CN209352877U - 循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置，包括下层辅助结构、多级微流控芯片微流通道机构、检测结构，多级微流控芯片微流通道机构包括一级分选富集流道、中间储液池、二级分选富集流道和废液池，键合于下层辅助结构上，检测结构与多级微流控芯片微流通道机构可拆卸式连接。与现有技术相比，本实用新型操作简单易行，将各实验功能集成在一块多级微流控芯片上实现，而且具有节省时间成本、实现自动化检测、提高检测效率和分析效率的优点，具有极其重要的临床检验价值。
Description
技术领域
本实用新型涉及生物医学工程领域，尤其是涉及一种循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)具有诊断价值，但在肿瘤病人患者血液中含量极低，因此对其分选的灵敏度和特异度需求也较高；近年来，因实体肿瘤组织中的单细胞也具有肿瘤异质性和免疫微环境的科研价值而在该领域成为研究热点。
早期的CTC研究使用了如CellSearch系统在内的肿瘤细胞计数功能，针对转移期乳腺癌患者中的EpCAM+和CD45-细胞进行了富集并计数，并建立了CTC数量和5年生存率的关联性模型。后续多个研究针对了各种肿瘤如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌和卵巢癌等，并进行了CTC计数和生存率的相关性研究，得出了相同的结论，即高CTC检出率的癌症患者生存率显著性低于低检出率者。
CTC样本的分离和检测，是当前单细胞临床应用领域的一个主要分支。CTC是一种脱离原发肿瘤后存在于循环系统中、出现频率极低的细胞，目前认为每毫升血液中大约仅有1～10个CTC，以单个或者数个团簇状形式存在，可导致远处转移。CTC目前主要的分选方法主要有三种：(1)依靠膜抗原识别分离(EpCAM、CK或其他特异性癌症表面标记物)(2)根据物理特征进行分选(细胞尺寸、细胞团簇或密度梯度)(3)利用肿瘤组织特异性荧光素酶报告系统进行显色。
主流的膜抗原分选方法有Johnson&Johnson公司的CellSearch系统，Illumina公司的MagSweeper系统，Sillicon Biosciences公司的DEP-Array系统，哈佛大学开发的CTC-Chip系列芯片，以及Automated Lab Solutions公司的CellCelector系统等。物理分选的方法有哈佛大学的Cluster-Chip，NIIM开发的ISET过滤筛，Creatv MicroTech公司的CellSieve，Greiner Bio-one公司的OncoQuick。而组织特异性腺病毒报告系统目前仅限于很少的研究机构，如Johns Hopkins大学和韩国国立癌症研究中心(NCC)。上述大多数CTC分离技术均来自于较为经典的实验原理和操作方法。尤其是大量广泛使用的有核细胞富集和白细胞负选原理，即将血液中的有核细胞进行富集，并将红细胞进行去除，再在富集的细胞中采用CD45单抗磁珠去除白细胞，最后用抗体(EpCAM、CK等)特异性阳性磁珠或磁棒吸附筛选肿瘤细胞，或抗体染色(EpCAM，CK等)进行肿瘤细胞鉴定和挑选。在有核细胞富集的步骤中，基于Ficoll密度梯度分选法和红细胞裂解液去除红细胞法的原理所衍生的CTC分选方法应用最广，且这两种方法均可以配合抗体磁珠和荧光抗体染色技术进行CTC的手工分选富集。同样采用红细胞裂解液自动分选法的流式细胞仪广泛用于高校的医学生物学研究中。
但由于上述设备不仅通常非常昂贵，且许多设备因技术局限性等原因造成仅能计数、并不能分离和进行下游其他应用，因而目前仅有CTC-Chip系列应用于单细胞RNA测序的临床研究。而且这些技术对CTC分离非常耗时，且对细胞有一定的破损，更不能满足新一代测序技术对肿瘤的转录组分析。
中国专利CN108671971A公开了一种循环肿瘤细胞及团簇阴性分离的微流控装置，由样品存储室和微流控芯片通过热键合组装而成，微流控装置直径为60mm，与直径为60mm的细胞培养皿相同，微流控装置可以刚好放入培养皿中进行离心，微坑阵列芯片可对CTCs和CTCs-Clusters同步捕获，基于该微流控装置可实现了对CTCs和CTCs-Clusters的同步阴性分离；整个微坑阵列芯片以数字1～64分为64个大区，并对以字母A～P把每个大区分为16个小区，可对每个微坑的精确定位，但是该装置无法很好得分离细胞混合液中的红细胞、白细胞，也无法收集循环肿瘤细胞。
实用新型内容
本实用新型的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种新式高灵敏度，高特异度，高效率及操作简易成本低廉的集成式多级CTC分选设备以配合精准医疗时代的分子诊断技术。以微流控芯片上集成多级分选富集流道的方式，实现从细胞混合液中高通量、高效率的分选富集循环肿瘤细胞，并设计满足原位检测要求的微结构，支持对从待检查病人的血液样本溶液中分离富集得到的循环肿瘤细胞进行再次收集。对循环肿瘤细胞进行数量统计可为临床上治疗提供指导，同时收集到的循环肿瘤细胞可为下游的细胞分型、单细胞基因组和转录组功能分析等工作提供良好的技术基础。
本实用新型的目的可以通过以下技术方案来实现：
循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置，包括下层辅助结构、多级微流控芯片微流通道机构、检测结构，
所述多级微流控芯片微流通道机构具有实现筛选与富集功能，键合于所述下层辅助结构上，所述检测结构具有循环肿瘤细胞富集检测功能，与所述多级微流控芯片微流通道机构可拆卸式连接。
该种多级微流控芯片装置从功能上主要可分六个基本单元，各基本单元都有相应的微结构：
第一个基本单元是红细胞裂解残留碎片及小粒径白细胞分离单元；
第二个基本单元是免疫磁珠标记白细胞单元；
第三个基本单元是白细胞去除单元；
第四个基本单元是循环肿瘤细胞(CTC)富集、染色标记及清洗单元；
第五个基本单元是循环肿瘤细胞(CTC)检测单元；
第六个基本单元是循环肿瘤细胞(CTC)回收单元。
所述多级微流控芯片微流通道机构包括一级分选富集流道、中间储液池、二级分选富集流道和废液池，所述一级分选富集流道的出口端分别与所述中间储液池及废液池连通，所述二级分选富集流道的进口端与所述中间储液池连通，出口端连接检测结构。
所述一级分选富集流道为红细胞裂解残留碎片和小粒径白细胞分离流道，末端与中间储液池相连通，采用双螺旋状弯曲微流通道，具有若干个螺旋圈。
所述双螺旋状弯曲微流通道的外侧设计有若干旁侧微流通道，该旁侧微流通道的一端与双螺旋状弯曲微流通道相连通，另一端与细胞混合液废液池相连通。
所述中间储液池中加入有免疫磁珠。
一级分选富集流道出口流出的细胞混合液剩余样本液与预先加入在中间储液池中的免疫磁珠完成孵育预处理，同时在二级分选富集流道出口处通过正压驱动气体进入中间储液池，加速免疫磁珠对白细胞的标记过程。随后通过二级分选富集流道出口处负压驱动，促使中间储液池中的溶液流经二级分选富集流道。
所述二级分选富集流道为白细胞去除流道，进口端与所述中间储液池连通，出口端与检测结构连通，为蛇形微流通道的结构，该通道上嵌设有强磁铁。
所述白细胞去除单元主要包括蛇形微流通道结构、磁珠和永久强磁铁，蛇形微流通道前端通过微流通道与中间储液池相连通，蛇形通道末端与循环肿瘤细胞富集检测结构相连通。微流控芯片装置工作时，永久强磁铁放置在蛇形微流通道上方设计好的永久强磁铁嵌入区域中，表面吸附有白细胞的免疫磁珠由于磁性被吸附在蛇形微流通道内壁上表面，从而实现混合溶液中循环肿瘤细胞和白细胞的分离。
循环肿瘤细胞(CTC)富集、染色标记、清洗单元及检测单元中，检测机构包括带滤膜的直通接头；所述带滤膜的直通接头一端与二级分选富集流道出口相连接，另一端通过导管与外载流体驱动进样装置相连通。
所述检测结构还包括激光发生器、信号接收器及相应的信号数据处理系统。所述激光发生器输出的激光束与待测区域法线呈一定角度入射角，经滤片组将信号传至信号接收器的输入端；所述信号数据处理系统的输入端与所述信号接收器的输出端相连接。
检测单元通过激光诱导荧光实现，染色标记用的荧光染料溶液的激发波长与激光诱导荧光用的激光发生器的激光波长相适应。
回收单元主要包括检测结构中的带滤膜的直通接头和若干个离心管，与上述直通接头直接相连；所述离心管用于回收从滤膜上洗脱下来的循环肿瘤细胞(CTC)，取样并放置在荧光显微镜下观察以挑选染色阳性的肿瘤细胞，进行下游的细胞分型及供后续进行单细胞分析使用。
所述下层辅助结构的材质为玻璃载玻片，所述多级微流控芯片微流通道机构由PDMS材料构成。
所述所有样本液及实验溶液均采用具有吸液排液功能的外载流体驱动进样装置进样，进样速度与该单元功能相匹配。
与现有技术相比，本实用新型克服了因技术局限性等原因造成仅能计数、并不能分离和进行下游其他应用的缺陷。实现了从细胞混合液中高通量、高效率的分选富集循环肿瘤细胞，并设计了满足原位检测要求的微结构，支持对从待检查病人的血液样本溶液中分离富集得到的循环肿瘤细胞进行再次收集。对循环肿瘤细胞进行数量统计可为临床上治疗提供指导，同时收集到的循环肿瘤细胞可为下游的细胞分型、单细胞基因组和转录组功能分析等工作提供良好的技术基础。实现了动化检测、提高检测效率和分析效率的优点，具有极其重要的潜在价值。
附图说明
图1为本实用新型的整体结构示意图；
图2为双螺旋状弯曲微流通道的结构示意图；
图3为利用双螺旋状弯曲微流通道形成二次流惯性分选细胞的原理示意图；
图4为利用免疫磁珠在蛇形弯曲微流通道结构内去除细胞混合液中白细胞的示意图；
图5为循环肿瘤细胞(CTC)富集检测结构的结构示意图；
图6为对细胞混合液中循环肿瘤细胞(CTC)进行检测的原理示意图；
图7为本实用新型的工作流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本实用新型进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本实用新型，但不以任何形式限制本实用新型。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本实用新型的保护范围。
实施例
一种循环肿瘤细胞(CTC)分选、富集及检测用的多级微流控芯片装置，其结构如图1所示，包括下层辅助结构1、上层实现筛选与富集功能的多级微流控芯片微流通道结构2及循环肿瘤细胞富集检测结构3三部分。上层的多级微流控芯片微流通道结构2键合于下层辅助结构1之上；上层实现筛选与富集功能的多级微流控芯片微流通道结构2由一整块长方形PDMS材料构成，其上面设计有很多微流通道结构，主要负责实现细胞混合液的进样、血液样本中红细胞裂解残留碎片和小粒径白细胞的分离、白细胞的去除、循环肿瘤细胞的富集、循环肿瘤细胞收集、检测及清洗等功能。上层实现筛选与富集功能的多级微流控芯片微流通道结构2包括细胞混合液进样入口21、双螺旋状弯曲微流通道22、中间储液池23、旁通微流通道24、蛇形弯曲微流通道25、废液池26、二级分选富集流道出口27、永久强磁铁嵌入区域28、一级分选富集流道内侧出口29、一级分选富集流道外侧出口210、二级分选富集流道入口211；循环肿瘤细胞富集检测结构3包括直通接头31、小孔径滤膜32；双螺旋状弯曲微流通道22具有一定的旋转圈数，具体旋转圈数因细胞混合液样本的不同而不同，根据具体实验进行设置；蛇形弯曲微流通道25具有一定的弯道数，具体弯道数的设置根据细胞混合液样本的种类进行设置；在双螺旋状弯曲微流通道22中利用其能形成二次流的原理对细胞混合液样本中的循环肿瘤细胞进行初步分选富集；各溶液池均与微流通道相连通，微流控芯片上的各进出口均与其下方的微流通道相连通，同时各进出口通过导管与外载流体驱动进样装置相连通；微流通道直径与所研究的细胞的结构相适应，并能保证通道内细胞溶液的功能运输。
本实用新型中的双螺旋状弯曲微流通道22区域中开设若干废液池26，并通过旁通微流通道24与双螺旋状弯曲微流通道22连通，旁通微流通道主要负责流通经红细胞裂解液裂解等预处理过程后的细胞混合液中的残留碎片及粒径较小的白细胞，并通过废液池26收集；在二次流作用下，细胞混合液中的循环肿瘤细胞(CTC)及部分较大粒径的白细胞流经一级分选富集流道内侧出口29，进入中间储液池23，如图2所示。在中间储液池中，一级分选富集流道内侧出口流出的白细胞会与预先加入在中间储液池中的免疫磁珠完成孵育预处理，使白细胞和免疫磁珠相互吸附；同时在二级分选富集流道出口27处通过正压驱动气体进入中间储液池，加速免疫磁珠对白细胞的标记过程。随后通过二级分选富集流道出口处负压驱动，促使中间储液池中的溶液流入二级分选富集流道。
如图3所示，本实用新型中的双螺旋状弯曲微流通道采用了二次流原理，通过环形液体流道对血液中的CTC进行无损分离，在较大的流速下，细胞混合液样本中的细胞按大小排列在双螺旋状弯曲微流通道22的横截面内，沿双螺旋状弯曲微流通道22由入口212向出口213运动形成各自的流通路径。较大的颗粒更易聚集在通道内壁214附近位置，较小的颗粒更易聚集在通道外壁215附近位置，较大的曲率则会产生横截面流场的二次流；由于一般情况下，循环肿瘤细胞41的粒径(>15um)大于白细胞42(5～15um)及红细胞裂解后残留碎片的粒径，在该二次流作用下，循环肿瘤细胞(CTC)和部分粒径较大的白细胞会在微流控芯片的双螺旋状弯曲微流通道出口位置处的内壁214一侧流出，而粒径较小的白细胞和红细胞裂解残留碎片等则会以较快的速度沿外壁215一侧流出。
如图4所示，本实用新型中的蛇形弯曲微流通道25采用免疫磁珠法去除初步分选富集后的细胞混合液中的白细胞42，微流控芯片装置工作时，永久强磁铁放置在蛇形微流通道上方设计好的永久强磁铁嵌入区域28中，在二级分选富集流道出口27处通过负压驱动，促使中间储液池中的细胞混合液流经蛇形弯曲微流通道；当细胞混合液在蛇形弯曲微流通道中流动时，表面吸附有白细胞的免疫磁珠由于磁性被吸附在蛇形微流通道内壁上表面，而循环肿瘤细胞41继续随细胞混合液流向二级分选富集流道出口，从而实现在蛇形弯曲微流通道内二次分选富集混合溶液中的循环肿瘤细胞和白细胞。
如图5所示，本实用新型中的循环肿瘤细胞(CTC)富集检测结构3主要包括直通接头31和小孔径滤膜32。滤膜在直通接头微结构的中间位置处；滤膜的孔径很小，具体尺寸根据实际需要进行收集的肿瘤细胞的种类进行设置，使需要进行收集的循环肿瘤细胞(CTC)无法通过滤膜以实现该微结构的功能；滤膜所在平面与直通接头内溶液的流动方向垂直。微流控芯片工作时，循环肿瘤细胞富集检测结构一端与二级分选富集流道出口相连通，另一端通过导管与外载流体驱动装置相连通。在二级分选富集流道出口处的负压驱动下，蛇形弯曲微流通道内流动的含有循环肿瘤细胞(CTC)的细胞混合液流过循环肿瘤细胞(CTC)富集检测结构，细胞混合液中的循环肿瘤细胞(CTC)由于粒径大于滤膜的孔径，无法随着细胞混合液一起通过滤膜，富集在微结构中滤膜的下侧。待细胞混合液完全通过微结构后，再在中间储液池23中加入适量的用于染色标记的荧光染料试剂，继续在二级分选富集流道出口27处施加负压驱动，驱使荧光染料试剂流过滤膜32，完成对循环肿瘤细胞(CTC)的染色标记；最后在中间储液池23中加入适量的清洗溶液，依旧二级分选富集流道出口27处施加负压驱动，驱使清洗溶液流过滤膜32，完成对完成荧光标记染色后的循环肿瘤细胞(CTC)的清洗。
如图6所示，本实用新型中的循环肿瘤细胞(CTC)检测原理及部件组成。该部分主要负责实现对循环肿瘤细胞(CTC)41进行检测的功能，包括激光发生器51、循环肿瘤细胞富集检测结构3、信号接收器52、信号数据处理系统53和打印报告设备54；在进行检测时，将循环肿瘤细胞富集检测结构移置到检测平台上的检测区域；检测单元通过激光诱导荧光实现，激光发生器输出的激光束与待测区域法线呈一定角度入射角，经滤片组将信号传至信号接收器输入端；信号数据处理系统的输入端与信号接收器的输出端相连接。待检测完成后，将带滤膜的直通接头拆下，用离心管回收从滤膜上洗脱下来的循环肿瘤细胞(CTC)，取样并放置在荧光显微镜下观察以挑选染色阳性的肿瘤细胞，进行下游的细胞分型及供后续进行单细胞分析使用。
图7为本实用新型循环肿瘤细胞(CTC)分选、富集及检测用的多级微流控芯片装置的工作流程图。经预处理后的细胞混合液样本，在外载流体驱动进样装置正压驱动下，经细胞混合液进样入口进入微流控芯片；首先在微流控芯片利用双螺旋状弯曲微流通道初步分选细胞混合液中的残留碎片及粒径较小的白细胞，分选后细胞混合液中的残留碎片及粒径较小的白细胞随细胞混合液一起进入废液池，细胞混合液中的剩下成分随着细胞混合液一起流进中间储液池；在中间储液池中细胞混合液中的白细胞与加入到中间储液池中的适量的免疫磁珠结合，完成孵育预处理，使白细胞和免疫磁珠相互吸附；然后在二级分选富集流道出口处负压驱动，促使中间储液池中的细胞混合液流经蛇形弯曲微流通道，在细胞混合液在蛇形弯曲微流通道中流动时，表面吸附有白细胞的免疫磁珠由于磁性被嵌入在蛇形弯曲微流通道上方区域的永久强磁铁吸引，吸附在蛇形微流通道内壁上表面，而循环肿瘤细胞(CTC)继续随细胞混合液流向二级分选富集流道出口，从而实现在蛇形弯曲微流通道内二次分选富集混合溶液中的循环肿瘤细胞(CTC)和白细胞；继续在二级分选富集流道出口处负压驱动，蛇形弯曲微流通道内流动的含有循环肿瘤细胞(CTC)的细胞混合液流过循环肿瘤细胞(CTC)富集检测结构，细胞混合液中的循环肿瘤细胞(CTC)由于粒径大于滤膜的孔径，无法随着细胞混合液一起通过滤膜，富集在微结构中滤膜的下侧；接下来，依旧在二级分选富集流道出口处施加负压驱动，驱使荧光染料试剂和清洗溶液依次流过滤膜，依次完成对循环肿瘤细胞(CTC)标记染色和清洗；紧接着采用检测设备对微结构中染色标记后的循环肿瘤细胞(CTC)进行检测；待检测完成后，将带滤膜的直通接头拆下，用离心管回收从滤膜上洗脱下来的循环肿瘤细胞(CTC)，取样并放置在荧光显微镜下观察以挑选染色阳性的肿瘤细胞(CTC)，进行下游的细胞分型及供后续进行单细胞分析使用。
以上对本实用新型的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本实用新型并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本实用新型的实质内容。
Claims (9)
1.循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置，其特征在于，该装置包括下层辅助结构、多级微流控芯片微流通道机构、检测结构，
所述多级微流控芯片微流通道机构键合于所述下层辅助结构上，所述检测结构与所述多级微流控芯片微流通道机构可拆卸式连接。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置，其特征在于，所述多级微流控芯片微流通道机构包括一级分选富集流道、中间储液池、二级分选富集流道和废液池，所述一级分选富集流道的出口端分别与所述中间储液池及废液池连通，所述二级分选富集流道的进口端与所述中间储液池连通，出口端连接检测结构。
3.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置，其特征在于，所述一级分选富集流道为红细胞裂解残留碎片和小粒径白细胞分离流道，末端与中间储液池相连通，采用双螺旋状弯曲微流通道，具有若干个螺旋圈。
4.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置，其特征在于，所述双螺旋状弯曲微流通道的外侧设计有若干旁侧微流通道，该旁侧微流通道的一端与双螺旋状弯曲微流通道相连通，另一端与细胞混合液废液池相连通。
5.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置，其特征在于，所述中间储液池中加入有免疫磁珠。
6.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置，其特征在于，所述二级分选富集流道为白细胞去除流道，进口端与所述中间储液池连通，出口端与检测结构连通，为蛇形微流通道的结构，该通道上嵌设有强磁铁。
7.根据权利要求2或6所述的循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置，其特征在于，所述检测结构包括带滤膜的直通接头，所述滤膜在直通接头微结构的中间位置，滤膜所在平面与直通接头内溶液的流动方向垂直，所述直通接头的一端与二级分选富集流道的出口相连通，另一端通过导管与外载流体驱动装置相连通。
8.根据权利要求7所述的循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置，其特征在于，所述检测结构还包括激光发生器、信号接收器及相应的信号数据处理系统。
9.根据权利要求8所述的循环肿瘤细胞分选、富集及检测用多级微流控芯片装置，其特征在于，所述激光发生器输出的激光束与待测区域法线呈一定角度入射角，经滤片组将信号传至信号接收器的输入端；所述信号数据处理系统的输入端与所述信号接收器的输出端相连接。
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