CN1946841A - 新型碱性蛋白酶以及含有该新型碱性蛋白酶的洗涤剂和清洁剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及两种相互类似的新型碱性蛋白酶(SEQ ID NO.4和7)，其DNA已经由土壤试样获得，去除C端的类似蛋白水解的活性片段(SEQ ID NO.5和8)，所有至少90％与SEQ ID NO.4相似或者87.5％与SEQ ID NO.7相似的碱性蛋白酶，可以归纳在衍生自SEQ ID NO.4和7的共有序列(SEQ ID NO.9)下的碱性蛋白酶。此外，本发明还涉及与所属核酸(SEQ ID NO.3和6)或相关片段有至少85％同一性的核酸。另外，还限定了蛋白酶的工业应用可能性，尤其描述了其在洗涤剂和清洁剂中的应用。

Description

新型碱性蛋白酶以及含有该新型碱性蛋白酶的洗涤剂和清洁剂

本申请涉及两种相互相似的新型碱性蛋白酶，其DNA已经从土壤试样中获得，去除C端的类似其水解活性的片段，所有足够相似的碱性蛋白酶和核酸，以及该蛋白酶的技术应用可能性，主要是在洗涤剂和清洁剂中的用途。

总体看来，蛋白酶属于工业上最主要的酶。其中，枯草杆菌素(subtilisin)型蛋白酶(Subtilase，枯草杆菌肽酶，EC 3.4.21.62)非常重要，其由于催化活性的氨基酸而被划归为丝氨酸蛋白酶。它们起着非特异内肽酶的作用，也就是说它可水解任何位于肽或蛋白质内部的酰胺键。其最适pH大多处于明显的碱性范围。有关该家族的综述例如可见R.Bott和C.Betzel主编，New York，1996年出版的“Subtilisin enzymes”第75-95页中由R.Siezen撰写的文章“Subtilases：枯草杆菌素样-蛋白酶(Subtilisin-like Proteases)”。枯草杆菌蛋白酶(Subtilasen)由微生物天然产生，特别要提及的是，由芽孢杆菌种产生和分泌的枯草杆菌素是枯草杆菌酶中最重要的一类。

除了其他酶，蛋白酶是洗涤和清洁剂中已确立的活性成分。其在清洁物品上起分解含蛋白的污渍的作用。在有利情形下，酶和相关组合物的其他成分之间存在协同效应。由于它们有利的酶特性，诸如稳定性或最适pH，枯草蛋白素在洗涤和清洁剂蛋白酶中脱颖而出。除此以外，其还存在大量其他工业应用可能性，例如作为化妆品或有机化学合成的成分。

获取新型酶的传统方式是，从天然环境提取含有机物的样品，并且在被认为合适的条件下-例如在碱性环境中-培养。在此情况下，可以得到微生物的富集培养物，其中该微生物可能也含有酶，包括碱性蛋白酶，其在有关条件下具有活性。由此，例如通过在含蛋白质的琼脂平板上涂铺以及测量所形成的裂解圈，可以选出和提纯具有最有效酶的微生物，或者克隆相关基因。这种方式已经由K.Horikoshi和T.Akiba(1982)公开在例如教科书“嗜碱微生物，新的微生物世界”，JapanScientific Societies Press，Springer-Verlag，New York，Heidelberg，Berlin，ISBN 0-387-10924-2，第2章，第9-26页。

天然的，优选微生物生成的碱性蛋白酶已经用在洗涤和清洁剂中。例如，根据申请WO 93/07276，蛋白酶164-A1得自芽孢杆菌种164-A1，并由Chemgen Corp.，Gaithersburg，MD，USA和Vista ChemicalCompany，Austin，TX，USA提供，适用于洗涤和清洁剂中。其他例子为来自芽孢杆菌种PD138的碱性蛋白酶，Novozymes A/S，Bagsvaerd，Dnemark的NCIMB 40338(WO 93/18140A1)，Kao Corp.，Tokyo，Japan的来自芽孢杆菌种ferm.BP-3376的蛋白酶K-16(US 5344770)，以及根据WO 96/25489A1(Procter & Gamble，Cincinnati，OH，USA)，来自嗜冷生物体大比目鱼黄杆菌(Flavobacterium balustinum)的蛋白酶。

天然的蛋白酶被本身已知的诱变方法优化用于洗涤和清洁剂。属于此类诱变的有点突变、缺失、插入或与其他蛋白或蛋白部分融合，或者通过其他修饰方法。针对已知分子引入特定点突变的策略，目的在于改善枯草杆菌素的洗涤能力，还可以表示为合理的蛋白设计。一种相似的性能改善策略是，改变表面电荷和/或分子的等电点，并由此改变与底物的相互作用。因此，例如通过点突变，枯草杆菌素的净电荷被改变，以对特别是用于洗涤和清洁剂中的底物结合产生影响。另一特别的补充策略是提高所涉及蛋白酶的稳定性和由此增加其作用效能。在专利US5230891中叙述了通过与聚合物结合提高了蛋白酶在化妆品中的稳定性；所述稳定性伴随着皮肤相容性的增强。然而，特别对于洗涤和清洁剂而言，通过点突变带来的稳定性更加常见。

现在的酶研究方向是，将已知蛋白的相互有关的元件通过统计方法结合到新酶中，使其具有迄今未达到的性能。这样的方法也概括地称为定向演化法。例如以下方法即属于此：StEP-法(Zhao等人(1998)，Nat.Biotechnol.，第16卷，第258-261页)，随机引发重组法(Shao等人(1998)，Nucleic Acids Res.，第26卷，第681-683页)，DNA-改组(shuffling)法(Stemmer，W.P.C.(1994)，Nature，第370卷，第389-391页)或RACHITT(Coco，W.M.等人(2001)，Nat.Biotechnol.，第19卷，第354-359页)。名称为“重组连接反应”(RLR)的其他改组(Shuffling)法在WO00/09679A1中有述及。

工业上最重要的枯草杆菌素型碱性蛋白酶已经在下列文献中有综述。来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或者枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的枯草杆菌素BPN’，已经由Vasantha等人公开在(1984)，J.Bacteriol.，第 159卷，第811-819页和J.A.Wells等人公开在(1983)，Nucleic Acids Research，第 11卷，第7911-7925页。枯草杆菌素BPN’用作枯草杆菌素的对照酶，尤其有关其位置编号。

因此，申请EP251446A1中的点突变涉及在编号BPN’中的全部枯草杆菌素，Procter & Gamble Comp.，Cincinnati，Ohio，USA的该申请物质用“蛋白酶B”表示。申请EP199404A1的BPN’变体由Procter &Gamble Comp.用“蛋白酶A”表示。根据申请WO91/06637A1，再次通过其他BPN’点突变的物质用“蛋白酶C”区分。“蛋白酶D”是指根据WO95/10590A1的来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的蛋白酶变体。

蛋白酶枯草杆菌素Carlsberg由E.L.Smith等人(1968)在J.Biol.Chem.，第243卷，第2184-2191页和由Jacobs等人(1985)在Nucl.AcidsRes.，第13卷，第8913-8926页的出版物中进行了介绍。其天然来自于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，并分别可从GenencorInternational Inc.，Rochester，New York，USA以商标名Maxatase以及从丹麦Novozymes A/S公司，Bagsvaerd以商标名Alcalase^购得。

蛋白酶PB92天然产自于亲碱细菌芽孢杆菌新种92和以商标名Maxacal^从荷兰的Gist-Brocades公司，Delft获得。其原始序列已在专利申请EP 283075 A2中述及。

枯草杆菌素147和309被Novozymes公司分别以商标名Esperase^以及Savinase^销售。其来源于芽孢杆菌菌株，在申请GB 1243784中作了公开。

枯草杆菌素DY最初描述在Nedkov等1985，Biol.ChemHoppe-Seyler，第 366卷，第421-430页。

迟缓芽孢杆菌(B.lentus)的碱性蛋白酶是指得自于芽孢杆菌种(Bacillus species)的碱性蛋白酶，在申请WO91/02792中做了公开。其自身显示对氧化具有相对高的稳定性和去污剂的作用。在申请WO 91/02792A1，或者专利EP 493398B1和US 5352604中记载了该酶可在地衣芽孢杆菌宿主中异源表达。在所述US专利的权利要求中，位置208、210、212、213和268作为特征用于表示迟缓芽孢杆菌(B.lentus)碱性蛋白酶；它们在成熟蛋白质的计数中与位置97、99、101、102和157一致，其中所述酶与成熟枯草杆菌素309(Savinase^)不同。这种酶的三维结构由Goddette等(1992)，在J.Mol.Biol.，第 228卷，第580-595页：“迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶枯草杆菌素BL的1.4分辨率的晶体结构(The crystal structure of the Bacillus lentus alkaline protease，Subtilisin BL，at 1.4resolution)”中做了描述。通过点突变而稳定的该酶的变体，其特别适用于洗涤和清洁剂中，公开在申请WO92/21760A1、WO95/23221A1、WO02/088340A2和WO03/038082A2中。

由普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)天然产生的酶Thermitase最初由Meloun等(FEBS Lett.1983，第195-200页)描述。其为一种分子，序列整体上相当大地偏离了其他枯草杆菌素。因此，成熟蛋白质Thermitase和源自迟缓芽孢杆菌(B.lentus)DSM 5483(见下文)的碱性蛋白酶具有45％的同一性(62％的相似氨基酸)。

蛋白酶K也是指一种与迟缓芽孢杆菌(B.lentus)碱性蛋白酶具有相对低的同一性的蛋白酶。其在成熟蛋白酶的水平上仅有33％同一性(46％相似的氨基酸)。蛋白酶K最初来自微生物林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)并且由K.-D.Jany和B.Mayer等1985，在Biol.Chem.Hoppe-Seyler，第 366卷，第485-492页中做了描述。

WO88/07581A1公开了相互间非常相似的蛋白酶TW3和TW7，尤其是用于洗涤和清洁剂中。

源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的枯草杆菌肽酶F在氨基酸水平上与迟缓芽孢杆菌(B.lentus)碱性蛋白酶仅有30％的相似性。该酶在上文提及的Siezen等人的文章中有叙述，但是，迄今仍未描述或断言用在洗涤和清洁剂中。

对于蛋白污渍而言具有优良性能的新型枯草杆菌素可以由申请WO01/68821A2得到。

其他自能够与天然环境分离的微生物形成的碱性蛋白酶，例如可以由申请WO03/054185A1(由吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)(DSM14391)产生)、WO03/056017A2(由芽孢杆菌种(Bacillus sp.)(DSM14390)产生)、WO03/055974A2(由芽孢杆菌种(Bacillus sp.)(DSM14392)产生)和WO03/054184A1(由吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)(DSM 14393)产生)得到。所有这些申请还公开了相应的洗涤和清洁剂，其中含有这些新型碱性蛋白酶。

另一类工业上重要的蛋白酶是金属蛋白酶，即一种需要金属阳离子作为辅助因子的蛋白酶。这些酶的代表同样可以被归入枯草杆菌蛋白酶大家族中。例如从中请US2003/0113895A1得知，可以由诸如枯草芽胞杆菌(B.subtilis)的革兰氏阳性微生物得到金属蛋白酶，也可以由酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、大肠杆菌(E.coli)和流感嗜血杆菌(H.influenzae)得到。含有金属蛋白酶的洗涤和清洁剂公开在申请WO00/60042A1和WO02/36727A1中。尚未公开的申请DE10360805.2公开了一种碱性金属蛋白酶，其所属DNA可以从土壤试样中分离，并可以用在洗涤和清洁剂中。

原则上对于所有确立的应用领域而言，可以由申请WO2004/033668A2得到多种新型蛋白酶。另一种已知的蛋白酶是源自嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的StmPr2，其以条目AY253983存放于基因银行(国家生物信息技术中心NCBI，国家健康研究所，Bethesda，MD，USA)并被公开。

其他已知的蛋白酶为Novozymes公司的商标名为Durazym^，Relase^，Everlase^，Nafizym，Natalase^和Kannase^的蛋白酶，Genencor公司的商标名为Maxapem^，Purafect^，Purafect OxP^和Properase^的蛋白酶，印度Advanced Biochemicals Ltd.公司，Thane的商标名为Protosol^的蛋白酶和中国Wuxi Snyder Biopruducts Ltd.的商标名为Wuxi^的蛋白酶。

正如长期的研究所证实的那样，工业上可用的蛋白酶具有更高的要求，这些蛋白酶中的一部分与至今已知的蛋白酶完全不同，另一部分仅在少数几个位置上与之不同。因而，它们应当覆盖更大的性能差异范围，这首先适用于洗涤和清洁产品，其自身就是一个更大的应用范围。由于其相对于相关条件-如存在变性表面活性剂，存在漂白剂，高温-的某种非敏感性，和由于其相对于相应底物的良好性能，底物如存在于食物残留中的蛋白质，优选特征在于用于洗涤或清洁产品的合适的蛋白酶。

同时明显的是，一种新型碱性蛋白酶的连续需求也一直存在，这种酶自身已是可用的，并且可以通过各种诱变能力进行特殊的进一步优化。特别是基于新近建立的改组技术，人们对这种新型蛋白酶应当有兴趣。其至今未知的核苷酸序列扩展了-当相应酶自身也产生相对适当性能时-利用已知序列进行新型改组方式的变异范围，并由此再次扩展了全新人工酶的变异范围。

本发明的任务在于，找出新型碱性蛋白酶。特别地，旨在发现，其已经天然地导致洗涤或清洁剂的性能改进。

与部分任务相联系的是，建立一种用于分离所述蛋白酶的合适方法。另一部分任务是提供一种用于编码这种蛋白酶的核酸，由此获得基因技术和微生物技术的元件，从而用于这种蛋白酶的获取和进一步发展，必要时，可以将这些元件引入改组法中。另外，还提供相应的组合物，特别是洗涤和清洁剂，相应的洗涤和清洁方法，还有相应的此种蛋白酶的可能用途。最后，旨在限定所发现的蛋白酶的可能的工业应用。

迄今几乎没有现成的方法能够用于完成本发明的任务。不采用常规的富集培养碱性蛋白酶阳性微生物，而是直接从土壤试样分离编码碱性蛋白酶的核酸。因为相应的核酸最初不能归入一个具体首株，即一个具体基因组，所以，其是指所谓的后基因组-DNA(metagenomicDNA)。

令人惊奇的是，应用此方法后，发现了两种新型蛋白酶，它们相互间具有惊人的相似性，它们作为完全成熟的酶或者作为C端缺失突变种可以成功用在洗涤和清洁剂中。

提出的任务因而可以通过碱性蛋白酶解决，其氨基酸序列与SEQID NO.4所示的氨基酸序列有至少90％的同一性，或者与SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列有至少87.5％的同一性。

作为发明的主题的是，与此相联系的所属核酸，相应的天然细胞，合适的鉴定方法，特别是基于核酸建立的分子生物学方法和方法元件以及组合物，洗涤和清洁组合物，洗涤和清洁方法，和通过对应蛋白酶表征的可能工业应用。

正如实施例所证实，SEQ ID NO.4和7中所示的酶或者所属成熟的酶已经具有可用于洗涤和清洁剂中的蛋白水解活性。基于所提供的DNA，酶的其他优化也可行，例如通过其他点突变进行优化。另外，还可以在改组方式中引入DNA，并因此可以生产全新种类的蛋白酶。

根据本申请，蛋白表示由天然氨基酸组成的聚合物，基本上为线性结构，并且通常采用三维结构发挥其功能。本申请是指19种生成蛋白的天然L-氨基酸，国际上以1-字和3-字代码表示。任意这些名称和数字的组合表示特定蛋白在各自位置所携带的氨基酸残基。相同的命名建立在点突变上。除非另有所述，所示的位置是指相关蛋白的各种成熟形式，即无信号肽(参见下文)。

根据本申请，酶是指一种蛋白质，它起着某种生化功能。蛋白酶或者具有蛋白酶解功能的酶例如，通常理解为那些水解蛋白质的酰胺键(特别是那些位于蛋白质内部的键)的蛋白酶或酶。很多蛋白质，作为所谓的蛋白前体(Praproteine)，与一个信号肽一起形成。蛋白的N-末端，其功能通常是保证形成的蛋白质从生产细胞释放到胞质或者周围的介质中，和/或保证其正确的折叠。然后信号肽在自然状态下被一种信号肽酶从原始蛋白上切下来，从而使蛋白在初始没有N末端氨基酸的情况下具有其真正的催化活性。

由于它们的酶活性，成熟的肽即合成后经处理的酶比起蛋白前体来说在工业应用上更受青睐。

前体蛋白(Pro-Proteine)就是没有活性的蛋白前体。其具有信号序列的前体(Vorlaufer)被称作前体蛋白的前体(Pra-Pro-Proteine)。

根据本申请，核酸是那些天然由核苷酸组成并被称作信息载体的分子，其用于编码蛋白质或酶中的线性氨基酸序列。它们可能是单链的，也可能是互补于此单链的单链，或者是双链。作为天然永久的信息载体，这些核酸DNA更适用于分子生物学工程。相比之下，为了在自然环境中例如在正在表达的细胞中实施本发明，形成RNA，从而对于本发明有很重要作用的RNA分子亦代表本发明的实施方案。例如通过反转录，(c)DNA分子可从中得以衍生。

根据本申请，对应于蛋白质的核酸信息单元被称作基因。在DNA中，所有三种可能的读码框中的两条互补链的序列都必须考虑到。此外，需要注意的是，不同的密码三联体可编码同一种氨基酸，因此，某种特定氨基酸序列可以从许多不同的并且也许仅有非常低同一性的核苷酸序列(遗传密码子的简并性)得到。除此以外，不同的生物在应用密码子上也存在差异。由于这些原因，不管是氨基酸序列还是核苷酸序列都必须列入保护范围，并且公开的核苷酸序列在每种情况下应只被看作编码某氨基酸序列的举例。

在目前常用方法的帮助下，如化学合成或者聚合酶链式反应(PCR)，结合分子生物学和/或蛋白质化学的标准方法，专业技术人员已经能够根据已知DNA和/或氨基酸序列生产完整的基因。这种方法是已知的，例如公开在“生化百科全书(Lexikon der Biochemie)”，SpektrumAkademischer Verlag，Berlin，1999，第1卷，第267-271页和第2卷，第227-229页上。具体而言，如果采用保藏在菌种保藏机构的菌株，这也是可能的。例如，利用基于已知序列合成的PCR引物或通过分离的mRNA分子，从此种菌株中，相关基因可被合成，克隆以及如果需要进一步加工，例如突变处理。

核苷酸序列的修饰，诸如那些通过本身已知的分子生物学方法得到的修饰被称为突变。根据修饰的类型，已知突变分为例如缺失突变、插入突变、替代突变，或者不同的基因或基因的不同部分被相互融合在一起(“改组”)的突变；这些就是基因突变。与此相关的生物就称为突变体。从这些突变核酸中得到的蛋白被称为变体。例如，缺失突变、插入突变、替代突变或者融合导致了基因的缺失突变、插入突变、替代突变或融合，以及在蛋白质水平上，导致对应的缺失变体、插入变体或者替代变体或者融合蛋白。

以下惯例用于说明涉及精确的氨基酸位置(氨基酸替换)的点突变：首先，以国际通用单字母编码表示天然存在的氨基酸，然后得出相关的序列位置并最后得出插入的氨基酸。在相同的多肽链内的多个替换通过切割而相互分离。

根据本申请，载体被认为是由核酸组成的元件，这些元件包括目的基因作为特征核酸区。它们能够在物种或细胞系中经若干代或细胞分裂作为稳定的遗传元件建立所述基因，所述遗传元件能够独立于其他基因组复制。载体是特殊的质粒，即环形的遗传元件，尤其是它们被用于细菌的时候。在基因工程中，一方面，这些载体之间是有区别的，这些载体用于储存进而进行基因操作的载体，即所谓的克隆载体，另一方面，执行这些功能的载体也是有区别的，这些载体在宿主细胞中生成目的基因，即能够表达相关的蛋白。这些载体都被认为是表达载体。

包括所述载体的细菌细胞和真核生物细胞不管其差异，都统称为细胞。含有载体，特别是表达载体并因此可被诱导表达转基因的细胞称为宿主细胞，因为它们内含相关的基因体系。

同源化是一种核酸或氨基酸序列与已知基因或蛋白的比较。例如，通过比对进行。同源性的度量为同一性的百分比，如通过下列文献中所示方法可加以确定：D.J.Lipman和W.R.Pearson，Science  227(1985)，第1435-1441页。优选通过比对算法得知，该算法使用商购的计算机程序进行。例如从InforMax，Inc.Bethesda，USA公司购买的程序VectorNTI^Suite 7.0即属于此，优选使用预设的缺省参数。同源性可指完整蛋白或待指定的区域。比同源性概念更宽的是相似性，也包括保守变异，即具有相似化学活性的氨基酸，因为考虑到它们在蛋白内通常具有相似的化学活性。对核酸而言，仅仅知道同一性的百分比。

通过同源化，从氨基酸或核苷酸序列中有可能推测出单个序列区域的功能，以及所涉及的完整酶的活性。不同蛋白之间的同源区域具有可比较的功能，这些功能在一级氨基酸序列中可被识别为同一性或保守替换。它们包括单个氨基酸，称作盒的非常小的区域，其在氨基酸一级序列中的长度有数个氨基酸，一直至长的区域。因此，同源区的功能理解上也包括由完整蛋白所实施功能的非常小的部分功能，例如单个氢键的形成，底物的络合或者过渡络合物。不参与真正酶法反应的蛋白的其他区域可对它们进行定性或定量修饰。例如，这涉及酶的稳定性，活性，反应条件或底物特异性。

因此，术语蛋白水解酶或蛋白酶表示超出催化活性部位的少量氨基酸残基的功能外的所有功能，这些功能是通过其余全部蛋白质或其一部分或大部分对真正的催化活性区域的影响而产生的。此外，同样可以通过例如本发明蛋白质的一个或多个部分定性或定量地修饰其它蛋白酶的活性。其它因素的影响也被视为是蛋白水解活性。蛋白水解活性酶也是那些其活性在给定的时间例如通过抑制剂而封闭的蛋白酶。它们的主要适合性对进行相应的蛋白水解反应是至关重要的。

片段是指那些比天然蛋白质或那些对应于完全翻译的基因更短并且例如也可通过合成得到的任何蛋白或者肽。由于它们的氨基酸序列，它们可归类为相应的完整蛋白。例如它们可以具有相同的结构，或可发挥蛋白水解活性或者部分活性。片段及初始蛋白的缺失变体基本上是一样的。然而，片段是相对较小的，缺失变体只是缺失小区域因此仅缺乏个别的小功能。

根据本申请，嵌合或者杂交蛋白是由那些来自相同或不同生物的不同多肽链天然产生的元件组成的蛋白。这个过程也就是改组或融合突变。融合的目的是例如，在融合部分本发明的蛋白的帮助下生成或者修饰某种酶的功能。

通过插入突变得到的蛋白被称为是变体，这种变体能够通过本身已知的方法把核酸片段或蛋白片段插入到起始序列中而得到。因为它们的原理相同，应将它们归类为嵌合蛋白中。在这些嵌合蛋白中，区别仅在于蛋白的不变部分与整个蛋白的大小比例不同。在插入突变蛋白中，外源蛋白的比例低于嵌合蛋白。

倒置突变，即部分序列的倒置，被看作一种缺失和插入的特殊形式。同样适用于分子不同部分的重组，这与原始的氨基酸序列相异。这也可以被看作是一种原始蛋白的缺失变体，插入变体或者改组变体。

根据本申请，衍生物是指其纯的氨基酸链已经化学修饰的蛋白。这种衍生化作用可通过宿主生物以生物方法结合蛋白合成进行。分子生物学的方法可以用于此目的，例如与提供相关修饰的基因共转化。然而，这些衍生物也可以化学方法来实施，例如将氨基酸的侧链化学转化或者通过共价结合将另一个化合物结合到蛋白上。该化合物可以是如通过双官能化合物与本发明所述的蛋白结合的其他蛋白。当结合的底物是抑制剂时，这种修饰例如可以影响底物的特异性或者与该底物的结合强度，或者导致酶活性的暂时性阻断。例如这对于储存的时间也是有用的。衍生化作用也被认为对大分子载体的共价结合。

根据本发明，所有的酶、蛋白、片段、融合蛋白及衍生物被集体的冠以上位概念蛋白，除非它们需要清晰的指称。

酶的性能在各种情形下被认为是在所属技术领域里的功效，优选在相应定向的产品的范围。所述性能是基于实际的酶解活性，但是也依赖于其他与这个过程相关的因素。这些因素包括例如稳定性、底物结合、与携底物的物质相互作用或与其他成分相互作用，尤其是协同作用。

根据本申请，洗涤剂或清洁剂的洗涤或清洁性能是指所涉及的产品对含污物品例如织物或者具有硬表面的物品所发挥的效果。评价这些产品中的单个组分例如单个酶对完整的洗涤或清洁产品的洗涤或清洁性能的作用。毕竟由一种酶的酶解性能不可能轻易地推断出所述酶对产品的洗涤功效的作用。其它因素例如有稳定性、底物结合、待洗涤物与所述洗涤或清洁产品中的其它成分的结合和相互作用，尤其是协同效应在除去污渍时也起重要作用。

如本发明实施例所述，SEQ ID NO.4和7所示的氨基酸序列，其衍生自从土壤试样中分离而得的核酸。其序列由SEQ ID NO.3或6得出。根据本发明，衍生的蛋白以蛋白酶HP70(对于SEQ ID NO.3和4而言)或HP53(对于SEQ ID NO.6和7而言)表示。根据比对，例如通过图4可以理解，在氨基酸水平上其相互间具有93.9％的同源性。

一种源自野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris)的细胞外丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.-)已被确认为与两种已被本发明实施例发现和表征的蛋白酶最为近似，前者在基因银行(国家生物信息技术中心NCBI，国家健康研究所，Bethesda，MD，USA)中的登录号码为NP_636242。如以下所有的同源性数值一样，该酶的同源性用从InforMax，Inc.Bethesda，USA公司购买的计算机程序Vector NTI^Suite7.0，以预设的缺省参数测定，在氨基酸水平上与HP70有75.0％的同一性，与HP53有75.4％的同一性。

确认为最近似的酶列于实施例4和5的表格中；其分别是指源自野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)和地毯草黄单胞菌(X.axonopodis)的细胞外丝氨酸蛋白酶。以碱性蛋白酶的总长计，在氨基酸水平上，HP70与迟缓芽孢杆菌(B.lentus)碱性蛋白酶(WO92/21760A1)具有26.2％的同一性，在核苷酸水平上具有33.6％的同一性。HP53与迟缓芽孢杆菌(B.lentus)碱性蛋白酶具有25.9％的同一性或者33.5％的同一性。

根据实施例的这些数据可以更新如下：源自嗜麦芽寡养单胞菌(St.maltophilia)的蛋白酶StmPr2(基因银行：AY253983)与本发明蛋白酶HP70(SEQ ID NO.4)的序列同源性为84.7％，与HP53(SEQ ID NO.7)具有82.5％的同一性。在WO2004/033668A2中以SEQ ID NO.66公开的蛋白酶与HP70具有83.1％的同一性，与HP53具有81.1％的同一性。与WO2004/033668A2中以SEQ ID NO.70公开的蛋白酶相比，与HP70具有85.0％的同一性，与HP53具有82.3％的同一性。

因此，所有在本申请保护范围内的碱性蛋白酶都包括在内，其氨基酸序列与SEQ ID NO.4具有至少90％同一性，与SEQ ID NO.7具有至少87.5％的同一性。

其中，优选功能性碱性蛋白酶，即不是有缺陷的或单纯推定的酶，而是使用事实上基于酶活性可以用在工业中的酶。

进而优选的是所有这种碱性蛋白酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列有至少95％的同一性，再进而优选为至少有96％、97％、98％、99％以及最优选为100％的同一性，或者与SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列有至少90％的同一性，再进而优选为至少有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及最优选为100％的同一性，所有整数或分数的中间值都包括在内。

实施例中所述的相关载体，用于编码具有100％同一性的蛋白，由图3所示载体衍生而得，对于HP70名称为70-pUC(AWB403)和对于HP53名称为53-pUC(AWB403)。它们以此名称于2003年10月2日保藏在德意志微生物保藏中心(the Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)Mascheroder Weg 1b，38124 Brunswick( http://www.dsmz.de)，保藏号为DSM15977或者DSM15976。其存活性由DSMZ于2003年10月17日予以确定。由这些载体编码的、在本申请实施例中检验的、并因此最优选的蛋白酶被称作HP70或HP53。

另外优选的是，本发明碱性蛋白酶在其同源值分别适合对应于根据SEQ ID NO.4的氨基酸位置33至581或者根据SEQ ID NO.7的位置39至586的区域。

由此，可以分别认为实际上是具有活性的成熟蛋白，因为它们产生工业上相关联的功能。目前，还不能毫无疑义地说，氨基酸代表成熟蛋白质的N-端。现在只是极有可能显示在位置33或39开始。在晚些时候可以表明，其他的氨基酸分别代表N-端，因此，与所要求的保护范围有关的是，该所述位置分别表示成熟蛋白质的首个氨基酸。

在实施例4中将成熟酶与最近似现有技术进行了序列比较，提供以下结果：(猜测)成熟蛋白酶HP70(SEQ ID NO.4，位置33至581)与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.66同源区相比具有84.2％的同一性，与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.70相比有86.2％的同一性，而与蛋白酶STmPr2具有85.8％的同一性。(猜测)成熟蛋白酶HP53(SEQ IDNO.7，位置39至586)与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.66同源区相比具有83.8％的同一性，与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.70相比有85.0％的同一性，而与蛋白酶STmPr2具有85.2％的同一性。

类似也适合于C端。目前，根据SEQ ID NO.4或7，位置581或586显示出较可信，因为根据SEQ ID NO.3的核苷酸位置1744至1746和根据SEQ ID NO.6的核苷酸位置1759至1761分别代表终止密码子。然而在较晚些时候可以表明，通过处理，另外一种氨基酸可以代表成熟活性蛋白的C端，因此，与所要求的保护范围有关的是，所示数字分别表示成熟活性蛋白的最后氨基酸。这通常同样适合的情况是，也许在蛋白成熟时切除内部片段。特别优选的是成熟活性蛋白的各个氨基酸序列。

此外，优选至今所公开的每种碱性蛋白酶，其中至少90％的同一性分别适合对应于根据SEQ ID NO.5的氨基酸位置33至470和根据SEQ ID NO.8的氨基酸位置33至470的区域。

正如实施例描述的那样，不论从HP70还是从HP53都能删除所述的并且排除出优选保护范围的C端，而此缺失变异不会失去其蛋白酶活性，特别是在洗涤或清洁过程中所必需的蛋白水解活性。该彻底缺失的优点是，在相关蛋白的生物制备中节约开支和成本。从而，根据本发明，在较短的时间内获得尤其可用于洗涤和清洁剂的酶，由此伴随着可以更好地利用对于生产微生物的发酵而言所必需的培养基成分。

在实施例4中将成熟的和C端缺失的酶与最近似现有技术进行了序列比较，提供以下结果：(猜测)成熟的和C端缺失的蛋白酶HP70(SEQID NO.5，位置33至470)与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.66同源区相比具有85.2％的同一性，与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.70相比有88.1％的同一性，而与蛋白酶STmPr2具有87.7％的同一性。(猜测)成熟的和C端缺失的蛋白酶HP53(SEQ ID NO.8，位置39至470)与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.66同源区相比具有85.4％的同一性，与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.70相比有87.0％的同一性，而与蛋白酶STmPr2同样具有87.0％的同一性。

进一步优选的是迄今所公开的每种蛋白酶，其具有根据SEQ IDNO.9共有序列的氨基酸序列，优选在氨基酸位置39至587范围内，更优选在氨基酸位置39至476范围内。

SEQ ID NO.9代表从两个氨基酸序列SEQ ID NO.4和7上获得的共有序列，可以例如通过图4的比对而确立。其包括这样的蛋白酶，即，该氨基酸序列在其每个位置上不仅可以属于SEQ ID NO.4也可以属于SEQ ID NO.7。因此，这两个序列在相互关联的或相似的枯草杆菌素蛋白酶之间开启了一个序列范围。它们具有SEQ ID NO.9所示的通用序列，在下文的35个位置上分别存在两个不同的氨基酸或者一种确定的(以三字母码表示)或没有(-)；也即具有以下可能性(在序列表中分别定义为“变体”)：位置2：-或Ile，位置3：Ser或Thr，位置4：His或Asn，位置5：Asp或Ser，位置7：-或Ser，位置8：-或Val，位置9：-或Pro，位置10：-或Gly，位置11：-或Asp，位置12：Gln或Pro，位置13：Pro或Gln，位置25：Ala或Gly，位置48：Ser或Ala，位置65：Asn或Thr，位置66：Leu或Asp，位置82：Ser或Gln，位置149：Ala或Ser，位置234：Ser或Ala，位置236：Ile或Tyr，位置259：Ser或Thr，位置267：Phe或Tyr，位置321：Thr或Ser，位置386：Ile或Val，位置406：Thr或Ala，位置438：Thr或Ser，位置487：Thr或-，位置488：Val或Thr，位置501：Ala或Ser，位置507：Ser或Ala，位置511：Val或Ala，位置522：Ser或Thr，位置527：Ser或Thr，位置546：Asn或Thr，位置562：Ser或Ala和最后，位置574：Gly或Ala。

因为两种酶HP70和HP53在本发明实施例记载的研究中具有优点，此外有93.9％相一致，可以预料的是，属于这种蛋白酶亚族的其他每种酶都具备类似的有益性质。

相应于以上说法，这优选适合于各自成熟的部分，即活性酶，更优选适合于这些缺失变体，其中在没有可察觉的蛋白酶活性损失时，可以去除大部分的C端。

进一步优选的是迄今没有公开的由核苷酸序列编码的碱性蛋白酶，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列有至少85％的同一性，更优选为至少90％、95％、96％、97％、98％、99％和最优选100％的同一性，特别是对应于SEQ ID NO.3的核苷酸位置97至1746的区域，尤其对应于SEQ ID NO.3的核苷酸位置97至1410的区域，或者是由核苷酸序列编码的碱性蛋白酶，所述核苷酸序列与SEQ IDNO.6所示核苷酸序列有至少85％的同一性，更优选为至少90％、95％、96％、97％、98％、99％和最优选100％的同一性，特别是对应于SEQ ID NO.6的核苷酸位置115至1761的区域，尤其对应于SEQ IDNO.6的核苷酸位置115至1428的区域，其中所有的整数和分数的中间值分别包括在内。

由上述说法以及尤其是实施例可以得知，特别优选的蛋白酶不是通过其本身或经由一种相应的微生物而被检测出，而是由与本发明所揭示的核酸所编码。

正如实施例3和4解释的那样，在核苷酸水平上与HP70和HP53最近似的酶，一种源自野油菜黄单胞菌(ATCC 33913；NP 636242)的细胞外丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.-)，可以通过从InforMax，Inc.Bethesda，USA公司购买的计算机程序Vector NTI^Suite 7.0，使用预设的缺省参数对该酶进行计算，在核苷酸水平上有74.4和75.0％的同一性。与此相应，所有的由明显相似的核酸编码的碱性蛋白酶和蛋白质包括在保护范围内。

根据实施例的这些数据可以更新如下：源自嗜麦芽寡养单胞菌(St.maltophilia)的蛋白酶StmPr2(基因银行：AY253983)在DNA水平上与本发明蛋白酶HP70(SEQ ID NO.3)的可同源区的序列同源性为80.8％，与HP53(SEQ ID NO.6)的DNA序列具有81.2％的同一性。在WO2004/033668A2中以SEQ ID NO.65公开的蛋白酶-DNA-序列与HP70具有79.6％的同一性，与HP53具有79.9％的同一性。与WO2004/033668A2中以SEQ ID NO.69公开的编码蛋白酶的DNA序列相比，与HP70-DNA具有81.3％的同一性，而与HP53-DNA具有81.1％的同一性。

迄今为止的方式尤其适合于核酸序列，由其编码为成熟蛋白，最适合编码为C端缺失的蛋白水解活性变体。酶的蛋白水解活性和其对本申请实施例中所覆盖的相应配方的洗涤或清洁剂的贡献是预定了的。

在实施例4中将编码成熟酶的DNA-段与最近似现有技术进行了序列比较，提供以下结果：(猜测)成熟蛋白酶HP70(SEQ ID NO.3，位置97至1746)的基因与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.65同源区相比具有80.0％的同一性，与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.69相比有81.8％的同一性，而与蛋白酶STmPr2具有81.3％的同一性。(猜测)成熟蛋白酶HP53(SEQ ID NO.6，位置115至1761)的基因与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.65同源区相比具有81.0％的同一性，与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.69相比有82.2％的同一性，而与蛋白酶STmPr2具有82.9％的同一性。

与此相应，从中衍生的碱性蛋白酶也是优选的。

在实施例4中将编码成熟的和C段缺失的酶的DNA-段与最近似现有技术进行了序列比较，提供以下结果：(猜测)成熟的和C段缺失的蛋白酶HP70(SEQ ID NO.3，位置97至1410)的基因与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.65同源区相比具有81.4％的同一性，与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.69相比有83.7％的同一性，而与蛋白酶STmPr2具有83.2％的同一性。(猜测)成熟的和C段缺失的蛋白酶HP53(SEQ ID NO.6，位置115至1428)的基因与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.65同源区相比具有82.1％的同一性，与WO2004/033668A2的SEQ ID NO.69相比有83.6％的同一性，而与蛋白酶STmPr2具有83.9％的同一性。

与此相应，由DNA-段衍生的碱性蛋白酶也是特别优选的。

此外，根据本发明，优选迄今所述的每种碱性蛋白酶，其能从天然环境分离出来或者其能衍生自从天然环境分离出的一种核酸。

可以认为，利用实施例所述方法分离出的DNA是由天然微生物形成的，并且也可以在体内编码为功能性蛋白。因此，也必须通过类似方法找到相关酶，尤其是，当其不是假基因而是实际上形成的蛋白时。另一方面，核酸的分离立即产生基因，其可以被引入分子生物学的表征并被生产出来。此外，并非预料的是，相关基因在全部条件下进行表达，从而也可以通过核酸分离而立即得到未翻译的基因。

另外，根据本发明，优选迄今所述的每种碱性蛋白酶，其自身和其相关的核酸由微生物产生，微生物可由天然环境分离而得。

因此，这种实施方式特别有优势，因为相关微生物本身可以进行培养。有利的是，本发明的蛋白酶可以由细胞提取物和培养上清液而分离和制备。

其中，那些碱性蛋白酶是优选的，这里是指微生物，优选为真菌或细菌，在此优选革兰氏阳性茵和更优选杆菌属(Bacillus)中的一种。

尤其对于微生物而言，现有技术中已经公开并建立了培养方法。这尤其适合于杆状菌，该菌在工业酶制备中有突出作用。另一个实施方式代表这种碱性蛋白酶和蛋白，其由黄单胞菌(Xanthomonas)种产生。确认为最近似的已知酶(见上文)由一种革兰氏阴性菌种产生；在黄单胞菌(Xanthomonas)的生物技术发酵中也有经验。

根据本发明，还优选的是一种迄今所述的碱性蛋白酶，其是通过片段化或缺失突变衍生的碱性蛋白酶，或者是具有至少100个，进一步优选为至少150、200、250个，最优选为至少300个在出发分子中已有关联的氨基酸的蛋白。

因此，可能的是，在酶的末端或环中删除单独一个氨基酸，而不丢失蛋白水解活性。这种突变例如在WO99/49057A1中有公开。WO01/07575A2教导，这种缺失使得相关蛋白酶的变应原性下降，并总体上改善了可用性。在较晚实施的方面，片段化给插入或取代突变和/或与其他酶融合带来益处。考虑到计划使用的酶，优选的是，在片段化或缺失突变之后，其还具有蛋白水解活性；更优选的是，其由此具有额外提高的活性。

如根据本发明前面所描述，或者迄今为止通过插入突变、取代突变和/或与至少一种其他蛋白融合而衍生的所述碱性蛋白酶或蛋白是进一步优选的。

现有技术的很多文献公开了在蛋白酶中插入和取代的有利效果；这里已知的是公报WO99/49057A1和WO01/07575A2。一般而言，氨基酸的单独替换也属于此，但是多种相关联的氨基酸也能够反向替换。与大的酶段进行新的结合也属于此，因此，上述片段与具有其他功能的其他蛋白酶或蛋白也属于此。例如根据WO99/57254A1，可以将本发明的蛋白或蛋白部分通过肽键结合或者直接作为融合蛋白与来自其他蛋白的结合区，如纤维素结合区结合，由此，更有效形成底物的水解。同样，本发明的蛋白例如还可以与淀粉酶或纤维素酶结合，以产生双官能性。

在源自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的碱性蛋白酶的编号中，在位置3、4、36、42、47、56、61、69、87、96、99、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、199、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268上有一个或多个氨基酸替换的碱性蛋白酶或蛋白是优选的，其中位置通过图1中的比对来分配。

迟缓芽孢杆菌(B.lentus)碱性蛋白酶的野生型分子中存在以下氨基酸残基：S3，V4，S36，N42，A47，T56，G61，T69，E87，A96，R99，A101，I102，S104，N114，H118，A120，S130，S139，T141，S142，S154，S157，A188，V193，V199，G205，L211，A224，K229，S236，N237，N242，H243，N255或者T268。

因为除了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的碱性蛋白酶，迟缓芽孢杆菌(B.lentus)的碱性蛋白酶在现有技术中是一类用于说明新型蛋白酶和点突变的重要参照分子，这里所述新型蛋白酶及其序列迄今未知，似乎有利的是点突变分配中参照此编号。另外，编号通常依赖于成熟蛋白，并且，如上文所述，目前还无法确定的是，成熟蛋白用哪个氨基酸起始。在SEQ ID NO.4(HP70)的编号中，这些位置-用图1可以理解-符合下列位置编号：P140，N141，T182，N188，Y195，A204，G209，T245，K264，K273，(-)，Y277，T278，D280，V296，E304，I306，S317，G326，V328，S329，S341，V345，A376，S381，S393，G399，Y406，V419，Q424，T432，P433，T438，L439，G453和V466。

在SEQ ID NO.7的编号中，也就是HP53中，有下列位置：P146，N147，T188，N194，Y201，A210，G215，T251，K270，K279，(-)，Y283，T284，D286，V302，E310，I312，S323，G332，V334，S335，S347，V351，A382，S387，S399，G405，Y412，V425，Q430，S438，P439，T444，L445，G459和V472。

在下列位置上的源自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)DSM5483的枯草杆菌素蛋白酶的单重或多重变体可以由申请WO92/21760A1得知：3、4、36、42、47、56、69、87、96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、157、188、193、199、205、224、229、236、237、242、243、255和268。申请WO95/23221A1另公开在分子位置99、154和211上的替换，特别是R99G，R99A，R99S，S154D，S154E，L211D和L211E。根据WO95/07770A1，这种变体还尤其适用于化妆品。除了其他替换，在申请WO02/088340A2中还描述了替换L211G，在WO03/038082A2中描述了替换G61A。

相应优选的是，其他氨基酸替换存在于位置3、4、61、188、193、199和211中一个或多个中。这与HP70中的位置P140，N141，G209，A376，S381，S393和Y406一致，或者与HP53中的位置P146，N147，G215，A382，S387，S399和Y412一致。

假如相应的同源位置并未天然地被优选氨基酸之一所占据的话，符合上述说法再次优选的是，氨基酸替换3T，4I，61A，188P，193M，199I和211D或211G中的一个或多个。

正如WO02/088340A2中所阐述的那样，替换S3T和V4I也许会通过在分子上的稳定效果而导致改进其对洗涤或清洗剂洗涤能力的贡献。根据WO95/23221A1，替换S3T，V4I，A188P，V193M，V199I和L211D表征了命名为F49的蛋白酶，其在本申请实施例7和8作为有效率的、在现有技术中确立的对照酶被使用。相反，HP70和HP53仍然指未修饰的野生型分子，其活性，尤其是对洗涤能力的贡献可以通过这种相同的替换而改进。

还优选的是本发明之前所述的碱性蛋白酶或这种蛋白，其可以另外稳定化。

在储存和/或使用中，例如在洗涤过程中，稳定性的提高会更长时间保持活性并因此增强其效果。所有现有技术公开的和适宜的策略都可以考虑作为稳定化的可能方式，例如根据US5230891，共价与聚合物连接。

稳定化优选可以通过分子自身的点突变达到。因为在获得蛋白之后没有更多的处理步骤。对此，几种合适的点突变可以从现有技术得知。根据US6087315和US6110884，通过将确定的酪氨酸基与其他基团替换而稳定蛋白酶。

其他的可能性例如：

-修饰金属离子的结合，特别是钙结合位点，例如按照申请WO88/08028A1和WO88/08033A1的教导；根据上述第一个文献，参与钙结合的一个或多个氨基酸残基必须被带有负电荷的氨基酸所替换；根据申请WO88/08033的教导，通过钙结合的稳定化作用，点突变必须同时导入两个残基精氨酸/甘氨酸序列中的至少一个残基中；

-根据专利US 5453372，蛋白可受到表面上特定突变的保护，以防止诸如表面活性剂的变性剂的作用。

另一针对高温和表面活性剂作用的稳定化作用的可能性将是应用WO92/21760A1、WO02/088340A2和WO03/038082A2的教导，对那些蛋白酶通过交换位于N端附近的氨基酸而得以稳定化，使得通过非共价相互作用与剩余分子接触，从而有助于维持球形结构。这尤其适合于碱性蛋白酶，该酶最初由迟缓芽孢杆菌(B.lentus)获得。具有SEQ IDNO.12和16的变体的相应突变体在本申请实施例中进行说明。

优选的实施方案是那些其中分子以多种途径被稳定化的蛋白酶。这是因为，例如，根据WO 89/09819A1，采用多个稳定突变，可认为有额外的作用。

优选的是本发明之前所述的碱性蛋白酶或这种蛋白，其还能被衍生化。

可以认为衍生物是通过其他修饰而衍生自上述蛋白的蛋白。这样的修饰可影响例如稳定性，底物特异性，或对底物的结合强度或者酶活性。它们也可用于减少蛋白的变应原性和/或免疫原性，从而增加例如其与皮肤的相容性。

这些衍生化作用可例如通过生物学方法实施，例如通过生成宿主生物体与蛋白生物合成相联系。诸如脂质或寡糖的低分子量化合物的偶联受到特别强调。

然而，衍生化作用也可通过化学方法，例如通过化学转化侧链或通过把另一个例如大分子化合物共价结合到蛋白上而进行。化学修饰描述在例如申请DE 4013142A1中。酶中的胺与羧基偶联改变等电点，例如公开在WO 95/26398A1中。例如，可例如通过双官能团化学化合物，将诸如蛋白质的大分子与本发明蛋白连接起来。因此，例如，应用WO 99/57154A1的教导，有可能通过非蛋白接头提供含有特异结合区的本发明的蛋白。这样的衍生物特别适用于洗涤或清洁产品中。也可能以类似于WO 00/01831A2的方式将蛋白酶抑制剂与本发明的蛋白通过接头，尤其是氨基酸接头连接起来。与其他诸如聚乙二醇的大分子化合物的偶联改善了该分子的其他有关特性，诸如稳定性或与皮肤的相容性；这已经有说明。

本发明蛋白的衍生物也以最广意义表示这些酶的制备物。取决于分离，加工或制备方法，蛋白可以与多种不同的其他物质相结合，例如与来自产蛋白酶的微生物的培养物中的物质相结合。为了增加其储存稳定性，蛋白也可用其他某些物质处理。因此，本发明也涉及本发明蛋白的所有制备物。这也独立于此酶活性是否真正展示在特定的制备物中。这是因为，对其来说，期望的是在储存过程中仅具有一点点活性或没有活性，而在使用时展示其蛋白水解功能。例如通过适当的相伴物质，这可得以控制。蛋白酶与蛋白酶抑制剂的共同制备物是有利的并在现有技术(WO00/01826A2)中公开。

优选本发明之前所述的碱性蛋白酶或这种蛋白，它们与本发明之前所述碱性蛋白酶或蛋白共同具有至少一种抗原决定簇，尤其在迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)碱性蛋白酶编号中的位置3、4、36、42、47、56、61、69、87、96、99、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、199、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268中，具有至少一个抗原决定簇区域，通过图1的比对而分配。

这尤其适合于这些位置中的变体，因为一方面其本身为优选，另一方面，通过针对这些区域而特异性形成的抗体，可以与蛋白酶相区别，所述蛋白酶在这些位置中与野生型分子相一致。

部分任务的解决和因此一个独立的发明主题表示为具有核苷酸序列的核酸，其与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列有至少85％的同一性，与SEQ ID NO.6所示核苷酸序列有至少85％的同一性。

这是因为，一方面，实施例所述蛋白酶的检测基于所述DNA的分离。另一方面，核酸能够立即克隆，因而引入到衍生酶的重组DNA生产中。

由此，进一步优选的是，与所示核苷酸序列进一步优选有至少87.5％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和最优选100％的同一性，其中包括所有整数和分数中间值。

对应上述完成的实施方式以及在实施例中所述，现有技术中，与SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6最近似的核苷酸序列仅仅有74.4％或者75.0％的同一性。

其他从WO2004/033668A2和基因银行通道AY253983得知的DNA序列已经进行了论述，并且与这里所述本发明的核苷酸序列有很大区别。

还优选的是，本发明的核酸，其同源值分别适用的区域对应于根据SEQ ID NO.3的核苷酸位置97至1746或者根据SEQ ID NO.6的核苷酸位置115至1761。

由此，对应于上述区域的说法意味着，成熟蛋白也即活性蛋白分别编码的区域。也包括终止密码子，因为它的存在使得有较大可能形成不再是功能性的无意的融合蛋白。因此，同样在克隆中要注意，当没有特异性地通过C端造成蛋白融合时，在该位置上存在终止密码子。后来表明，由序列的其他部分形成了成熟蛋白，因此，保护范围相应地适合该部分。

根据本发明，另外优选的是这种核酸，其同源值分别适用的区域是对应于根据SEQ ID NO.3的核苷酸位置97至1410或者根据SEQ IDNO.6的核苷酸位置115至1428。

如实施例所述，在蛋白HP70和HP53中，使用全蛋白的N端部分是足够的；重要C端的缺失在两种情况下导致的是，在洗涤和清洁剂中蛋白水解活性的酶，其给相关组合物的全部清洁能力带来相应的贡献。因此，编码这种变体的核酸为优选实施方式，因为其使得相关蛋白的生物技术制备具有成本效率。

此外，如上所述，相应优选的是本发明的核酸，其编码第一个发明主题的碱性蛋白酶或蛋白。

通过本申请应当提供可用的同样蛋白，因而仅编码非活性蛋白的核酸不是本发明的解决方法。优选的是编码成熟蛋白的核酸，更优选的是编码更有活性变体的核酸。

另外优选的是本发明所述的核酸，其一种或优选多种密码子被同义密码子替代。

这方面尤其涉及相关蛋白酶的异源表达。因而，每种生物，尤其是每种生产株具有某种密码子用法。由此，当存在于转基因核酸中的密码子在宿主细胞中面对相对较小数量的负荷tRNAs时，其在蛋白生物合成中会遭遇瓶颈。与此相反，同义密码子编码相同的氨基酸，并依靠宿主而更好地翻译。因此，任选必需的转录依赖于表达体系的选择。特别在来自未知的、也许是不可培养的生物样品中，必需做出相应的调整。

另外，如上所述，生物细胞包括在保护范围之内，并且表示一个独立的发明主题，其包含天然的本发明核酸。

通过培养可以直接得到希望的酶。

在此，特别优选的是这样的细胞，其天然地表达和优选分泌第一个发明主题的蛋白酶或蛋白。

由此，可以立即测试与本发明蛋白酶有关的预期应用范围，并可以通过立即培养这种生物而相对大量地获得。

还优选这样的细胞，其是指微生物，优选是指真菌或细菌，其中优选为革兰氏阳性菌，更优选为杆菌属(Bacillus)或者黄单胞菌属(Xanthomonas)的革兰氏阴性菌。

现有技术中存在使用微生物的有关分子生物学技术和生产的丰富经验。这特别适合于革兰氏阳性菌，其中杆菌属(Bacillus)属于最熟悉的生产株。然而，同样优选的是黄单胞菌属(Xanthomonas)革兰氏阴性菌，其迄今为止被用于生产细胞外多糖黄原胶。基于已经论述和在实施例所示的同源对比，这种菌属的天然菌种可以生产本发明特别优选的蛋白酶HP70和HP53。至少可以实现在密切相关菌种中的生产，例如密码子用法。

另一个独立的发明主题是第一个发明主题所述碱性蛋白酶的识别方法，这基于从天然生活环境分离核酸。

如本发明所述，新型蛋白酶的识别并非绝对必要，相关蛋白酶和微生物也可以从自然界分离。特别是通过散射克隆或替代地通过已知序列基序的PCR引物，可以直接找出相关核酸。这种方法在本申请实施例1至3中有描述。之后，例如可以培养土壤试样的微生物群落，从中分离DNA，并通过在表达载体中的克隆来测试蛋白酶表达。

优选的方法是，使用一种，优选两种相互相关的寡核苷酸，其可以用作PCR引物，并衍生自两种序列SEQ ID NO.3或6之一。

一种可对照的利用合适引物的基于PCR的方式来自申请WO03/002711A2的α-淀粉酶实施例。代替培养微生物和制备DNA的是，可以直接扩增土壤试样中所含的核酸。其适合基于PCR的方式。SEQ ID NO.3和6所示核苷酸序列可以作为原型用于设计相应PCR引物。有利的是，根据本身已知的方法设计引物，其含有唯一的或者尤其是稍多于成熟蛋白的N端；此外，还可以使用如下在dc-变体(实施例6)上获得的发现，即，通过PCR，仅扩增编码相应的截短蛋白的核酸。

另优选的方法是克隆分离的核酸，优选为表达和更优选为通过表达产物的蛋白酶活性而识别为蛋白酶。

如果不先进行PCR时，克隆通常为重要的分子生物学步骤，用克隆方式启动有关酶的获取。表达用作核酸衍生的蛋白的生化表征。特别地，如果蛋白酶活性的测试成功，例如通过分解蛋白底物(对比实施例)，可以保证发现蛋白酶，其可以在下述有关工业应用可能性的测试中进行检验。

一个单独的发明主题是载体，其包含前述本发明的核酸区域。

为了处置与本发明相关的核酸，并且因此特别是为了制备本发明的蛋白，将它们方便地连接到载体中。这些载体及其相关的操作方法详细描述在现有技术中。载体可以大量和多种选择从市场上获得，既用于克隆也用于表达。这些载体包括例如，衍生自细菌质粒的载体，衍生自噬菌体的载体，或衍生自病毒的载体，或主要是合成的载体。此外，根据载体能够建立自身的细胞类型的性质，它们可区分成例如革兰氏阴性细菌载体，革兰氏阳性细菌载体，酵母载体或高等真核生物载体。它们是例如合适的分子生物学和生化研究的出发点，也是有关基因表达或者相应蛋白的出发点。

在一个实施方案中，本发明的载体是克隆载体。

克隆载体除了储存，生物学扩增或选择目的基因之外，还适用于其他分子生物学表征。同时，它们是要求保护的核酸的可转运和可储存的形式，并且也是不与细胞连接的分子生物学技术的出发点，所述技术诸如PCR或体外突变方法。

优选地，本发明的载体是表达载体。

这种表达载体是在生物生产体系中用于制备相应核酸并由此生产相关蛋白的基础。本发明这种主题的优选实施方案是携带对表达所必需的遗传元件的表达载体，所述遗传元件例如是最初位于所述基因上游的天然启动子或另一生物体的启动子。所述元件可以例如排列成“表达盒”的形式。或者由各自宿主细胞提供可用的一种或所有调节元件。表达载体尤其优选地匹配其他特性，例如对选择表达系统，尤其是宿主细胞的最适拷贝数(参见下文)。

在基因技术的修饰之后包含上述定义的本发明一种核酸区域的细胞，构成一个单独的发明主题。

这些细胞含有合成本发明蛋白的遗传信息。其中，与上述天然生产株对照，这样的细胞同样是指根据本身已知的方法，其具有本发明的核酸，或者由这种细胞衍生。对此，合适地选择相对而言能够简单培养和/或提供高产率的宿主细胞。

它们使得例如相应基因的扩增，突变处理或转录和翻译成为可能，并且最终也使得相关蛋白通过生物技术生产成为可能。这种遗传信息可存在于染色体外，作为单独的遗传元件，即存在于细菌中位于质粒上，或者被整合到染色体中。挑选合适系统取决于目的，例如基因或者生物体的储存方式和持续时间或者突变或选择的方式。因此，例如基于噬菌体-及其特异宿主细胞-用于开发洗涤剂用酶的突变和选择方法被描述在现有技术中(WO97/09446A1)。

在一些国家，相应的国内法要求，从这种申请主题中排除人类胚胎干细胞，本发明仅要求了相应受限的主题。

优选所述核酸区处于本发明上述载体上，尤其在克隆载体或表达载体上。

它们由此对于实现本发明是有意义的。

另外，优选这样的细胞，其表达，优选为分泌第一个发明主题的碱性蛋白酶或蛋白。

形成蛋白的宿主细胞使得通过生物技术生产该蛋白成为可能。适合作为蛋白表达的宿主细胞原则上是所有生物体，即原核生物，真核生物或蓝藻(Cyanophyta)。优选的宿主细胞是那些可容易进行遗传操作，例如表达载体的转化及其稳定建立以及表达调控的细胞，如单细胞的真菌或者细菌。此外，优选的宿主细胞的特征在于良好的微生物和生物技术操作性。这例如涉及易培养性、高生长率、对发酵培养基的低需求、良好的生产率以及外源蛋白质的分泌。尤其优选针对表达的实验室菌株。这些菌株可商购，或一般从菌种保藏机构获得。通过这种方法，本发明的任何蛋白质理论上可以从大量宿主生物中得到。必须通过试验，根据现有技术，从可得到的不同系统的丰度中才能确定哪种表达系统对个别情况最适合。

宿主细胞本身尤其是蛋白酶阴性的，因此不会降解产生的蛋白。

优选的实施方案是那些宿主细胞，其活性由于存在适当的遗传元件可得以调控，例如，通过控制加入化学化合物，改变培养条件或依赖于各自的细胞密度。这种可控表达使得非常经济地生产目的蛋白成为可能；例如其可以通过相应的元件在相关载体上实现。合适的是，基因，表达载体和宿主细胞例如对表达所需的遗传元件(核糖体结合位点，启动子，终止子)，或对密码子应用彼此匹配。

其中优选这些宿主细胞，其特征在于它们是细菌。

细菌本身的特征在于短的传代时间，以及对培养条件的低的要求。这使得建立成本效应的方法成为可能。此外，人们具有细菌发酵技术的大量经验。对于在个别情况下有待通过试验确定的多种理由而言，革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌适用于特定生产，所述理由诸如营养源，产物形成速率，所需时间等。

在一个优选的实施方案中，其是指革兰氏阳性菌，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、假单胞菌(Pseudomonas)或黄单胞菌(Xanthomonas)，优选是指菌株E.coli K12、E.coli B或植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)，最优选是指菌株Escherichia coliBL21(DE3)，E.coli RV308，E.coli DH5α，E.coli JM 109，E.coli XL-1或植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)(Rf)的衍生物。

在诸如大肠杆菌(E.coli)的革兰氏阴性细菌中，有大量蛋白被分泌到胞质空间。对于特殊应用这可能是有利的。在申请WO01/81597A1中公开了一种方法，根据这种方法，表达的蛋白也实现了通过革兰氏阴性细菌的输出。这种系统也适用于生产本发明的蛋白。作为优选的革兰氏阴性菌一般易于商购或从菌种保藏机构获得，也易于与具有同样大量的可用其他成分，诸如载体相互作用一同优化至特定制备条件。

如上所述，基于与体内产生HP70和/或HP53的菌株可能的关系，黄单胞菌(Xanthomonas)是有前景的宿主细胞，假单胞菌(Pseudomonas)也是有前景的宿主细胞；同样，相当重要的是也由于其可能相似的密码子用法。

任选的，同样优选的实施方案是指革兰氏阳性菌，优选是杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)或棒状杆菌属(Corynebakterium)，最优选是迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，克虏伯氏芽孢杆菌(B.globigii)或亲碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)或谷氨酸棒杆菌(Corynebcteriumglutamicum)。

革兰氏阳性菌具有与革兰氏阴性菌的基本差别在于，立即将分泌的蛋白释放到细胞周围的营养介质中，如果希望，本发明的表达蛋白可从中直接加以纯化。此外，它们与对于工业上重要的枯草杆菌素(Subtilisins)的大多数同族微生物是同源的或同一的，并且形成相当的枯草杆菌素(Subtilisins)，从而它们具有相似的密码子用法，并且其蛋白合成装置自然也一致。另外一个优点是，通过这种方法可能获得本发明蛋白与由宿主菌株内源性产生的枯草杆菌素的混合物。这样一种共表达同样可以由申请WO91/02792得知。不希望的是，天然存在于宿主细胞的蛋白酶基因必须永久性或短暂性失活。

进一步优选宿主细胞，其特征在于它们是真核细胞，优选是酵母菌属(Saccharomyces)。

合适的真核生物的例子为真菌，如放线菌(Actinomycetes)或者酵母如糖酵母(Saccharomyces)或克鲁伯氏酵母(Kluyveromyces)。嗜热真菌表达系统在例如WO96/02653A1中提出。它们尤其适合于表达耐热的变体。真核系统中进行的修饰，尤其与蛋白合成相连的修饰，包括结合诸如膜锚分子(anchor)或寡糖的低分子化合物。这种寡糖修饰可以是期望的，例如，用于减少变应原性。与由这样的细胞天然产生的酶，如纤维素酶共表达可能也是有利的。

本发明的单独主题是第一个本发明主题所述碱性蛋白酶或蛋白的制备方法。

每一种生产上述本发明的蛋白的方法，例如化学合成方法都属于此。

然而，与此相反，优选上文各个方面所述的所有在现有技术中确立的分子生物学，微生物学或生物技术学生产方法。

优选是指这样的方法，即应用上述本发明核酸，优选应用上述载体和更优选应用上述细胞所完成的方法。

通过所述核酸，特别是在序列表中SEQ ID NO.3或6所示的核酸，将相应优选的基因信息制成微生物可用形式，即将其用于重组DNA生产方法。进一步优选，所提供的一种宿主细胞或者这种细胞本身是特别可用的载体。相应的生产方法可以被本领域技术人员知晓。

本发明的实施方案能够以所属核酸序列为基础，也可以无细胞的表达体系为基础，此时，可以理解为在体外进行蛋白的生物合成。所有上述元件也可以结合在新方法中，以制备本发明的蛋白。因此，可想到的是，对于每一种本发明的蛋白，都有很多在方法步骤上的组合可能性，从而对每一种具体情况必须用实验确定最佳方法。

与上述说法相应，在与细胞有关的方法中，优选的是，在一种或优选多种密码子中调整核苷酸序列至宿主菌株的密码子用法。

本发明的一个单独主题是组合物，其包含上述本发明的碱性蛋白酶。

所有类型的组合物，尤其是混合物，配剂，溶液等，它们的效用通过加入上述本发明的蛋白而得以改善，在此包括在本发明的保护范围内。取决于应用领域，它们可以是例如固体混合物，例如含有冻干或胶囊化的蛋白的粉剂，或凝胶状产品或液体产品。优选的配方包括例如缓冲物质，稳定剂，蛋白酶的反应物和/或其他辅助因子和/或与蛋白酶有协同作用的其他成分。在此，这些组合物可理解为用在下文详述的应用领域中。其他应用领域从现有技术中也是一目了然的，并且描述在例如手册“工业用酶及其应用(Industrial enzymes and theirapplications)”，H.Uhlig，Wiley出版，New York，1998。

本发明的主题中，作为优选的实施方案的组合物是洗涤或清洁剂。

如在本发明的示例性实施方案中所示，令人惊奇地已经发现，具有本发明优选蛋白酶的洗涤和清洁组合物相对于无酶制剂而言能力提高。

所有能考虑到的清洁剂都可以算作本发明的主题，既包括浓缩物也包括不用稀释加以使用的组合物，用于商业规模，用于洗衣机或用于手洗或手工清洁。对此包括例如用于织物、地毯或天然纤维的洗涤剂，在本发明对此使用术语洗涤剂。它们也包括例如用于洗碗机的洗碗液或用于硬表面，例如金属、玻璃器皿、瓷器、陶器、瓦片、宝石、涂漆面、塑料、木制品或皮革的手工洗碗剂或清洗剂。对于这些来说，在本发明使用术语清洁剂。

本发明的实施方案包含任何按照现有技术中确定的施用形式和/或所有本发明洗涤或清洁剂的施用形式。它们包括例如固体、粉末、液体、胶状或膏状剂，必要时由若干相组成，挤压式或非挤压式；其他例子还包括：包装在大容器内和小份中的压出胶、颗粒、片剂及小袋。

除了本发明枯草杆菌素型碱性蛋白酶，必要时，本发明的洗涤或清洁剂还包含与使用领域相应的其他成分，如其他酶，酶稳定剂，表面活性剂，如非离子的、阴离子的和/或两性的表面活性剂，和/或漂白剂，和/或助洗剂(builder)，以及必要时以下详述的常规成分。

在优选的实施方案中，本发明的洗涤或清洁剂包括上述本发明的枯草杆菌素型碱性蛋白酶，每克组合物的用量为2μg至20mg，优选5μg至17.5mg，更优选20μg至15mg，最优选50μg至10mg。包括所有分别介于这些数值之间的整数和非整数的值。

这种组合物的蛋白酶活性可以按照在Tenside[表面活性剂]，第7卷(1970)，第125-132页中描述的方法测定。相应地，以PE(蛋白酶-单位)所示。

在性能比较中，如本申请实施例所述，两种洗涤剂酶必须在同蛋白使用和同活性使用之间相区别。尤其在重组技术所得的尽可能无其他活性的制备物中，同蛋白使用是恰当的。一种说法由此成为可能，即是否相同蛋白量-计量发酵产物的量-带来类似结果。活性物质与总蛋白的各个比例(特定活性值)相互分离，因此建议进行同活性比较，因为各个酶的性质可以比较。总体上，通过加入较大的蛋白量可以平衡低比活性。这里是出于最终的经济性考虑。

那么，非详尽地说明重要的对洗涤和清洁剂常见的成分。其他对于各自目的合适的成分可以引入作为替代或补充。

优选的非离子表面活性剂为烷氧基化的，有利的是乙氧基化的，特别优选含有8-18个碳原子以及平均每mol醇1-12mol环氧乙烷(EO)的伯醇，其中醇残基可以是直链的，或优选在位置2上被甲基支化的，优选以混合形式含有直链和甲基支链的残基，所以其通常以羰基合成醇残基存在。然而，尤其优选的是包含具有12-18碳原子、天然来源的醇的直链残基以及平均每mol醇2-8EO的脂肪醇乙氧基化物，例如椰子油醇、棕榈油醇、牛油醇或油醇。优选的乙氧基化醇包括，例如含有3或4EO的C12-14醇、含有7EO的C9-11醇、含有3EO、5EO、7EO或8EO的C13-15醇、含有3EO、5EO或7EO的C12-18醇及其混合物，例如含有3EO的C12-14醇和含有5EO的C12-18醇的混合物。上述乙氧化的程度是统计平均值，对于特殊产品来说，这个平均值可能是整数或分数。优选的醇乙氧基化物具有窄的同系物分布(窄范围乙氧基化物，NRE)。除了这些非离子表面活性剂之外，也可以使用高于12EO的脂肪醇。这类脂肪醇的例子是包含14EO、25EO、30EO或40EO的牛油醇。

另一类或作为非离子表面活性剂单用或与其他非离子表面活性剂合用的优选非离子表面活性剂是烷氧基化的、优选乙氧基化的、或乙氧基化和丙氧基化的优选包含1-4个碳原子的烷基链的脂肪酸烷酯，特别是脂肪酸甲酯。

另一类优选使用的非离子表面活性剂是烷基多葡糖苷(APG)。合适的烷基多葡糖苷对应于通式RO(G)z，其中R是直链或支链的，特别是2-甲基支链的、饱和或不饱和的、含有8-22个以及优选12-18个碳原子的脂族基，G是含有5或6个碳原子的糖单元，优选是葡萄糖。糖苷化的程度z介于1.0-4.0之间，优选在1.0-2.0之间，以及更优选在1.1-1.4之间。优选使用直链烷基多葡糖苷，即烷基多葡糖苷，其中多糖基部分是葡萄糖单元以及烷基部分是正-烷基基团。

氧化胺类的非离子表面活性剂，例如N-椰油烷基-N，N-二甲胺氧化物以及N-牛油烷基-N，N-二羟乙胺氧化物，和脂肪酸链烷醇酰胺类也适用。这些非离子表面活性剂的所用量优选不多于乙氧基脂肪醇量，尤其不多于其量的一半。

其它合适的表面活性剂为多羟基脂肪酸酰胺，对应于通式(II)：

其中RCO是包含6-22个碳原子的脂族酰基，R1是氢、含有1-4个碳原子的烷基或羟烷基基团，以及[Z]是直链或支链的、包含3-10个碳原子和3-10个羟基的多羟烷基。多羟基脂肪酸酰胺为已知物质，其通常可通过将还原糖用氨、烷基胺或链烷醇胺加以还原性胺化，继而用脂肪酸、脂肪酸烷酯或氯代脂肪酸加以酰化而获得。

这组多羟基脂肪酸酰胺还包括对应于式(III)的化合物：

其中R是含有7-12个碳原子的直链或支链烷基或者链烯基，R1是含有2-8个碳原子的直链、支链或环化的烷基基团或者芳香基团，以及R2是含有1-8个碳原子的直链、支链或环化的烷基基团或芳香基团或者是烷氧基基团，但优选C1-4的烷基或者苯基基团，以及[Z]是直链的多羟基烷基基团，其烷基链至少被2个羟基取代，或者该基团的烷氧基化，优选乙氧基化或丙氧基化的衍生物。

[Z]优选由还原糖例如葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、甘露糖或木糖的还原性胺化而获得。然后通过例如以醇盐作为催化剂与脂肪酸甲酯反应，可将N-烷氧基或N-芳氧基取代的化合物转化成所需的多羟基脂肪酸酰胺。

合适的阴离子表面活性剂是例如那些磺酸酯和硫酸酯类。合适的磺酸酯类表面活性剂优选是C9-13的烷基苯磺酸酯、烯烃磺酸酯，即烯烃和羟烷基磺酸酯的混合物，以及例如通过气态三氧化硫的磺酸化接着碱化或酸化磺酸化产物而从带有中间或末端双键的C12-18单烯烃中获得的二磺酸酯。其它合适的磺酸酯类表面活性剂是例如通过氯磺化作用或磺化氧化作用接着水解或中和而从C12-18烷烃中获得的链烷磺酸酯。α-磺基脂肪酸的酯(磺酸酯)，例如氢化椰子油、棕榈核油或牛油脂肪酸的α-磺酸化甲酯也适用。

其它合适的阴离子表面活性剂有硫酸化脂肪酸甘油酯。本发明上下文中的脂肪酸甘油酯指单酯、二酯和三酯及其混合物，其由单甘油与1-3mol的脂肪酸的酯化作用或者在甘油三酯和0.3-2mol的甘油发生酯交换反应进行生产而得来的。优选的硫酸化脂肪酸甘油酯是含6-22个碳原子的饱和脂肪酸的硫酸化产物，例如己酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸或山萮酸。

优选的烷(链烯)基硫酸盐是碱金属盐，以及具体是C12-18的脂肪醇的硫酸半酯的钠盐，例如椰油脂肪醇、牛油脂肪醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇或硬脂醇或C10-20的羰基合成醇以及具有同样链长仲醇的对应的半酯。其它优选的烷(链烯)基硫酸盐是那些具有上述链长、含有基于石化产品的合成的、直链烷基链，并且它们的降解行为类似于基于油化品原料的对应的化合物。C12-16烷基硫酸酯、C12-15烷基硫酸酯以及C14-15烷基硫酸酯从洗涤技术的观点出发而优选。其它合适的阴离子表面活性剂是2，3-烷基硫酸酯。

用1-6mol的环氧乙烷乙氧基化的直链或者支链C7-21醇例如含有平均3.5mol环氧乙烷(EO)的2-甲基支链的C9-11醇或者是含有1-4EO的C12-18脂肪醇的硫酸单酯也同样适用。鉴于他们高的发泡能力，他们仅以相对小的量使用，例如按重量计在清洗剂中的量为1％-5％。

其它合适的阴离子表面活性剂是烷磺基琥珀酸的盐，其也已知是磺基琥珀酸盐或磺基琥珀酸酯，以及表示磺基琥珀酸与醇，优选脂肪醇，以及特别是乙氧基化的脂肪醇而形成的单酯或/或二酯。优选的磺基琥珀酸酯含有C8-18脂肪醇残基或其混合物。特别优选的磺基琥珀酸酯含有衍生自乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分，其在分离中考虑时，代表非离子的表面活性剂(描述参见上文)。在这些磺基琥珀酸盐中，那些衍生自窄范围乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分尤其优选。在烷(链烯)基链中优选含有8-18个碳原子的烷(链烯)基琥珀酸或其盐也同样适用。

其它合适的阴离子表面活性剂尤其是肥皂。合适的肥皂是饱和脂肪酸肥皂，如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、氢化芥子酸和山萮酸的盐，以及尤其衍生自天然脂肪酸如椰油、棕榈核油或牛油脂肪酸的肥皂混合物。

阴离子表面活性剂包括肥皂可以钠、钾或铵盐及作为有机碱如单-、二-或三乙醇胺的可溶性盐的形式存在。阴离子表面活性剂优选以钠或钾盐的形式存在，更优选的是钠盐形式。

表面活性剂在本发明的清洁或洗涤产品中存在的总量优选5-50重量％，特别是8-30重量％，以最终产品计。

本发明的洗涤或清洁产品可包含漂白剂。在那些能在水中产生H2O2而充当漂白剂的化合物中，过碳酸钠，过硼酸钠盐四水合物和过硼酸钠一水合物是特别的重要。其它有用的漂白剂有例如过氧焦磷酸盐、柠檬酸的过水合物和产生H2O2的过酸盐或过酸，如过硫酸盐或过硫酸。也可使用脲过氧水合物过尿素，其化学式为H2N-CO-NH2·H2O2。如果需要，产品中也可含有有机类的漂白剂，特别是用于清洗硬表面，例如在洗碗机中，虽然原则上有机漂白剂也可用于洗衣剂。典型的有机漂白剂是二酰基过氧化物，例如二苯甲酰基过氧化物。其它典型的有机漂白剂是过氧酸，其中烷基过氧酸和芳基过氧酸作为例子特别提及。优选的代表是过氧苯甲酸及其环取代的衍生物，例如烷基过氧苯甲酸，还有过氧-α-萘甲酸和单过邻苯二甲酸镁盐，脂族或取代的脂族过氧酸，例如过氧月桂酸、过氧硬脂酸、ε-苯二(甲)酰亚氨基过氧己酸(PAP)、o-羧基苯甲酰氨基过氧己酸、正壬烯氨基过酸性脂肪酸和正壬烯氨基过琥珀酸盐，以及脂族和芳脂族的过氧二羧酸，例如1，12-二过氧羧酸、1，9-二过氧壬二酸、二过氧癸二酸、二过氧巴西基酸、二过氧苯二甲酸、2-癸基二过氧丁烷-1，4-二酸、N，N-对苯二甲酰-二(6-氨基过氧己酸)。

漂白剂在洗涤或清洁产品中的含量是1-40重量％，特别是10至20重量％，其中有利地使用过硼酸盐一水合物或者过碳酸盐。

如果洗涤温度等于或者低于60℃，以及特别是对衣物进行预处理，为了提高漂白效果，洗涤剂中可含有漂白活化剂。合适的漂白活化剂是形成脂族过氧羧酸的化合物，所述脂族过氧羧酸优选含有1-10个碳原子，以及更优选含有2-4个碳原子和/或在过水解条件下任选取代的过苯甲酸。携带具有上述碳原子数的O-和/或N-酰基和/或任选取代的苯甲酰基的物质是适用的。优选的漂白活化剂是聚酰化的烷撑二胺，特别是四乙酰基乙烯二胺(TAED)、酰化的三嗪衍生物，特别是1，5-二乙酰基-2，4-二氧代六氢-1，3，5-三嗪(DADHT)、酰化的甘脲，特别是1，3，4，6-四乙酰基甘脲(TAGU)、N-酰基亚胺，特别是正壬酰基琥珀酰亚胺(NOSI)、酰化的苯酚磺酸盐，特别是正壬酰基或者是异壬酰基羟苯磺酸盐(正-或异-NOBS)、酰化羟羧酸，例如三乙基-O-乙酰基柠檬酸盐(TEOC)、羧酸酐，特别是邻苯二甲酸酐、靛红酸酐和/或琥珀酸酐、羧酸酰胺，例如N-甲基二乙酰胺、乙交酯、酰化多元醇，特别是三醋精、乙二醇二乙酸酯、异丙烯基乙酸酯、2，5-双乙酸基-2，5-二氢呋喃和烯醇酯，它们从德国专利申请DE 196 16 693和DE 196 16 767中得知，乙酰化的山梨醇和甘露醇及其混合物(SORMAN)，它们在欧洲专利申请EP 0 525 239中描述，酰化糖衍生物，特别是五乙酰基葡萄糖(PAG)、五乙酰基果糖、四乙酰基木糖和八乙酰基乳糖，以及乙酰化的任选N-烷基化葡糖胺和葡糖酸内酯、三唑和三唑衍生物和/或粒状的己内酰胺和/或己内酰胺衍生物，优选的是N-乙酰化内酰胺，例如N-苯甲酰己内酰胺和N-乙酰己内酰胺，这些是从国际专利申请WO 94/27970、WO94/28102、WO 94/28103、WO 95/00626、WO 95/14759和WO 95/17498中得来。从德国专利申请DE 196 16 769中得知的取代的亲水性酰基乙缩醛和在德国专利申请DE 196 16 770以及国际专利申请WO 95/14075中描述的酰基内酰胺也优选采用。与从德国专利申请DE 44 43 177中得知的常规漂白活化剂组合也可采用。腈衍生物，例如氰基吡啶、四腈(Nitrilquats)，例如N-烷基铵乙腈，和/或氨腈衍生物也可使用。优选的漂白活化剂为4-(辛酰氧基)-苯磺酸钠、正壬酰或异壬酰氧基苯磺酸酯(正或异-NOBS)、十一酰氧基苯磺酸酯(UDOBS)、十二酰氧基苯磺酸钠(DOBS)、十一酰氧基苯甲酸(DOBA，OBC 10)和/或十二酰氧基苯磺酸酯(OBS 12)以及N-甲基吗啉鎓乙腈(MMA)。这类漂白活化剂常用量占整个组成的0.01-20重量％，优选0.1-15重量％，以及更优选1-10重量％。

除了或代替上述的常规漂白活化剂，所谓的漂白催化剂也可掺入。漂白催化剂是促进漂白的过渡金属盐或者是过渡金属配合物如锰、铁、钻、钌或者钼-Salen配合物或者羰基配合物。具有含氮的三角配体的锰、铁、钴、钌、钼、钛、钒和铜的配合物，以及钴、铁、铜、钌-氨合物的复合物体也可以用做漂白催化剂，优选使用在DE 19709284 A1中描述的化合物。

本发明的洗涤或清洁产品通常含有一种或多种助洗剂(Builder)，特别是沸石、硅酸盐、碳酸盐、有机共助洗剂以及磷酸盐，假使根据生态环境对使用这些磷酸盐没有反对意见的话。磷在洗碗机洗涤剂中是尤其优选的主要助洗剂。

可在此提及的化合物为晶体层状硅酸钠，对应于通式NaMSixO2x+1·yH2O，其中M是钠或者氢，x是1.6-4，优选1.9至4.0之间的数，以及y是0-20之间的数，x值优选为2、3或4。这样的晶体层状硅酸盐记载在如欧洲专利申请EP 164514中。对应于上述通式的优选的晶体层硅酸盐是其中M为钠、x为2或3的那些。β-和δ-二硅酸钠Na2Si2O5·yH2O均特别优选。这些化合物可从市场上购得，如SKS(Clariant)。因此SKS-6主要是δ-二硅酸钠，其化学式为Na2Si2O5·yH2O，而SKS-7主要是β-二硅酸钠。通过与酸(例如柠檬酸或碳酸)反应，δ-二硅酸钠生成kanemite NaHSi2O5·H2O，其以SKS-9和SKS-10(Clariant)在市场上销售。对这些层状硅酸盐进行化学修饰也有优势。例如，层状硅酸盐的碱度可受到适度的影响。与δ-二硅酸钠相比，掺杂磷酸或者碳酸的层状硅酸盐已经修饰了晶体形态，他们溶解更快而且显示出与δ-二硅酸钠相关的钙结合能力增加。层状硅酸盐具有一般的经验式x Na2O·yH2O·zP2O5，其中x与y的比例对应于0.35-0.6，x和z的比例对应于1.75-1200，以及y和z的比例对应于4-2,800，它们在专利申请DE 196 01 063中有记载。层状硅酸盐的溶解度还可通过利用特别精细颗粒的层状硅酸盐来提高。晶体层状硅酸盐和其他成分的化合物也可采用。尤其引人关注的是与纤维素衍生物组成的化合物，其在崩解效果上具有优势，并尤其用于洗涤剂片剂中，以及与聚羧酸如柠檬酸或聚合的聚羧酸组成的化合物，例如丙烯酸的共聚物。

其他有用的助洗剂是无定形硅酸钠盐，其模量(Na2O∶SiO2比率)为1∶2-1∶3.3，优选为1∶2-1∶2.8，以及更优选是1∶2-1∶2.6，其可以延迟崩解并表现多重洗涤循环特性。与常规的无定形硅酸钠相关的溶解推迟可由多种方法获得，例如表面处理、混合/压实或通过过干燥法。在本发明的上下文中，术语“无定形”同样可理解为包括“X-射线无定形”。换一种说法，硅酸盐并不产生任何强烈的X-射线反射，这在X-射线衍射实验中是晶体物质的特征，但最多有一个或多个具有几度衍射角宽的散射X-辐射的最大值。然而，在电子衍射实验中，当硅酸盐粒子产生弯曲或者甚至尖锐的衍射最大值时，甚至可获得特别好助洗剂特性。这个可解释表示这些产品具有微晶区域，大小介于10至数百nm，优选上限为50nm以及更优选上限达20nm。尤其优选压实的无定型硅酸盐、混合的无定型硅酸盐以及干燥的X-射线-无定形硅酸盐。

如果需要，本发明可使用的精细晶体、含有结合水的合成沸石优选是沸石A和/或沸石P。沸石MAP(Crosfield公司的销售产品)是尤其优选的P-型沸石。然而，沸石X和A、X和/或P的混合物也可适用。依照本发明，优选的是使用例如，商业上可得到的沸石X和沸石A的共晶体化物(约80重量％的沸石X)，其由CONDEA Augusta S.p.A.公司以VEGOBOND AX商标名销售，并可由下式描述：

nNa2O·(1-n)K2O·Al2O3·(2-2.5)SiO2·(3.5-5.5)H2O。

适合的沸石的平均粒子尺寸小于10μm(体积分布，测量方法：Coulter Counter)，并优选含有18-22重量％，以及更优选的20-22重量％的结合水。

众所周知的磷酸盐当然也可用作助洗剂，倘若它们的应用对处于生态环境的理由不应避免。在大量市场上可得到的磷酸盐中，碱金属磷酸盐在洗涤剂工业中最为重要，三磷酸五钠和三磷酸五钾(钠和钾的三磷酸盐)尤其优选。

“碱金属磷酸盐”是各种磷酸的碱金属(特别是钠和钾)盐的集合术语，包括偏磷酸(HPO3)n和正磷酸(H3PO4)以及更高分子量的代表。磷酸盐兼有各种优点：他们充当碱性载体，阻止石灰沉积在机器零件上以及在织物上石灰结壳，此外，有助于清洁效果。

磷酸二氢钠(NaH2PO4)以二水化合物(密度1.91gcm^-3，熔点60°)和一水化合物(密度2.04gcm^-3)存在。这两种盐都是白色非常易溶于水的粉末，加热后失去结晶水，并在200℃下转化为弱酸性的二磷酸盐(二磷酸氢二钠，Na2H2P2O7)，以及在更高温度时转化为三偏磷酸钠(Na3P3O9)和长链高分子量偏磷酸钠(Maddrell盐)(参见下文)。NaH2PO4显示酸性反应。用氢氧化钠调整磷酸到pH值4.5，然后喷雾干燥所得“浆”就可形成NaH2PO4。磷酸二氢钾(原或者一元磷酸钾、磷酸氢钾、KDP)KH2PO4是白色盐，其密度为2.33gcm^-3，熔点253°(分解形成多磷酸钾(KPO3)x)，并且易溶于水。

硫酸氢二钠(次磷酸钠)Na2HPO4是无色、易溶于水的晶体盐。以无水、带2mol水(密度2.066gcm^-3，95℃时失水)、带7mol水(密度1.68gcm^-3，熔点48°时失去5水)以及12mol水(密度1.52gcm^-3，熔点35°失去5水)的形式存在，在100°时变成无水，在急剧加热下，就会转变成二磷酸盐Na4P2O7。以酚酞作指示剂，用苏打水中和磷酸就能制备磷酸氢二钠。磷酸氢二钾(次级或者二元磷酸钾)K2HPO4是无定型的白色盐、易溶于水。

磷酸三钠，叔磷酸钠，Na3PO4，是无色晶体，作为十二水合物，其密度是1.62gcm^-3，熔点是73-76℃(分解)，作为十水合物，其熔点为100℃(对应于19-20％P2O5)，无水形式的密度为2.536gcm^-3(对应于39-40％P2O5)。通过碱性反应磷酸三钠易溶于水，其制备方法是通过蒸发浓缩恰好1mol磷酸二钠和1mol氢氧化钠的溶液。磷酸三钾(三级或者三元磷酸钾)K3PO4是白色易潮解的颗粒粉末，密度2.56gcm^-3，熔点1340°，通过碱性反应易溶于水。例如如果托马斯(Thomas)矿渣与煤和硫酸钾一起加热，就形成磷酸三钾。尽管价格更高，但由于它们更易溶，所以在洗涤剂工业中，高效磷酸钾通常比相应的钠化合物更受欢迎。

二磷酸四钠(焦磷酸钠)Na4P2O7以无水形式(密度2.534gcm^-3，熔点988℃，有时是880℃)和十水合物的形式存在(密度1.815-1.836gcm^-3，熔点94℃时失水)。这两个物质都是无色晶体，通过碱性反应溶于水中。当磷酸氢二钠加热到200°以上，或通过磷酸与苏打以化学计量比反应并喷雾干燥该溶液就形成焦磷酸钠。十水合物络合重金属盐和硬盐，由此减少了水的硬度。二磷酸钾(焦磷酸钾)K4P2O7以三水合物的形式存在，是一种无色吸湿性粉末，密度2.33gcm^-3，溶于水，在25°时，1％溶液pH值为10.4。

相对高分子量的磷酸钠和磷酸钾是通过浓缩NaH2PO4和KH2PO4形成的。它们可划分成环型，即钠和钾的偏磷酸盐，以及链型，即钠和钾的多磷酸盐。特别是链型有很多不同的名称：熔合或煅烧的磷酸盐、格雷姆盐(Graham盐)、四聚偏磷酸钾(Kurrol盐)以及Maddrell盐。所有更高的钠和钾的磷酸盐都统称为浓缩的磷酸盐。

在工业上有重要用途的三磷酸五钠Na5P3O10(三聚磷酸钠)是非吸湿性白色水溶性盐，其不带水或带6个水分子结晶，具有通式NaO-[P(O)(ONa)-O]n-Na，其中n＝3。在室温条件下，大约17克无结晶水的盐溶于100克的水中，在60°时是约20克，而在100°时大约是32克。将这种溶液加热2小时到100°，大约8％的正磷酸盐和15％的二磷酸通过水解形成。在制备三磷酸五钠时，将磷酸与苏打水溶液或者氢氧化钠以化学计量比反应，并将溶液喷雾干燥。同格雷姆盐和磷酸氢钠相似，三磷酸五钠溶解许多不溶性的金属化合物(包括石灰肥皂等)。市场上的三磷酸五钠K5P3O10例如按重量计都是50％溶液(＞23％P2O5，25％K2O)的形式。多磷酸钾广泛应用于洗涤剂工业中。还存在三磷酸钾钠，根据本发明，也可使用。例如当三偏磷酸钠用氢氧化钾水解时形成三磷酸钾钠：

(NaPO3)3+2KOHNa3K2P3O10+H2O

根据本发明，它们可以完全相同的方式用作三聚磷酸钠、三聚磷酸钾或者它们的混合物。根据本发明，三聚磷酸钠和三聚磷酸钠钾两者的混合物或者三聚磷酸钾和三聚磷酸钾钠两者的混合物或者三聚磷酸钠和三聚磷酸钾和三聚磷酸钠钾三者的混合物也可使用。

本发明的洗涤和清洁产品中的有机共助洗剂尤其包括多羧酸盐或多羧酸、聚体多羧酸盐、多天冬氨酸、聚乙缩醛、任选氧化糊精、其他有机共助洗剂(参见下文)和膦酸酯。下面描述这些类物质。

有用的有机助洗剂例如为以其钠盐形式使用的多羧酸，其中多羧酸应理解为携带一个以上酸官能团的羧酸。只要对生态是安全的，这些羧酸包括例如柠檬酸、己二酸、丁二酸、戊二酸、苹果酸、酒石酸、马来酸、反丁烯二酸、糖酸、氨基羧酸、次氮基三乙酸(NTA)及其混合物。优选的盐是多羧酸的盐，如柠檬酸、己二酸、丁二酸、戊二酸、酒石酸、糖酸及其混合物。

这些酸本身就可使用。除了它们助洗效应以外，这些酸也通常具有使成分酸化的性质，因此在洗涤剂或清洗剂中用来建立相对较低和适中的pH值，除非pH值要求通过混合其他成分而得到。在这方面特别提及系统相容性和对环境安全的酸，如柠檬酸、乙酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、葡萄酸以及它们的任意混合物。然而，无机酸尤其是硫酸，或碱尤其是铵或碱金属的氢氧化物也可用作pH调节剂。这些调节剂存在于本发明的产品中，其量优选不高于20重量％，以及特别为1.2-17重量％。

其他合适的助洗剂有聚合的多羧酸盐，例如是聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的碱金属盐，例如那些相对分子量为500-700,000g/mol的。

本说明书中提及的聚合多羧酸盐的分子量是各自酸形式的重均分子量Mw，其主要利用紫外检测仪通过凝胶渗透色谱法(GPC)测定。测定根据聚丙烯酸的外标进行，所述外标依靠其与所研究聚合物的结构相似性而提供实际的分子量值。这些值完全不同于以聚苯乙烯磺酸为标准测定的分子量值。以聚苯乙烯磺酸为标准测定的摩尔质量一般高于本说明书中给出的摩尔质量。

尤其合适的聚合物是聚丙烯酸酯，其优选具有2,000-20,000g/mol的分子量。由于具有优良的溶解性，该组优选的代表是短链聚丙烯酸酯，其分子量为2,000-10,000g/mol，以及特别为3,000-5,000g/mol。

此外，合适的还有共聚合的聚羧酸酯，特别是丙烯酸与甲基丙烯酸的那些共聚合的聚羧酸酯，以及丙烯酸或甲基丙稀酸与马来酸的那些共聚合的聚羧酸酯。证明含有50-90重量％丙烯酸以及50-10重量％马来酸的丙烯酸/马来酸共聚物尤其合适。以游离酸计，它们的相对分子量一般为2,000 to 70,000g/mol，优选在20,000-50,000g/mol，更优选在30,000-40,000g/mol。(共)聚合的聚羧酸酯可以粉末形式或者水溶液的形式利用。(共)聚合的聚羧酸酯在清洗剂中所占的含量为0.5-20重量％，特别为1-10重量％。

为了改善水中的溶解度，这些聚合体也可包含烯丙基磺酸，如烯丙基羟苯磺酸以及甲代烯丙基磺酸作为单体。

特别优选的聚合物是由2种以上不同单体单元构成的可生物降解的聚合物，如那些含有丙烯酸和马来酸以及乙烯醇或乙烯醇衍生物作为单体的，或者那些含有以丙烯酸和2-烷基烯丙基磺酸和糖衍生物作为单体的。

其他优选的共聚物是那些优选含有丙烯醛和丙烯酸/丙烯酸盐或丙烯醛和乙烯基醋酸酯作为单体的共聚物。

其他优选的助洗剂是聚合的氨基二元羧酸、其盐或其前体。聚天冬氨酸或者盐及其衍生物是特别优选的。

其他合适的助洗剂是聚缩醛，它们可通过二醛与含有5-7个碳原子和至少3个羟基的多羟基羧酸反应得到。优选的聚缩醛可从二醛如乙二醛、戊二醛、对苯二醛及其混合物得到，以及从多羟基羧酸如葡糖酸和/或葡庚糖酸获得。

其他合适的有机助洗剂是糊精，如碳水化合物的低聚物或聚合物，它们可由部分水解淀粉获得。通过常规方法如酸或者酶催化的方法进行水解反应。水解产物优选平均分子量为400-500,000g/mol。优选具有右旋糖当量(DE)0.5-40，特别为2-30的多糖，其中与DE为100的右旋糖比较，该DE是衡量多糖的还原效果的常用尺度。DE为3-20的麦芽糊精和DE为20-37的干葡萄糖糖浆以及具有相对高的分子量为2,000-30,000g/mol的所谓黄、白糊精都可采用。

这些糊精的氧化衍生物是它们与氧化剂的反应产物，所述氧化剂能将糖环的至少一个醇官能团氧化成羧酸官能团。本发明产品中尤其优选的有机助洗剂是根据EP 472 042、WO 97/25399和EP 755944的氧化淀粉或其衍生物。

其他合适的共助洗剂是羟二琥珀酸盐以及其他二琥珀酸的衍生物，优选二琥珀酸化乙二胺。乙二胺-N，N’-二琥珀酸盐(EDDS)优选以钠盐或者镁盐形式使用。就此而论，丙三醇二琥珀酸酯和丙三醇三琥珀酸酯也是优选对象。在含沸石、碳酸盐和/或含硅酸盐的产品中使用量为3-15重量％。

其它有用的有机助洗剂是例如乙酰化的羟基羧酸及其盐，其可任选以内酯形式出现并含有至少4个碳原子、至少一个羟基和最多2个酸性基团。

具有共助洗剂特性的另一类物质是膦酸盐。对此特别是羟基链烷和氨基链烷膦酸盐。在羟基链烷膦酸盐中，1-羟基乙烷-1，1-二膦酸盐(HEDP)作为共助洗剂尤为重要。优选使用钠盐，其中二钠盐显示中性反应，以及四钠盐显示碱性反应(pH 9)。优选的氨基链烷膦酸盐有乙二胺四亚甲基膦酸盐(EDTMP)、二乙基三胺五亚甲基膦酸盐(DTPMP)及其更高的同系物。优选使用中性反应的钠盐形式，如EDTMP的六钠盐或者DTPMP的七-和十钠盐。在膦酸盐中，HEDP优选用作助洗剂。另外，氨基链烷膦酸盐具有显著的重金属结合能力。因此，尤其如果洗涤剂里亦含有漂白剂，有益的是可利用氨基链烷膦酸盐，特别为DTPMP，或者上述膦酸盐的混合物。

另外，任何能与碱土金属离子形成复合物的化合物都可用作共助洗剂。

本发明的洗涤或清洁产品中可任选包含其量高达90重量％的助洗剂。其含量优选高达75重量％。本发明洗涤剂中的助洗剂含量尤其为5-50重量％。在本发明的洗涤剂用于硬表面清洁，特别是用于餐具的机械洗涤时，助洗剂的含量尤其为5-88重量％，其中在这种洗涤剂中优选不含水不溶性的助洗剂。在一优选实施方案中，本发明的特别用于洗碗机的洗涤剂包含20-40重量％的水溶性有机助洗剂，特别是碱金属柠檬酸盐，含有5-15重量％的碱金属碳酸盐以及20-40重量％的碱金属二硅酸盐。

在液体至凝胶形式的洗涤和清洁产品的组成中可用的溶剂来源于例如一元醇或者多元醇、烷醇胺或乙二醇醚的基团，条件是在指定的浓度范围内它们能与水混合。这些溶剂优选选自乙醇，正或异丙醇，丁醇，乙二醇甲醚，乙二醇乙醚，乙二醇丙醚，乙二醇一-正丁醚，二乙二醇甲醚，二乙二醇二乙醚，丙二醇甲基、乙基或丙基醚，二丙二醇单甲基或单乙基醚，二异丙二醇单甲基或单乙基醚，甲氧基、乙氧基或丁氧基三甘醇，1-丁氧基乙氧基-2-丙醇，3-甲基-3-甲氧基丁醇，丙二醇叔-丁醚以及这些溶剂的混合物。

在本发明的液体至凝胶形式的洗涤和清洁产品中，溶剂的含量为0.1-20重量％，优选低于15重量％，以及特别低于10重量％。

为了调节粘度，可向本发明产品中加入一种或者多种增稠剂，例如增稠体系。这些高分子量物质也称为膨胀剂通常吸收大量液体并且在此过程中膨胀，以便最终变成粘滞的纯溶液或胶状溶液。

合适的增稠剂是无机或者聚合的有机化合物。无机增稠剂包括例如聚硅酸、粘土矿物如蒙脱石、沸石、硅石和膨润土。有机增稠剂来源于天然聚合物、改性的天然聚合物和完全合成的聚合物。天然存在的聚合物的例子有琼脂、角叉菜、黄蓍胶、阿拉伯胶、藻酸盐、果胶、聚糖、瓜耳胶、刺槐豆胶、淀粉、糊精、明胶以及干酪素。可用作增稠剂的改性天然聚合体主要来源于改性淀粉和纤维素。这里例如是羧甲基纤维素及其他纤维素醚、羟基乙基和羟基丙基纤维素以及树胶醚。完全合成的增稠剂包括聚合物，如聚丙烯和聚甲基丙烯化合物、乙烯基聚合物、聚羧酸、聚醚、聚亚胺、聚酰胺和聚氨基甲酸酯。

以最终的产品计，增稠剂的用量最高达5重量％，优选0.05-2重量％，以及特别优选为0.1-1.5重量％。

本发明的洗涤和清洁产品可任选含有螯合剂、电解液和其他助剂，如荧光增白剂、泛灰抑制剂、银腐蚀抑制剂、染料转移抑制剂、泡沫抑制剂、研磨剂、染料和/或香精，以及微生物活性成分，紫外吸收剂和/或酶稳定剂作为它的补充成分。

本发明的织物洗涤剂可包含二氨基1，2-二苯乙烯二磺酸的衍生物或其碱金属盐作为荧光增白剂。合适的荧光增白剂有例如4，4’-双-(2-苯胺基-4-吗啉基-1，3，5-三嗪基-6-氨基)-1，2-二苯乙烯-2，2’-二磺酸的盐或者相似组成的化合物，所述化合物的吗啉基可被二乙醇氨基、甲氨基、苯胺基或者2-甲氧基乙氨基替代。也可使用取代的二苯基苯乙烯基型的增白剂，如4，4’-双-(2-磺苯乙烯基)-二苯基、4，4’-双-(4-氯-3-磺苯乙烯基)-二苯基或者4-(4-氯苯乙烯基)-4’-(2-磺苯乙烯基)-二苯基的碱金属盐。上述荧光增白剂的混合物也可以使用。

泛灰抑制剂的作用是使从织物纤维上溶解出的污物保持悬浮于洗涤液中。合适的泛灰抑制剂是大多数的天然有机物的水溶性胶体，如淀粉、动物胶、明胶、淀粉或纤维素的羧酸乙醚或者磺酸乙醚的盐，也可以是纤维素或淀粉的酸性硫酸酯的盐。包含酸性基团的水溶性聚酰胺也适用此目的。淀粉衍生物除了上面提及的以外，例如还有乙醛淀粉等也都可使用。纤维素乙醚如羧甲基纤维素(钠盐)、甲基纤维素、羟烷基纤维素以及混合醚，如甲基羟乙基纤维素、甲基羟丙基纤维素、甲基羧甲基纤维素及其混合物优选使用，例如以该洗涤剂计，其用量为0.1-5重量％。

为了保护银器免遭腐蚀，可以在本发明的洗碗洗涤剂中使用银腐蚀抑制剂。现有技术中，银腐蚀抑制剂是已知的，并包括例如，苯并三唑、氯化铁(III)以及硫酸钴。例如，从欧洲专利EP 0 736 084 B1已知，特别适合与酶一起使用的银腐蚀抑制剂有锰、钛、锆、铪、钒、钴或铈盐和/或络合物，在这些络合物中上述金属元素以氧化数II、II、IV、V或VI的一种形式存在。这些化合物的例子有MnSO4、V2O5、V2O4、VO2、TiOSO4、K2TiF6、K2ZrF6、Co(NO3)2、Co(NO3)3及其混合物。

污渍释放剂或污渍驱除剂通常是聚合物，当这些聚合物用于洗涤剂中时，它们就给洗涤的纤维提供污渍排斥特性和/或支持洗涤剂的其他成分悬浮污渍的能力。在这些聚合物用于硬表面的清洗剂中时，也能观测到可比的效果。

特别有效并且长期以来已知的污渍释放活性剂是具有二羧酸、烷撑二醇以及聚亚烷基二醇单元的共聚酯。例子为聚对苯二甲酸乙二酯和聚乙二醇的共聚物或混合聚合物(DT 16 17 141或DT 22 00 911)。DE22 53 063中提到酸性组合物，其中含有由二碱性羧酸和亚烷基或环亚烷基聚乙二醇组成的共聚物。在DE 28 57 292、DE 33 24 258以及EP 0253 567中描述了对苯二甲酸亚乙酯和聚环氧乙烷-对苯二甲酸酯的共聚物和它们在洗涤剂中的应用。欧洲专利EP 066 944涉及一种组合物，其含有由乙二醇、聚乙二醇、芳族二羧酸与磺化芳族二羧酸以一定摩尔比构成的共聚酯。欧洲专利EP 0 185 427描述了甲基-或乙基-末端的聚酯，其含有对苯二甲酸亚乙酯和/或亚丙酯单元和聚环氧乙烷-对苯二甲酸酯单元，以及描述了含有此种污渍释放聚合物的洗涤剂。欧洲专利EP 0 241 984涉及聚酯，这种聚酯除了含有氧乙烯基团和对苯二甲酸单元以外，还包含取代的亚乙基单元和甘油单元。欧洲专利EP 0 241985公开了一种聚酯，其除了含有氧乙烯基团和对苯二甲酸以外，还含有1，2-亚丙基、1，2-亚丁基和/或3-甲氧基-1，2-亚丙基和甘油单元，并且其以C1-4烷基为末端。欧洲专利申请EP 0 272 033描述了包含聚对苯二甲酸亚丙酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯单元的至少部分以C1-4烷基或酰基为末端的聚酯。欧洲专利EP 0 274 907描述了包含以磺乙基为末端的对苯二甲酸酯的污渍释放聚酯。根据欧洲专利申请EP 0357 280，包含对苯二甲酸、亚烷基二醇和聚-C2-4-乙二醇单元的污渍释放聚酯可通过不饱和端基的磺化来制备。国际专利申请WO 95/32232涉及酸性芳族污渍释放聚酯。国际专利申请WO 97/31085描述用于棉织物的未聚合的污渍驱除剂，其含有若干官能团单元：第一单元例如可能是阳离子的，能通过静电相互作用吸附到棉表面，以及第二单元是疏水的，负责遗留在水/棉界面上的活性物质。

适用于本发明的洗衣店用洗涤剂中的染料转移抑制剂尤其包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯咪唑、聚合的N-氧化物，如聚-(乙烯基吡啶-N-氧化物)和乙烯基吡咯烷酮与乙烯基咪唑的共聚物。

在机器清洗过程中使用时，将泡沫抑制剂加入到洗涤剂中会大有好处。合适的泡沫抑制剂例如是具有较高含量的C18-24脂肪酸的天然或合成来源的皂类。合适的非表面活性剂类的泡沫抑制剂是例如有机聚硅氧烷及其与微细的任选硅烷化的硅酸以及石腊、腊、微晶腊的混合物，以及它们与硅烷化的硅酸或者二-硬脂酰亚乙基二酰胺的混合物。不同泡沫抑制剂的混合物，如硅酮、石蜡和蜡的混合物也可以被有效的利用。泡沫抑制剂，特别是含硅氧烷-和/或含石蜡-的泡沫抑制剂优选固定到粒状水溶性的或水分散的支持物上。尤其优选石蜡和双-硬脂酰亚乙基二酰胺的混合物。

另外，本发明的硬表面清洗剂可含有研磨剂组分，特别是选自石英粉、锯末、塑料粉、白垩和玻璃微珠以及它们的混合物。存在于本发明清洗剂中的研磨剂，其量优选不超过20重量％，特别为5-15重量％。

将染料和香精加入到本发明的洗涤剂/清洗剂中以改善产品的美学吸引力，并给消费者不仅提供所需要的洗涤和清洁功效而且还提供了视觉和感官上“特别和不易错认”的产品。合适的芳香油或香料包括个别的芳香化合物，如酯、醚、醛、酮、醇和烃类的合成产品。酯类的芳香化合物例如是乙酸苄酯、异丁酸苯氧基乙基酯、乙酸p-叔丁基环己酯、乙酸芳樟酯、乙酸二甲基苄基原酯、乙酸苯基乙酯、苯甲酸芳樟酯、甲酸苄基酯、氨基乙酸乙基甲基苯酯、丙酸烯丙基环己酯、丙酸甲基苯基原酯和水杨酸苄酯。醚包括例如苄基乙基醚；醛包括例如含有8-18个碳原子的直链链烷醛(Alkanale)、柠檬醛、香茅醛、香茅基含氧乙醛、仙客来醛、羟基香茅醛、铃兰醛和Bourgeonal；酮包括例如紫罗酮、α-异甲基紫罗酮以及甲基柏木酮；醇包括茴香脑、香茅醇、丁子香酚、香叶醇、沉香醇、苯乙基醇和松油醇；以及烃最主要包括萜烯，如芋烯和蒎烯。然而，优选使用各种香精的混合物一起产生诱人的香味。象这样的芳香油也可包含天然香精混合物，这些混合物可得自植物源如松树、柑橘属植物、茉莉、绿叶刺蕊草、玫瑰或衣兰衣兰油。还可适用的有鼠尾草油、春黄菊油、丁香油、蜜蜂花油、薄荷油、肉桂叶油、酸橙花油、杜松子油、岩兰油、乳香油、枫子香油和岩蔷薇油，以及橙花油、苦橙油、桔皮油和檀香油。洗涤剂/清洗剂的染料含量通常低于0.01重量％，而香料却可占到整个组合物的2重量％。

香料可直接掺入到洗涤和清洁产品中，然而，有利地是将香味涂覆到载体上，所述载体能够增强香气在洗涤物上的附着力，并通过缓慢释放香气给处理过的织物特别提供持久的芳香。合适的载体物质例如是环糊精，其中环糊精/香料复合物还可附加地用其它助剂涂覆。另一优选的芳料载体是已描述过的沸石X，它也能够代替表面活性剂或与表面活性剂混合吸收香气。因此，含有所述沸石X的洗涤和清洁产品是优选的，其中所述香料至少部分吸收在沸石上。

专业人员毫无困难地选择的优选的染料具有高的储藏稳定性，不受产品中的其他常规成分和受光的影响，并且对织物纤维不显示显著的直接染色性从而不给它们上色。

为了控制微生物，洗涤或清洁产品可以含有抗菌活性成分。依赖抗菌谱和作用机理，抗菌剂分为细菌抑制剂和杀菌剂、真菌抑制剂和杀真菌剂等。这些组的重要代表是例如苯扎氯胺、烷芳基磺酸盐、卤代苯酚和苯酚醋酸汞化物。在本发明教导的范围中，术语“抗微生物活性”和“抗微生物活性物质”具有本领域的常规意义，如K.H.Wallhuβer在“Praxis der Sterilisation，Desinfektion-Konservierung：Keimidentifizierung-Betriebshygiene”(第5版，Stuttgart/New York：Thieme，1995)中所定义，其中所述的任何具有抗微生物活性的物质均可使用。合适的抗微生物活性成分优选选自醇、胺、醛、抗微生物的酸及其盐、羧酸酯、酰胺、苯酚、苯酚衍生物、联苯、联苯基烷、尿素衍生物、氧和氮缩醛和缩甲醛、苄脒、异噻唑啉、邻苯二甲酰亚胺衍生物、吡啶衍生物、抗微生物的表面活性化合物、胍、抗微生物的两性化合物、喹啉、1，2-二溴代-2，4-二氰基丁烷、碘代-2-丙基丁基氨基甲酸酯、碘、碘递体、过氧化合物、卤化合物以及上述的任意混合物。

因此杀菌活性成分可选自乙醇、正丙醇、异丙醇、1，3-丁二醇、苯氧基乙醇、1，2-丙二醇、甘油、十一烯酸、苯甲酸、水杨酸、二氢乙酸(Dihydracetic acid)、邻-苯基酚、N-甲基吗啉乙腈(MMA)、2-苄基-4-氯酚、2，2’-亚甲基-双-(6-溴代-4-氯酚)、4，4’-二氯-2’-羟基联苯乙醚(Dichlosan)、2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯基醚(Trichlosan)、Chlorohexidine、N-(4-氯苯基)-N-3，4-二氯苯基)-脲、N，N′-(1，10-癸烷二基二-1-嘧啶基-4-亚基)-双-(1-辛胺)-二氢氯化物、N，N′-双-(4-氯苯基)-3，12-二亚氨基-2，4，11，13-四氮杂四癸烷二亚氨基酰胺、葡糖鱼精蛋白、抗微生物的表面活性季化合物、胍包括二胍和聚胍，如1，6-双-(2-乙基己基二胍基己烷)-二氢氯化物、1，6-双-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氢氯化物、1，6-二-(N1，N1′-苯基-N1，N1-甲基二胍基-N5，N5′)-己烷二氢氯化物、1，6-二-(N1，N1′-邻-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氢氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，6-二氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氢氯化物、1，6-二-[N1N1′-β-(对-甲氧基苯基)-二胍基-N5，N5′]-己烷二氢氯化物、1，6-二-(N1N1′-α-甲基-β-苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氢氯化物、1，6-二-(N1，N1′-对-硝基苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氢氯化物、ω：ω-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-二-正丙基醚二氢氯化物、ω：ω′-二-(N1，N1′-对-氯苯基二胍基-N5，N5′)-二-正丙基醚四氢氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，4-二氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氢氯化物、1，6-二-(N1，N1′-对-甲基苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氢氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，4，5-三氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氢氯化物、1，6-二-[N1，N1′-α-(对-氯苯基)-乙基二胍基-N5，N5′]-己烷二氢氯化物、ω：ω-二-(N1，N1′-对-氯苯基二胍基-N5，N5′)-间-二甲苯二氢氯化物、1，12-二-(N1，N1′-对-氯苯基二胍基-N5，N5′)-十二烷二氢氯化物、1，10-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-癸烷四氢氯化物、1，12-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-十二烷四氢氯化物、1，6-二-(N1，N1′-邻-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氢氯化物、1，6-二-(N1，N1′-邻-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氢氯化物、乙烯-双-(1-甲苯基双缩胍)、乙烯-双-(对-甲苯基双缩胍)、乙烯-双-(3，5-二甲基苯基双缩胍)、乙烯-双-(对-叔戊基苯基双缩胍)、乙烯-双-(壬基苯基双缩胍)、乙烯-双-(苯基双缩胍)、乙烯-双-(正丁基苯基双缩胍)、乙烯-双-(2，5-二乙氧基苯基双缩胍)、乙烯-双-(2，4-二甲基苯基双缩胍)、乙烯-双-(邻-联苯双缩胍)、乙烯-双-(混合-戊基萘基双缩胍)、正丁基乙烯-双-(苯基双缩胍)、三亚甲基-双-(邻-甲苯基双缩胍)、正丁基三亚甲基-双-(苯基双缩胍)以及相应的盐，如醋酸盐、葡糖酸盐、氢氯化物、氢溴化物、柠檬酸盐、亚硫酸氢盐、氟化物、聚马来酸盐、正椰油烷基肌氨酸盐、亚磷酸盐、次亚磷酸盐、过氟辛酸盐、硅酸盐、山梨酸盐、水杨酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、乙二胺四乙酸盐、亚氨基醋酸盐、肉桂酸盐、硫氰酸盐、精氨酸盐、苯四酸盐、四羧基丁酸盐、安息香酸盐、戊二酸盐、单氟磷酸盐、过氟丙酸盐和它们的混合物。卤化二甲苯和甲酚衍生物，如对-氯-间-甲酚或对-氯-间-二甲苯，并且植物起源的天然杀菌剂(如香料和香草)以及动物和微生物起源的天然抗菌剂也是合适的。优选的抗菌剂有抗菌性表面活性的四元化合物、植物起源和/或动物起源的天然抗菌剂，以及最优选的是至少一个植物起源的抗菌剂，其来自咖啡因、可可碱和茶碱以及香精油如丁子香酚、麝香草酚和香叶醇，和/或至少一个动物起源的抗菌剂，其来自酶如牛奶蛋白、溶菌酶以及乳过氧化物酶和/或至少一个抗菌性表面活性的四元化合物，其包含铵、锍、鏻、碘鎓或砷鎓基、过氧化合物和氯化合物。微生物起源的物质即所谓的“杀菌素”也可以使用。

适合用作抗微生物活性成分的季铵化合物(QAC)具有通式(R1)(R2)(R3)(R4)N+X-，其中R1-R4可以相同或不同，并代表C1-22烷基、C7-28芳烷基或杂环基，其中两个或在芳香化合物如吡啶的情况下甚至是三个基团与氮原子一起形成杂环基，如吡啶鎓或咪唑鎓化合物，以及X-代表卤离子、硫酸根离子、氢氧根离子或类似的阴离子。为了达到最佳抗微生物活性，这些取代基中至少一个优选具有8-18，更优选12-16个碳原子的链长。

QAC可以通过叔胺与烷基化试剂反应得到，所述烷基化试剂如氯代甲烷、苄基氯、硫酸二甲酯、十二烷基溴，以及环氧乙烷。带有一个长烷基链和两个甲基的叔胺的烷基化尤其简单，同样在氯代甲烷的帮助下在温和条件下可以进行含两个长链基团和一个甲基的叔胺的季铵化。含三个长烷基或者羟基取代的烷基的胺缺乏活性，并优选采用硫酸二甲酯来季铵化。

合适的QAC是例如苄烷铵氯化物(N-烷基-N，N-二甲基苄基氯化铵，CAS No.8001-54-5)、Benzalkon B(m，p-二氯苄基二甲基-C12-烷基氯化铵，CAS No.58390-78-6)、苯佐氯铵(苄基-十二基-双-(2-羟乙基)-氯化铵)、十六烷三甲基溴化铵(N-十六烷基-N，N-三甲基溴化铵，CASNo.57-09-0)、苯索氯铵(N，N-二甲基-N-[2-[2-[对-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基]-乙基]-苄基氯化铵，CAS No.121-54-0)、二烷基二甲基氯化铵，如二-正癸基二甲基氯化铵(CAS No.7173-51-5-5)、二癸基二甲基溴化铵(CAS No.2390-68-3)、二辛基二甲基氯化铵、1-十六烷基氯化吡啶鎓(CAS No.123-03-5)和噻唑啉碘化物(CAS No.15764-48-1)以及它们的混合物。尤其优选的QAC是含有C8-18烷基的苄烷氯化铵，特别是C12-14-烷基-苄基-二甲基-氯化铵。

苯扎卤铵和/或取代的苯扎卤铵是商业上可获得的，如来自Lonza的Barquat、来自Mason的Marquat、来自Witco/Sherex的Variquat以及来自Lonza的Hyamine和来自Lonza的Bardac。其他商业上可获得的抗微生物活性成分有N-(3-氯烯丙基)-hexaminium氯化物，如来自Dow的Dowicide和Dowicil，苄索氯铵，如来自Rohm & Haas的Hyamine1622，甲基苯索氯铵，如来自Rohm & Haas的Hyamine10X，十六烷基吡啶鎓氯化物，如来自Merrell Labs的氯化十六烷基吡啶。

该杀菌活性成分的用量在0.0001-1重量％的范围内，优选在0.001-0.8重量％的范围内，更优选在0.005-0.3重量％的范围内，以及最优选在0.01-0.2重量％的范围内。

另外，本发明的洗涤或清洁产品可任选含有紫外吸收剂，所述吸收剂可吸附到经处理的织物上，并增强纤维和/或其他组成成分的光稳定性。紫外吸收剂是有机物质(滤光剂)，它们能吸收紫外线并以长波辐射如热的形式释放吸收的能量。

具有这些所需特性的化合物是例如通过无辐射钝化作用而具有所需特性的化合物以及具有位置2和/或位置4取代基的二苯甲酮的衍生物。此外其他合适的紫外吸收剂是取代的苯并三唑、3-苯基-取代的丙烯酸盐(位置2上任选用氰基取代的肉桂酸衍生物)、水杨酸盐、有机Ni复合物和天然物质，如伞形酮和内生的尿刊酸。联苯基以及主要是1，2-二苯乙烯衍生物具有特别的意义，例如在EP 0728749 A中所述的商业上以TinosorbFD和TinosorbFR ex Ciba可得到的。合适的UV-B吸收剂包括3-苯亚甲基樟脑或3-苯亚甲基降樟脑和它的衍生物，如在EP 0693471 B1中所述的3-(4-甲基苯亚甲基)-樟脑；4-氨基苯甲酸衍生物，优选4-(二甲基氨基)-苯甲酸-2-乙基己基酯、4-(二甲基氨基)-苯甲酸-2-辛基酯和4-(二甲基氨基)-苯甲酸戊基酯；肉桂酸的酯，优选4-甲氧基肉桂酸-2-乙基己基酯、4-甲氧基肉桂酸丙基酯、4-甲氧基肉桂酸异戊基酯、2-氰基-3，3-苯基肉桂酸-2-乙基己基酯(氰双苯丙烯酸辛酯)；水杨酸的酯，优选水杨酸-2-乙基己基酯、水杨酸-4-异丙基苄基酯、水杨酸高薄荷基酯；二苯甲酮的衍生物，优选2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基-4′-甲基二苯甲酮、2，2′-二羟基-4-甲氧基二苯甲酮；亚苄基丙二酸的酯，优选4-甲氧基亚苄基丙二酸二-2-乙基己基酯；三嗪衍生物，如2，4，6-三苯胺-(对-羰基-2′-乙基-1′-己氧基)-1，3，5-三嗪和EP0818450 A1中所述的辛基三嗪酮或者二辛基丁氨基三嗪酮(UvasorbHEB)；丙烷-1，3-二酮如1-(4-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮；如EP 0694521 B1中所述的酮三环(5.2.1.0)癸烷衍生物。其他合适的UV-B吸收剂有2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和碱金属、碱土金属、铵、烷基铵、烷醇铵及其葡糖铵盐；二苯甲酮的磺酸衍生物，优选2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸及其盐；3-苯亚甲基樟脑的磺酸衍生物，如4-(2-氧代-3-亚龙脑基甲基)-苯磺酸和2-甲基-5-(2-氧代-3-亚龙脑基)-磺酸及其盐。

典型的UV-A过滤剂具体有苯甲酰甲烷的衍生物，如1-(4′-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮、4-叔丁基-4′-甲氧基联苯甲酰甲烷(Parsol 1789)、1-苯基-3-(4′-异丙基苯基)-丙烷-1，3-二酮和DE19712033 A1(BASF)中所述的烯胺化合物。UV-A和UV-B过滤剂当然可以混合物的形式利用。除了上面提到的可溶性物质外，不溶的光封闭色素，也就是细分散的优选“毫微化的”金属氧化物或盐也可以用于这种目的。适合的金属氧化物的例子具体有氧化锌、二氧化钛以及铁、锆、硅、镁、铝和铈的氧化物以及它们的混合物。硅酸盐(滑石)、硫酸钡和硬脂酸锌也可作为盐使用。氧化物和盐以色素的形式应用在护肤的乳剂和装饰性化妆品上。颗粒直径平均小于100nm，优选在5-50nm之间，以及更优选在15-30nm之间。它们一般为球形，尽管椭圆或其他非球形颗粒也能用。这些色素也可经表面处理，也就是说亲水性的或疏水性的。典型的例子是包覆的二氧化钛，如Titandioxid T805(Degussa)和EusolexT2000(Merck)。合适的疏水型包覆材料首要是硅氧烷，以及其中尤其是三烷氧基辛硅烷或者二甲硅油。微粉化的氧化锌优选使用。其他合适的UV过滤剂可以在P.Finkel，SFW-Journal 122，第543页(1996)的综述中找到。

UV吸收剂的常用量在0.01-5重量％的范围内，以及优选在0.03-1重量％的范围内。

为了提高洗涤或清洁能力，本发明的组合物包含其他酶，通常可以使用所有现有技术中为此目的所确立的酶。这些酶尤其包括其它蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，半纤维素酶，纤维素酶或氧化还原酶，以及优选为它们的混合物。这些酶一般天然生成；来自于天然分子的变体酶用在改善洗涤和清洁剂中，其相应优选被使用。本发明组合物包含酶，优选以活性蛋白计其总量为1×10^-8至5重量％。

优选其他蛋白酶是枯草杆菌素型酶。例如枯草杆菌素BPN’和Carlsberg，蛋白酶PB92，枯草杆菌素147和309，来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的碱性蛋白酶，枯草杆菌素DY和在狭义上不再归类于枯草杆菌素而归类于Thermitase，归类于枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶K和蛋白酶TW3和TW7的酶。枯草杆菌素Carlsberg能以商标名为Alcalase的形式购得，得自Novazymes A/S，Bagsvaerd，Dnemark公司。枯草杆菌素147和309以商标名Esperase或者Savinase由Navozymes公司销售。以名称BLAP表示的变体衍生自迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)DSM 5483(WO91/02792A1)的蛋白酶，尤其在WO92/21760A1，WO95/23221A1，WO02/088340A2和WO03/038082A2中公开。其他来自不同的杆菌种(Bacillus sp.)和B.gibsonii的可用蛋白酶由前言已经提及的专利申请WO03/054185A1，WO03/056017A2，WO03/055974A2和WO03/054184A1得知。

其他可用的蛋白酶是，例如Novozymes公司的商标名为Durazym^，Relase^，Everlase^，Nafizym，Natalase^，Kannase^和Qvozymes^的蛋白酶，Genencor公司的商标名为Maxapem^，Purafect^，Purafect OxP^和Properase^的蛋白酶，印度Advanced Biochemicals Ltd.公司，Thane的商标名为Protosol^的蛋白酶，中国Wuxi SnyderBiopruducts Ltd.的商标名为Wuxi^的蛋白酶，日本AmanoPharmaceuticals Ltd.公司，Nagoya的商标名为Proleather和Protease P的蛋白酶和日本Kao Corp.公司，Tokyo的商标名为Proteinase K-16的蛋白酶。

本发明可用的淀粉酶的例子是，来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的α-淀粉酶，以及它们用在洗涤和清洁剂中的改进的衍生物。来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的酶可以从Novozymes公司以名称为Termamyl和从Genencor公司以名称为PurastarST购得。

α-淀粉酶的衍生物产品可以从Novozymes公司以商标名Duramyl和Termamylultra，从Genencor公司以商标名PurastarOxAm，从日本Daiwa Seiko Inc.公司，Tokyo以商标名Keistase购得。来自解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的α-淀粉酶由Novozymes公司以名称BAN销售，以及来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶的衍生变体同样由Novozymes公司以名称BSG和Navamyl销售。

另外，对于此目的，强调的是在申请WO02/10356A2中公开的来自杆菌种(Bacillus sp.)A7-7(DSM 12368)的α-淀粉酶和申请WO02/44350A2所述来自B.agaradherens(DSM 9948)的环糊精-葡聚糖转移酶(CGTase)。此外，解淀粉酶也可用，其属于α-淀粉酶序列范围，在申请WO03/002711A2中限定，并且在申请WO03/054177A2中有描述。同样，所述分子的融合产物也可用，例如由申请DE10138753A1所述。

此外，合适的是，购自Novazymes公司的商标名为Fungamyl的α-淀粉酶衍生物来自黑曲霉菌(Aspergillus niger)和米曲霉菌(A.oryzae)。另外的商品为例如Amylase-LT。

尤其由于其切割甘油三酸酯的活性，本发明的组合物可以含有脂肪酶或角质酶，而且，这是为了从合适前体就地产生过酸。这包括例如最初由Humicola lanuginasa(嗜热真菌Thermomyces lanuginosus)可得的或者衍生的脂肪酶，尤其是用氨基酸替换D96L的酶。它们是例如由Novozymes以商标名Lipolase，LipolaseUltra，LipoPrime，Lipozyme和Lipex销售的酶。另外，角质酶也可用，例如最初由Fusarium solani pisi和特异腐质霉H(umicola insolens)分离的酶。同样，可用的脂肪酶可从Amano公司以名称Lipase CE，Lipase P，LipaseB或者Lipase CES，Lipase AKG，Bacillis sp.Lipase，LipaseAP，Lipase M-AP和Lipase AML购得。Genencor公司的脂肪酶或者角质酶也可用，其起始酶最初由门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)和Fusarium solanii分离。最初由Gist-Brocades公司销售的M1 Lipase和Lipomax，以及由日本Meito Sangyo KK公司以名称Lipase MY-30，Lipase OF和Lipase PL销售的酶作为其他重要的商品被提及，此外还有Genencor公司的产品Lumafast。

尤其当其用于处理织物时，本发明的组合物可以含有纤维素酶，根据作为纯酶、酶制剂或混合物形式的目的，可以有利地补充的单独成分。这些能力方面尤其是，对于组合物的初级洗涤能力相互之间能力不同、次级洗涤能力(抗再污渍效果或变灰抑制性)和Avivage(织物效果)的贡献，以及对产生“石洗”效果的贡献。

可用的真菌、富含内葡聚糖酶(EG)的纤维素酶制剂，或者其衍生物由Navozymes公司以商标名Celluzyme提供。同时，从Navozymes公司商购的产品Endolase和Carezyme基于来自H.insolens DSM1800的50kD-EG或者43kD-EG。该公司其他可用的商品是Cellusoft和Renozyme。后者基于申请WO96/29397A1。能力改进的纤维素酶变体例如可由申请WO98/12307A1得知。同样，申请WO97/14804A1所公开的纤维素酶也可用；例如其中公开的来自Melanocarpus的20kD-EG，其从芬兰AB Enzymes公司以商标名Ecostone和Biotouch购得。AB Enzymes公司的其他商品是Econase和Ecopulp。来自杆菌(Bacillus sp.)CBS670.93和CBS669.93的其他合适纤维素酶在WO96/34092A2中公开，其中来自杆菌(Bacillus sp.)CBS670.93的酶从Genencor公司以商标名Puradax购得。Genencor公司的其他商品是“Genencor清洁剂纤维素酶L”和IndiAgeNeutra。

尤其对于特定问题污渍的清除，本发明的组合物含有其他酶，其概括为述语半纤维素酶。其包括甘露聚糖酶、侧链酶(Xanthanlyase)、Pectinlyase(＝果胶酶)、果胶酯酶、Pectatlyase、Xyloglucanase(＝木聚糖酶)、普鲁兰酶和β-葡聚糖酶。合适的甘露聚糖酶是例如从Navozymes公司以名称Gamanase和Pektinex AR，从AB Enzymes公司以名称RohapecB1L，和从美国Diversa Corp.公司，San Diego，CA以名称Pyrolase购得。合适的来自亲碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)的β-葡聚糖酶例如从申请WO99/06573A1得知。从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)得到的β-葡聚糖酶以名称Cereflo从Navozymes公司购得。

为了提高漂白效果，本发明的洗涤和清洁剂可以含有氧化还原酶，例如氧化酶，加氧酶，过氧化氢酶，过氧化物酶，如卤素-、氯-、溴-、木质素-、葡萄糖-或锰-过氧化物酶，二加氧酶或漆酶(酚氧化酶、多酚氧化酶)。Navozymes公司的Denilite1和2可以认为是合适的商品。有利的是，可以加入其他优选有机的，更优选芳族的，与酶相互作用的化合物，目的是增强有关氧化还原酶的活性(增强剂)或者是在氧化酶和污渍之间有很大不同的氧化还原势能中保证有电流(mediator)。

在本发明组合物中使用的酶或者最初源自微生物，如杆菌属(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、土生隐球菌(Humicola)和假单孢菌(Pseudomonas)，和/或根据本身已知的生物技术方法通过微生物生产，如通过杆菌属(Bacillus)或丝状真菌的转基因表达宿主。

通过本身确立的方法，适宜地完成相应酶的纯化，例如通过沉淀、沉降、浓缩、液相过滤、微滤、超滤、与化学物质作用、除臭或这些步骤的适宜组合。

根据本发明的组合物，酶可以添加到任何根据现有技术确立的形式中。这包括例如通过粒化、挤出或冷冻得到的固体制剂，或者尤其在液体或胶状组合物中，有利地尽可能浓缩、干燥和/或掺混稳定剂的酶溶液。

替代地，酶不仅能够以固体形式还能够以液体形式胶囊化，例如通过喷雾干燥或酶溶液与优选为天然聚合物一起共同挤出，或以胶囊形式，例如酶包在凝固的凝胶中或以核壳型，用水保护层、空气保护层和/或不透水的化学物质保护层包裹含有酶的核。在涂覆的层中，还可以涂其他有效物质，如稳定剂、乳化剂、颜料、漂白剂或染色剂。这种胶囊用已知方法涂覆，例如通过振动粒化或滚动粒化或在流化床过程。有利地，例如通过聚合物成膜剂涂覆，这样的颗粒是无尘的并且由于外壳而存储稳定。

另外，两种或多种酶共同包装，从而单独颗粒具有多种酶活性。

包含在本发明组合物中的蛋白和/或酶尤其可以在储存过程中免受损害，例如由于物理影响、氧化或水解切割而失活、变性或分解。在以微生物制备蛋白和/或酶的情形下，抑制水解尤其优选，特别是当组合物含有蛋白酶时。优选本发明的组合物含有针对目的的稳定剂。

一组稳定剂是可逆的蛋白酶抑制剂。常用的有苯甲脒-氢氯化物、硼砂、亚硼酸、硼酸或其盐或酯，其中优选是有芳族基团的衍生物，邻位-、间位-或对位-取代的苯基硼酸，特别是4-甲酰苯基-硼酸，或者所述化合物的盐或酯。为此目的，还使用肽醛，也就是具有还原C末端的寡肽，特别是那些由2-50个单体组成的肽醛。另外，肽的可逆性蛋白酶抑制剂尤其包括卵类粘蛋白和Leupeptin。针对蛋白酶枯草杆菌素的特异性可逆的肽抑制剂以及蛋白酶和特异性肽抑制剂的融合蛋白质也适合于此。

其他酶的稳定剂有氨基醇，如单-、二-、三-乙醇-和-丙醇胺和它们的混合物，最多达C₁₂的脂族羧酸，如琥珀酸，其他二羧酸或上述酸的盐。封端的脂肪酸酰胺烷氧酸盐也适合于此目的。如WO 97/18287中所公开，某些用作助洗剂的有机酸额外能够稳定存在的酶。

除了多元醇如甘油、乙二醇、丙二醇或山梨醇以外，低级脂族醇也是其他常用的酶稳定剂。二磷酸甘油也保护其免受物理影响而变性。同样，可以使用钙盐和/或镁盐，例如乙酸钙或甲酸钙。

聚酰胺寡聚物或者聚合物，例如木质素，水溶性乙烯基共聚物或者纤维素乙醚、丙烯酸聚合物和/或聚酰胺可对酶制剂产生稳定作用，以克服物理影响或者pH值的变化。包含了聚胺-N-氧化物的聚合物同时担当酶稳定剂和染料转移抑制剂。其它聚合物稳定剂是直链C_8-18聚氧化烯。烷基聚糖苷可稳定本发明产品中的酶成分，甚至提高它们的功效。交联的含氮化合物担当着污渍释放剂和酶稳定剂的双重作用。疏水性非离子聚合物尤其对必要时所含的纤维素酶有稳定的作用。

还原剂和抗氧化剂将增加酶对氧化分解的稳定性；这里常见的是例如含硫的还原剂。其它的例子是亚硫酸钠和还原糖类。

特别优选采用稳定剂的组合，例如多元醇、硼酸和/或硼砂的组合，硼酸或硼酸盐、还原盐与丁二酸或其它二羧酸的组合，或者硼酸或硼酸盐与多元醇或多氨基化合物的组合以及与还原盐的组合。肽/乙醛稳定剂的效果可通过与硼酸和/或硼酸衍生物和多元醇的组合来增强，其还可通过添加二价阳离子，如钙离子而带来额外效果。

因为本发明的组合物可以任何可想到的形式提供，所以在适于加至各自组合物中的本发明酶或蛋白，均是本发明的实施方案。其例子包括液体制剂、固体颗粒或胶囊。

胶囊化形式是保护酶或其它成分免遭其它组分例如漂白剂的影响，或者使缓释成为可能的途径。胶囊按照大小可以划分为毫胶囊、微胶囊或者纳米胶囊，其中对于酶来说尤其优选微胶囊。例如，这样的胶囊在专利申请WO 97/24177和DE 19918267中公开。另一可能的胶囊化方法是从蛋白质溶液与淀粉或淀粉衍生物的溶液或悬浮液的混合物开始，将蛋白质包封在该物质中。申请WO 01/38471描述了这样一种胶囊化方法。

在固体产品的情况下，该蛋白质可以以例如干燥的、造粒的和/或胶囊化的形式使用。它们可以单独即作为单相添加，或者与其它组分一起在同相中以压实或未压实形式添加。如果微胶囊化的酶以固态形式生产，则可按照现有技术已知的方法从污迹获得的水溶液中除去水，例如喷雾干燥、离心去除或者再溶解。以这种方式获得的颗粒大小通常为50-200μm。

可以从按照现有技术进行的蛋白质回收和制备开始将酶和本发明必需的蛋白质以浓缩的水或非水溶液、悬浮液或乳液加入本发明的液体、凝胶状或膏状产品中，同样也可以以凝胶状或胶囊化或作为干燥粉末加入。本发明的这种洗涤产品或者清洗产品一般通过简单混合成分来制备，所述成分以固体物质本身或作为溶液加入自动搅拌器中。

除基本洗涤性能外，在洗涤产品中包含的蛋白酶还可以满足通过蛋白酶解裂解活化其它酶组分或者在相应的作用时间之后使其失活的功能，例如在申请WO 94/29426或EP 747 471中所公开的。通过本发明的蛋白也可以获得可比的调节功能。此外，本发明的另一实施方案涉及那些含有由蛋白酶敏感材料制成的胶囊的产品，其例如在预期的时间点被本发明蛋白质水解并释放出其内容物。在其它多相产品的情况下也可以获得可比的效果。

另外一个实施方案是用于处理纺织原料或者织物保养的组合物，其包含本发明的碱性蛋白酶。

另外一个实施方案是用于处理纤维或含有天然组分的织物和特别是含有羊毛或丝的织物的组合物。

特别是天然纤维例如羊毛或丝的特征为其独特的微观表面结构。正如R.Breier在其文章“Melliand Textilberichte”1.4.2000(第263页)中用羊毛的实例所说明的，所述表面结构能长期导致不希望的效果，例如一些纠结。为了避免这种效果，使用本发明的组合物处理这些天然原材料，这将有助于使基于蛋白质结构的鱼鳞状表面结构光滑并因此防止纠结。

在本发明的优选实施方案中，含有本发明蛋白酶的组合物被这样设计，即其一般可以作为保养剂使用，例如通过在洗涤过程中加入，在洗涤之后使用或者其应用不依赖于洗涤。所需的效果是长时间获得光滑的织物表面结构和/或预防和/或减少对织物的损坏。

本发明的一个单独主题是机械清洁织物或硬表面的方法，在洗涤方法的至少一个步骤中使上述本发明的碱性蛋白酶活化。

其中，这种方法优选的是，本发明的碱性蛋白酶每次的用量为40μg至4g，优选50μg至3g，更优选100μg至2g，以及最优选200μg至1g。所有介于这些数值之间的整数的和非整数的值都包括在内。

这些方法包括手工和机械方法，优选机械方法，因为它们可对例如用量和作用时间更精确加以控制。

织物清洗的方法的特征通常在于若干个方法步骤，所述步骤包括将各种不同的具有清洁活性的物质施用到待清洗物上，并且在作用时间之后漂洗，或者以其它的方式将该待清洗物用清洁剂或该清洁剂的溶液处理。这同样适合于除织物之外的其他所有材料，这些材料被概括为术语硬表面。这种方法可以在所有可想到的洗涤或清洁方法中的至少一个洗涤步骤中加入本发明的蛋白质，并且这些方法成为本发明的实施方案。

因为本发明优选的酶已经自然具有溶解蛋白质的活性，并且它们也可以在本来不具有清洗力的介质(例如单纯的缓冲液)中显示所述活性，所以这种机械清洗织物的方法中的单个分步骤可由在所需的情况下除稳定的化合物、盐或缓冲物质外加入本发明的酶作为唯一具有清洗活性的组分所组成。这是本发明特别优选的实施方案。

在这种方法的进一步优选的实施方案中，本发明的相关碱性蛋白酶提供在本发明产品，尤其是本发明的洗涤或清洁产品的上述一种配方中。

本发明主题的优选实施方案是处理纺织原料或用于纺织品保养的方法，在至少一个方法步骤中，使本发明的碱性蛋白酶活化。

在此，方法优选用于纺织原料，纤维或含有天然组分的纺织品，更优选用于那些含有羊毛或丝的纺织品。

由此，方法是指例如为在纺织品中处理的材料做准备，如抗毛毡上浆，或者方法是指丰富了有关护理成分的穿着用纺织品的洗涤。由于上述蛋白酶在天然含蛋白原料上的效果，在优选实施方案中，其是指用于处理纺织原料、纤维或含有天然成分的纺织品，尤其是含有羊毛或丝的纺织品的方法。

本发明的单独主题是上述本发明的碱性蛋白酶用于清洁纺织品或硬表面。

上述浓度范围优选适用于此用途。

根据上述性质和上述方法，本发明的蛋白酶尤其能够应用于从纺织品或从硬表面除去含蛋白的污渍。实施方案是例如由从纺织品或硬表面上手洗或手工去除斑点或者与机械方法相结合的用途。

在用途的优选实施方案中，相关的本发明的碱性蛋白酶提供在本发明产品，尤其是洗涤或清洁产品的上述一种配方范围中。

正如已知，洗涤或清洁剂的蛋白成分由于蛋白酶的影响而失活。本发明的主题涉及使用这种本来不希望的作用。如上所述，通过蛋白水解同样可以首先使其它的组分活化，例如当所述组分是一种由真正的酶和其相应的抑制剂组成的杂合蛋白质时，如在申请WO00/01831A2中所公开。这种调节的另一实例是其中的活性组分已包封在一种易受蛋白水解攻击的材料中以保护或控制其活性。因此本发明的蛋白质可用于钝化、活化或释放反应，尤其在多相产品中。

根据以上说法，下列用途也是本发明的实施方式：

-本发明蛋白酶在纺织品生产中用于制备或处理原料或中间产物，尤其用于从织物上清除保护层的用途；

-本发明蛋白酶用于纺织品原料处理或纺织品护理的用途，其中优选

-对纺织原料、纤维或含有天然成分的纺织品，尤其是含有羊毛或丝的纺织品的相应用途。

含本发明碱性蛋白酶的组合物的形式，其是指化妆品而实现本发明。这里，可以理解为用于人类皮肤或毛发的所有清洁和护理组合物，尤其是清洁组合物。

因为蛋白酶在人类皮肤的细胞再生(脱落)过程中扮演重要的角色(T.Egelrud等，Acta Derm.Venerol.，第71卷(1991)，第471至474页)，因此蛋白酶也作为生物活性组分被用于护肤产品中以便促进干性皮肤中日益增多的桥粒结构的退化。例如在WO97/07770A1所述，在位置R99G/A/S，S154D/E和/或L211D/E中氨基酸替换的枯草杆菌素蛋白酶用于化妆目的。根据上述说法，本发明的蛋白酶能够通过相应的点突变而衍生。因此，本发明的蛋白酶，特别是那些例如在突变后或由于添加合适的与其相互作用的物质来控制其活性的蛋白酶同样适合在皮肤或头发洗涤或氧护产品中作为活性组分。特别优选这些酶的制品，其如上所述，例如通过连接在大分子载体上而被稳定(参照US 5230891)和/或通过在高变应原性位置的点突变而被衍生化，所以它们与人皮肤的相容性增加。

因此，本发明的主题还包括这种蛋白水解酶用于化妆目的，特别是在相应组合物中的应用，例如香波、皂或洗浴液，或者在以霜的形式提供的护理产品中的应用，相应地化妆用清洁和护理方法。同样在去皮药物或其组合物中的应用也包括在本发明的权利要求中。

除了用在洗涤和清洁组合物和化妆品中，现有技术中确立了蛋白酶的很多应用可能性，特别是枯草杆菌蛋白酶。H.Uhlig，“工业用酶及其应用(Industrial enzymes and their applications)”，Wiley，纽约，1998提供了一个概述。所有这些技术都可以引入到本发明的碱性蛋白酶中。已经表明，通过应用本发明蛋白酶，它们可以被衍生，因此，它们包括在本发明保护范围中。尤其包括以下的使用范围：

-本发明碱性蛋白酶在生化分析或低分子量化合物的合成或蛋白的合成上的用途；

-其中优选的是，在肽序列分析范围内确定末端的用途；

-本发明的碱性蛋白酶在制备、纯化或合成天然物质或生物有价值物质上的用途，优选在相应组合物或方法范围内；

-本发明的碱性蛋白酶在蛋白合成或其他低分子量化合物合成上的用途；

-本发明的碱性蛋白酶在天然原料处理，优选是表面处理，最优选在皮革处理方法中的用途，尤其在相应的组合物或方法范围内；

-本发明的碱性蛋白酶在处理照片胶片，尤其在清除含胶质的或类似的保护层上的用途；和

-本发明的碱性蛋白酶在食品制造和饲料制造上的用途。

一般而言，本申请包括每一个技术领域，其通过由此提出的新型碱性蛋白酶或者在此建立的方法或者用途得以扩展。

以下实施例解释而非限制本发明。

实施例

所有分子生物学操作步骤遵循如下列手册所述的标准方法，Fritsch，Sambrook和Maniatis，“分子克隆：实验室手册”，Cold SpringHarbour Laboratory Press，New York，1989，或者可比较的相关著作。根据各个生产商的说明书使用酶和试剂盒。

实施例1

从土壤环境获取细胞材料

从德国的不同地区获取土壤试样，置于水中，静置30分钟使悬浮物沉淀。用HSP10-固体培养基(0.1g酵母提取物，来自Difco，Heidelberg；0.1g酪蛋白胨，胰蛋白酶消化，Difco；0.1g溶解淀粉(Merck，Order-No.1.01251)；2g Na₂CO₃，余量1000ml蒸馏水；pH 10)将上清液铺在5％的琼脂平板上，在30℃培养约2周。可以从琼脂表面以机械方式获取菌苔。

实施例2

表达基因库的设立

选择的表达系统是在大肠杆菌(Escherichia coli)DH12S中的载体pUC18(Genbank，Natinal Institute of Health，Bethesda，MD，USA；获取号L08752；图3)。这种载体携带通过加入IPTG而诱导的lac-操纵子的β-半乳糖苷酶启动子，从而可以实现在细胞中可控表达整合在多克隆位置的DNA。菌株DH12S是合适的，由于其laclq-基因型而适合于IPTG诱导，并优选适合于蛋白酶活性筛选，因为其具有足够小的内源蛋白水解活性。初步的研究表明，E.Coli JM109满足同样的要求。

根据实施例1从试样获得DNA的操作可以按照Zhou等人(1996)，Appl.Environ.Microbiol.，62卷，316-322页实施。这种纯化的后基因组DNA(见下文)使用限制性内切酶Alu I进行制备性部分限制性切割以制备大小为2至10kb的片段。

首先，通过记录酶动力学而确定最佳的限制酶温育时间。对此，2.8μg的DNA制备物在由Alu I的生产商(New England Biolabs公司，Schwalbach，德国；目录号R0137S)提供的合适的反应缓冲液中在37℃温育。通过每μgDNA加入0.2U Alu I，以21μl的总体积开始反应，之后每两分钟时间间隔从反应物中取出1.5μl，通过向其中每次都立即加入10mM Tris/HCl，pH7.0；20％甘油；0.1％SDS，冷却至0℃而终止反应。随后通过在0.7％的琼脂糖凝胶上进行分析，可以确定部分消化的最佳限制性酶切时间。为了获得片段的尺寸范围为2至10kb，用于分离实施例1的DNA为约6至7分钟。

因此，在30个平行批量中进行预备性部分消化。在反应适当停止后，在制备性的0.7％琼脂糖凝胶上电泳分离上述批量，切下含有2至10kb大小DNA的凝胶区域，借助电洗脱在透析管中在4℃进行分离。最后，用1/10体积的3M乙酸钠和2.5倍体积的乙醇沉淀DNA，并吸收在足够的体积中。重复进行凝胶电泳、电穿孔和沉淀，用于可能存在的更小DNA-片段的分离。

440ng所得片段化的后基因组DNA，通过向1×连接酶缓冲液中加入400NEB-单位的T4-DNA-连接酶，在总体积15μl中与150ng载体pUC18于16℃过夜连接。该载体提前用Sma I线性化，并用来自小牛胸腺的碱性磷酸酶脱磷酸化。

通过电转化，实施E.coli DH12S-细胞(Gibco Life Technologies公司，Karlsruhe，目录号18312017)的转化。对此，1μl连接批量和25μl细胞混合，在电穿孔试管中在冰上温育1分钟，并在电穿孔器(BTXECM630，Genetronics Inc.公司，San Diego，USA)中按照生产商的说明操作。在立即转移到1ml SOC-培养基(2％Bacto-Tryptone；0.5％酵母提取物；10mM的NaCl；2.5mM的KCl；pH7.0，用NaOH调节；高温灭菌；补充10mM的MgSO₄和MgCl₂以及20mM的D(+)葡萄糖)之后，紧接着是在37℃的1h的回收阶段，并且如实施例1所述，用HSP10-固体培养基平铺在琼脂平板上。

实施例3

蛋白水解活性的筛选

为了测试实施例2所制备的E.Coli DH12S中基因库的品质，在测试平板中通过蓝/白-筛选而确定全部所得原代转化子中的数目和携带插入片段的克隆的数目。为此，1和10μl各转化批量被涂布到含有LB培养基(每升10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，1ml 1NNaOH)的5％琼脂平板上，该培养基被另外用100μg/ml氨苄青霉素，0.2mM(或4μg/ml)IPTG和0.2mM(或1μg/ml)X-Gal处理，并在37℃温育过夜。从10个白色菌落，其是转化子，通过微量沉淀方法(来自Qiagen的试剂盒，Hilden，Germany)分离质粒，使用限制性内切酶Sac I和Hind III进行限制性酶切以切出插入片段(参见图3)，该片段在0.7％琼脂糖凝胶上分离。事实上，所有的载体含有的插入片段大小约2到10kb。

在14cm直径的5％琼脂平板上进行根据实施例2获得的基因库的筛选，该平板使用LB培养基氨苄青霉素/IPTG/X-Gal(见上文)以及另外2％脱脂奶粉(脱脂奶粉，Difco，Order No.232100)。在这10个筛选琼脂平板上，对应于转化批量的库体积的滴度，分别通过玻璃珠方法均匀涂布到大约10 000cfu(初次涂布)。

在37℃温育16小时后，平板在28℃温育直至两周。在此期间，形成蛋白酶的菌落通过在混浊的基质中形成透明的晕圈而显示它们自己。用于检测未外泌的蛋白水解酶的单独的细胞溶解不是必要的。通过新鲜分离初次菌落和随后通过分离有关的含有插入片段的pUC 18载体，重新转化和新鲜筛选(如上；第二次涂布)而证实质粒介导的蛋白酶形成。此后的转化子同样地显示对脱脂牛奶培养基的晕圈形成，并因此证实在所有情况下蛋白酶基因定位在克隆的DNA片段中。

实施例4

蛋白酶解活性的克隆的序列分析(HP 70Pa_2)

从根据实施例3获得的名称HP 70Pa_2的蛋白酶阳性的克隆中，根据标准方法分离出质粒DNA，通过Sac I/Hind III消化(参见上文)制备插入片段，并根据标准方法测序。这里，首先使用根据SEQ ID NO.1和2名称为M13f和M13r的对于载体和插入片段两侧特异性的引物，随后“引物行走”，如现有技术中(R.J.Kaiser等.(1989)：“Specificprimer-directed DNA sequencing using automated fluorescence detection”；Nucl.Acids Res.，17(15)，pp.6087-6102)已知的。

这种克隆的测序提供具有开放阅读框的区域，其DNA序列表示为SEQ ID NO.3。由于其来源，其被表示成“未知的”生物体，并且另外表示这种序列归于DNA分离物。此外，由于目前的数据(尤其是通过序列比较，见下文)，必需假定核苷酸位置1到96编码信号肽和全部编码区从1到延伸1746。SEQ ID NO.4公开了由此导出的氨基酸序列，数据来源相同。

作为描述的最相似的酶，发现了来自野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris)(ATCC 33913)的细胞外丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.-)，其在GenBank(National Center for BiotechnologyInformation NCBI，National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)获取号为NP 636242。通过计算机程序Vector NTI Suite 7.0，可从InforMax，Inc，Bethesda，USA获得，以指定的缺省参数测定氨基酸水平的同源性对HP 70为75.0％同一性。在本检索中发现的另外的蛋白质，其在氨基酸水平仍然显得最相似，被归纳在以下的表1中。

表1：在氨基酸水平发现的对HP70最相似的序列

获取号	描述	同一性[％]
			NP_636242	来自野油菜黄单胞菌株ATCC 33913的细胞外蛋白酶	75.0
NP_641280	来自Xanthomonas axonopodis pv.citri株306的细胞外蛋白酶	73.5
			NP_641281	来自Xanthomonas axonopodis pv.citri株306的细胞外蛋白酶	60.8
NP_641282	来自Xanthomonas axonopodis pv.citri株306的细胞外蛋白酶	60.8
			NP_636245	来自野油菜黄单胞菌株ATCC 33913的细胞外蛋白酶	59.2

在DNA水平，74.4％的同一性产生来自野油菜黄单胞菌(基因ID XCC0851)的细胞外丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.-)。

因此发现的蛋白酶最有可能同样是丝氨酸蛋白酶。对建立的迟缓芽孢杆菌(B.lentus)碱性蛋白酶(WO 92/21760A1)在氨基酸水平产生26.2％的同源性以及在核酸水平33.6％的同一性。

名称70-pUC(AWB 403)的相关载体于2003年10月2日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124Brunswick(http://www.dsmz.de)，保藏号DSM 15977。其编码的蛋白酶命名为HP 70。

实施例5

蛋白酶解活性的克隆(HP 53Pa_2)的序列分析

从根据实施例3获得的名称HP 53Pa_2的另外的蛋白酶阳性克隆制备插入片段并且在实施例4测序。获得的序列显示为SEQ ID NO.6和7。由于其来源，其被表示成“未知的”生物体，并另外表明这些序列归于DNA分离物。此外，由于目前的数据(尤其是通过序列比较，见下文)，必需假定核苷酸位置1到114编码信号肽和全部编码区从1到延伸1761。

这也是一种枯草杆菌素蛋白酶，在氨基酸水平对来自野油菜黄单胞菌(ATCC 33913；见上文)的细胞外丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.-)具有75.4％的同源性，也测定为最相似。在本检索中发现的另外的蛋白质，其在氨基酸水平仍然显得最相似，被归纳在以下的表2中。

表2：在氨基酸水平对HP53发现的最相似的序列

获取号	描述	同一性[％]
			NP_636242	来自野油菜黄单胞菌株ATCC 33913的细胞外蛋白酶	75.4
NP_641280	来自Xanthomonas axonopodis pv.citri株306的细胞外蛋白酶	72.6
			NP_641281	来自Xanthomonas axonopodis pv.citri株306的细胞外蛋白酶	59.3
NP_641282	来自Xanthomonas axonopodis pv.citri株306的细胞外蛋白酶	59.8
			NP_636245	来自野油菜黄单胞菌株ATCC 33913的细胞外蛋白酶	59.0

在DNA水平，产生对来自野油菜黄单胞菌的细胞外丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.-)基因75.0％的同一性。

在所述氨基酸水平，对建立的B.lentus碱性蛋白酶(WO92/21760A1)产生25.9％的同源性和在核酸水平产生33.5％的同一性。

名称53-pUC(AWB 403)的相关载体于2003年10月2日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg lb，38124Brunswick(http://www.dsmz.de)，保藏号DSM 15976。其编码的蛋白酶命名为HP 53。

实施例6

HP 70和HP 53C-末端缺失突变体的生产

HP 70dc

从实施例3获得和实施例4描述的名称为HP70Pa_2的克隆得到的蛋白酶，在C’-末端缺失332bp。该氨基酸序列HP70_deltaC显示在SEQ ID NO.5。由于其构建，其被表示为合成的序列，具体为“DNA分离物，Delta C”。根据SEQ ID NO.3和4，位置1到32的部分也被认为是信号肽。

为此，使用寡核苷酸HP 70f(SEQ ID NO.10)和HP 70r(SEQ ID NO.11)作为引物在下标准PCR条件下从SEQ ID NO.3的DNA产生1413bp大小的DNA片段。在以核酸内切酶EcoRI和BamHI处理获得的片段后，所述片段被克隆进入E.coli表达载体pUC18对应的切割位点并在合适的株系(例如E.coli DH12S)中转化。从获得的转化体，通过蓝/白筛选能够鉴定所需的候选者，活性表达，并因此获得足够的量用于进一步的研究。

HP53dc

从根据实施例3获得和实施例5描述的名称为HP53Pa_2的克隆得到蛋白酶，在C’-末端缺失330bp。氨基酸序列HP53_deltaC显示为SEQ ID NO.8。

为此，使用寡核苷酸HP 53f(SEQ ID NO.12)和HP 53r(SEQ ID NO.13)作为引物在下标准PCR条件下从SEQ ID NO.6的DNA产生1303bp大小的DNA片段。在以核酸内切酶BlpI和BamHI处理获得的片段后，所述片段被克隆进入本实施例的第一部分中获得的E.coli表达载体pUC18_HP70_dc对应的切割位点，该载体预先用相同的内切酶处理过。

在合适的株系(例如E.coli DH 12S)中转化后，能够使用SacII(pUC_HP53_dc含有这种切割位点)，通过限制性内切酶分析，从获得的转化体鉴定所需的候选者，活性表达并因此获得合适的量而用于进一步的研究。

由于这种构建，如在SEQ ID NO.5的情况一样，在SEQ ID NO.8表示其为合成的序列，具体为“DNA分离物，Delta C”。此外根据SEQ ID NO.5的位置1到32的部分被引入此处，使得其被认为是HP 70的信号肽。

实施例7

根据本发明定量获得蛋白水解酶以及它们的生物化学特性

根据实施例3到6获得的表达克隆被吸收在100ml LB培养基(10g/l胰蛋白胨，5g/l，酵母提取物，10g/l NaCl)中，在37℃在500mlErlenmeyer烧瓶中以200rpm震荡培养。

随后，确定它们的生化特性。此处，通过“MTP分析”测定酶水解活性，该分析基于荧光偶联的酪蛋白底物(BODIPY^FL Conjugate，Molecular Probes，Gttingen，Germany；订货号#6638)，荧光团(发射物)和淬灭剂(淬灭物)与之偶联。在完整的底物中，发射物的荧光被淬灭物抑制。在水解酪蛋白时，以基团与它们偶联的寡肽彼此分开，在发生对应的激发荧光发射时，从而其强度为蛋白质水解的量度。

为了测定活性，在所有情况下根据实施例5的5μl蛋白酶样品在具有所需pH和4.5μg/ml BODIPY^FL Conjugate I的100mMTris/HCl以总体积100μl在所需的温度温育1h。下面的所有测量在96-孔微量滴定板(Opaque^Plates，black；Corning BV Life Sciences，Schiphol-Rijk，Netherlands；Order No.#3915)中借助FLUOstar^荧光测量装置(BMG Lab Technologies，Offenburg，Germany)进行。

最适pH和最适温度

对于SEQ ID NO.7显示的蛋白酶HP53，有以下的生化参数：37℃下的最适pH为8.6，而pH8.6时的最适温度为37℃。

络合剂的影响

通过添加1mM EDTA在pH 8.6在上述分析即在37℃和50℃研究络合剂的影响。没有添加EDTA的测定值被定为100％。比较起来，在50℃的相对的蛋白水解活性为27％，而在37℃是10％。

稳定性测量

为了测量稳定性，使用的蛋白酶样品首先在50℃在50mM NaHCO₃缓冲液，pH 10.9中预温育15min，然后在所有情况下在上述分析中在37℃和50℃，在pH 8.6测量残余活性。这里，没有预温育然而进行相同处理的同样提取物在所有情况下定在100％。以这种方法，对于37℃测得11％的残余活性，50℃测得13％的残余活性。

由此可见这些是对高pH相对稳定的分子，而且几乎与温度无关。

实施例8

根据本发明的蛋白酶HP 70对在相对低温洗涤性能的贡献

对于这个实施例，使用配有污渍的标准织物，其已经从Eidgenssische Material-Prüfungs-und-Versuchsanstalt，St.Gallen，Switzerland(EMPA)订货。在该情况下，使用以下污渍物和织物：A(血液/乳汁/绘图墨水在棉织品上)，B(血液/乳汁/绘图墨水在聚酯-棉混纺织物)和C(蛋/煤烟在棉织品上)。

使用这个试验材料，通过launderometrically研究不同去污剂配方的洗涤性能。为此，在所有情况下设定液比1∶12并在40℃温度下进行洗涤30min。每升洗涤液各个组合物的剂量是5.9g。所述水的硬度是16°德国硬度。

使用的对照去污剂是以下组成的去污剂基本配方(所有数据基于重量百分比)：4％直链烷基苯磺酸(钠盐)，4％C12-C18-脂肪醇硫酸盐(钠盐)，5.5％C12-C18-脂肪醇，具有7EO，1％钠皂，11％碳酸钠，2.5％非晶体二硅酸钠，20％过硼酸钠四水合物，5.5％TAED，25％沸石A，4.5％聚羧酸酯，0.5％膦酸，2.5％泡沫抑制颗粒，5％硫酸钠，剩余物：水，光学增亮剂，盐。

在所有情况下平行处理活性相同的本发明蛋白酶和对照组蛋白酶。对于对照组，使用B.lentus碱性蛋白酶F49(WO 95/23221 A1；厂商：Biozym，Kundl，Austria)。这具有(根据说明书所述方法可以测定)比活性大约200000PE/g，其中每100g F49浓度为0.2％重量的组合物大约40000PE，每升洗涤液得到活性大约2400PE。制剂被另外制备，其被配有对应量的盐，在所有情况下包含0.5％，亦即蛋白酶量的2.5倍。本发明的所述蛋白酶以相同的活性浓度被添加到相同的基本制剂。在这方面，重量％值表明对于下表中的F49是正确的并且经过近似比较而适用于HP 70。

在洗涤后，洗涤的织物的白度与已经标准化至100％的硫酸钡的白度相比而测量。所述测量在Datacolor SF 500-2分光计上在460nm(UV陷波器3)，30mm光阑，无光泽，光类型D65，10°，d/8°进行。获得的结果被收集作为反射百分数，亦即作为与硫酸钡连同以下表3的各个初始值相比的百分比。在所有情况下从三个测量表明平均值。允许立即对使用的组合物中存在的酶对洗涤性能的贡献作出结论。

表3：根据本发明的蛋白酶HP 70对在40℃下洗涤性能的贡献

基本去污剂，含有：	A	B	C
				初始值	14.1	12.8	28.9
没有蛋白酶的对照	18.9	16.0	51.3
				0.2％HP70	26.7	26.5	68.3
0.2％B.lentus碱性蛋白酶F49	25.7	25.6	68.1
				0.5％HP70	33.4	29.8	68.4
0.5％B.lentus碱性蛋白酶F49	30.0	32.2	70.2
				标准差	1.3	1.3	1.8

全部三个测量系列验证本发明的蛋白酶HP 70与无蛋白酶的去污剂相比提供对含蛋白质污渍的洗涤性能的提高。亦即，其还显示在有变性剂例如表面活性剂参与情况下的蛋白水解活性。对于B.lentus碱性蛋白酶F49测定的值，通过点突变(参见WO 95/23221A1)对于这个应用而优化的分子验证了试验方法的正确性。在测量系列A中和在测量系列B的更低浓度下，HP 70超过F49；另一个值与F49的值相当。

实施例9

本发明的蛋白酶HP 53对在相对低温洗涤性能的贡献

使用本发明的蛋白酶HP 53重复前述的测试。所述条件相同。然而，对污渍D测定性能而不是对污渍C(棉织品上的血液)。结果归纳在下面的表4。

表4：本发明的蛋白酶HP 53对在40℃下洗涤性能的贡献

基本去污剂，含有：	A	B	D
				初始值	13.5	13.9	18.8
无蛋白酶的对照	20.1	18.7	67.3
				0.2％HP53	48.1	60.7	73.7
0.2％B.lentus碱性蛋白酶F49	25.5	27.9	69.7
				0.5％HP53	42.9	53.5	69.0
0.5％B.lentus碱性蛋白酶F49	32.6	41.1	73.8
				标准差	4.5	1.7	2.4

这些测量系列验证本发明的蛋白酶HP 53与无蛋白酶的去污剂相比还提供对含蛋白质污渍的洗涤性能的提高。亦即，其还显示在有变性剂例如表面活性剂或漂白剂参与情况下的蛋白水解活性。测定的值对B.lentus碱性蛋白酶F49至少是相当的，在测量系列A和B中甚至更明显的优势。

实施例10

本发明的蛋白酶HP 53dc对在相对低温洗涤性能的贡献

如先前两个实施例，还研究变体HP 53dc对于污渍A，B和C的性能贡献。所述条件再次相同。结果归纳在下面的表5。

表5：本发明的蛋白酶HP 53dc对在40℃下洗涤性能的贡献

基本去污剂，含有	A	B	C
				初始值	14.6	13.2	28.1
没有蛋白酶的对照	19.6	16.2	54.0
				0.2％HP53dc	42.8	41.2	71.2
0.2％B.lentus碱性蛋白酶F49	26.8	31.2	70.0
				0.5％HP53dc	48.6	50.0	70.8
0.5％B.lentus碱性蛋白酶F49	29.8	40.7	70.9
				标准差	1.6	1.9	2.5

这些测量系列验证本发明的蛋白酶HP53dc与无蛋白酶的去污剂相比还提供对含蛋白质污渍的洗涤性能的提高。亦即，其还显示在有变性剂例如表面活性剂或漂白剂参与情况下的蛋白水解活性。在测量系列A和B中测定的值明显优于B.lentus碱性蛋白酶F49，在系列C至少是相当的。

实施例11

本发明的蛋白酶HP53dc对在相对高温洗涤性能的贡献

以HP 53对两种污渍A和B在洗涤温度60℃其它条件都相同重复先前的测试。结果归纳在下面的表6。

表6：本发明的蛋白酶HP53dc对在60℃下洗涤性能的贡献

基本去污剂，含有	A	B
			初始值	14.6	13.2
没有蛋白酶的对照	20.5	16.7
			0.2％HP53dc	36.3	36.9
0.2％B.Lentus碱性蛋白酶F49	25.6	32.4
			0.5％HP53dc	47.7	48.0
0.5％B.lentus碱性蛋白酶F49	31.4	43.5
			标准差	1.7	1.3

即使在60℃，测量系列A和B中观察到本发明的蛋白酶HP53dc优于B.lentus碱性蛋白酶F49。幸运的是，本发明的蛋白酶HP53dc在60℃没有明显变性，使得其特别适合用作去污剂蛋白酶。

附图说明：

图1：本发明碱性蛋白酶HP70和HP53(SEQ ID NO.4和7)与现有技术碱性蛋白酶的比对。

该图中：

HP70：本发明SEQ ID NO.4的碱性蛋白酶；

HP53：本发明SEQ ID NO.7的碱性蛋白酶；

SP：源自野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris)的细胞外丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.-)(ATCC 33913)(基因库获取号No.NP_636242)

BLAP：来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)DSM 5483的碱性蛋白酶(WO92/21760A1)

图2：本发明碱性蛋白酶HP70和HP53(SEQ ID NO.3和6)的基因与现有技术碱性蛋白酶的基因比对。

其中：

HP70：本发明SEQ ID NO.3的碱性蛋白酶的基因；

HP53：本发明SEQ ID NO.6的碱性蛋白酶的基因；

SP：源自野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris)的细胞外丝氨酸蛋白酶的基因(E.C.3.4.21.-)(ATCC 33913)(基因库获取号No.NP 636242)

BLAP：来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)DSM 5483的碱性蛋白酶的基因(WO92/21760A1)

图3：用于构建根据实施例2的表达基因库的质粒载体pUC18的示意图。

该载体用Sma I线性化以构建以Alu I消化的后基因组DNA。

其中：

ORI：复制起点

Plac：lac-启动子

LacZ-α：β-半乳糖苷酶的α-肽的基因

amp^R：氨苄青霉素抗性介导的β-内酰胺酶

图4：两种本发明碱性蛋白酶HP70(SEQ ID NO.4)和HP53(SEQID NO.7)的比对用以开发SEQ ID NO.9的共同序列。

其中，以变量X表示的氨基酸位置可以表示在HP70或者HP53上。

                       序列表

                       序列表

<110>汉高两合股份公司Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien

<120>新型碱性蛋白酶以及含有该新型碱性蛋白酶的洗涤剂和清洁剂

     (Novel alkaline proteases and detergents and

     cleaners comprising these novel alkaline

     proteases)

<130>SCT062468-47

<140>

<141>

<150>DE102004019751.2

<151>2004-04-23

<160>13

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>Synthetic sequence

<220>

<223>Description of the synthetic sequence：Primer M13f

<400>1

gtaaaacgac ggccag                                                     16

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>Synthetic sequence

<220>

<223>Description of the synthetic sequence：Primer M13r

<400>2

caggaaacag ctatgac                                                    17

<210>3

<211>1777

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>Description of the unknown organism：

     DNA isolate

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(96)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1746)

<400>3

atg tct cat gat tcg caa ccc cgt ttg cgt cag cgt gca ttg gtt gta     48

Met Ser His Asp Ser Gln Pro Arg Leu Arg Gln Arg Ala Leu Val Val

  1            5               10               15

ctc ggc gcg tcc gtc ctg tcc acc ctg ctg ctg gcc gcc ccg gca ttc     96

Leu Gly Ala Ser Val Leu Ser Thr Leu Leu Leu Ala Ala Pro Ala Phe

           20               25               30

gcc ggc gat gtg cag ctg agc ggc ttg tcg tcg gca ccg acg cac cag    144

Ala Gly Asp Val Gln Leu Ser Gly Leu Ser Ser Ala Pro Thr His Gln

        35               40               45

cgt ttc atc gtc aaa tac aag gat ggc gcc aac ctg gtc gcc acc ccg    192

Arg Phe Ile Val Lys Tyr Lys Asp Gly Ala Asn Leu Val Ala Thr Pro

    50               55               60

acc gca ctg gcc agc tcg ttg aag gcg gcg gcc tcg gcc gta ccg gct    240

Thr Ala Leu Ala Ser Ser Leu Lys Ala Ala Ala Ser Ala Val Pro Ala

 65               70               75               80

gcg cag ggt cgc gcg ctg ggc ctg cag aag ctg cgc cag ctg gcc att    288

Ala Gln Gly Arg Ala Leu Gly Leu Gln Lys Leu Arg Gln Leu Ala Ile

              85               90               95

ggg ccg acc gtg gtc aag gcc gac cgt ccg ctg gat gcg gcc gag tcg    336

Gly Pro Thr Val Val Lys Ala Asp Arg Pro Leu Asp Ala Ala Glu Ser

          100              105               110

gaa ctg ctg atg cgc cgc ctg gcg gcc gac ccg aac gtg gaa tac gtc    384

Glu Leu Leu Met Arg Arg Leu Ala Ala Asp Pro Asn Val Glu Tyr Val

       115             120               125

gaa gtc gat cag ctg atg cac gcc acc ctg gtg ccc aac gac gcg cgc    432

Glu Val Asp Gln Leu Met His Ala Thr Leu Val Pro Asn Asp Ala Arg

   130              135               140

ctg tcc gag cag tgg ggc ttc ggc acc agc aac gcc tcg atc aac gtg    480

Leu Ser Glu Gln Trp Gly Phe Gly Thr Ser Asn Ala Ser Ile Asn Val

145              150               155              160

cgc ccg gca tgg gac aag gcc acc ggt acc ggc gtg gtg gtg gcg gtg    528

Arg Pro Ala Trp Asp Lys Ala Thr Gly Thr Gly Val Val Val Ala Val

             165              170               175

atc gac acc ggc atc acc aac cat ccg gac ctc aac gcc aac atc ctg    576

Ile Asp Thr Gly Ile Thr Asn His Pro Asp Leu Asn Ala Asn Ile Leu

          180              185               190

ccc ggc tat gac ttc atc agc gac gcg gcg atg gcg cgc gat ggt ggc    624

Pro Gly Tyr Asp Phe Ile Ser Asp Ala Ala Met Ala Arg Asp Gly Gly

      195               200              205

ggc cgt gac aac aac gcg aac gat gaa ggc gac tgg tac gcc gcc aac    672

Gly Arg Asp Asn Asn Ala Asn Asp Glu Gly Asp Trp Tyr Ala Ala Asn

   210               215              220

gag tgc ggc tcg ggc att ccg gcg tcg aac tcg agc tgg cac ggt acc     720

Glu Cys Gly Ser Gly Ile Pro Ala Ser Asn Ser Ser Trp His Gly Thr

225              230               235              240

cac gta gcc ggc acc atc gcg gcg gtg acc aac aac agc act ggc gtg     768

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Val Thr Asn Asn Ser Thr Gly Val

             245               250              255

gcc ggt acg gca ttc aac gcg aag gtc gtg ccg gtg cgt gtg ctc ggc     816

Ala Gly Thr Ala Phe Asn Ala Lys Val Val Pro Val Arg Val Leu Gly

          260              265               270

aag tgc ggc ggt tac acc tcc gac atc gcc gat gcg atc gtg tgg gcc     864

Lys Cys Gly Gly Tyr Thr Ser Asp Ile Ala Asp Ala Ile Val Trp Ala

       275              280              285

tcc ggc ggc acg gtc agc ggc gtg ccg gcc aat gcc aac ccg gcc gaa     912

Ser Gly Gly Thr Val Ser Gly Val Pro Ala Asn Ala Asn Pro Ala Glu

   290               295              300

gtg atc aac atg tcg ctg ggc ggc ggt ggc acc tgc tcg acc acc tac     960

Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gly Thr Cys Ser Thr Thr Tyr

305              310               315              320

cag aac gcg atc aac ggc gcg gtg tcg cgc ggc acg acg gtg gtg gtg    1008

Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ala Val Ser Arg Gly Thr Thr Val Val Val

             325               330              335

gcg gcg ggc aac agc aac acc aac gtg tcc tcg tcg gtg ccg gcc aac    1056

Ala Ala Gly Asn Ser Asn Thr Asn Val Ser Ser Ser Val Pro Ala Asn

          340              345               350

tgc gcc aac gtg atc gcg gtg gcg gcc acg acg tcg gcc ggc gcg cgc    1104

Cys Ala Asn Val Ile Ala Val Ala Ala Thr Thr Ser Ala Gly Ala Arg

       355              360              365

gcg agc ttc tcg aac tac ggt gcg ggc atc gat att tcg gcg ccg ggc    1152

Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ala Gly Ile Asp Ile Ser Ala Pro Gly

   370               375              380

cag gcg atc ctg tcc acg ctc aac agc ggt acg acg gtg ccg ggc acg    1200

Gln Ala Ile Leu Ser Thr Leu Asn Ser Gly Thr Thr Val Pro Gly Thr

385              390              395               400

gcg tcc tac gcg tcc tac aac ggg acg tcg atg gcg gcg ccg cac gtg    1248

Ala Ser Tyr Ala Ser Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ala Pro His Val

             405               410              415

gcc ggc gtg gtg gcg ctg gtg cag tcg gtg gca ccg acg gcg ttg acg    1296

Ala Gly Val Val Ala Leu Val Gln Ser Val Ala Pro Thr Ala Leu Thr

          420              425               430

ccg gcg gcg atc gag acg ttg ctg aag aac acg gca cgg gca ttg ccg    1344

Pro Ala Ala Ile Glu Thr Leu Leu Lys Asn Thr Ala Arg Ala Leu Pro

       435              440              445

ggc gca tgc agc ggt ggg tgc ggc gcg ggc atc gtg gsc gcc gat gcg    1392

Gly Ala Cys Ser Gly Gly Cys Gly Ala Gly Ile Val Asp Ala Asp Ala

   450               455              460

gcg gtc acg gcg gcg ctg ggc ggg acg aat ccg aac ccg ggc acg ggg    1440

Ala Val Thr Ala Ala Leu Gly Gly Thr Asn Pro Asn Pro Gly Thr Gly

465              470              475               480

acg gtg ctg cag aac aat gtg ccg gtg agc ggt ctg ggc gcg gcc agc    1488

Thr Val Leu Gln Asn Asn Val Pro Val Ser Gly Leu Gly Ala Ala Ser

             485               490              495

ggg gca tcg ctg tcc tat acg gtg gtg gtg ccg tcg ggc cgt tcg cag    1536

Gly Ala Ser Leu Ser Tyr Thr Val Val Val Pro Ser Gly Arg Ser Gln

          500              505               510

ctg aag gtg agc atc gcc ggt ggc agt ggt gat gcg gat ctg tac gtg    1584

Leu Lys Val Ser Ile Ala Gly Gly Ser Gly Asp Ala Asp Leu Tyr Val

       515              520              525

cgt tcg ggc agc gcg ccg acc gac acg gtg tac aac tgc cgt ccg tac    1632

Arg Ser Gly Ser Ala Pro Thr Asp Thr Val Tyr Asn Cys Arg Pro Tyr

   530               535              540

ctg agc ggc aac aac gag acc tgc acg atc act tca ccg gcg gcc ggt    1680

Leu Ser Gly Asn Asn Glu Thr Cys Thr Ile Thr Ser Pro Ala Ala Gly

545              550               555              560

acc tgg cac gtg cgg gtg aag ggc tac tcg acc ttc tcc ggg gtc acc    1728

Thr Trp His Val Arg Val Lys Gly Tyr Ser Thr Phe Ser Gly Val Thr

              565              570              575

ctg acc gcg cag tac tga gcccagatcc ctctccaatg ggcacgcccc g         1777

Leu Thr Ala Gln Tyr

          580

<210>4

<211>581

<212>PRT

<213>Unknown

<223>Description of the unknown organism：

     DNA isolate

<400>4

Met Ser His Asp Ser Gln Pro Arg Leu Arg Gln Arg Ala Leu Val Val

  1            5               10                15

Leu Gly Ala Ser Val Leu Ser Thr Leu Leu Leu Ala Ala Pro Ala Phe

           20               25               30

Ala Gly Asp Val Gln Leu Ser Gly Leu Ser Ser Ala Pro Thr His Gln

        35               40               45

Arg Phe Ile Val Lys Tyr Lys Asp Gly Ala Asn Leu Val Ala Thr Pro

    50               55               60

Thr Ala Leu Ala Ser Ser Leu Lys Ala Ala Ala Ser Ala Val Pro Ala

 65               70               75               80

Ala Gln Gly Arg Ala Leu Gly Leu Gln Lys Leu Arg Gln Leu Ala Ile

               85              90                95

Gly Pro Thr Val Val Lys Ala Asp Arg Pro Leu Asp Ala Ala Glu Ser

          100               105              110

Glu Leu Leu Met Arg Arg Leu Ala Ala Asp Pro Asn Val Glu Tyr Val

       115              120              125

Glu Val Asp Gln Leu Met His Ala Thr Leu Val Pro Asn Asp Ala Arg

   130               135              140

Leu Ser Glu Gln Trp Gly Phe Gly Thr Ser Asn Ala Ser Ile Asn Val

145              150               155              160

Arg Pro Ala Trp Asp Lys Ala Thr Gly Thr Gly Val Val Val Ala Val

              165              170              175

Ile Asp Thr Gly Ile Thr Asn His Pro Asp Leu Asn Ala Asn Ile Leu

          180              185               190

Pro Gly Tyr Asp Phe Ile Ser Asp Ala Ala Met Ala Arg Asp Gly Gly

      195               200              205

Gly Arg Asp Asn Asn Ala Asn Asp Glu Gly Asp Trp Tyr Ala Ala Asn

   210               215              220

Glu Cys Gly Ser Gly Ile Pro Ala Ser Asn Ser Ser Trp His Gly Thr

225              230              235               240

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Val Thr Asn Asn Ser Thr Gly Val

             245               250              255

Ala Gly Thr Ala Phe Asn Ala Lys Val Val Pro Val Arg Val Leu Gly

          260              265              270

Lys Cys Gly Gly Tyr Thr Ser Asp Ile Ala Asp Ala Ile Val Trp Ala

       275              280              285

Ser Gly Gly Thr Val Ser Gly Val Pro Ala Asn Ala Asn Pro Ala Glu

   290               295              300

Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gly Thr Cys Ser Thr Thr Tyr

305              310               315              320

Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ala Val Ser Arg Gly Thr Thr Val Val Val

             325              330               335

Ala Ala Gly Asn Ser Asn Thr Asn Val Ser Ser Ser Val Pro Ala Asn

          340              345               350

Cys Ala Asn Val Ile Ala Val Ala Ala Thr Thr Ser Ala Gly Ala Arg

       355              360              365

Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ala Gly Ile Asp Ile Ser Ala Pro Gly

   370               375              380

Gln Ala Ile Leu Ser Thr Leu Asn Ser Gly Thr Thr Val Pro Gly Thr

385              390              395               400

Ala Ser Tyr Ala Ser Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ala Pro His Val

             405               410              415

Ala Gly Val Val Ala Leu Val Gln Ser Val Ala Pro Thr Ala Leu Thr

          420              425               430

Pro Ala Ala Ile Glu Thr Leu Leu Lys Asn Thr Ala Arg Ala Leu Pro

       435              440              445

Gly Ala Cys Ser Gly Gly Cys Gly Ala Gly Ile Val Asp Ala Asp Ala

   450              455               460

Ala Val Thr Ala Ala Leu Gly Gly Thr Asn Pro Asn Pro Gly Thr Gly

465              470               475              480

Thr Val Leu Gln Asn Asn Val Pro Val Ser Gly Leu Gly Ala Ala Ser

             485               490              495

Gly Ala Ser Leu Ser Tyr Thr Val Val Val Pro Ser Gly Arg Ser Gln

          500              505               510

Leu Lys Val Ser Ile Ala Gly Gly Ser Gly Asp Ala Asp Leu Tyr Val

      515               520              525

Arg Ser Gly Ser Ala Pro Thr Asp Thr Val Tyr Asn Cys Arg Pro Tyr

   530               535              540

Leu Ser Gly Asn Asn Glu Thr Cys Thr Ile Thr Ser Pro Ala Ala Gly

545              550               555              560

Thr Trp His Val Arg Val Lys Gly Tyr Ser Thr Phe Ser Gly Val Thr

             565               570              575

Leu Thr Ala Gln Tyr

          580

<210>5

<211>470

<212>PRT

<213>Synthetic sequence

<220>

<223>Description of the synthetic sequence：DNA isolate，

     Delta C

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)..(32)

<400>5

Met Ser His Asp Ser Gln Pro Arg Leu Arg Gln Arg Ala Leu Val Val

  1            5               10                15

Leu Gly Ala Ser Val Leu Ser Thr Leu Leu Leu Ala Ala Pro Ala Phe

           20               25               30

Ala Gly Asp Val Gln Leu Ser Gly Leu Ser Ser Ala Pro Thr His Gln

        35               40               45

Arg Phe Ile Val Lys Tyr Lys Asp Gly Ala Asn Leu Val Ala Thr Pro

    50               55                60

Thr Ala Leu Ala Ser Ser Leu Lys Ala Ala Ala Ser Ala Val Pro Ala

 65               70               75               80

Ala Gln Gly Arg Ala Leu Gly Leu Gln Lys Leu Arg Gln Leu Ala Ile

              85                90               95

Gly Pro Thr Val Val Lys Ala Asp Arg Pro Leu Asp Ala Ala Glu Ser

          100              105               110

Glu Leu Leu Met Arg Arg Leu Ala Ala Asp Pro Asn Val Glu Tyr Val

       115              120              125

Glu Val Asp Gln Leu Met His Ala Thr Leu Val Pro Asn Asp Ala Arg

   130               135              140

Leu Ser Glu Gln Trp Gly Phe Gly Thr Ser Asn Ala Ser Ile Asn Val

145              150              155               160

Arg Pro Ala Trp Asp Lys Ala Thr Gly Thr Gly Val Val Val Ala Val

             165               170              175

Ile Asp Thr Gly Ile Thr Asn His Pro Asp Leu Asn Ala Asn Ile Leu

          180              185              190

Pro Gly Tyr Asp Phe Ile Ser Asp Ala Ala Met Ala Arg Asp Gly Gly

      195               200              205

Gly Arg Asp Asn Asn Ala Asn Asp Glu Gly Asp Trp Tyr Ala Ala Asn

   210               215              220

Glu Cys Gly Ser Gly Ile Pro Ala Ser Asn Ser Ser Trp His Gly Thr

225              230              235               240

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Val Thr Asn Asn Ser Thr Gly Val

             245               250              255

Ala Gly Thr Ala Phe Asn Ala Lys Val Val Pro Val Arg Val Leu Gly

          260              265               270

Lys Cys Gly Gly Tyr Thr Ser Asp Ile Ala Asp Ala Ile Val Trp Ala

       275              280              285

Ser Gly Gly Thr Val Ser Gly Val Pro Ala Asn Ala Asn Pro Ala Glu

   290               295              300

Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gly Thr Cys Ser Thr Thr Tyr

305              310              315               320

Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ala Val Ser Arg Gly Thr Thr Val Val Val

             325               330              335

Ala Ala Gly Asn Ser Asn Thr Asn Val Ser Ser Ser Val Pro Ala Asn

          340              345               350

Cys Ala Asn Val Ile Ala Val Ala Ala Thr Thr Ser Ala Gly Ala Arg

       355              360              365

Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ala Gly Ile Asp Ile Ser Ala Pro Gly

    370              375             380

Gln Ala Ile Leu Ser Thr Leu Asn Ser Gly Thr Thr Val Pro Gly Thr

385              390              395               400

Ala Ser Tyr Ala Ser Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ala Pro His Val

             405              410               415

Ala Gly Val Val Ala Leu Val Gln Ser Val Ala Pro Thr Ala Leu Thr

          420              425               430

Pro Ala Ala Ile Glu Thr Leu Leu Lys Asn Thr Ala Arg Ala Leu Pro

       435              440              445

Gly Ala Cys Ser Gly Gly Cys Gly Ala Gly Ile Val Asp Ala Asp Ala

   450               455              460

Ala Val Thr Ala Ala Leu

465              470

<210>6

<211>1761

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>Description of the unknown organism：

     DNA isolate

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(114)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1761)

<400>6

atg att acg aat tcg agc tcg gta ccc ggg gat ccg cag cgc ttg cgt     48

Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Val Pro Gly Asp Pro Gln Arg Leu Arg

  1            5               10                15

cag cgt gcc ttg gtt gta ctc ggt ggt tcg gtg ctt tcg acc ctg ctc     96

Gln Arg Ala Leu Val Val Leu Gly Gly Ser Val Leu Ser Thr Leu Leu

           20               25               30

ctg gcg gcg ccg gca ttc gcc ggc gac gtg cag ttg agt ggc ctg gcc    144

Leu Ala Ala Pro Ala Phe Ala Gly Asp Val Gln Leu Ser Gly Leu Ala

        35               40               45

tcg gcc ccg acc cac cag cgt ttc atc gtc aag tac aag gac ggc gcc    192

Ser Ala Pro Thr His Gln Arg Phe Ile Val Lys Tyr Lys Asp Gly Ala

    50               55               60

acc gac gtg gcc acc ccg acc gca ctg gcc agt tcg ctc aag gcc gcc    240

Thr Asp Val Ala Thr Pro Thr Ala Leu Ala Ser Ser Leu Lys Ala Ala

 65               70               75               80

gcc caa gcc gtt ccc gcc gcg cag ggg cgc gcg ctg ggc ctg cag aag    288

Ala Gln Ala Val Pro Ala Ala Gln Gly Arg Ala Leu Gly Leu Gln Lys

              85               90                95

ctg cgc cag ctg gcc atc ggc ccg acc gtg gtc aag gcc gac cgc ccg    336

Leu Arg Gln Leu Ala Ile Gly Pro Thr Val Val Lys Ala Asp Arg Pro

          100              105               110

ctg gat gcc gcc gaa tcg gaa ctg ctg atg cgt cgc ctg gcc gcc gat    384

Leu Asp Ala Ala Glu Ser Glu Leu Leu Met Arg Arg Leu Ala Ala Asp

       115              120              125

ccg aac gtg gaa tac gtc gaa gtc gac cag ctg atg cac gcc acc ctg    432

Pro Asn Val Glu Tyr Val Glu Val Asp Gln Leu Met His Ala Thr Leu

    130             135              140

gtg ccc aac gac agc cgc ctg tcc gag cag tgg ggc ttc ggc acc agc    480

Val Pro Asn Asp Ser Arg Leu Ser Glu Gln Trp Gly Phe Gly Thr Ser

145              150              155               160

aac gcc tcg atc aac gtg cgc ccg gcc tgg gac aag gcc acg ggg acc    528

Asn Ala Ser Ile Asn Val Arg Pro Ala Trp Asp Lys Ala Thr Gly Thr

             165               170              175

ggc gtg gtg gtg gcg gtg atc gat acc ggc atc acc aac cat ccg gat    576

Gly Val Val Val Ala Val Ile Asp Thr Gly Ile Thr Asn His Pro Asp

          180               185              190

ctg aac gcc aac atc ctg ccc ggc tat gac ttc atc agc gat gcc gcg    624

Leu Asn Ala Asn Ile Leu Pro Gly Tyr Asp Phe Ile Ser Asp Ala Ala

       195              200              205

atg gcg cgc gat ggc ggt ggc cgc gac aac aat gcc aac gac gaa ggc     672

Met Ala Arg Asp Gly Gly Gly Arg Asp Asn Asn Ala Asn Asp Glu Gly

   210               215              220

gac tgg tat gcc gcc aac gaa tgc ggc gcc ggc tac ccg gcc tcc aat     720

Asp Trp Tyr Ala Ala Asn Glu Cys Gly Ala Gly Tyr Pro Ala Ser Asn

225              230               235              240

tcc agc tgg cac ggc acc cac gtg gcc ggc acc atc gcc gcg gtg acc     768

Ser Ser Trp His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Val Thr

             245               250              255

aac aac acc acc ggc gtg gcc ggc acc gcc tac aac gcc aag gtc gtt     816

Asn Asn Thr Thr Gly Val Ala Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Lys Val Val

          260              265               270

ccg gtg cgc gtg ctg ggc aag tgc ggc ggc tat acc tcc gac atc gcc     864

Pro Val Arg Val Leu Gly Lys Cys Gly Gly Tyr Thr Ser Asp Ile Ala

       275              280              285

gat gcg atc gtg tgg gca tcc ggc ggc acc gtc agc ggc gtg ccg gcc     912

Asp Ala Ile Val Trp Ala Ser Gly Gly Thr Val Ser Gly Val Pro Ala

    290              295              300

aat gcc aac ccg gcc gaa gtg atc aac atg tcc ctc ggc ggc ggc ggc     960

Asn Ala Asn Pro Ala Glu Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gly

305              310              315               320

agc tgc tcg acc acc tac cag aac gcc atc aac ggc gcg gtg tcg cgc    1008

Ser Cys Ser Thr Thr Tyr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ala Val Ser Arg

              325              330              335

ggc acc acc gtg gtg gtg gca gcg ggc aac agc aac acc aac gtg tcc    1056

Gly Thr Thr Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Asn Thr Asn Val Ser

          340              345               350

tcg tcg gtg ccg gcc aac tgc gcc aac gtg atc gcg gtg gcc gcc acc    1104

Ser Ser Val Pro Ala Asn Cys Ala Asn Val Ile Ala Val Ala Ala Thr

       355              360              365

acc tcg gcc ggc gcc cgc gcc agc ttc tcc aac tac ggt gcc ggc atc    1152

Thr Ser Ala Gly Ala Arg Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ala Gly Ile

    370              375              380

gat gtc tcg gcg ccg ggc cag gcg atc ctg tcc acg ctc aac agc ggc    1200

Asp Val Ser Ala Pro Gly Gln Ala Ile Leu Ser Thr Leu Asn Ser Gly

385              390               395              400

acc acc gtg ccg ggc gct gcg tcc tat gcg tcg tac aac ggc acc tcg    1248

Thr Thr Val Pro Gly Ala Ala Ser Tyr Ala Ser Tyr Asn Gly Thr Ser

             405               410              415

atg gcg gcc ccg cac gtg gcc ggc gtg gtc gcg ctg gtg cag tcg gtc    1296

Met Ala Ala Pro His Val Ala Gly Val Val Ala Leu Val Gln Ser Val

          420              425               430

gcg ccc acc gcg ctg tcg ccg gca gcc atc gag acg ctg ctc aag aac    1344

Ala Pro Thr Ala Leu Ser Pro Ala Ala Ile Glu Thr Leu Leu Lys Asn

       435              440              445

acc gca cgg gcc ctg ccg ggc gcc tgc agc ggc ggc tgc ggc gcg ggc    1392

Thr Ala Arg Ala Leu Pro Gly Ala Cys Ser Gly Gly Cys Gly Ala Gly

   450               455              460

atc gtc gat gcg gat gcg gcc gtc acc gcc gcg ctg ggc ggg acc aac    1440

Ile Val Asp Ala Asp Ala Ala Val Thr Ala Ala Leu Gly Gly Thr Asn

465              470              475               480

ccg aac ccg ggc acc ggc acg ctg cag aac aac gtg ccg gtc agc ggc    1488

Pro Asn Pro Gly Thr Gly Thr Leu Gln Asn Asn Val Pro Val Ser Gly

             485              490               495

ctg ggt gct tcc agc ggt gca tcg ctg gcc tac acc gtg gcc gtg ccc    1536

Leu Gly Ala Ser Ser Gly Ala Ser Leu Ala Tyr Thr Val Ala Val Pro

          500              505               510

tcg ggt cgc tcg cag ctg aag gtg acc atc gcc ggc ggc acg ggc gat    1584

Ser Gly Arg Ser Gln Leu Lys Val Thr Ile Ala Gly Gly Thr Gly Asp

       515              520              525

gcg gac ctg tac gtg cgc tcg ggc agc gcg ccc acc gac acc gtg tac    1632

Ala Asp Leu Tyr Val Arg Ser Gly Ser Ala Pro Thr Asp Thr Val Tyr

   530               535              540

acc tgc cgc ccg tac ctg agc ggc aac aac gaa acc tgc acg atc acc    1680

Thr Cys Arg Pro Tyr Leu Ser Gly Asn Asn Glu Thr Cys Thr Ile Thr

545              550              555               560

gcc ccg gcc gcg ggg acc tgg cat gtc cgg gtg aag gcc tac agc acc    1728

Ala Pro Ala Ala Gly Thr Trp His Val Arg Val Lys Ala Tyr Ser Thr

             565               570              575

ttc tcc ggc gtg acc ctg acc gcg cag tat tga                        1761

Phe Ser Gly Val Thr Leu Thr Ala Gln Tyr

          580              585

<210>7

<211>586

<212>PRT

<213>Unknown

<223>Description of the unknown organism：

     DNA isolate

<400>7

Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Val Pro Gly Asp Pro Gln Arg Leu Arg

  1            5               10               15

Gln Arg Ala Leu Val Val Leu Gly Gly Ser Val Leu Ser Thr Leu Leu

           20               25               30

Leu Ala Ala Pro Ala Phe Ala Gly Asp Val Gln Leu Ser Gly Leu Ala

        35               40               45

Ser Ala Pro Thr His Gln Arg Phe Ile Val Lys Tyr Lys Asp Gly Ala

    50               55                60

Thr Asp Val Ala Thr Pro Thr Ala Leu Ala Ser Ser Leu Lys Ala Ala

 65               70               75               80

Ala Gln Ala Val Pro Ala Ala Gln Gly Arg Ala Leu Gly Leu Gln Lys

              85               90               95

Leu Arg Gln Leu Ala Ile Gly Pro Thr Val Val Lys Ala Asp Arg Pro

          100              105               110

Leu Asp Ala Ala Glu Ser Glu Leu Leu Met Arg Arg Leu Ala Ala Asp

       115              120              125

Pro Asn Val Glu Tyr Val Glu Val Asp Gln Leu Met His Ala Thr Leu

   130               135              140

Val Pro Asn Asp Ser Arg Leu Ser Glu Gln Trp Gly Phe Gly Thr Ser

145              150               155              160

Asn Ala Ser Ile Asn Val Arg Pro Ala Trp Asp Lys Ala Thr Gly Thr

             165              170               175

Gly Val Val Val Ala Val Ile Asp Thr Gly Ile Thr Asn His Pro Asp

          180              185               190

Leu Asn Ala Asn Ile Leu Pro Gly Tyr Asp Phe Ile Ser Asp Ala Ala

      195               200              205

Met Ala Arg Asp Gly Gly Gly Arg Asp Asn Asn Ala Asn Asp Glu Gly

   210               215              220

Asp Trp Tyr Ala Ala Asn Glu Cys Gly Ala Gly Tyr Pro Ala Ser Asn

225              230              235               240

Ser Ser Trp His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Val Thr

             245               250              255

Asn Asn Thr Thr Gly Val Ala Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Lys Val Val

          260              265               270

Pro Val Arg Val Leu Gly Lys Cys Gly Gly Tyr Thr Ser Asp Ile Ala

       275              280              285

Asp Ala Ile Val Trp Ala Ser Gly Gly Thr Val Ser Gly Val Pro Ala

   290               295              300

Asn Ala Asn Pro Ala Glu Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gly

305              310              315               320

Ser Cys Ser Thr Thr Tyr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ala Val Ser Arg

             325              330               335

Gly Thr Thr Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Asn Thr Asn Val Ser

          340              345               350

Ser Ser Val Pro Ala Asn Cys Ala Asn Val Ile Ala Val Ala Ala Thr

       355              360              365

Thr Ser Ala Gly Ala Arg Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ala Gly Ile

   370               375              380

Asp Val Ser Ala Pro Gly Gln Ala Ile Leu Ser Thr Leu Asn Ser Gly

385              390               395              400

Thr Thr Val Pro Gly Ala Ala Ser Tyr Ala Ser Tyr Asn Gly Thr Ser

             405               410              415

Met Ala Ala Pro His Val Ala Gly Val Val Ala Leu Val Gln Ser Val

          420              425               430

Ala Pro Thr Ala Leu Ser Pro Ala Ala Ile Glu Thr Leu Leu Lys Asn

       435              440              445

Thr Ala Arg Ala Leu Pro Gly Ala Cys Ser Gly Gly Cys Gly Ala Gly

   450               455              460

Ile Val Asp Ala Asp Ala Ala Val Thr Ala Ala Leu Gly Gly Thr Asn

465              470               475              480

Pro Asn Pro Gly Thr Gly Thr Leu Gln Asn Asn Val Pro Val Ser Gly

              485              490              495

Leu Gly Ala Ser Ser Gly Ala Ser Leu Ala Tyr Thr Val Ala Val Pro

          500              505               510

Ser Gly Arg Ser Gln Leu Lys Val Thr Ile Ala Gly Gly Thr Gly Asp

       515              520              525

Ala Asp Leu Tyr Val Arg Ser Gly Ser Ala Pro Thr Asp Thr Val Tyr

   530               535              540

Thr Cys Arg Pro Tyr Leu Ser Gly Asn Asn Glu Thr Cys Thr Ile Thr

545              550              555               560

Ala Pro Ala Ala Gly Thr Trp His Val Arg Val Lys Ala Tyr Ser Thr

              565              570               575

Phe Ser Gly Val Thr Leu Thr Ala Gln Tyr

          580              585

<210>8

<211>470

<212>PRT

<213>Synthetic sequence

<220>

<223>Description of the synthetic sequence：DNA isolate，

     Delta C

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)..(32)

<223>Signal peptide from HP70

<400>8

Met Ser His Asp Ser Gln Pro Arg Leu Arg Gln Arg Ala Leu Val Val

  1            5               10                15

Leu Gly Ala Ser Val Leu Ser Thr Leu Leu Leu Ala Ala Pro Ala Phe

          20                25               30

Ala Gly Asp Val Gln Leu Ser Gly Leu Ala Ser Ala Pro Thr His Gln

       35                40               45

Arg Phe Ile Val Lys Tyr Lys Asp Gly Ala Thr Asp Val Ala Thr Pro

    50               55               60

Thr Ala Leu Ala Ser Ser Leu Lys Ala Ala Ala Gln Ala Val Pro Ala

 65               70               75               80

Ala Gln Gly Arg Ala Leu Gly Leu Gln Lys Leu Arg Gln Leu Ala Ile

              85               90                95

Gly Pro Thr Val Val Lys Ala Asp Arg Pro Leu Asp Ala Ala Glu Ser

          100              105               110

Glu Leu Leu Met Arg Arg Leu Ala Ala Asp Pro Asn Val Glu Tyr Val

       115              120              125

Glu Val Asp Gln Leu Met His Ala Thr Leu Val Pro Asn Asp Ser Arg

   130               135              140

Leu Ser Glu Gln Trp Gly Phe Gly Thr Ser Asn Ala Ser Ile Asn Val

145              150               155              160

Arg Pro Ala Trp Asp Lys Ala Thr Gly Thr Gly Val Val Val Ala Val

             165               170              175

Ile Asp Thr Gly Ile Thr Asn His Pro Asp Leu Asn Ala Asn Ile Leu

          180               185              190

Pro Gly Tyr Asp Phe Ile Ser Asp Ala Ala Met Ala Arg Asp Gly Gly

      195               200              205

Gly Arg Asp Asn Asn Ala Asn Asp Glu Gly Asp Trp Tyr Ala Ala Asn

   210               215              220

Glu Cys Gly Ala Gly Tyr Pro Ala Ser Asn Ser Ser Trp His Gly Thr

225              230               235              240

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Val Thr Asn Asn Thr Thr Gly Val

             245               250              255

Ala Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Lys Val Val Pro Val Arg Val Leu Gly

          260              265               270

Lys Cys Gly Gly Tyr Thr Ser Asp Ile Ala Asp Ala Ile Val Trp Ala

       275              280              285

Ser Gly Gly Thr Val Ser Gly Val Pro Ala Asn Ala Asn Pro Ala Glu

   290               295              300

Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ser Thr Thr Tyr

305              310               315              320

Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ala Val Ser Arg Gly Thr Thr Val Val Val

             325               330              335

Ala Ala Gly Asn Ser Asn Thr Asn Val Ser Ser Ser Val Pro Ala Asn

          340               345              350

Cys Ala Asn Val Ile Ala Val Ala Ala Thr Thr Ser Ala Gly Ala Arg

       355              360              365

Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ala Gly Ile Asp Val Ser Ala Pro Gly

   370               375              380

Gln Ala Ile Leu Ser Thr Leu Asn Ser Gly Thr Thr Val Pro Gly Ala

385              390               395              400

Ala Ser Tyr Ala Ser Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ala Pro His Val

             405               410              415

Ala Gly Val Val Ala Leu Val Gln Ser Val Ala Pro Thr Ala Leu Ser

          420              425               430

Pro Ala Ala Ile Glu Thr Leu Leu Lys Asn Thr Ala Arg Ala Leu Pro

       435              440              445

Gly Ala Cys Ser Gly Gly Cys Gly Ala Gly Ile Val Asp Ala Asp Ala

   450               455              460

Ala Val Thr Ala Ala Leu

465              470

<210>9

<211>587

<212>PRT

<213>Synthetic sequence

<220>

<223>Description of the synthetic sequence：

     Consensus sequence

<220>

<221>VARIANT

<222>(2)

<223>- or Ile

<220>

<221>VARIANT

<222>(3)

<223>Ser or Thr

<220>

<221>VARIANT

<222>(4)

<223>His or Asn

<220>

<221>VARIANT

<222>(5)

<223>Asp or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>(7)

<223>- or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>(8)

<223>- or Val

<220>

<221>VARIANT

<222>(9)

<223>- or Pro

<220>

<221>VARIANT

<222>(10)

<223>- or Gly

<220>

<221>VARIANT

<222>(11)

<223>- or Asp

<220>

<221>VARIANT

<222>(12)

<223>Gln or Pro

<220>

<221>VARIANT

<222>(13)

<223>Pro or Gln

<220>

<221>VARIANT

<222>(25)

<223>Ala or Gly

<220>

<221>VARIANT

<222>(48)

<223>Ser or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>(65)

<223>Asn or Thr

<220>

<221>VARIANT

<222>(66)

<223>Leu or Asp

<220>

<221>VARIANT

<222>(82)

<223>Ser or Gln

<220>

<221>VARIANT

<222>(149)

<223>Ala or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>(234)

<223>Ser or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>(236)

<223>Ile or Tyr

<220>

<221>VARIANT

<222>(259)

<223>Ser or Thr

<220>

<221>VARIANT

<222>(267)

<223>Phe or Tyr

<220>

<221>VARIANT

<222>(321)

<223>Thr or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>(386)

<223>Ile or Val

<220>

<221>VARIANT

<222>(406)

<223>Thr or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>(438)

<223>Thr or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>(487)

<223>Thr or -

<220>

<221>VARIANT

<222>(488)

<223>Val or Thr

<220>

<221>VARIANT

<222>(501)

<223>Ala or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>(507)

<223>Ser or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>(511)

<223>Val or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>(522)

<223>Ser or Thr

<220>

<221>VARIANT

<222>(527)

<223>Ser or Thr

<220>

<221>VARIANT

<222>(546)

<223>Asn or Thr

<220>

<221>VARIANT

<222>(562)

<223>Ser or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>(574)

<223>Gly or Ala

<400>9

Met Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Leu Arg

  1            5               10                15

Gln Arg Ala Leu Val Val Leu Gly Xaa Ser Val Leu Ser Thr Leu Leu

           20               25               30

Leu Ala Ala Pro Ala Phe Ala Gly Asp Val Gln Leu Ser Gly Leu Xaa

        35               40               45

Ser Ala Pro Thr His Gln Arg Phe Ile Val Lys Tyr Lys Asp Gly Ala

    50               55                60

Xaa Xaa Val Ala Thr Pro Thr Ala Leu Ala Ser Ser Leu Lys Ala Ala

 65               70               75               80

Ala Xaa Ala Val Pro Ala Ala Gln Gly Arg Ala Leu Gly Leu Gln Lys

              85               90                95

Leu Arg Gln Leu Ala Ile Gly Pro Thr Val Val Lys Ala Asp Arg Pro

          100              105              110

Leu Asp Ala Ala Glu Ser Glu Leu Leu Met Arg Arg Leu Ala Ala Asp

       115              120              125

Pro Asn Val Glu Tyr Val Glu Val Asp Gln Leu Met His Ala Thr Leu

    130             135               140

Val Pro Asn Asp Xaa Arg Leu Ser Glu Gln Trp Gly Phe Gly Thr Ser

145               150              155              160

Asn Ala Ser Ile Asn Val Arg Pro Ala Trp Asp Lys Ala Thr Gly Thr

             165              170               175

Gly Val Val Val Ala Val Ile Asp Thr Gly Ile Thr Asn His Pro Asp

          180               185             190

Leu Asn Ala Asn Ile Leu Pro Gly Tyr Asp Phe Ile Ser Asp Ala Ala

       195              200              205

Met Ala Arg Asp Gly Gly Gly Arg Asp Asn Asn Ala Asn Asp Glu Gly

   210              215               220

Asp Trp Tyr Ala Ala Asn Glu Cys Gly Xaa Gly Xaa Pro Ala Ser Asn

225              230               235              240

Ser Ser Trp His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Val Thr

             245               250              255

Asn Asn Xaa Thr Gly Val Ala Gly Thr Ala Xaa Asn Ala Lys Val Val

          260              265               270

Pro Val Arg Val Leu Gly Lys Cys Gly Gly Tyr Thr Ser Asp Ile Ala

       275              280              285

Asp Ala Ile Val Trp Ala Ser Gly Gly Thr Val Ser Gly Val Pro Ala

    290              295              300

Asn Ala Asn Pro Ala Glu Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gly

305              310              315               320

Xaa Cys Ser Thr Thr Tyr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ala Val Ser Arg

             325               330              335

Gly Thr Thr Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Asn Thr Asn Val Ser

          340              345               350

Ser Ser Val Pro Ala Asn Cys Ala Asn Val Ile Ala Val Ala Ala Thr

       355              360              365

Thr Ser Ala Gly Ala Arg Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ala Gly Ile

   370               375              380

Asp Xaa Ser Ala Pro Gly Gln Ala Ile Leu Ser Thr Leu Asn Ser Gly

385              390              395               400

Thr Thr Val Pro Gly Xaa Ala Ser Tyr Ala Ser Tyr Asn Gly Thr Ser

             405               410              415

Met Ala Ala Pro His Val Ala Gly Val Val Ala Leu Val Gln Ser Val

          420              425               430

Ala Pro Thr Ala Leu Xaa Pro Ala Ala Ile Glu Thr Leu Leu Lys Asn

       435              440              445

Thr Ala Arg Ala Leu Pro Gly Ala Cys Ser Gly Gly Cys Gly Ala Gly

    450              455              460

Ile Val Asp Ala Asp Ala Ala Val Thr Ala Ala Leu Gly Gly Thr Asn

465              470              475               480

Pro Asn Pro Gly Thr Gly Xaa Xaa Leu Gln Asn Asn Val Pro Val Ser

             485              490               495

Gly Leu Gly Ala Xaa Ser Gly Ala Ser Leu Xaa Tyr Thr Val Xaa Val

          500              505               510

Pro Ser Gly Arg Ser Gln Leu Lys Val Xaa Ile Ala Gly Gly Xaa Gly

       515              520              525

Asp Ala Asp Leu Tyr Val Arg Ser Gly Ser Ala Pro Thr Asp Thr Val

    530              535              540

Tyr Xaa Cys Arg Pro Tyr Leu Ser Gly Asn Asn Glu Thr Cys Thr Ile

545              550              555               560

Thr Xaa Pro Ala Ala Gly Thr Trp His Val Arg Val Lys Xaa Tyr Ser

             565              570               575

Thr Phe Ser Gly Val Thr Leu Thr Ala Gln Tyr

          580              585

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>Synthetic sequence

<220>

<223>Description of the synthetic sequence：Primer HP70f

<400>10

gaattcgatg tctcatgatt cgcaacc                                        27

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>Synthetic sequence

<220>

<223>Description of the synthetic sequence：Primer HP70r

<400>11

ggatcctcac agcgccgccg tgaccgccg                                      29

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>Synthetic sequence

<220>

<223>Description of the synthetic sequence：Primer HP53f

<400>12

gctgagcggc ctggcctcgg ccccg                                          25

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>Synthetic sequence

<220>

<223>Description of the synthetic sequence：Primer HP53r

<400>13

ggatcctcac agcgccgccg tgacggccg                                      29

Claims (53)

1.碱性蛋白酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列具有至少90％同一性或者与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有至少87.5％同一性。

2.根据权利要求1的碱性蛋白酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列进一步优选具有至少95％，96％，97％，98％，99％以及最优选100％同一性，或者与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列进一步优选具有至少90％，95％，96％，97％，98％，99％以及最优选100％同一性。

3.根据权利要求1或2的碱性蛋白酶，同源值分别适合对应于SEQ ID NO.4的氨基酸位置33至581或者SEQ ID NO.7的氨基酸位置39至586的区域。

4.根据权利要求1-3之一的碱性蛋白酶，其同源值从至少90％同一性起分别适合对应于SEQ ID NO.5的氨基酸位置33至470或SEQ IDNO.8的氨基酸位置33至470的区域。

5.根据权利要求1至4之一的碱性蛋白酶，其具有根据SEQ ID NO.9共有序列的氨基酸序列，优选在氨基酸位置39至587范围内，更优选在氨基酸位置39至476范围内。

6.根据权利要求1至5之一的碱性蛋白酶，其由一种核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列具有至少85％同一性，进一步优选具有至少90％，95％，96％，97％，98％，99％同一性和最优选100％同一性，尤其对应于SEQ ID NO.3的核苷酸位置97至1746的区域，最优选对应于SEQ ID NO.3的核苷酸位置97至1410的区域，或者其由一种核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与SEQID NO.6所示的核苷酸序列具有至少85％同一性，进一步优选具有至少90％，95％，96％，97％，98％，99％同一性和最优选100％同一性，尤其对应于SEQ ID NO.6的核苷酸位置115至1761的区域，最优选对应于SEQ ID NO.6的核苷酸位置97至1428的区域。

7.根据权利要求1至6之一的碱性蛋白酶，其可从天然环境分离或者衍生自一种从天然环境分离的核酸。

8.根据权利要求1至7之一的碱性蛋白酶，所述碱性蛋白酶或其核酸源自一种可从天然环境分离的生物。

9.权利要求8的碱性蛋白酶，其是指一种微生物，优选是指一种真菌或细菌，其中优选是指革兰氏阳性菌和更优选是指杆菌属。

10.由权利要求1至9之一的碱性蛋白酶通过片段化或缺失突变而衍生的碱性蛋白酶或蛋白，具有至少100，进一步优选至少150，200，250和最优选至少300个已经在出发分子中相关的氨基酸。

11.根据权利要求1至10之一的碱性蛋白酶或蛋白，通过插入突变，通过取代突变和/或通过与至少一种其他蛋白融合，衍生自权利要求1至10之一的碱性蛋白酶或蛋白。

12.根据权利要求11的碱性蛋白酶或蛋白，其在源自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的碱性蛋白酶的编号位置3、4、36、42、47、56、61、69、87、96、99、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、199、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268上具有一个或多个氨基酸替换，其位置通过图1中的比对来分配。

13.根据权利要求1至12之一的碱性蛋白酶或蛋白，其额外地被稳定化。

14.根据权利要求1至13之一的碱性蛋白酶或蛋白，其额外地被衍生化。

15.碱性蛋白酶或蛋白，其与权利要求1至14所述的碱性蛋白酶或蛋白共同具有至少一种抗原决定簇，尤其位于迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)的碱性蛋白酶编号位置3、4、36、42、47、56、61、69、87、96、99、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、199、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268中的至少一个抗原决定簇区域，所述位置通过图1的比对而分配。

16.具有核苷酸序列的核酸，其与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少85％同一性或者与SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列具有至少85％同一性。

17.根据权利要求16的核酸，其序列与所示核苷酸序列之一进一步优选具有至少90％，95％，96％，97％，98％，99％和最优选100％同一性。

18.根据权利要求16或17的核酸，其同源值分别适合对应于SEQID NO.3的核苷酸位置97至1746的区域或者对应于SEQ ID NO.6的核苷酸位置115至1761的区域。

19.根据权利要求16至18之一的核酸，其同源值分别适合对应于SEQ ID NO.3的核苷酸位置97至1410的区域或者对应于SEQ IDNO.6的核苷酸位置115至1428的区域。

20.根据权利要求16至19之一的核酸，其编码权利要求1至16之一的碱性蛋白酶或蛋白。

21.根据权利要求16至20之一的核酸，用同义密码子代替一种或优选多个密码子。

22.一种微生物细胞，其天然含有权利要求16至21之一的核酸。

23.根据权利要求22的细胞，其天然地表达，优选分泌权利要求1至15之一的蛋白酶或蛋白。

24.根据权利要求22或23的细胞，其是指微生物，优选是指真菌或细菌，其中优选为革兰氏阳性菌，更优选为杆菌属(Bacillus)之一或者黄单胞菌属(Xanthomonas)中的革兰氏阴性菌。

25.用于识别权利要求1至15之一的碱性蛋白酶的方法，其基于从天然生存环境中分离核酸。

26.根据权利要求25的方法，利用一种优选使用两种相互相关的可以用作PCR引物的寡核苷酸，并衍生自两种序列SEQ ID NO.3或6之一。

27.根据权利要求25或26的方法，其中分离的核酸被克隆，优选为被表达和更优选为通过表达产物的蛋白酶活性而被识别为蛋白酶。

28.载体，其含有权利要求16至21所述的核酸区域。

29.根据权利要求28的克隆载体。

30.根据权利要求28的表达载体。

31.细胞，其在重组DNA修饰后含有权利要求16至21所述的核酸区域。

32.根据权利要求31的细胞，其中所述核酸区域存在于载体上，优选存在于根据权利要求28至30之一的载体上。

33.根据权利要求31或32的细胞，其表达优选分泌权利要求1至15所述碱性蛋白酶或蛋白中的一种。

34.根据权利要求31至33之一的细胞，其是指一种细菌。

35.根据权利要求34的细胞，其是指革兰氏阴性菌，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、假单胞菌(Pseudomonas)或黄单胞菌(Xanthomonas)，优选是指菌株E.coli K12、E.coli B或植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)，最优选是指菌株Escherichia coliBL21(DE3)，E.coli RV308，E.coli DH5α，E.coli JM 109，E.coli XL-1或植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)(Rf)的衍生物。

36.根据权利要求34的细胞，其是指革兰氏阳性菌，优选是杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)或棒状杆菌属(Corynebakterium)之一，最优选是迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，克虏伯氏芽孢杆菌或亲碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)，肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)或谷氨酸棒杆菌(Corynebcterium glutamicum)。

37.根据权利要求31至33之一的细胞，其是指一种真核细胞，优选是酵母菌属(Saccharomyces)之一。

38.制备权利要求1至15之一的碱性蛋白酶或蛋白的方法。

39.根据权利要求38的方法，其使用权利要求16至21之一的核酸，优选使用权利要求28至30之一的载体，更优选使用权利要求31至37之一的细胞。

40.根据权利要求38或39的方法，其中核苷酸序列在一个或优选多个密码子中与宿主菌株的密码子用法一致。

41.组合物，其含有根据权利要求1至15之一的碱性蛋白酶。

42.根据权利要求41的组合物，其是至一种洗涤或清洁制剂。

43.根据权利要求42的组合物，其中每克组合物中的碱性蛋白酶的用量为2μg至20mg，优选5μg至17.5mg，更优选20μg至15mg，最优选50μg至10mg。

44.根据权利要求42或43的组合物，其额外含有其他酶，尤其是其他蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，半纤维素酶、氧化还原酶和/或脂肪酶。

45.根据权利要求41的组合物，其是指用于纺织品原料处理或纺织品护理的组合物。

46.根据权利要求41的组合物，其用于处理纤维或含有天然成分的纺织品，尤其是那些含有羊毛或丝的纺织品。

47.用于机械清洁纺织品或硬表面的方法，其在至少一个方法步骤中将权利要求1至15之一的碱性蛋白酶活化。

48.根据权利要求47的方法，其中碱性蛋白酶每次的用量为40μg至4g，优选50μg至3g，更优选100μg至2g，以及最优选200μg至1g。

49.纺织品原料处理或纺织品护理的方法，其在至少一个方法步骤中将权利要求1至15之一的碱性蛋白酶活化。

50.根据权利要求49的方法，其用于处理纤维或含有天然成分的纺织品，最优选是那些含有羊毛或丝的纺织品。

51.根据权利要求1至15之一的碱性蛋白酶在清洁纺织品或硬表面上的用途。

52.根据权利要求51的用途，其中碱性蛋白酶每次的用量为40μg至4g，优选50μg至3g，更优选100μg至2g，以及最优选200μg至1g。

53.根据权利要求41的组合物，其是指一种化妆品。

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