CN1810247A - 小檗胺衍生物ebb在抑制人体肿瘤细胞侵袭转移的药物应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及小檗胺衍生物EBB在抑制人体肿瘤细胞侵袭转移的药物应用，这类物质通过保护基底膜不受破坏而抑制肿瘤细胞的转移。具有降低MMP－2及MMP－9表达，同时增强TIMP表达，从而提高TIMP/MMP比例的显著效果。小檗胺衍生物EBB是溶于稀盐酸的化合物，可以按常规方法制成相应的水剂或粉剂。也可以应用生理可以接受的载体和辅料制成胶囊和片剂。还可以与其它相辅药物混合制成胶囊和片剂。小檗胺衍生物EBB临床剂量为10～120mg/d，最好为10～80mg/d。
Description
技术领域
本发明涉及小檗胺衍生物EBB在抑制人体肿瘤细胞侵袭转移的药物应用，这类物质通过保护基底膜不受破坏而抑制肿瘤细胞的转移。
背景技术
肿瘤转移是抗癌治疗失败和患者死亡的主要原因。据临床统计，约有80％以上的肿瘤患者死于肿瘤的侵袭与转移，故此方面的研究一直受到人们特别的的关注。肿瘤侵袭和转移是一个主动过程，Litta曾经把这一过程概括为三个步骤：(1)肿瘤细胞与细胞外基质成分粘附；(2)肿瘤细胞释放或诱导释放蛋白水解酶，降解细胞外基质；(3)降解区域肿瘤细胞在趋化因子引导下迁移。完善的细胞外基质和基底膜可以限制肿瘤细胞的侵袭和转移(Liotta LA.Tumor invasion andmetastases-role of the extracellular-matrix：Rhoads Memorial Awardlecture.Cancer Res，1986，46(1)：1-7.)。
在组织学上，基底膜完整性的破坏被认为是恶性肿瘤侵袭开始的一个标志。肿瘤细胞的生物学性状有别于正常细胞，研究这些细胞及其所依赖的细胞外环境中各种不同类型分子与肿瘤间质之间的相互关系，发现了许多新的细胞粘附分子和细胞移动分子及各种类型的降解酶。
细胞外基质和基底膜重塑是癌细胞侵袭转移过程中的关键环节，需借助于蛋白降解酶的表达和激活。肿瘤细胞合成及分泌大量基质降解酶，降解细胞外基质是肿瘤细胞侵袭、转移的重要步骤。肿瘤细胞侵袭与转移的成功在很大程度上，正是依赖于这些酶降解了一系列的组织屏障(屏障的主要成分：各型胶原、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹力蛋白及蛋白多糖等)，可依据这些酶底物成分的理化、生物学特点将降解酶分类为金属蛋白酶类、丝氨酸蛋白类、巯基蛋白酶类、酸性蛋白酶类等。也可以分为蛋白酶类和糖苷酶类。前者主要降解细胞外基质中的蛋白成分，如IV型胶原，层粘连蛋白及蛋白聚糖中的核心蛋白部分，后者主要降解其中的糖蛋白及蛋白聚糖中的多糖链。现已识别的蛋白酶类有四种：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)。它们能够降解基质成分，并具有不同程度的特异性。基质金属蛋白酶是一组重要的细胞外基质降解酶，它通过对细胞外基质中不同成分的降解，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。
人们发现MMPs在对胞外基质有效成分降解的过程中起着关键的作用，对金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)及其组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)的研究最多，目前已发现的MMPs有25种，分为膜型和分泌型。TIMPs的功能主要是天然地抑制MMPs，在调节细胞外基质的代谢中起重要的作用。两者表达水平的动态平衡关系决定了细胞外基质的降解程度，继而也决定了肿瘤的侵袭与转移。其作用方式较为复杂，大多数情形下以1∶1的比例二者结合成复合物，使MMPs活性丧失(Nelson AR，FingletonB，Rothenberg ML，et al.Matrix metalloproteinase：biologic activity andclinical implication[J].J Clin Oncol，2000，18(5)：1135～11491)。越来越多的研究表明，恶性表型和侵袭转移表型的细胞均高表达MMPs水平。在形成细胞外基质的两大部分，即基底膜和间质中，基底膜构成一道阻滞屏障，该屏障以基膜胶原即IV型胶原为主要成分，故对其降解是细胞侵袭与转移的关键步骤，因此IV型胶原酶(MMP-2，MMP-9)被研究得最多。不同种类的肿瘤如乳腺癌其恶性程度与MMP-2，MMP-9过多表达呈正相关(Hanemaaier R，Verheijen J H，Mayuire TM，et al.Increasedgelatinase-A and gelatinase-B activities in mallignant vs benignbreast tumors[J].Int J Cancer，2000，86：204～207)。许多研究发现，MMP-2、MMP-9与TIMPs特别是TIMP-1、-2相互作用的结果与肿瘤细胞侵袭与转移有相关性，MMP-2/TIMP-2比值甚至作为一些肿瘤恶性程度及预后判断的一项指标。Still等在比较前列腺良性和恶性肿瘤的研究中发现，正常或良性前列腺疾病MMP-2/TIMP-2比值约在1左右，恶性肿瘤或预后不良疾病MMP-2/TIMP-2比值多大于1(StillK，Robson CN，Autzen P，et al.Localization and quantification of mRNAfor matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and tisue inhibitor of matrixmetalloproteinase22(TIMP-2)in human benign and malignant protatictissue[J].Prostate，2000，42(1)：18～25)。Gong等研究了MMP-2，MMP-9与TIMP-1表达在肿瘤过程和恶性预后中的关系，发现MMP-2，MMP-9/TIMP-1可能成为肿瘤临床研判的一项新的指标(Gong YI，Xu GM，Huang WD，et al.Expression of natrix metalloproteinases and thetissue inhibitors of metalloproteinases and their local invasiveness andmetastasis in Chinese human pancreatic cancer[J].J SurgOncol，2000，73(2)：95～99)。目前，在IV型胶原酶特别是MMP-2的研究中，除发现与TIMP-2关系密切外，还发现膜型基质金属蛋白酶(MT1-MMP)参与活化MMP-2，使基底膜成分降解增加，继而引发细胞侵袭与转移(Dalberg K，Eriksson E，Enberg U，et al.Gelatinase A，membranetype 1 matrix metalloproteinase，and extracellular matrixmetalloproteinase inducer mRNA expression：correlationwith invasivegrowth of breast cancer[J].World J Surg，2000，24(3)：334～340)。MMPs的抑制可能在两个层次上，一是在基质中不能被转化为活性状态，二是其活性被体内天然的组织金属蛋白酶抑制因子(tissueinhibitor of metalloproteinase，TIMPs)通过与活性形式结合的方式而抑制(Yoshimoto M，Itoh F，Yamamoto H，et al.Expression ofMMP-7(PUMP-1)mRNA inhuman colorectal cancers.Int JCancer，1993，19；54(4)：614-618.)。Koshiba等利用明胶酶图(Gelatinzymograph)检测了13例正常胰腺组织、14例慢性胰腺炎组织和33例胰腺癌组织中MMP-2的潜伏和激活的形式，并用Western blot分析进一步证实了这种结果。结果显示在所有的胰腺癌、慢性胰腺炎和正常组织中都检测到了MMP-2的潜伏形式，胰腺癌中MMP-2活性形式在所有组织中全部表达(33/33)，其激活率明显高于慢性胰腺炎和正常组织中的激活率。pT3期肿瘤中的激活率显著高于pT1期肿瘤。在胰腺癌组织中那些有局部淋巴结转移和远处转移的组织中MMP-2的激活率也显著高于没有转移的组织。在6个月内复发的病人MMP-2的激活率也显著高于没有转移的组织。在6个月内复发的病人MMP-2的活化率显著高于6个月内没有复发的病人。结果提示MMP-2的激活在胰腺癌侵袭和转移中起了重要作用(Koshiba T，Hosotani R，Wada M，et al.Involvement of matrix metallo-proteinase-2activity in vasion andmetastasis of pancreatic carcino-ma.Cancer，1998，15；82(4)：642-650.)。
TIMP-2过度表达，能抑制转移性ras转化小鼠胚胎成纤维细胞裸鼠静脉注射后肺转移灶的形成，以及体内肿瘤的生长速度和癌细胞的浸润特性(Delercd YA，Perez N，Shimada H，et al.Inhibition of invasionand metastasis in cells tansfected with a inhibitor ofmetalloproteinases.Can-cer Res，1992，52：701-708.)。
体外实验结果显示，ras基因诱导的恶性肿瘤细胞株的MMP-2表达增加，激活MMP-2的单克隆抗体能促进A2085细胞株的侵袭能力，而抑制MMP-2的单抗则使A2085细胞株穿透重组基底膜的能力明显减弱。
针对以上侵袭转移机制，人们正致力于研究靶点新颖、作用有效的抗肿瘤侵袭和转移的药物，如抑制粘附的抗肿瘤侵袭和转移药物、抑制基质金属蛋白酶的抗肿瘤侵袭和转移药物、抑制血管生成的抗肿瘤侵袭和转移药物、干预信号传导的抗肿瘤侵袭和转移药物等。
钙调素拮抗剂是一类以钙调素(calmodulin，CaM)为靶点的药物，它们的药理作用非常广泛。常见的有抗精神病类药，如三氟拉嗪(TFP)，氯丙嗪；肌肉松弛类药物，如w-7及其类似物；钙拮抗剂，如维拉帕米。钙调素拮抗剂的靶点钙调素是细胞内Ca2+信号传导途径中的主要信号传导分子，参与并调节细胞的增殖、分化、运动等基本代谢过程，已成为一种潜在的肿瘤化疗靶点(Hait WN，Lazo Js，et al.Calmodulin：a potential target for cancer chemotherapeutic agents.[J].JClin Oncol，1986 Jun；4(6)：994-1012)。
EBB是国内首先合成的小檗胺衍生物，为一种以钙调素为靶点的钙调素拮抗剂。钙调素拮抗剂的基本结构骨架为：
小檗胺和它的衍生物EBB的结构式为：
R＝-CH2CH2CH2CH2-OCH2CH3
小檗胺 EBB
先前研究表明，EBB在体内外均显示出对肿瘤细胞增殖的抑制作用(LIU Jiewen，QI Shuling，ZHU Huifang，et al.The effect of calmodulin antagonistberbamine derivative-EBB on hepatoma in vitro and in vivo.Chinese Medical Journal2002，115(5)：759-762.)及耐药逆转作用(齐淑玲，刘杰文，付津等，钙调素拮抗剂EBB逆转K562/VCR细胞系多药耐药性的研究，中国实验血液学杂志，1996年03期)对常用化疗抗癌药有协同效应。目前关于钙调素拮抗剂小檗胺衍生物EBB抑制肿瘤细胞侵袭和转移作用的研究尚未见到报道。
发明内容
本发明的目的在于公开小檗胺及其衍生物EBB对抑制人体肿瘤细胞侵袭转移的药物应用。这种药物通过保护基底膜不受破坏而抑制肿瘤细胞的侵袭转移，具有降低MMP-2及MMP-9表达，同时增强TIMP表达，从而提高TIMP/MMP比例的显著效果。
本发明是利用人纤维瘤细胞系HT1080、人卵巢癌细胞系ES-2和SKOV3、人黑色素瘤细胞系M21、人肺癌细胞系BE-1等人类肿瘤高转移细胞系进行小檗胺衍生物EBB抗肿瘤侵袭和转移研究所得出的结论，所述人类肿瘤高转移细胞系的MMP-2和MMP-9表达高于正常细胞(Kanamori Y，Matsushima M，Minaguchi T.Cancer Res.1999，59(17)：4225-4227)。
目前已知肿瘤细胞表面可以表达很多黏附分子，与肿瘤转移密切相关的有整合素，如CD44等等，其中整合素又分很多亚族，如α2β1是一种胶原的受体，与肿瘤转移有关。Eguchi等用一种强蛋白激酶C的激动剂TPA预先刺激黑色素瘤细胞上α2β1整合素的表达，结果发现与I型胶原黏附的细胞数增加，这种现象能够被钙调素拮抗剂W-7和抗α2抗体所抑制，却不能被蛋白激酶C抑制剂如H-7，calphostin阻断。很显然这种黑色素瘤细胞与I型胶原黏附能力增强与α2β1整合素的表达增加及CaM激酶的激活有关，而并非由于PKC的激活。钙调素拮抗剂则恰好能抑制CaM激酶的激活，从而削弱α2β1整合素的黏附能力，达到抑制转移的目的(Eguchi H，Horikoshi T et al.The expression of intergin alpha 2 beta 1 and attachment to type I collagenof melanoma cells are preferentially induced by tumor promoter，TPA(12-0-tetradecanoyl phorbol-13-acetate).[J].Br J Dermatol.1996Jan；134(1)：33-9)。此外，尿激酶型血纤维蛋白溶解酶原激动剂(urokinase-type plasminogen activator，uPA)、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)降解过程中主要涉及的两种酶类。Ca2+离子是调节细胞生长和蛋白酶产生信号途径中的主要辅助因子Farias等在体外证实了钙拮抗剂维拉帕米可剂量依赖性地刺激uPA、MMP-9产生，并在BALB/c小鼠自发转移模型中得到了51.3％的转移抑制率(Farias EF，Aguirre GhisoJA，et al.Verapamil inhibits tumor protease production，local invasion andmetastasis development in murine caricinoma cells.[J].Int J Cancer.1998Dec 9；78(6)：727-34)。赵环宇等用Lewis肺癌细胞种植于C57BL/6J小鼠腹股沟皮下，观察自发性肺转移能力，同样也证实了不同剂量的维拉帕米均能显著抑制Lewis肺癌细胞自发性肺转移，随着剂量的增加，肺转移抑制率由43.9％上升到85.9％。已知Lewis肺癌为自发性肺内未分化上皮样癌，常通过诱导血小板聚集发生血道转移，研究也证实了不同浓度的维拉帕米均能抑制Lewis肺癌诱导的血小板聚集，随着药物浓度增加，血小板聚集抑制率由19％上升至76.2％(ZhaoHY et al.An experimental study on the inhibition of spontaneous tumormetastasis of Lewis lung carcinoma by the calcium antagonistverapamil.[J].Chinese Clinical Oncology，2002 Feb.7(1)：5-7)。
总之，肿瘤细胞侵袭和转移过程中，ECM的降解和BM的破坏是癌细胞突破正常细胞基底膜在别处形成转移灶的关键步骤。MMPs及TIMPs家族是其中关键的因素之一；前者与ECM和BM成分的破坏和降解相关，后者是MMPs的特异性抑制因子，两者的动态平衡维持了ECM和BM的完整性。因此，使细胞MMPs活性与TIMPs活性保持动态平衡，维持ECM和BM完整性，是抗癌侵袭转移治疗的基本机制之一。
本申请人用2、5和10μg/ml浓度的EBB处理HT1080、ES-2、SKOV3、M21、EB-1细胞系24h后，细胞外MMP-2、MMP-9酶活性呈减低趋势；RT-PCR检测结果表明MMP-2、MMP-9及TIMP-1在mRNA水平上的表达均有所改变，MMP-2和MMP-9的mRNA表达量均随着药物浓度的升高，呈明显的下降趋势；TIMP-1的mRNA表达则相反，随着药物浓度的升高，呈明显的上升趋势。细胞外MMP-2、MMP-9的蛋白活性与细胞内mRNA表达均一致减低，降低了HT1080细胞对ECM和BM的降解破坏能力。这种变化在侵袭实验中得到证实，随着药物浓度的升高HT1080、ES-2、SKOV3细胞过膜细胞数下降。因而一定浓度的EBB能够抑制HT1080、ES-2、SKOV3细胞的侵袭能力。实验表明EBB的抗侵袭能力是通过与钙调素结合而影响MMP-2、MMP-9及TIMP-1的mRNA表达，即对MMP-2、MMP-9的抑制及对TIMP-1的激活有关，并由此维持基底膜的完整性，抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。本实验中，还研究了EBB对HT1080、ES-2、SKOV3、M21、EB-1细胞粘附能力的影响，结果表明EBB不能改变HT1080、ES-2、SKOV3、M21、EB-1细胞的粘附能力。
实验详细内容如下：
实验一：MMT法测定药物敏感性
方法：选取对数生长期人类肿瘤细胞系HT1080、ES-2、SKOV3、M21、EB-1，调整细胞浓度1×105/ml，接种于96孔板，每孔细胞数为2×104，培养过夜。加入不同浓度药物(EBB)，终体积为200μl，继续培养72小时。实验分为空白对照组和7个浓度梯度药物组，每组做3个平行孔。培养结束前4h，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的MTT，继续培养4小时。弃上清，每孔加入100μl的DMSO，震荡10分钟。546nm测定吸光度值，计算IC50值。
结果：EBB在0.469-30μg/ml浓度范围内对HT1080、ES-2、SKOV3、M21、EB-1等人类肿瘤细胞系作用72h，均产生细胞毒作用；其作用存在因子量效应，随着因子量增加，对细胞生长的抑制越明显；IC50的范围在2-10μg/ml。
实验二：细胞侵袭分析
方法：应用transwell小室进行细胞侵袭重建基底膜实验。在transwell小室滤膜(8μm孔径)的上、下表面分别铺以10μg的ECM胶和5μg纤粘连蛋白，ECM胶用50μl培养基重建1h后备用。HT1080、ES-2、SKOV3等人类肿瘤细胞系经2、5和10μg/ml浓度EBB分别处理48h，重悬于含0.1％BSA的RPMI1640培养基中，每小室中加入2.5×105细胞，37℃培养10h。HE染色，统计侵袭细胞数目。实验重复3次，按下式计算药物对肿瘤细胞侵袭抑制率。
结果：用2、5和10μg/ml浓度EBB处理HT1080、ES-2、SKOV3、M21、EB-1等人类肿瘤细胞系48h后，侵袭细胞数与药物浓度呈反比，侵袭抑制率与药物浓度呈正比(见表1)。各实验组与对照组作t检验，均具有极显著统计学意义(p＜0.001)，表明EBB可明显降低HT1080、ES-2、SKOV3人类肿瘤细胞系的侵袭能力。
EBB对HT1080、ES-2细胞侵袭能力的抑制作用见图1、图2所示。
不同浓度EBB对HT1080、SKOV3、ES-2细胞的抑制率如表1所示。
表1
Tab.1 Inhibitic effection of EBB on the invasive ability of
HT1080，SKOV3，ES-2cells in vitro
| Cell line | Group | No.of invadingcells( X±S) | Ratio ofinhibitory(％) | P value |
| HT1080 | control2μg/ml5μg/ml10μg/ml | 89.47±1.85661.53±0.874336.67±1.56825.13±0.267 | 31.13±2.26559.91±2.56671.58±0.5960 | p＝0.0002p＜0.0001p＜0.0001 |
| SKOV3 | control2μg/ml5μg/ml10μg/ml | 109.3±3.57878.67±6.06764.93±5.06046.53±7.856 | 27.87±5.96740.16±6.80160.95±8.411 | p＝0.0121p＜0.0020p＜0.0019 |
| ES-2 | control2μg/ml5μg/ml10μg/ml | 137.3±3.23896.07±1.33347.87±2.88822.80±2.835 | 30.00±1.37265.10±2.32483.29±2.384 | p＝0.003p＜0.0001p＜0.0001 |
实验三：明胶酶活性测定
方法：将2×105/ml HT1080、SKOV3、EB-1等人类肿瘤细胞系接种于6孔板，含血清RPMI1640中培养24h后，再分别用含2、5和10μg/ml浓度EBB的无血清RPMI1640培养，同时设空白及培养基对照组，继续培养24h。收集对照组和用药组上清液，4℃低温下电泳。电泳完毕用去离子水漂洗两次，移入2.5％Triton-100洗脱，37℃孵育16h。用去离子水洗胶两遍，染色1h，脱色2h，可见白色明胶酶条带。
结果：SDS-聚丙烯酰胺凝胶中加入明胶酶底物明胶，可用来检测细胞条件培养基中明胶酶MMP-2和MMP-9的活性。HT1080(见图3)、ES-2(见图4)、EB-1(见图5)人纤维肉瘤细胞同时表达MMP-2和MMP-9，经EBB作用后，MMP-2和MMP-9的活性均降低。其中用药2μg/ml时MMP-2的活性与对照组之间未见明显差异；增至5或10μg/ml可见明显差异。用药2或5μg/ml时MMP-9的活性与对照组之间未见明显差异；增至10μg/ml可见差异。SKOV3只表达MMP-2，其活性在各用药组与对照组之间也可见差异(见图6)。
实验四：RT-PCR法检测MMP-2、MMP-9及TIMP-1mRNA表达
方法：分别用2、5和10μg/ml浓度EBB处理HT1080、ES-2等人类肿瘤细胞系24h，各取0.5-1×107细胞，按Trizol试因子盒说明提取总RNA，按M-MuLV试因子盒说明进行逆转录反应，MMP-2、MMP-9及TIMP-1的PCR反应条件为94℃10min、94℃1min、55℃30s、72℃1min，72℃延伸10min。琼脂糖电泳测定MMP-2、MMP-9和TIMP-1mRNA表达，拍照。
结果：实验表明肿瘤细胞能否有效降解和侵袭基底膜发生转移，取决于基质金属蛋白酶的表达及活性。用2、5和10μg/ml浓度EBB处理HT1080、ES-2等细胞24h后，MMP-2和MMP-9的mRNA表达均有下降趋势。其中MMP-9更明显。对于HT1080细胞，用药2或5μg/ml时MMP-2的mRNA表达与对照的差异较小；10μg/ml时差异较大(见图7)。MMP-9的mRNA表达在2μg/ml与对照组之间即可见明显差异；5μg/ml组、10μg/ml组与对照组之间可见极其明显差异(见图8)。对于ES-2细胞，用药2或5μg/ml时MMP-2的mRNA表达与对照的差异较小；10μg/ml时可见差异(见图10)。MMP-9的mRNA表达在各个加药组与对照组之间可见极其明显差异(见图10)。由此可见，EBB处理可使HT1080、ES-2等细胞基质金属蛋白酶分泌受到抑制。
EBB对基质金属蛋白酶组织性抑制因子TIMP-1mRNA的表达有升高作用(HT1080见图9，ES-2见图10)。
实验五：电镜观察
方法：分别用2、5和10μg/ml浓度EBB处理HT1080、ES-2、M21等人类肿瘤细胞系24h，各取1-9×107细胞，做超薄切片观察。结果：电镜观察HT1080(见图11)、ES-2(见图12)、M21(见图13)等细胞内线粒体均发生肿胀，甚至空泡变，嵴形态排列不规则，数量变少，有脂滴出现。
附图说明
附图1不同浓度EBB对HT1080细胞侵袭能力的抑制作用组图。
其中：图1-A、图1-B、图1-C、图1-D的EBB浓度分别为control、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。
附图2不同浓度EBB对ES-2细胞侵袭能力的抑制作用组图。
其中：图2-E、图2-F、图2-G、图2-H的EBB浓度分别为control、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。
附图3不同浓度EBB对HT-1080细胞MMP-2和MMP-9活性的影响。
图中：1、marker 2、control 3、2μg/ml 4、5μg/ml 5、10μg/ml。
附图4不同浓度EBB对ES-2细胞MMP-2和MMP-9活性的影响。
图中：1、marker 2、control 3、2μg/ml 4、5μg/ml 5、10μg/ml。
附图5不同浓度EBB对BE-1细胞MMP-2和MMP-9活性的影响。
图中：1、marker 2、control 3、2μg/ml 4、5μg/ml 5、10μg/ml。
附图6不同浓度EBB对SKOV3细胞MMP-2和MMP-9活性的影响。
图中：1、marker 2、control 3、2μg/ml 4、5μg/ml 5、10μg/ml。
附图7 RT-PCR法检测不同浓度EBB对HT1080细胞MMP-2反应结果。
图中：1、marker 2、control 3、2μg/ml 4、5μg/ml 5、10μg/ml。
附图8 RT-PCR法检测不同浓度EBB对HT1080细胞MMP-9反应结果。
图中：1、marker 2、control 3、2μg/ml 4、5μg/ml、5、10μg/ml。
附图9 RT-PCR法检测不同浓度EBB对HT1080细胞TIMP-1基因反应结果。
图中：1、marker 2、control 3、2μg/ml 4、5μg/ml 5、10μg/ml。
附图10 RT-PCR法检测不同浓度EBB对ES-2细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1基因反应结果。
图中：MMP-9：1、control 2、2μg/ml 3、5μg/ml 4、10μg/ml。
MMP-2：6、control 7、2μg/ml 8、5μg/ml 9、10μg/ml。
TIMP-1：10、control 11、2μg/ml 12、5μg/ml 13、10μg/ml。
附图11不同浓度EBB对HT1080、ES-2、M21细胞形态结构的影响电镜观察组图。
其中：图11-A、图11-B、图11-C的EBB浓度分别为control、5μg/ml、10μg/ml。
附图12不同浓度EBB对ES-2细胞形态结构的影响电镜观察组图。
其中：图12-D、图12-E、图12-F的EBB浓度分别为control、5μg/ml、10μg/ml。
附图13不同浓度EBB对M21细胞形态结构的影响电镜观察组图。
其中：图13-G、图13-H、图13-I的EBB浓度分别为control、5μg/ml、10μg/ml。
具体实施方式
小檗胺衍生物EBB是溶于稀盐酸的化合物，可以按常规方法制成相应的水剂或粉剂。也可以应用生理可以接受的载体和辅料制成胶囊和片剂。还可以与其它相辅药物混合制成胶囊和片剂。小檗胺衍生物EBB临床剂量为10～120mg/d，最好为10～80mg/d。
Claims (1)
1、通式(I)的小檗胺衍生物EBB在抑制人体肿瘤细胞侵袭转移的药物应用，通式：
其中：R＝-CH2CH2CH2CH2-OCH2CH3。
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