CS260066B1

CS260066B1 - Mouse lymphocytar hybridome producing monocline immunoglubulin against human chorionic gonadotropin hormone

Info

Publication number: CS260066B1
Application number: CS871040A
Authority: CS
Inventors: Vladimir Holan; Alena Zajicova; Helena Storchova
Original assignee: Vladimir Holan; Alena Zajicova; Helena Storchova
Priority date: 1987-02-17
Filing date: 1987-02-17
Publication date: 1988-11-15
Also published as: CS104087A1

Abstract

Jedná se o prostředek použitelný k časnému průkazu těhotenství a ke sledování úspěšnosti léčby některých nádorových onemocněni. Podstatou je monoklonální protilátka proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu /HCG/. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS H-3G4 je uložen ve Sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze.It is a usable tool to early detection and monitoring the success of some cancer treatments disease. The essence is monoclonal anti-human choriogonadotropic antibody hormone (HCG). Mice lymphocytic CZG H-3G4 IMG hybrid is stored in the Collection of hybridomas OAS of molecular genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences in Prague.

Description

Vynález se týká myšího mynfooytárního hybridomu produkujícího monoklonální imunoglobulín proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu. Jedná se o hybridní buněčnou linii, která byla sestrojena fúzí buněk myelomové linie SP2/0 a myších slezinných buněk produkujících protilátky proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu /HCG/. Tento hormon je prokazatelný v krvi a v moči těhotných žen a zcela chybí u netěhotných.The invention relates to a murine mynfooytic hybridoma producing a monoclonal immunoglobulin against human chorionic gonadotropic hormone. It is a hybrid cell line that has been constructed by fusing cells of the myeloma line SP2 / 0 and murine spleen cells producing antibodies against human chorionic gonadotropic hormone (HCG). This hormone is detectable in the blood and urine of pregnant women and is completely absent in non-pregnant women.

Jeho výskyt v organismu začíná po implantaci oplozeného vajíčka /okolo 8. dne po ovulaci/ a koncentrace HCG pak prudce stoupá. Na průkazu přítomnosti HCG v organismu jsou založeny diagnostické testy na těhotenství.Its occurrence in the body begins after implantation of fertilized egg (about 8 days after ovulation) and the concentration of HCG then increases sharply. Diagnostic tests for pregnancy are based on evidence of HCG presence in the body.

Potřeba časné a spolehlivé diagnostiky těhotenství vyvstává nyní zvláště v souvislosti se zaváděním miniinterupcí, jejichž provedení je vázáno na první týdny po početí. S tím také vzrůstají požadavky na zvýšení citlivosti a spolehlivosti diagnostického testu.The need for early and reliable diagnosis of pregnancy now arises especially in connection with the introduction of mini-abortions, which are tied to the first weeks after conception. As a result, there is an increasing demand to increase the sensitivity and reliability of the diagnostic test.

Dosavadní diagnostické testy využívají imunologické reakce konvenčních antisér připravených imunizací králíků purifikovaným HCG. Sérum imunizovaných zvířat je zdrojem protilátek pro imunologické testy. Nevýhodou přípravy těchto konvenčních antisér -ge požadavek na vysoce purifikovaný hormon pro jejich přípravu a jednotlivé šarže antisér se liší svou aktivitou a obsahují značně heterogenní směs protilátek. Je známo, že HCG a další podobné hormony /LH,Previous diagnostic tests utilize immunological reactions of conventional antisera prepared by immunizing rabbits with purified HCG. The serum of immunized animals is a source of antibodies for immunoassays. The disadvantage of the preparation of these conventional antisera -ge the requirement for highly purified hormone for their preparation and the individual batches of antisera differ in their activity and contain a considerably heterogeneous mixture of antibodies. It is known that HCG and other similar hormones / LH,

FSH/ mají vysokou podobnost svého alfa řetězce a části beta řetězce, a proto polyvalentní konvenční protilákty proti HCG reagují i s těmito hormony. Z důvodů určité basálni koncentrace LH i u netěhotných žen aglutinačni testy využívající konvenčni protilátky nejsou schopné specificky prokázat méně než 50 IU HCG/1 a tudíž těhotenství tak nemůže být těmito protilátkami prokázané dříve než za 7 až 10 dní po vynechání menzes.FSHs have a high similarity to their alpha chain and part of the beta chain, and therefore polyvalent conventional anti-HCG antibodies also react with these hormones. Due to a certain basal LH concentration even in non-pregnant women, conventional antibody-based agglutination tests are not able to specifically detect less than 50 IU HCG / L and therefore pregnancy cannot be detected by these antibodies until 7 to 10 days after omission.

Pomoci rozsáhlého vyhledávacího testování je možné vyselektovat takové produkty hybridomů - monoklonální protilátky - které reagují jen s jedinou antigenní determinantou na beta podjednotce HCG, která je specifická pro molekulu HCG a která chybí na molekulách ostatních hormonů. Taková monoklonální protilátka je využitelná pro specifickou detekci HCG. To umožňuje zcitlivění doposud používaných aglutinačních testů a zavedení nových forem diagnostických testů, jako jsou testy enzymoimunologické a radioimunologické.Through extensive screening, it is possible to select those hybridoma products - monoclonal antibodies - that react only with a single antigenic determinant on the HCG beta subunit that is specific for the HCG molecule and that is absent on other hormone molecules. Such a monoclonal antibody is useful for the specific detection of HCG. This makes it possible to sensitize the agglutination tests hitherto used and to introduce new forms of diagnostic tests, such as the enzyme-immuno-and radio-immuno-tests.

Využití monoklonálních protilátek proti HCG umožňuje zcitlivění detekce HCG. Úspěšná příprava monoklonálních protilátek proti HCG byla již v zahraničí popsána a monoklonální protilátky jsou využívány pro citlivou diagnostiku gravidity.The use of anti-HCG monoclonal antibodies allows for sensitization of HCG detection. Successful preparation of monoclonal antibodies against HCG has been described abroad and monoclonal antibodies are used for sensitive diagnosis of pregnancy.

Podstatou vynálezu je myši lymfocytární hybridom produkující monoklonální imunoglobulín proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu uložený ve Sbírce hybridomů ÚMG ČSAV v Praze 6, Flemingovo nám. 2, pod označením IMG CZAS H-3G4.The subject of the invention is a murine lymphocyte hybridoma producing monoclonal immunoglobulin against human chorionic gonadotropic hormone deposited in the Collection of Hybridomas of the IMG CSAV in Prague 6, Flemingovo nam. 2, under the designation IMG CZAS H-3G4.

Uvedený hybridom byl získán fúzí slezinných buněk z BALB/c myší opakovaně imunizovaných HCG s buňkami myelomové linie SP2/0 způsobem známým z odborné literatury /Fazekas de St.Said hybridoma was obtained by fusing spleen cells from BALB / c mice re-immunized with HCG with cells of the myeloma line SP2 / 0 according to the method known in the literature / Fazekas de St.

Groth, S., Scheidigger, D. : J. Xmmunol. Methods 35: 1, 1980/ a klonováním získané populace hybridních buněk. Hybridom H-3G4 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných'pro živočišné buňky a je adaptován pro růst.in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Buňky hybridomu H-3G4 jsou uchovávány v kapalném dusíku a po jejich rozmražení je možné zahájit produkci monoklonálních protilátek bez dalšího požadavku na antigen.Groth, S., Scheidigger, D.: J. Xmmunol. Methods 35: 1, 1980) and cloning the obtained hybrid cell population. The H-3G4 hybridoma can be cultured in vitro in media suitable for animal cells and is adapted for growth in vivo in the peritoneal cavity of BALB / c mouse mice. H-3G4 hybridoma cells are stored in liquid nitrogen and once thawed, monoclonal antibody production can be started without further antigen requirement.

Základním kultivačním médiem pro buňky hybridomu H-3G4 je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí obohacené o neesenciální aminokyseliny. Toto médium /označované H-MEMd - Ústav molekulární genetiky ČSAV/ je pro kultivace hybridomů doplněno antibiotiky /penicilín, streptomycin/ a 10»inaktivovaného telecího séra. Hybridom je kultivován při 37 °C a produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulín podtřídy IgGl. Tato protilátka reaguje v enzymoimunologickém testu /ELISA/ s částečně purifikovanou beta podjednotkou HCG, s celou molekulou HCG, ale nereaguje s preparáty močových proteinů netěhotných žen /obsahující hormony LH, FSH a další bílkoviny/.The basic culture medium for H-3G4 hybridoma cells is Eagle's minimal essential medium with Hanks salt mixture enriched with non-essential amino acids. This medium (called H-MEMd - Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences) is supplemented with antibiotics (penicillin, streptomycin) and 10 inactivated calf serum for hybridoma cultivation. The hybridoma is cultured at 37 ° C and the antibody produced is a monoclonal immunoglobulin of IgG1 subclass. This antibody reacts in an enzymatic immunoassay (ELISA) with partially purified beta subunit HCG, with the whole HCG molecule, but does not react with non-pregnant female urinary protein preparations (containing LH, FSH and other proteins).

Příprava monoklonální protilátky x 10⁶ hybridomových .buněk je aplikováno do peritoneální dutiny myším kmene BALB/c, kterým byl 7 až 10 dní před podáním hybridomových buněk injikován do peritoneální dutiny 1,0 ml přistanu /2,6,10,14-tetrametylpentadekan/ nebo parafinové oleje. Po 7 až 12 dnech růstu hybridomů se u myší vytváří v peritoneální dutině ascitická tekutina /4-6 ml/myš/, která obsahuje 1 až 3 mg protilátky, na ml. Imunoglobulin může být částečně purifikován z ascitické tekutiny precipitací síranem amonným.Preparation of monoclonal antibody x 10 ⁶ hybridoma cells is injected into the peritoneal cavity of a BALB / c mouse mouse injected into the peritoneal cavity with 1.0 ml of pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) 7-10 days prior to the administration of the hybridoma cells. or paraffin oils. After 7-12 days of hybridoma growth, mice develop ascitic fluid (4-6 ml / mouse) containing 1 to 3 mg antibody per ml in the peritoneal cavity. The immunoglobulin may be partially purified from the ascites fluid by ammonium sulfate precipitation.

Protilátka přítomná v ascitické tekutině reaguje v enzymoimunologickém testu /ELISA/ s HCG při ředění do titru více než 1:100 000. V radioimunologických testech /RIA/ vykazuje tato protilátka specififckou reaktivitu s HCG při jejím pracovním ředění do titru 1:340 000 a může prokázat méně než 50 mlU HCG/ml. Vykazuje rychlejší ustavení chemické rovnováhy reakce s antigenem než doposud používané polyvalentní protilátky. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem H-3G4 byla již ověřena na souborech pacientek s počátečními stádii gravidity a s nádorovými onemocněními urogenitálního traktu a byla prokázána její vhodnóst pro výrobu souprav RIA a ELISA testů ke klinickému průkazu HCG.The antibody present in the ascites fluid reacts in an enzyme-immunoassay (ELISA) with HCG at a dilution of more than 1: 100,000. In radioimmunoassays (RIA), this antibody exhibits specific reactivity with HCG at its working dilution to a titre of 1: 340,000 and demonstrate less than 50 mlU HCG / ml. It shows a faster establishment of the chemical equilibrium of the reaction with the antigen than the polyvalent antibodies used hitherto. The monoclonal antibody produced by the H-3G4 hybridoma has already been tested in patients with early pregnancy and urogenital tract cancer and has been shown to be suitable for the production of RIA and ELISA kits for the clinical detection of HCG.

Claims

Mouse lymphocyte hybridoma IMG CZAS H-3G4, producing a monoclonal immunoglobulin against human chorionic gonadotropic hormone.