaly typické morfologické charakteristiky vaskulárních SMC, například vřetenový tvar a vzor vrchol-údoli. Identifikace vaskulárních SMC se dále potvrdila in šitu barvením hladkého svalstva alfa-aktinem.
Příklad 2
Syntéza oligonukleotinů
15-merní protisměrné, stejnosměrné a náhodné oligonukle24 otidy.se syntetizovaly na vysokoprůchodném DNA syntetizátoru Applied Biosystems model 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Větší množství pro studie in vivo se syntetizovaly na modifikovaném DNA syntetizátoru pro velké měřítko Applied Biosystems 390Z. Oligonukleotidy se lyofilizovaly, znovu suspendovaly v PBS a kvantifikovaly spektrofotometrií. Modifikované (fosforothiolát) oligonukleotidy z oblasti iniciace translace lidského c-myc genu se použily v této studii. Sekvence byly následující: stejnosměrný oligonukleotid (5' atgCCCCTCAACGTT 3, sekvence číslo 2), protisměrný oligonukleotid (5' AACGTTGAGGGGCAT 3', sekvence číslo 1) a náhodný oligonukleotid (5' TACGGGTTG AGCAA 3', sekvence číslo 3).
Příklad 3
Růstový pokus >
Počáteční průchody (2 a 4) lidských SMC v 20 % FBSDMEM se nasadily na hustotu 10000 buněk na jamku v 24 miskových podnosech. Dvacet čtyři hodiny po nasazené se původní médium nahradilo médiem zastavujícím růst 0.5 % FBS-DMEM na dalších 48 hodin. Růst buněk se synchronizoval přídavkem 20 % FBS-DMEM. Oligonukleotidy se přidaly dvacet čtyři hodiny před stimulací, během stimulace a potom každých 48 hodin, pokud není v textu uvedeno jinak. V označených časech SMC se trypsinovaly a počítaly v Coulterově čítači. Stupeň inhibice se vypočítal následovně:
% inhibice = (1 -(čistý růst buněk ošetřovaných protis25 měrně / čistý růst buněk ošetřovaných stejnosměrně))*100.
Čistý růst lidských' SMC se získal odečtením počtu výchozích buněk (v době, kdy buňky se uvolňují z Gq fáze) od počtu buněk v označených časových bodech pokusu. Každý pokus se prováděl třikrát. Data jsou vyjádřena jako průměr +/ směrodatná odchylka.
Příklad 4
Přijímání oligonukleotidů buňkami
SMC se pěstovaly na 100 mm miskách živených 20 % FBSDMEM. Po zastavení růstu (0.5 % FBS-DMEM) na 48 hodin se SMC synchronizovaly 20 % FBS-DMEM. Aby se stanovilo přijímání oligonukleotidů buňkami, SMC se inkubovaly s 0.002 mmolů 33P koncově značených oligonukleotidů (5*10® cpm/mg) po 1, 3, 6, 16, 24 a 36 hodin. Po inkubaci se buňky promyly v PBS a 0.2 mol glycinu (pH 2.8), aby se odstranily oligonukleotidy vázané na membránu, zbylá radioaktivita spojená s buňkami, která představuje vnitrobuněčné přijímání oligonukleotidů se měřila scintilačním čítačem. Přijímání oligonukleotidů je vyjádřeno jako praol/10s buněk.
Příklad 5
Reversní transkripce a řetězová reakce polymerázy (RT-CPR) Aby se stanovily hladiny c-myc mRNA v lidských SMC, použila se modifikovaná RŤ-CPR technika. Celá RNA se isolovala jednostupňovým postupem pomocí kyselé guanidinium thio26 kyanát- fenol-chloroformové-extrakční metody? Aby se rozlišila amplifikace genomické DNA a cDNA, páry priméru byly navrženy tak, aby zahrnovaly alespoň jeden intron na genomické sekvenci c-myc. Priméry se syntetizovaly, jak je popsáno výše, a sekvence priméru byly následující: primér A, 5' TGGTGCTCCATGAGGAGACA 3' (sekvence číslo 4), primér B, 5' GTGTTCAACTGTTCTCGTC 3' (sekvence číslo 5). Priméry byly 5' koncově značené 0.050 mCi (gama-32P)-ATP podle značkovacího protokolu 5' DNA konce (GIBCO BRL Technologies, lne. Gaithersburg, MD). Dva mikrogramy celá RNA se reversně transkribovaly na cDNA 200 jednotkami SuperSeript reversní transkriptázy. PCR amplifikace cDNA se provedla pomocí protokolu GeneAmp RNA PCR (Perkin-Elmer Corp., Hayward, CA). V krátkosti, alikvot cDNA se přidal k reakční směsi obsahující 0.020 mmol primérů a 5 jednotek Taq polymerázy. Amplifikace provedla v DNA termickém cykleru (Perkin-Elmer Cetus) pro 30 cyklů. Profil cyklů spočíval v 1 minutě při 94 °C pro denaturaci, 2 minuty při 60 °C pro žíhání a 2 minuty při 72 °C pro rozšířeni priméru. RT-CPR produkty se elektroforézovaly v 6 % polyakrylamidovém gelu a vystavily filmu Kodak.
Příklad 6
Exprese c-myc proto-ontogenu v lidských SMC
Aby se stanovila hladina exprese c-myc proto-ontogenu v lidských SMC, c-myc mRNA se stanovila v klidných (zastavení na 48 hodin) a rostoucích (2, 4 a 24 hodin po stimulaci) buňkách. RT-CPR se prováděla, jak je popsáno v příkladě 5, pomocí primérů specif ických pro c-myc/Obrázek 1 ;jé;‘autoradiogram amplifikované mRNA z klidných á - množících se lidských SMC.. Jak lze vidět na obrázku 1, klidné lidské SMC vy- jadřují nízkou hladinu c-myc mRNA. Naopak u množících se SMC, hladiny c-myc mRNA stouply ve 2 a 4 hodiny po stimulaci růstu buněk, c-myc mRNA poklesla ve 24 hodin, ačkoliv její hladina zůstala vyšší než u klidných buněk.
' Příklad 7 ; '. : · /·
Inhibice růstu SMC
Lidské SMC se inkubovaly s c-myc fosforothiolátovými protisměrnými oligonukleotidy, jak je popsáno v příkladě 3. Pokusy se prováděly trojmo a opakovaly se třikrát při různých příležitostech dávajíce podobné výsledky. Výsledky-jsou vyneseny jako průměr +/- směrodatná odchylka. Jak lze vidět na obrázku 3, inkubace lidských SMC s c-myc fosforothiolátovými protisměrnými oligonukleotidy vedla k významnému inhibičnímu účinku na růst, zatím co stejnosměrné a náhodné oligonukleotidy neměly žádný vliv na růst buněk. Významná inhibice se udržovala alespoň 4 dny s kontinuálním vystavením oligonukleotidům (p pod 0.001). Na rozdíl od inhibičního účinku na růst fosforothiolátových oligonukleotidů, nemodifikované protisměrné oligonukleotidy neměly žádný vliv na růst SMC v dávkách až do 0.040 mmol.
Růstové pokusy prováděné v souladu s příkladem 3 také ukázaly, že podle očekávání protirůstový účinek c-myc fosforothiolátových protisměrných oligonukleotidů byl závislý na dávce v rozpětí od 0.001 do 0.010 mmol, jak je ukázáno na obrázku 3. Navíc bez předcházejícího ošetření, inkubace lidských SMC s c-myc protisměrnými oligonukleotidy po 8 a 24 hodin dávala srovnatelnou inhibici růstu 58 +/- 13 % a 70 +/“ 14 %.
Podobné studie se prováděly, aby se stanovil inhibiční účinek na růst c-myc protisměrných oligonukleotidů vepřových SMC. Pozorovala se inhibice růstu přesahující 90% po c-myc protisměrném ošetření (0.012 mmol) ve srovnání s kontrolami nebo stejnosměrném ošetření vepřových SMC. Ve všech růstových pokusech ošetřené SMC vykazovaly normální morfologii a nebylo zaznamenáno žádné odumření buněk ve zkoušeném rozpětí dávek.
Aby se zjistil možný dlouhodobý účinek c-myc protisměrného ošetření na růst buněk, oligonukleotidy se stáhly po 8 hodinách inkubace a lidské SMC se pěstovaly ještě 7 dní. Počty buněk se potom získaly za 1, 2, 4 a 6 dní. Rychlosti růstu protisměrně ošetřených a kontrolních SMC byly identické. To ukazuje normální životnost SMC po ošetření protisměrnými oligonukleotidy.
Očekávali jsme, že protirůstový účinek c-myc protisměrných oligonukleotidů by byl rušen přídavkem přebytku stejnosměrných oligonukleotidů do SMC kultury. Jak je ukázáno na obrázku 4, zvyšování poměru stejnosměrných k protisměrným oligonukleotidům zcela zrušil inhibici růstu. To se asi sta29 lo v důsledku tvorby heteroduplexů mezi dvěmafoligonukleotidy, což ukazuje.na inhibici růstu protisměrnými oligonukleotidů specifickou k sekvenci.
Příklad 8
Inhibice exprese c-myc
Aby se stanovilo, zda protirůstový účinek c-myc protisměrných oligonukleotidů je působen redukcí exprese c-myc, c-myc mRNA, se stanovila po protisměrném a stejnosměrném ošetření, jak je popsáno v příkladě 5. Obrázek 5 ukazuje, že c-myc fosforothiolátové protisměrné oligonukleotidy (0.010 mmol) redukovaly cílovou mRNA v rostoucích lidských SMC, zatím co stejnosměrně ošetřené buňky vykazovaly nezměněnou úroveň c-myc mRNA ve srovnání s buňkami bez ošetření oligonukleotidy.
Příklad 9 , Přijímání oligonukleotidů buňkami a vnitrobuněčná kinetika
Kinetika přijímání oligonukleotidů buňkami lidských SMC je ukázána na obrázku 6. V označených časových bodech se buňky promyly v PBS a 0.2 mol glycinu (pH 2.8). Radioaktivita spojená s SMC byla stanovitelná už 1 hodinu po inkubaci a rychle se kontinuálně zvyšovala až do 16 hodin. Nebyl rozdíl mezi přijímáním 32P koncově značených oligonukleotidů buňkami klidnými a rostoucími. Podobné výsledky se získaly při použití třídiče fluorescentně značených buněk s FITC značenými^oligonukleotidy.' í+ů v: ' ; íiá.b®£ň:.Protože radioaktivita spojená s buňkami'nemusí představovat nedotčené oligonukleotidy,'ale také degradované olígonukleotidy 32P koncové značení nebo 32P zabudovaný v buněčných makromolekulách, stanovila se akumulace nedotčených oligonukleotidů v lidských SMC. Vnitrobuněčná koncentrace nedotčených oligonukleotidů se zvyšovala během 24 hodin a podobné množství nedegradoyaných oligonukleotidů zůstávalo uvnitř SMC alespoň po dalších 12 hodin (například 36 hodin po expozici). Tedy přes krátký vnitrobuněčný poločas, stabilita fosforothiolátových oligonukleotidů v séru a rychlé přijímání buňkami umožňují jejich trvalé hladiny v lidských SMC.
Příklad 10
Farmakokinetika v srdečních artériích
Aby se stanovila vnitřní dodávky a farmakokinetiky oligomerů in vivo, c-myc protisměrné oligonukleotidy se označily 3SS. Po lokalizovaném poranění balónkem, jak je popsáno v příkladě 11, stejná množství značených oligonukleotidů se injikovaly do vepřových srdečních artérií (1 mg/céva) v místě poranění přes pórovitý balónkový katetr pod tlakem 0.40 MPa,. Doba dodávky byla 26 +/- 4 sekundy, zvířata se utratila 30 minut/ 1, 3 a 7 dnů po podání oligonukleotidů. Ošetřené srdeční artérie se vyňaly a. homogenizovaly (hmotnost 75-100 mg/céva). Radioaktivita vzorku se měřila scintilačním čita31 čem.,Množství oligonukleotidů se kvantifikovalo podlé známého množství oligonukleotidů značených 3Ss. Výsledky jsou ukázány na obrázcích 7 (oligomer v plasmě) a 8 (oligomer v srdečních artériích). Rozdělení oligonukleotidů v orgánech jako funkce času po podání je dána v tabulce:.
Tabulka l
Koncentrace oligonukleotidů v orgánech
(mikrogramů na Orgán | gram tkáně) 30 min | 1 den | 3 dny | 7 dnů |
Kostní dřeň | 0.37 | 0.38 | . 0.46 | 0.45 |
Tenké střevo | 0.53 | 0.51 | 0.48 | 0.11 |
Srdeční sval | 0.45 | 0.38 | 1.14 | 0.34 |
Kosterní sval | 0.34 | 0.25 | 0.29 | 0.35 |
Plíce | 0.49 | 0.42 | 0.43 | 0.35 |
Játra | 2.18 | 2.39 | 1.71 | 0.73 |
Ledviny | 10.12 | 4.8 | 0.70 | 0.57 |
Vzdálené artérie 0.0 | o'o | 0.0 | 0.0 | |
(nepoškozené) Obrázek 7 | ukazuje hladiny oligonukleotidů | v plasmě. |
Docházelo k rychlému zbavování se oligomerů z plasmy s poločasem asi 20 minut. Ačkoliv koncentrace oligonukleotidů v plasmě se snižovala k úrovním pozadí po 24 hodinách po lokálním podání, zvýšená koncentrace oligonukleotidů v plasmě se pozorovala po 72 hodinách. Zvýšená hladina oligonukleotidů se udržela dalších 96 hodin. Postuluje se, že oligonukle32 v .otidy rychle odcházejí z plasmy a hromadí se v játrech/ ledvinách a srdečním svalu. Tyto orgány byly útočištěm oligonukleotidů, které se vrátily do oběhu po delším časovém období.
Obrázek 8 je schematické znázornění farmakokinetiky oligonukleotidů v místech srdečních artérií v místech lokalizovaného poranění balónkem. Kontrolní cévy (bez oligomerů) neukazovaly žádnou radioaktivitu ve všech časových bodech/ ják je ukázáno v tabulce 1. Asi 0.2 % oligomerů se uložilo v místech lokalizovaného poraněni srdečních artérií balónkem. Mimochodem, podávání oligomerů katetrem dávalo vyšší koncentrace oligonukleotidů v místě podávání (2-64 násobné zvýšení) ve srovnání s různými orgány a vzdálenými artérieni 30 minut po injekci. Koncentrace oligonukleotidů sé zvýšila ve stěnách artérií při 72 hodinách po injekci. Mimochodem, nepoškozené srdeční artérie vzdálené od místa poranění balónkem neukazovaly žádnou akumulaci značených oligonukleotidů v žádném časovém bodě. Možné vysvětlení je, že poranění stěny cévy indukuje zánětlivou odpověď a množení buněk, které může zvyšovat přijímání oligonukleotidů buňkami. Oligonukleotidy, které se vrátily do oběhu ze zásobních” orgánů by mohly být zdrojem redistribuce na místo poranění stěny artérie.,
Jako důsledek uloženi přebytku oligonukleotidů (například dávka oligonukleotidů, která se nedala injekcí přímo do stěny artérie) se přes uložení z plasmy do zásobních orgánů λ mohla překvapivě udržovat terapeuticky dostatečná koncentrace oligonukleotidu stálým unikáním oligonukleotidu zásobních orgánů do cirkulující plasmy, doplněná zvýšeným přijímáním z plasmy v místě poranění.
Farmakokinetické údaje ve vepřovém modelu svědčí, že stálá hladina oligonukleotidu v stěně cévy je dosažitelná lokálním podáváním katetrem. pata také naznačují, potenciál pro systémové ošetřování restenózy pomocí c-myc protisměr* ných oligonukleotidů, protože překvapivě velmi nízké koncentrace v cirkulující plasmě mohou dát terapeuticky účinné koncentrace v místě poranění.
Potenciál pro terapeutickou účinnost překvapivě nabízí studie se zvířaty in vivo. studie in vitro popsané shora (příklad 7) dosáhly pouze částečnou inhibici růstu SMC při koncentraci oligonukleotidů 0.010 mmol, se stálým kontaktem s lidskými SMC během 4 dní. Nicméně přechodná lokální aplikace in vivo při koncentracích 0.020 mg/g cévy (asi 0.0Q6 mmol) následovaná přísunem ze zásobních orgánů vedla k podstatné redukci tvorby výstelky ve standardním modelu vepřové restenózy.
Příklad 11
Studie se ztvířaty - inhibice restenózy c-myc protisměrnými oligonukleotidy
Účinnost c-myc protisměrných sloučenin inhibovat restenózu se testovala podáváním specifických c-myc protisměrných oligonukleotidů (sekvence číslo*1) a placebá (sékvence číslo 2) fosforothiolátových oligonukleotidů na místo koronární angioplastiky ve standardním modelu vepřové resténózy podle konvenčního protokolu, viz například Karas aj., J. Am. Coll. Card., 1992, 20, 467-474, a Schwartz aj. Circulation, 1990, 82, 2190-2200. Domácí křížená prasata (Sus scrofa) se před studií ošetřila orálním aspirinem (650 mg). Celková anestezie spočívala ve vnitrosvalové injekci ketaminu (12 mg/kg) a xylazinu (8 mg/kg). Další dávky anestetika se podávaly během pokusu intravenosně. Když se chirurgicky obnažila pravá vnější srdeční artérie, podal se praseti intravenosně heparin (10000 U). Pomocí vedoucího katetru 8 French SAL 1 (Medtronic Interventional Vascular, lne., Danvers, MA) se kanulovaly koronární ostia za fluoroskopického vedení. Před podáním c-myc protisměrných oligonukleotidů a placebá se použil nadměrný angioplastický balónek k poranění vnitřních a středních vrstev stěn artérií nafouknutím na 1 MPa a zadržením po sekund třikrát po sobě. Ihned po angioplastice se balónek odstranil, a vnitrocévní injekce (2 ml) do srdečních artérií se provedla pomocí zvláštního pórovitého balónku, c-myc protisměrné oligonukleotidy (13 opakováni) a placebo (12 opakování) se injikoval pod tlakem 0.40 MPa a dodávka se skončila v průměru za 27 sekund. Dávka oligomerů byla 1 mg na poškozenou srdeční artérií. S podáním oligomerů nebyly spojeny žádné nevhodné účinky. Jeden měsíc po podání se zvířata utratila a stanovil se morfologií maximální povrch vnitřního novotvaru (NA max), tloušťka vnitřního novotvaru (NT max) a zbylý průřez (RT) v místech poranění. Výsledky (průměr +/- směrodatná odchylka) jsou ukázány níže v tabulce a na připojených obrázcích 9-11.
Tabulka 2 | ||
Oligomer Opakováni | NA max (mm2) | |
Placebo | 12 | 0.80+/-0.17 |
Protisměrný | 13 | 0.24+/-0.06 |
P | pod 0.01 |
NT max (mm)
0.48+/-0,009
0.20+/-0.04 pod 0.01
RT %
64+/-6 81+/-5 pod 0.05
Obrázky 9A (mírné poranění) a 9B (těžké poranění) jsou fotografie průřezu srdeční artérie příkladné kontroly (která například dostala stejnosměrný oligomer) 1 měsíc po angioplastice. Histologické skóre se stupňovalo následovně: Stupeň I: bodové trhliny ve vnitřní elastické výstelce, novotvar je přítomný jen na luminální straně vnitřní elastické výstelky, Stupeň II: trhliny ve vnitřní elastické výstelce, novotvar je viditelný na obou stranách vnitřní elastické výstelky, Stupeň III: roztrhaná vnitřní elastická výstelka, novotvar nahrazuje 2/3 prostředí, Stupeň III: roztrhaná vnitřní elastická výstelka, novotvar se šiří do adventicia. Mírné poranění je založeno na skóre poranění stupně I a II, těžké poraněni je reprezentováno stupněm III a IV. Významná tloušťka novotvaru je na obrázcích 9A a 9B označena (šipky).
-.---. obrázky 10A (mírné poranění) ?a 10B (těžké poranění) jsou fotografie průřezu příkladné srdeční artérie ošetřené protisměrným oligonukleotidem. Pozoruje se významné snížení počáteční tloušťky novotvaru. Když se analyzoval maximální povrch vnitřního novotvaru jako funkce stupně poranění (obrázek 11) regresní linie představující vztah mezi novotvarem a skórem poranění (například závažností poranění) ukázala významný rozdíl směrnic (p pod 0.01). Jak je ukázáno na obrázku 11, protisměrný oligonukleotid významně snížil tvorbu novotvaru, zejména u pokročilejších poranění.
Celkově tyto výsledky ukazují, že lokální podávání přes katetr specifických c-myc protisměrných oligonukleotidů významně snižuje tvorbu novotvarů v koronární vaskulatuře po poškození stěny artérie působené balónkem. Víi
Příklad 12
Růstový pokus - další c-myc protisměrné oligonukleotidy
Inhibiční účinek na růst protisměrných oligonukleotidů cílenými na oblasti c-myc mRNA mimo oblast iniciace translace se zkoumaly následovně. Lidské SMC se daly na misky při 5000/cm2 a zastavily se v 0.5 % FBS po 48 hodin. Buňky se pak stimulovaly 20 % FBS a jeden z následujících fosforothiolátvých oligomerů komplementárních k různým cílovým sekvencím c-myc mRNA (0.008 nebo 0.016 mmol) se pak přidal v čase stimulace:
5' AAAGTGCCCG CCCGCTGCTA 3' (sekvence číslo 6), zaměřená na nukleotidy 358-377 5' nekódujíc! oblasti, 5' GGGAGAGAGTCG CGTCCTTGCT 3' (sekvence číslo 7), zaměřená na nukleotidy 400-:419 5' nekódující oblasti,.
5' CCAGTGCAAA GTGCCCGCCC 3' (sekvence číslo 8), zaměřená na nukleotidy 365-384 5' nekódující oblasti,
5' GGCCTTTTCA TTGTTTTCCA 3' (sekvence číslo 9), zaměřená na nukleotidy 1709-1728 kódující oblasti, fc, .1
5' TCATGGAGCA CCAGGGGCTC 3' (sekvence číslo 10), zaměřená na nukleotidy 1264-1283 kódující oblasti,
5' CGGATCTCCC TTCCCAGGAC 3' (sekvence číslo 11), zaměřená na nukleotidy 242-262 5' nekódující oblasti,
5' CGTTCTTTTT TCCCGCCAAC 3' (sekvence číslo 12), zaměřenáTna nukleotidy 80-89 5' nekódující oblasti, ř
5' AACGTTGAGGGGCAT 3' (sekvence číslo 1) sloužila jako positivní kontrola. Následující oligomery sloužily jako negativní kontrola: stejnosměrný oligonukleotid k oblasti iniciace translace (sekvence číslo 2), náhodný oligomer 5' AACGTGGATTGGCAG 3' (sekvence číslo 13), který se liší od sekvence číslo 1 čtyřmi nesouhlasy a míchaněsměrný oligomer 5' GAACGGAGACGGTTT 3' (sekvence číslo 14). Buňky se inkubovaly s oligomery a bez nich 3 dny a počet buněk se počítal Coulterovým čítačem. Růst a inhibice se počítaly, jak je popsáno dříve. Výsledky jsou ukázány na obrázku 12. Získaly se různé stupně inhibice růstu, c-myc protisměrné oligonukleotidy sekvence číslo 7 a 10 daly podobný stupeň inhibice růstu lidských SMC ve srovnání se sekvencí číslo cílenou na oblast iniciace
- a míchané translace'1·'*' Stejnosměrné (sěnse), náhodné (mis) (ser) oligomery nepůsobily žádnou inhibici růstu.
Výsledky na obrázku 12 jsou’ vyjádřeny jako průměr tří pozorování. Pokus se dvakrát opakoval. Dostaly se podobné výsledky.
Všechny odkazy citované s ohledem na syntetické, preparativní a analytické postupy jsou sem zahrnuty odkazem.
Tento vynález lze uskutečnit v jiných specifických formách, aniž by se odchýlily od jeho ducha nebo jeho podstatných atributů a tedy by se měl brát ohled na připojené nároky spíše, než na, předcházející popis jako‘vymezení rozsahu vynálezu.
Seznam sekvencí ’ .
(1) Všeobecná informace:
(i) Přihlašovatel: Universita Thomase Jeffersona (ii) Název vynálezu: Protisměrná inhibice c-myc modulující množení buněk hladkého svalstva (iii) Počet sekvencí: 14 (iv) Adresa korespondence1* (A) Adresát: Seidel, gonda, Lavorgna a Monaco, P.
C.
(B) Ulice: Two Penn Center, Suitě 18000 (C) Město: Philadelphia (D) Stát: PA (E) Země: USA (F) ZIP: 19102 (v) Strojně čitelná forma:
(A) Typ media: Disketa 3.5 palce 720 Kb (B) Počítač IBM PS/2 ' (C) Operační systém: MS/DOS (D) Software: WordPerfect 5.1 (vi) Údaje o této přihlášce:
(A) Číslo přihlášky: h/a (B) Datum přihlášení: totéž (C) Klasifikace:
(vii) Údaje o předešlé přihlášce:
(A) Číslo přihlášky: 004,799 (B) Datum přihlášení: 7. ledna 1993 (viii) Informace o zástupci:
(A) Jméno: Daniel A. Monaco (B) Registrační číslo: 30,480 (C) Referenční číslo: 8321-9 (ix) Informace o telekomunikaci (A) Telefon: (215) 568-8383 (B) Telefax: (215) 568-5549 r Informace o.sekvenci 1 .
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 15 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovitost: jednoduchá . (D) Topologie: lineární * (iv) Protisraěrnost: ano (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 1:
AACGTTGAGG GGCAT 15
Informace o sekvenci 2 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 15 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovitost: jednoduchá -(D) Topologie: lineární (iv) Protisměrnost: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 2:
ATGCCCCTCA ACGTT 15 “ . 41
Informace o sekvenci 3 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 15 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovítost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protisměrnost: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 3:
TACGGGTTG AGCAA 15
Informace o sekvenci 4 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protisměrnost: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 4:
TGGTGCTCCA TGAGGAGACA 20
Informace o sekvenci 5 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ív) Protisměrnost: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 5:
GTGTTCAAC TGTTCTCGTC 20
Informace o sekvenci 6 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protisměrnost: ano (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 6:
AAAGTGCCCG CCCGCTGCTA 20
Informace o sekvenci 7 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protisměrnost: ano (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 7:
GGGAGAGAGTCG CGTCCTTGCT 20
Informace o sekvenci 8 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární ··(iv) Protisměrnost: ano (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 8:
CCAGTGCAAA GTGCCCGCCC 20
Informace o sekvenci 9 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovitost: jednoduchá (Dj Topologie: lineární (iv) Protisměrnost: ano (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 9:
GGCCTTTTCA TTGTTTTCCA 20
Informace o sekvenci 10 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protisměrnost: ano (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 10: TCATGGAGCA CCAGGGGCTC 20
Informace o sekvenci 11 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovítost: jednoduchá .·>:>.· (D) Topologie: lineární (iv) Protisměrnost: ano (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 11:
CGGATCTCCC TTCCCAGGAC 20
Informace o sekvenci 12 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 . ., ..... ............ - . , (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protisměrnost::·, ano. .
(xi) Popis sekvence:: Sekvence; číslo 12:.
CGTTCTTTTT TCCCGCCAAC 20
Informace o sekvenci 13 , (i) Charakteristika sekvence·:
(A) Délka: 15 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protisměrnost: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 13:
AACGTGGATT GGCAG 15
Informace o sekvenci 14 (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 15 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězovítost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protisměrnost: ne (xi) Popis sekvence: Sekvence číslo 14:
GAACGGAGAC GGTTT 15
Claims (20)
1. Oligonukleotid podle nároku 1, vyznačující se tím, že je komplementární k oblasti mRNA kódující c-myc, přičemž je dlouhý 10 až 50 nukleotidů a nukleázně rezistentní.
2. Oligonukleotid podle nároku 1, vyznačující se tím, že je komplementární k iniciační oblasti translace mRNA kódující c-myc.
»
3. Oligonukleotid podle jednoho z předcházejících nároků , vyznačující se tím, že obsahuje nukleotidní sekvenci číslo 1.
4. Oligonukleotid podle nároku 3, vyznačující š e tím, že dále obsahuje fosforothioátní vazby.
7. Oligonukleotid podle nároku 1, vyznačující se tím, že je komplementární k oblasti mRNA kódující c-myc, přičemž dávka je v množství nanejvýš 5 mg.
8. Oligonukleotid podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje nukleotidní sekvenci číslo
1 a nukleázně rezistantni vazby a restenóza je v koronární artérii.
9. Oligonukleotid podle nároku 1, vyznačující š e tím,, že obsahuje nukleotidní mající sekvenci číslo 10 a nukleázně rezistantni vazby.
10. Oligonukleotid podle nároku 1, vyznačující se tím, že je komplementární k oblasti mRNA kódující c-myc, přičemž je nukleázně rezistentní.
11. Použití oligonukleotidů podle jednoho z nároků 1 až 10 pro přípravu léku pro modulaci rozrůstání buněk lidského hladkého svalstva in vivo.
12. Použití oligonukleotidů podle nároku 10, vyznačující se tím, že tento je komplementární k oblasti mRNA kódující c-myc a nukleázně rezistentní.
13. Použití oligonukleotidu -podle nároku 10, vyznačující se tím, že je komplementární k iniciační oblasti translace mRNA kódující c-myc.
14. Použití protisměrného oligonukleotidu specifického k c-myc pro přípravu léku pro léčení restenózy.
15. Použití oligonukleotidu podle nároku 14, vyznačující se tím, že je komplementární k oblasti mRNA kódující c-myc, přičemž je dlouhý 10 až
50 nukleotidů a nukleázně rezistentní.
16. Použití oligonukleotidu podle nároků * 14 nebo 15, vyznačující se tím, že je komplementární k iniciační oblasti translace mRNA kódující c-myc.
17. Použití oligonukleotidu podle nároku 14, vyznačující se t í m j že obsahuje nukleotidní sekvenci číslo 1, přičemž je dlouhý 10 až 50 nukleotidů.
18. Použití oligonukleotidu podle nároku 14, vyznačující se tím, že tento obsahuje nukleotidní sekvenci číslo 7.
T9z-Použití-oTigonukleotidu-podle-nároku—-1-4-7 vyznačující se tím, že tento obsahuje nukleotidní sekvenci číslo 10.
20. Použití oligonukleotidu podle nároku 14, vyznačující se tím, že lék obsahuje dávku oligonukleotidu v množství nejvýše 5 mg.
*
23. Použití oligonukleotidu podle nároku 14, vyznačující se tím, že lék obsahuje dávku oligonukleotidu v množství nejvýše 1 mg;
24. Použití oligonukleotidu podle nároku 14, vyznačující -se tím, že oligonukleotid je místně aplikován po: dobu 30 až 180 sekund.
25. Použití oligonukleotidu podle jednoho z nároků 11 až 24, vyznačující se tím, že tento obsahuje fosforothiové vazby.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US479993A | 1993-01-07 | 1993-01-07 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ172395A3 true CZ172395A3 (en) | 1996-03-13 |
Family
ID=21712588
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ951723A CZ172395A3 (en) | 1993-01-07 | 1994-01-07 | Oligonucleotide and the use thereof |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6159946A (cs) |
EP (1) | EP0690726B1 (cs) |
JP (1) | JPH08505397A (cs) |
KR (1) | KR100316205B1 (cs) |
CN (1) | CN1119830A (cs) |
AT (1) | ATE208634T1 (cs) |
AU (1) | AU685080B2 (cs) |
BR (1) | BR9405707A (cs) |
CA (1) | CA2153158A1 (cs) |
CZ (1) | CZ172395A3 (cs) |
DE (1) | DE69429087T2 (cs) |
DK (1) | DK0690726T3 (cs) |
ES (1) | ES2167358T3 (cs) |
HU (1) | HU220969B1 (cs) |
PT (1) | PT690726E (cs) |
WO (1) | WO1994015646A1 (cs) |
Families Citing this family (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6515009B1 (en) | 1991-09-27 | 2003-02-04 | Neorx Corporation | Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells |
AU685080B2 (en) * | 1993-01-07 | 1998-01-15 | Thomas Jefferson University | Antisense inhibition of C-MYC to modulate the proliferation of smooth muscle cells |
DE69429539T2 (de) * | 1993-10-15 | 2002-09-05 | Thomas Jefferson University, Philadelphia | Inhibierung der synthese von extrazellulärer matrix mittels "antisense"-zusammensetzungen, die gegen c-myc gerichtet sind |
US6323184B1 (en) * | 1993-10-15 | 2001-11-27 | Thomas Jefferson University | Arteriovenous and venous graft treatments: methods and compositions |
US6133242A (en) * | 1993-10-15 | 2000-10-17 | Thomas Jefferson Univerisity | Inhibition of extracellular matrix synthesis by antisense compounds directed to nuclear proto-oncogenes |
WO1996024334A1 (en) * | 1995-02-10 | 1996-08-15 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Lipid constructs for cytoplasmic delivery of agents |
US5660855A (en) * | 1995-02-10 | 1997-08-26 | California Institute Of Technology | Lipid constructs for targeting to vascular smooth muscle tissue |
US6265389B1 (en) | 1995-08-31 | 2001-07-24 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Microencapsulation and sustained release of oligonucleotides |
AU7596496A (en) * | 1995-10-19 | 1997-05-07 | Johnson & Johnson Interventional Systems | Conjugation of c-myc antisense oligonucleotides with cholesterol to significantly enhance their inhibitory effect on neointimal hyperplasia |
US5681558A (en) * | 1995-11-30 | 1997-10-28 | Berlex Laboratories, Inc. | Method of using beta-interferons to treat restenosis |
EP1007650B1 (en) | 1997-04-10 | 2009-03-18 | Stichting Katholieke Universiteit University Medical Centre Nijmegen | Pca3, pca3 genes, and methods of use |
CA2340322A1 (en) * | 1998-08-13 | 2000-02-24 | Johnson & Johnson Research Pty Limited | Dnazymes and methods for treating restenosis |
KR20010102992A (ko) * | 1999-01-29 | 2001-11-17 | 추후보정 | 표적 rna를 검출하는 비-침입적 방법 |
US7094765B1 (en) * | 1999-01-29 | 2006-08-22 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense restenosis composition and method |
KR20000065690A (ko) * | 1999-04-08 | 2000-11-15 | 박종구 | 반응 특이성 및 안정성을 개선시킨 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, 안티센스 dna 및 그 제조방법 |
AU7636400A (en) | 1999-09-29 | 2001-04-30 | Diagnocure Inc. | Pca3 messenger rna species in benign and malignant prostate tissues |
DE60115203T2 (de) | 2000-01-24 | 2006-08-03 | Biocompatibles Uk Ltd., Farnham | Beschichtete implantate |
WO2001072203A2 (en) * | 2000-03-24 | 2001-10-04 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Therapy of proliferative disorders by direct irradiation of cell nuclei with tritiated nuclear targeting agents |
WO2002034908A2 (en) * | 2000-10-23 | 2002-05-02 | Mermaid Pharmaceuticals Gmbh | Method for temporally controlling antisense-mediated gene inactivation |
CA2447052A1 (en) * | 2001-05-17 | 2002-11-21 | Avi Biopharma, Inc. | Combined approach to treatment of cancer using a c-myc antisense oligomer |
US20050159378A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-07-21 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
US7893248B2 (en) * | 2002-02-20 | 2011-02-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
US7241581B2 (en) * | 2002-08-16 | 2007-07-10 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Methods of identifying compounds that modulate IL-4 receptor-mediated IgE synthesis utilizing a c-MYC protein |
US7407672B2 (en) * | 2002-11-04 | 2008-08-05 | National Heart Center | Composition derived from biological materials and method of use and preparation |
ES2420914T3 (es) | 2002-11-13 | 2013-08-27 | Genzyme Corporation | Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B |
EP2336318B1 (en) | 2002-11-13 | 2013-04-24 | Genzyme Corporation | Antisense modulation of apolipoprotein b expression |
US7781415B2 (en) * | 2003-02-07 | 2010-08-24 | Roche Madison Inc. | Process for delivering sirna to cardiac muscle tissue |
EP1592809B1 (en) | 2003-02-07 | 2013-04-10 | Diagnocure Inc. | Method to detect prostate cancer in a sample |
ES2351976T3 (es) | 2003-04-29 | 2011-02-14 | Avi Biopharma, Inc. | Composiciones para mejorar el transporte y la eficacia antisentido de análogos de ácidos nucleicos en células. |
US20050288246A1 (en) | 2004-05-24 | 2005-12-29 | Iversen Patrick L | Peptide conjugated, inosine-substituted antisense oligomer compound and method |
CA2491067A1 (en) | 2004-12-24 | 2006-06-24 | Stichting Katholieke Universiteit | Mrna rations in urinary sediments and/or urine as a prognostic marker for prostate cancer |
US8067571B2 (en) | 2005-07-13 | 2011-11-29 | Avi Biopharma, Inc. | Antibacterial antisense oligonucleotide and method |
KR100818047B1 (ko) | 2005-11-25 | 2008-03-31 | 한국원자력연구원 | 평활근-22α의 활성을 억제하여 암세포의 사멸을 촉진하는방법 및 평활근-22α의 활성 억제제를 유효성분으로포함하는 항암제 |
AU2008271050B2 (en) * | 2007-06-29 | 2014-11-06 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Tissue specific peptide conjugates and methods |
US20100016215A1 (en) | 2007-06-29 | 2010-01-21 | Avi Biopharma, Inc. | Compound and method for treating myotonic dystrophy |
CN102317458B (zh) * | 2008-12-04 | 2018-01-02 | 库尔纳公司 | 通过红细胞生成素(epo)天然反义转录物的抑制对epo相关疾病的治疗 |
US20110269665A1 (en) | 2009-06-26 | 2011-11-03 | Avi Biopharma, Inc. | Compound and method for treating myotonic dystrophy |
US8946182B2 (en) * | 2010-01-25 | 2015-02-03 | Curna, Inc. | Treatment of RNASE H1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to RNASE H1 |
CN103180445B (zh) * | 2010-10-22 | 2018-02-16 | 库尔纳公司 | 通过抑制α‑L‑艾杜糖醛酸酶(IDUA)的天然反义转录物而治疗IDUA相关疾病 |
US9161948B2 (en) | 2011-05-05 | 2015-10-20 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Peptide oligonucleotide conjugates |
US9228189B2 (en) * | 2012-10-26 | 2016-01-05 | Geron Corporation | C-myc antisense oligonucleotides and methods for using the same to treat cell-proliferative disorders |
WO2016033424A1 (en) | 2014-08-29 | 2016-03-03 | Genzyme Corporation | Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b |
US11020417B2 (en) | 2015-06-04 | 2021-06-01 | Sarepta Therapeutics, Inc | Methods and compounds for treatment of lymphocyte-related diseases and conditions |
WO2018118599A1 (en) | 2016-12-19 | 2018-06-28 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5276019A (en) * | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US5264423A (en) * | 1987-03-25 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
SE462364B (sv) * | 1988-09-30 | 1990-06-18 | Goeran Hansson | Anvaendning av gamma-interferon foer beredning av ett preparat foer behandling av vaskulaer stenos |
US5245022A (en) * | 1990-08-03 | 1993-09-14 | Sterling Drug, Inc. | Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides |
NZ239247A (en) * | 1990-08-03 | 1993-11-25 | Sterling Drug Inc | Oligonucleosides containing a non-phosphate inter nucleoside linkage |
US5122048A (en) * | 1990-09-24 | 1992-06-16 | Exxon Chemical Patents Inc. | Charging apparatus for meltblown webs |
EP0558697A1 (en) * | 1991-06-28 | 1993-09-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Localized oligonucleotide therapy |
WO1993008845A1 (en) * | 1991-11-08 | 1993-05-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Localized oligonucleotide therapy |
US5756476A (en) * | 1992-01-14 | 1998-05-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibition of cell proliferation using antisense oligonucleotides |
US5821234A (en) * | 1992-09-10 | 1998-10-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Inhibition of proliferation of vascular smooth muscle cell |
AU5961094A (en) * | 1992-12-31 | 1994-08-15 | Texas Biotechnology Corporation | Antisense molecules directed against a platelet derived growth factor receptor related gene |
WO1994015645A1 (en) * | 1992-12-31 | 1994-07-21 | Texas Biotechnology Corporation | Antisense molecules directed against genes of the raf oncogene family |
AU685080B2 (en) * | 1993-01-07 | 1998-01-15 | Thomas Jefferson University | Antisense inhibition of C-MYC to modulate the proliferation of smooth muscle cells |
CA2164632A1 (en) * | 1993-06-11 | 1994-12-22 | John P. Cooke | Treatment of vascular degenerative diseases by modulation of endogenous nitric oxide production or activity |
DE69429539T2 (de) * | 1993-10-15 | 2002-09-05 | Thomas Jefferson University, Philadelphia | Inhibierung der synthese von extrazellulärer matrix mittels "antisense"-zusammensetzungen, die gegen c-myc gerichtet sind |
-
1994
- 1994-01-07 AU AU60235/94A patent/AU685080B2/en not_active Ceased
- 1994-01-07 CA CA002153158A patent/CA2153158A1/en not_active Abandoned
- 1994-01-07 WO PCT/US1994/000265 patent/WO1994015646A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-01-07 EP EP94906558A patent/EP0690726B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-07 CN CN94190891A patent/CN1119830A/zh active Pending
- 1994-01-07 AT AT94906558T patent/ATE208634T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-01-07 BR BR9405707A patent/BR9405707A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-01-07 HU HU9502061A patent/HU220969B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-01-07 PT PT94906558T patent/PT690726E/pt unknown
- 1994-01-07 KR KR1019950702808A patent/KR100316205B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-01-07 ES ES94906558T patent/ES2167358T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-07 JP JP6516242A patent/JPH08505397A/ja not_active Ceased
- 1994-01-07 DE DE69429087T patent/DE69429087T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-01-07 DK DK94906558T patent/DK0690726T3/da active
- 1994-01-07 CZ CZ951723A patent/CZ172395A3/cs unknown
- 1994-01-07 US US08/481,341 patent/US6159946A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US6159946A (en) | 2000-12-12 |
PT690726E (pt) | 2002-05-31 |
AU685080B2 (en) | 1998-01-15 |
ATE208634T1 (de) | 2001-11-15 |
HUT71937A (en) | 1996-02-28 |
HU220969B1 (hu) | 2002-07-29 |
CN1119830A (zh) | 1996-04-03 |
KR960700076A (ko) | 1996-01-19 |
ES2167358T3 (es) | 2002-05-16 |
DK0690726T3 (da) | 2002-03-11 |
KR100316205B1 (ko) | 2002-04-24 |
EP0690726A4 (en) | 1998-10-07 |
HU9502061D0 (en) | 1995-09-28 |
WO1994015646A1 (en) | 1994-07-21 |
CA2153158A1 (en) | 1994-07-21 |
EP0690726B1 (en) | 2001-11-14 |
DE69429087D1 (de) | 2001-12-20 |
AU6023594A (en) | 1994-08-15 |
BR9405707A (pt) | 1996-08-06 |
JPH08505397A (ja) | 1996-06-11 |
EP0690726A1 (en) | 1996-01-10 |
DE69429087T2 (de) | 2002-07-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0690726B1 (en) | Antisense inhibition of c-myc to modulate the proliferation of smooth muscle cells | |
US6133242A (en) | Inhibition of extracellular matrix synthesis by antisense compounds directed to nuclear proto-oncogenes | |
Carter et al. | Antisense technology for cancer therapy: does it make sense? | |
AU714658B2 (en) | Arteriovenous and venous graft treatments: methods and compositions | |
EP1340765A2 (en) | Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides | |
JP2010184933A (ja) | bcl−2遺伝子発現の調節 | |
US6080727A (en) | Oligonucleotide treatments and compositions for human melanoma | |
CA2105595A1 (en) | Antisense polynucleotides | |
WO1997012899A1 (en) | S-dC28 AS AN ANTIRESTENOSIS AGENT AFTER BALLOON INJURY | |
EP0732940B1 (en) | Inhibition of extracellular matrix synthesis by antisense compounds directed to c-myc | |
US5856461A (en) | Oligonucleotides to inhibit the expression of isoprenyl protein transferases | |
US5935937A (en) | Compositions and methods for inducing apoptosis | |
Prins et al. | Antisense of oligonucleotides and the inhibition of oncogene expression | |
US7501400B1 (en) | Inhibition of gastric acid production and/or secretion | |
JP2002512025A (ja) | インテグリンαv−サブユニット発現の抑制のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド | |
Sang Cho-Chung | Overview: Oncologic, Endocrine & Metabolic Antisense oligonucleotides for the treatment of cancer | |
Camenzind et al. | Local delivery of antisense oligomers to c-myc for the prevention of restenosis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |