CN217922153U - 一种可实现气溶胶和液体两维度暴露的微型芯片装置 - Google Patents

Abstract

一种可实现气溶胶和液体两维度暴露的微型芯片装置，包括芯片层和底部基板构成，芯片层包括设有气流通道的上层芯片、中间层芯片、设有液体通道的下层芯片；下层芯片中靠近进液端的通道为曲折形，位于后部的液体通道为间隔的椭圆形结构作为细胞培养区域；中间层芯片为孔径0.2‑12μm的多孔薄膜作为细胞接种培养生长支撑；上层芯片的气流通道的底部和下层芯片的椭圆形结构的液体通道顶部均开设有条形开口用于和中间层芯片相嵌合。本装置的优点在于：多孔膜结构可使气体层中气溶胶的成分和液体层中液体的成分直接与细胞接触，真实反映所测试污染物的实际暴露浓度和成分组成特征，细胞暴露条件均一稳定，可获得准确可靠的评估结果。

Description

一种可实现气溶胶和液体两维度暴露的微型芯片装置

技术领域

本实用新型涉及环境污染物暴露的体外毒理学评价研究领域，具体说是一种可实现气溶胶和液体多浓度梯度两维度暴露的微型芯片装置。

背景技术

浓度梯度的配制是生物学、医学、分析化学等科研实验中最基本和最常用的操作之一。传统的浓度梯度配制方法需要精确的计算、称量、多次的溶液混合和定容，所需化学容器多、步骤繁琐而且易引起实验误差甚至错误，且因不同实验人员操作习惯的差异，极易导致实验误差增大、可重现性降低。

微流控芯片技术是将不同流体操作步骤高度缩微化、集成化的一种技术，它将生物、医学及化学等领域所涉及的样品制备、反应、分离和检测等基本操作单元集成到几个平方厘米大小的具有微米级通道结构的芯片上。微流控芯片尺度上缩微的特点，使得其在应用中有高通量的独特优势。

微流控芯片系统可用于环境毒理学中污染物的毒理学预测和机制研究，目前国内外关于环境污染物暴露的体外毒性评价多采用传统细胞实验，操作耗时、费力，无法模拟微环境。基于微流控芯片技术开发暴露评价新模型，可实现微纳尺度上环境污染物研究的微环境模拟和多维度暴露分析。基于微流控技术的浓度梯度发生装置已在药物活性筛选、细胞和微生物培养、组织器官仿生、微量物质检测等领域得到应用。相比于传统的手动配制浓度梯度，基于微流控技术的浓度梯度发生装置具有极大的优势。根据应用的需求预先设计，微流控浓度梯度发生装置可实现对流体（气体、液体）的精确控制，其原理在于不同浓度或不同成分的流体在浓度梯度发生装置内部通道网络中多次相遇、混合并分离，通过扩散效应最终形成浓度梯度，可形成等比、等差、指数比或任意预期的浓度梯度，其产生的时间和空间瞬时梯度精确、可控、易于定量且重现性好，可帮助研究者更好的开展科研实验。单一的气体或液体浓度梯度较易实现，但是对于气溶胶和液体多浓度梯度两维度暴露的设计目前鲜有涉及。

现有技术中有一种可用于气体和液体的暴露装置，具体结构参见图1，是由上层芯片、下层芯片以及位其之间的中间层芯片组成，中间层芯片使用激光雕刻机，对0.5 mm厚的有机塑料板雕刻4*4阵列的孔状结构，孔径1 mm，0.7 μL凝胶注入微孔，中间层芯片用于装载凝胶，细胞接种在凝胶上，中间凝胶里的细胞和上层气体和下层液体是间接接触。但实际应用后发现凝胶层会截留气溶胶和液体中的成分，减少细胞接触到的成分的种类，还会降低接触到的成分的浓度，这就使得在实际污染物暴露评估的应用时低估了所测试污染物的危害效应，进而会影响测试结果的稳定性和准确性。

实用新型内容

本实用新型的目的正是基于上述现有技术状况而提出的一种可实现气溶胶和液体多浓度梯度两维度暴露的微型芯片装置，可以真实反映所测试污染物的实际暴露浓度和成分组成特征，细胞暴露条件均一稳定，进而获得准确可靠的评估结果。

本实用新型的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种可实现气溶胶和液体多浓度梯度两维度暴露的微型芯片装置，包括芯片层和底部基板构成，芯片层包括设有气流通道的上层芯片、中间层芯片、设有液体通道的下层芯片；下层芯片中靠近进液端的通道为曲折形，位于后部的液体通道为间隔的椭圆形结构作为细胞培养区域；中间层芯片以孔径0.2-12 μm的多孔薄膜作为细胞接种培养生长支撑；上层芯片的气流通道的底部和下层芯片的椭圆形结构的气流通道顶部均开设有条形开口用于和中间层芯片相嵌合/贴合（也称为键合）。芯片上、中、下三层键合后，经乙醇清洗消毒后，细胞悬液通过上层芯片上的气体出口注入通过上层芯片气流通道的底部条形开口流入多孔薄膜，使得细胞均匀接种于芯片中间层的多孔薄膜上。

所述多孔薄膜可为聚碳酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚二甲基硅氧烷、聚四氟乙烯材质。

所述上层芯片的气流通道为四条，下层芯片的液体通道为四条，可形成四个浓度梯度，能够实现气溶胶和液体污染物两维度的高通量毒理学暴露研究。上层芯片中的气流通道和下层芯片中的液体通道方向相互垂直。

所述气流通道的高度为0.8 mm，宽度为2 mm；所述液体通道的高度为0.15 mm、宽度为0.6 mm，液体通道细胞培养区域椭圆形长径为3 mm、短径为2 mm。气体通道比液体通道高是因为要保证可实现气体通道中的气体浓度梯度的形成，降低气体流速，减少气流对细胞的损伤。

所述上层芯片中设有两个气体入口和一个气体出口；所述下层芯片中设有两个液体入口和一个液体出口。

本实用新型相比现有技术的优点在于：中间层采用多孔薄膜结构，细胞生长在微孔膜上，多孔膜使得芯片上层、芯片下层是直接相通的，细胞与上层气体和下层液体直接接触。且多孔薄膜材料具备良好的生物相容性，可作为细胞生长的支撑介质，对细胞无毒害影响，适用于细胞接种和长时间连续培养，多孔膜的结构可使气体层中气溶胶的成分和液体层中液体的成分直接与细胞接触，细胞直接暴露到的成分的种类和浓度与成分在实际上层气溶胶和/或下层液体中的种类、浓度是一致的。相比现有技术中所采用的凝胶层结构，凝胶层阻隔了芯片上、下层之间的相通，上、下层成为阻隔的空间，凝胶层中的细胞与上层气体和下层液体是间接接触，凝胶层会截留气溶胶和液体中的成分，减少细胞接触到的成分的种类，降低接触到的成分的浓度，这就使得在实际污染物暴露评估的应用时低估了所测试污染物的危害效应。另外，气溶胶和液体中的成分在凝胶层中会发生扩散现象，不同成分的扩散系数有差异，导致成分在凝胶中的不均匀分布，使得不同位置处的细胞暴露测试结果存在大的误差，影响测试的稳定性和准确性。因此，本实用新型的结构特征可以真实反映所测试污染物的实际暴露浓度和成分组成特征，细胞暴露条件均一稳定，可获得准确可靠的评估结果。

附图说明

图1为现有技术中的芯片结构的剖面视图；

图1中：1’为凝胶，2’为细胞。

图2为本实用新型芯片层结构的剖面视图；

图3为本实用新型上层芯片结构视图；

图4为本实用新型下层芯片结构视图；

图5为本实用新型中间层芯片结构视图；

图6为本实用新型整体结构设计图，A:键合为一体的示意图，B：待键合的分层示意图；

图2-6中：1：上层芯片，1.1：上层芯片气体通道，1.2：气体A入口，1.3：气体B入口，1.4：气体出口；2：中间层芯片（多孔薄膜）；3：下层芯片，3.1：下层芯片液体通道，3.2：液体A入口，3.3：液体B入口，3.4：液体出口；4：底部基板。

图7为本实用新型制作得到的实物图，A：俯视图，B：侧视图。

图8为上层气体通道气体浓度梯度表征，A：通入CO₂后0、4、6 min通道内颜色变化图，B：色度量化分析线性图。

图9为下层液体通道液体浓度梯度表征，A：液体浓度梯度形成颜色变化图（最上面一条通道（1）是无菌水通入的通道为无色）；B：色度量化分析线性。

具体实施方式

本实用新型的结构以下结合附图做进一步描述：

如图2-7所示：一种可实现气溶胶和液体多浓度梯度两维度暴露的微型芯片装置，包括芯片层和底部基板4构成，芯片层包括设有气流通道1.1的上层芯片1、中间层芯片2、设有液体通道3.1的下层芯片3；下层芯片中靠近进液端的通道为曲折形，位于后部的液体通道为间隔的椭圆形结构作为细胞培养区域；中间层芯片2以孔径0.2-12 μm的多孔薄膜作为细胞接种培养生长支撑；上层芯片1的气流通道1.1的底部和下层芯片3的椭圆形结构的液体通道3.1顶部均开设有条形开口用于和中间层芯片2相嵌合/贴合（也可称键合）。

所述上层芯片1的气流通道1.1为四条，下层芯片3的液体通道3.1为四条，可形成四个浓度梯度，能够实现气溶胶和液体污染物两维度的高通量毒理学暴露研究。上层芯片1中的气流通道1.1和下层芯片3中的液体通道3.1方向相互垂直。

本实用新型的制作过程以下结合实施例做进一步描述：

1、上层芯片：

上层芯片1为气体通道层，设计图案如图3，上层芯片上设置两个气体入口1.2、1.3和一个气体出口1.4，气体层深度为0.8 mm，芯片一侧通入气体A，另一侧通入气体B，两路气体可在中间通道中相互混合，形成气体A和气体B的不同混合比例的四个气体浓度，四个通道相互独立，通道末端汇集到一个气体出口处。

采用机械加工的方法制作上层芯片的模具，通道高度为0.8 mm，利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚体和固化剂按照10:1的比例混合，然后在模具上浇注成型，浇注后进行真空脱气，以消除产生的气泡，之后在烘箱中加热1 h，待PDMS固化后，进行脱模操作，脱模之后切去芯片的多余部分，并使用打孔器在预留的气体进、出口位置打孔，模具在通道位置是凸突形的，浇注PDMS成型后，脱模下的上层芯片的条形开口位置是与模具凸突形的上表面接触的位置。打孔之后的上层芯片置于异丙醇中经超声清洗仪清洗后烘干备用。

2、中间层芯片：

中间层芯片2为0.2-12 μm孔径的多孔薄膜，参见图5，多孔薄膜材质可选用聚碳酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚二甲基硅氧烷、聚四氟乙烯等多种材料，多孔薄膜材料具备良好的生物相容性，可作为细胞生长的支撑介质，对细胞无毒害影响，适用于细胞接种和长时间连续培养，其多孔的特征可以在膜上下进行物质交换，膜下方的液体培养基能够通过多孔膜上的微孔进行直接物质交换为膜上的细胞提供营养支持，细胞分泌的细胞因子和代谢分子可通过薄膜微孔直接进入下层培养液中，便于毒性评价实验中生物标志物指标的在线收集，另外多孔膜厚度薄和透明性好的特征也能够便于膜上接种细胞的原位检测和分析。

优选孔径为5 μm的聚碳酸酯膜，按照设计的尺寸大小，利用激光雕刻机进行切割，备用。

3、下层芯片：

下层芯片为液体通道层，设计图案如图4，下层芯片上设置两个液体入口3.2、3.3和一个液体出口3.4，芯片一侧通入液体A，另一侧通入液体B，两路液体在前端的“曲折型结构”中充分混合相互稀释，形成四个不同浓度的混合液体，后端的椭圆形细胞培养区域也有助于减小流体流动过程中对细胞的流体剪切力，后端四个通道相互独立，通道末端汇集到一个液体出口处

按照标准软光刻工艺制作下层芯片的模具，经过基片清洗-涂胶-前烘-曝光-显影五个步骤制作下层模具，之后利用PDMS预聚体和固化剂按照10:1的比例混合，然后在模具上浇注成型，浇注后进行真空脱气，以消除产生的气泡，之后在烘箱中加热1 h，待PDMS固化后，进行脱模操作，切去多余部分并使用打孔器在预留的液体进、出口位置打孔，模具在通道位置是凸突形的，浇注PDMS成型后，脱模下的下层芯片的条形开口位置是与模具凸突形的上表面接触的位置。打孔之后的下层芯片置于异丙醇中经超声清洗仪清洗后烘干备用。

4、底部基板：

将2 mm厚的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板经激光雕刻机按照尺寸切割，制作底部基板层，底部基板4用于对整体芯片的固定和支撑，材料及厚度也可根据需求自行选择。

5、将上、中、下层芯片结构和底部基板键合形成一块完整的芯片，具体键合步骤如下：

下层芯片底面朝上，PMMA基板待改性面朝上，将二者一并放入等离子体表面处理仪中进行改性（气体：O₂，功率：100 W，压强：600 mTorr，时间：40 s），取出下层芯片及基板，对准并接触（即下层芯片和基板形状对准并紧贴），放入70℃烘箱加热约2 h以完成下层芯片及基板间的键合。加热结束后从烘箱中取出复合芯片，室温冷却，将冷却至室温的复合芯片及处理好的中间层多孔薄膜的待键合面朝上一并放入等离子体表面处理仪中改性（条件同上），小心取出复合芯片和多孔薄膜，对准并接触，将复合芯片放入70℃烘箱加热约2 h以完成复合芯片与多孔薄膜间的键合。加热结束后从烘箱中取出复合芯片，室温冷却，将冷却至室温的复合芯片及上层芯片的待键合面朝上一并放入等离子体表面处理仪中改性（条件同上），小心取出复合芯片及上层芯片，对准并接触，将复合芯片放入70℃烘箱加热约2 h以完成复合芯片与上层芯片间的键合。

制作得到的完整微型芯片装置结构如图7所示。

6、上层芯片气体浓度梯度形成实验表征

依据溴百里酚蓝溶液遇CO₂由蓝变黄的变色现象，将上层气体浓度梯度的变化转变为溶液颜色的变化。选用CO₂气体作为指示气体，溴百里酚蓝的碱性溶液作为指示剂来指示气体浓度梯度的形成，由于碱性的溴百里酚蓝溶液遇CO₂会变黄绿色（具体实验时，是先在气体通道内全部通满蓝色的溴百里酚蓝碱性溶液，之后，在气体通道一侧通入CO₂气体。另一侧通入合成空气，随着两种气体在气体通道内的混合使得气体通道内的CO₂气体浓度形成梯度，利用溴百里酚蓝溶液遇CO₂由蓝变黄的变色现象进行表征上层芯片气体浓度梯度的形成），随着CO₂的累积，通道内液体颜色呈现连续性的变化，且CO₂浓度越大变黄现象越显著。在通入CO₂气体4 min、6 min时间点拍照监测通道内液体颜色变化，结果如图8A，在0min无CO₂存在的情况下四个通道均为蓝色，随着CO₂的通入，通道内液体颜色逐渐变黄，4min时可见浓度梯度稳定形成，从黄色通道到蓝色通道CO₂浓度从最大到最小。色度定量分析结果如图8B所示，4 min和6 min时间的拟合线性方程分别为：y=34.014x-36.634、R²=0.9947，y=33.779x-25.314、R²=0.9433，四个通道气体浓度梯度呈较好的线性关系，表明上层芯片气体层能够满足气体浓度梯度形成的设计目标。

7、下层芯片液体浓度梯度形成实验表征

液体浓度梯度表征的方法是通入无菌水和溴百里酚蓝溶液，将浓度梯度变化转变为蓝色深浅的变化，如图9A所示，通入液体15 min后的浓度分布图可以看出四个通道内具有深浅不同的蓝色，形成四个浓度梯度，通过对色度的量化分析拟合线性方程：y=0.3539x-0.3025、R²=0.9315，线性相关性良好（图9B），表明下层芯片液体层能够满足液体浓度梯度形成的设计目标。

Claims (9)

1.一种可实现气溶胶和液体两维度暴露的微型芯片装置，其特征在于：包括芯片层和底部基板构成，芯片层包括设有气流通道的上层芯片、中间层芯片及设有液体通道的下层芯片；下层芯片中靠近进液端的通道为曲折形，位于后部的液体通道为间隔的椭圆形结构作为细胞培养区域；中间层芯片以孔径0.2-12 μm的多孔薄膜作为细胞接种培养生长支撑；上层芯片的气流通道的底部和下层芯片的椭圆形结构的气流通道顶部均开设有条形开口用于和中间层芯片相嵌合/贴合。

2.根据权利要求1所述的可实现气溶胶和液体两维度暴露的微型芯片装置，其特征在于：所述多孔薄膜为聚碳酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚二甲基硅氧烷、聚四氟乙烯材质。

3.根据权利要求1所述的可实现气溶胶和液体两维度暴露的微型芯片装置，其特征在于：所述上层芯片的气流通道为四条。

4.根据权利要求1所述的可实现气溶胶和液体两维度暴露的微型芯片装置，其特征在于：所述下层芯片的液体通道为四条。

5.根据权利要求1所述的可实现气溶胶和液体两维度暴露的微型芯片装置，其特征在于：所述上层芯片中的气流通道和下层芯片中的液体通道方向相互垂直。

6.根据权利要求1或4所述的可实现气溶胶和液体两维度暴露的微型芯片装置，其特征在于：所述气流通道的高度为0.8 mm，宽度为2 mm。

7.根据权利要求1所述的可实现气溶胶和液体两维度暴露的微型芯片装置，其特征在于：所述液体通道的高度为0.15 mm，宽度为0.6 mm，液体通道细胞培养区域椭圆形长径为3mm、短径为2 mm。

8.根据权利要求1所述的可实现气溶胶和液体两维度暴露的微型芯片装置，其特征在于：所述上层芯片中设有两个气体入口和一个气体出口。

9.根据权利要求1所述的可实现气溶胶和液体两维度暴露的微型芯片装置，其特征在于：所述下层芯片中设有两个液体入口和一个液体出口。

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