CN87107227A

CN87107227A - 通过器官发生和体细胞克隆变异使大豆属物种进行整株植物的再生

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Publication number: CN87107227A
Application number: CN198787107227A
Authority: CN
Inventors: 厄沙B·巴韦尔; 杰克M·惠特霍姆
Original assignee: Illinois State University; Lubrizol Genetics Inc
Current assignee: Mycogen Plant Science Inc; Illinois State University
Priority date: 1986-12-02
Filing date: 1987-12-02
Publication date: 1988-09-28
Also published as: CA1281905C; EP0270353A3; EP0270353A2; JPS63240724A; US4857465A

Abstract

本发明提供了一种产生大豆属物种(最好是Glycine max)，的器官发生组织培养物，并再生成整株植物的方法，该法涉及使用器官发生的组织培养基，而所说培养基中包括高浓度的细胞激动素(最好至少约为10μM BAP)，而且最好还包括至少约为正常浓度3倍的MS微量营养物。器官发生培养基适用于产生具有由体细胞克隆变异而诱发的所需性状的植物。

Description

本发明涉及从大豆和其他大豆属（Glycine或G.）物种的体外组织培养物再生成整株植物的器官发生方法，以及在所说物种中诱发体细胞克隆变异。

探求从组织培养物中获得大豆及其亲属再生的方法历来已久。大豆与烟草和矮牵牛这类容易再生的物种不同，以往对于将其从组织培养物再生成整株植物的大量尝试均未成功。组织培养物是十分理想的，它可以使所需的性状经由体细胞克隆变异引入大豆或能以此结籽的物种（如G.Soja）内。它们对遗传工程师也将有所稗益，可使细胞经土壤杆菌感染或采用其他手段而使之在培养物中转化，由此产生含有外来DNA的转化细胞，然后该转化细胞被再生成能结籽和表达外来基因的整株植物。

文献“D.A.Evans，et al（eds.）（1983）in Handbook of Plant Cell Culture，vol.l，at pp.178-179，”中讨论了通常用于植物体外繁殖体增殖的三种可能途径：（a）增强腋芽释放;（b）通过器官发生而产生不定枝;和（3）体细胞胚的发生。

从分生组织、嫩芽端或萌芽的培养物中进行腋芽再育而作为一种再生手段，它涉及使用业已在体内分化的初发枝。因此为得到整株植物，仅需使其伸长和进行根的分化。另一方面，体外器官发生和胚发生涉及发育变化：通常形成愈伤组织，其后再组合形成小植株。这对大多数植物来说均不易达到。埃文斯等人（上述文献178页）讨论了以往对大豆所用的器官发生法的失败原因，指出：“液芽再育的诱发似乎在许多情况下均可适用，例如香石竹和大豆，而器官发生法和胚发生法对此均告失败”。

在178至179页中，他们继续陈述：“虽然借助于器官发生和胚发生，小植株的增殖速率是惊人的，但经若干次传代培养后，它们的再生能力往往迅速降低，以至最终其形态适应能力完全丧失。另一方面，腋芽再育的初始增殖速率相当慢。然而，在最初的一些传代培养期间，增殖速率增加，并最终将在其后的传代培养循环期间达到稳定状态。”因此，这些作者推荐不同于器官发生和胚发生的腋芽再育法来用于大批生产。

“M.S.Wright，et al.，（1986）in“Plant Regeneration by organogenesis in Glycine max”，Plant Cell Reports，5：150-154”中描述了芽再育的方法。该法包括使Glycine max（L.）种子在含有无机盐（其浓度为推荐值的一半）和5μMBA（苄基腺嘌呤，也称作BAP，即苄氨基瞟呤，CAS注册号为1214-39-7）的MS培养基（Murashige，T.and Skoog，F.（1962）Physiol.Plant.15：473）上进行发芽。从发芽的幼苗上切去子叶节，并除去不是节的组织。将上述节组织的切片在发芽培养基上进行培养，然后移入相同的培养基中，但该培养基中无机盐的浓度仅为推荐值的1/4，而BA浓度仍为5μM。接着将节切细并移入另外的培养基中，最后移入包含土壤的培养基中，以使整株植物成熟。这一方法可看作是分生组织繁殖法，未经过反分化细胞的阶段。上述文献指示，大豆子叶节的特定表面区能被诱发而成为分生组织和出枝，并且在培养期间自始至终存在BA可使前期再生组织的枝形态的发生得以维持。

有关从组织培养物中再生含有G.max（大豆）和G.soja的大豆亚属Soja的方法，研究成功者廖廖无几，不过在诸如G.canescens和G.clandestina之类的野生型亲属中已取得很大成功。[D.F.Hildebrand，et al.，（1986），in a review article，“Soybean[Glycine max（L.）Merr.]，”Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol.2：Crops I（Y.P.S.Bajaj，ed.）283-308，（Table 4）]中概述了近年来有关大豆属体外再生的工作，并在293页上引用了以下讨论的题为“分生组织培养”的参改文献。

“K.K.Kartha，et al.（1981）“Plant Regenerat-ion from meristems of grain legumes：soybean，cowpea，peanut，chickpea and bean，”Can.J.Bot 59：1671-1679”中描述了在含有1μM NAA和0.05-0.1μM BA的培养基上，从大豆枝顶端分生组织中进行植物的再生。再生得到整株植物。在较高的BA浓度下形成愈伤组织，但未获得整株植物的再生。

“T.Kameya，et al.（1981），“Plant Regeneration from Hypocotyl Sections of Glycine Species，”Plant Sci.Lett.21：289-294”揭示了使用G.Canescens和G.tomentella幼苗的胚轴切片在加有不同浓度NAA和BA的MS培养基上进行培养，以再生成正常植物。在包括G.max和G.soja在内的8个试验物种中，仅观察到G.canescens的胚轴切片有较高的嫩芽再生频率，所用BA浓度为1-5mg/l（5-25μM）。

“T.Y.Cheng，et al.（1980），“Plant Regenerat-ion from Soybean Cotyledcnary Node Segments in Culture，”Plant Sci.Lett.19：91-99报道了用幼苗的调整子叶节片刺激培养物中大豆复枝芽的生成。所用的培养基含有0.25μM植物生长素IBA（吲哚丁酸）和5-50μM BAP。该法并不涉及愈伤组织的生成，而是使用分离块。若BAP浓度大于10μM，则会抑制主枝和根的生长，以及抑制子叶节区枝芽的生成。上述文献并未明确报道是否能再生得到可独立地在土壤中生长的整株植物。

“H.Saka，et al.（1980），“Stimulation of Multiple Shoot Formation of Soybean Stem Nodes in Culture，”Plant Sci.Lett.19：193-201”同样描述了用含有植物生长素IBA和5-50μM BAP的培养基，在G.max的茎节或顶端生成枝芽。文内还报道了愈伤组织的形成，它影响枝芽的生成。但上述文献既未报道在愈伤组织中出现新的分生组织，也未报道整株植物的再生。

上述参考文献无一对能产生新分生组织中心的组织培养物可被维持的器官发生的再生方法进行描述。

除了在希尔达布雷恩（Hildebrand）等人的综述性文章中所引用的上述参考文献外，下述参考文献对目前技术发展水平作了阐述。

“J.M.Widholm，et al.（1983），“Shoot Regener-ation from Glycine canescens Tissue Cultures，”Plant Cell Reports 2;19-20”报道了利用一些培养基，其中包括含有NAA和5mg/l（25μM）BAP的培养基，而使G.canescens子叶和胚根的愈伤组织诱发出芽。但未再生成整株植物，根的形成极少。

“W.D.Beversdorf，et al.，in”Degrees of Differentiation Obtained in Tissue Cultures of Glycine Species，”（1977）Crop Sci.17：307-311”中报道了已获得称为“生长中心”的类似分生组织细胞的密集小结节。

贝费斯道夫（Beversdorf）等人用含有2，4-D（2，4-二氯苯氧基乙酸）和/或NAA（α-萘乙酸），及0.5mg/l激动素（6-呋喃基氨基嘌呤）的诱发培养基来培养G.max及G.soja的胚轴切片，获得了“生长中心”，但并未进一步发育成小植株。

“C.A.Newell，et al.（1985）“Protoplast culture and plant regeneration in Glycine canescens，”Plant Cell Tissue Organ Culture 4：145-149”中描述了幼苗胚轴组织中取出的原生质体再生成为整株G.canescens植物。在所报道的一些实验中，嫩芽诱发培养基含有0.4mg/l（2μM）BA和0.1或1.0mg/l的NAA。

以上参考文献均未描述在含有高浓度BAP或其他细胞激动素的培养基中对包括G.max胚在内的未成熟胚进行培养，而获得整株植物的器官发生的再生。

本文发明人的最近工作如下：

由厄锡B.巴威尔（Usha B.Barwale）的题为“筛选大豆栽培品种的植物再生能力，并从未分化组织再生大豆植物”的硕士论文已于1986年3月16日列入伊利诺斯大学图书馆的图书目录中。这篇论文确定了用于本发明的器官发生培养基和在培养基中植物的发育。

“U.B.Barwale，et al.（1986）in“Screening of Glycine max and Glycine Soja Genotypes for Multiple Shoot Formation at the Cotyledonary Node，”Theor.Appl.Genet.72：423-428”中描述了在含有1或5μM BAP的B5培养基中178基因型种子的发芽现象，并计算出子叶节上所生成的枝的数目。

“H.R.Kerns，et al，（1986），“Correlation of Cotyledonary node shoot proliferation and Somatic embryoid development in suspension cultures of soybean（Glycine max L.Merr.）”，Plant Cell Reports 5：140-143”中揭示了用不含有细胞激动素的悬浮培养基、在胚轴中所取出的组织，以及从发芽种子的子叶组织上诱发胚的现象。胚的生成似乎与前面研究中的子叶节上所生成的嫩芽数相对应。但文献中并未对胚是能否再生成整株植物进行报道。

“U.B.Barwale，et al.（1986），“Plant regenerat-ion from callus cultures of several soybean genotypes viaembryogenesis and organogenesis，”Planta 167：473-481”报道了作为本专利申请依据的大量工作。

最近共同转让的有关不同的大豆属再生方法的专利申请在1986年8月4日向美国专利局提出申请，美国专利申请号为893，256（申请人为Glem B.Collins等人）。该申请描述了通过体细胞胚发生而再生G.max和其他大豆属物种的方法，方法中涉及到未成熟胚上切下的子叶组织进行培养。此申请对于在含有高浓度细胞激动素的培养基中培养整个胚，以获得器官发生的再生并未予以揭示，也未请求取得保护。

本发明提供了一种高效的大豆属物种（包括Glycine max，即大豆）的器官发生的再生方法，该法系通过充分地反分化培养，并经体细胞克隆变异，而发育成具有所需性状的植物。这一方法对所试验的全部大豆基因型均为有效。大豆是已知的最难再生的大豆属物种。本发明的器官发生法也适用于转化和细胞选择，以得到所需性状;以及悬浮培养和原生质体的产生。该法较之以前的体细胞胚发生的再生方法明显地有效得多。

本发明涉及在器官发生培养基上培养未成熟的胚，以形成器官组织培养物。所说培养基中含有细胞激动素，其中以BAP为佳，而细胞激动素的浓度应足够高，以防止胚发芽，并促使器官发生嫩芽的产生，为此，浓度至少宜为10μM左右，尤以约13μM-14μM范围内的浓度最佳，且最好不大于约15μM。

器官发生培养基可以是该技术领域公知的任何发芽培养基，但最好是MS培养基。培养基中必须含有微量营养物，其浓度应足以能促使器官发生枝的产生，而不是使胚发芽，最好至少是正常浓度的三倍左右，尤以正常浓度的4至6倍左右为更佳。

未成熟胚的大小约为1.5mm至10mm长，而用于放入培养基中的最好约为4至6mm长。

培养物被定期转移到新配制的培养基中，最好约每隔2至3周转移一次，并可使之连续生长，以产生体细胞克隆变异。

体细胞克隆变异可以自发地产生，也可通过在培养物上施加选择性压力而产生。本文所述的器官发生培养物可用来诱发体细胞克隆变异;或者也可使用该技术领域公知的，或文献中（例如美国专利申请号893，256，或上文提到的“U.B.Barwale，et al.（1986），Planta”所述的胚发生培养物。由体细胞克隆变异而产生的有效突变体系指提供具有下述性状之表型的突变体，这些性状是：雄性不育、双生种子、氨基酸的过度产生、抗病性、耐除草剂、耐逆境条件（例如耐热和耐冷）、能耐受不利的土壤条件（如有毒金属的存在）、以及成熟变异（如早熟）。

在组织培养阶段、再生体（Ro）阶段、Ro代的子代阶段（R₁）或由自交或回交亲本和祖亲本植物所产生的其后子代阶段均可观察到变异体表型。最好能在二个或二个以上子代中观察到变异体，以确保稳定遗传率。

为了从愈伤组织培养物再生整株植物，将培养物上再育的芽切碎后，放在该领域中公知的再生培养基上，并使之在光照下（最好是一个16小时的光周期）生长至适合移入生根培养基中的高度（最好约为1cm）。在无激素的生根培养基（最好是MS培养基）上生长后，可将植物移入具有土壤的培养基中，使之成熟。

在移入具有土壤的培养基中之前，最好先将植物移入液体培养基中，而该液体培养基宜包括含有特定微量营养物的，而浓度约为1/4的Hoagland溶液。通过使用这种液体培养基，植物的生长发育力和结籽能力大为提高。

俟植物长至适当高度，最好约为3英寸时，将其移入带有土壤的培养基中，并宜用含有镍离子的溶液施肥。

可对用上述方法从器官发生的愈伤组织中再生的植物进行选择，以选出变异体或非变异体的表型。

本文所用的术语“器官发生”和“器官发生培养物”系指在体外从愈伤细胞培养物中产生芽。器官发生培养物并不像胚发生培养物那样在形成嫩芽前产生体细胞胚，它亦不像腋芽再育或克隆其他类型植物组织的方法那样涉及在体内所形成的组织之繁殖。

大豆属物种系指包括G.max G.soja，的大豆属物种，以及诸如G.argyrea，G.canescens，G.clandestina，G.crytoloba，G.falcata，G.latifolia，G.latrobeana，G.tabacina和G.tomentella之类的野生型物种。

体细胞克隆变异是一种利用在实验室组织培养物中植物细胞内产生的自发遗传变化，以产生所需表型的技术。在文献“J.A.Miller（1985）“Somaclonal Variation，”Science News 128：120-121”（此处引用，以供参考）中对体细胞克隆变异进行了有益的讨论。

将大豆属物种的未成熟胚（最好是亚属soja，尤以Glycine max为更佳）进行培养，使之通过器官发生而再生成整株植物。未成熟胚的大小范围约从1.5mm至10mm，最好约从4mm至6mm。所说胚必须包括胚轴。业已证明，若将轴切除，则不会发生令人满意的器官发生。

将未成熟胚置于培养基上，进行平板培养。包括B5，L2和MS培养基（T.Murashige，et al.（1962），文献名称同上）在内的一些合适培养基为该技术领域的人们所公知。这些培养基中以MS培养基为佳。重要的是，培养基应含有高浓度的细胞激动素。一些细胞激动素已为该技术领域公知，这包括BAP（6-苄氨基嘌呤;也称作BA，即苄基腺嘌呤）、ADE（腺嘌呤硫酸盐）、玉米素、激动素和2-ip（2-异戊烷基腺嘌呤）。上述细胞激动素中以BAP较佳。而细胞激动素的浓度应足以防止胚发芽，最好不小于约10μM，尤以约13μM至14μM之间为更佳。并且其浓度不应太高，以防将胚杀死，最好不高于约15μM。

培养基内最好还含有植物生长素。可以使用该技术领域公知的植物生长素，例如NAA（α-萘乙酸），IAA（吲哚-3-乙酸）、IBA（吲哚-3-丁酸）（以上植物生长素均与NAA类同）;或2，4-D（2，4-二氯苯氧基乙酸）、毒莠定（4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸）pCPA（对氯苯氧基乙酸）、2，4，5-T（2，4，5-三氯苯氧基乙酸）和麦草畏（2-甲氧基，3，6-二氯-邻-茴香酸）（后面提到植物生长素均与2，4-D类同）。最好使用类似于NAA的植物生长素，尤以NAA为最佳。植物生长素的浓度应足以刺激生长，而当其为NAA时，则它的浓度最好应在约0.1μM和0.4μM之间，其中尤以0.2μM为最佳。

器官发生培养基的其他组分可以包括;（a）硫胺系，其用量最好约在0.5μM至5.9μM之间，尤以5.0μM为更佳;（b）脯氨酸，其浓度最好约在6mM至24mM之间，尤以12mM为更佳。这些组分对于包括A3127和Williams 82在内的大多数基因型来说并不是必不可少的，但可促进某些基因型生长。

此外，业已发现若将MS微量组分的浓度增加到至少约为正常浓度的3倍，而且最好增加到正常浓度的4至6倍左右。则可提高器官发生能力。所说微量组分是H₃BO₃、MnSO₄、ZnSO₄、KI、Na₂MoO₄、CuSO₄和CoCl₂。在较低的微量组分浓度时，亦即约为正常浓度的2倍或更低时，则发生胚发芽，而不是形成器官发生愈伤组织。微量组分的较佳形式和浓度示于表1b。

最初是将器官发生培养物在暗处和室温下培育约4周，直至生成适合转移大小的嫩芽。然后将嫩芽移入该领域内公知的再生培养基中，最好是表1a所示的MSR培养基或R5培养基。正如该技术领域的人们所知，存在许多适合芽再育的培养基，但对细胞激动素的浓度应予以考虑，使不致生成脆性的非器官发生的愈伤组织。当所用的细胞激动素是BAP时，再生培养基的浓度应小于约10μM。培养物应处于光照下在再生培养基上生长，最好在约为80μM质子/平方米·秒的冷白荧火灯下培育16小时左右，温度在白天约为室温（约25℃-28℃），而在夜里降低温度，最好约为18℃。

再生培养基不需要如同用于器官发生培养基那样的高浓度微量组分或微量营养物，最好采用表1a中MSR培养基或R5培养基的配方。

最好每隔2或3周将器官发生培养物从再生培养基移入新配制的再生培养基中，直至它们达到1cm左右的高度。此刻即将它们移入该技术领域中公知的生根培养基中。而生根培养基最好是无生长调节剂的MS培养基。

为尽量减少对植物造成的逆境压力，生根后可将植物移入溶液培养基，而该培养基中最好含有约为1/4浓度的Hoaqland溶液（Hoagland，D.R.，et al.（1950）“The Waterculture method for growing plants without soil，”California Agric Exp.Sta.Bull.No.347）最好在Hoagland溶液中添加含有KCl，H₃BO₃，MnSO₄，ZnSO₄，CuSO₄和（NH₄）₆Mo₇O₂₄的微量营养物溶液，以改善其性能，而且宜采用实施例1（见表2）中所示的形式和浓度。溶液培养基最好还含有铁盐，特别以Fe330（Sequestrine 330 Fe.Ciba-Geigy），为佳，而且pH宜为6.5左右。若略去溶液培养生长阶段，则再生后每株植物结籽的数量很少超过5个，而使用溶液培养基，则每株植物一般至少可结10颗以上的籽，最多可达100颗籽。而且经溶液培养生长阶段后，在土壤中的存活率也得以提高，约达80%，而不经过这一步的话，其存活率约为20%。植物需维持在溶液培养基中，直至它们生长到足够大，以致可以在不会发生损伤的情况下移入土壤，最好直至它们长到3英寸左右的高度，一般约在7至15天后。

液体培养生长后，将植物移栽到带有土壤的培养基上，培养基最好是具有下述配比的混合物∶泥炭藓∶蛭石∶土壤＝1∶1∶1。最好用含有镍离子的肥料溶液施在正在土壤中生长的植物上。较佳的肥料溶液如例1所述（见表3）。

器官发生组织培养物可被连续维持，每隔2至3周将其移入新配制的培养基中，由于每一愈伤组织可再被切成约4至6块，因而每次转移后可再生约10至40株植物。愈伤组织连续地形成分生组织部位，并长出芽。从这种愈伤组织物质（参见实施例2）再生得到的植物的突变程度是愈伤组织中高度反分化程度的征兆，事实上在不同的植物中均观察到分生组织中心。

从器官发生培养物再生所得值物中出现的较高变异体表型的发生率使其适用于诱发体细胞克隆变异。为了用器官发生培养物质诱发体细胞克隆变异，可向愈伤组织培养物选择性地施加压力。例如可以用完全中毒量或亚致死量的诸如镇草宁、百草枯和阿特拉津之类的除草剂施加到培养物中，以诱发一种能产生具有抗性的植物的抗性愈伤组织。通过增加超氧化岐化酶（它的存在可提供对疾病的抵抗力）之类的酶含量而产生对百草枯耐受性的突变是极其重要的。能耐受阿特拉津的能力对于减少除草剂所带来的损害是十分重要的，特别对于直接将这种化合物用于作物上是不可设想之处更是如此。

还可进行热（例如约40℃）和冷（例如约4℃）处理，以得到耐热和耐冷的愈伤组织，处理时间的长短不一，最好在植物再生前再进行试验。

业已知道在许多紧张条件下脯氨酸的含量会积聚起来，而脯氨酸已被证明能提高对某些逆境的耐受性。因此，例如通过选择对诸如羟基脯氨酸或氮杂-2-环丁烷羧酸盐之类的毒性脯氨酸类似物的耐受性，则可选出脯氨酸含量增高的突变。

也可以进行氨基酸选择，以提高种子中氨基酸含量，例如用乙硫氨酸之类的毒性甲硫氨酸类似物选择，可提高种子中甲硫氨酸的含量;而用5-甲基色氨酸之类的毒性类似物近行选择，而提高种子中色氨酸的含量。也可用毒性苯基丙氨酸类似物进行选择，以引起与抗虫害和疾病有关的多酚类的过度产生。

其他有用的选择包括耐毒性土壤条件的选择，如镉、铜、锌和铅之类毒性重金属的存在，以及氯化钠的存在或低pH值。

也可进行抗病性（例如褐茎腐病）的选择，以产生抗性株系，并最好用病原体培养物的滤液进行。

可由体细胞克隆变异诱发的其他有用性状包括雄性不育和早熟之类的发育性状。

另一方面，正如本文所述，在并未施加特别选择性压力的情况下出现许多突变。这些突变包括诸如雄性不育、早熟和双生种子之类所需性状。突变诱发后，应确定诱发表型的稳定性。再生植物（Ro代）自交形成R₁代。然后这一代自交形成R₂代，后者可自交形成R₃代。Ro植物不显示任何所需性状，其原因是它们大部分是杂合的，所观察到性状多半是稳性性状。在R₁代观察到的所需性状继续在R₂代出现，最好仍然在R₃代上出现，或R₂和R₁代回交，并观察到它们的分离型。可能需要其他的自交、回交或杂交代，以表明所需性状稳定性的所需程度。进行该领域中公知的统计分析，以确定这种稳定遗传。选出显示稳定遗传的植物，以进一步用于育种计划。

以下提供的实施例系用于说明的目的，并非用来对本发明进行限制。

实例，实例1：通过器官发生方法使大豆再生

除另外注明外，大豆种子是从位于Urbana的农业大豆种质收集中心美国分部得到的，并在大田里或暖房里生长。在这个研究中用的基因型是依靠在子叶节上多重芽形成测定而选择出来的[Barwale等（1986），《Theor.Appl，Genet.》supra]。高芽产物（8个或更多的芽）：

Ada PI 30.692 PI 79.739

Blackhawk PI 31.122 PI 404.155A

Carlin P I36.653 Sooty

中芽产物（6～8个芽）：

Adams J-88 PI 53.650A

Capitol J-103 Wayne

Century J-105 Wells

Earlyana Mitchell Wisconsin Black

Habaro PI 153.292

Henry PI 227.327

不经多重芽测定试验的系列：

白桦籽（Berch）和橡籽（Oak） J-122 Simpson

CN290 LN80-16017 Sparks

CN210 PI86.063 Williams79

33D Pixie Williams82

Harsoy Sherman

[所有的J系列是从Jacques种子公司（美国Wisconsin，prescott）得到的;A3127是从Asgrow种子公司（美国Michigan Kalamazoo）得到的;白桦籽（Birch）和橡籽（Qak）是从依利诺斯（Illinois）种子基地（美国Illinois Tolono）得到的，33D是从J.Harper博士（Urbana，Illinois大学）得到的。]

大小范围为0.5～10mm的胚胎从豆荚里切下来，豆荚已经用具有一滴Tween80（聚山梨糖醇酐单油酸乙烯酯《营养生物化学》美国俄玄俄州（Cleveland）的商用漂白粉制备的0.78%的Na OCl进行表面灭菌25～30分钟，并用足量灭菌过的去离子蒸馏水冲洗二次，每次至少冲洗5分钟。通过剥去种子衣将胚胎移出，种脐邻近的卵泡被割去，这样，保证了一个完整的胚胎。这些胚胎被置于器官发生（OR）培养基（表1a），并在暗处，25±2℃培养4星期。当使用EB培养基时，体细胞的胚胎形成优先于出芽。在OR培养基中形成的芽转移到再生培养基MSR和R5（表1a），白天在25℃下（光为冷白荧光灯的光，美国马塞，Fall River，Sylvania;约80μM光子m-2s-1光照16小时），夜间为18℃。器官发生的培养物每2或3星期转移一次，并且在MSR和R5培养基上，改变白天和夜间的温度以维持16小时的光周期。当芽长到约1cm高后，它们被转移到含有无激素的MS培养基[Murashige和Skoog（1962）supra]的试管中长根。植物长根后通常转移至暖房里，放于1升体积的以铝箔覆盖的罐头中，罐头中装有强度为0.25的Hoagland 1号溶液[Hoagland，D·R.，等（1950）supra]，并连续通气。在盖上开两个直径约1cm的孔，植物在这样的罐头中的海绵上生长，植物的根部浸没在液体中。

Hoagland溶液通过在每升Hoagland溶液中加入4ml如表2所述的次要营养元素溶液和2ml浓度为9.5g/l的Fe330溶液加以改进。所述溶液的pH为6.5。

表1a：用于这些实验的培养基组分，都用6g/l的Bact0-琼脂^a固化

培养基组份

OR MS主要盐+4x浓度的次要元素^b

+维生素B5^c+13.3μMBAp^d+

0.2μMNAA^d+5.0μM硫胺素

+12mM脯氨酸^d

EB MS基础培养基+43.0μMNAA+

5.0μM硫胺素+0.03μM菸酸^e

MSR MS基础培养基+1.7μMBAP+

0.2μMIBA^d

R5 MS基础培养基+9.8μMIBA+5.0

nMBAP+5μMGA^d ₃

a.美国米奇，Detroit，Difco实验室

b.MS主要和次要盐，根据Murashige和Skoog（1962），supra中所述的方法制备的。见表1b。

c.维生素B5，根据Gambog，OL等（1968）的“大豆根细胞的悬浮培养的营养需求”一文的方法的改进而制备的，该文刊登于《细胞研究实验》第50卷：151～158。见表1c。

d.Sigma化学公司，美国，MD.Louis街。不是对所有的基因型都必需的。

e.ICN营养生物化学，美国俄亥俄州，cleveland。

表1b：MS基础培养基的次要元素原料

（每升培养基用40ml的原料）

原液浓度在MS培养基中

（g/l）（g/l）

H₃BO₃0.6200 .02

MnSO₄.H₂O 1.5640 .06

（or MnSO₄4H₂O）（2.230）

ZnSO₄.7H₂O 0.8600 .03

KI 0.0830 .003

Na₂MoO₄.2H₂O 0.0250 .001

CuSO₄.5H₂O 0.0025 .0001

（or CuSO₄）（0.0016）

CoCl₂6H₂O 0.0025 .0001

表1c∶原液∶维生素B5

（每立升培养基中用10ml原液）

mg/100ml

菸酸 10

硫胺素盐酸盐 100

盐酸吡哆醇 10

肌醇 1克

表2：次要营养素原料-Hoaglands

q/l

KCl 3.728

H₃BO₃1.546

MnSO₄.7H₂O 0.846

ZnSO₄.7H₂O 0.575

CuSO₄.5H₂O 0.125

（NH₄）₆Mo₇O₂₄.4H₂O 0.0184

通常，不用生长调节剂，在MS培养基中长根后，绿色植物被转移至暖房中，当这种直接转移至土壤混合物时，植物存活率是很低的，并且这些植物保持小的个体。约5颗种子以上，植物方可稀少地产生;但是当植物首先在如上所述的Hoagland溶液中生长，然后再转移至土壤混合物时，植物的继续生长速率和生长会有很大的提高并且个体接近正常，除了几种只结2粒至3粒子的小植物。当在肥沃的暖房或大田里生长，得到的所有绿色植物可产10-100粒子，且从它们的籽实子（R₁）生长的植物可正常地发育。

8天后，上述植物被转移至1∶1∶1（泥炭藓∶蛭石∶土，体积比）的混合物里或大田里。植物用一种特殊肥料溶液施肥，该特殊肥料溶液由7.5g/l Peters20∶10∶20肥料（Peter肥料厂产品，W.R Grace CO.of Fogelsville，宾夕法尼亚州）制成。根据D.L.Eskew等（1983）“镍：用于豆和可能所有较高等植物的一种基本微量营养素”《Science》222：621～623，镍已被发现是一种用于豆类的基本微量元素。据此，如表3所示的微量元素原液被制备并加入至肥料溶液中，该肥料溶液也含有1mm Mg SO₄和10ppm Fe EDTA。微量营养素原液以7.5ml/l的量加入20∶10∶20肥料中。然后，将溶液稀释为1∶10～1∶20，50～100ml的量被用于以1天1次的频率施用到每一植物。

组织学的研究中，器官发生的愈伤组织通过浸没于福马林∶冰醋酸∶酒精（FAA，2∶1∶10+6份水，体积比）中24小时而固定。接着用叔丁醇脱水，材料在热空气炉55℃下被浸入或植入商用原生质（Monoject Scientific，美国Missouri，Lounis）中。要切片部分被切下（厚度为10μm），切出的带状物放到使用Haupt溶液（Johansen，D.A.（1940），《植物微技术》，Mc Graw-Hill出版，纽约，伦敦523）的载玻片上。然后，用二甲苯冲洗载玻片除去原生质，再在溶解于50%酒精中的Safranin0号12小时，以及在溶解于95%酒精中的显色绿（fast green）（sigma化学公司，美国密苏里州，路易斯街）中20～50秒以连续染色。

表3：微量元素肥料

6.25μM H₃BO₃38.65mg/l

1.0μM Mn5O₄.H₂O 169.0

2.0μM Zn5O₄.7H₂O 575

0.5μM Cu5O₄.5H₂O 123

0.5μM （NH₄）₂MoO₄98

0.01μM CoSO₄.H₂O 1.78

0.2μM NiSO₄.6H₂O 52.6

Add 5 ml/l conc.H₂SO₄

用于这种研究的54种大豆基因型包括高芽产物和低芽产物，产物是用多重芽形成测定法定义的，测定法则是由使用大豆种质（Barwale等，（1986），《Theor.Appl Genet》supra）的籽苗来进行的。在这个测定中，芽是以子叶结数计算的。基因型的选择包括各种集合中可见的形式，其中包括种子颜色，花朵颜色，成熟时间，种子来源和对疾病的敏感以及抵抗力。

所有的培养从处于不同发展阶段的，长度为0.5～10mm的未成熟的胚胎开始。

器官发生愈伤组织培养物是从生长在OR培养基上的未成熟大豆胚胎得到的，OR培养基具有高浓度（13.3μm）的6-苯甲氨嘌呤（BAP），0.2μMNAA，其浓度是标准MS培养基（表5）中的次要元素的4～5倍。临界因子是BAP浓度，作为低浓度（3.3和6.6μM），就产生低数量的器官发生培养物（表6）。次要元素的水平减少也会减少响应。当每一次要元素在较高的浓度下进行个别试验，而其他元素维持在正常水平（1X）时，只有较低水平的钼酸盐或铁似乎减少了响应。因此，看上去无特别的次要元素能清楚地控制这种响应。但是，最好的器官发生愈伤组织生长物只有当所有的次要因素都以高浓度存在时才能得到。初步实验表明：5～6mm长的胚胎给出了最大器官发生能力的培养物，在一些基因型，包括CV Williams 82中，可高达100%（表4）

表4：胚胎大小对于从未成熟大豆胚胎的愈伤组织培养器官发生的影响。在培养开始4星期后进行观察，使用CV.Williams 82，在OR培养基上，具有每次处理的40个胚胎。

大小（mm）器官发生（%）

1.5 0

2.0 0

3.0 21

4.0 53

5.0-6.0 100

6.0-7.0 10

8.0或更大 -

a：在形成器官发生的培养物的平板上未成熟胚胎的百分数。

表5

较高浓度的MS次要元素对于从未成熟大豆胚胎在愈伤组织培养物中的器官发生所产生的影响，在培养开始4星期后进行观察，使用CV·Williams 82，在具13.3μMBAP的MS培养基上具有每次处理的40个胚胎。次要元素是H₃BO₃，MnSO₄，KI，Na₂MoO₄·2H₂O，CuSO₄·5HO和COCl₂·6H₂O。

次要元素的相对浓度器官发生（%）^a

1 80^b

2 75^b

3 60

4 54

5 62

a：形成器官发生培养物的板上未成熟胚胎的百分数。

b：胚胎发芽优先于器官发生愈伤组织形成。

表6：BAP浓度对于在从未成熟大豆胚胎的愈伤组织培养物中器官发生的影响。在培养开始4星期后观察，使用CV·Williams 82，在具4倍次要元素浓度的MS培养基上具有每次处理的40个胚胎。

BAP（μM）器官发生（%）^a

3.3 11

6.6 9

9.9 90

13.3 80

a：形成器官发生的培养物的平板上未成熟胚胎的百分数。

组织学的研究证明了这些培养的器官发生的实质。可以看见几个芽的分生组织。这些分生组织不是在同样的平面上都可以看见的，尽管这些平面可有预存在的分生组织的少量增生。所观察到的是从分化的组织的分生位置的典型的从头的启动。

器官发生培养是在黑暗中开始的。光照将诱发未成熟合子胚胎的发芽，因此，所得到的愈伤组织在黑暗里或者直接形成芽，或随后变为器官发生。当最初的器官发生（芽启动）时需要黑暗，进一步的生长则需要光。培养物在OR培养基上开始培养4星期后，培养物再置于增生培养基：MSR或R5上，并光照，这样，它们生长很迅速，每2～3星期就需要转移到新鲜培养基上生长，越来越多的芽就产生了。在高的BAP浓度（13.3）μM下，四个月后，培养物形成易碎的非器官发生的愈伤组织。一旦芽再生被启动，为了使器官发生培养物进一步增生和维持，在培养基中不再需要高浓度的BAP和次要元素。当芽在MSR或R5培养基上长到约1cm高后，它们可以不经生长调节剂转移到MS培养基上以诱发根的形成，然后，转移到溶液裁培培养基中，再移至暖房生长和成熟。

器官发生的培养物在MSR或R5培养基上维持18个月以上，仍然保持器官发生的能力，可以重新产生植物。采用这种方法，每次转移可再生10～40株植物，因为每个愈伤组织可减数分裂为4～6个另外的片断，片断增生就增加了植物数量。

采用前面所述的方法，从未成熟大豆胚胎得到高达100%的通过器官发生方法产生的再生植物是可能的。这个体系对于所有的基因型试验是成功的，只是在再生的百分数上略有不同。因此，不同的基因型，如成熟种类、种子外衣颜色等的不同，不致于从本质角度影响植物再生。在子叶结上形成的芽的数量与植物再生能力之间也没有明显的联系。

实例2：体细胞克隆变化

为了测定从器官发生的大豆培养物是否发生了植物再生以及这些植物的子代显示的自发变化，对R₀，R₁，R₂和R₃植物进行了质量变化的形态观察的检查。

大豆（Glycine max L.Merr.）种子A3127，Adams，Capitol，CN210 Earlyana，P I36.653，P I361.063，P I404.155 A和Williams 82是从地区大豆种质收集中心，伊利诺斯，Urbana，伊利诺斯大学得到的。胚胎基因和器官发生培养是从未成熟胚胎开始的，并如例1描述的方法和U.B.Barwale等（1986）《planta》supra描述的方法维持，这里优先采用两种方法的结合。从这些植物得到的自身种子被植于大田里或发往Puerto Rico的幼苗室过冬。R₀植物的自身种子繁衍，生出一R₁族，每一个R₁植物繁衍出一个新的R₂族。在Puerto Rico生长的族肉眼观察不到变化，但是R₁、R₂和R₃族，在伊利诺斯Urbana生长的，被评价为有很大的质量变化。每一族的十二颗种子植于1.2米长的列中（每列间隔空间为0.8米）。对照种子（植物的自身种子，它不经过组织培养周期）也被植入以进行比较。对特性，例如叶子数;叶子形态;叶绿素不足;植物的高度、花的颜色、不育、多重分枝和出芽、生长习性、在整个生长季节中的青春期和成熟期进行评价。263株R₀植物产生263个R₁族，其中153个R₁族已进行了一次以上的再生检查。只有R₁族产生多于12颗籽的生长。单个R₁植物引起了下一个再生的R₂族。使用在Puerto Rico得到的大量种子的所有再生进行了所有的评价。66个R₂族（5578株R₂植物）和548个R₃族（13415株R₃植物）进行生长，并在这个研究中被采用目测评价。

在R₁、R₂和R₃世代中，观察到不同的表现型，包括叶绿素不足，完全或部分不育，皱折叶子形态，双种子，异常叶子形态，异常叶子数，矮小生长习性和多重出芽。

非致死的叶绿素不足在几个A3127族的R₂和R₃世代中被注意到。这些植物的叶绿素不足，生长不及对照植物旺盛，在一个族的大量种子中，2.7%R₂植物和7.1%R₃植物用这种特性分开。在R₃世代中的分离比率使3∶1模型适合于表示出这种特性世代繁衍的稳定遗传的隐性、单个的基因特性。1908株对照植物以外，二株显示了叶绿素不足（0.1%分离比率），这就消除了这种表现型可被归结为环境因素的可能性。因为这种特性被稳定地遗传，在这个表现型上可能引起疾病的可能性是小的。

完全不育在CN210 R₂世代上被观察到。15.6%（表7）的分离比率适合3∶1模型，以可用X平方的数值测定。该数据表现了从R₁到R₂世代的不育的稳定遗传。对照植物不显示这个特性。

在R₃世代中，可以看到皱折的叶子形态，35%同族植物用这种表现型分开（表7）。同族的R₂种子生长，在叶子形态上显示出很小的变化。

上述特性指示：一些可见的变异是稳定遗传的，并且看来是归结于组织培养过程中的基因变化。在另外三个例子中，一种表现型只在R₁世代中可以被看见（表7）。一些植物发展了双种子;但不是所有在这些植物上的种子都是成双的。异常的叶子形态和叶子数被发现是随机发生的。不是在植物上所有三叶型都显示这种表现型。显示这种表现型的小三叶型的最大数量是3。显示矮个生长习性的植物被发现其他的特性是正常的;但是，这些特性的基因不能用分离比率测定（表7）。可以看见花朵色泽并无差异。而多重出芽也被发现是随机的。

对于双种子、矮个生长习性、异常叶子形态、叶子数和多重出芽（表7），现有的分离数据很难测定这些特性的遗传性。在这个世代（表8）中，除了三株R₁变异，没在这一代中发现其他的变异体。但是，大量的R₂和R₃族表示了变异的表现型。

表现型变异的频率通过将在R₁族中不同质量变异的变异表现型的总数以同一系列的R₁族总样品数相除来计算。这种计算频率的方法相似于S.Edallo等（1981）“与体内培养有关的染色体变异和自发突变频率以及在玉米中植物的再生”《Maydica》第26卷：39～56;和T.B.Rice（1982）“减少在玉米上再生的近亲繁殖的遗传变异的细胞培养”《第三十七届谷物和高梁工业研讨年会记录》，美国种子交易协会，华盛顿特区，pp.148～162上所描述的方法。每个R₀植物的频率范围为0～4（表9）。A3127和Williams 82的低频率可能是使人误解的，因为相似的表现型是一次计数的，尽管它们可能是相似的，但是它们是互不相关的，有大量R₁族是从这两种表现型中取样的。相似的表现型不能计算作为不相关连的事物，因为胚胎源的记录不被保留。因此，每株R₀植物的初始物不可能被测定。表10显示了总数为263个R₁族中153个R₁族的可能的成熟频率。余下110个R₁族的R₂和R₃世代未进行研究。

由Williams 82的胚胎培养物和器官发生培养物得到的植物子代被检测。表9显示了在从所述两种培养体系得到的族的R₁和R₂世代中观察到的变异。一个R₁族和这个R₁族繁衍的12个R₂族在每一培养体系中被检测。在两种体系中观察到的变异是相似的，在胚芽培养衍生物中都具有较高的叶绿素不足的频率。另外一些表现型具有相似的分离比率（表9）。三种瓣状的白化病也在从胚胎培养的R₀植物中被观察到，这些都不能生长到成熟，并且得不到种子。

表7：从不同基因型的器官发生的愈伤组织培养

衍生的R₂和R₃族中观察到的不同表现型

大豆变异变异植物分离

因型型表现型数的总数比率（%）^a

A3127 双种子 2 62 3.2

矮个生长 2 30 6.6

异常叶子形态 2 26 1.7

异常叶子数 1 29 3.7

皱折叶子 1 20 35.0_★

叶绿素不足 1 14 7.1^★

P136.653 多重芽 1 25 4.0

CN210 不育 8 51 15.6^★

对照

A3127 叶绿素不足 2 1908 0.1

矮个生长 1 1908 0.1

CN210 0 140 0.0

P136.653 叶绿素不足 1 157 0.6

a：在表现出特性的每个R₂或R₃族中变异表现型的频率。

＊：与大于0.05概率水平的3∶1模型相适应的X平方值。

表8：在显示出变异表现型的不同世代中的族的数目。

植物世代再生变异表现型表现出变异性的族数

R₀化学白化体 3

R^a ₁叶绿素不足 1

异常叶子形态 1

皱折叶子类型 1

R^b ₂叶绿素不足 11

异常叶子形态 3

不同叶子数 4

矮个生长习性 1

R^c ₃叶绿素不足 29

异常叶子形态 28

不同叶子数 21

矮个生长习性 4

皱折叶子类型

a：200个R₁族用于检验变异表现型。

b：66个R₂族用于检验变异表现型。

c：548个R₃族用于检验变异表现型。

表9：以Williams 82的胚胎培养和器官发生的愈伤组织培养中衍生的R₁和R₂上观察到的变异表现型

世代变异表现型总数变异数分离比率（%）^a

胚胎发生

R₂叶绿素不足 21 6 28.5

异常叶子形态 26 1 3.8

器官发生

R₂叶绿素不足 25 1 4.0

异常叶子形态 31 1 3.2

异常叶子数 30 1 3.3

a.在每个表达这种特性的R₂族中，变异表现型的频率

表10：从用于研究体细胞克隆变异^a的9种大豆基因型检测到的在R₁族中可见变异的频率

大豆基因型 R₁族^b的数目每个R₀植物成熟基因型的频率

A3127 16 0.11

Adams 3 1.33

Capitol 1 4.00

CN210 4 1.00

Earlyana 1 1.00

P136.653 15 0.53

P1361.063 1 2.00

P1404.155A 5 1.60

Williams 82 47 0.11

a：从一种基因型的几种胚胎再生的植物，培养时间比再生推前60～350天。

b：得到12颗种子以上的再生植物的数量。

c：在一给出的系列中，在所有R₁族中观察到的成熟表现型的总数除以R₁族的总数;在二个或更多的同一基因型的R₁族中相同的成熟表现型作为一单独的成熟事件计数。

实例3：疾病抵抗力

如实例1中描述的器官发生和胚胎愈伤组织生长于phialophor gregate，一种引起褐色茎腐烂的致病菌培养滤液中，在1∶4（v/v-滤液：培养基）的浓度下，如下7种基因型被用于试验：BSR-201，Century，PZ.437，833，Corsoy，A3127，Williams-82和P I84946-2。基因型BSR-201，PZ·437，833和PZ84946-2对于褐色茎腐烂具有抵抗力[Sebastian，S·A·等（1985）《J.Hered.》第76卷：194页;Sebastian，S·A·等（1985）《Crop.Sci.》第25卷：753页;Gray，L·E·等（1985）《世界大豆研讨会记录Ⅲ》，科罗拉多州，Bouldrt，Westview Press 598～601页]。当从敏感基因型的相同类型的愈伤组积被滤液杀死后，从抗体基因型中得到的易碎的器官发生和胚胎愈伤组织对于滤液是不敏感的。敏感基因型的培养物在1∶4（v/v）（浓度）的培养滤液存在下生长，该滤液是亚致死的，30～40天以后，改善了生长特性的培养物被选择出来，用于再生有疾病抵抗力的可繁殖的植物。

实例4：对除草剂的抵抗力

如实例1中描述的基因型A3127和Williams 82的器官发生的愈伤组织分别在毒和亚致死水平的镇草宁（非选择性除草剂）、对草快和莠去津存在下生长。所使用的浓度是这样的：25～200μM镇草宁，15～25μM对草快和10～100μM莠去津。

在高浓度的这些物质存在下较好生长的培养物被选择出来用于可繁殖植物的再生，可繁殖植物对于各种除草剂是有抵抗力的。对草快-耐受培养物进一步试验，以测定对于一定量致病菌的抵抗力，与对草快耐受体相关的疾病被鉴定。

实例5：耐逆境的抵抗力

如实例1中描述的A3127和Williams 82的分离器官发生的愈伤组织，在热至40℃，冷至4℃的时间变化周期下进行生长。处理后残留的愈伤组织作脯氨酸增强试验，稳定的培养物被选择出来再生以形成对逆境有抵抗力的可繁殖植物。

实例6：对不良土壤条件的抵抗力

如实例1中描述的A3127基因型的分离器官发生的愈伤组织在浓度为0.001～0.3mM的镉，pH约5.7;0.01～0.6mM铜，0.001～3.0mM锌或0.001～3.0mM铅，且铜、锌和铅溶液在生长培养基上的pH约为～4.2;或0.1%～10% NaCl存在下生长。表现出改善生长的培养物被选择出来进行对各种不良土壤条件具有抵抗力的可繁殖的植物的再生。

实例7：提高的氨基酸的过量产生

如实例1中描述的A3127和Williams 82分离器官愈伤在组织对氨基酸进行毒性模拟的条件下生长4～8星期，氨基酸的浓度列于表11中。

表11：氨基酸的过量产生

氨基酸毒性模拟物浓度

脯氨酸羟脯氨酸 0.2～1.2mM

氮杂环丁烷-2-羧酸盐 0.01～0.03mM

蛋氨酸乙硫氨酸 0.01～0.3mM

色氨酸 5-甲基色氨酸 0.01～0.3mM

苯丙氨酸 P-氟代苯丙氨酸 0.01～3mM

在毒性模拟物下很好生长的培养物被选择出来进行可繁殖植物的再生，这些可繁殖植物经过毒性模拟的选择，具有提高的氨基酸水平。所选出的具对位-氟代苯丙氨酸的培养物进一步进行多酚过量生产试验，阳性物再进一步进行对各种昆虫和疾病抵抗力的试验。表现出这样的抵抗力的这些培养物进行具有所试验的抵抗力的可繁殖的植物的再生。

Claims

1、一种产生包括大豆属物种细胞的器官发生组织培养物的方法，该法包括在含有细胞激动素的培养基上培养所说大豆属物种的未成熟胚，而所说细胞激动素的浓度应足够高，以防止胚发芽，并促使器官发生芽的产生。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的细胞激动素是BAP。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所说BAP的浓度约在10μM和15μM（每升）之间。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说培养基还包括MS培养基的微量营养物，其浓度约为正常浓度的4至6倍。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的大豆物种是Glycine max。

6、一种在权利要求1的培养基上所产生的芽再生而成的植物或其子代。

7、一种从大豆属物种的结枝组织再生成整株植物的方法，它包括将所说的结枝组织移入包含Hoagland溶液的溶液培养基中，直至其明显地生长，然后将所说的结枝组织移入包含土壤的培养基中，直至发育成整株植物，所说的Hoagland溶液被稀释至正常浓度的1/4，并对其成份进行调整，以包括微量营养物，而微量营养物包括KCL，H₃BO₃，MnSO₄，ZnSO₄，CuSO₄，和（NH₄）₆Mo₇O₂₄。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所说整株植物包括由体细胞克隆变异而诱发的遗传性稳定突变。

9、一种产生含有Glycine max细胞的组织培养物的方法，它包括在含有约10μM/1至15μM/l BAP和微量营养物（其浓度为MS培养基中微量营养物正常浓度的4至6倍左右）的培养基上培养未成熟的Glycine max胚。

10、一种产生大豆属物种的植物的方法，所说植物包括由体细胞克隆变异所产生的遗传性状，该方法包括：

（a）将包含所说物种细胞的组织培养物连续地维持足够时间，以使所说细胞的遗传物质产生体细胞克隆变异;

（b）从所说组织培养物再生成整株植物;

（c）获得所说整株植物的子代;

（d）对至少二代所说植物及其子代的所需性状进行观察;和

（e）选出显示所需性状的子代植物。